CN115605502A

CN115605502A - 用于预防或治疗纤维化疾病的重组融合蛋白

Info

Publication number: CN115605502A
Application number: CN202180028847.9A
Authority: CN
Inventors: 吴埈瑞
Original assignee: Cineris Co ltd
Current assignee: Cineris Co ltd
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2021-03-31
Publication date: 2023-01-13
Also published as: EP4137507A1; AU2021255518A1; KR102638021B1; JP2023521906A; WO2021210812A1; KR20210154784A; US20230357356A1; BR112022020350A2; CA3175503A1; EP4137507A4

Abstract

本发明涉及一种可用于预防或治疗发生在肝脏、胰腺、肺等中的纤维化疾病的白蛋白与视黄醇结合蛋白的融合蛋白，本发明的融合蛋白可通过抑制引起组织纤维化的星状细胞的活化或者诱导星状细胞的失活来预防或治疗纤维化疾病，与用于相同目的的现有融合蛋白相比，在低浓度下表现出更优异的效果，因此，本发明的融合蛋白有望成为一种通用的基础技术，可以显着降低蛋白质治疗剂对人体的给药剂量和频率。

Description

用于预防或治疗纤维化疾病的重组融合蛋白

技术领域

本发明涉及一种可用于预防或治疗发生在肝脏、胰腺、肺等中的纤维化疾病的白蛋白与视黄醇结合蛋白的融合蛋白。

背景技术

组织纤维化(fibrosis)导致组织功能衰竭的致命后果。例如，肝纤维化导致肝功能衰竭，然后发展为肝硬化和肝癌，在慢性胰腺炎和胰腺癌中都观察到纤维化组织。目前，尚无针对纤维化疾病的治疗剂，组织移植是最有希望的治疗方法。组织纤维化的分子机制尚未阐明，对纤维化疾病治疗剂的研发是必要的。

最近，发现组织纤维化是由构成组织的细胞之一的星状细胞(stellate cells)的活化过程(活化(activation)及转分化(transdifferentiation))引起的。活化的星状细胞过度表达和积累细胞外基质如胶原蛋白，并分化为肌成纤维细胞(myofibroblast)。这些活化的星状细胞在组织纤维化的发展中起着至关重要的作用。

星状细胞(stellate cell)不仅分布在肝脏中，还分布在胰腺、肺、肾和肠等中，并在调节整个身体的类视黄醇稳态中发挥核心作用。从食物中获得的维生素A(视黄醇)与血流中的视黄醇结合蛋白(Retinol Binding Protein，RBP)结合并循环，通过作为RBP受体的STRA6移动到星状细胞，并以视黄酯的形式储存在细胞质脂肪滴中。另一方面，已知白蛋白抑制其在星状细胞中的活化，并且已经活化的星状细胞中白蛋白的表达转变为活化前的状态。

在先前的研究中，本发明人通过结合RBP与白蛋白制备了一种靶向星状细胞的融合蛋白，并确认了纤维化的预防及治疗效果，该RBP可以通过STRA6进入星状细胞，以抑制星状细胞的活化或使其失活，这是组织纤维化的开始(KR 10-1395394)。

发明内容

技术问题

本发明所要解决的技术问题在于，提高现有RBP-白蛋白融合蛋白对星状细胞的活化抑制或失活的效果，本发明提供一种白蛋白的一个以上氨基酸序列被取代的RBP-白蛋白融合蛋白以及以不同排列方式连接的RBP-白蛋白融合蛋白。

并且，本发明通过提供可表达上述融合蛋白的载体和其中导入了上述载体的转化体来提供本发明的重组蛋白的大量生产方法。

并且，本发明的融合蛋白与现有RBP-白蛋白融合蛋白相比在星状细胞的活化抑制或失活的方面表现出更优异的效果，因此，本发明提供一种包含上述融合蛋白的用于预防或治疗纤维化疾病的组合物。

然而，本发明所要解决的技术问题并不限于如上所述的问题，本领域的普通技术人员通过以下描述将清楚地理解未提及的问题或其他问题。

解决问题的方案

为了解决上述问题，本发明提供一种由序列1或2的氨基酸序列组成或者包含其的融合蛋白。

并且，本发明提供一种由序列3至8中任一氨基酸序列组成或者包含其的融合蛋白。

作为本发明一实例，上述融合蛋白可用于预防或治疗组织纤维化。

并且，本发明提供一种编码上述各融合蛋白的多核苷酸，上述多核苷酸可由序列9至14中任一碱基序列组成或者包含这些。

并且，本发明提供一种包含用于编码上述融合蛋白的基因的重组载体，以及包含上述重组载体的转化体。

并且，本发明提供一种融合蛋白的生产方法，包括：步骤(1)，制备重组载体，上述重组载体包含用于编码由序列1至8中任一氨基酸序列组成的融合蛋白的基因；步骤(2)，通过将上述重组载体导入宿主细胞来制备转化体；步骤(3)，培养上述转化体；以及步骤(4)，从上述培养液中获得融合蛋白。

