WO2005083075A1 - 表皮分化に関与する新規遺伝子、およびその利用 - Google Patents

表皮分化に関与する新規遺伝子、およびその利用 Download PDF

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Takeshi Matsui
Fumie Kisumi
Yoko Kinoshita
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Definitions

  • the present invention relates to a novel secretory protein expressed in stratified epithelium.
  • the epidermis is a typical stratified squamous epithelium that is highly keratinized, and is composed of a basal cell layer, a spiny cell layer, a granular cell layer, and a keratinocyte layer.
  • Epidermal cells (keratinocytes) migrate upward from the basal cell layer to the keratinocyte layer. This movement is accompanied by a characteristic morphological change as well as a characteristic keratinocyte diversion.
  • the keratinocytes lose their intracellular organelles and become flattened to form the keratinized layer.
  • Non-Patent Documents 1 1 3
  • keratinocytes in the basement membrane express a basal keratin pair (K5Z K14) that is highly proliferative. Keratinocytes diverge away from the basement membrane and are characterized by changes in keratin expression from K5 / K14 to K1ZK10, an upper basal layer pair (Non-Patent Documents 417).
  • keratinocytes also initiate the synthesis of keratinocytes (CE) and precursor proteins such as the cross-linking enzyme transglutaminase (TGase) 1.
  • CE keratinocytes
  • precursor proteins such as the cross-linking enzyme transglutaminase
  • the keratinized membrane (CE) has a highly insoluble structure on the cytoplasmic granule side of the plasma membrane of keratinocytes in the keratinized layer, and also holds various types of protein power cross-linked by TGase 1 (non-patent literature). 8—11).
  • CE In terms of epidermal noria function, the components of CE have been well identified, including, for example, cystatin, desmoplakin, empoplakin, elafin, filaggrin and other keratins, involucrin, small proline
  • SPRRP rich protein family members
  • Non-Patent Document 11 There are rich protein family members (SPRRP) and oral ricklin (Non-Patent Document 11).
  • repetin, hornein, and periphilin have been identified as putative CE precursor proteins (Non-patent Documents 12 to 14).
  • CE-related proteins are derived from the so-called “Epidermal” on human chromosome lq21 (Non-Patent Documents 15–17) and mouse chromosome 3 (Non-Patent Documents 18 and 19).
  • Defferentiation complex (EDC) is encoded by clustered genes.
  • EDC Defferentiation complex
  • some CE protein genes encoding periplakin, sciellin, empoplin, hornein and periphilin are located in EDC! / ⁇ NA ⁇ (see Non-Patent Documents 20-22, 13, 14) .
  • EDC has at least 32 genetic forces that cause the keratinization process, and these genes are classified into three groups based on their structure (see Non-Patent Document 23).
  • Non-Patent Document 24 Certain involucrins, oral riculins and SPRRPs each have short tandem repeats in the central region (Non-Patent Document 24).
  • Non-Patent Document 25 Used two-dimensional polyacrylamide electrophoresis to clarify the expression of numerous proteins in epidermis and cultured keratinocytes. Reported a partial catalog of secreted proteins in keratinocyte cultures (Non-Patent Document 26).
  • Non-Patent Documents 27 and 28 Keratinocyte cDNA libraries randomly sequenced (Non-Patent Documents 27 and 28), Differential Display PCR (Non-Patent Documents 29-34), cDNA Microarray (Non-Patent Documents 35-37), Patent Literatures 38 and 39) and signal sequence traps (Non-Patent Literature 40) have provided the expression profiles of many genes and proteins in keratinocytes.
  • the whole skin when used for preparing a cDNA library or a cell lysate, it may be used for keratinocytes, melanocytes, fibroblasts, sebaceous epithelial cells (sebocyte endothelial cells, nerve cells or muscle cells).
  • This makes it difficult to analyze the gene expression profile of keratinocytes themselves.
  • researchers have used primary cultured keratinocytes, In addition, they are discriminated and suspended culture (raft culture) to form stratified epithelium and obtain information on keratinocytes themselves (Non-Patent Documents 41-45). However, even in this system, it is difficult to obtain information on gene expression in individual layers of the epidermis.
  • Non-patent literature 1 Watt FM, “Terminal differentiation of epidermal keratinocytes. J, Curr. Opin. Cell Biol., 1989, Vol. 1, p. 1107-1115.
  • Non-Patent Document 2 Eckert RL, "Structure, function and differentiation of the keratinocyte. J, Physiol. Rev. ⁇ 1989, Vol. 69, p. 1316—1346
  • Non-Patent Document 3 Eckert RL, Crish JF, Robinson NA, "The epidermal keratinocyte as a model for the study of gene regulation and cell differentiation.”, Physiol. Rev. ⁇ 1997, Vol. 77, p. 397- 424
  • Non-Patent Document 4 Fuchs E, Green H, "Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.”, Cell, 1980, Vol.19, p.1033-1042
  • Non-Patent Document 5 Moll R, Franke WW, Vole-Platzer B, Krepler R, "Different keratin polypeptides in epidermis and other epithelia of human skin: a specific cytokeratin of molecular weight 46,000 in epithelia of the pilosebaceous tract and basal cell epitheliomas.”, J Cell Biol, 1982 , Vol.95, p.285— 295
  • Non-Patent Document 6 Fuchs E and Byrne C, "The epidermis rising to the surface.”, Curr. Opin. Genetics Dev. ⁇ 1994, Vol. 4, p. 725—736
  • Non-Patent Document 7 Fuchs E, ⁇ Keratins and the skin. '', Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 1995, Vol. 11, p. 123-153.
  • Non-Patent Document 8 Roop, D., "Defects in the barrier.”, Science, 1995, Vol.267, p.474-475.
  • Non-Patent Document 9 Ishida-Yamamoto A, lizuka H, "Structural organization of cornified cell envelopes and alterations in inherited skin disorders.”, Exp. Dermatol., 1998, Vol. 7, p. 1-10.
  • Non-Patent Document 10 Kalinin A, Marekov LN, Steinert PM, ⁇ Assembly of epidermal cornified cell envelope. '', J. Cell Sci. ⁇ 2001, Vol.114, p.3069-3070
  • Non-Patent Document 11 Kalinin AE, Kajava AV, Steinert PM, ⁇ Epithelial barrier lunction: assembly and structural features of the cornified cell envelope. '', BioEssays, 2002, Vol.24, p.789-800
  • Patent Document 12 Krieg P, Schuppler M, Koesters R, Mincheva A, Lichter P, and Marks ⁇ Repetin (Rptn), a new member of the "fused gene" subgroup within the S100 gene family encoding a murine epidermal differentiation protein. , Genomics, 1997, Vol. 43, p. 339-348
  • Non-Patent Document 13 Makino T, Takaishi M, Morohashi M, Huh N, ⁇ Hornein, a novel profilaggrin- like protein and diffeerntiation- specific marker isolated from mouse skin.J, J Biol. Chem., 2001, Vol. 276, p.47445-47452
  • Non-Patent Document l4 Kazerounian S, Aho S, ⁇ Characterization of periphilin, a widespread, highly insoluble nuclear protein and potential constituent of the keratinocyte cornified envelope. '', J. Biol. Chem. ⁇ 2003, Vol. 278, p. .36707-36717
  • Non-Patent Document 15 Volz A, Korge BP, Compton JG, Ziegler A, Steinert PM, Mischke D, ⁇ Physical mapping of a functional cluster of epidermal differentiation genes on chromosome lq21. '', Genomics 1993, Vol.18, p.92— 99
  • Non-Patent Document 16 Mischke D, Korge BP, Marenholz I, Volz A, Ziegler A, ⁇ Genes encoding structural proteins of epidermal cornification and S100 calcium--binding proteins form a gene complex ("epidermal differentiation complex '') on human chromosome lq21 . ", J. Invest. Dermatol., 1996, Vol. 106, p. 989—992.
  • Non-Patent Document 17 Marenholz I, Volz A, Ziegler A, Davies A, Ragoussis I, Korge BP, Mischke D, ⁇ Genetic analysis of the epidermal differentiation complex (EDC) on human chromosome lq21: chromosomal orientation, new markers, and a 6— Mb YAC contig-”, Genomics ⁇ 1996, Vol.37, p.295-302
  • Non-Patent Document 18 Rothnagel JA, Longley MA, Bundman DS, Naylor SL, Lalley PA, Jenkins NA, Gilbert DJ, Copeland NG, Roop DR, ⁇ Shi haracterization of the mouse loricrin gene: linkage with profillagerin and the flaky tail and soft coat mutant loci on chromosome 3. '', Genomics, 1994, Vol.23, p.450-456
  • Non-Patent Document 19 Song HJ, Poy G, Darwiche N, Lichti U, Kuroki T, Steinert PM, Kartasova T, ⁇ Mouse Sprr2 genes: a clustered family of genes showing differential expression in epithelial tissues. '', Genomics, 1999, Vol.55, p.28-42
  • Non-Patent Document 20 Aho S, McLean WHI, Li K, Uitto J, ⁇ cDNA cloning, mRNA expression, and chromosomal mapping of human and mouse periplakin genes. '', Genomics, 1998, Vol. 48, p. 242- 247
  • Non-Patent Document 21 Champliaud M, Burgeson RE, Jin W, Baden HP, Olson PF, ⁇ cDNA cloning and characterization of sciellin, a LIM domain protein of the keratinocyte cornified envelope. '', J. Biol. Chem. ⁇ 1998 , Vol.273, p.31547-31554
  • Non-Patent Document 22 Maata A, Ruhrberg C, Watt F, ⁇ Structure and regulation of the envoplakin gene.J, J. Biol.Chem. ⁇ 2000, Vol.275, p.19857-19865 ("a” in "Maata” on the left is an umlaut in "a”.)
  • Non-Patent Document 23 Marenholtz I, Zirra M, Fischer DF, Backendorf C, Ziegler A, Mischke D, ⁇ Identification of human epidermal differentiation complex
  • Non-Patent Document 25 Celis JE, Rasmus sen HH, Gromov P, ⁇ The human keratiocyte two- dimentional gel protein database (update 199 no.mapping components of signal transduction pathways-'', Electrophoresis, 1995, Vol. 16, p. .2177-2240
  • Non-Patent Document 2b Katz AB, and Taichman LB, ⁇ A partial catalog of proteins secreted by epidermal keratinocytes in culture. '', J. Invest.Dermatol., 1999, Vol. 112, p. 818-821.
  • Patent Document 27 Konishi K, Morishima Y, Ueda E, Kibe Y, Nonomura K, Yamanishi K, Yasuno H, (Cataloging of the genes expressed in human keratinocytes:
  • Non-Patent Document 28 Kita H, Okubo K, Matsubara K, ⁇ an expression profile of active genes in cultured human keratinocytes.J, DNA Res., 1996, Vol.3, p.1-7
  • Non-Patent Document 29 Frank S, Werner S, ⁇ The human homologue of the yeast CHL1 gene is a novel keratinocyte growth factor-regulated gene. ", J. Biol. Chem. ⁇ 1996 ⁇ Vol.271, p.24337-24340
  • Non-Patent Document 30 Frank S, Munz B, Werner S, ⁇
  • the human homologue of a bovine nonselenium glutathione peroxidase is a novel keratinocyte growth factor-regulated gene. '', Oncogene, 1997, Vol. 14, p. 915- 921
  • Non-Patent Document 31 Munz B, Gerke V, Gillitzer R, Werner S, "Differential expression of the calpain I subunits annexin II and pl l in cultured keratinocytes and during wound repair.”, J. Invest.Dermatol., 1997 , Vol.108, p.307— 312
  • Non-Patent Document 32 Rivas MV, Jarvis ED, Morisaki S, Carbonaro H, Gottling AB,
  • Non-Patent Document 33 Rutberg SE, Lee EJ, Hansen LH, Glick AB, Yuspa SH, ⁇ Identification of differentially expressed genes in chemically induced skin tumors.J, Mol.Carcinogen., 1997, Vol. 20, p. 80. -98
  • Non-Patent Document 34 DiSepio D, Ghosn C, Eckert RL, Deucher A, Robinson N, Duvic M, Chandraratna RAS, Nagpal S, ⁇ Identification and characterization of a retinoid- induced class II tumor suppressor / growth regulatory gene. '' Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ⁇ 1998, Vol.95, p.14811-14815
  • Non-Patent Document 35 Trenkle T, Welsh J, Jung B, Mathieu-Daude F, McClelland M, ⁇ Nonstoichiometric reduced complexity probes for cDNA arrays. '', Nucleic Acids Res., 1998, Vol.26, p.3883- 3891
  • Non-Patent Document 36 Cole J, Tsou R, Wallance K, Gibran N, Isik F, ⁇ Early gene expression profile of human skin to injury using high-density cDNA microarrays.J, Wound Repair and Degeneration ⁇ 2001, Vol. 9, p.360—370
  • Non-Patent Document 37 Bernard FX, Pedretti N, Rosdy M, Deguercy A, ⁇ Comparison of gene expression profiles in human keratinocyte mono-layer cultures, reconstituted epidermis and normal human skin; transcriptional effects of retinoid treatments in reconstituted human epidermis., Exp. Dermatol., 2002, Vol. 11, p. 59—74 38: Jansen BJH, Van Ruissen F, De Jongh G, Zeeuwen PLJM, Schalkwijk J, ⁇ Serial analysis of gene expression indiiferentiated cultures of human epidermal keratinocytes-'', J. Invest.Dermatol., 2001, Vol. 116, p. .12-22
  • Non-Patent Document 39 Ruissen FV, Jansen BJH, dejongh GJ, Zeeuwen PLJM, Schalkwijk J, ⁇ A partial trans criptome of human epidermis '', Genomics, 2002, Vol. 79, p. 671-678.
  • Non-Patent Document 40 Bonkobara M, Das A, Takao J, Cruzjr PD, Ariizumi K, ⁇
  • Non-Patent Document 41 Bell E, Ehrlich HP, Buttle DJ, Nakatsuji T, ⁇ Living tissue formed in vivo and accepted as skm—equivalemt tissue of full thickness. '', Science, 1981 Cattle, Vol. 211, p. 1052- 1054
  • Non-Patent Document 42 Mackenzie IC, Fusenig NE, "Regeneration of organized epithelial structure, J. Invest. Dermatol., 1983, Vol. 81, p.l89s—194s.
  • Non-Patent Document 43 Asselineau D, Prunieras M, ⁇ Reconstruction of simplified skin: control of fabrication-'', Br.J.Dermatol., 1984, Vol.111, p.219-222.
  • Non-Patent Document 44 Parenteau NL, Nolte CM, Bilbo P, Rosenberg M, Wilkins LM,
  • Non-Patent Document 45 Stark HJ, Baur M, Breitkreutz D, Mirancea M, Fusenig NE, ⁇ Organotypic keratinocyte cocultures in defined medium with regular epidermal morphogenesis and differentiation. '', J. Invest.Dermatol., 1999, Vol. 112. , P.681-691
  • the present inventors have conducted intensive research to solve the above-mentioned problems.
  • the present inventors In order to identify new genes involved in epidermal differentiation, the present inventors have developed a recently established gene screening method called “No-throughput in situ Neubridization System (HT-ISH)” ( Komiya T, Tanigawa Y, Hirohashi S: Anal. Biochem. 254: 23-30, 1997) was used for mouse foot epidermis.
  • HT-ISH No-throughput in situ Neubridization System
  • This method makes it possible to analyze the pattern of gene expression in individual layers of keratinocytes in the "intact" epidermis without separating the individual cell layers.
  • the present inventors By applying this method to mouse plantar epidermal slices, the present inventors have succeeded in identifying one hundred genes showing layer-specific expression in intact epidermis.
  • the present inventors identified and characterized two splicing nores, dermokine-a and - ⁇ , of one novel gene, a secretory peptide that is specifically expressed in the spinous layer of the epidermis. did.
  • the gene was identified as two other keratinocyte proteins, suprabasin (Park GT, Lim SE, Jang S, Morasso MI: J. Biol. Chem.
  • keratinocyte differentiation-related protein (Kdap) (Oomizu S, Sahuc F, Asahina K, Inamatsu M, Matsuzaki T, Sasaki M, Obara M, Yoshizato K: Gene. 256: 19-27, 2000) It was found to be located at the encoding genomic locus. The present inventors have shown that suprabasin and Kdap are also secreted peptides, and that dermokine-aZ-j8, suprabasin and Kdap are mainly expressed in stratified epithelium.
  • SSC Stratified epithelium secreted peptides complex
  • dermokine-o has the activity of causing keratinocytes to differentiate into stratified epithelial cells by expressing them in keratinocytes.
  • the present invention relates to a novel gene involved in epidermal differentiation, and a gene complex containing the gene.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, or 8, wherein one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added;
  • polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a DNA consisting of the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 7, wherein the polynucleotide is expressed on keratinocytes to form an overlap with the keratinocytes.
  • a keratinocyte differentiation inducer comprising dermokine-a protein or dermokine- ⁇ protein as an active ingredient
  • a method for screening a keratinocyte differentiation inducer comprising the following steps (a)-(c):
  • a method for screening a keratinocyte inhibitor comprising the following steps (a) to (c): (a) a step of bringing a test compound into contact with cells expressing dermokine-a protein or dermokine- ⁇ protein
  • a method for screening a keratinocyte differentiation inducer comprising the following steps (a)-(c):
  • a method for screening a keratinocyte inhibitor comprising the following steps (a)-(c):
  • a method for testing a test cell for the strength of cancer cells derived from stratified epithelium comprising the following steps (a) and (b):
  • test cell is a cancer cell derived from stratified epithelium when the expression level or the activity is changed as compared to a control
  • a method for diagnosing (examining) squamous cell carcinoma or basal cell carcinoma of a subject comprising the following steps (a) and (b): (a) a step of determining whether or not cancer cells derived from stratified epithelium by the method according to (17) for the cell sample prepared by the subject,
  • a method for treating a disease caused by reduced keratinocyte differentiation induction comprising a step of administering a keratinocyte differentiation inducer obtained by the screening method according to [13] or [15];
  • (23) a method for treating a disease caused by enhanced keratinocyte differentiation, comprising a step of administering a compound selected from the group consisting of the following (a) to (d):
  • treatment of a disease caused by enhanced keratinocyte differentiation comprising a step of administering a keratinocyte differentiation inhibitor obtained by the screening method according to [14] or [16].
  • FIG. 1 is a diagram and a photograph showing the results of high throughput in situ hybridization (HT-ISH).
  • A Evaluation results of the equalized mouse back skin cDNA library are shown.
  • the starting library (E0) and the equalized libraries (E1 and E2) were analyzed in duplicate by quantitative real-time PCR analysis. All data were standardized for the internal standard, oral cyclin. Compared to E0, E2 reduced both keratin 14 and keratin 5 cDNAs (rich cDNAs) to about 1/5 each. However, integrin (X-M (rare cDNA) increased to about 42-fold.
  • B Photo showing an example of HT-ISH signal.
  • CRNA probe power prepared from the equalized cDNA library (E2) 96 Adult mouse foot in the L-format was hybridized to sections of epidermis, cyclophilin A (NM008907) was specifically expressed in the basal and basal layers (a), and Kdap was examined in the suprabasal cell layer.
  • prothymosin ⁇ ( ⁇ 008972) (c), diazepam binding inhibitor (BC028874) (d), tubulin j8 -2 chain similar gene (XM130158) (e), lamin A (BC015302) (f), Nuclear distribution C homolog (NM010948) (g), desmoplakin I (XM138593) (h), keratin-related protein 16-5 (NM130857) (i), and nucleoside diphosphate kinase C (AF288691) (j) (K) was detected in the granular layer.Mouth riculin (U09189) mRNA was exclusively (1) No specific signal was detected with the sense probe for each clone (data not shown), the dashed line represents the boundary between epidermis and dermis. Scale bar: 50 ⁇ m.
  • FIG. 2-AB A diagram and a photograph showing the identification of dermokine-a and j8.
  • A Photograph showing the HT-ISH signal with the SK063F08 probe for a section of an adult mouse foot-epidermis.
  • Antisense no signal was detected with the force sense probe (Sense), which gave an intense signal from the spinous layer of the epidermis.
  • H + E is a hematoxylin-eosin stained image. Dashed lines represent the boundaries between epidermis and dermis. Scale bar; 50 m.
  • B Mouse ESTs having the SK063F08 sequence and their human homologues EST.
  • FIG. 2-C is a view showing identification of dermokine-a and j8.
  • the amino acid sequences of mouse and human dermokine-a and - ⁇ deduced from each EST of AK003695 / AL832080 and AK081753 / BC035311 are shown.
  • the putative signal sequence predicted by the SignalP server is underlined, and the same region between dermokine-a and 13 is boxed. Glycine and serine-rich domains of dermokine- ⁇ are indicated by dashed lines.
  • the sequence data of dermokine- ⁇ and dermokine-j8 are registered in GenBank with accession numbers AK003695 and AK081753 for mice and accession numbers AL832080 and BC035311 for humans, respectively!
  • FIG. 3-A is a view showing the structure of dermokine-a and - ⁇ genes.
  • the exons of the human dermokine-a and -j8 genes on chromosome 19ql31 are shown.
  • White and black boxes represent the coding and non-coding regions of the mRNA, respectively, and represent the exon. Putative translation start and stop sites are indicated by ATG and TGA, respectively.
  • Exons 2-6 of dermokine- ⁇ were utilized by dermokine-j8 as exons 12-16 and were identical to the COOH-terminal sequence and 3'-noncoding region.
  • FIG. 3-B is a view showing the structure of dermokine-a and -j8 genes.
  • 1 shows mouse and human loci having genes for suprabasin, demokine- ⁇ / ⁇ ⁇ , and keratinocyte differentiation-related protein (Kdap). Arrows indicate the transfer direction.
  • Testis-specific GAPDH testis-specific dalyseraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene
  • GPR43 G protein-coupled receptor 43 gene.
  • FIG. 4-BC is a photograph showing the result of analyzing the secretion of dermokine- ⁇ / -j8, Kdap and suprabasin.
  • B four SEAP (His) fusion proteins in 293 / EBNA-1 cells
  • suprabasin lacks its own signal peptide with a (His) C-terminal tag
  • SEAP secreted alkaline phosphatase
  • fusion proteins were transiently expressed in 293 / EBNA-1 cells.
  • the culture medium (10 g in each lane) (Medium) was separated by SDS-PAGE and subjected to immunoblotting with an anti-His antibody.
  • the fusion protein secreted into the medium is indicated by an arrowhead. All four fusion proteins were secreted into the medium.
  • the culture medium of 293 / EBNA-1 cells was collected, and the fusion protein was purified by TALON Metal Affinity Resin.
  • the purified protein (arrow) was degraded by SDS-PAGE, and subsequently stained with Coomassie brilliant blue to analyze the N-terminal amino acid sequence.
  • dermokine- ⁇ —SEAP His
  • Kdap—SEAP His
  • FIG. 5 is a photograph showing the expression pattern of dermokine- ⁇ / ⁇
  • the membrane was hybridized with a Kdap-specific probe (Kdap), a suprabasin-specific probe (Suprabasin) and a control GAPDH-specific probe. All genes were highly expressed in the skin, and low in the stomach. Kdap was also detected in the lung.
  • Kdap was also detected in the lung.
  • B Photographs showing expression patterns of dermokine-a, - ⁇ , Kdap, and suprabasin in epidermis.
  • Serial sections of mouse foot ⁇ epidermis were obtained from dermokine-j8 (SK063F08; Dermokine- ⁇ / - ⁇ ), dermokine- ⁇ , ⁇ -holes, Dermo ken e- ⁇ ), Kaap (Kdap; and suprabasin).
  • Dermokine-a hybridized with an antisense and sense probe specific to the ZC-terminal region, and showed a section that was hybridized with the sense probe, showing hematoxylin-eosin staining (H + E).
