JP2023521906A

JP2023521906A - 線維症の予防又は治療用組換え融合タンパク質

Info

Publication number: JP2023521906A
Application number: JP2022562862A
Authority: JP
Inventors: ソオ，ジュン
Original assignee: セネリックスカンパニーリミテッド
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2021-03-31
Publication date: 2023-05-25
Also published as: KR20210154784A; CN115605502A; BR112022020350A2; CA3175503A1; US20230357356A1; EP4137507A1; AU2021255518A1; KR102638021B1; WO2021210812A1; EP4137507A4

Abstract

本発明は、肝臓、膵臓、肺などに発生する線維症を予防又は治療するために使用できるアルブミンとレチノール結合タンパク質の融合タンパク質に関するものであって、本発明の融合タンパク質は、組織の線維化の原因となる星状細胞の活性化を抑制したり、又は不活性化を誘導することによって線維症の予防又は治療が可能であり、同一の目的の従来の融合タンパク質に比べて低い濃度でより優れた効果を示すので、タンパク質治療剤の人体投与用量及び投与頻度を画期的に減少できる汎用的基盤技術になり得ると期待される。

Description

発明の詳細な説明

［技術分野］
本発明は、肝臓、膵臓、肺などに発生する線維症を予防又は治療するために使用できるアルブミンとレチノール結合タンパク質の融合タンパク質に関する。

［背景技術］
組織の線維化（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）は、組織の機能喪失をもたらす致命的な結果を生じる。例えば、肝臓の線維化は、肝機能喪失から肝硬化及び肝癌に進められ、慢性膵炎と膵臓癌で共通的に線維化された組織が観察される。現在まで用いられている線維症治療剤はなく、治療可能性が最も高い方法として組織移植が施行されている。組織線維化の分子メカニズムは未だに明らかになっておらず、線維症治療剤の開発研究が必要である。

近年、組織の線維化は、組織を構成する細胞の一つである星状細胞（ｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌｓ）の活性化過程（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ及びｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）によって発生することが明らかになった。活性化された星状細胞は、コラーゲンなどの細胞外基質を過剰発現して蓄積させ、筋線維化細胞（ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に分化される。このように活性化された星状細胞は、組織線維化の発生に決定的な役割を果たす。

星状細胞（ｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌｓ）は、肝臓のみならず、膵臓、肺、腎臓、及び腸などに分布され、全身でのレチノイド恒常性の調節に中心的な役割をする。食品から得られたビタミンＡ（レチノール）は、血流でレチノール結合タンパク質（ＲｅｔｉｎｏｌＢｉｎｄｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ、ＲＢＰ）と結合して循環しながら、ＲＢＰ受容体であるＳＴＲＡ６を通じて星状細胞に移動し、細胞質内の脂肪滴内にレチニルエステルの形態で貯蔵される。一方、アルブミンは、星状細胞内でその活性化を阻害し、既に活性化された星状細胞内でのアルブミンの発現は、活性化前の状態に転換させることが知られている。

以前の研究により、本発明者等は、組織線維化の開始となる星状細胞の活性化抑制又は不活性化のために、ＳＴＲＡ６を通じて星状細胞内に移動し得るＲＢＰとアルブミンとを結合することによって星状細胞をターゲッティングする融合タンパク質を製造し、その線維化予防及び治療効果を確認した（ＫＲ１０－１３９５３９４）。

［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
本発明が達成しようとする技術的課題は、従来のＲＢＰとアルブミン融合タンパク質の星状細胞の活性化抑制又は不活性化効果を増進させるために、アルブミンの一つ以上のアミノ酸配列が置換されたＲＢＰ－アルブミン融合タンパク質及び互いに異なる配列で連結されたＲＢＰ－アルブミン融合タンパク質を提供することにある。

また、本発明は、前記融合タンパク質を発現できるベクター、及び前記ベクターが導入された形質転換体を提供し、本発明の組換えタンパク質の大量生産方法を提供しようとする。