作为本发明一实例，编码上述融合蛋白的基因可包含由选自由序列9至14组成的组中的一个以上碱基序列组成的多核苷酸。

作为本发明另一实例，上述宿主细胞可以为哺乳动物的细胞，优选地，可以为哺乳动物的癌细胞，更优选地，可以为CHO细胞(CHO cell)。

并且，本发明可提供一种包含由序列1至8中任一氨基酸序列组成的融合蛋白的用于预防或治疗纤维化疾病的药物组合物。

并且，本发明可提供一种纤维化疾病的预防或治疗方法，包括向个体给予由序列1至8中任一氨基酸序列组成的融合蛋白的步骤。

作为本发明一实例，上述个体可以为需要预防或治疗纤维化疾病的人类，尤其，可以为非酒精性脂肪肝病的患者。

作为本发明另一实例，上述方法还可以包括在给药上述融合蛋白之后通过进行CT成像或活检来诊断纤维化程度的步骤。

作为本发明一实例，上述纤维化疾病可以为选自由肝纤维化(liver fibrosis)、慢性肝炎(chronic hepatitis)、肝硬化(cirrhosis)、肝癌(hepatic cancer)、化疗相关脂肪性肝炎(chemotherapy-associated steatohepatitis，CASH)、肺纤维化(lungfibrosis)、肾纤维化(renal fibrosis)、肾衰竭(renal failure)、胰腺纤维化(pancreatic fibrosis)、慢性胰腺炎(chronic pancreatitis)及胰腺癌(pancreaticcancer)组成的组中的一种以上疾病。

并且，本发明提供一种上述融合蛋白在制备用于预防或治疗纤维化疾病的药物中的用途。

发明的效果

本发明的融合蛋白可通过抑制引起组织纤维化的星状细胞的活化或者诱导星状细胞的失活来预防或治疗纤维化疾病，与用于相同目的的现有融合蛋白相比，在低浓度下表现出更优异的效果，因此，本发明的融合蛋白有望成为一种通用的基础技术，可以显着降低蛋白质治疗剂对人体的给药剂量和频率。

附图说明

图1为示出白蛋白III与RBP结合的融合蛋白包含在活化的星状细胞中并起作用的机制的图。

图2为比较并确认本发明的融合蛋白1及2与现有融合蛋白(RBP-白蛋白III及白蛋白III-RBP)对活化的星状细胞的失活诱导效果的图。

图3为比较并确认本发明的融合蛋白1及2与融合蛋白3至6对活化的星状细胞的失活诱导效果的图。

图4a及图4b通过天狼星红组织染色来比较并确认向肝纤维化动物模型给药融合蛋白1及4和RBP-白蛋白后的肝纤维化程度的图。

具体实施方式

白蛋白是一种主要在肝细胞中合成的多功能血浆蛋白。白蛋白具有三个结构域(domain)，每个结构域由两个亚结构域(subdomain)A和B组成。已知白蛋白在分子运动中发挥作用，即，与包括脂肪酸和视黄酸在内的各种疏水物质结合并在血液中运输分子。根据晶体学分析，五个强脂肪酸结合位点不对称分布在白蛋白中(一个在亚结构域IB，一个在IA与IIA之间，两个在IIIA，一个在IIIB)。

在之前的研究中，本发明人制备了一种白蛋白与用于靶向星状细胞的视黄醇结合蛋白(Retinol Binding Protein，RBP)结合的融合蛋白，并确认了上述融合蛋白流入到活化的星状细胞中，以将细胞的形态反向转换为活化前的形态，从而能够预防和治疗纤维化疾病。此外，本发明人已确定视黄酸(retinoic acid，RA)在星状细胞的活化过程中起重要作用，并且融合蛋白通过降低这种RA的细胞内水平来控制星状细胞的活化。因此，为了开发一种能够更稳定地与视黄酸(retinoic acid，RA)结合以诱导星状细胞的活化抑制或失活的融合蛋白，利用白蛋白的序列变异以及多种组合的白蛋白亚结构域(sub-domain)和RBP的排列制备了一种新的白蛋白RBP融合蛋白。

在以往的研究中，在白蛋白的结构域中，结构域III与RBP的融合蛋白对星状细胞的活化抑制或失活效果最好。基于该结果，本发明人尝试制备与视黄酸结合增强的重组融合蛋白。

因此，在现有白蛋白结构域III和RBP融合蛋白中，估计结构域III的第526位和第600位大氨基酸干扰与RA的结合，将其替换为较小尺寸的氨基酸，以确认活化的星状细胞由于与RA结合而失活的效果(参见序列1及2)。

具体地，本发明人将白蛋白结构域III中的第526位氨基酸残基(苯丙氨酸(phenylalanine))和第600位氨基酸残基(缬氨酸(valine))分别替换为缬氨酸(valine)和丙氨酸(alanine)，从而如下设计和制备了融合蛋白1及2。