  • H + E hematoxylin-eosin staining
  • a Z- ⁇ , dermokine- ⁇ and suprabasin-specific hybridization signals were equally detected in the spinous layer of mouse foot-epidermal, but Kdap-specific signals were detected in the suprabasal region of the spinous layer. Signals specific to sections hybridizing with the sense probe were not detected, dashed lines indicate boundaries between epidermis and dermis, scale bar;
  • FIG. 6-A Photograph of SSC product. 1 is a photograph showing dermokine- ⁇ / - ⁇ expression during mouse embryonic development. All stage blots (Seegene) of mouse embryos were probed with DIG-labeled SK063F08 cRNA fragment. Dermokine-j8 (arrow) started to be expressed at E15.5. Dermokine- ⁇ (arrowhead) first appeared at E16, its expression increased until E17.5, and then decreased by E18.5. The lower panel is ethidium bromide stained membrane. [6- ⁇ ] is a diagram showing in vitro screening of primary cultured human keratinocytes.
  • FIG. 7 is a view showing the effect of Dermokine-o; on keratinocyte differentiation.
  • A a graph showing the yield of total RNA from 12 wells.
  • pcDNA-human Dermokine- ⁇ -HA was expressed using TransIT LT1 kertinocyte. Only pcDNA3.1 was used as Mock. Extraction of total RNA significantly reduced the amount of total RNA recovered in keratinocytes expressing human Dermokine- ⁇ -HA.
  • B is a graph showing the expression of Involucrin. QRT-PCR was performed on involucrin mRNA from total RNA prepared in A. Expression of Dermokine- ⁇ significantly increased involucrin mRNA
  • FIG. 8-AB shows a diagram and a photograph showing that an antibody against the SSC protein group was prepared.
  • A Diagram of Construct used to create antigen.
  • Dermokine-j8-AC lacked the common part of dermokine- ⁇ and dermokine-a, and was used to generate dermokine- ⁇ -specific antibodies.
  • ⁇ a photograph showing the protein used for the antigen. 293 / EBNA-1 cells ⁇ ⁇ transiently expressed dermokine- ⁇ , dermokine-j8-AC, Kdap ⁇ Suprabasin fusion protein with SEAP (His)
  • the figure is a CBB-stained image.
  • FIG. 8-C is a photograph showing that an antibody against the SSC protein group was prepared.
  • 4 is a photograph showing an immunoblot using an antiserum against the SSC protein group.
  • Dermokine-a, - ⁇ ,- ⁇ Kdap and Suprabasin were transiently expressed in 293 / EBNA-1 cells, respectively, to prepare culture supernatants. After electrophoresis, they were transferred to a nitrocellulose membrane and immunoblotted with antiserum against each protein. The CBB staining image of the culture supernatant is also shown. It was. The antibody against dermokine-a reacts with dermokine- ⁇ - ⁇ C.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of analyzing human and mouse dermokine- ⁇ / - ⁇ AC expressed in 293 cells by CBB (Coomassie Brilliant Blue) and immunoblot. The right side of the center is the result of mouse, and the left side is the result of human.
  • CBB Clickassie Brilliant Blue
  • A is the result of mouse and B is the result of human.
  • the present invention relates to a novel secreted protein expressed in the differentiated epidermal layer above the basal layer, and a polynucleotide encoding the protein.
  • the proteins of the present invention are believed to be involved in keratinocyte sorting and Z or proliferation.
  • the two novel proteins identified in the present invention have been named "dermokine-a” and "dermokine- ⁇ " by the present inventors.
  • the nucleotide sequence of the mouse dermokine-a gene is described in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene is described in SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence of the mouse dermokine-18 gene is described in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene is described in SEQ ID NO: 4.
  • the nucleotide sequence of the human dermokine-a gene is described in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene is described in SEQ ID NO: 6.
  • the nucleotide sequence of the human dermokine-18 gene is described in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene is described in SEQ ID NO: 8.
  • the present invention first provides a polynucleotide according to any one of the following (a) to (d).
  • the above (c) or (d) is the following polynucleotide.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, or 8, wherein one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added;
  • polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a DNA consisting of the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 7, wherein the polynucleotide is expressed on keratinocytes to form an overlap with the keratinocytes.
  • a person skilled in the art would determine whether any polypeptide has the ability to have the "activity of causing keratinocytes to differentiate into stratified epithelial cells by being expressed in keratinocytes" as described in (c) or (d) above. Can be appropriately determined.
  • a test polypeptide can be introduced into keratinocytes, and the expression can be determined using the expression of a differentiation marker for stratified epithelium, preferably involucrin as an indicator. For example, when the expression of involucrin is increased, the test polypeptide is determined to have “activity of causing keratinocytes to differentiate into stratified epithelial cells by expressing them in keratinocytes”.
  • the polynucleotide according to any one of the above ( a ) to (d), which is a gene involved in keratinocyte division and Z or proliferation, and which encodes a secretory protein, is there.
  • the dermokine-a protein and dermokine- ⁇ protein in the mouse or human and a variant (variant) of the protein. More specifically, a polypeptide comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, or 8, and in the amino acid sequence, one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and The present invention provides a polypeptide consisting of Z or an added amino acid sequence and which is functionally equivalent to the dermokine-a protein or dermokine- ⁇ protein.
  • the present invention relates to a polypeptide identified by the present inventors, a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide, and a polynucleotide encoding the polypeptide.
  • “functionally equivalent” means a polypeptide whose target polypeptide has been identified by the present inventors (for example, a polypeptide having the amino acid sequence power described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8). ) Has the same biological function (activity) as! /.
  • the biological function (activity) possessed by the polynucleotide of the present invention is, for example, expression in the differentiated epidermal layer in the upper layer of the basal layer or involvement in keratinocyte division and growth or proliferation.
  • the activity of inducing keratinocytes can be mentioned.
  • Further examples include a function expressed specifically in the stratified epithelium, a function responsible for stratification of the epidermis in vivo in the early stage of mouse development, and the like.
  • dermokine-related functions (activities) described in the examples below can be mentioned.
  • the present invention provides an amino acid having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, or 8, wherein one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added.
  • the present invention also includes polynucleotides that are expressed in, or that encode proteins involved in keratinocyte sorting and Z or proliferation.
  • the polynucleotides of the present invention are secretory proteins!
  • test polypeptide is a secretory protein
  • a test polypeptide is a secretory protein
  • it should express a fusion protein tagged with SEAP (secreted alkaline phosphatase) (His).
  • SEAP secreted alkaline phosphatase
  • a vector is prepared and the vector is transfected into cells.
  • immunoblotting with an anti-His antibody it is possible to examine whether or not the test protein is secreted into the cell culture medium. More specifically, it can be carried out by the method described in Examples described later.
  • test polypeptide test gene
  • test gene test gene
  • Northern blotting Western blotting
  • Western blotting and so on. It can be appropriately performed by a plotting method, an in situ hybridization method, or the like.
  • whether or not the test polypeptide (test gene) is involved in keratinocyte division, Z or proliferation can be determined, for example, under the conditions of high Ca 2+ concentration or high cell density. It can be examined by expression analysis of the test polypeptide (gene). More specifically, it can be confirmed by examining the expression level by qRT-PCR using a stratified epithelial marker. More specifically, it can be appropriately carried out according to the method described in Examples described later.
  • polynucleotide of the present invention can be isolated by those skilled in the art by a generally known method. For example, hybridization technology (Southern, EM., J Mol Biol, 1975, 98, 503.) and polymerase chain reaction (PCR) technology (Saiki, RK. Et al, Science, 1985, 230, 1350. Saiki, RK. Et al., Science 1988, 239, 487.).
  • hybridization technology Southern, EM., J Mol Biol, 1975, 98, 503.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, or 7, or a part thereof is used as a probe, and the polynucleotide of any of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, or 7 is used as a probe.
  • An oligonucleotide which specifically hybridizes or hybridizes to a polynucleotide which also has a nucleotide sequence strength is used as a primer to obtain a polynucleotide having the nucleotide sequence strength described in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5 and 7 from a desired animal. Isolation of polynucleotides having homology is routine to those skilled in the art.
  • polynucleotide that can be isolated by the hybridization technique or the PCR technique and hybridizes with the polynucleotide having the nucleotide sequence described in any of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 7 is also included in the present invention. Included in polynucleotides. Such polynucleotides include, for example, a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7. And homologs in organisms other than mice and humans.
  • the stringent hybridization conditions refer to the conditions of 6M urea, 0.4% SDS, 0.5 ⁇ SSC or the equivalent hybridization condition of stringency.
  • 6M urea, 0.4% SDS, 0.1 X SSC it is expected that a polynucleotide with higher homology can be isolated.
  • the polynucleotide thus isolated is considered to have high homology at the amino acid level with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8.
  • High homology refers to sequence identity of at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more in the entire amino acid sequence.
  • the polynucleotide of the present invention includes genomic DNA, cDNA and chemically synthesized DNA. Preparation of genomic DNA and cDNA can be performed by a person skilled in the art by conventional means.
  • genomic DNA is extracted from biological force genomic DNA having the polynucleotide of the present invention (for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7), and a genomic library (for example, a vector such as Plasmids, phages, cosmids, BACs, PACs, etc. can be used), developed, and colony hybridized using a probe prepared based on the polynucleotide of the present invention. Line up Can be prepared.
  • a primer specific to the polynucleotide of the present invention for example, SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7
  • PCR PCR
  • cDNA is synthesized based on mRNA extracted from a biological force having the polynucleotide of the present invention, and the cDNA is inserted into a vector such as ⁇ ZAP to prepare a cDNA library, which is developed and expanded as described above.
  • a cDNA library which is developed and expanded as described above.
  • it can be prepared by performing colony hybridization or plaque hybridization and by performing PCR.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding a protein structurally similar to the protein consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 8.
  • a polynucleotide include a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z- or added in the protein.
  • the number and location of amino acid mutations in the above proteins are not limited as long as their functions are maintained. The number of mutations will typically be within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, and more preferably within 1% of all amino acids. More specifically, the number of amino acid mutations is usually within 50 amino acids, preferably within 30 amino acids, more preferably within 10 amino acids, even more preferably within 5 amino acids, and most preferably 3 amino acids. Less than acid.
  • the present invention also relates to a polypeptide comprising an amino acid sequence having homology (homology) with the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 8, (Polypeptides).
  • the “homology” is not particularly limited as long as the polypeptide has the above-mentioned function (activity), but usually has a homology of 60% or more, preferably 70% or more. % Or more, more preferably 80% or more, even more preferably 85% or more, even more preferably 90% or more, most preferably Have over 95% homology.
  • the mutation may not be accompanied by mutation of an amino acid in the protein (degenerate mutation), and such a degenerate mutant polynucleotide is also included in the present invention.
  • the present invention also provides fragments of the polypeptide of the present invention.
  • a fragment is a polypeptide having an amino acid sequence that is not entirely identical to a portion of the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention.
  • the polypeptide fragment of the present invention is usually a polypeptide fragment having a sequence of 8 amino acid residues or more, preferably 12 amino acid residues or more (for example, 15 amino acid residues or more).
  • Suitable fragments include, for example, a deletion of a series of residues including the amino terminus or a series of residues including the carboxyl terminus, or a combination of a series of residues including the amino terminus and a series of residues including the carboxyl terminus.
  • truncation polypeptides having an amino acid sequence with truncated residues deleted.
  • fragments characterized by structural or functional properties such as those that contain variable regions, surface forming regions, substrate binding regions, and high antigen index regions.
  • Variants of the specified sequences and fragments also form part of the invention.
  • Preferred variants are those that involve substitution of conservative amino acids. That is, a residue is substituted with another residue of similar properties.
  • Typical such substitutions are, for example, between Ala, Val, Leu and lie, between Ser and Thr, between the acidic residues Asp and Glu, between Asn and Gin, between the basic residues Lys and Arg, Or occurs between the aromatic residues Phe and Tyr.
  • the amino acid to be substituted is preferably an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution from the viewpoint of maintaining the function of the protein.
  • Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, and Trp are all classified as non-polar amino acids, and are considered to have similar properties to each other.
  • examples of the non-charger include Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, and Gin.
  • acidic amino acids include Asp and Glu
  • basic amino acids include Lys, Arg, and His. Therefore, the type of amino acid to be modified in the present invention is not particularly limited, but the amino acids before and after modification are separated into properties similar to those described above. Preferably, the amino acids are similar to each other.
  • polypeptide encoded by the polynucleotide of the present invention is also included in the present invention.
  • the present invention provides a vector into which the polynucleotide of the present invention has been inserted, the polynucleotide of the present invention or a host cell carrying the vector, and a method for producing the polypeptide of the present invention using the host cell. .
  • the vector of the present invention is not particularly limited as long as it can stably maintain the inserted DNA.
  • a pBluescript vector manufactured by Stratagene
  • an expression vector is particularly useful.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it expresses the polypeptide in a test tube, in Escherichia coli, in cultured cells, or in an individual organism. Examples of the expression vector include a pBEST vector (manufactured by Promega) for expression in a test tube.
  • pET vector manufactured by Invitrogen
  • PME18S-FL3 vector GeneBank Accession No. AB009864
  • PME18S vector Mol Cell Biol. 8: 466-472 (1988)
  • Insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site (Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4—11.11).
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and various host cells may be used depending on the purpose.
  • Cells for expressing the polypeptide include, for example, bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus), insect cells (eg, Drosophila S2) , Spodoptera SF9), animal cells (eg, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) and plant cells.
  • Vectors can be introduced into host cells by, for example, calcium phosphate precipitation, electropulse perforation (Current protocols in
  • the medium is recovered.
  • the polypeptide of the present invention is produced intracellularly, the cell is first lysed and then the polypeptide is recovered.
  • Recombinant cell cultures also have the ability to recover and purify the polypeptides of the present invention by precipitation with ammonium sulfate or ethanol, acid extraction, ion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography.
  • Known methods including chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography, and lectin chromatography can be used.
  • the present inventors also concluded that the dermokine-a gene and the dermokine- ⁇ gene of the present invention were located between the keratinocyte-digestion-related protein (Kdap) -encoding gene and the suprabasin (spravacin) gene. I found out. In addition, they discovered for the first time that these four genes are secreted proteins and are gene complexes (gene clusters) expressed at the onset of stratification. That is, the above four genes are under common gene expression regulation, and constitute a gene complex. The present inventors named the gene complex SSC.
  • the present invention relates to a gene complex characterized by being under common gene expression regulation, comprising: (1) a Kdap gene, (2) a dermokine- ⁇ gene, (3) a dermokine-j8 gene, and (4) To provide a gene complex involved in the division or growth of keratinocytes composed of each gene of the uprabasin gene.
  • the gene complex of the present invention is located on chromosome 7 in mice and on chromosome 19 in humans, as shown in Fig. 3, for example. Those skilled in the art can use the information shown in FIG. 3 to obtain information on the exact position and sequence of the gene complex of the present invention by appropriately using public databases, commercially available analysis tools, and the like. It is possible to obtain it.
  • the gene complex of the present invention is preferably a genomic DNA fragment containing the gene of (1) or (4) above, and desirably contains a common expression control region of the gene.
  • the genomic DNA fragment is preferably an isolated and purified DNA fragment.
  • the DNA fragment is preferably derived from a mouse or human.
  • the genomic DNA fragment of the present invention is not particularly limited! /, But is a DNA fragment having a length of about 40 kbp (approximately).
  • the present invention relates to the polynucleotide of the present invention (eg, the polynucleotide having the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 7, or a complementary strand thereof). Both nucleotides have a nucleotide length of 15 nucleotides.
  • complementary strand refers to one strand of a double-stranded nucleic acid that has the base pair force of A: T (U for RNA) and G: C.
  • ⁇ complementary '' is not limited to a case where the sequence is completely complementary to at least 15 contiguous nucleotide regions, and is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, and still more preferably 95%. It is only necessary to have the above homology on the base sequence.
  • the algorithm for determining homology should use the one described herein.
  • Such a nucleotide can be used as a probe for detecting and isolating the polynucleotide of the present invention, and as a primer for amplifying the nucleotide of the present invention. When used as a primer, it usually has a chain length of 15-100 nucleotides, preferably 15-35 nucleotides.
  • a polynucleotide having a chain length of at least 15 nucleotides, preferably at least 30 nucleotides, containing at least a part or the entire sequence of the DNA of the present invention is used.
  • Such a polynucleotide preferably hybridizes specifically to a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention.
  • “Specifically hybridizes” refers to a polynucleotide of the present invention (eg, SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7) under ordinary hybridization conditions, preferably under stringent conditions. DNA that hybridizes and encodes another polypeptide means that it does not hybridize.
  • the above polynucleotides include polynucleotides that suppress the expression of a gene encoding the polypeptide of the present invention.
  • Such polynucleotides include antisense polynucleotides (antisense DNA / RNA; genes encoding the polypeptides of the present invention).
  • Ribozyme RNA encoding ribozyme activity that specifically cleaves a transcript of a gene encoding the polypeptide of the present invention
  • DNA nucleic acids having an RNAi effect.
  • the action of the antisense polynucleotide to suppress the expression of the target gene includes the following multiple factors. In other words, inhibition of transcription initiation by triplex formation, suppression of transcription by hybridization with a site where a local open loop structure was formed by RNA polymerase, inhibition of transcription by hybridization with RNA that is undergoing synthesis, and inhibition of intron.
  • the antisense nucleic acid (polynucleotide) used in the present invention may suppress the expression of a target gene by any of the above actions.
  • designing an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 'end of the mRNA of a gene is considered to be effective in inhibiting translation of the gene.
  • sequences complementary to the coding region or the 3 'untranslated region may also be used.
  • the polynucleotide containing the antisense sequence of the sequence of the untranslated region as well as the translated region of the gene is also included in the antisense polynucleotide used in the present invention.
  • the antisense polynucleotide to be used is ligated downstream of an appropriate promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is ligated on the 3 'side.
  • An antisense polynucleotide sequence is a sequence that is complementary to a target gene or a portion thereof. It is preferable that they are not completely complementary as long as they can effectively inhibit gene expression.
  • the transcribed RNA preferably has at least 90%, most preferably at least 95% complementarity to the transcript of the target gene.
  • the antisense polynucleotide In order to effectively inhibit the expression of a target gene using an antisense sequence, the antisense polynucleotide must have at least 15 nucleotides or more, preferably 100 nucleotides, and more preferably 500 nucleotides or more to cause an antisense effect. And usually has a chain length of no more than 3000 nucleotides, preferably no more than 2000 nucleotides.
  • the antisense polynucleotide can be obtained, for example, based on the sequence information of a polynucleotide (eg, SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7) encoding the polypeptide of the present invention based on the phosphorothione method (Stein, 1988 Physicochemicai properties of phosphorothioate
  • Suppression of the expression of an endogenous gene can also be performed using a nucleic acid (polynucleotide) encoding a ribozyme.
  • a ribozyme is an RNA molecule having catalytic activity. There are ribozymes with various activities. Among them, research on ribozymes as enzymes that cleave RNA has made it possible to design ribozymes for site-specific cleavage of RNA.
  • Some ribozymes have an active domain of about 40 nucleotides called the hammerhead type or the hapin type, some of which are more than 400 nucleotides in size, such as the group I intron type and the M1 RNA contained in RNaseP ( Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, (1990) Protein nucleic acid enzyme, 35: 2191).
  • the self-cleaving domain of the hammerhead ribozyme cleaves the 3 ′ side of C13 of G13U14C15, but it is important for the activity that U14 forms a base pair with A at position 9; Has been shown to be cleaved by A or U in addition to C (M. Koizumi et al., (1988) FEBS Lett. 228: 225).
  • ribozyme substrate-binding site is designed to be complementary to the RNA sequence near the target site, it is possible to create a restriction-enzymatic RNA-cleaving ribozyme that recognizes the UC, UU, or UA sequence in the target RNA (M.Koizumi et al., (1988) FEBS Lett. 239: 285, Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, (1990) Protein nucleic acid enzyme, 35: 2191,
  • Hairpin ribozymes are also useful for the purpose of the present invention. Hairpin-type ribozymes are found, for example, in the minus strand of satellite RNA of tobacco ring spotinoles (JMBuzayan Nature 323: 349, 1986). It has been shown that this ribozyme can also be designed to cause target-specific RNA cleavage (Y. Kikuchi and N. Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19: 6751, Kikuchi Hiroshi, (1992) Chemistry and Biology 30). : 112).
  • the preferred siRNA of the present invention ! /, as an embodiment, dermokine-a or
  • Double-stranded RNA having an RNAi (RNA interference) effect on the dermokine- ⁇ gene can be mentioned. More specifically, a double-stranded RNA (siRNA) having a sense RNA and an antisense RNA with respect to the partial sequence of the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 7 can be mentioned.
  • the enzyme called DICER comes into contact with double-stranded RNA, and the double-stranded RNA is converted into small interfering RNA or siRNA. It is thought to be broken down into smaller pieces called.
  • the double-stranded RNA having the RNAi effect in the present invention also includes the double-stranded RNA before being degraded by DICER. In other words, even a long-chain RNA that does not have the RNAi effect if it has the same length is expected to be degraded into siRNA having the RNAi effect in cells, so that the present invention
  • the length of double-stranded RNA is not particularly limited
  • RNA corresponding to the full-length or almost full-length region of the mRNA of the dermokine gene of the present invention can be degraded by, for example, DICER in advance, and the degradation product can be appropriately used.
  • This degradation product is expected to include a double-stranded RNA molecule (siRNA) having an RNAi effect.
  • siRNA double-stranded RNA molecule
  • the region on the mRNA expected to have the RNAi effect does not have to be particularly selected. That is, the region on the mRNA of the dermokine gene of the present invention having the RNAi effect does not necessarily have to be precisely defined! /.
  • the present invention also includes a molecule having a structure in which one end of the RNA molecule is closed, for example, siRNA (shRNA) having a hairpin structure. That is, a single-stranded RNA molecule capable of forming a double-stranded RNA structure in the molecule is also included in the present invention.
  • siRNA siRNA
  • the above "double-stranded RNA that can be suppressed by the RNAi effect" of the present invention is It can be appropriately prepared based on the base sequence of the dermokine gene of the present invention, which is a target of double-stranded RNA.
  • the double-stranded RNA of the present invention can be prepared based on the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 7. That is, based on the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 7, an arbitrary continuous RNA region of mRNA which is a transcript of the sequence is selected and corresponds to this region.
  • RNA sequence having a stronger RNAi effect from an mRNA sequence which is a transcript of the sequence by a known method.
  • one strand for example, the nucleotide sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 7
  • those skilled in the art can easily understand the other strand (complementary sequence). Chain) can be known.
  • Those skilled in the art can appropriately produce siRNA using a commercially available nucleic acid synthesizer. For synthesis of desired RNA, a general synthesis service can be used.
  • a DNA (vector) capable of expressing the above RNA of the present invention is also a DNA of the present invention.
  • a DNA (vector) capable of expressing the above-described double-stranded RNA of the present invention includes a DNA encoding one strand of the double-stranded RNA and a DNA encoding the other strand of the double-stranded RNA, respectively. DNA having a structure linked to a promoter so that it can be expressed.
  • the above-mentioned DNA of the present invention can be appropriately prepared by those skilled in the art by general genetic engineering techniques. More specifically, the expression vector of the present invention can be prepared by appropriately inserting a DNA encoding the RNA of the present invention into various known expression vectors.
  • a viral vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, and an adeno-associated virus vector
  • a non-viral vector such as ribosome or ribosome.
  • the present invention provides an antibody that binds to the polypeptide of the present invention.
  • antibody Includes polyclonal and monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single-chain antibodies, humanized antibodies, as well as Fab fragments containing Fab or the products of other immunoglobulin expression libraries.
  • the polypeptide of the present invention or a fragment or analog thereof, or a cell expressing the same, can also be used as an immunogen for producing an antibody that binds to the polypeptide of the present invention.
  • the antibodies are preferably immunospecific for a polypeptide of the invention. "Immunospecific" means that the antibody has a substantially higher affinity for the polypeptide of the invention than for its affinity for other polypeptides.
  • Antibodies that bind to the polypeptide of the present invention can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • a polyclonal antibody can be obtained, for example, as follows.
  • the polypeptide of the present invention or its fusion protein with GST is immunized to small animals such as egrets to obtain serum.
  • This is prepared by, for example, purification using ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, an affinity column to which the polypeptide of the present invention is coupled, and the like.
  • a monoclonal antibody for example, a small animal such as a mouse is immunized with the polypeptide of the present invention, a spleen is excised from the mouse, and the spleen is crushed to separate cells, and mouse myeloma cells and polyethylene glycol are used. And a clone that produces an antibody that binds to the polypeptide of the present invention is selected from the resulting fused cells (hybridomas).