また、本発明の融合タンパク質は、従来のＲＢＰ－アルブミン融合タンパク質よりも星状細胞の活性化抑制又は不活性化に優れた効果を示すので、本発明は、前記融合タンパク質を含む線維症の予防又は治療用組成物を提供しようとする。

しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されなく、言及していない他の課題は、下記の記載から当該技術分野で通常の技術者に明確に理解され得るだろう。

［課題を解決するための手段］
前記課題を解決するために、本発明は、配列番号１又は２のアミノ酸配列からなったり、これを含む融合タンパク質を提供する。

また、本発明は、配列番号３乃至８のうちいずれか一つのアミノ酸配列からなったり、これを含む融合タンパク質を提供する。

本発明の一具現例として、前記融合タンパク質は、組織の線維化を予防又は治療するための用途であり得る。

また、本発明は、前記各融合タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、配列番号９乃至１４のうちいずれか一つの塩基配列からなったり、これを含むことができる。

また、本発明は、前記融合タンパク質を暗号化する遺伝子を含む組換えベクターを提供し、前記組換えベクターを含む形質転換体を提供する。

また、本発明は、（１）配列番号１乃至８のうちいずれか一つのアミノ酸配列からなる融合タンパク質を暗号化する遺伝子を含む組換えベクターを製造する段階；（２）前記組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を製造する段階；（３）前記形質転換体を培養する段階；及び（４）前記培養液から融合タンパク質を収得する段階；を含む融合タンパク質の生産方法を提供する。

本発明の一具現例として、前記融合タンパク質を暗号化する遺伝子は、配列番号９乃至１４からなる群から選ばれる１以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むことができる。

本発明の他の具現例として、前記宿主細胞は、哺乳類の細胞であってもよく、好ましくは哺乳類の癌細胞であってもよく、さらに好ましくはＣＨＯ細胞であってもよい。

また、本発明は、配列番号１乃至８のうちいずれか一つのアミノ酸配列からなる融合タンパク質を含む、線維症の予防又は治療用薬学的組成物を提供することができる。

また、本発明は、配列番号１乃至８のうちいずれか一つのアミノ酸配列からなる融合タンパク質を個体に投与する段階を含む線維症の予防又は治療方法を提供することができる。

本発明の一具現例として、前記個体は、線維症の予防又は治療が必要な人間であってもよく、特に非アルコール性脂肪性肝疾患の患者であってもよい。

本発明の他の具現例として、前記方法は、前記融合タンパク質の投与後にＣＴ撮影又は組織検査を行い、線維化程度を診断する段階をさらに含むことができる。

本発明の一具現例として、前記線維症は、肝線維症（ｌｉｖｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓ）、慢性肝炎（ｃｈｒｏｎｉｃｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、肝硬化（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃｃａｎｃｅｒ）、化学療法－関連脂肪肝炎（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ＣＡＳＨ）、肺線維症（ｌｕｎｇｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎臓線維症（ｒｅｎａｌｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎不全（ｒｅｎａｌｆａｉｌｕｒｅ）、膵臓線維症（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓ）、慢性膵炎（ｃｈｒｏｎｉｃｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）及び膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ）からなる群から選ばれる１種以上の疾患であり得る。

また、本発明は、線維症の予防又は治療用薬剤を製造するための前記融合タンパク質の用途を提供する。

［発明の効果］
本発明の融合タンパク質は、組織の線維化の原因となる星状細胞の活性化を抑制したり、又は不活性化を誘導することによって線維症の予防又は治療が可能であり、同一の目的の従来の融合タンパク質に比べて低い濃度でより優れた効果を示すので、タンパク質治療剤の人体投与用量及び投与頻度を画期的に減少できる汎用的基盤技術になり得ると期待される。

［図面の簡単な説明］
［図１］アルブミンIIIとＲＢＰとが結合された融合タンパク質が活性化された星状細胞内に内包されて作用するメカニズムを図式化した図である。

［図２］本発明の融合タンパク質１及び２と従来の融合タンパク質（ＲＢＰ－アルブミンIII及びアルブミンIII－ＲＢＰ）の活性化された星状細胞の不活性化誘導効果を比較・確認した図である。