-融合蛋白1：RBP(1～193)+白蛋白III{404～526(F→V)～600(V→A)～601}

-融合蛋白2：白蛋白[信号肽(signal peptide)(1～18)+III{404～526(F→V)～600(V→A)～601}]+RBP(17～192)

并且，本发明人确认白蛋白的亚结构域(sub-domain)IB和IIIA与视黄酸非常稳定地结合，并如下设计和制备了融合蛋白3至6。

-融合蛋白3：RBP(1～193)+白蛋白[IIIA{404～517(V)}+IB(131～218)]

-融合蛋白4：RBP(1～193)+白蛋白[IIIA{404～517(V)}+IB(134～218)]

-融合蛋白5：白蛋白[信号肽(signal peptide)(1～18)+IIIA{404～517(V)}+IB(131～218)]+RBP(17～192)

-融合蛋白6：白蛋白[信号肽(signal peptide)(1～18)+IIIA{404～517(V)}+IB(134～218)]+RBP(17～192)

接着，本发明人用制备的融合蛋白1或2处理活化的星状细胞以测量作为星状细胞活化标志物的α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和I型胶原蛋白(collagen type I)的表达水平，从而比较并确认了先前开发的融合蛋白(RBP-白蛋白III和白蛋白III-RBP)和星状细胞的失活作用。结果证实，与先前开发的融合蛋白相比，本发明的融合蛋白1及2可以将α-SMA和I型胶原蛋白(collagen I)的表达从低浓度降低至高水平(参见实施例1)。

由此，本发明人确认了当白蛋白III的526a.a和600a.a被小分子量氨基酸取代时，与视黄酸的结合力增加，可以更有效地诱导星状细胞的失活。

因此，本发明可将第526位和第600位氨基酸分别独立地取代的白蛋白与RBP结合的融合蛋白用于纤维化疾病的治疗，在上述融合蛋白中，可以定位为白蛋白III的第526位氨基酸残基的氨基酸可以是缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸，可以定位为第600位氨基酸残基的氨基酸可以是丙氨酸、甘氨酸，并且上述融合蛋白可以由序列1或2的氨基酸序列组成或包含这些。

接着，本发明人比较并确认了融合蛋白1及2与融合蛋白3至6的α-SMA和I型胶原蛋白(collagen I)表达抑制效果，其显示出比现有融合蛋白更优异的抑制星状细胞活化过程的效果。结果证实，融合蛋白3至6即使在较低浓度下也能有效抑制星状细胞的活化(实施例2)。

同时，本发明人使用四氯化碳引起的肝纤维化动物模型，确认了融合蛋白1及4与现有融合蛋白(RBP-白蛋白III)之间的肝纤维化改善效果，结果证实，融合蛋白1及4可以在比RBP-白蛋白III更低的浓度下更有效地改善纤维化(实施例3)。

因此，本发明人可以提供一种用于预防或治疗纤维化疾病的药物组合物，其包含选自由开发的上述融合蛋白1至6组成的组中的一种以上融合蛋白，并且可以提供一种纤维化疾病的预防或治疗方法，其包括向个体给予选自由融合蛋白1至6组成的组中的两种以上融合蛋白。

已确认本发明的融合蛋白1至6可以以低于现有RBP与白蛋白的融合蛋白的浓度有效地诱导活化的星状细胞的失活，本发明的药物组合物有望成为一种通用的基础技术，可以显着降低蛋白质治疗剂对人体的给药剂量和频率。

在本发明中，“纤维化疾病”是指由于正常组织被破坏并被纤维结缔组织替代的纤维化(fibrosis)而使器官因纤维化而不能发挥功能的疾病，包括肝纤维化(liverfibrosis)、慢性肝炎(chronic hepatitis)、肝硬化(cirrhosis)、肝癌(hepatic cancer)、化疗相关脂肪性肝炎(chemotherapy-associated steatohepatitis，CASH)、肺纤维化(lung fibrosis)、肾纤维化(renal fibrosis)、肾衰竭(renal failure)、胰腺纤维化(pancreatic fibrosis)、慢性胰腺炎(chronic pancreatitis)及胰腺癌(pancreaticcancer)，只要是由器官的一部分硬化的纤维化引起的疾病，则不限于此。

在本发明中，“个体”只要是哺乳动物就没有限定，优选地，可以为人或家畜。

在本发明中，预防是指通过给药本发明的药物组合物来延缓纤维化疾病的发生或组织纤维化的任何行为，治疗是指通过给药本发明的药物组合物来使纤维化疾病的症状好转或有利地改变的任何行为。

