KR101947902B1

KR101947902B1 - 간 섬유화 예방 또는 치료용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 간 섬유화 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101947902B1
Application number: KR1020170060995A
Authority: KR
Inventors: 한충성; 우동훈; 조건식; 김정성; 안근호; 전혜련
Original assignee: (주) 넥셀
Priority date: 2017-05-17
Filing date: 2017-05-17
Publication date: 2019-02-13
Also published as: KR20180126236A; EP3424944A1; JP6904602B2; JP2019521638A; JP2020005649A; CN109661405A; EP3424944A4; JP6585296B2; WO2018212372A1; CN109661405B

Abstract

본 발명은 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질을 기반으로 재조합된 단백질로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 조직섬유화 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 비롯한 해당 재조합 단백질을 포함하는 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
이를 통해, 본 발명은 기존의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질에 비해 조직섬유화 예방 또는 치료기능의 수준이 현저히 개선되어 조직섬유화의 예방 및 치료를 통한 회복 수준이 정상 조직에 매우 가깝게 이루어질 수 있다.

Description

간 섬유화 예방 또는 치료용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 간 섬유화 예방 또는 치료용 조성물 {RECOMBINANT PROTEIN FOR TREATMENT OR PREVENTION AND COMPOSITON FOR TREATMENT OR PREVENTION CONTAINING THEREOF}

본 발명은 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질을 기반으로 재조합된 조직섬유화 예방 또는 치료용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

간 섬유화 및 간 경화를 포함한 만성 간질환에 대한 치료법은 간 이식이 유일한 방법이나, 간 이식을 위한 공여자를 구하기 어려운 실정이다. 이런 이유로, 현재 간 이식을 제외한 만성 간질환의 치료에 우루소디옥시콜린산(Ursodeoxycholic acid, UDCA) 및 실리마린(Silymarin)을 포함한 화합물을 성분으로 하는 약물들이 사용되고는 있다.

하지만, 이들 화합물은 간세포의 손상을 방지하는 효과를 보이는 치료 보조제에 불과하여 간 질환을 치료하는 근본적인 치료제로 적용되지 못함에 따라 효과적인 만성 간질환 치료제 개발이 절실한 실정이다.

또한, 최근 S-아데노실메티오닌(S-adenosylmethionine), 로시글리타존 (Rosiglitazone), 피오글리타존(Pioglitazone), 로자탄(Losartan) 등 항섬유화 효과를 보이는 화합물이 임상 시험 중에 있으나, 이들 화합물들 역시 임상 시험에서 뚜렷한 질병 개선 효과를 보이지 못하는 실정으로 만성 간질환을 포함한 조직 섬유화를 치유할 수 있는 약물의 개발이 절실한 실정이다.

이와 관련하여 본 발명의 출원인은 대한민국 공개특허공보 10-2017-0013621호의 "Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8)을 이용한 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물"에 따른 선행문헌을 통해 TGFβ/Smad 신호전달경로를 통해 유도된 콜라겐의 발현 감소, 간성상세포의 활성 억제를 통한 간섬유화 호전, 간섬유화 질환 모델에서의 간섬유화 정도를 감소 및 체외 배양된 간성상세포 활성화 억제 등의 특성을 기반으로 한 간, 폐, 신장, 뇌, 심장 또는 횡경막 등에서의 조직섬유화의 예방 또는 치료를 위한 조성물을 제시한 바 있다.

이와 같은 단백질 치료제는 기존 저분자 화합물에 비하여 생체 친화적이며, 부작용이 적고, 대량 생산 등 품질관리가 쉬우며, 임상 시험에서 신약 성공률이 2배 높은 장점이 있다.

하지만 본 출원인은 기존의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8)을 이용한 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물에 의해 제공되는 조직섬유화 예방 또는 치료 기능의 수준에 그치지 않고 더욱 기능적 개선이 이루어질 수 있도록 하여 조직섬유화가 일어나지 않은 정상에 매우 가까운 수준으로까지 항조직섬유화 기능이 제공될 수 있도록 하고자 한다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 창작된 것으로써, 본 발명의 목적은 기존의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질에 비해 조직섬유화 예방 또는 치료기능을 개선시켜 조직섬유화의 수준이 정상적 수준에 매우 가깝게 회복 가능한 정도의 항조직섬유화 기능을 갖춘 재조합 단백질 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 조직섬유화 예방 또는 치료용 재조합 단백질은, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질을 기반으로 재조합된 단백질로서, 하기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진다.