  • the obtained no and ibridomas are transplanted intraperitoneally into the mouse, ascites is collected from the mouse, and the obtained monoclonal antibody is subjected to, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography. Alternatively, it can be prepared by purifying with an affinity column or the like to which the polypeptide of the present invention has been coupled.
  • the antibody of the present invention can be used for isolation, identification, and purification of the polypeptide of the present invention and cells expressing the same.
  • the present inventors have succeeded in actually producing antibodies (polyclonal antibodies) against the human dermokine- ⁇ , -j8, Kdap, and Suprabasin proteins of the present invention.
  • an antibody against human dermokine- ⁇ , -j8, Kdap, or Suprabasin shown in Examples described later can be mentioned.
  • dermokine knockout mice can be produced based on the findings found by the present inventors. The knockout animal (non-human animal) is very useful for studying the physiological role of SSC.
  • the present invention relates to an animal (non-human animal) in which the expression of the gene of the present invention (for example, dermokine- ⁇ / ⁇ ⁇ ) is artificially suppressed.
  • gene expression is artificially suppressed generally means that one or both of a gene pair has a gene mutation such as insertion, deletion, or substitution of a nucleotide and so on. Is suppressed! A case where the function as a normal protein is reduced or lost! /, Or a mutant protein is expressed! /, Is also included in the “suppression of gene expression”.
  • suppression includes the case where only the expression of one gene of the gene pair of the gene is suppressed when the expression of the gene is completely suppressed.
  • the target of genetic modification is usually an animal other than a human, preferably a rodent such as a mouse, a rat, a nose, a muster, a rabbit, and particularly a mouse. Is preferred.
  • ES cells to be subjected to gene modification are also preferably derived from mice, particularly those derived from rodents.
  • the “knockout animal” generally referred to is also included in the genetically modified animal of the present invention.
  • the means for artificially suppressing gene expression includes deletion of the entire gene or a part thereof.
  • the method include a method of deleting a gene and a method of deleting all or a part of the expression control region of a gene, and preferably a method of inactivating a gene by inserting a foreign gene into one or both of a gene pair.
  • the genetically modified animal is characterized in that a foreign gene is inserted into one or both of a gene pair.
  • the genetically modified animal of the present invention can be produced by those skilled in the art by generally known genetic engineering techniques.
  • a genetically modified mouse can be prepared as follows. First, DNA containing the etason portion of the gene of the present invention (for example, dermokine- ⁇ / ⁇ ⁇ ) is isolated from a mouse, and an appropriate marker gene is inserted into this DNA fragment to obtain a DNA fragment. -Construct a targeting vector. This targeting vector is introduced into a mouse ES cell line by the electo-portion method or the like, and a cell line in which homologous recombination has occurred is selected. As a marker gene to be inserted, an antibiotic resistance gene such as a neomycin resistance gene is preferable.
  • a cell line in which homologous recombination has occurred can be selected only by culturing in a medium containing the antibiotic.
  • a homologous recombinant was assayed by PCR and Southern blotting. It is advantageous to obtain a cell line in which one of the gene pairs of the gene of the present invention has been inactivated.
  • chimera production may be performed using a plurality of clones in addition to the homologous recombination site because unknown gene disruption may be caused by gene insertion. Preferred ⁇ .
  • the obtained ES cell line is injected into mouse blastoderm to obtain a chimeric mouse.
  • a mouse in which one of the gene pairs of the gene of the present invention is inactivated can be obtained.
  • a mouse in which both of the gene pair of the gene of the present invention are inactivated can be obtained.
  • Gene modification can also be performed in animals other than mice in which ES cells have been established by the same method.
  • an ES cell line in which both of the gene pair of the gene of the present invention are inactivated can be obtained by the following method. That is, by culturing an ES cell strain in which one of the gene pairs has been inactivated, in a medium containing a high concentration of an antibiotic, the cell line in which the other of the gene pairs has been inactivated, that is, the present invention, An ES cell line in which both gene pairs of genes have been inactivated can be obtained. Alternatively, it can be prepared by selecting an ES cell line in which one of the gene pairs has been inactivated, introducing a targeting vector again into this cell line, and selecting a cell line in which homologous recombination has occurred.
  • the marker gene to be inserted into the targeting vector is preferably different from the above-mentioned marker gene.
  • the present invention also provides a cell line established from the genetically modified non-human animal of the present invention.
  • Known methods can be used to establish the cell line derived from the genetically modified animal of the present invention.
  • the method of primary culture of fetal cells can be used. (Shinsei Kagaku Kenkyusho, Vol. 18, pp. 125-129, Tokyo Kagaku Doujin and Mouse Embryo Operation Manual, pp. 262-264, Modern Press).
  • the genetically modified animal of the present invention a cell line established from the animal, and an ES cell line can be used for detailed analysis of the function of the gene of the present invention. Furthermore, the genetically modified animal of the present invention can be used for a method for screening a compound that substitutes for the function of the protein of the present invention.
  • the polypeptide (protein) of the present invention is expected to have a keratinocyte differentiation-inducing action. Therefore, the present invention relates to a keratinocyte differentiation inducer (hereinafter, sometimes referred to as a “differentiation inducer”) containing the polypeptide (protein) of the present invention as an active ingredient.
  • a keratinocyte differentiation inducer hereinafter, sometimes referred to as a “differentiation inducer”
  • the present invention provides a keratinocyte differentiation inducer comprising a dermokine-a protein or a dermokine- ⁇ protein as an active ingredient.
  • the dermokine- ⁇ protein includes, for example, the polypeptide described in SEQ ID NO: 2 or 6.
  • the dermokine-j8 protein may be, for example, the polypeptide of SEQ ID NO: 4 or 8.
  • the present invention also includes a DNA encoding the above-mentioned polypeptide, which is a component of the present invention inducer.
  • the present invention also relates to an agent for inducing keratinocyte differentiation, comprising a substance for activating expression of SSC or dermokine- ⁇ / ⁇ protein.
  • the “protein expression activity” is a substance (protein) that significantly activates (increases) protein expression.
  • the “activation of expression” of the present invention includes the activation of transcription of a gene encoding the protein and the activation of translation of ⁇ or the transcription product of the gene.
  • the SSC or dermokine- ⁇ / ⁇ protein expression activator of the present invention includes, for example, a gene that binds to the transcriptional regulatory region (eg, promoter region) of the SSC or dermokine-aZjS gene, Substances that promote the transcription of transcription (such as transcription activation factor) It comes out.
  • a gene that binds to the transcriptional regulatory region (eg, promoter region) of the SSC or dermokine-aZjS gene Substances that promote the transcription of transcription (such as transcription activation factor) It comes out.
  • the expression activity of SSC or dermokine- ⁇ / ⁇ protein can be measured by methods known to those skilled in the art, for example, RT-PCR, Northern plotting, Western plotting. It can be easily implemented by a method or the like.
  • dermokine-a protein or dermokine- ⁇ protein are collectively referred to as “dermokine- ⁇ / ⁇ protein (gene)”.
  • the substance (compound) that suppresses the expression or function of (sometimes) is expected to have a keratinocyte differentiation inhibitory action.
  • the present invention relates to a keratinocyte inhibitor (hereinafter referred to as a “differentiation inhibitor”) containing a dermokine- ⁇ protein or dermokine- ⁇ protein expression or function inhibitory substance (compound) as an active ingredient. May be written).
  • the "expression inhibitor” according to the present invention which significantly lowers the expression of a protein, is a substance (a conjugate) that completely suppresses the expression.
  • the “inhibition of expression” of the present invention includes inhibition of transcription of a gene encoding the protein and inhibition of translation of ⁇ or the transcription product of the gene.
  • a preferred embodiment of the above-mentioned disulfide inhibitor is a drug containing, as an active ingredient, a compound selected from the group consisting of the following (a) to (d).
  • RNAi RNA interference
  • RNAi is a method for introducing double-stranded RNA having a sequence identical or similar to the target gene sequence into cells. When inserted, it refers to a phenomenon in which the expression of both the introduced foreign gene and the target endogenous gene is inhibited.
  • RNAi RNA used for RNAi need not be completely identical to the dermokine- ⁇ gene or a partial region of the gene, but preferably has complete homology.
  • Examples of the dermokine- ⁇ / ⁇ protein function inhibitor include the above antibodies of the present invention, for example, an antibody that binds to dermokine- ⁇ / ⁇ protein (an antibody that recognizes dermokine- ⁇ / ⁇ protein; dermokine- ⁇ / ⁇ protein antibody).
  • the antibody inhibits the function of the dermokine-aZ ⁇ protein by binding to the dermokine- ⁇ / ⁇ protein, and as a result, is expected to induce keratinocyte division.
  • the antibody of the present invention does not bind to proteins other than dermokine-aZjS and specifically binds to dermokine- ⁇ / ⁇ protein (recognizes dermokine-a / ⁇ protein).
  • it is an antibody.
  • the antibody that binds to the dermokine- ⁇ / ⁇ protein of the present invention may be used, for example, for the purpose of suppressing keratinocyte differentiation.
  • a human antibody or a humanized antibody is preferable in order to reduce immunogenicity.
  • the keratinocyte differentiation-inducing agent of the present invention is expected to be a therapeutic agent for diseases caused by abnormal keratinocyte differentiation (reduced differentiation).
  • diseases caused by abnormal keratinocyte differentiation include psoriasis vulgaris with parakeratosis, actinic keratosis and the like.
  • the keratinocyte disulfide inhibitor of the present invention is expected to be a therapeutic agent for a disease caused by enhanced keratinocyte dilation.
  • the disease include ichthyosis vulgaris with hyperkeratosis, sex-related ichthyosis vulgaris, wart vulgaris, lichen amyloid and lichen planus with thickening of the granular layer, vesicular congenital ichthyosis-like red Skin diseases such as dermatoses.
  • the keratinocyte migration inducer or the keratinocyte migration inhibitor of the present invention may be a physiologically acceptable carrier.
  • Oral or parenteral as a pharmaceutical composition by mixing with the body, excipients, or diluents, etc. Can be administered.
  • Oral preparations can be in the form of granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions, suspensions and the like.
  • a dosage form such as an injection, a drip, an external preparation, or a suppository can be selected. Injections include subcutaneous injections, intramuscular injections, and intraperitoneal injections.
  • the topical drug may be a nasal agent or an ointment. Formulation techniques for preparing the above-mentioned dosage form so as to contain the differentiation inducer of the present invention as a main component are known.
  • a tablet for oral administration can be produced by adding an excipient, a disintegrant, a binder, a lubricant and the like to the drug of the present invention, mixing and compression-shaping.
  • an excipient lactose, starch, mannitol and the like are generally used.
  • disintegrant calcium carbonate, carboxymethylcellulose calcium and the like are generally used. Gum arabic, carboxymethylcellulose, or polyvinylpyrrolidone is used as the binder.
  • Known lubricants include talc magnesium stearate and the like.
  • the tablet containing the drug of the present invention can be coated with a known coating for masking and enteric-coated preparations.
  • Ethyl cellulose, polyoxyethylene glycol, or the like can be used as the coating agent.
  • An injection can be obtained by dissolving the agent of the present invention as a main component together with a suitable dispersant, dissolving or dispersing in a dispersion medium.
  • a suitable dispersant dissolving or dispersing in a dispersion medium.
  • any of an aqueous solvent and an oily solvent can be used.
  • an aqueous solvent distilled water, physiological saline, Ringer's solution, or the like is used as a dispersion medium.
  • an oily solvent various vegetable oils such as propylene glycol are used as a dispersion medium.
  • a preservative such as paraben can be added as necessary.
  • known tonicity agents such as sodium salt and glucose can be added to the injection.
  • a soothing agent such as Shiridani Benzalko-Pam Hydrochloride Proforce In can be added.
  • the drug of the present invention can be used as an external preparation by preparing a solid, liquid, or semi-solid composition.
  • a solid or liquid composition an external preparation can be prepared by using the same composition as described above.
  • the semi-solid composition can be prepared by adding a thickener to an appropriate solvent, if necessary.
  • Water, ethyl alcohol, polyethylene glycol, or the like can be used as the solvent.
  • Thickeners include general For example, bentonite, polybutyl alcohol, acrylic acid, methacrylic acid, or polybutylpyrrolidone is used.
  • a preservative such as Shiojiri Benzalco-Pum can be added.
  • suppositories can be prepared by combining an oily base such as cocoa butter or an aqueous gel base such as a cellulose derivative as a carrier.
  • the drug of the present invention is administered to mammals including humans in a required amount within a safe dose range.
  • the dose of the drug of the present invention can be finally determined appropriately by the judgment of a doctor or veterinarian in consideration of the type of the dosage form, the administration method, the age and weight of the patient, the symptoms of the patient, and the like.
  • the drug of the present invention also includes, for example, dry skin, dandruff, acne, keratosis, eczema, skin peeling, pruritus,
  • dry skin, dandruff, acne, keratosis, eczema, skin peeling, pruritus For abnormal biological symptoms or injuries of the epidermis such as senile spots, moles, melasma, wrinkles, warts, skin spots, hyperpigmented skin, hyperkeratotic skin, inflammatory skin, age-related skin changes, etc.
  • the drug of the present invention is generally used for humans, but can also be used for skin diseases such as dogs and cats.
  • the present invention also provides a method for screening a keratinocyte differentiation inducer (a compound having a differentiation induction effect).
  • a preferred embodiment of the screening method of the present invention is a method using the expression level or activity of dermokine- ⁇ / ⁇ protein as an index. That is, a compound that increases the expression or activity of the dermokine- ⁇ / ⁇ protein is expected to have a keratinocyte differentiation-inducing action.
  • test compound is brought into contact with cells expressing dermokine-a and Z or j8 protein (gene).
  • the “cell” used in the present method is not particularly limited, but is preferably a human-derived cell.
  • “Cells that express dermokine- ⁇ / ⁇ protein” include cells that express endogenous dermokine-a / ⁇ protein, or cells into which exogenous dermokine- ⁇ / ⁇ gene is introduced, and the gene is expressed. You can use the cells that do.
  • Cells expressing the exogenous dermokine- ⁇ gene are usually expressed with the dermokine- ⁇ / ⁇ gene inserted. It can be prepared by introducing a vector into a host cell.
  • the expression vector can be prepared by general genetic engineering techniques.
  • test compound to be used in the screening method of the present invention is not particularly limited.
  • single compounds such as natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, and peptides, as well as compound libraries, expression products of gene libraries, cell extracts, cell culture supernatants, fermentation microorganism products, and marine products
  • compound libraries include, but are not limited to, biological extracts and plant extracts.
  • test compounds can be appropriately labeled and used as necessary.
  • the label include a radiolabel, a fluorescent label and the like.
  • the "contact" of a test compound with cells expressing the dermokine- ⁇ / ⁇ gene is usually performed by adding the test compound to a culture solution of cells expressing the dermokine- ⁇ / ⁇ gene. It does, but is not limited to this method.
  • “contact” can be performed by introducing a DNA vector expressing the protein into the cell.
  • the expression amount or activity of dermokine- ⁇ / ⁇ protein in cells expressing dermokine- ⁇ / ⁇ protein is measured in the following manner.
  • the measurement of the expression level can be easily performed by those skilled in the art, and can be appropriately performed by a general method, for example, the Northern plot method, the Westerlot method and the like.
  • "expression” means either transcription of a gene encoding a protein (production of mRNA) or translation of a transcription product of the gene.
  • the above-mentioned screening method is performed using the activity of dermokine- ⁇ / ⁇ protein as an index, the above-mentioned function (activity) of dermokine- ⁇ / ⁇ protein, for example, the distribution of keratinocytes of dermokine- ⁇ / ⁇ protein.
  • the dani induction activity can be used as an index.
  • the measurement of the activity of the dermokine-aZjS protein can be appropriately performed by those skilled in the art by a known method.
  • the above-mentioned “activity” is preferably the above-mentioned “dermokine-a”. / Expression of ⁇ protein in keratinocytes to cause the keratinocytes to differentiate into stratified epithelial cells ”.
  • test compound is not brought into contact with
  • a compound that increases the expression level or activity of the dermokine- ⁇ / ⁇ protein is selected.
  • the compound obtained by the above screening method is expected to be, for example, a therapeutic agent for a disease caused by abnormal keratinocyte differentiation.
  • the present invention also provides a method for screening a keratinocyte differentiation inhibitor (a compound having a differentiation-inducing action).
  • a preferred embodiment of the screening method of the present invention is a method using the expression level or activity of dermokine- ⁇ / ⁇ protein as an index. That is, a compound that decreases (inhibits) the expression or activity of the dermokine- ⁇ / ⁇ protein is expected to have a keratinocyte binding inhibitory action.
  • the above method of the present invention can be appropriately carried out according to the above-described method for screening for a differentiation inducer. That is, in the above method of the present invention, first, a test compound is contacted with cells expressing dermokine-a and Z or j8 protein (gene). Next, a compound that reduces the expression level or activity of the dermokine- ⁇ / ⁇ 8 protein compared to the case where the test compound is not contacted is selected.
  • the compound obtained by the above screening method is expected to be, for example, a therapeutic agent for a disease caused by enhanced keratinocyte differentiation.
  • a preferred embodiment of the above-described screening method of the present invention is a screening method using the above-mentioned "activity of expressing dermokine-a / ⁇ protein in keratinocytes to differentiate the keratinocytes into stratified epithelial cells" as an index. .
  • the present invention relates to a method for screening a keratinocyte differentiation inducer, comprising the following steps (a) to (c).
  • the present invention also provides a method for screening a keratinocyte migration inhibitor, comprising the following steps (a) to (c).
  • Another embodiment of the present invention is a method for screening for a keratinocyte differentiation inducer, comprising the following steps (a) to (c).
  • Still another embodiment of the present invention relates to a method for screening a keratinocyte inhibitor, comprising the following steps (a) to (c).
  • Cells expressing the dermokine- ⁇ / - ⁇ protein in the above step (a) are allowed as long as they can be cultured together with keratinocytes, and may be keratinocytes themselves. Keratinocytes are preferred. Cells expressing the dermokine- ⁇ / - ⁇ protein are usually ready for expression of the DNA encoding the dermokine- ⁇ / ⁇ protein. It can be produced by introducing the retained vector (dermokine- ⁇ / ⁇ expression vector) into keratinocytes.
  • the "activity of expressing dermokine- ⁇ / ⁇ protein in keratinocytes to divide the keratinocytes into stratified epithelial cells" in step (b) is, for example, a differentiation marker of stratified epithelium, preferably Can be measured as appropriate using the expression of involucrin as an index.
  • a compound that increases the expression of involucrin is determined to have a keratinocyte differentiation-inducing effect, and a compound that decreases the expression of involucrin is determined to have a keratinocyte-digesting inhibitory effect.
  • the dermokine- ⁇ / ⁇ protein of the present invention is expressed in stratified epithelium, it is expected that, for example, it will be a marker for cancer cells derived from stratified epithelium.
  • the presence or absence of the expression or activity of the dermokine- ⁇ / ⁇ protein of the present invention as an index it is possible to determine whether or not a desired cancer cell is a cancer cell derived from a stratified epithelial force. It is.
  • the present invention provides a method for examining whether or not a test cell is a cancer cell that also has a stratified epithelial force, using the presence or absence of dermokine-aZjS protein expression or activity as an index.
  • the method comprises the following steps (a) and (b).
  • test cell is a cancer cell derived from stratified epithelium when the expression level or the activity is changed as compared to a control
  • the "measurement” in the above step (a) can be appropriately performed by the above-described method.
  • the “control” in the above step (b) usually refers to a normal cell. Specifically, it is a cell that has been previously determined not to be a cancer cell, and is generally a cell derived from a healthy subject. In addition, a cancer cell that has been found in advance not to be a cancer cell derived from a stratified epithelial force can also be used as the “control”.
  • cells that have changed as compared with dermokine- ⁇ / ⁇ expression or activity control are cancer cells derived from stratified epithelium, for example, squamous epithelium It can be determined that the cell is a cancer cell.
  • the above “change” usually means “increase” and “decrease”, and preferably refers to "decrease”. Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, the cell in which the expression or activity of dermokine- ⁇ Z ⁇ is decreased as compared to a control is a cancer cell derived from stratified epithelium, for example, a squamous cell cancer cell. Can be determined.
  • the protein of the present invention is considered to be involved in abnormal proliferation and differentiation diseases derived from stratified epithelium.
  • stratified epithelium squamous cell carcinoma and basal cell carcinoma derived from stratified squamous epithelium (pseudostratified epithelium in the case of lung cancer) are often found in skin cancer, esophageal cancer, cervical cancer, lung cancer, thymic cancer and the like.
  • the protein (gene) of the present invention is predicted to be involved in the degree of cancer progression or division in these cancers, that is, it is useful as a marker for these cancers.
  • the “cancer cell from which stratified epithelial force is also derived” preferably refers to the above-mentioned cancer cell.
  • the above method of the present invention is effective for squamous cell carcinoma of the lung bronchi (pseudostratified epithelium) which is not originally stratified squamous epithelium.
  • the present invention relates to a method for diagnosing squamous cell carcinoma or basal cell carcinoma in a subject, comprising the following steps (a) and (b).
  • the above test (diagnosis) method can be performed using a body fluid such as blood as a test sample.
  • a body fluid such as blood as a test sample.
  • the protein of the present invention is a secretory protein, particularly when the protein of the present invention is secreted in blood, diagnosis of cancer derived from stratified epithelium, for example, esophageal cancer or lung cancer, may be appropriately performed. It is possible to implement.
  • the protein of the present invention is considered to be involved in various skin diseases. For example, in a pathological condition such as psoriasis in which epidermal turnover is enhanced, the basal layer is remarkably increased, proliferation is increased, and parakeratosis occurs. In lichen planus, etc. In, hyperkeratosis without granulation and hypertrophy of the granular layer are observed. It is also conceivable that the protein of the present invention (for example, dermokine-aZj8) is involved in diseases caused by abnormal differentiation and proliferation as described above.
  • the present invention provides a method for diagnosing a skin disease in a subject, comprising the following steps (a) and (b).
  • step (b) when the expression amount or activity in step (b) is increased, it is determined that the skin disease is associated with an increase in the expression or activity of dermokine- ⁇ / ⁇ . You. On the other hand, when the expression level or the activity is decreased, it is determined that the dermokine-aZjS is suffering from a skin disease associated with the decreased expression or activity.
  • the “skin disease” usually refers to a disease associated with (caused by) a change in the expression or activity of dermokine- ⁇ / ⁇ protein. More specifically, examples of skin diseases include psoriasis, lichen planus, keratosis, eczema, pruritus, melasma, and inflammatory dermatitis.
  • Examples of a biological sample that can be subjected to the above-mentioned diagnostic method include a skin tissue (cells) of a subject, and a sample containing cells or a cell extract derived from the subject. If there is, there is no particular limitation.
  • the subject usually refers to a human, but is not particularly limited as long as it is an organism having the protein of the present invention (for example, dermokine- ⁇ / ⁇ ).
  • the test and diagnosis method of the present invention for example, a skin disease diagnosis method
  • animals such as dogs and cats.
  • the expression or activity of dermokine- ⁇ / ⁇ protein is measured by measuring the expression or activity of SSC of a complex containing dermokine- ⁇ / ⁇ protein as a component. Can also be implemented.
  • the present invention relates to a dermokine-a protein or a dermokine- ⁇ protein, or a keratinocyte sliver-inducing agent obtained by the above-described screening method. And a method for treating or preventing a disease caused by reduced keratinocyte component-inducing ability.
  • the present invention relates to a compound selected from the group consisting of the following (a) to (d), or a (therapeutically effective amount) of a keratinocyte diversion inhibitor obtained by the above-mentioned screening method.
  • a method for treating or preventing a disease caused by enhanced keratinocyte dysfunction characterized by administering to a subject.
  • the present invention also relates to the use of a dermokine-a protein or a dermokine- ⁇ protein, or a keratinocyte induction agent obtained by the above screening method, in the manufacture of a therapeutic agent for a disease caused by reduced keratinocyte induction induction. About.
  • the present invention also relates to a compound selected from the group consisting of the following (a) to (d), or a keratinocyte disulfide inhibitor obtained by the above-mentioned screening method, due to keratinocyte disulfide enhancement.