［図３］本発明の融合タンパク質１及び２と融合タンパク質３乃至６の活性化された星状細胞の不活性化誘導効果を比較・確認した図である。

［図４ａ及び図４ｂ］肝線維化動物モデルへの融合タンパク質１及び４とＲＢＰ－アルブミン^２投与による肝線維化程度をシリウスレッド組織染色を通じて比較・確認した図である。

［発明を実施するための最善の形態］
アルブミンは、主に肝細胞で合成される多機能性血漿タンパク質である。アルブミンは、３個のドメイン（ｄｏｍａｉｎ）を有し、それぞれは、二つのサブドメイン（ｓｕｂｄｏｍａｉｎ）Ａ及びＢで構成される。アルブミンは、脂肪酸及びレチノイン酸を含む多様な疎水性物質と結合し、血液内で運搬させる分子移動の役割をするものとして知られている。結晶学分析によると、５個の強力な脂肪酸結合部位がアルブミン内に非対称的に分布する（サブドメインIＢに一つ、IＡとIIＡとの間に一つ、IIIＡに二つ、そして、IIIＢに一つ）。

本発明者等は、以前の研究でアルブミンと星状細胞ターゲッティングのためのレチノール結合タンパク質（ＲｅｔｉｎｏｌＢｉｎｄｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ、ＲＢＰ）とが結合された融合タンパク質を製造し、前記融合タンパク質は、活性化された星状細胞の内部に流入し、細胞の形態を活性化前に逆転換させ、これによって線維症の予防及び治療が可能であることを確認した。さらに、本発明者等は、星状細胞の活性化過程でレチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ、ＲＡ）が重要な役割をし、融合タンパク質がこのようなＲＡの細胞内レベルを減少させることによって星状細胞の活性化を制御することを究明した。したがって、より安定的にレチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ、ＲＡ）と結合し、星状細胞の活性化抑制又は不活性化を誘導できる融合タンパク質を開発するために、アルブミンの配列変異及び多様な組み合わせのアルブミンサブドメインとＲＢＰの配列を用いて新しいアルブミンＲＢＰ融合タンパク質を製造した。

従前の研究では、アルブミンのドメインのうちドメインIIIとＲＢＰの融合タンパク質で星状細胞の活性化抑制又は不活性化効果に最も優れていたので、これに基づいて、本発明者等は、レチノイン酸との結合力が強化された組換え融合タンパク質を製造しようとした。

そこで、従来のアルブミンドメインIIIとＲＢＰ融合タンパク質において、ドメインIIIの５２６番目と６００番目のバルキー（ｂｕｌｋｙ）なアミノ酸がＲＡとの結合を妨害するものであると推定し、これをより小さいアミノ酸に置換し、ＲＡとの結合を通じた活性化された星状細胞の不活性化効果を確認しようとした（配列番号１及び２参照）。

具体的には、本発明者等は、アルブミンドメインIIIにおいて、５２６番目のアミノ酸残基（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）と６００番目のアミノ酸残基（ｖａｌｉｎｅ）をそれぞれバリン（ｖａｌｉｎｅ）とアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）に交替し、下記のように融合タンパク質１及び２を設計して製造した。

－融合タンパク質１：ＲＢＰ（１～１９３）＋アルブミンIII｛４０４～５２６（Ｆ→Ｖ）～６００（Ｖ→Ａ）～６０１｝
－融合タンパク質２：アルブミン［シグナルペプチド（１～１８）＋III｛４０４～５２６（Ｆ→Ｖ）～６００（Ｖ→Ａ）～６０１｝］＋ＲＢＰ（１７～１９２）
また、本発明者等は、アルブミンのサブドメインIＢとIIIＡがレチノイン酸と非常に安定的に結合することを確認し、下記のように融合タンパク質３～６を設計して製造した。