아울러, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물은, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질을 기반으로 재조합된 단백질로서, 하기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루진 재조합 단백질을 유효성분으로 포함한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질을 기반으로 하기 서열번호 1의 아미노산 서열과 같이 재조합된 단백질을 코딩하는 유전자를 또 다른 하나의 양태로서 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질을 기반으로 하기 서열번호 1의 아미노산 서열과 같이 재조합된 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 또 다른 하나의 양태로서 제공한다.

본 발명에 의하면 다음과 같은 효과가 있다.

첫째, 기존의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질에 비해 조직섬유화 예방 또는 치료기능의 수준이 현저히 개선되어 조직섬유화의 예방 및 치료를 통한 회복 수준이 정상 조직에 매우 가깝게 이루어질 수 있다.

둘째, 저분자 화합물 형태의 종래 조직섬유화 예방 또는 치료제에 비해 생체 친화적이며, 부작용이 적은 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

셋째, 대량생산 및 품질관리가 용이한 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

넷째, 앞서 설명된 효과들을 통해 단순한 조직섬유화 예방 또는 치료용 보조제가 아닌 근본적 만성 간질환 치료 용도의 제공이 가능해진다.

도1은 본 발명의 NP-011을 코딩하는 유전자가 A부위에 삽입될 수 있으며, HEK293로의 형질도입을 위한 Backbone Vector(pLGCF vector)의 구조를 도시하고 있다.
도2는 도1에 표시된 A부위에 삽입될 수 있으며, 본 발명의 NP-011을 코딩하는 유전자의 DNA 염기 서열을 도시하고 있다.
도3은 본 발명의 NP-011을 코딩하는 유전자를 포함하는 pLGCF vector를 HEK293로 형질도입한 뒤 분리 정제된 NP-011의 전기영동을 통한 쿠마시 브릴리언트블루 (Coomassie brilliant blue, CBB) 염색 및 웨스턴 블로팅(Western Blotting) 결과도이다.
도4는 본 발명의 NP-011를 이루는 아미노산 서열을 도시하고 있다.
도5는 정상군, 질병 대조군(Sham), MFG-E8 적용군, NP-011 적용군의 간조직 형태 염색 결과를 나타내는 사진이다.
도6은 정상군, 질병 대조군(Sham), MFG-E8 적용군, NP-011 적용군의 간조직 내 COL1A1의 발현 양상을 분석한 결과도이다.
도7은 정상군, 질병 대조군(Sham), MFG-E8 적용군, NP-011 적용군의 간조직 내 COL1A2의 발현 양상을 분석한 결과도이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조하여 더 구체적으로 설명하되, 이미 주지된 기술적 부분에 대해서는 설명의 간결함을 위해 생략하거나 압축하기로 한다.

1. Milk fat globule- EGF factor 8( MFG -E8) 단백질에 기반을 둔 재조합 단백질 NP-011의 클로닝(Cloning) 및 분리 정제 방법에 관한 설명

본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질에 기반을 둔 재조합 단백질 NP-011의 클로닝(Cloning) 및 분리 정제가 어떠한 과정으로 이루어지는지에 대해 도1 내지 도4를 참조하여 상세하게 설명한다.

먼저, MFG-E8 단백질 구조 개량을 위해 Origene사의 MFG-E8 (NM_005928) Human cDNA Clone (Cat. No. RG217163)을 구입하여 주형(template)로 사용하여 PCR을 진행하여 도2와 같은 DNA fragments를 생성하였다.

그 후, Mammalian expression vector이며, 도1에 도시된 바와 같은 구조를 갖춘 pLGCF vector의 HindIII 및 SalI 제한 효소 사이트(도1의 A부위)에 PCR 증폭을 통해 수득한 도2의 DNA fragments를 삽입하는 클로닝을 진행하였다.