  • a compound selected from the group consisting of the following (a) to (d), or a keratinocyte disulfide inhibitor obtained by the above-mentioned screening method due to keratinocyte disulfide enhancement.
  • examples of the disease caused by reduced keratinocyte induction induction include psoriasis vulgaris or actinic keratosis.
  • examples of the disease caused by the enhancement of cynocytosis include ichthyosis vulgaris with hyperkeratosis, hereditary ichthyosis vulgaris, wart vulgaris, lichen amyloid, and lichen planus with thickening of the granular layer.
  • bullous congenital ichthyosis-like erythroderma can be mentioned bullous congenital ichthyosis-like erythroderma.
  • the individual in the treatment or prevention method of the present invention generally refers to a patient with the above-mentioned diseases, and is not particularly limited, but is preferably a human.
  • administration to a patient can be performed by a method known to those skilled in the art, such as intraarterial injection, intravenous injection, and subcutaneous injection.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the compound can be encoded by DNA
  • the DNA may be incorporated into a vector for gene therapy to perform gene therapy.
  • Examples of gene therapy vectors include, for example, retrovirus vectors, adenovirus vectors, virus vectors such as adeno-associated virus vectors, and non-virus vectors such as ribosomes.
  • the target DNA can be administered to a patient by an ex vivo method or an in vivo method using the vector.
  • NHEK Normal human embryonic keratinocytes
  • KURABO Osaka, Japan
  • NHEK cells were cultured in serum-free medium Humedia KG2 (KURABO).
  • 293ZEBNA-1 cells were purchased from Invitrogen (San Diego, CA) and maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (Sigma) supplemented with 10% fetal calf serum.
  • Anti-His antibody Penta'His Antibody.BSA free
  • QIAGEN Valencia, CA
  • mouse skin cDNA library was constructed and equalized according to the previously described method (Komiya T, Tanigawa Y, Hirohashi S: Anal. Biochem. 254: 23-30, 1997). Briefly, mouse skin cDNA was constructed from total RNA from mouse back skin (8-week-old female BalbZc mice) using a Notl restriction site and a primer Oligo _ ((one)). After amplification, two equalization cycles were performed according to the method previously described (Ko: Nucleic Acids Res. 18: 5705-5711, 1990; Takahashi N, Ko MSH: Genomics 23: 202-210, 1994). The Cot values at each stage of the equalization (El and E2) were 10 and 100, respectively.
  • Equalization was assessed in duplicate by quantitative real-time PCR analysis as described below.
  • the following gene-specific primer pairs were constructed from the cDNA sequences NM016958, NM027011, NM008401 and NM008508: mouse keratin 14 (5, -GGACGCCCACCTTTCATCTTC-3 '(SEQ ID NO: 9): forward, 5'-ATCTGGCGGTTGGTGGAGG-3 '(SEQ ID NO: 10): reverse direction),
  • Mouse keratin 5 (5'-CAGTTCTACATTTGTGTTGCACGTC-3, (SEQ ID NO: 11): forward, 5, -TTGGACAGACTCTGGAGGAAGTCAG-3, (SEQ ID NO: 12): reverse), mouse integrin a -M (5, -TTGAAAGGACCCCAGTGCTGAACTGC- 3, (SEQ ID NO: 13): forward, 5 '-ATGGAGCTGCCCACAATGAGTGGTACAG-3' (SEQ ID NO: 14): reverse), and
  • the E2 library was digested with Notl and Sail, and the resulting fragment was digested with pBlueScript KS (-) (
  • HT-ISH in 96-well plates was performed as previously described (Komiya T, Tanigawa Y, Hirohashi S: Anal. Biochem. 254: 23-30, 1997). Briefly, adult mouse foot-skin was also newly isolated from 8-week-old female BalbZc mice. The isolated skin was fixed with 1% getyl pyrocarbonate (DEPC) in phosphate buffered saline (PBS) for 1 hour at room temperature. The sample was then dehydrated, embedded, sectioned, and hybridized to mounts and 96-well plates.
  • DEPC getyl pyrocarbonate
  • PBS phosphate buffered saline
  • RNA from various adult mouse tissues was prepared according to the method described by Chomczynski and Sacchi (Chemczynski P, Sacchi N: Anal. Biochem. 162: 23-30, 1997.). Total RNA (20 g) was electrophoresed and transferred to a Hybond-N + membrane (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, U.K.).
  • First strand cDNA was prepared from human skin total RNA (Stratagene) using Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen).
  • the DNA fragment encoding the ORF of human dermokine-a and -j8 was prepared using the 5 'SalI-dermokine-a primer (SEQ ID NO: 17Z primer (SEQ ID NO: 18ZGCGGCCGCCCAAAACTTCACCCACTGCAGAGGG) and the 5' SalI-dermokine- ⁇ primer
  • 3'NotI-suprabasin primers (SEQ ID NO: 24Z) were amplified. These primers were designed based on the following GenBank accession numbers: AK003695 (dermokine-a), BC035311 (dermokine-j8), BX112106 (Kdap) And BC063640 (suprabasin).
  • normal human epidermal keratinocytes were placed in a dish (2.5 X 10 3 Zcm 2 ) in awake edia KG2 medium (Ca 2+ concentration 0.15 mM, containing pituitary pituitary extract (BPE)). The cells were seeded at a density and cultured for 2 days. The cells were then washed several times with normal Ca 2+ medium (Ca 2+ 0.15 mM) or high Ca 2+ medium (Ca 2+ 1.5 mM) without BPE, respectively. Keratinocytes were then cultured in normal Ca 2+ medium for 2, 4 and 6 days or in high Ca 2+ medium for 2 days. These cells were also prepared using RNeasy Mini Kit (QIAGEN) for total RNA for qRT-PCR. Also, if you want to perform transmission, use TransIT LT1
  • keratinocyte (Mirus) the cells were transfused into keratinocytes cultured on 0.15 mM Ca 2+ on the second day.
  • Quantitative real-time PCR was performed in duplicate with the QuantiTect SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) and the ABI PRISM 7700 sequence Detection system (Applied Biosystems, Foster city, A) by observing the increase in SYBRGreen I dye fluorescence. .
  • the primer was designed to match a single real-time PCR thermal profile (95 ° C for 15 minutes and 40 cycles of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute) so that multiple transcripts could be analyzed simultaneously. All data were standardized for an internal standard (daricelaldehyde-3-phosphate dehydrogenase mRNA; A Ct method, User Bulletin 2, Applied Biosystems).
  • the set of primers is as follows.
  • mice The foot-epidermis of mice is thicker than the epidermis between follicles such as the skin on the back, and its morphology is similar to that of human epidermis. Therefore, the present inventors set out the sections of mouse foot-epidermis (8-week-old Balb / c mice) to identify layer-specific expression of genes in high-throughput in situ hybridization (HT-ISH). It was used. After the sections were placed on each well of a 96-well plastic plate (100 plates; total 9600 sections), a DIG-labeled cRNA probe, which was also prepared for an equalized cDNA library, was hybridized. Hybridization signals were observed in approximately 11,000 out of 9600 sections.
  • HT-ISH high-throughput in situ hybridization
  • Cyclophilin A, Kdap, prothymosin a, diazepam binding inhibitor, tubulin 13-2 chain homolog, lamin A, nuclear distribution C homolog, desmoplakin, keratin-related protein 16-5, nucleoside diphosphate kinase, small proline rich-like 2 And HT-ISH signals for oral likulin are shown in FIG. 1B as an example.
  • the expression of cyclofilin, Kdap, and oral ricklin were localized to the basal layer Z, the basal layer, and the condylar layer, respectively (AL-Daraji WI, Grant KR, Ryan K, Sacton A , Reynolds NJ:
  • the present inventors identified a novel cDNA fragment (SK063F08) in which the in situ hybridization signal was specifically detected in the spinous layer of these 116 cDNA clones (FIG. 2A).
  • a search was made of a publicly available mouse EST database to identify an EST clone (AK003695) having the entire sequence of SK063F08 (FIG. 2B).
  • AK003695 EST clone
  • This AK003695 EST contains a 22 bp short 5'-untranslated region (UTR), which encodes 104 amino acids (SEQ ID NO: 53)! /, A 315 bp open reading frame (ORF), and polyadenyl. It is composed of a 324 bp 3'-UTR containing an activation signal!
  • the corrected AK081753 EST sequence had a 170 bp short 5'-UTR, a 1554 bp ORF encoding a 517 amino acid protein, and a 320 bp 3'-UTR containing a polyadullation signal! / (FIG. 2B). .
  • BMP bone morphogenetic protein
  • the gene for Ensembl Human Genome Browseri on chromosome 19ql3.1 [this gene maps to human dermokine- ⁇ and -j8 (ENSG00000161249), which extends over the range of 14-kb.
  • human dermokine- ⁇ and -j8 consist of 6 and 16 exons, respectively.
  • exon 1 of the dermokine- ⁇ gene has both a putative translation initiation site and a signal sequence and is located between exons 11 and 12 of the dermokine-18 gene, which are transcribed by separate promoters. It is suggested that The putative stop codon was contained within exon 5 of dermokine-a, ie, exon 15 of dermokine-.
  • mice dermokine-a / -j8 gene was mapped to ENSMUSG00000036665 on the chromosome 7 in the Ensembl Mouse Genome Browser as ENSMUSG00000036665, a region shared with human 19ql3.1 in synth.
  • the exact genomic organization of the mouse dermokine-j8 gene has not been determined due to incomplete information from the available genomic databases, but the same genomic organization has been identified around the mouse dermokine- ⁇ locus.
  • keratinocyte-related peptide suprabasin and keratinocyte differentiation-related protein has been mapped to two genes (Fig.3B).
  • T basaki M, Obara M, Yoshizato K: Kdap, a novel gene associated with the stratification of the epithelium.
  • the suprabasin ⁇ dermokine- ⁇ / -j8 and Kdap genes are in this order in the same direction as transcription.
  • the testis-specific dalyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and ubiquitous GPR43 genes encoding keratinocyte-specific proteins are located upstream of suprabasin and downstream of Kdap, respectively.
  • the SignalP server estimated that not only dermokine-a / -j8 but also Kdap and suprabasin had putative signal sequences at their N-termini (FIG. 4A). This has been previously noted in Kdap (Oomizu S, Sahuc F, Asahina K, Inamatsu M, Matsuzaki T, Sasaki M, Obara M, Yoshizato K: Kdap, a novel gene associated with the stratification of the epithelium. Gene. 256: 19-27, 2000.), while the N-terminal hydrophobic sequence of suprabasin is considered as a potential transmembrane domain! /, (Park uT, Lim SE, Jang b, Morasso MI: Suprabasin, a novel epidermal differentiation marker and potential cornified envelope precursor.J. Biol. Chem.
  • the dermokine- ⁇ / —j8, Kdap, and suprabasin genes form a gene complex, and all of their products are secreted from keratinocytes. I want to guess. To test this idea, human dermokine-oV-jS, Kdap and suprabasin (0.7-kb transcript) cDNAs were transformed into mammalian expression vectors.
  • the protein was expressed. These fusion proteins were transiently expressed in cultured 293 / EBNA-1 cells and were detected in the culture medium by immunoblotting using an anti-His antibody (FIG. 4B). Interestingly, in the SDS-PAGE gel, the cells detected in the medium were significantly shifted upward in comparison to the estimated molecular mass of the fusion protein, indicating that the secreted protein This suggests that post-translational modification was possibly due to glycosylation and Z or intermolecular disulfide bonds.
  • suprabasin- SEAP yields 0.15 mg / L, 0.3 mg / L, 13.5 mg / L, and 15 mg / L, respectively
  • the expression pattern of the 0.7-kb and 2.2-kb splicing variants of the suprabasin gene was very similar to that of dermokine-a / -j8 (Suprabasin FIG. 5A). Furthermore, the present inventors examined the expression of these proteins by quantitative RT-PCR (qRT-PCR) (Table 1).
  • Table 1 shows the results of quantitative real-time RT-PCR analysis of the expression of dermokine-a, - ⁇ , Kdap and suprabasin in various epithelial tissues.
  • Total RNA was prepared from various epithelial tissues from 8-week-old female Balb / c mice and subjected to SYBR Green-based quantitative real-time RT-PCR using primers specific for mouse dermokine- ⁇ -j8 Kdap and suprabasin. Done. All data were normalized for an internal GAPDH mRNA control.
  • the present inventors compared the expression of the SSC product in the stratified epithelium in detail, and performed in situ hybridization analysis on serial sections of the epidermis of the mouse foot. Serial sections of eight epidermis were hybridized with antisense or sense cRNA probes for dermokine- ⁇ / j8, Kdap and suprabasin. As shown in Fig. 5B, dermokine- ⁇ / - ⁇ (SK063F08, Fig. 2B), dermokine- j8 probe (j8 probe, Fig. 2B) and suprabasin antisense probe are distributed evenly through the epidermal spinous layer. A hybridization signal occurred.
  • the PCDNA3.1-SEAP (His) vector used in Fig. 4 to generate a polyclonal antibody to human dermokine- ⁇ , -j8, Kdap, and Suprabasin used human dermokine- ⁇ , Kdap, Suprabasin was introduced, and Dermokine- ⁇ was deleted from the common part with dermokine- (dermokine-j8- ⁇ C) (Fig. 8A). And expressed transiently.
  • the resulting culture medium was purified as a single band using TALON Superflow Metal Affinity Resin (FIG. 8B). Eggs were immunized with these fusion proteins to obtain antisera.
  • the mouse dermokine- ⁇ A C-SEAP (His) 6 was immunized to a rat (Wister rat female) to produce monoclonal antibodies (referred to as Anti-hDK mAb and Anti-mDK mAb, respectively).
  • the cells were transfected into 293 / EBNA-1 cells, and the obtained culture supernatant was subjected to SDS-PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane. The membrane was reacted with Anti-hDK mAb and Anti-mDK mAb, and immunoblot was performed.
  • each well was washed once with a phosphate buffer solution containing 0.02% Tween20 (0.02% T-PBS), and the prepared Anti-hDK mAb and Anti-mDK mAb (the supernatant of a non-hybridoma serum-free culture) were added to 50 ⁇ l. 1 was added and incubated at room temperature for 1 hour. The solution in each well was discarded and washed three times with 0.02% T-PBS to immobilize the antibody. Next, each well was treated at 65 ° C for 10 minutes and diluted with PBS. 6.25-50 nM human / mouse dermokine- ⁇ -SEAP (His) or human / mouse dermokine- ⁇ AC-SEAP (His) 50 ⁇ 1
  • the alkaline phosphatase activity of C-SEAP (His) was detected.
  • the reaction solution is 1420 ARVO
  • the measurement was performed at 460 nm with a multilabel counter, Wallacl420 Manager.
  • Figure 10A mouse
  • Figure 10B human
  • Anti-hDK mAb and Anti-mDK mAb bound to dermokine-j8 in a concentration-dependent manner.
  • the recombinant protein containing only SEAP hardly bound to the immobilized antibody.
  • the column operation was performed at 4 ° C. using an AKTAexplorerlOS system (P-903 pump, UV-900 monitor, pH / C-900 monitor, Frac-901 fraction collector-1; manufactured by Amersham Biosciences).
  • the protein in each fraction was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis (15% acrylamide gel).
  • the present invention has shown that SSCs are expressed in multilayered epithelia and are induced in a differentiation-specific manner. Therefore, it is possible that SSCs are involved in the division and Z or proliferation of epithelial keratinocytes. By creating dermokine knockout mice, the exact physiological role of SSC can be examined. In addition, this gene can be used as a novel marker in the characterization of skin and other multilayered epithelial diseases

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Abstract

　表皮分化にかかわる新規遺伝子を同定する目的で、ハイスループットin situハイブリダイゼーションシステム法をマウス足蹠表皮に対して適用した。その結果、約100種のユニークなmRNAの表皮における発現パターンが検出された。その中から、基底層上層の分化した表皮層で発現される2つの新規分泌タンパク質dermokine-αおよび-βを同定することに成功した。また、上記タンパク質をコードする遺伝子は、新規遺伝子複合体(SSC)を構成していることが判明した。

Description

明 細 書
表皮分化に関与する新規遺伝子、およびその利用
技術分野
[0001] 本発明は、重層上皮で発現する新規分泌タンパク質に関する。
背景技術