－融合タンパク質３：ＲＢＰ（１～１９３）＋アルブミン［IIIＡ｛４０４～５１７（Ｖ）｝＋IＢ（１３１～２１８）］
－融合タンパク質４：ＲＢＰ（１～１９３）＋アルブミン［IIIＡ｛４０４～５１７（Ｖ）｝＋IＢ（１３４～２１８）］
－融合タンパク質５：アルブミン［シグナルペプチド（１～１８）＋IIIＡ｛４０４～５１７（Ｖ）｝＋IＢ（１３１～２１８）］＋ＲＢＰ（１７～１９２）
－融合タンパク質６：アルブミン［シグナルペプチド（１～１８）＋IIIＡ｛４０４～５１７（Ｖ）｝＋IＢ（１３４～２１８）］＋ＲＢＰ（１７～１９２）
続いて、本発明者等は、製作された融合タンパク質１又は２を活性化された星状細胞に処理し、星状細胞の活性化マーカーであるα－ＳＭＡ（α－ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎ）とコラーゲンタイプIの発現レベルを測定することによって、従来の開発された融合タンパク質（ＲＢＰ－アルブミンIII及びアルブミンIII－ＲＢＰ）と星状細胞の不活性化効果を比較・確認した。その結果、本発明の融合タンパク質１及び２は、従来の開発された融合タンパク質に比べて低い濃度及び高いレベルでα－ＳＭＡとコラーゲンIの発現を減少できることを確認した（実施例１参照）。

これを通じて、本発明者等は、アルブミンIIIの５２６ａ．ａと６００ａ．ａが小さい分子量のアミノ酸に置換される場合、レチノイン酸との結合力が上昇し、より効果的に星状細胞の不活性化を誘導できることを確認した。

そこで、本発明は、５２６番目と６００番目のアミノ酸がそれぞれ独立的に置換されたアルブミンIIIとＲＢＰとが結合された融合タンパク質を線維症治療用途に提供することができ、前記融合タンパク質においてアルブミンIIIの５２６番目のアミノ酸残基として位置し得るアミノ酸は、バリン、アラニン及びグリシンであってもよく、６００番目のアミノ酸残基として位置し得るアミノ酸は、アラニン及びグリシンであってもよく、前記融合タンパク質は、配列番号１又は２のアミノ酸配列からなったり、これを含むことができる。

続いて、本発明者等は、従来の融合タンパク質より優れた星状細胞の活性化過程抑制効果を示した融合タンパク質１及び２と融合タンパク質３乃至６のα－ＳＭＡとコラーゲンIの発現抑制効果を比較・確認した。その結果、融合タンパク質３乃至６は、より低い濃度でも星状細胞の活性化を効果的に抑制できることを確認した（実施例２）。

併せて、本発明者等は、四塩化炭素による肝線維化動物モデルを用いて融合タンパク質１及び４と従来の融合タンパク質（ＲＢＰ－アルブミンIII）の肝線維化改善効果を確認した結果、融合タンパク質１及び４は、ＲＢＰ－アルブミンIIIより低い濃度でより効果的に線維化を改善できることを確認した（実施例３）。

そこで、本発明者等は、前記開発された融合タンパク質１乃至６からなる群から選ばれた１種以上の融合タンパク質を含む線維症の予防又は治療用薬学的組成物を提供することができ、融合タンパク質１乃至６からなる群から選ばれる２種以上の融合タンパク質を個体に投与する段階を含む線維症の予防又は治療方法を提供することができる。

本発明の融合タンパク質１乃至６は、従来のＲＢＰとアルブミンの融合タンパク質より低い濃度で効果的に活性化された星状細胞の不活性化を誘導できることを確認したので、本発明の薬学的組成物は、タンパク質治療剤の人体投与用量及び投与頻度を画期的に減少できる汎用的基盤技術になり得ると期待される。

本発明において、「線維症」とは、正常な組織が破壊されながら線維性結合組織に取り替えられる線維化（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）によって臓器が本来の機能を果たせないことから表れる疾病であって、肝線維症（ｌｉｖｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓ）、慢性肝炎（ｃｈｒｏｎｉｃｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、肝硬化（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃｃａｎｃｅｒ）、化学療法－関連脂肪肝炎（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ＣＡＳＨ）、肺線維症（ｌｕｎｇｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎臓線維症（ｒｅｎａｌｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎不全（ｒｅｎａｌｆａｉｌｕｒｅ）、膵臓線維症（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓ）、慢性膵炎（ｃｈｒｏｎｉｃｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）及び膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ）を含み、臓器の一部が固まる線維化によって表れる疾病であればこれに制限されない。