다음으로, plasmid DNA를 추출하여 HEK 293 세포로 형질도입 (Transfection)하여 2일 후에 배양액을 모아서 FLAG resin으로 면역침강반응 (Immunoprecipitation, IP)하여 웨스턴 블로팅(Western Blotting)으로 NP-011에 해당하는 단백질 발현을 확인하였다.

또한, 발현을 확인한 plasmid DNA를 maxi prep을 통하여 대량 확보한 후 HEK 293 세포를 준비하여 대량의 plasmid DNA를 HEK 293 세포에 형질 도입함에 따라 NP-011에 해당하는 단백질의 대량 생산을 수행하였다.

구체적으로는 corning사의 CellSTACK cell culture chamber 10개를 준비하여 HEK 293 세포를 도포한 후 1600㎍의 plasmid DNA와 3200ul의 Transfection reagents를 혼합하여 상온에서 15분간 혼합한 후, 형질도입을 수행하였고 형질도입 4시간 뒤에 배양액을 교체해 주고 6일간 추가 배양하였으며 배양액은 2일 마다 총 3번 수거하여 수거된 배양액에서 affinity 방식을 이용하여 단백질을 정제하였다.

이와 같은 단백질 정제는 각각의 단백질의 C-teminal에 FLAG 유전자가 발현되어 있음으로 FLAG affinity resin을 사용하여 표적 단백질만 결합시킨 후 세척 완충액(Washing buffer)으로 세척하여 표적 단백질을 제외한 단백질들은 제거하였다.

이후, 용출 완충액(Elution buffer)을 사용하여 순수한 표적 단백질만을 추출한 뒤, 최종적으로 획득한 단백질 확인을 위해 SDS-PAGE를 진행하여 쿠마씨 블루(Coomassie blue) 염색 및 웨스턴 블로팅(Western Blotting)을 이용하여 표적단백질 생산 및 순도를 확인하였다.

여기서, 웨스턴 블로팅(Western Blotting)은 anti-FLAG 항체를 사용하여 분석하였으며, 최종적으로 얻은 단백질은 Thermo사의 micro BCA kit을 사용하여 농도를 측정하였으며, 해당 결과는 도3에 도시된 바와 같다.

이와 같이 클로닝 및 분리 정제 과정을 거쳐 마련된 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질에 기반의 재조합 단백질 NP-011은 도4 또는 하기 서열목록의 서열번호1에 표시된 바와 같다.

2. Milk fat globule- EGF factor 8( MFG -E8) 단백질에 기반을 둔 재조합 단백질 NP-011의 조직 항섬유화 효과 검증 시험 결과에 관한 설명

다음으로, 본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질을 기반으로 재조합된 단백질로서, 하기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 재조합 단백질 NP-011과 관련하여 해당 재조합 단백질에서 기인한 조직섬유화의 예방 또는 치료 기능의 발현 여부 및 MFG-E8와 비교하여 개선된 수준을 시험을 통해 확인하였으며, 해당 시험은 당업계의 기술자들에게 자명한 수단에 의한 성질 등을 정의하기 위한 목적으로 하기와 같은 실험 방법들이 이용되었다.

(1) 간 섬유화 동물 모델의 제작 및 단백질 주입

우선, 간 섬유화 생쥐 모델을 확립하기 위해 5주령의 C57/BL6 수컷 생쥐를 이용하였다. 구체적으로는 5주령의 C57/BL6 수컷 생쥐에 200mg/kg 농도의 티오아세트아미드(Thioacetamide, TAA)를 주입하여 간 섬유화 모델을 제작하였고, 보다 구체적으로는 주 3회 200mg/kg 농도의 티오아세트아미드(Thioacetamide, TAA)를 생쥐의 복강에 8주간 주사하여 간 섬유화 모델을 제작하였다.

8주간 티오아세트아미드(Thioacetamide, TAA)를 주입하여 간 섬유화 생쥐 모델을 제작한 후, 다음날 160㎍/kg 농도의 NP-011을 복강 주사하였다.