[0002] 表皮は高度に角化した典型的な重層扁平上皮であり、これは基底細胞層、有棘細 胞層、顆粒細胞層および角化細胞層から構成される。表皮細胞 (ケラチノサイト）は基 底細胞層から角化細胞層へと上方に移動する。この移動は特徴的な形態変化と同 時に、ケラチノサイトの特徴的な分ィ匕を伴う。分ィ匕の最終ステージでは、ケラチノサイ トは細胞内オルガネラを失い、角化層を構成するために扁平形になる。そこで、ケラ チノサイト分ィ匕の間の遺伝子発現への空間的および時間的な変化パターンが、皮膚 病学者だけでなく、細胞生物学者にお 、ても興味をひ 、て 、る (非特許文献 1一 3)。 例えば、基底膜におけるケラチノサイトは増殖性が高ぐ基底型のケラチン対 (K5Z K14)を発現する。ケラチノサイトは基底膜から離れると分ィ匕し、 K5/K14から基底層上 層型の対である K1ZK10までのケラチン発現における変化によって特徴付けられる（ 非特許文献 4一 7)。さらに、その上部の有棘細胞および顆粒細胞層においても、ケ ラチノサイトは、角化膜 (CE)および架橋結合酵素であるトランスグルタミナ一ゼ（ TGase) 1などの前駆タンパク質の合成を開始する。角化膜 (CE)は角化層ではケラチ ノサイトのプラスマ膜の細胞質顆粒側で高度な不溶性構造を有し、 TGase 1によって 架橋結合される様々なタイプのタンパク質力も成り立って 、る（非特許文献 8— 11)。
[0003] 表皮のノ リア一機能の観点から、 CEの構成要素はかなり同定されており、例えばシ スタチン、デスモプラキン、ェンポプラキン、エラフィン、フィラグリンおよびその他のケ ラチン類はもちろんのこと、インボルクリン、スモールプロリンリッチタンパク質ファミリー メンバー（SPRRP)および口リクリンがある（非特許文献 11)。さらに、 repetin、 hornein、 periphilinが推定 CE前駆タンパク質として同定されている（非特許文献 12— 14)。興 味深いことに、これらの CE-関連タンパク質の多くは、ヒト染色体 lq21 (非特許文献 15 一 17)およびマウス 3番染色体（非特許文献 18および 19)上のいわゆる「Epidermal defferentiation complex(EDC)」としてクラスター化した遺伝子によってコードされる。し かし、ペリプラキン、 sciellin、ェンポプラキン、 horneinおよび periphilinをコードしてい る 、くつかの CEタンパク質遺伝子は EDCに位置して!/ヽな ヽ（非特許文献 20— 22、 1 3、 14参照)。 EDCは、角化過程の原因となる少なくとも 32種の遺伝子力 なり、これ らの遺伝子はその構造に基づ ヽて 3つのグループに分類される（非特許文献 23参照 ) o第 1のグループであるインボルクリン、口リクリンおよび SPRRPはそれぞれ中心領域 に短い縦列反復配列を有する（非特許文献 24)。第 2のグループであるプロフイラダリ ン、トリコヒアリンおよび repetinは、融合遺伝子サブグループと呼ばれ、 N末端領域に EFノヽンドドメインを有し、その後に多数の縦列反復配列がある。第 3のグループであ る S 100ファミリーのメンバーは、 EFハンドモチーフをもつ。
[0004] 現在、マウスゲノムと同じくヒトにおける全ての遺伝子が同定され、今後はケラチノサ イトの分ィ匕における遺伝子発現パターンの空間的および時間的な変化力 ゲノムワイ ドな方法でより計画的に分析されると考えられる。
最近の分子生物学的および生化学的技術の進歩により、 in vivoおよび in vitroにお いて、ヒトケラチノサイト中の多数の遺伝子およびタンパク質の発現を研究することが 可能になった。 Celisらは、 2次元ポリアクリルアミド電気泳動を用い、表皮および培養 したケラチノサイト中の多数のタンパク質の発現を明らかにした (非特許文献 25)。 Katzらは、ケラチノサイト培養液中の分泌タンパク質の部分的カタログを報告した (非 特許文献 26)。無作為に配列決定したケラチノサイト cDNAライブラリー (非特許文献 27および 28)、ディファレンシャルディスプレイ PCR (非特許文献 29— 34)、 cDNAマ イクロアレイ (非特許文献 35— 37)、遺伝子発現の連続分析 (非特許文献 38および 39)並びにシグナル配列トラップ (非特許文献 40)は、ケラチノサイトの多くの遺伝子 およびタンパク質の発現プロファイルを提供した。
[0005] しかし、皮膚全体を cDNAライブラリーまたは細胞溶解液の調製に使用する場合は 、これは、ケラチノサイト、メラニン細胞、繊維芽細胞、皮脂性上皮細胞 (sebocyte 内 皮細胞、神経細胞または筋細胞のような異種構造を含み、このことがケラチノサイトそ れ自身の遺伝子発現プロファイルの分析を困難にして 、る。一部の報告にぉ 、て、 研究者達は、初代培養したケラチノサイトを使用し、かつこれらを鑑別し、浮遊培養 (raft culture)により重層上皮を形成し、ケラチノサイト自身の情報を得ている（非特許 文献 41一 45)。しかし、この系においても表皮の個別の層における遺伝子発現情報 を得るのは困難である。
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非特許文献 40 : Bonkobara M, Das A, Takao J, Cruzjr PD, Ariizumi K著、「
Identification of noval genes for secreted and membrane-anchored proteins in human keratinocytes -」、 Brit. J. Dermatology, 2003年、 Vol.148, p.654— 664
非特許文献 41 : Bell E, Ehrlich HP, Buttle DJ, Nakatsuji T著、「Living tissue formed in vivo and accepted as skm— equivalemt tissue of full thickness.」、 Science、 1981牛、 Vol.211, p.1052-1054
非特許文献 42 : Mackenzie IC, Fusenig NE著、「Regeneration of organized epithelial structure 、 J. Invest. Dermatol.、 1983年、 Vol.81, p.l89s— 194s
非特許文献 43 :Asselineau D, Prunieras M著、「Reconstruction of simplified skin: control of fabrication -」、 Br. J. Dermatol.、 1984年、 Vol.111, p.219-222
非特許文献 44 : Parenteau NL, Nolte CM, Bilbo P, Rosenberg M, Wilkins LM,
Johnson EW, Watson S, Mason VS, Bell E著、「Epidermis generated in vitro:
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発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、表皮分化に関与する新規遺伝子の提供を課題とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。表皮分化にかかわる新 規遺伝子を同定する目的で、本発明者らは「ノヽイスループット in situノヽイブリダィゼー シヨンシステム (HT-ISH)」と呼ばれる最近確立された遺伝子スクリーニング方法（ Komiya T, Tanigawa Y, Hirohashi S: Anal. Biochem. 254:23-30, 1997)をマウス足躕 表皮に対して用いた。この方法は、個々の細胞層を分離することなぐ「無傷の」表皮 におけるケラチノサイトの個別の層における遺伝子の発現パターンを分析することが 可能である。この方法をマウス足底表皮切片に適用することにより、本発明者らは無 傷の表皮において層特異的な発現を示す一 100個の遺伝子の同定に成功した。そ の中から、本発明者らは、表皮の有棘層で特異的に発現する分泌ペプチドである 1 つの新規な遺伝子の 2つのスプライシングノ リアントである dermokine- aおよび- βを 同定および特長付けした。ゲノムデータベースをこれらの配列に関して検索したとこ ろ、その遺伝子が 2つの他のケラチノサイトタンパク質である、 suprabasin (スプラバシ ン）（Park GT, Lim SE, Jang S, Morasso MI: J. Biol. Chem. 277:45195-45202, 2002) およびケラチノサイト分化関連タンパク質（Kdap) (Oomizu S, Sahuc F, Asahina K, Inamatsu M, Matsuzaki T, Sasaki M, Obara M, Yoshizato K: Gene. 256: 19—27, 2000 )をコードするゲノム遺伝子座に位置することが判明した。本発明者らは、 suprabasin および Kdapも分泌ペプチドであること、および dermokine- a Z- j8、 suprabasinおよび Kdapが重層上皮において主に発現されることを示した。これらの知見は、
SSC(Stratified epithelium secreted peptides complex)と仮に命名された新規な重層 上皮関連遺伝子クラスターの存在を明らかにした。
さらに本発明者らは、 dermokine- o;力 ケラチノサイトに発現させることにより該ケラ チノサイトを重層上皮細胞へ分化させる活性を有することを見出した。
以上の結果は、 dermokine- α - β , Kdapおよび suprabasinという 4種の分泌タンパ ク質が、 SSCと命名した新規遺伝子複合体を形成し、重層化の開始時に発現され、ケ ラチノサイトの分ィ匕誘導に関与して 、ることを示して 、る。 GeneBank AY444557, AY444558には、 dermokine- /- β遺伝子の塩基配列と類 似の配列が公開されて 、るが、本明細書に記載の dermokine- α /~ β遺伝子と塩基 配列が異なっており、またその活性も明らかにされていない。
本発明は、表皮分化に関与する新規遺伝子、および該遺伝子を含む遺伝子複合 体に関し、より具体的には、
〔1〕 下記 (a)— (d)の 、ずれかに記載のポリヌクレオチド、
(a)配列番号： 2、 4、 6または 8のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なる（を含有す る）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(b)配列番号： 1、 3、 5または 7のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むポ リヌタレ才チド
(c)配列番号： 2、 4、 6または 8のいずれかに記載のアミノ酸配列において、 1もしくは 複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列からなるポ リペプチドであって、ケラチノサイトに発現させることにより該ケラチノサイトを重層上皮 細胞へ分ィ匕させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(d)配列番号： 1、 3、 5または 7のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAとストリン ジヱントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドであって、ケラチノサイトに発 現させることにより該ケラチノサイトを重層上皮細胞へ分化させる活性を有するポリべ プチドをコードするポリヌクレオチド
〔2〕 ケラチノサイトの分ィ匕または増殖に関与する遺伝子であって、分泌タンパク質を コードする〔1〕に記載のポリヌクレオチド、
〔3〕 〔1〕または〔2〕に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、 〔4〕 〔1〕または〔2〕に記載のポリヌクレオチドが挿入されたベクター、
[5] 〔1〕もしくは〔2〕に記載のポリヌクレオチド、または〔4〕に記載のベクターを保持 する宿主細胞、
〔6〕 [5]に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産生さ せたポリペプチドを回収する工程を含む、〔3〕に記載のポリペプチドの製造方法、 〔7〕 共通の遺伝子発現調節下にあることを特徴とする遺伝子複合体であって、 ( 1) Kdap遺伝子、 (2) dermokine- 遺 1zS子、 (3) dermokine- β遺 is子、および {4) suprabasin遺伝子の各遺伝子カゝら構成されるケラチノサイトの分ィ匕または増殖に関与 する遺伝子複合体、
〔8〕 〔1〕または〔2〕に記載のポリヌクレオチドと特異的にノ、イブリダィズするポリヌクレ ォチドであって、少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を持つポリヌクレオチド、
〔9〕 〔1〕もしくは〔2〕に記載のポリヌクレオチドまたはその一部に対するアンチセンス ポリヌクレオチド、
〔10〕 〔3〕に記載のポリペプチドに結合する抗体、
〔11〕 dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質を有効成分として含 む、ケラチノサイト分化誘導剤、
〔12〕 以下の (a)—（d)力もなる群より選択される化合物を含む、ケラチノサイト分ィ匕 抑制剤、
(a) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の転写産物に対するアンチセ ンス核酸
(b) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の転写産物を特異的に開裂 するリボザィム活性を有する核酸
(c) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の発現を、 RNAi効果による阻 害作用を有する核酸
(d) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質と結合する抗体
〔13〕 以下の工程 (a)—（c)を含む、ケラチノサイト分化誘導剤のスクリーニング方法
(a) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質を発現する細胞と、被検 化合物を接触させる工程
(b)該細胞における dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質の発現 量または活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、前記発現量または活性を上昇させ る化合物を選択する工程
〔14〕 以下の工程 (a)—（c)を含む、ケラチノサイト分ィ匕抑制剤のスクリーニング方法 (a) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質を発現する細胞と、被検 化合物を接触させる工程
(b)該細胞における dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質の発現 量または活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、前記発現量または活性を低下させ る化合物を選択する工程
〔15〕 以下の工程 (a)—（c)を含む、ケラチノサイト分化誘導剤のスクリーニング方法
(a) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質、またはそれらを発現す る細胞と、ケラチノサイト及び被検化合物を共存させる工程
(b)ケラチノサイトの重層上皮細胞への分ィ匕を測定する工程
(c)被検化合物を共存させな!/、場合と比較して、重層上皮細胞への分化を上昇させ る化合物を選択する工程
〔16〕 以下の工程 (a)—（c)を含む、ケラチノサイト分ィ匕抑制剤のスクリーニング方法
(a) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質、またはそれらを発現す る細胞と、ケラチノサイト及び被検化合物を共存させる工程
(b)ケラチノサイトの重層上皮細胞への分ィ匕を測定する工程
(c)被検化合物を共存させない場合と比較して、重層上皮細胞への分化を低下させ る化合物を選択する工程
〔17〕 以下の工程 (a)および (b)を含む、被検細胞について、重層上皮から派生し た癌細胞力否かを検査する方法、
(a)被検細胞について、 dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質の 発現量または活性を測定する工程
(b)対照と比較して、前記発現量または活性が変化している場合に、被検細胞は重 層上皮から派生した癌細胞であるものと判定する工程
〔18〕 以下の工程 (a)および (b)を含む、被検者 (被検者由来の試料等）について、 扁平上皮癌または基底細胞癌の診断 (検査)方法、 (a)被検者カも調製された細胞試料について、〔17〕に記載の方法により、重層上皮 から派生した癌細胞力否かを判定する工程、
(b)前記工程により、重層上皮力 派生した癌細胞であるものと判定された場合に、 被検者は、扁平上皮癌または基底細胞癌に罹患して 、るものと判定する工程 〔19〕 以下の工程 (a)および (b)を含む、被検者について、皮膚疾患の診断 (検査） 方法、
(a)被検者から調製された被検試料にっ 、て、 dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質の発現量または活性を測定する工程
(b)対照と比較して、前記発現量または活性が変化している場合に、被検者は皮膚 疾患に罹患して 、るものと判定する工程
〔20〕 皮膚疾患が乾皮症、乾癬、または魚鱗癬である、〔19〕に記載の診断 (検査） 方法、
〔21〕 dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質を投与する工程を含 む、ケラチノサイト分ィ匕誘導低下に起因する疾患の治療方法、
[22] 〔13〕または〔15〕に記載のスクリーニング方法によって得られるケラチノサイト 分化誘導剤を投与する工程を含む、ケラチノサイト分化誘導低下に起因する疾患の 治療方法、
〔23〕 以下の (a)— (d)からなる群より選択される化合物を投与する工程を含む、ケ ラチノサイト分化亢進に起因する疾患の治療方法、
(a) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の転写産物に対するアンチセ ンス核酸
(b) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の転写産物を特異的に開裂 するリボザィム活性を有する核酸
(c) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の発現を、 RNAi効果による阻 害作用を有する核酸
(d) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質と結合する抗体
〔24〕 〔14〕または〔16〕に記載のスクリーニング方法によって得られるケラチノサイト 分化抑制剤を投与する工程を含む、ケラチノサイト分ィヒ亢進に起因する疾患の治療 方法、
〔25〕 ケラチノサイト分ィ匕誘導低下に起因する疾患が、尋常性乾癬あるいは日光角 化症である、〔21〕または〔22〕に記載の治療方法、
〔26〕 ケラチノサイト分ィ匕亢進に起因する疾患が、過角化を伴う尋常性魚鱗癬、伴 性遺伝性魚鱗癬、尋常性疣贅、アミロイド苔癬及び顆粒層肥厚を伴う扁平苔癬、ある いは水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症である、〔23〕または〔24〕に記載の治療方法、 [27] dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質の、ケラチノサイト分 化誘導低下に起因する疾患の治療剤の製造における使用、
〔28〕 〔13〕または〔15〕に記載のスクリーニング方法によって得られるケラチノサイト 分化誘導剤の、ケラチノサイト分化誘導低下に起因する疾患の治療剤の製造におけ る使用、
〔29〕 以下の (a)— (d)力もなる群より選択される化合物の、ケラチノサイト分化亢進 に起因する疾患の治療剤の製造における使用、
(a) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の転写産物に対するアンチセ ンス核酸
(b) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の転写産物を特異的に開裂 するリボザィム活性を有する核酸
(c) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の発現を、 RNAi効果による阻 害作用を有する核酸
(d) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質と結合する抗体
〔30〕 〔14〕または〔16〕に記載のスクリーニング方法によって得られるケラチノサイト 分ィ匕抑制剤の、ケラチノサイト分ィ匕亢進に起因する疾患の治療剤の製造における使 用、
〔31〕 ケラチノサイト分ィ匕誘導低下に起因する疾患が、尋常性乾癬あるいは日光角 化症である、〔27〕または〔28〕に記載の製造における使用、
〔32〕 ケラチノサイト分ィ匕亢進に起因する疾患が、過角化を伴う尋常性魚鱗癬、伴 性遺伝性魚鱗癬、尋常性疣贅、アミロイド苔癬及び顆粒層肥厚を伴う扁平苔癬、ある いは水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症である、〔29〕または〔30〕に記載の製造における 使用、
を提供するものである。
図面の簡単な説明
[図 1]ハイスループット in situハイブリダィゼーシヨン（HT- ISH)の結果を示す図および 写真である。 A,均等化したマウス背中皮膚 cDNAライブラリーの評価した結果を示す 。開始ライブラリー (E0)および均等化ライブラリー (E1および E2)は重複して定量的リ アルタイム PCR解析によって分析した。全データは内部標準である口リクリンについて 標準化した。 E0と比較して、 E2では、ケラチン 14およびケラチン 5の両方の cDNA (豊 富な cDNA)がそれぞれ約 1/5量にまで減少した。しかしインテグリン (X -M (希少な cDNA)は約 42倍量に増加した。 B, HT-ISHシグナルの例を示す写真である。均等化 した cDNAライブラリー（E2)より調製した cRNAプローブ力 96ゥエルフォーマットにお ける成体マウス足躕表皮の切片にハイブリダィズした。シクロフィリン A (NM008907)は 基底層および基底層上に特異的に発現した (a)。 Kdapは基底上細胞層にお 、て検 出された（b)。プロチモシン α (ΝΜ008972) (c)、ジァゼパム結合インヒビター（ BC028874) (d)、チューブリン j8 - 2鎖類似遺伝子（XM130158) (e)、ラミン A ( BC015302) (f)、核分布 Cホモログ（NM010948) (g)、デスモプラキン I (XM138593) (h) 、ケラチン関連タンパク質 16-5 (NM130857) (i)、およびヌクレオシドニリン酸キナーゼ C (AF288691) (j)は有棘層および顆粒層で検出された (k)。口リクリン（U09189) mRNA はもっぱら顆粒層においてのみ検出された (1)。特異的なシグナルは、各クローンに 対するセンスプローブで検出されなかった (データ示さず)。ダッシュ線は、表皮およ び真皮の間の境界を表わしている。スケールバー； 50 μ m。
[図 2-AB]dermokine- aおよび j8の同定を示す図および写真である。 A,成体マウス 足躕表皮の切片につ 、て SK063F08プローブでの HT- ISHシグナルを示す写真であ る。アンチセンス SK063F08プローブ (Antisense)は、表皮の有棘層から強烈なシグナ ルを与えた力 センスプローブ（Sense)ではシグナルは検出されなかった。 H+Eはへ マトキシリン-ェォジン染色画像である。ダッシュ線は、表皮および真皮の間の境界を 表わしている。スケールバー；50 m。 B, SK063F08配列を有するマウス ESTおよびそ れらのヒトホモログ ESTを示す図である。 SK063F08の全長配列を有するマウス EST、 および 3'-末端領域で AK003695と同じ配列をシェアした (ΑΚ003695では 98-661 bp および AK081753では 1505- 2064 bp)マウス EST (AK081753)は、これらの ESTがスプ ライシングバリアントであることを示唆して 、る。 AK003695および AK081753のヒトホモ ログは、それぞれ 2つの EST、 AL832080および BC035311として発見された。 ORFは 四角で示した。 j8プローブはノーザンブロッテイングおよび in situハイブリダィゼーシ ヨンに使用した（図 5および 6参照)。 1個のヌクレオチドの挿入 (グァニン）が
AK081753配列の 743位において発見された。また、 1132bpと 1133bpの間に 27bpの揷 入、 1197— 1244bpの欠失が確認された。
[図 2-C]dermokine- aおよび j8の同定を示す図である。 AK003695/AL832080および AK081753/BC035311の各 ESTから推測されるマウスおよびヒト dermokine- aおよび- βのアミノ酸配列を示す。 SignalP serverにより予想された推定シグナル配列に下線 を付け、 dermokine- aと 13の間の同一領域は、四角で囲んだ。 dermokine- βのグリ シンおよびセリン-リッチドメインは、ダッシュ線で示した。 dermokine- αおよび dermokine- j8の配列データは、 GenBankに、各々、マウスにおいてはァクセッション 番号 AK003695および AK081753にて、ヒトにおいてはァクセッション番号 AL832080お よび BC035311にて登録されて!、る。
[図 3-A]dermokine- aおよび- β遺伝子の構造を示す図である。染色体 19ql31上の ヒト dermokine- aおよび- j8遺伝子のェキソンを示す。白ボックスおよび黒ボックスは 、それぞれ mRNAのコード領域および非コード領域をコードして!/、るェキソンを表わし て 、る。推定翻訳開始および終止部位はそれぞれ ATGおよび TGAで示した。
dermokine- αのェキソン 2- 6は、ェキソン 12- 16として dermokine- j8によって利用され 、 COOH-末端配列および 3'-非コード領域と同一であった。
[図 3- B]dermokine- aおよび- j8遺伝子の構造を示す図である。 suprabasin、 demokine- α /~ βおよびケラチノサイト分化関連タンパク質 (Kdap)に対する遺伝子 を有する、マウスおよびヒト遺伝子座を示す。矢印は、転写方向を示している。精巣 特異的 GAPDH、精巣特異的ダリセルアルデヒド 3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝 子; GPR43、 Gタンパク質共役型受容体 43遺伝子。
[図 4- A]ヒト dermokine- α /- j8、 Kdapおよび suprabasin (0.7- kb転写産物)の N末端で の推定シグナルペプチドの概略図を示す図である。矢頭は、予測された切断部位を 表す。 pi値は含有されたアミノ酸残基から計算した。 dermokine- αおよび対応する dermokine- j8の C末端領域の推定分泌フォーム力 かなり高い pi値 (pl=10.3)を示し たことは特筆すべきである。
[図 4- BC]dermokine- α /- j8、 Kdapおよび suprabasinの分泌を解析した結果を示す 写真である。 B, 293/EBNA-1細胞における、 4種の SEAP(His)融合タンパク質である
6
、 dermokine- a— SEAP(His)、 dermokine- β— SEAP(His)、 Kdap— SEAP(His)、および
6 6 6 suprabasin— SEAP(hisノを表す写真である。 dermokine— a、一 βヽ Kdapおよび
6
suprabasinは、 (His) C-末端タグとともにそれ自身のシグナルペプチドを欠いている
6
分泌アルカリ性ホスファターゼ（SEAP)の N末端へ融合した。 dermokine- a、 - β、 Kdapおよび suprabasin (またコントロールとして SEAP(His) )の推定シグナル配列を運
6
ぶこれらの融合タンパク質を、 293/EBNA-1細胞において一過性に発現させた。培 養培地（各レーンに 10 g) (Medium)は、 SDS- PAGEにより分離し、かつ抗- His抗体に よりィムノブロッテイングを施した。培地に分泌された融合タンパク質は、矢頭で示し た。 4種の融合タンパク質の全ては、培地中に分泌された。分泌された
Kdap-SEAP(His)が高い分子量（アスタリスク）のバンドで検出された。 C,培養培地か
6
ら精製した dermokine—ひ—SEAP(His)、 dermokine- β -SEAP(His)、 Kdap— SEAP(His)
6 6 6
、および suprabasin- SEAP(His)の写真である。分泌融合タンパク質を含む
6
293/EBNA-1細胞の培養培地を回収し、融合タンパク質を TALON金属ァフィ二ティ 一レジンによって精製した。精製したタンパク質 (矢印）を SDS- PAGEにより分解し、引 き続きクーマシーブリリアントブルー染色し、 N末端アミノ酸配列を解析した。分泌され た dermokine— a— SEAP(His)、 dermokine- β— SEAP(His)、 Kdap— SEAP(His)、および
6 6 6 suprabasin-SEAP(His)の N末端アミノ酸配列は、 Aにおいて予測されたように、それぞ
6
れ WGADA、 GPLQS、 ATLGG、および ASDDPとして検出された。
[図 5]組織における dermokine- α /- |8、 Kdap,および suprabasinの発現パターンを示 す写真である。 A.ノーザンブロッテイングの結果を示す写真である。マウス組織から の総 RNA(20 /z g)をブロットしたナイロン膜を、各遺伝子に特異的な DIG-標識した cRNA断片でプロ一ビングした。 dermokine- a (矢頭）および対応する dermokine- β ( 矢印）の C末端領域の両方にハイブリダィズする SK063F08プローブは 2つのバンド（ Dermokine- α /- β )を开成したが、 dermokine- βの特異的にハイブリダィズする j8 プローブは 1つのバンド（Dermokine- j8 )だけ形成した（図 2B参照）。メンブレンは、 Kdap特異的プローブ（Kdap)、 suprabasin特異的プローブ（Suprabasin)およびコント口 ール GAPDH特異的プローブとハイブリダィズした。全ての遺伝子は皮膚に多く発現 し、少ないながらも胃でも発現していた。 Kdapはまた肺でも検出された。 B, 表皮での dermokine- a、- β、 Kdap,および suprabasinの発現パターンを示す写真である。マウ ス足躕表皮の連続切片は、 dermokine- j8 (SK063F08； Dermokine- α /- β ) , dermokine- β 、 βフ—口 ~~ブ； Dermo謹 e- β )、 Kaap (Kdap;および suprabasinの dermokine- a ZC末端領域に対して特異的なアンチセンス (Antisense)およびセンス (Sense)プローブとハイブリダィズした。センスプローブとハイブリダィズした切片のへ マトキシリン-ェォジン染色を示した（H+E)。 dermokine- a Z- β、 dermokine- βおよ び suprabasin特異的ハイブリダィゼーシヨンシグナル力 等しくマウス足躕表皮の有棘 層において検出された。しかし、 Kdap特異的シグナルは有棘層の基底上領域に限 局して 、た。センスプローブとハイブリダィズする切片に特異的なシグナルは検出さ れな力つた。ダッシュ線は表皮および真皮の間の境界を示す。スケールバー；50 m
[図 6-A]SSC産物の写真である。マウス胚発生の間の dermokine- α /- βの発現を示 す写真である。マウス胚の全ステージのブロット（Seegene)は DIG-標識された SK063F08の cRNA断片でプローブした。 dermokine- j8 (矢印）は E15.5で発現を始め た。 Dermokine- α (矢頭）はまず E16で現れ、 E17.5までその発現が増加し、その後 E18.5までに減少した。下段パネルはェチジゥムブロマイド染色メンブレンである。 圆 6-Β]初代培養ヒトケラチノサイトの in vitro分ィ匕を示す図である。ヒト初代ケラチノサ イトは、異なる Ca2+濃度下 (0.15mM Ca2+および 1.50mM Ca2+)2日間 (2 days)で培養し た、並びに 0.15mM Ca2+濃度 (0.15mM Ca2+)下異なる細胞密度 (2 days, 4 days,およ び 6 days)で培養した。分化は Ca2+濃度の増加（0.15mMから 1.50mM)あるいは 0.15mM Ca2+濃度での細胞密度の減少（2-dayから 6-day)によって誘導された。総 RNAはこれらの細胞から調製し、かつ SYBR Green-ベースの qRT- PCR解析を、 dermokine- a、- β、 Kdap、 suprabasinおよび分化特異的遺伝子 (ケラチン 10、インポ ルクリン、口リクリンおよびトランスダルタミナーゼ 1)について特異的プライマーおよび コントロール ァクチン遺伝子で行った。全データは内部 GAPDH mRNAコントロール について標準化した。分化特異的遺伝子に同じぐ dermokine- α、 - |8、 Kdap、およ び suprabasin遺伝子は分化が誘導されると有意に上方調節された。コントロール ァ クチン遺伝子の転写は誘導されな力つた。バーは、 2連して行われた 3回の個別の実 験の標準偏差を表わして 、る。
[図 7]Dermokine- o;がケラチノサイトの分化に及ぼす影響について示す図である。 A 、 12 wellからの total RNAの収量について示すグラフである。 12 wellに 2500 cells/cm2 で培養したケラチノサイトに対して、 TransIT LT1 kertinocyteを用いて pcDNA-human Dermokine- α -HAを発現させた。 Mockとしては pcDNA3.1のみを用いた。 Total RNA を抽出したところ、 human Dermokine- α - HAを発現させたケラチノサイトでは有意に total RNAの回収量が減少した。 B、インボルクリン（Involucrin)の発現について示す グラフである。 Aで調製した、 total RNAから、 qRT- PCRをインボルクリンの mRNAに対 して行った。 Dermokine- αを発現させると、有意にインボルクリンの mRNAが増加した