在本发明中，用于形成上述融合蛋白的白蛋白可以来自任何物种，但优选来自与待给药个体相同的物种(species)，以避免免疫原性的风险。

在本发明中，药物组合物(pharmaceutical composition)除融合蛋白1至6外，还可以进一步包含一种以上已知的能够预防或治疗组织纤维化的物质，还可包含通常用于制备药物组合物的合适的载体、赋形剂和稀释剂。

在本发明中，“载体”也称为运载体(vehicle)，是指促进蛋白质或肽添加到细胞或组织中的化合物，例如，二甲基亚砜(DMSO)是一种助于将许多有机物质导入生物体的细胞或组织中的常用的载体。

在本发明中，“稀释剂(diluent)”定义为在水中稀释的化合物，该化合物不仅可以稳定目标蛋白质或肽的生物活性形式，而且可以溶解该蛋白质或肽。溶解在缓冲溶液中的盐在本领域用作稀释剂。一种常用的缓冲溶液是磷酸盐缓冲生理盐水，因为它模拟了人体溶液的盐态。因为缓冲盐可以在低浓度下控制溶液的pH值，所以缓冲稀释剂很少改变化合物的生物活性。如本文所用，含有壬二酸的化合物可以原样或者与用于联合治疗的其他成分或合适的载体或赋形剂混合的药物组合物施用于人类患者。

并且，本发明的用于预防或治疗纤维化疾病的药物组合物分别按照常规方法配制成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等外用剂和无菌注射液剂型，本发明的抗菌组合物可以根据需要的方法口服或肠胃外给药(例如，静脉内、皮下、腹腔内或局部给药)，剂量根据患者的状况和体重、疾病的严重程度、药物剂型、给药途径及持续时间而变化，但是本领域技术人员可以适当地选择，例如，可以以与药学上可接受的载体混合的形式给药约0.001mg至1000mg。本发明的抗菌组合物可以根据需要每天给药一次至数次，可以单独使用或与使用手术、激素疗法、药物疗法及生物反应调节剂的方法联合使用。

另一方面，本发明的重组融合蛋白的氨基末端可以与乙酰基、芴基甲氧基羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂基及聚乙二醇(PEG)等保护基结合，肽的羧基末端可以用羟基(-OH)、氨基(-NH₂)、叠氮基(-NHNH₂)等修饰。

并且，脂肪酸(fatty acids)、寡糖链(oligosaccharides chains)、所有纳米颗粒(金颗粒、脂质体、肝素、水凝胶等)、氨基酸、载体蛋白(carrier proteins)都可以与本发明的融合蛋白末端或氨基酸的R-残基(R-group)结合。上述氨基酸的修饰用于改善本发明蛋白质的效力(potency)和稳定性。

如本文所用，术语“稳定性”不仅指体内(in vivo)稳定性，还指储存稳定性(包括在室温、冷藏和冷冻储存下的储存稳定性)。

另一方面，本发明提供一种上述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)，制备重组载体，上述重组载体包含用于编码由序列3至8中任一氨基酸序列组成的融合蛋白的基因；

步骤(2)，通过将上述重组载体导入宿主细胞来制备转化体；

步骤(3)，培养上述转化体；以及

步骤(4)，从上述培养液中获得融合蛋白。

如本文所用，术语“基因”应以其最广泛的意义来考虑，并且旨在编码结构蛋白或调节蛋白，只要是编码本发明的融合蛋白1至6的DNA片段，则不做限定，具体可以包含序列9至14中任一碱基序列。

并且，在本发明中，“载体(vector)”是指含有可操作地连接到能够在合适宿主中表达DNA的合适调节序列的DNA序列的DNA制备物。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅是潜在的基因组插入物。一旦转化到合适的宿主中，载体就可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者在某些情况下可以整合到基因组本身中。由于质粒是目前最常用的载体形式，因此在本说明书中有时可以互换使用质粒(plasmid)和载体(vector)。

当一个碱基序列与另一个碱基序列形成功能关系时，它是“可操作地链接”的。它可以是当合适的分子(例如，转录激活蛋白)与(多个)调节序列结合时以使基因表达的方式连接的基因和(多个)调节序列。例如，如果针对前序列(pre-sequence)或分泌前导(leader)的DNA作为参与多肽分泌的前蛋白表达，则它与针对多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或者，如果核糖体的结合部位影响序列的转录，则核糖体结合位点与编码序列可操作地连接；或者当定位以促进翻译时，核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。一般而言，“可操作地连接”是指连接的DNA序列是接触的，并且在分泌前导的情况下，是指接触的并且存在于阅读框中。然而，增强子(enhancer)不需要接触。这些序列的连接是通过在方便的限制酶位点处连接(ligation)来完成的。当这样的位点不存在时，使用根据常规方法合成的寡核苷酸接头(oligonucleotide adaptor)或衔接物(linker)。

并且，如本文所用，“转化”或“转染”是指将DNA导入宿主，使得DNA可以作为染色体外因子复制或通过染色体整合完成复制，在本发明中，用于制备融合蛋白使用的宿主细胞为CHO细胞，但不限于此。