정상 대조군으로는 티오아세트아미드(Thioacetamide, TAA)를 주입하지 않은 생쥐(Normal)를 사용하였고, 질환 대조군으로는 티오아세트아미드(Thioacetamide, TAA)를 8주간 주입 후 단백질을 주입하지 않은 생쥐(Sham)를 사용하였다.

양성 대조군은 8주간 티오아세트아미드(Thioacetamide, TAA)를 주입하여 간 섬유화 생쥐 모델을 제작한 후, R&D system으로부터 구입한 MFG-E8을 160㎍/kg 농도로 주입하였다.

(2) 간섬유화 동물 모델들의 섬유화 정도 분석 시험

앞서 설명한 바와 같은 단백질 주입이 이루어진지 3일 후에 모든 대조군 및 실험군에서 생쥐 간 조직을 수거하여, 생쥐 간 내의 섬유화 정도를 분석하였다.

각 동물 모델로부터 적출한 간 조직의 일부는 섬유화 관련 지표 유전자 (COL1A1, COL1A2) 분석을 위해 RNA를 추출하였고, 나머지 간 조직은 조직 검사를 위해 4% PFA에 고정 후, 파라핀 블록을 제조하여 4㎛ 두께로 제작된 파라핀 블록을 절제하여 H&E 염색 및 Sirius red 염색을 통해 간 조직의 섬유화 정도를 분석하였다.

여기서, H&E 염색을 위해서는 Sigma에서 구입한 헤마톡실린(Hematoxylin) 및 에오신(Eosin)을 사용하였으며, Sirius Red 염색을 위해서는 Sigma에서 구입한 Picro Siris Red stain Kit를 사용하였다.

그 결과는 도5에 도시된 바와 같이 NP-011를 주입한 실험동물의 간 조직의 손상 정도 및 콜라겐(Collagen) 축적 정도가 질병 대조군(Sham)에 비해 확연히 개선되었으며, 그 개선 정도가 구체적으로 정상군 (Normal)과 매우 유사한 수준으로 회복되었음을 보여주고 있다.

한편, 각 동물 모델로부터 적출된 간 조직의 섬유화 관련 지표 유전자 분석을 위해서는 TRIzol 시약을 사용하여 RNA를 수득하고, 역전사 시스템(Promega Corp., USA)을 사용한 역전사 과정을 수행하였다. PCR 증폭 조건은 94℃ 5분, 35사이클(94℃ 30초, 50-57℃ 30초 및 72℃ 30초) 및 72℃ 10분으로 설정하였다.

구체적으로, RT-PCR 분석은 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 수행하였다. PCR 반응물은 12.5㎕ SYBR Green PCR Master Mix, 각각 0.8㎕ 10mM의 프라이머, 10.4㎕ 증류수및 0.5㎕ 주형 cDNA를 포함하는 25㎕로 구성하여 각 프라이머에 맞는 조건에서 증폭하여 확인하였다. 각 유전자의 상대적인 발현수준은 GAPDH을 사용하여 정규화하여 측정하였다. 사용된 프라이머의 서열은 하기 표1에 나타난바와 같다.

유전자	정방향(5‘→3’)	역방향(5‘→3’)	산물크기 (b.p)
COL1A1	CAATGCAATGAAGAACTGGACTGT	TCCTACATCTTCTGAGTTTGGTGA	105
COL1A2	GCAGGGTTCCAACGATGTTG	GCAGCCATCGACTAGGACAGA	76
GAPDH	GTTGTCTCCTGCGACTTCA	GGTGGTCCAGGGTTTCTTA	184

그 결과, 도6 및 도7에 도시된 바와 같이 적출한 간 조직으로부터 RNA를 추출하여, 섬유화 지표인 COL1A1, COL1A2의 발현 양상을 비교해보면 NP-011에 해당하는 재조합 단백질은 모두 질병 대조군 (Sham)에 비하여 콜라겐(Collagen) 축적을 감소시키는 효과가 있다.