[図 8-AB]SSCタンパク質群に対する抗体を作成したことを示す図および写真である。 A、抗原を作成するために用いられた Constructの図である。 dermokine- j8 - A Cは dermokine- βにおける dermokine- aとの共通部分を欠失したもので dermokine- βに 特異的な抗体を作成するために用いられた。 Β、抗原に用いたタンパク質を示す写真 である。抗原には、 293/EBNA-1細胞^ ^一過性に発現させた、 dermokine- α、 dermokine- j8 - A C, Kdapゝ Suprabasinの SEAP(His)との融合タンパク質をそれぞれ
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用いた。図は CBB染色像である。
[図 8-C]SSCタンパク質群に対する抗体を作成したことを示す写真である。 SSCタンパ ク質群に対する抗血清を用いた immunoblotを示す写真である。 293/EBNA-1細胞に dermokine- a、- β、- ヽ Kdap, Suprabasinをそれぞれ一過性に発現させて、 培養上清を調製した。それらを電気泳動後、ニトロセルロース膜へトランスファーし、 各タンパク質に対する抗血清で immunoblotした。培養上清の CBB染色像も供に示し た。 dermokine- aに対する抗体は、 dermokine- β - Δ Cには反応して 、な!/、。
[図 9]293細胞で発現させたヒト及びマウス dermokine- β /- β A Cを CBB (クーマシー ブリリアントブルー）および immunoblotにより解析した結果を示す写真である。中央よ り右側がマウス、左側がヒトの結果である。
[図 10]ヒト /マウス dermokine- j8 -SEAP(His)もしくは dermokine- j8 Δ C-SEAP(His)の
6 6 アルカリフォスファターゼ活性を検出した結果を示すグラフである。 Aがマウス、 Bがヒ トの結果である。
[図 l l]pcDNA3.1— human dermokine— j8、 pcDNA3.1— human dermokine- β A Cを 293/EBNA-l細胞に transfectionし SDS- PAGEした後のゲルを硝酸銀染色した結果、 および Anti-hDK mAbによる immunoblotの結果を示す写真である。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明は、基底層上層の分化した表皮層で発現する新規分泌タンパク質、および 該タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のタンパク質は、ケラチノ サイトの分ィ匕および Zまたは増殖に関与するものと考えられる。
[0012] 本発明の同定された 2種の新規タンパク質は、本発明者らによって「dermokine- a」 、および「dermokine- β」と命名された。マウス dermokine- a遺伝子の塩基配列を配 列番号： 1に、該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 2 に記載する。また、マウス dermokine- 18遺伝子の塩基配列を配列番号： 3に、該遺伝 子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号: 4に記載する。また、ヒ ト dermokine- a遺伝子の塩基配列を配列番号： 5に、該遺伝子によってコードされる タンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 6に記載する。さらに、ヒト dermokine- 18遺伝 子の塩基配列を配列番号： 7に、該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸 配列を配列番号： 8に記載する。
[0013] 本発明はまず、下記 (a)— (d)の 、ずれかに記載のポリヌクレオチドを提供する。
(a)配列番号： 2、 4、 6または 8のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なるポリべプチ ドをコードするポリヌクレオチド
(b)配列番号： 1、 3、 5または 7のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むポ リヌタレ才チド (c)配列番号： 2、 4、 6または 8に記載のアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミ ノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力もなるポリペプチド をコードするポリヌクレオチド
(d)配列番号： 1、 3、 5または 7に記載の塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条 件下でノ、イブリダィズするポリヌクレオチド
[0014] 本発明の好ましい態様においては、上記 (c)または (d)は、以下のポリヌクレオチド である。
(c)配列番号： 2、 4、 6または 8のいずれかに記載のアミノ酸配列において、 1もしくは 複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列からなるポ リペプチドであって、ケラチノサイトに発現させることにより該ケラチノサイトを重層上皮 細胞へ分ィ匕させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(d)配列番号： 1、 3、 5または 7のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAとストリン ジヱントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドであって、ケラチノサイトに発 現させることにより該ケラチノサイトを重層上皮細胞へ分化させる活性を有するポリべ プチドをコードするポリヌクレオチド
[0015] 当業者においては、任意のポリペプチドに対し、上記 (c)または (d)の「ケラチノサイ トに発現させることにより該ケラチノサイトを重層上皮細胞へ分化させる活性」を有す る力否かについて、適宜、判定を行うことができる。例えば、被検ポリペプチドをケラ チノサイトへ導入し、重層上皮の分化マーカー、好ましくはインボルクリンの発現を指 標として、判定することができる。例えば、上記インボルクリンの発現が上昇する場合 、被検ポリペプチドは、「ケラチノサイトに発現させることにより該ケラチノサイトを重層 上皮細胞へ分化させる活性」を有するものと判定される。
さらに、本発明の好ましい態様においては、ケラチノサイトの分ィ匕および Zまたは増 殖に関与する遺伝子であって、分泌タンパク質をコードする上記 (a)—（d)のいずれ かに記載のポリヌクレオチドである。
[0016] 本発明の好ましい態様においては、上記マウスもしくはヒトにおける dermokine- aタ ンパク質および dermokine- βタンパク質、ならびに該タンパク質の改変体（変異体）を 提供する。 より詳しくは、配列番号： 2、 4、 6、または 8のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有 するポリペプチド、並びに、該アミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が置換 、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、 dermokine- aタンパク質または dermokine- βタンパク質と機能的に同等なポリべプチ ドを提供する。
[0017] 本発明は、本発明者らにより同定されたポリペプチド、および該ポリペプチドと機能 的に同等なポリペプチド、並びに、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関 する。ここで「機能的に同等」とは、対象となるポリペプチドが本発明者らにより同定さ れたポリペプチド (例えば、配列番号： 2、 4、 6または 8に記載のアミノ酸配列力もなる ポリペプチド)と同等の生物学的機能 (活性)を有して!/、ることを意味する。
本発明のポリヌクレオチドが持つ生物学的機能 (活性）としては、例えば、基底層上 層の分化した表皮層で発現すること、または、ケラチノサイトの分ィ匕および Ζまたは増 殖に関与すること等を挙げることができる。例えば、ケラチノサイトの分ィ匕誘導活性を 挙げることができる。さらに例示すれば、重層上皮特異的に発現する機能、マウス発 生初期の in vivoにおける表皮重層化を担う機能等を挙げることができる。これら以外 にも本発明に dermokine- に関して、後述の実施例に記載された機能 (活性） を挙げることができる。
[0018] 従って本発明には、配列番号： 2、 4、 6または 8のいずれかに記載のアミノ酸配列に おいて、 1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したァミノ 酸配列からなり、基底層上層の分ィ匕した表皮層で発現する、または、ケラチノサイトの 分ィ匕および/または増殖に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含ま れる。さらに、配列番号： 1、 3、 5または 7のいずれかに記載の塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドであって、基底層上 層の分ィ匕した表皮層で発現する、または、ケラチノサイトの分ィ匕および Zまたは増殖 に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。また、本発 明のこれらポリヌクレオチドは、分泌タンパク質であることが好まし!/、。
[0019] 被検ポリペプチド (タンパク質）について、分泌タンパク質であるか否かは、当業者 においては、公知の方法により評価することができる。例えば、被検タンパク質へ SEAP(secreted alkaline phosphatase)(His)タグを付けた融合タンパク質を発現するべ
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クタ一を作製し、該ベクターを細胞へトランスフエクシヨンする。抗 His抗体によるィムノ ブロッテイングによって、該細胞培地へ被検タンパク質が分泌されるカゝ否かを検討す ることができる。より詳細には、後述の実施例に記載の方法によって実施することがで きる。
[0020] また、被検ポリペプチド (被検遺伝子）が基底層上層の分化した表皮層で発現して いる力否かは、当業者においては、公知の方法、例えば、ノーザンブロット法、ウェス タンプロット法、または in situノヽイブリダィゼーシヨン法等により適宜、実施することが できる。また、被検ポリペプチド (被検遺伝子）が、ケラチノサイトに分ィ匕および Zまた は増殖に関与している力否かは、例えば、高 Ca2+濃度または高細胞密度の条件下に おける被検ポリペプチド (遺伝子)の発現解析によって、検討することができる。より詳 細には、重層上皮分ィ匕マーカーを用いて qRT-PCRによりその発現量を検討すること によって確認することができる。より具体的には、後述の実施例に記載の方法によつ て適宜、実施することができる。
[0021] 本発明の上記ポリヌクレオチドは、当業者においては、一般的に公知の方法により 単離することが可能である。例えば、ハイブリダィゼーシヨン技術（Southern, EM., J Mol Biol, 1975, 98, 503.)やポリメラーゼ連鎖反応（PCR)技術（Saiki, RK. et al, Science, 1985, 230, 1350.、 Saiki, RK. et al., Science 1988, 239, 487.)を利用する方 法が挙げられる。すなわち、配列番号： 1、 3、 5または 7のいずれかに記載の塩基配 列からなるポリヌクレオチドもしくはその一部をプローブとして、また配列番号： 1、 3、 5 または 7のいずれかに記載の塩基配列力もなるポリヌクレオチドに特異的にノ、イブリ ダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、所望の動物から配列番号： 1、 3、 5 または 7の 、ずれかに記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチドと高 、相同性を有す るポリヌクレオチドを単離することは、当業者にとって通常行い得ることである。このよ うに、ハイブリダィゼーシヨン技術や PCR技術によって単離し得る、配列番号： 1、 3、 5 または 7のいずれかに記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチドとハイブリダィズする ポリヌクレオチドもまた本発明のポリヌクレオチドに含まれる。このようなポリヌクレオチ ドとしては、例えば、配列番号： 1、 3、 5または 7に示される塩基配列からなる遺伝子 の、マウスまたはヒト以外の生物におけるホモログ等を挙げることができる。
[0022] 上記ポリヌクレオチドを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でノ、 イブリダィゼーシヨン反応を行う。本発明にお 、てストリンジェントなハイブリダィゼー シヨン条件とは、 6M尿素、 0.4% SDS、 0.5 X SSCの条件またはこれと同等のストリンジ エンシーのハイブリダィゼーシヨン条件を指す。よりストリンジエンシーの高い条件、例 えば、 6M尿素、 0.4% SDS、 0.1 X SSCの条件下では、より相同性の高いポリヌクレオ チドを単離できることが期待される。こうして単離されたポリヌクレオチドは、アミノ酸レ ベルにおいて、配列番号： 2、 4、 6または 8に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有 すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも 70%以上、好ましく は 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の配列の同一性を 指す。
[0023] アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチユールによるアルゴリズ ム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, 87, 2264-2268.、 Karlin, S. & Altschul, SF" Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993, 90, 5873.)を用いて決定できる。 BLASTのァ ルゴリズムに基づ 、た BLASTNや BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されて!、る ( Altschul, SF. et al.， J Mol Biol, 1990, 215, 403.) 0 BLASTNを用いて塩基配列を解 析する場合は、パラメータ一は、例えば score= 100、 wordlength= 12とする。また、 BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメータ一は、例えば score = 50 、 wordlength=3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プロ グラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知 で fco (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
[0024] 本発明のポリヌクレオチドには、ゲノム DNA、 cDNAおよび化学合成 DNAが含まれる 。ゲノム DNAおよび cDNAの調製は、当業者にとって常套手段により行うことが可能で ある。ゲノム DNAは、例えば、本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列番号： 1、 3、 5 または 7に記載の塩基配列）を有する生物力 ゲノム DNAを抽出し、ゲノミックライブラ リー（ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、 BAC、 PACなどが利用 できる）を作製し、これを展開して、本発明のポリヌクレオチドを基に調製したプローブ を用いてコロニーハイブリダィゼーシヨンある 、はプラークハイブリダィゼーシヨンを行 うことで調製できる。また、本発明のポリヌクレオチド (例えば、配列番号： 1、 3、 5また は 7)に特異的なプライマーを作製し、これを利用した PCRを行って調製することも可 能である。 cDNAは、例えば、本発明のポリヌクレオチドを有する生物力 抽出した mRNAを基に cDNAを合成し、これを λ ZAPなどのベクターに挿入して cDNAライブラリ 一を作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダィゼーシヨンあるいは プラークハイブリダィゼーシヨンを行うことで、また PCRを行うことにより調製できる。
[0025] また、本発明は、配列番号： 2、 4、 6または 8のいずれかに記載のアミノ酸配列から なるタンパク質と構造的に類似しているタンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供 する。このようなポリヌクレオチドとしては、該タンパク質において 1もしくは複数のアミ ノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なるタンパク質を コードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。上記タンパク質におけるァ ミノ酸の変異数や変異部位は、その機能が保持される限り制限はない。変異数は、 典型的には、全アミノ酸の 10%以内であり、好ましくは全アミノ酸の 5%以内であり、さ らに好ましくは全アミノ酸の 1%以内であると考えられる。より具体的には、アミノ酸の 変異数は、通常 50アミノ酸以内であり、好ましくは 30アミノ酸以内であり、より好ましく は 10アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 5アミノ酸以内であり、最も好ましくは 3ァミノ 酸以内である。
[0026] また本発明は、配列番号： 2、 4、 6または 8のいずれかに記載のアミノ酸配列と相同 性 (ホモロジ一）を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、上述の機能 (活 性)を有するポリペプチドを提供する。この「相同性 (ホモロジ一）」は、該ポリペプチド が上述の機能 (活性)を有する限り、その高さは特に制限されないが、通常、 60%以 上の相同性を有し、好ましくは 70%以上の相同性を有し、より好ましくは 80%以上の 相同性を有し、さらに好ましくは 85%以上の相同性を有し、さらに好ましくは 90%以上 の相同性を有し、最も好ましくは 95%以上の相同性を有する。
[0027] 上記ポリヌクレオチドを調製するために、当業者によく知られた方法としては、上記 したノ、イブリダィゼーシヨン技術やポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)技術の他に、例えば、 該ポリヌクレオチドに対し、 site— directed mutagenesis法（Kramer, W. & Fritz, HJ.， Methods Enzymol, 1987, 154, 350.)により変異を導入する方法が挙げられる。また、 自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変 異することは起こり得ることである。また、塩基配列が変異していても、その変異がタン パク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合 (縮重変異）があり、このような縮重変異ポ リヌクレオチドも本発明に含まれる。
[0028] 本発明は、また、本発明のポリペプチドの断片を提供する。こうした断片は全体的 に前記本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の一部と同一である力 全部とは同一で ないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。本発明のポリペプチド断片は、通常、 8アミノ酸残基以上、好ましくは 12アミノ酸残基以上 (例えば、 15アミノ酸残基以上）の 配列からなるポリペプチド断片である。好適な断片としては、例えば、ァミノ末端を含 む一連の残基もしくはカルボキシル末端を含む一連の残基の欠失、またはァミノ末端 を含む一連の残基とカルボキシル末端を含む一連の残基の二連の残基の欠失した アミノ酸配列を有するトランケーシヨン (truncation)ポリペプチドが含まれる。また、 αへ リックスと aヘリックス形成領域、 βシートと βシート形成領域、ターンとターン形成領 域、コイルとコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、 ひ両親媒性領域、 両親 媒性領域、可変性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原指数領域を 含む断片のような、構造的または機能的特性により特徴づけられる断片も好適である 。特定された配列および断片の変異型も本発明の一部を構成する。好適な変異型は 、同類アミノ酸の置換を伴うものである。即ち、ある残基が同様の性質の他の残基で 置換されているものである。典型的なこうした置換は、例えば、 Ala, Val, Leuと lieの間 、 Serと Thrの間、酸性残基 Aspと Gluの間、 Asnと Ginの間、塩基性残基 Lysと Argの間 、または芳香族残基 Pheと Tyrの間で起こる。
[0029] 本発明にお 、て置換されるアミノ酸は、タンパク質の機能の保持の観点から、置換 前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、 Ala, Val、 Leu、 Ile、 Pro, Met, Phe、 Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た 性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、 Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr, Asn、 Ginが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、 Aspおよび Glu力 塩基性アミノ酸とし ては、 Lys、 Arg、 Hisが挙げられる。従って、本発明において改変に供するアミノ酸の 種類は特に制限されないが、改変の前後のアミノ酸が、上記のように似た性質に分 類されるアミノ酸同士であることが好ま 、。
また、本発明の上記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた本発明に 含まれる。
[0030] 本発明は、本発明のポリヌクレオチドが挿入されたベクター、本発明のポリヌクレオ チドまたは該ベクターを保持する宿主細胞、および該宿主細胞を利用した本発明の ポリペプチドの製造方法を提供する。
本発明のベクターとしては、挿入した DNAを安定に保持するものであれば特に制限 されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローユング用ベクターとしては pBluescriptベクター (Stratagene社製)などが好まし!/、。本発明のポリペプチドを生産 する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発 現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチド を発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であれば pBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であれば pETベクター（Invitrogen社製）、培 養細胞であれば PME18S- FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864)、生物 個体であれば PME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988))などが好ましい。ベ クタ一への本発明の DNAの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリ ガーゼ反応により行うことができる (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4—11.11)。
[0031] 本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなぐ 目的に応じて種 々の宿主細胞が用いられる。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば 、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフイロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草 菌）、真菌細胞 (例：酵母、ァスペルギルス）、昆虫細胞 (例：ドロソフイラ S2、スポドプテ ラ SF9)、動物細胞（例： CHO、 COS, HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 HEK293、 Bowesメラノ 一マ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、 例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in
Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons, section 9.1-9.9)、リポフエクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公 知の方法で行うことが可能である。 [0032] 宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、また は細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに 組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であ つても、異種シグナルであってもよい。
[0033] 本発明のポリペプチドの回収は、本発明のポリペプチドが培地に分泌される場合は 、培地を回収する。本発明のポリペプチドが細胞内に産生される場合は、その細胞を まず溶解し、その後にポリペプチドを回収する。
組換え細胞培養物力も本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモ -ゥムまたはエタノール沈殿、酸抽出、ァ-オンまたはカチオン交換クロマトグラフィ 一、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィ- ティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロ マトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。
[0034] また本発明者らは、本発明の dermokine- a遺伝子および dermokine- β遺伝子が、 ケラチノサイト分ィ匕関連タンパク質 (Kdap)をコードする遺伝子、および suprabasin (スプ ラバシン)遺伝子との間に位置することを見出した。さらに、これら 4種の遺伝子は分 泌タンパク質であり、重層化の開始時に発現される遺伝子複合体 (遺伝子クラスター )であることを初めて見出した。即ち、上記 4種の遺伝子は共通の遺伝子発現調節下 にあり、遺伝子複合体を構成している。本発明者らは該遺伝子複合体を SSCと命名し た。
[0035] 本発明は、共通の遺伝子発現調節下にあることを特徴とする遺伝子複合体であつ て、（1) Kdap遺伝子、（2) dermokine- α遺伝子、（3) dermokine- j8遺伝子、および（4 uprabasin遺伝子の各遺伝子カゝら構成されるケラチノサイトの分ィ匕または増殖に関 与する遺伝子複合体を提供する。
[0036] 本発明の上記遺伝子複合体は、例えば、図 3で示すように、マウスにおいては 7番 染色体上に、ヒトにおいては 19番染色体上に位置している。当業者においては、図 3 で示される情報を基に、本発明の遺伝子複合体の正確な位置、および配列につい ての情報を、適宜、公共のデータベース、市販の解析ツール等を利用して、取得す ることが可能である。 本発明の上記遺伝子複合体とは、好ましくは、上記（1)一 (4)の遺伝子を含む、ゲ ノム DNA断片であり、該遺伝子の共通の発現調節領域を含むことが望ましい。該ゲ ノム DNA断片は、好ましくは、単離 '精製された DNA断片である。また、該 DNA断 片は、マウス、またはヒト由来であることが好ましい。
また、好ましい態様においては、本発明の上記ゲノム DNA断片は、特に制限され るものではな!/、が、 40kbp (程度）の長さの DNA断片である。
[0037] 本発明は、本発明のポリヌクレオチド (例えば、配列番号： 1、 3、 5または 7のいずれ かに記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチド、またはその相補鎖）に相補的な、少な くとも 15ヌクレオチドの鎖長を有するヌクレオチドを提供する。ここで「相補鎖」とは、 A:T (ただし RNAの場合は U)、 G:Cの塩基対力 なる 2本鎖核酸の一方の鎖に対する 他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも 15個の連続したヌクレオチド領域で 完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも 70%、好ましくは少なくとも 80%、より 好ましくは 90%、さらに好ましくは 95%以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相 同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればょ 、。こ のようなヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドを検出、単離するためのプローブと して、また、本発明のヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することが 可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、 15— 100ヌクレオチド、好ましく は 15— 35ヌクレオチドの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発 明の DNAの少なくとも一部若しくは全部の配列を含む少なくとも 15ヌクレオチド、好ま しくは少なくとも 30ヌクレオチドの鎖長のポリヌクレオチドが用いられる。このようなポリ ヌクレオチドは、好ましくは本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異 的にハイブリダィズするものである。「特異的にハイブリダィズする」とは、通常のハイ ブリダィゼーシヨン条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で、本発明のポリヌクレ ォチド (例えば、配列番号： 1、 3、 5または 7)とハイブリダィズし、他のポリペプチドを コードする DNAとはノ、イブリダィズしないことを意味する。
[0038] また、上記ポリヌクレオチドには、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現 を抑制するポリヌクレオチドが含まれる。このようなポリヌクレオチドには、アンチセンス ポリヌクレオチド（アンチセンス DNA/RNA;本発明のポリペプチドをコードする遺伝子 の転写産物と相補的なアンチセンス RNA、および該 RNAをコードする DNA)やリボザ ィム (本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボ ザィム活性を有する RNAをコードする DNA)、および RNAi効果を有する核酸 (siRNA) が含まれる。
[0039] アンチセンスポリヌクレオチドが標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下 のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、 RNA ポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成 による転写抑制、合成の進みつつある RNAとのハイブリッド形成による転写阻害、ィ ントロンとェキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプラ イソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、 mRNAとのノ、イブ リツド形成による核力も細胞質への移行抑制、キヤッビング部位やポリ (A)付加部位と のハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリツ ド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形 成による翻訳抑制、 mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成に よるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイプリ ッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または 翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する (平島および井上「新生化学 実験講座 2核酸 IV遺伝子の複製と発現」，日本生化学会編,東京化学同人
,ρρ.319- 347,1993)。