本発明において、「個体」とは、哺乳類であれば制限されないが、好ましくは、人間又は家畜であり得る。

本発明において、「予防」とは、本発明に係る薬学的組成物の投与によって線維症の発病を遅延させたり、組織の線維化を遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、本発明に係る薬学的組成物の投与によって線維症の症状が好転したり、有利に変更される全ての行為を意味する。

本発明において、前記融合タンパク質の形成に使用されるアルブミンは、任意の種から由来したものであり得るが、免疫原性の危険を避けるために、投与される個体と同一の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の由来であることが好ましい。

本発明において、薬学的組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、融合タンパク質１乃至６の他に、組織の線維化を予防又は治療できる公知の物質を１種以上さらに含むことができ、薬学的組成物の製造に通常使用される適切な担体、賦形剤、及び希釈剤をさらに含むことができる。

本発明において、「担体（ｃａｒｒｉｅｒ）」とは、ビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）とも呼ばれ、細胞又は組織内へのタンパク質又はペプチドの付加を容易にする化合物を意味するものであって、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、生物体の細胞又は組織内への多くの有機物の投入を容易にする、通常使用される担体である。

本発明において、「希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）」とは、対象タンパク質又はペプチドの生物学的活性形態を安定化させるだけでなく、タンパク質又はペプチドを溶解させるようになる水で希釈される化合物と定義される。バッファー溶液に溶解されている塩は、当該分野で希釈剤として使用される。通常使用されるバッファー溶液は、ホスフェートバッファー食塩水であって、これは、人間の溶液の塩状態を模倣しているためである。バッファー塩は、低い濃度で溶液のｐＨを制御できるので、バッファー希釈剤が化合物の生物学的活性を変形することは稀である。ここで使用されたアゼライン酸を含有する各化合物は、人間の患者にそれ自体として投与されたり、結合療法のように他の成分と共に、又は適当な担体や賦形剤と共に混合された薬剤学的組成物として投与され得る。

また、本発明に係る線維症の予防又は治療用薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの外用剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用されてもよく、本発明の抗菌用組成物は、目的とする方法によって経口投与又は非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内又は局所に適用）することができ、投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物の形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適宜選択可能であり、例えば、薬学的に許容可能な担体と混合された形態で約０．００１ｍｇ乃至１０００ｍｇが投与され得る。本発明の抗菌用組成物は、必要によって１日１回乃至数回に分けて投与することができ、単独で使用してもよく、又は、手術、ホルモン治療、薬物治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用してもよい。

一方、本発明の組換え融合タンパク質のアミノ末端には、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの保護基が結合されてもよく、ペプチドのカルボキシ末端は、ヒドロキシ基（－ＯＨ）、アミノ基（－ＮＨ_２）、アジド（－ＮＨＮＨ_２）などに変形してもよい。

また、本発明の融合タンパク質末端又はアミノ酸のＲ－残基（Ｒ－ｇｒｏｕｐ）に脂肪酸（ｆａｔｔｙａｃｉｄｓ）、糖鎖（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｃｈａｉｎｓ）、全てのナノ粒子（ゴールド粒子、リポソーム、ヘパリン、ハイドロゲルなど）、アミノ酸、担体タンパク質（ｃａｒｒｉｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓ）などを結合することができる。上述したアミノ酸の変形は、本発明のタンパク質の力価（ｐｏｔｅｎｃｙ）及び安定性を改善する作用をする。

本明細書において、用語「安定性」は、生体内（ｉｎｖｉｖｏ）安定性のみならず、貯蔵安定性（常温、冷蔵、冷凍保管時の貯蔵安定性を含む）も意味する。

一方、本発明は、下記の段階を含む前記融合タンパク質の製造方法を提供する：
（１）配列番号３乃至８のうちいずれか一つのアミノ酸配列からなる融合タンパク質を暗号化する遺伝子を含む組換えベクターを製造する段階；
（２）前記組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を製造する段階；
（３）前記形質転換体を培養する段階；及び
（４）前記培養液から融合タンパク質を収得する段階。