특히나 도6과 같이 COL1A1에 관해서는 NP-011이 적용됨에 따라 MFG-E8 단백질이 적용된 군에 비해 확연히 정상군과 매우 유사한 수준으로 축적된 Collagen이 분해됨을 알 수 있으며, 이는 MFG-E8 단백질이 적용된 군과 비교해 4배 가량 개선된 효과를 나타냄을 알 수 있다.

아울러, 도7과 같이 COL1A2에 관해서도 NP-011이 적용됨에 따라 MFG-E8 단백질이 적용된 군에 비해 확연히 정상군과 매우 유사한 수준으로 축적된 Collagen이 분해됨을 알 수 있으며, 이는 MFG-E8 단백질이 적용된 군과 비교해 2.4배 가량 개선된 효과를 나타냄을 알 수 있다.

이와 같이 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질을 기반으로 재조합된 단백질로서, 도4 또는 하기 서열목록의 서열번호1에 표시된 바 같은 아미노산 서열을 갖춘 재조합 단백질 NP-011은 조직섬유화의 예방 및 치료 효과(항조직섬유화능)에 있어서, 기존의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8)과 비교하여 확연히 구분되는 개선 수준을 나타낸다.

여기서, 앞서 설명한 재조합 단백질 NP-011을 통한 조직섬유화의 예방 및 치료 효과(항조직섬유화능)의 제공이 가능한 조직이라 함은, 특히 간 조직을 대표로 하나 이에 한정되지 않고 폐, 침샘 등 생체 내 조직섬유화의 발생이 가능한 다양한 조직이 해당될 수 있다.

좀 더 구체적으로 이러한 NP-011 개선 수준의 정도가 조직섬유화의 예방 및 치료 효과(항조직섬유화능)의 제공을 통해 정상 조직 수준으로 회복 가능하다는 점은 단순한 조직섬유화 예방 또는 치료용 보조제가 아닌 근본적 만성 간질환 치료 용도의 활용에 가장 적합함을 알 수 있다.

본 발명에 개시된 실시예는 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의해서 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 보호범위는 아래 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> NEXEL Co., Ltd. <120> NP-011 <130> MFG-E8-NP-011 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein for curing tissue fibrosis including liver fibrosis <400> 1 Met Pro Arg Pro Arg Leu Leu Ala Ala Leu Cys Gly Ala Leu Leu Cys 1 5 10 15 Ala Pro Ser Leu Leu Val Ala Leu Asp Ile Cys Ser Lys Asn Pro Cys 20 25 30 His Asn Gly Gly Leu Cys Glu Glu Ile Ser Gln Glu Val Arg Gly Asp 35 40 45 Val Phe Pro Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Asn 50 55 60 His Cys Glu Thr Lys Cys Val Glu Pro Leu Gly Met Glu Asn Gly Asn 65 70 75 80 Ile Ala Asn Ser Gln Ile Ala Ala Ser Ser Val Arg Val Thr Phe Leu 85 90 95 Gly Leu Gln His Trp Val Pro Glu Leu Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly 100 105 110 Met Val Asn Ala Trp Thr Pro Ser Ser Asn Asp Asp Asn Pro Trp Ile 115 120 125 Gln Val Asn Leu Leu Arg Arg Met Trp Val Thr Gly Val Val Thr Gln 130 135 140 Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser His Glu Tyr Leu Lys Ala Phe Lys Val 145 150 155 160 Ala Tyr Ser Leu Asn Gly His Glu Phe Asp Phe Ile His Asp Val Asn 165 170 175 Lys Lys His Lys Glu Phe Val Gly Asn Trp Asn Lys Asn Ala Val His 180 185 190 Val Asn Leu Phe Glu Thr Pro Val Glu Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr 195 200 205 Pro Thr Ser Cys His Thr Ala Cys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly 210 215 220 Cys 225

Claims

Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질을 기반으로 재조합된 단백질로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어져 간 조직에 대한 항섬유화능이 우수한 간 섬유화 예방 또는 치료용 재조합 단백질.
제1항의 재조합 단백질을 포함하는 간 섬유화 예방 또는 치료용 조성물.
제1항의 재조합 단백질을 코딩하는 유전자.
제3항의 재조합 단밸질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.