发明的实施方式

本发明可以有多种变形，并且可以具有多种实施例，以下，在附图中例示特定实施例并在详细说明中进行详细说明。然而，这并不意在将本发明限制于特定实施方式，应理解，包括本发明的精神和技术范围内所包含的所有修改、等同物和替代物。在描述本发明时，如果判断为相关公知技术的详细描述可能混淆本发明的主旨，则将省略其详细描述。

实验方法

1.肝星状细胞(Hepatic stellate cells，HSCs)的分离及培养

首先，用磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate-buffered saline，PBS)灌注14周龄雄性BALB/c小鼠的肝脏，再用含有胶原酶(collagenase)、链霉蛋白酶(pronase)及DNase的格氏平衡盐溶液(Gey's balanced salt solution，GBSS)灌注后，提取肝脏。去除附着在肝脏上的胆囊和结缔组织，然后将肝细胞悬液置于与GBSS相同的溶液中，并在37℃下处理12分钟后，在13.4％密度梯度离心剂(Nycodenz)梯度下以1400g离心20分钟。取密度梯度离心剂(Nycodenz)溶液与水层之间界面上的星状细胞，并在补充有10％胎牛血清(FBS)的杜贝克改良鹰培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)(Carlsbad，CA)中培养。星状细胞的纯度通过显微镜观察和使用抗酪氨酸氨基转移酶抗体(anti-tyrosineaminotransferase antibody)的蛋白质印迹(western blotting)来评价。当细胞在培养皿中汇合(confluent)时，将它们传代培养并用作活化的星状细胞。通过形态学变化和α-SMA和I型胶原蛋白(collagen I)的表达增加确认了肝星状细胞的活化。

2.融合蛋白的设计及制备

2-1.融合蛋白的设计

为了增强与视黄酸的结合力而设计的融合蛋白1至6的具体信息如下表1所示。小写字母表示的氨基酸表示信号肽(signal peptide)的序列，白蛋白III中取代的氨基酸用粗体字母和下划线表示，下划线表示的氨基酸表示RBP。

表1

2-2.融合蛋白的制备

制备编码为了制备融合蛋白而设计的融合蛋白1至6的多核苷酸，并将每个DNA片段克隆到XbaI/KpnI cut pcDNA3.1(+)载体中以制备重组表达载体。关于编码每种融合蛋白的DNA片段的具体信息总结在下表2中。使用脂质体2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)将每种载体导入CHO细胞中，以制备表达融合蛋白的转化体。通过培养上述转化体表达和分泌的融合蛋白通过亲和层析(affinity chromatography)和HPLC法进行纯化和使用。

表2

3.实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)

使用TRIzol(Ambion，Austin，TX，USA)准备总RNA并制备cDNA。使用ABIQuantStudio TM 3实时荧光定量PCR系统(ABI QuantStudio TM 3Real-Time PCR System)进行qRT-PCR。为了控制反应的变化，将PCR产物标准化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的mRNA水平。

4.肝纤维化动物模型的制备

将按1：1的比例溶解在矿物油中的CCl₄以1mL/kg的浓度注射到BALB/c小鼠腹腔内6周，每周3次，以制备肝损伤诱导的肝纤维化小鼠模型。对照组仅给药相同量的矿物油。在最后一次注射CCl₄后48小时处死小鼠。

为了评价处死小鼠的纤维化，取出肝脏，将各实验组的肝脏组织固定在10％缓冲福尔马林中并包埋在石蜡中，制备组织切片。为了进行组织学分析，组织切片用天狼星红(Sirius red)染色，然后用光学显微镜观察。

5.统计分析

结果表示为平均值±标准偏差(SD)。使用t检验(t-tests)进行统计分析。为了比较，在P<0.05时检验了显著性，并对P值进行了双边检验。

实验结果

实施例1.融合蛋白1及2与现有白蛋白-RBP融合蛋白的效果比较

将在前期研究中对星状细胞的活化抑制或失活表现出优异效果的RBP-白蛋白III及白蛋白III-RBP与实施例2中设计的融合蛋白1及2进行比较。具体地，用0.25μM的每种融合蛋白处理活化的小鼠肝星状细胞20小时，并使用实时PCR(real-time PCR)测量α-SMA和I型胶原蛋白(collagen I)的表达水平。现有融合蛋白(RBP-白蛋白III及白蛋白III-RBP)是KR 10-1395394中的R-III和III-R融合蛋白。

结果，如图2所示，确认了融合蛋白1及2比现有融合蛋白更能降低α-SMA和I型胶原蛋白(collagen I)的mRNA表达。

实施例2.融合蛋白1至6的效果比较

将在活化的星状细胞的失活效果中确认了优于现有融合蛋白的效果的融合蛋白1及2与融合蛋白3至6的效果进行比较并确认。除了处理活化的星状细胞的融合蛋白的量设定为0.125μM之外，以与实施例1相同方法进行。