本明細書において、「遺伝子」とは、最広義の意味として見なされなければならなく、構造タンパク質又は調節タンパク質を暗号化するものであって、本願の融合タンパク質１乃至６を暗号化するＤＮＡ切片であれば制限されなく、具体的には、配列番号９乃至１４のうち一つの塩基配列を含むことができる。

また、本発明において、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、適切な宿主内でＤＮＡを発現できる適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は、簡単に潜在的ゲノム挿入物であり得る。適当な宿主に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムと関係なく複製して機能できたり、又は、一部の場合、ゲノム自体に統合され得る。プラスミドが現在のベクターの最も通常的に使用される形態であるので、本発明の明細書において、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）とベクター（ｖｅｃｔｏｒ）は時々相互交換的に使用される。

塩基配列は、他の塩基配列と機能的な関係で配置されるとき、「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋｅｄ）」される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合されるとき、遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列であり得る。例えば、プレ配列（ｐｒｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又は分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プローモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されたり；リボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されたり；又は、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コーディング配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また、分泌リーダーの場合、接触してリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）は接触する必要がない。これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位でライゲーション（連結）によって行われる。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使用する。

また、本明細書において、「形質転換」又は「形質注入」は、ＤＮＡを宿主に導入し、ＤＮＡが染色体外因子として又は染色体統合完成によって複製可能になることを意味し、本発明において、融合タンパク質を製造するために使用した宿主細胞はＣＨＯ細胞であるが、これに制限されない。

［発明を実施するための形態］
本発明は、多様な変換を加えることができ、様々な実施例を有し得るので、以下では、特定の実施例を図面に例示し、これについて詳細に説明する。しかし、これは、本発明を特定の実施形態に対して限定しようとするものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物及び代替物を含むものと理解しなければならない。本発明を説明するにおいて、関連する公知の技術に対する具体的な説明が本発明の要旨を不明瞭にし得ると判断される場合、それについての詳細な説明は省略する。

［実験方法］
１．肝星細胞（Ｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌｓ、ＨＳＣｓ）の分離及び培養
まず、１４週齢の雄のＢＡＬＢ／ｃマウスの肝をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）で灌流し、続いて、コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、プロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）及びＤＮａｓｅを含有するＧＢＳＳ（Ｇｅｙ’ｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎ）溶液で灌流させた後、肝を抽出した。肝に付着した胆嚢及び結合組織を除去し、肝細胞懸濁液を前記ＧＢＳＳと同一の溶液に入れ、３７℃で１２分間処理した後、１３．４％ナイコデンツ（Ｎｙｃｏｄｅｎｚ）勾配上で１４００ｇで２０分間遠心分離した。ナイコデンツ溶液と水性層との境界面上にある星状細胞を採取し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補充されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ）（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で培養した。星状細胞の純度は、顕微鏡観察と抗チロシンアミノトランスフェラーゼ抗体（ａｎｔｉ－ｔｙｒｏｓｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いたウエスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）を通じて評価した。細胞がディッシュに一杯に（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）なると継代培養をし、これを活性化された星状細胞として用いた。肝星細胞の活性化は、形態学的変化及びα－ＳＭＡとコラーゲンIの発現増加を通じて確認した。

２．融合タンパク質の設計及び製作
２－１．融合タンパク質の設計
レチノイン酸との結合力を強化するために設計された融合タンパク質１乃至６の具体的な情報は、下記の表１に示した。小文字で示したアミノ酸は、シグナルペプチドの配列を意味し、アルブミンIIIで置換されたアミノ酸は、太い字及び下線で表示し、下線で表示したアミノ酸はＲＢＰを意味する。