[0040] 本発明で用いられるアンチセンス核酸 (ポリヌクレオチド）は、上記のいずれの作用 で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子の mRNAの 5'端 近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害 に効果的と考えられる。しかし、コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配 列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアン チセンス配列を含むポリヌクレオチドも、本発明で利用されるアンチセンスポリヌクレ ォチドに含まれる。使用されるアンチセンスポリヌクレオチドは、適当なプロモーター の下流に連結され、好ましくは 3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。ァ ンチセンスポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子またはその一部と相補的な配列であ ることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくて もよい。転写された RNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは 90%以 上、最も好ましくは 95%以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的 に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンス 効果を引き起こすために、少なくとも 15ヌクレオチド以上、好ましくは 100ヌクレオチド、 さらに好ましくは 500ヌクレオチド以上の鎖長を有し、通常、 3000ヌクレオチド以内、好 ましくは 2000ヌクレオチド以内の鎖長を有する。
[0041] 該アンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチド (例えば、配列番号： 1、 3、 5または 7)の配列情報を基にホスホロチォネ ~~卜法 (Stein, 1988 Physicochemicai properties of phosphorothioate
oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res 16, 3209-21 (1988))などにより調製するこ とが可能である。
[0042] 内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザィムをコードする核酸 (ポリヌクレオチド )を利用して行うことも可能である。リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子のことを いう。リボザィムには種々の活性を有するものがあるが、中でも RNAを切断する酵素と してのリボザィムの研究により、 RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザィムの設 計が可能となった。リボザィムには、グループ Iイントロン型や、 RNasePに含まれる M1RNAのように 400ヌクレオチド以上の大きさのものもある力 ハンマーヘッド型やへ ァピン型と呼ばれる 40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある (小泉誠およ び大塚栄子， (1990)蛋白質核酸酵素, 35:2191)。
[0043] 例えば、ハンマーヘッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15の C15の 3' 側を切断するが、活性には U14が 9位の Aと塩基対を形成することが重要とされ、 15位 の塩基は Cの他に Aまたは Uでも切断されることが示されている (M.Koizumiら, (1988) FEBS Lett.228:225)。リボザィムの基質結合部を標的部位近傍の RNA配列と相補的 になるように設計すれば、標的 RNA中の UC、 UUまたは UAという配列を認識する制限 酵素的な RNA切断リボザィムを作出することが可能である (M.Koizumiら, (1988) FEBS Lett. 239:285、小泉誠および大塚栄子, (1990)蛋白質核酸酵素, 35:2191、
M.Koizumiら， (1989) Nucleic Acids Res. 17:7059)。 [0044] また、ヘアピン型リボザィムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボ ザィムは、例えばタバコリングスポットゥイノレスのサテライト RNAのマイナス鎖に見出さ れる (J.M.Buzayan Nature 323:349, 1986)。このリボザィムも、標的特異的な RNA切断 を起こすように設計できることが示されている (Y.Kikuchiおよび N.Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19:6751、 菊池洋， (1992)化学と生物 30: 112)。
[0045] また、本発明の上記 siRNAの好まし!/、態様としては、 dermokine- aもしくは
dermokine- β遺伝子に対して RNAi (RNA interference； RNA干渉）効果を有する二本 鎖 RNA (siRNA)を挙げることができる。より具体的には、配列番号： 1、 3、 5、または 7 のいずれかに記載の塩基配列の部分配列に対するセンス RNAおよびアンチセンス RNA力もなる二本鎖 RNA(siRNA)を挙げることができる。
[0046] RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もある力 DICERといわれる酵素（ RNase III核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖 RNAと接触し、二本鎖 RNAが small interfering RNAまたは siRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられ ている。本発明における RNAi効果を有する二本鎖 RNAには、このように DICERによつ て分解される前の二本鎖 RNAも含まれる。即ち、そのままの長さでは RNAi効果を有さ な 、ような長鎖の RNAであっても、細胞にお!、て RNAi効果を有する siRNAへ分解さ れることが期待されるため、本発明における二本鎖 RNAの長さは、特に制限されない
[0047] 例えば、本発明の dermokine遺伝子の mRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応 する長鎖二本鎖 RNAを、例えば、予め DICERで分解させ、その分解産物を適宜利用 することが可能である。この分解産物には、 RNAi効果を有する二本鎖 RNA分子 (siRNA)が含まれることが期待される。この方法によれば、 RNAi効果を有することが期 待される mRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、 RNAi効果を有する本発 明の dermokine遺伝子の mRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はな！/、。
[0048] なお、上記 RNA分子において一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構 造を有する siRNA(shRNA)も本発明に含まれる。即ち、分子内において二本鎖 RNA構 造を形成し得る一本鎖 RNA分子もまた本発明に含まれる。
[0049] 本発明の上記「RNAi効果により抑制し得る二本鎖 RNA」は、当業者においては、該 二本鎖 RNAの標的となる本発明の dermokine遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製す ることができる。一例を示せば、配列番号： 1、 3、 5、または 7のいずれかに記載の塩 基配列をもとに、本発明の二本鎖 RNAを作製することができる。即ち、配列番号：1、 3、 5、または 7のいずれかに記載の塩基配列をもとに、該配列の転写産物である mRNAの任意の連続する RNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖 RNAを作製 することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることで ある。また、該配列の転写産物である mRNA配列から、より強い RNAi効果を有する siRNA配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施する ことが可能である。また、一方の鎖 (例えば、配列番号： 1、 3、 5、または 7のいずれか に記載の塩基配列）が判明して 、れば、当業者にぉ 、ては容易に他方の鎖 (相補鎖 )の塩基配列を知ることができる。 siRNAは、当業者においては市販の核酸合成機を 用いて適宜作製することが可能である。また、所望の RNAの合成については、一般の 合成受託サービスを利用することができる。
[0050] さらに、本発明の上記 RNAを発現し得る DNA (ベクター)もまた、本発明の
dermokine遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本 発明の上記二本鎖 RNAを発現し得る DNA (ベクター）は、該ニ本鎖 RNAの一方の鎖 をコードする DNA、および該ニ本鎖 RNAの他方の鎖をコードする DNA力 それぞれ 発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有する DNAである。本発明の上記 DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することが できる。より具体的には、本発明の RNAをコードする DNAを公知の種々の発現べクタ 一へ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である
[0051] 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドは、遺 伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクタ 一、アデノ随伴ウィルスベクターなどのウィルスベクターやリボソームなどの非ウィル スベクターなどを利用して、 ex 法や in viV0法などにより患者へ投与を行うことが 考えられる。
[0052] 本発明は、本発明のポリペプチドに結合する抗体を提供する。ここで「抗体」には、 ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さら に Fabまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含む Fabフラグメントが含ま れる。
[0053] 本発明のポリペプチドまたはその断片もしくは類似体、またはそれらを発現する細 胞は、本発明のポリペプチドに結合する抗体を産生するための免疫原としても使用 することができる。抗体は、好ましくは、本発明のポリペプチドに免疫特異的である。「 免疫特異的」とは、その抗体が他のポリペプチドに対するその親和性よりも本発明の ポリペプチドに対して実質的に高い親和性を有することを意味する。
[0054] 本発明のポリペプチドに結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製すること が可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができ る。本発明のポリペプチドあるいはその GSTとの融合タンパク質をゥサギ等の小動物 に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のポリペプチドをカップリングしたァフィ- ティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば 、例えば、本発明のポリペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾 臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、マウスミエローマ細胞とポリエチレン グリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞 (ハイブリドーマ）の 中から、本発明のポリペプチドに結合する抗体を産生するクローンを選択する。次い で、得られたノ、イブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得 られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のポリペプチドをカップリングしたァフィ- ティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
[0055] 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドやこれを発現する細胞の単離、同定、およ び精製に利用することができる。
本発明者らは、本発明のヒト dermokine- α、 - j8、 Kdap、 Suprabasinの各タンパク質 に対する抗体 (ポリクローナル抗体)を、実際に作製することに成功した。本発明の抗 体の一例として、後述の実施例に示されるヒト dermokine- α、 - j8、 Kdap、または Suprabasinに対する抗体を挙げることができる。 [0056] また、本発明者らによって見出された知見により、 dermokineノックアウトマウスを作 製することが可能である。該ノックアウト動物 (非ヒト動物）は、 SSCの生理的役割の検 討に非常に有用である。
即ち本発明は、本発明の遺伝子 (例えば、 dermokine- α /~ β )の発現が人為的に 抑制されて 、る動物（非ヒト動物）に関する。
上記の「遺伝子の発現が人為的に抑制されている」とは、通常、遺伝子対の一方ま たは双方に、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換等の遺伝子変異を有することにより該 遺伝子の発現が抑制されて!ヽる状態を指す。正常なタンパク質としての機能が減少 または喪失して!/、る変異タンパク質が発現して!/、る場合も、この「遺伝子の発現の抑 制」に含まれる。上記「抑制」には、遺伝子の発現が完全に抑制されている場合のほ 力 該遺伝子の遺伝子対の一方の遺伝子の発現のみが抑制されて 、る場合も含ま れる。
[0057] 本発明において遺伝子の改変の対象となる動物は、通常、ヒト以外の動物であり、 好ましくはマウス、ラット、ノ、ムスター、ゥサギ等のげつ歯類であり、その中でも特にマ ウスが好ましい。本発明において遺伝子の改変の対象となる ES細胞もまた、げっ歯 類に由来するものが好ましぐ特にマウス由来が好ましい。なお、一般的に称される「 ノックアウト動物」も本発明の遺伝子改変動物に含まれる。
[0058] 本発明の遺伝子改変非ヒト動物（単に、「遺伝子改変動物」と記載する場合あり）に おいて、遺伝子の発現を人為的に抑制する手段としては、遺伝子全体またはその一 部を欠損させる方法や遺伝子の発現制御領域の全部またはその一部を欠損させる 方法等を例示することができるが、好ましくは遺伝子対の一方または双方に外来遺 伝子を挿入することにより遺伝子を不活性化する方法である。即ち、本発明の好まし い態様において、遺伝子改変動物は、遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が 挿入されて ヽることを特徴とする。
[0059] 本発明の遺伝子改変動物は、当業者においては一般的に公知の遺伝子工学技術 により作製することができる。例えば、以下のようにして遺伝子改変マウスを作製する ことができる。まず、マウスから本発明の遺伝子（例えば、 dermokine- α /~ β )のエタ ソン部分を含む DNAを単離し、この DNA断片に適当なマーカー遺伝子を挿入し、タ ーゲッティングベクターを構築する。このターゲッティングベクターをエレクト口ポレー シヨン法などによりマウスの ES細胞株に導入し、相同組み換えを生じた細胞株を選抜 する。挿入するマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質 耐性遺伝子が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含 む培地で培養するだけで相同組み換えを生じた細胞株を選抜することができる。また 、より効率的な選抜を行うためには、ターゲッティングベクターにチミジンキナーゼ遺 伝子などを結合させておくことも可能である。これにより、非相同組み換えを起こした 細胞株を排除することができる。また、 PCRおよびサザンブロットにより相同組み換え 体の検定を行 \本発明の遺伝子の遺伝子対の一方が不活性化された細胞株を効 率よく得ることちでさる。
[0060] 相同組み換えを生じた細胞株を選抜する場合、相同組み換え箇所以外にも、遺伝 子挿入による未知の遺伝子破壊の恐れがあることから、複数のクローンを用いてキメ ラ作製を行うことが好まし ヽ。得られた ES細胞株をマウス胚盤葉にインジェクションし キメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配させることで、本発明の遺伝 子の遺伝子対の一方を不活性ィ匕したマウスを得ることができる。さらに、このマウスを 交配させることで、本発明の遺伝子の遺伝子対の双方を不活性ィ匕したマウスを取得 することができる。マウス以外の ES細胞が榭立された動物においても、同様の手法に より、遺伝子改変を行うことができる。
[0061] また、本発明の遺伝子の遺伝子対の双方を不活性ィ匕した ES細胞株は、以下の方 法により取得することも可能である。すなわち、遺伝子対の一方を不活性ィ匕した ES細 胞株を高濃度の抗生物質を含む培地で培養することにより、遺伝子対のもう一方も 不活性化された細胞株、即ち、本発明の遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化した ES細胞株を得ることができる。また、遺伝子対の一方を不活性化した ES細胞株を選 抜し、この細胞株に再度ターゲッティングベクターを導入し、相同組換えを生じた細 胞株を選択することでも作製することができる。ターゲッティングベクターに挿入する マーカー遺伝子は、前出のマーカー遺伝子とは異なるものを使用することが好ましい
[0062] また本発明は、本発明の遺伝子改変非ヒト動物力ゝら榭立された細胞株を提供する。 本発明の遺伝子改変動物由来の細胞株を榭立する方法としては、公知の方法を利 用することができる。例えば、げっ歯類においては、胎仔細胞の初代培養の方法を 用いることが可能である。（新生化学実験講座、 18卷、 125頁一 129頁、東京化学同人 、およびマウス胚の操作マニュアル、 262頁一 264頁、近代出版)。
[0063] 本発明の遺伝子改変動物、該動物から榭立した細胞株、および ES細胞株は、本発 明の遺伝子の詳細な機能の解析に利用することができる。さらに、本発明の遺伝子 改変動物は、本発明のタンパク質の機能を代替する化合物のスクリーニング方法等 に利用することが可能である。
[0064] また、本発明の上記ポリペプチド (タンパク質）は、ケラチノサイト分化誘導作用を有 することが期待される。従って本発明は、本発明の上記ポリペプチド (タンパク質)を 有効成分として含む、ケラチノサイト分化誘導剤 (本明細書においては、「分化誘導 剤」と記載する場合あり）に関する。
好まし 、態様にぉ 、て本発明は、 dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタ ンパク質を有効成分として含むケラチノサイト分化誘導剤を提供する。上記 dermokine- αタンパク質としては、例えば、配列番号： 2または 6に記載のポリべプチ ドを挙げることができる。また、上記 dermokine- j8タンパク質としては、例えば、配列 番号： 4または 8に記載のポリペプチドを示すことができる。
また、本発明の分ィ匕誘導剤の成分である上記ポリペプチドをコードする DNAもまた 、本発明に含まれる。
[0065] また本発明は、 SSCあるいは dermokine- α / βタンパク質の発現活性化物質を含 む、ケラチノサイト分化誘導剤に関する。
本発明における「タンパク質の発現活性ィ匕物質」は、タンパク質の発現を有意に活 性化 (上昇)させる物質 (ィ匕合物)である。本発明の上記「発現活性化」には、該タン パク質をコードする遺伝子の転写活性化、および Ζまたは該遺伝子の転写産物から の翻訳活性化が含まれる。
[0066] 本発明の SSCもしくは dermokine- α / βタンパク質の発現活性化物質としては、例 えば、 SSCもしくは dermokine- a Z jS遺伝子の転写調節領域 (例えば、プロモーター 領域）に結合して、該遺伝子の転写を促進する物質 (転写活性ィ匕因子等)を挙げるこ とがでさる。
[0067] また、本発明にお!/、て SSCもしくは dermokine- α / βタンパク質の発現活性の測定 は、当業者においては周知の方法、例えば、 RT-PCR法、ノーザンプロット法、ウェス タンプロット法等により、容易に実施することができる。
[0068] また、 dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質（本明細書にお！、て は、これら 2つのタンパク質（遺伝子）を合わせて「dermokine- α / βタンパク質（遺伝 子)」と記載する場合あり）の発現または機能を抑制する物質 (化合物）は、ケラチノサ イト分化抑制作用を有することが期待される。従って本発明は、 dermokine- αタンパ ク質もしくは dermokine- βタンパク質の発現もしくは機能阻害物質 (化合物）を有効成 分として含む、ケラチノサイト分ィ匕抑制剤 (本明細書においては、「分化抑制剤」と記 載する場合あり）に関する。
[0069] 本発明における「発現阻害物質」は、タンパク質の発現を有意に低下させる、ある!/、 は、発現を完全に抑制させる物質 (ィ匕合物)である。本発明の上記「発現阻害」には、 該タンパク質をコードする遺伝子の転写阻害、および Ζまたは該遺伝子の転写産物 力 の翻訳阻害が含まれる。
[0070] 上記分ィ匕抑制剤の好ま 、態様としては、以下の (a)— (d)力もなる群より選択され る化合物を有効成分として含む薬剤である。
(a) dermokine- α / β遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b) dermokine- α / β遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有す る核酸
(c) dermokine- α / β遺伝子の発現を RNAi効果による阻害作用を有する核酸
(d) dermokine- α / βタンパク質と結合する抗体（抗 dermokine- α / βタンパク質抗 体）
[0071] 本発明の上記薬剤における核酸としては、例えば、上述のアンチセンス核酸、およ びリボザィム活性を有する核酸を好適に示すことができる。また、内在性遺伝子の発 現の阻害は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖 RNAを用いた RNA干渉（RNA interferance； RNAi)〖こよっても行うことができる。 RNAiと は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖 RNAを細胞内に導 入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも阻害され る現象のことを指す。 RNAiの機構の詳細は明らかではないが、最初に導入した二本 鎖 RNAが小片に分解され、何らかの形で標的遺伝子の指標となることにより、標的遺 伝子が分解されると考えられて 、る。 RNAiに用いる RNAは、 dermokine- α β遺伝 子もしくは該遺伝子の部分領域と完全に同一である必要はないが、完全な相同性を 有することが好ましい。
[0072] また、 dermokine- α / βタンパク質の機能阻害物質としては、本発明の上記抗体、 例えば、 dermokine- α / βタンパク質に結合する抗体（dermokine- α / βタンパク 質を認識する抗体； 抗 dermokine- α / βタンパク質抗体)を挙げることができる。該 抗体は、 dermokine- α / βタンパク質と結合することにより、 dermokine- a Z βタン パク質の機能を阻害し、その結果、ケラチノサイトの分ィ匕が誘導されることが期待され る。本発明の上記抗体は、特に制限されないが、 dermokine- a Z jS以外のタンパク 質とは結合せず、特異的に dermokine- α / βタンパク質と結合する（dermokine- a / βタンパク質を認識する)抗体であることが好ま 、。
[0073] 本発明の dermokine- α / βタンパク質に結合する抗体は、例えば、ケラチノサイト の分化抑制を目的とした使用が考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（ 抗体治療)で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体 が好ましい。
本発明のケラチノサイト分化誘導剤は、ケラチノサイトの分化異常 (分化誘導の低下 )に起因する疾患の治療薬となることが期待される。該疾患としては、例えば、不全角 化を伴う尋常性乾癬、 日光角化症等を挙げることができる。
[0074] また、本発明のケラチノサイト分ィ匕抑制剤は、ケラチノサイトの分ィ匕亢進に起因する 疾患の治療薬となることが期待される。該疾患としては、例えば、過角化を伴う尋常 性魚鱗癬、伴性遺伝性魚鱗癬、尋常性疣贅、アミロイド苔癬及び顆粒層肥厚を伴う 扁平苔癬、水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症等の皮膚疾患を挙げることができる。
[0075] 本発明のケラチノサイト分ィ匕誘導剤またはケラチノサイト分ィ匕抑制剤 (本明細書に おいては、双方をまとめて「薬剤」と記載する場合あり）は、生理学的に許容される担 体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的 に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、 乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点 滴剤、外用薬剤、あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下 注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、 経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明の分化誘 導剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。
[0076] 例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および 滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤に は、乳糖、デンプン、あるいはマン-トール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、 炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結 合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドン が用いられる。滑沢剤としては、タルクゃステアリン酸マグネシウム等が公知である。
[0077] 本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコー ティングを施すことができる。コーティング剤には、ェチルセルロースやポリオキシェ チレングリコール等を用いることができる。
[0078] また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒 に溶解、あるいは分散させること〖こより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶 剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生 理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油ゃプ ロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存 剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩ィ匕ナトリウムゃブドウ糖等の公知の 等張化剤をカ卩えることができる。更に、塩ィ匕ベンザルコ-ゥムゃ塩酸プロ力インのよう な無痛化剤を添加することができる。
[0079] 本発明の薬剤は、固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外用剤 とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたものと同 様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当な溶 剤に必要に応じて増粘剤をカ卩えて調製することができる。溶剤には、水、ェチルアル コール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、一般 にベントナイト、ポリビュルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビュル ピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩ィ匕ベンザルコ -ゥム等の保存剤を加 えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロース誘 導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。
[0080] 本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物 に対して、必要量が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法 、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の 判断により適宜決定することができる。
[0081] また、本発明の薬剤 (ケラチノサイト分化誘導剤'抑制剤）は、上述の疾患以外にも 、例えば、乾燥皮膚、ふけ、にきび、角化症、湿疹、皮膚のはがれ、そう痒症、老人斑 、ほくろ、黒皮症、しわ、いぼ、皮膚の斑点、過色素沈着皮膚、過角化性皮膚、炎症 性皮膚、年齢関連皮膚変化、等の表皮の異常な生物学的症状もしくは傷害に対して 、治療もしくは予防効果を有することが期待される。本発明の薬剤は、通常、ヒトに対 して使用されるが、例えば、ィヌ、ネコ等の皮膚疾患に対して用いることも可能である
[0082] また本発明は、ケラチノサイト分化誘導剤 (分化誘導作用を有する化合物）のスクリ 一二ング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法の好まし 、態様にぉ ヽては、 dermokine- α / βタンパ ク質の発現量または活性を指標とする方法である。即ち、 dermokine- α / βタンパク 質の発現もしくは活性を上昇させる化合物は、ケラチノサイト分化誘導作用を有する ことが期待される。
[0083] 本発明の上記方法にぉ 、ては、まず、 dermokine- aおよび Zまたは j8タンパク質（ 遺伝子)を発現する細胞に被検化合物を接触させる。
本方法に用いる「細胞」は、特に制限されないが、好ましくはヒト由来の細胞である。 「dermokine- α / βタンパク質を発現する細胞」としては、内因性の dermokine- a / βタンパク質を発現して 、る細胞、または外来性の dermokine- α / β遺伝子が導入 され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性の dermokine- α Ζ β遺伝子が発現した細胞は、通常、 dermokine- α / β遺伝子が挿入された発現 ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現べクタ一は、 一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
[0084] 本発明のスクリーニング方法に供する被検化合物としては、特に制限はない。例え ば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合 物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞 培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、こ れらに限定されない。
また、これらの被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識と しては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
[0085] dermokine- α / β遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常、 dermokine- α / β遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加すること〖こ よって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該 タンパク質を発現する DNAベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うこ とがでさる。
[0086] 本方法にお!、ては、次 、で、 dermokine- α / βタンパク質を発現する細胞におけ る dermokine- α / βタンパク質の発現量または活性を測定する。発現量の測定は、 当業者が簡便に行い得るものであり、一般的な方法、例えばノーザンプロット法、ゥェ スタンプロット法等により適宜実施することが可能である。例えば、 dermokine- α / |8 タンパク質を発現する細胞に接触させた被検化合物に付した標識を指標にして測定 することも可會である。
[0087] 尚、本発明において「発現」とは、タンパク質をコードする遺伝子力もの転写 (mRNA の生成）、または該遺伝子の転写産物力もの翻訳のいずれの場合をも意味する。 また、 dermokine- α βタンパク質の活性を指標にして上記スクリーニング方法を 実施する場合には、 dermokine- α / βタンパク質の上述の機能 (活性）、例えば、 dermokine- α / βタンパク質のケラチノサイトの分ィ匕誘導活性を指標とすることがで きる。 dermokine- a Z jSタンパク質の活性の測定は、当業者においては、公知の方 法によって適宜実施することができる。