结果，如图3所示，确认了融合蛋白3至6即使在蛋白质的量少的情况下也能够将α-SMA和I型胶原蛋白(collagen I)的表达降低到非常高的水平。

实施例3.融合蛋白1及4与现有白蛋白-RBP融合蛋白在体内(In vivo)的效果比较

使用通过注射四氯化碳(CCl₄)诱导的肝纤维化模型对融合蛋白的治疗效果进行了比较并评价。具体地，将按1：1的比例溶解在矿物油中的四氯化碳以1ml/kg的浓度注射到BALB/c小鼠腹腔内6周，每周3次，并在最后一次注射CCl₄后静脉内给药上述融合蛋白(25μg、12.5μg、6.25μg或3μg)或生理盐水2周，每周3次(n＝5只)。

用光学显微镜观察组织的结果，仅给药矿物油的对照组的小鼠(control)表现出正常的肝脏结构，而用CCl₄处理的小鼠表现出严重的肝组织结构损伤和纤维化。并且，可以确认白蛋白与RBP的融合蛋白的给药改善纤维化(图4a)。

使用ImageJ软件(NIH)对天狼猩红(Siruis red)染色进行定量分析的结果，改善纤维化的效果因试样而异(图4b)。现有融合蛋白RBP-白蛋白III仅在25μg给药组中显示出显着改善效果，而融合蛋白4在6.25μg给药组中也显示出优异的效果。从上述结果可以确认，融合蛋白1及4与现有融合蛋白相比，在低浓度下表现出优异的效果。

以上对本发明内容的特定部分进行了详细描述，对于本领域的普通技术人员来而言，该具体描述仅为优先实施方式且本发明的范围并不限于此是显而易见的。因此，本发明的实质范围将由所附发明要求保护范围及其等同物来定义。

产业上的可利用性

本发明有望成为一种通用的基础技术，通过用作预防及治疗纤维化疾病的药物，可以显着降低蛋白质治疗剂对人体的给药剂量和给药频率。

<110> 高丽大学校产学协力团

<120> 用于预防或治疗纤维化疾病的重组融合蛋白

<130> OPK21-0258-PC

<150> KR 10-2020-0044982

<151> 2020-04-14

<150> KR 10-2021-0040819

<151> 2021-03-30

<160> 14

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 391

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> fusion protein 1_varient

<220>

<221> VARIANT

<222> (316)

<223> X is one of valine, alanine, and glycine

<220>

<221> VARIANT

<222> (390)

<223> X is alanine or glycine

<400> 1

Met Lys Trp Val Trp Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Ala Ala Ala

1 5 10 15

Glu Arg Asp Cys Arg Val Ser Ser Phe Arg Val Lys Glu Asn Phe Asp

20 25 30

Lys Ala Arg Phe Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Met Ala Lys Lys Asp Pro

35 40 45

Glu Gly Leu Phe Leu Gln Asp Asn Ile Val Ala Glu Phe Ser Val Asp

50 55 60

Glu Thr Gly Gln Met Ser Ala Thr Ala Lys Gly Arg Val Arg Leu Leu

65 70 75 80

Asn Asn Trp Asp Val Cys Ala Asp Met Val Gly Thr Phe Thr Asp Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Ala Lys Phe Lys Met Lys Tyr Trp Gly Val Ala Ser Phe

100 105 110

Leu Gln Lys Gly Asn Asp Asp His Trp Ile Val Asp Thr Asp Tyr Asp

115 120 125

Thr Tyr Ala Val Gln Tyr Ser Cys Arg Leu Leu Asn Leu Asp Gly Thr

130 135 140

Cys Ala Asp Ser Tyr Ser Phe Val Phe Ser Arg Asp Pro Asn Gly Leu

145 150 155 160

Pro Pro Glu Ala Gln Lys Ile Val Arg Gln Arg Gln Glu Glu Leu Cys

165 170 175

Leu Ala Arg Gln Tyr Arg Leu Ile Val His Asn Gly Tyr Cys Asp Gly

180 185 190

Arg Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu

195 200 205

Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg

210 215 220

Tyr Thr Lys Lys Val Pro Glu Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val

225 230 235 240

Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu

245 250 255

Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn

260 265 270

Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr

275 280 285

Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala

290 295 300

Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Xaa Asn Ala Glu Thr

305 310 315 320

Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln

325 330 335

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<212> DNA

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tttagcgtgg atgagacagg ccagatgtct gctaccgcca agggcagagt gcgcctgctg 240

aacaattggg acgtgtgcgc tgacatggtg ggcaccttca cagataccga ggacccagcc 300

aagtttaaga tgaagtattg gggcgtggct agctttctgc agaagggcaa cgacgatcac 360

tggatcgtgg acacagatta cgacacctat gccgtgcagt acagctgcag actgctgaac 420

ctggatggca catgtgctga ctcttattcc ttcgtgtttt ctcgcgatcc aaatggcctg 480

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<212> DNA

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<212> DNA

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tacgctatgg ccaagaagga ccccgagggc ctgttcctgc aggacaatat cgtggctgag 180