２－２．融合タンパク質の製造
融合タンパク質を製造するために設計された融合タンパク質１乃至６を暗号化するポリヌクレオチドを製作し、各ＤＮＡ切片をＸｂａＩ／ＫｐｎＩｃｕｔｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにクローニングすることによって組換え発現ベクターを製造した。各融合タンパク質を暗号化するＤＮＡ切片の具体的な情報は、下記の表２にまとめた。前記各ベクターをリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてＣＨＯ細胞に導入し、融合タンパク質を発現する形質転換体を製造した。前記形質転換体を培養し、発現分泌された融合タンパク質を親和クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＨＰＬＣ法によって精製して使用した。

３．定量的リアルタイム重合酵素連鎖反応（ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ）
ＴＲＩｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を用いて総ＲＮＡを準備し、ｃＤＮＡを製作した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＢＩＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ３Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲシステムで行った。反応の変化を統制するために、ＰＣＲ産物は、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のｍＲＮＡレベルに正規化した。

４．肝線維化動物モデルの製造
ミネラルオイル中に１：１で溶解させたＣＣｌ_４をＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に１ｍＬ／ｋｇの濃度で週３回、６週間注射し、肝損傷を誘導した肝線維化マウスモデルを製造した。対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）には、同一の量のミネラルオイルを単独で投与した。最終的にＣＣｌ_４を注射してから４８時間後にマウスを犠牲させた。

犠牲されたマウスの線維化を評価するために肝を摘出し、各実験群の肝組織を１０％緩衝ホルマリンで固定した後、パラフィン包埋することによって組織切片を製作した。各組織切片は、組織学的分析のためにシリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓｒｅｄ）染色を行った後、光学顕微鏡で観察した。

５．統計学的分析
各結果は、平均±標準偏差（ＳＤ）で表現した。統計学的分析は、ｔ－ｔｅｓｔｓを用いて行った。比較は、Ｐ＜０．０５で有意度を検定し、Ｐ数値は、両側検定を行った。

［実験結果］
実施例１．融合タンパク質１及び２と従来のアルブミン－ＲＢＰ融合タンパク質の効果比較
従前の研究において、星状細胞の活性化抑制又は不活性化に優れた効果を示したＲＢＰ－アルブミンIII及びアルブミンIII－ＲＢＰと実施例２で設計した融合タンパク質１及び２の効果を比較した。具体的には、活性化されたマウスの肝星細胞に各融合タンパク質０．２５μＭを２０時間にわたって処理し、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲを用いてα－ＳＭＡとコラーゲンIの発現レベルを測定した。従来の融合タンパク質（ＲＢＰ－アルブミンIII及びアルブミンIII－ＲＢＰ）は、ＫＲ１０－１３９５３９４のＲ－IIIとIII－Ｒ融合タンパク質である。

その結果、図２に示したように、従来の融合タンパク質と比較して、融合タンパク質１及び２は、α－ＳＭＡとコラーゲンIのｍＲＮＡ発現をさらに多く減少させることを確認できた。

実施例２．融合タンパク質１乃至６の効果比較
活性化された星状細胞の不活性化効果において、従来の融合タンパク質より優れた効果を確認した融合タンパク質１及び２と融合タンパク質３乃至６の効果を比較して確認しようとした。実施例１と同一の方法で行い、活性化された星状細胞に処理する融合タンパク質の量は０．１２５μＭとした。

その結果、図３に示したように、融合タンパク質３乃至６は、より少ない量のタンパク質量でも著しく高いレベルでα－ＳＭＡとコラーゲンIの発現を減少できることを確認した。

実施例３．Ｉｎｖｉｖｏでの融合タンパク質１及び４と従来のアルブミン－ＲＢＰ融合タンパク質の効果比較
四塩化炭素（ＣＣｌ_４）注射で誘導された肝線維化モデルを用いて融合タンパク質の治療効果を比較評価した。具体的には、ミネラルオイル中に１：１で溶解させた四塩化炭素を１ｍｌ／ｋｇの濃度で週３回、６週間ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射し、前記融合タンパク質（２５μｇ、１２．５μｇ、６．２５μｇ、又は３μｇ）又は食塩水をＣＣｌ_４処理の最後の２週間、１週当たり３回静脈投与した（ｎ＝５匹）。