tttagcgtgg atgagacagg ccagatgtct gctaccgcca agggcagagt gcgcctgctg 240

aacaattggg acgtgtgcgc tgacatggtg ggcaccttca cagataccga ggacccagcc 300

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ctgctggtgc ggtataccaa gaaggtgcca gaggtgtcca cacccaccct ggtggaggtg 720

agcaggaatc tgggcaaggt cggctctaag tgctgtaagc accctgaggc taagcggatg 780

ccatgcgccg aggattacct gtctgtggtg ctgaaccagc tgtgcgtgct gcatgagaag 840

acacccgtgt ccgacagagt gacaaagtgc tgtaccgagt ccctggtgaa caggcggccc 900

tgcttcagcg ccctggaggt ggacgataac ccaaatctgc ccagactggt gcgcccagag 960

gtggatgtga tgtgcacagc tttccacgac aatgaggaga cctttctgaa gaagtacctg 1020

tatgagatcg ccagacgcca tccctacttt tatgctcctg agctgctgtt ctttgccaag 1080

cggtacaagg ctgccttcac agagtgctgt caggctgctg acaaggctgc ttgcctgctg 1140

ccaaagctgg atgagctgag ggacgagggc aaggcttctt ccgcc 1185

<210> 12

<211> 1176

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DNA encoding fusion protein 4

<400> 12

atgaagtggg tgtgggctct gctgctgctg gctgcttggg ccgctgccga gagagattgc 60

cgcgtgtcca gcttcagagt gaaggagaac ttcgacaagg cccgcttttc cggcacctgg 120

tacgctatgg ccaagaagga ccccgagggc ctgttcctgc aggacaatat cgtggctgag 180

tttagcgtgg atgagacagg ccagatgtct gctaccgcca agggcagagt gcgcctgctg 240

aacaattggg acgtgtgcgc tgacatggtg ggcaccttca cagataccga ggacccagcc 300

aagtttaaga tgaagtattg gggcgtggct agctttctgc agaagggcaa cgacgatcac 360

tggatcgtgg acacagatta cgacacctat gccgtgcagt acagctgcag actgctgaac 420

ctggatggca catgtgctga ctcttattcc ttcgtgtttt ctcgcgatcc aaatggcctg 480

ccccctgagg cccagaagat cgtgaggcag aggcaggagg agctgtgcct ggctaggcag 540

taccggctga tcgtgcataa tggctattgt gacggcaggc tggtggagga gccccagaac 600

ctgatcaagc agaattgcga gctgttcgag cagctgggcg agtacaagtt tcagaacgcc 660

ctgctggtgc ggtataccaa gaaggtgcca gaggtgtcca cacccaccct ggtggaggtg 720

agcaggaatc tgggcaaggt cggctctaag tgctgtaagc accctgaggc taagcggatg 780

ccatgcgccg aggattacct gtctgtggtg ctgaaccagc tgtgcgtgct gcatgagaag 840

acacccgtgt ccgacagagt gacaaagtgc tgtaccgagt ccctggtgaa caggcggccc 900

tgcttcagcg ccctggaggt gccaaatctg cccagactgg tgcgcccaga ggtggatgtg 960

atgtgcacag ctttccacga caatgaggag acctttctga agaagtacct gtatgagatc 1020

gccagacgcc atccctactt ttatgctcct gagctgctgt tctttgccaa gcggtacaag 1080

gctgccttca cagagtgctg tcaggctgct gacaaggctg cttgcctgct gccaaagctg 1140

gatgagctga gggacgaggg caaggcttct tccgcc 1176

<210> 13

<211> 1188

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DNA encoding fusion protein 5

<400> 13

atgaagtggg tgacattcat cagcctgctg ttcctgttct cctccgccta ctctctggtg 60

gaggagcccc agaacctgat caagcagaat tgcgagctgt tcgagcagct gggcgagtac 120

aagtttcaga acgccctgct ggtgaggtat accaagaagg tgccagaggt gtccaccccc 180

acactggtgg aggtgagcag gaatctgggc aaggtcggct ctaagtgctg taagcaccct 240

gaggccaagc ggatgccatg cgctgaggat tacctgtccg tggtgctgaa ccagctgtgc 300

gtgctgcatg agaagacacc tgtgagcgac agggtgacaa agtgctgtac cgagtctctg 360

gtgaacaggc ggccctgctt ctccgctctg gaggtggacg ataacccaaa tctgcccaga 420

ctggtgcgcc cagaggtgga tgtgatgtgc acagctttcc acgacaatga ggagaccttt 480

ctgaagaagt acctgtatga gatcgccaga cgccatccct acttttatgc tcctgagctg 540

ctgttctttg ccaagcggta caaggctgcc ttcacagagt gctgtcaggc tgctgacaag 600

gctgcttgcc tgctgccaaa gctggatgag ctgagggacg agggcaaggc ttcttccgcc 660

gagagagatt gccgcgtgtc cagcttcaga gtgaaggaga acttcgacaa ggcccgcttt 720

tccggcacct ggtacgctat ggccaagaag gaccccgagg gcctgttcct gcaggacaat 780

atcgtggctg agtttagcgt ggatgagaca ggccagatgt ctgctaccgc caagggcaga 840

gtgcgcctgc tgaacaattg ggacgtgtgc gctgacatgg tgggcacctt cacagatacc 900

gaggacccag ccaagtttaa gatgaagtat tggggcgtgg ctagctttct gcagaagggc 960

aacgacgatc actggatcgt ggacacagat tacgacacct atgccgtgca gtacagctgc 1020

agactgctga acctggatgg cacatgtgct gactcttatt ccttcgtgtt ttctcgcgat 1080

ccaaatggcc tgccccctga ggcccagaag atcgtgaggc agaggcagga ggagctgtgc 1140

ctggctaggc agtaccggct gatcgtgcat aatggctatt gtgacggc 1188

<210> 14

<211> 1179

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DNA encoding fusion protein 6

<400> 14

atgaagtggg tgacattcat cagcctgctg ttcctgttct cctccgccta ctctctggtg 60

gaggagcccc agaacctgat caagcagaat tgcgagctgt tcgagcagct gggcgagtac 120

aagtttcaga acgccctgct ggtgaggtat accaagaagg tgccagaggt gtccaccccc 180

acactggtgg aggtgagcag gaatctgggc aaggtcggct ctaagtgctg taagcaccct 240

gaggccaagc ggatgccatg cgctgaggat tacctgtccg tggtgctgaa ccagctgtgc 300

gtgctgcatg agaagacacc tgtgagcgac agggtgacaa agtgctgtac cgagtctctg 360

gtgaacaggc ggccctgctt ctccgctctg gaggtgccaa atctgcccag actggtgcgc 420

ccagaggtgg atgtgatgtg cacagctttc cacgacaatg aggagacctt tctgaagaag 480

tacctgtatg agatcgccag acgccatccc tacttttatg ctcctgagct gctgttcttt 540

gccaagcggt acaaggctgc cttcacagag tgctgtcagg ctgctgacaa ggctgcttgc 600

ctgctgccaa agctggatga gctgagggac gagggcaagg cttcttccgc cgagagagat 660

tgccgcgtgt ccagcttcag agtgaaggag aacttcgaca aggcccgctt ttccggcacc 720

tggtacgcta tggccaagaa ggaccccgag ggcctgttcc tgcaggacaa tatcgtggct 780

gagtttagcg tggatgagac aggccagatg tctgctaccg ccaagggcag agtgcgcctg 840

ctgaacaatt gggacgtgtg cgctgacatg gtgggcacct tcacagatac cgaggaccca 900

gccaagttta agatgaagta ttggggcgtg gctagctttc tgcagaaggg caacgacgat 960

cactggatcg tggacacaga ttacgacacc tatgccgtgc agtacagctg cagactgctg 1020

aacctggatg gcacatgtgc tgactcttat tccttcgtgt tttctcgcga tccaaatggc 1080

ctgccccctg aggcccagaa gatcgtgagg cagaggcagg aggagctgtg cctggctagg 1140

cagtaccggc tgatcgtgca taatggctat tgtgacggc 1179

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，由序列1或2的氨基酸序列组成。

2.一种融合蛋白，其特征在于，由序列3至8中任一氨基酸序列组成。

3.一种多核苷酸，编码权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，上述多核苷酸由序列9至14中任一碱基序列组成。

4.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种转化体，其特征在于，包含权利要求4所述的重组载体。

6.一种融合蛋白的生产方法，其特征在于，包括：

步骤(2)，通过将上述重组载体导入宿主细胞来制备转化体；

步骤(3)，培养上述转化体；以及

步骤(4)，从上述培养液中获得融合蛋白。

7.一种用于预防或治疗纤维化疾病的药物组合物，其特征在于，包含由序列1至8中任一氨基酸序列组成的融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的用于预防或治疗纤维化疾病的药物组合物，其特征在于，上述纤维化疾病为选自由肝纤维化、慢性肝炎、肝硬化、肝癌、化疗相关脂肪性肝炎、肺纤维化、肾纤维化、肾衰竭、胰腺纤维化、慢性胰腺炎及胰腺癌组成的组中的一种以上疾病。

9.一种纤维化疾病的预防或治疗方法，其特征在于，包括向个体给予由序列1至8中任一氨基酸序列组成的融合蛋白的步骤。

10.一种由序列1至8中任一氨基酸序列组成的融合蛋白在制备用于预防或治疗纤维化疾病的药物中的用途。