光学顕微鏡で組織を観察した結果、ミネラルオイルのみを投与した対照群のマウス（ｃｏｎｔｒｏｌ）は、正常な肝構造を示すが、ＣＣｌ_４処理されたマウスでは深刻な肝組織構造の破壊及び線維化を観察できた。また、アルブミンとＲＢＰの融合タンパク質の投与で線維化が改善されることを確認できた（図４ａ）。

ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）によるシリウスレッド染色の定量分析結果、線維化改善効果は、試料によって差を示した（図４ｂ）。従来の融合タンパク質ＲＢＰ－アルブミンIIIの場合、２５μｇ投与群でのみ有意な改善効果を示した一方で、融合タンパク質４は、６．２５μｇ投与でも優れた効果を示した。前記結果から、融合タンパク質１及び４は、従来の融合タンパク質に比べて低い濃度で優れた効果を示すことを確認できた。

以上では、本発明の内容の特定部分を詳細に説明したが、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は、好ましい実施様態に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されると言える。

［産業上の利用可能性］
本発明は、線維症の予防及び治療用医薬品に用いられ、タンパク質治療剤の人体投与用量及び投与頻度を画期的に減少できる汎用的基盤技術になり得ると期待される。

アルブミンIIIとＲＢＰとが結合された融合タンパク質が活性化された星状細胞内に内包されて作用するメカニズムを図式化した図である。本発明の融合タンパク質１及び２と従来の融合タンパク質（ＲＢＰ－アルブミンIII及びアルブミンIII－ＲＢＰ）の活性化された星状細胞の不活性化誘導効果を比較・確認した図である。本発明の融合タンパク質１及び２と融合タンパク質３乃至６の活性化された星状細胞の不活性化誘導効果を比較・確認した図である。肝線維化動物モデルへの融合タンパク質１及び４とＲＢＰ－アルブミン^２投与による肝線維化程度をシリウスレッド組織染色を通じて比較・確認した図である。肝線維化動物モデルへの融合タンパク質１及び４とＲＢＰ－アルブミン^２投与による肝線維化程度をシリウスレッド組織染色を通じて比較・確認した図である。

Claims

配列番号１又は２のアミノ酸配列からなる融合タンパク質。
配列番号３乃至８のうちいずれか一つのアミノ酸配列からなる融合タンパク質。
請求項２の融合タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、配列番号９乃至１４のうちいずれか一つの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
請求項３のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
請求項４の組換えベクターを含む形質転換体。
（１）配列番号３乃至８のうちいずれか一つのアミノ酸配列からなる融合タンパク質を暗号化する遺伝子を含む組換えベクターを製造する段階；
（２）前記組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を製造する段階；
（３）前記形質転換体を培養する段階；及び
（４）前記培養液から融合タンパク質を収得する段階；を含む融合タンパク質の生産方法。
配列番号１乃至８のうちいずれか一つのアミノ酸配列からなる融合タンパク質を含む、線維症の予防又は治療用薬学的組成物。
前記線維症は、肝線維症（ｌｉｖｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓ）、慢性肝炎（ｃｈｒｏｎｉｃｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、肝硬化（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃｃａｎｃｅｒ）、化学療法－関連脂肪肝炎（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ＣＡＳＨ）、肺線維症（ｌｕｎｇｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎臓線維症（ｒｅｎａｌｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎不全（ｒｅｎａｌｆａｉｌｕｒｅ）、膵臓線維症（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓ）、慢性膵炎（ｃｈｒｏｎｉｃｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）及び膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ）からなる群から選ばれる１種以上の疾患であることを特徴とする、請求項７に記載の薬学的組成物。
配列番号１乃至８のうちいずれか一つのアミノ酸配列からなる融合タンパク質を個体に投与する段階を含む、線維症の予防又は治療方法。
線維症の予防又は治療用薬剤を製造するための配列番号１乃至８のうちいずれか一つのアミノ酸配列からなる融合タンパク質の用途。