本発明の方法にぉ 、て、上記「活性」としては、好ましくは、上述の「dermokine- a / βタンパク質をケラチノサイトに発現させることにより該ケラチノサイトを重層上皮細 胞へ分化させる活性」を挙げることができる。
[0088] 本方法にお!ヽては、次 、で、被検化合物を接触させな 、場合と比較して、
dermokine- α / βタンパク質の発現量または活性を上昇させる化合物を選択する。 上記スクリーニング方法によって取得される化合物は、例えば、ケラチノサイトの分 化異常に起因する疾患の治療薬となることが期待される。
[0089] また本発明は、ケラチノサイト分化抑制剤 (分化誘導作用を有する化合物）のスクリ 一二ング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法の好まし 、態様にぉ ヽては、 dermokine- α / βタンパ ク質の発現量または活性を指標とする方法である。即ち、 dermokine- α / βタンパク 質の発現もしくは活性を低下 (阻害)させる化合物は、ケラチノサイト分ィ匕抑制作用を 有することが期待される。
[0090] 本発明の上記方法においては、上述の分化誘導剤のスクリーニング方法に倣って 、適宜、実施することができる。即ち、本発明の上記方法においては、まず、 dermokine- aおよび Zまたは j8タンパク質 (遺伝子）を発現する細胞に被検化合物 を接触させる。次いで、被検化合物を接触させない場合と比較して、 dermokine- α / ι8タンパク質の発現量または活性を低下させる化合物を選択する。
[0091] 上記スクリーニング方法によって取得される化合物は、例えば、ケラチノサイトの分 化亢進に起因する疾患の治療薬となることが期待される。
本発明の上記スクリーニング方法の好まし 、態様としては、上記の「dermokine- a / βタンパク質をケラチノサイトに発現させることにより該ケラチノサイトを重層上皮細 胞へ分化させる活性」を指標とするスクリーニング方法である。
[0092] 即ち本発明は、以下の工程 (a)—（c)を含む、ケラチノサイト分化誘導剤のスクリー ユング方法に関する。
(a) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質を発現するケラチノサイ トと、被検化合物を接触させる工程
(b)前記 dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質の、ケラチノサイト を重層上皮細胞へ分化させる活性を測定する工程 (c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、前記活性を上昇させる化合物を選 択する工程
[0093] また本発明は、以下の工程 (a)一 (c)を含む、ケラチノサイト分ィ匕抑制剤のスクリー ニング方法を提供する。
(a) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質を発現するケラチノサイ トと、被検化合物を接触させる工程
(b)前記 dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質の、ケラチノサイト を重層上皮細胞へ分化させる活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、前記活性を低下させる化合物を選 択する工程
[0094] また、本発明の別の態様としては、以下の工程 (a)— (c)を含む、ケラチノサイト分 化誘導剤のスクリーニング方法である。
(a) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質、またはそれらを発現す る細胞と、ケラチノサイト及び被検化合物を共存させる工程
(b)ケラチノサイトの重層上皮細胞への分ィ匕を測定する工程
(c)被検化合物を共存させな!/、場合と比較して、重層上皮細胞への分化を上昇させ る化合物を選択する工程
[0095] さらに本発明の別の態様においては、以下の工程 (a)—（c)を含む、ケラチノサイト 分ィ匕抑制剤のスクリーニング方法に関する。
(a) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質、またはそれらを発現す る細胞と、ケラチノサイト及び被検化合物を共存させる工程
(b)ケラチノサイトの重層上皮細胞への分ィ匕を測定する工程
(c)被検化合物を共存させない場合と比較して、重層上皮細胞への分化を低下させ る化合物を選択する工程
[0096] 上記工程（a)における dermokine- α /- βタンパク質を発現する細胞は、ケラチノ サイトと一緒に培養できれば 、かなる細胞でも許され、ケラチノサイトそのものであつ ても良 、。好ましくはケラチノサイトである。 dermokine- α /- βタンパク質を発現する 細胞は、通常、 dermokine- α / βタンパク質をコードする DNAを発現可能な状態で 保持するベクター (dermokine- α / β発現ベクター）を、ケラチノサイトへ導入するこ とにより、作製することができる。
[0097] また、上記工程 (b)における「dermokine- α / βタンパク質をケラチノサイトに発現 させることにより該ケラチノサイトを重層上皮細胞へ分ィ匕させる活性」は、例えば、重 層上皮の分化マーカー、好ましくは、インボルクリンの発現を指標として、適宜、測定 することができる。例えば、上記インボルクリンの発現を上昇させる化合物は、ケラチ ノサイト分化誘導作用を有するものと判定され、インボルクリンの発現を低下させる化 合物は、ケラチノサイト分ィ匕抑制作用を有するものと判定される。
[0098] また本発明の dermokine- α / βタンパク質は、重層上皮において発現していること から、例えば、重層上皮から派生した癌細胞のマーカーとなることが期待される。本 発明の dermokine- α / βタンパク質の発現もしくは活性の有無を指標とすることによ り、所望の癌細胞について、重層上皮力 派生した癌細胞である力否かの判定を行 うことが可能である。本発明は、 dermokine- a Z jSタンパク質の発現もしくは活性の 有無を指標とする、被検細胞について、重層上皮力も派生した癌細胞であるか否か の検査方法を提供する。
[0099] 本発明の上記検査方法の好ましい態様においては、以下の工程 (a)および (b)を 含む方法である。
(a)被検細胞について、 dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質の 発現量または活性を測定する工程、
(b)対照と比較して、前記発現量または活性が変化している場合に、被検細胞は重 層上皮から派生した癌細胞であるものと判定する工程
[0100] 上記工程 (a)における「測定」は、上述の方法によって、適宜実施することができる 。また、上記工程 (b)における「対照」とは、通常、正常細胞を指す。具体的には、癌 細胞ではないことが予め判明している細胞であり、一般的には、健常者由来の細胞 である。また、重層上皮力も派生した癌細胞ではないことが予め判明している癌細胞 を、上記「対照」として用いることも可能である。
[0101] 本発明の上記工程 (b)においては、 dermokine- α / βの発現もしくは活性力 対 照と比較して変化している細胞は、重層上皮から派生した癌細胞、例えば扁平上皮 癌細胞であるものと判定することができる。
[0102] 本発明において上記「変化」とは、通常、「上昇」および「減少」を意味するが、好ま しくは「減少」を指す。従って、本発明の好ましい態様においては、 dermokine- α Z βの発現もしくは活性力 対照と比較して減少している細胞は、重層上皮から派生し た癌細胞、例えば扁平上皮癌細胞であるものと判定することができる。
[0103] 本発明のタンパク質は、重層上皮から派生する増殖、分化異常疾患に関与するこ とが考えられる。例えば、皮膚癌、食道癌、子宮頸癌、肺癌、胸腺癌等は、重層扁平 上皮 (肺癌の場合は、偽重層上皮)から派生した扁平上皮癌や基底細胞癌が良く認 められる。本発明のタンパク質 (遺伝子）は、これらの癌において癌の進行度または 分ィ匕度に関与していることが予測され、即ち、これらの癌のマーカーとして有用である 。本発明においては、上記「重層上皮力も派生した癌細胞」とは、好ましくは、上述の 癌の細胞を指す。特に、元々重層扁平上皮ではない肺の気管支 (偽重層上皮）の扁 平上皮癌には、本発明の上記方法は有効である。
[0104] また、上記検査方法を用いて、被検者につ!、て、扁平上皮癌もしくは基底細胞癌 に罹患している力否かの診断を行うことが可能である。即ち、本発明は、以下の工程 (a)および (b)を含む、被検者について、扁平上皮癌または基底細胞癌の診断方法 に関する。
(a)被検者力 調製された細胞試料について、本発明の上記検査方法により、重層 上皮から派生した癌細胞力否かを判定する工程
(b)前記工程により、重層上皮力 派生した癌細胞であるものと判定された場合に、 被検者は、扁平上皮癌または基底細胞癌に罹患して 、るものと判定する工程
[0105] また本発明は、血液等の体液を被検試料として上記検査 (診断)方法を行うことが 可能である。本発明のタンパク質は、分泌タンパク質であることから、特に、血中に本 発明のタンパク質が分泌された場合には、重層上皮から派生する癌、例えば、食道 癌、または肺癌等の診断を適宜、実施することが可能である。
[0106] また、本発明のタンパク質は、種々の皮膚疾患に関与することが考えられる。例え ば、表皮のターンオーバーが亢進している乾癬等の病態においては、その基底層が 著しく増大し、増殖が亢進し、錯角化等が起こっている。また、扁平苔癬等において は、錯角化を伴わない角質肥厚や顆粒層の肥厚が認められる。上記のような分化、 増殖異常に起因する疾患にも、本発明のタンパク質 (例えば、 dermokine- a Z j8 )が 関与して!/ヽることが考えられる。
[0107] 本発明は、以下の工程 (a)および (b)を含む、被検者について、皮膚疾患の診断 方法を提供する。
(a)被検者から調製された被検試料にっ 、て、 dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質の発現量または活性を測定する工程
(b)対照と比較して、前記発現量または活性が変化している場合に、被検者は皮膚 疾患に罹患して 、るものと判定する工程
[0108] 上記方法においては、工程 (b)における発現量もしくは活性が上昇している場合に 、 dermokine- α / βの発現もしくは活性の亢進に伴う皮膚疾患に罹患して 、るものと 判定される。一方、発現量もしくは活性が低下している場合に、 dermokine- a Z jSの 発現もしくは活性の低下に伴う皮膚疾患に罹患しているものと判定される。
[0109] 上記「皮膚疾患」とは、通常、 dermokine- α / βタンパク質の発現もしくは活性の「 変化」に伴う（起因する)疾患を言う。より具体的には、皮膚疾患として、乾癬、扁平苔 癬、角化症、湿疹、そう痒症、黒皮症、炎症性皮膚炎等を挙げることができる。
[0110] また上記診断方法に供することができる生体試料として、例えば、被検者の皮膚組 織 (細胞)等を挙げることができるが、被検者由来の細胞もしくは細胞抽出物を含む 試料であれば、特に制限されない。
また、本発明において被検者とは、通常、ヒトを指すが、本発明のタンパク質 (例え ば、 dermokine- α / β )を有する生物であれば特に制限されない。例えば、ィヌ、ネ コ等の動物について、本発明の検査'診断方法 (例えば、皮膚疾患の診断方法)を 実施することも可能である。
[0111] なお、本発明において dermokine- α / βタンパク質の発現もしくは活性の測定は、 dermokine- α / βタンパク質を構成要素として含む複合体の SSCについて、その発 現もしくは活性を測定することによつても実施することが可能である。
[0112] また本発明は、 dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質、あるいは 上記スクリーニング方法によって得られるケラチノサイト分ィ匕誘導剤を個体 (例えば、 患者等)へ投与することを特徴とする、ケラチノサイト分ィヒ誘導能低下に起因する疾 患の治療もしくは予防方法に関する。
[0113] また本発明は、以下の（a)—（d)からなる群より選択される化合物、あるいは上記ス クリーニング方法によって得られる（治療上有効量の)ケラチノサイト分ィ匕抑制剤を個 体へ投与することを特徴とする、ケラチノサイト分ィ匕亢進に起因する疾患の治療もしく は予防方法に関する。
(a) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の転写産物に対するアンチセ ンス核酸
(b) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の転写産物を特異的に開裂 するリボザィム活性を有する核酸
(c) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の発現を、 RNAi効果による阻 害作用を有する核酸
(d) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質と結合する抗体
[0114] また本発明は、 dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質、あるいは 上記スクリーニング方法によって得られるケラチノサイト分ィ匕誘導剤の、ケラチノサイト 分ィ匕誘導低下に起因する疾患の治療剤の製造における使用に関する。
[0115] また本発明は、以下の（a)—（d)からなる群より選択される化合物、あるいは上記ス クリーニング方法によって得られるケラチノサイト分ィ匕抑制剤の、ケラチノサイト分ィ匕亢 進に起因する疾患の治療剤の製造における使用に関する。
(a) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の転写産物に対するアンチセ ンス核酸
(b) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の転写産物を特異的に開裂 するリボザィム活性を有する核酸
(c) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の発現を、 RNAi効果による阻 害作用を有する核酸
(d) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質と結合する抗体
[0116] なお、本発明におけるケラチノサイト分ィ匕誘導低下に起因する疾患としては、例え ば尋常性乾癬あるいは日光角化症を挙げることができる。また、本発明におけるケラ チノサイト分ィ匕亢進に起因する疾患としては、例えば過角化を伴う尋常性魚鱗癬、伴 性遺伝性魚鱗癬、尋常性疣贅、アミロイド苔癬及び顆粒層肥厚を伴う扁平苔癬、ある いは水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症を挙げることができる。
[0117] 本発明の治療もしくは予防方法における個体とは、通常、上記疾患の患者を指し、 特に制限されないが好ましくはヒトである。
[0118] 患者への投与は一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当 業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法 などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能で ある。また、該化合物が DNAによりコードされうるものであれば、該 DNAを遺伝子治療 用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。
[0119] 遺伝子治療用ベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスべ クタ一、アデノ随伴ウィルスベクターなどのウィルスベクターやリボソームなどの非ウイ ルスベクターなどを例示することができる。該ベクターを利用して、 ex vivo法や in vivo 法などにより患者へ目的の DNAの投与を行うことができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0120] 以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例 に制限されるものではな 、。
[0121] [細胞培養および抗体]
正常ヒト胚ケラチノサイト（NHEK)は、供給元（KURABO、 Osaka, Japan)による初代 培養後に凍結細胞として購入した。 NHEK細胞を無血清培地 Humedia KG2 ( KURABO)中で培養した。 293ZEBNA- 1細胞は Invitrogen社（San Diego, CA)から購 入し、 10%ゥシ胎仔血清を加えたダルベッコ変法イーグル培地（Sigma)中で維持した 。抗 His抗体 (Penta'His Antibody.BSA free)は QIAGEN (Valencia, CA)より購入した
[0122] [マウス皮膚 cDNAライブラリーの構築および均等化、ならびに DIG標識 RNAプロ一 ブの調製] cDNAライブラリ一は、以前に記述された方法（Komiya T, Tanigawa Y, Hirohashi S: Anal. Biochem. 254:23-30, 1997)に従って構築および均等化した。簡潔に述べると 、マウス背部皮膚（8週齢雌 BalbZcマウス）の全 RNAから、 Notl制限部位を用い、オリ ゴ_((1丁）プライマーを用いてマウス皮膚 cDNAを構築した。 cDNAを PCRにより増幅した 後に、以前に記載された方法に従って（Ko: Nucleic Acids Res. 18:5705-5711, 1990 ； Takahashi N, Ko MSH: Genomics 23:202-210, 1994)、均等化サイクルを 2回行った 。均等化の各段階（Elおよび E2)におる Cot値はそれぞれ 10および 100であった。
[0123] 均等化の評価は定量的リアルタイム PCR分析によって、以下に記述されているよう に二重化して行なった。以下に示す各遺伝子特異的なプライマー対は、各 cDNA配 列である NM016958、 NM027011, NM008401および NM008508より構築した： マウスケラチン 14 (5，- GGACGCCCACCTTTCATCTTC-3 ' (配列番号： 9)：順方向 、 5 ' - ATCTGGCGGTTGGTGGAGG-3 ' (配列番号： 10)：逆方向）、
マウスケラチン 5(5 ' -CAGTTCTACATTTGTGTTGCACGTC- 3，（配列番号： 11)：順 方向、 5，- TTGGACAGACTCTGGAGGAAGTCAG- 3，（配列番号： 12)：逆方向)、 マウスインテグリン a -M(5， -TTGAAAGGACCCCAGTGCTGAACTGC-3，（配列番 号： 13)：順方向、 5 ' - ATGGAGCTGCCCACAATGAGTGGTACAG- 3 ' (配列番号： 14) :逆方向)、および
マウス口リクリン (5，- CCTACCTGGCCGTGCAAG- 3，（配列番号： 15)：順方向、 5， -CATGAGAAAGTTAAGCCCATCG-3 ' (配列番号： 16)：逆方向)。同じ量の、均等 化したライブラリー（E1および E2)およびスターティングライブラリー（E0)を PCR解析に 利用した。全データは内部標準について標準化した (口リクリン； A Ct metod、 User Bulletin 2, Applied Biosystems)。
[0124] E2ライブラリーを Notlおよび Sailで消化し、得られた断片を pBlueScript KS (-) (
Stratagene、 La Jolla、 CA)中にクローユングした。コロニーを無作為に選択し、 cDNA 揷入物を、 Native Plu DNAポリメラーゼ（Stratagene)を用い、ベクタープライマーの対 を利用する PCRによって増幅した。増幅断片には、ベクターに由来する T3および T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列が追加される。アンチセンスプローブ（Stratagene) を作製するために、 T7 RNAポリメラーゼを用いる cRNA転写を Nunc MicroWell™プレ ート（Nunc, Roskilde, Denmark)において行った。センスプローブは T3 RNAポリメラー ゼ（Stratagene)を用いることによって作製した。
[0125] [ハイスノレ一プット in situハイブリダィゼーシヨン（HT- ISH) ]
96ゥエルのプレートにおける HT- ISHを以前に記述された通りに行った（Komiya T, Tanigawa Y, Hirohashi S: Anal. Biochem. 254:23-30, 1997)。簡潔に述べると、成体 マウス足躕皮膚を 8週齢の雌 BalbZcマウス力も新たに単離した。単離した皮膚をリン 酸緩衝食塩水（PBS)中で 1 %ジェチルピロカルボネート（DEPC)により室温で 1時間 かけて固定した。それから試料を脱水し、包埋し、切片を作製し、マウントおよび 96ゥ エルプレートにハイブリダィゼーシヨンした。
[0126] [ノーザンブロット]
種々の成体マウス組織由来の全 RNAを、 Chomczynskiおよび Sacchiにより記載され た方法に従って調製した（Chemczynski P, Sacchi N: Anal. Biochem. 162:23-30, 1997.)。全 RNA (20 g)を電気泳動し、 Hybond- N+膜（Amersham Pharmacia Biotech 、 Little Chalfont、 U.K.)に移行させた。
dermokine- /- β (図 2Bの SK063F08)、 dermokine- β (図 2Βの j8 -probe)ゝ Kdap (XM 149907)および suprabasin (318- 765bp of BC051531)の cDNA断片は DIG RNA標 識キット (Roche Applied Science)を用いて、 DIG標識を施した。 DIG標識 RNAプローブ とのハイブリダィゼーシヨンは、製造者（Roche Applied Science)により記載されたプロ トコールに従って行った。種々の段階の胚発生における dermokine- α / βの発現を、 Mouse Embryo Full Stage Blot (¾eegene、 Seoul、 Korea) 用 ヽて評価した。
[0127] [SEAP融合タンパク質のための cDNAクローユングおよび構築]
第一鎖 cDNAは、 Superscript II逆転写酵素（Invitrogen)を用いてヒト皮膚全 RNA ( Stratagene)から調製した。ヒト dermokine- aおよび- j8の ORFをコードする DNA断片 は、 5'SalI- dermokine- aプライマー（配列番号： 17Z プライマー（配列番号： 18ZGCGGCCGCCCAAAACTTCACCCACTGCAGCAGG) および 5'SalI- dermokine- βプライマー（配列番号： 19Z
GTCGACGCCACCATGAAGTTCCAGGGGCCCCTGG) /3'NotI— dermokine— βプ ライマー (配列番号：
それぞれ用いる PCRによって増幅した。ヒト Kdapおよび suprabasin (0.7-kb断片； Park uT, Lim SE, Jang b, Morasso MI: Suprabasin, a novel epidermal differentiation marker and potential cornified envelope precursor. J. Biol. Chem.
277:45195-45202, 2002.)の cDNAは、 5'SalI- Kdapプライマー（配列番号： 2lZ 一（配列番号： 22ZGCGGCCGCCTGGGCATCAGGAGTTGCGCTC)および 5 'Sail- suprabasinプライマー（配列番号： 23Z
3'NotI- suprabasinプライマー（配列番号： 24Z よって増幅した。これらのプライマーは以下の GenBankァクセッション番号に基づいて 設計した： AK003695 (dermokine- a )、 BC035311 (dermokine- j8 )、 BX112106 (Kdap )および BC063640 (suprabasin)。
これらの cDNAを、（His) COOH末端タグでそれ自身のシグナルペプチドを欠いて
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V、る分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP)をコードして!/、る cDNAの 5'末端へ融合さ せた。 PCDNA3.1- SEAP (His)ベクターと命名した SEAP (His)発現ベクターを
6 6
pDREF- SEAP (His)から構築した（Ikeda W, Kakunaga S, Itoh S, Shingai T, Takeuni
6
K, Satoh K, Inoue Y, Hamaguchi A, Morimoto K, Takeuchi M, Imai T, Takai Y: J. Biol. Chem. 278:28167-28172, 2003)。 Sailおよび Notlによる消化後に、 dermokine- 、 dermokine— j8、 Kdap,および suprabasinの cDNAを pcDNA3.1— SEAP (His) 中の
6
Sail- Notl部位にクローユングし、それぞれ pcDNA3.1- dermokine- a - SEAP (His)、
6 pcDNA3.1- dermokine- j8 - SEAP (His)、 pcDNA3.1- Kdap- SEAP (His)および
6 6
pcDNA3. 1- suprabasin- SEAP (His)を得た。これら発現ベクターを TransIT LT1 (
6
Mirus, Madison, WI)を用いることにより、 293ZEBNA-1細胞に導入した。 TALON Superflow Metal Affinity Resin(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)を使用した ものを除いて、一時的に発現させ、培地中に分泌させた SEAP融合タンパク質を以前 に記載した通りに精製した（Imai T, Baba M, Nishimura M, Kakizai M, Takagi S, Yoshie O: J. Biol. Chem. 272: 15036-15042, 1997)。精製した SEAP融合タンパク質 は、 N末端アミノ酸シーケンシングに従属させた。
[0129] [ケラチノサイトのインビトロ分化]
集密に達して 、な 、正常ヒト表皮ケラチノサイトを H醒 edia KG2培地 (Ca2+濃度 0.15mM、ゥシ下垂体抽出物（BPE)を含む）皿中（2.5 X 103個 Zcm2)の密度で播き、 2 日間培養した。続いて細胞をそれぞれ BPEを含まない、正常 Ca2+培地 (Ca2+ 0.15mM)あるいは高 Ca2+培地（Ca2+ 1.5mM)で何回か洗浄した。ケラチノサイトを次 に正常 Ca2+培地中で 2、 4および 6日間、あるいは高 Ca2+培地中で 2日間培養した。 qRT- PCRに用いるための全 RNAを、 RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いてこれらの細 胞カも調製した。また、トランスフエクシヨンをする場合は、 TransIT LT1
keratinocyte(Mirus)を用いて二日目の 0.15mM Ca2+で培養したケラチノサイトにトラン スフエタトした。
[0130] [定量的リアルタイム RT- PCR分析]
マウス組織の定量的リアルタイム PCR分析のために、種々のマウス組織（8週齢雌 BalbZcマウス）から、 RNeasy Fibrous Tissue Miniキット（QIAGEN)を用いて全 RNAを 調製した。 RNA PCRキット（AMV) Ver.2.1 (TAKARA, Shiga, Japan)をランダムな 9量 体プライマーとともに用いて、第一鎖 cDNAテンプレートを総 RNAから調製した。定量 的リアルタイム PCRは、 QuantiTect SYBR Green PCRキット（QIAGEN)および ABI PRISM 7700 sequence Detection system (Applied Biosystems, Foster city,し A)で、 SYBRGreen I色素の蛍光の増加を観測することによって二重化して行った。プライマ 一は、多数の転写物が同時に解析できるような単リアルタイム PCR熱プロフィール（95 °C15分、および 95°C15秒および 60°C1分を 40サイクル）に一致するようにデザインさ れた。全データは内部標準（ダリセルアルデヒド- 3-リン酸デヒドロゲナーゼ mRNA ; A Ct method, User Bulletin 2、 Applied Biosystems)について標準ィ匕した。プライマ 一のセットは以下のとおりである。
[0131] マウス dermokine- a (AK003695)、 j噴方向プライマー (5，
-GACTGTACGAGAGCACAACCATG-3， Z配列番号： 25)および逆方向プライマー (5 ' - CTGAACCCCAGCTGTGGC- 3 ' Z配列番号： 26)； マウス dermokine- j8 (AK081753)、順方向プライマー (5，
- CATGCCCCATCTCCCAGC- 3 ' Z配列番号： 27)および逆方向プライマー (5， -CCCTCAATCTGTTTCCAGTTGAAG-3 ' /配列番号： 28)；
マウス Kdap(XM149907)、 j噴方向プライマー (5，
-ACTGGCACGTCATCACTGATATGTTC- 3， Z配列番号： 29)および逆方向プライ マー (5 ' -GGAATCAGGAGCGGCACTTC-3 ' Z配列番号： 30)；
マウス suprabasin(AYl 15494)、順方向プライマー (5，
-GTCAACAAGCCATTTATCAACTTCC- 3' Z配列番号： 31)および逆方向プライマ 一 (5， -GTGTGACAACCGGAGCATTC-3， Z配列番号： 32);
マウス GAPDH(NM008084)、 j噴方向プライマー (5 '
-AAGGTGGTGAAGCAGGCATCTGAG-3， Z配列番号： 33)および逆方向プライマ 一 (5， -GGAAGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3， Z配列番号： 34)； ヒト dermokine- a (AL832080)、順方向プライマー (5，
-ATGAACATGAAGCCGGCCAC-3， Ζ配列番号： 35)および逆方向プライマー (5， - CGTTTCTGCAGTGATGACGCG- 3 ' /配列番号： 36)；
ヒト dermokine- j8 (BC035311)、順方向プライマー (5，
-AAAGGCCATTGGCAAAGAGGCC-3， Z配列番号： 37)および逆方向プライマー (5 ' -ACCCTGTTGCCCAAAGCATCTG-3 ' Z配列番号： 38)；
ヒト Kdap(BXl 12106)、順方向プライマー (5，
-AACTGGCACGCCCTCTTTGAGTCTATC- 3 ' Z配列番号： 39)および逆方向プラ イマ一 (5 ' - ATGGTCACTGGGCATCAGGAGTTG- 3 ' Z配列番号： 40)； ヒト suprabasin(BC063640)、 j噴方向プライマー (5，
-AACCAGCTGCTGAATGGCAACCA-3， Z配列番号： 41)および逆方向プライマー (5 ' -ATGAAAGGCGTGTTGACCGAGG-3 ' Z配列番号： 42)；
ヒトケラチン 10 004029)、順方向プライマー (5，
-CTTGGCAGAAACAGAAGGTCGCTAC-3， Z配列番号： 43)および逆方向プライ マー (5 ' - CGGTTTCAGCTCGAATCTCTTGC- 3 ' Z配列番号： 44)；
ヒトインボルクリン (M13903)、順方向プライマー (5， -CCACCCAAACATAAATAACCACCCG-3， Z配列番号： 45)および逆方向プライ マー (5， -TAGCGGACCCGAAATAAGTGGAGC-3， Z配列番号： 46)；
ヒト TGase 1 (NM000359)、順方向プライマー (5，- ATGTCTCAGGCCACGTCAAG- 3 ， Z配列番号： 47)および逆方向プライマー (5， -CTGCTCCCAGTAACGTGAGG-3， Z配列番号: 48) ;
ヒト 13 -actin (NM001101)、順方向プライマー (5，
-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3， Z配列番号： 49)および逆方向プライマ 一 (5 ' - TGCTTGCTGATCCACATCTGC- 3 ' Z配列番号： 50)；
およびヒト GAPDH(NM002046)、順方向プライマー (5，
- ACTTCAACAGCGACACCCACTC- 3 ' Z配列番号： 51)および逆方向プライマー (5 ' -CCTGTTGCTGTAGCCAAATTCG-3 ' Z配列番号： 52)。
[マウス表皮にお!、て発現した遺伝子のハイスループット in situハイブリダィゼーショ ンスクリーニング]
マウス皮膚切片の in situハイブリダィゼーシヨン用に cRNAプローブを生成するため に、本発明者らは 8週齢雌 Balb/cマウスの背中皮膚力も cDNAライブラリーを調製し、 上記実験手順に述べたように均一化した。均一化は、低レベルで転写される遺伝子 を効率よく拾 、上げるためのこのタイプのスクリーニングは必須である。 cDNAライブラ リーがうまく均等化されたかを確認するために、マウスのケラチン 14(NM016958)、ケラ チン 5(NM027011)、インテグリン α - M(NM008401)、および口リクリン（NM008508)に対 する遺伝子特異的プライマーで定量的リアルタイム PCRを、インテグリン a -Mの発現 レベルは比較的低いと思われる力 ケラチン 14およびケラチン 5は大量に発現される と思われる期待値で行った。 cDNA铸型間の量を標準化するため、口リクリン cDNAの 量はマウス口リクリンに対する特異的プライマーで決定した。図 1Aに示すように、ライ ブラリーの均等化後、ケラチン 14およびケラチン 5の両方ともおよそ 1/5に減少してい たことが示された。対照的に、インテグリン α -Μ量は、およそ一 42倍に増加していた。 均等化効率についても、均等化の前後に、そのライブラリ一力 無作為に選択した一 500のクローンの DNA配列決定により評価した。クラスター解析から、非均等化および 均等化ライブラリーについての予備的な重複性力 それぞれ 35.3%および 1.3%であ つた。これらの知見は、均等化方法が、非常に豊富な cDNA種の量、すなわちクロー ンの重複性 (redundancy)力^まく減少したことを示す。
[0133] マウスの足躕表皮は、背中の皮膚のような濾胞間の表皮よりも厚ぐその形態はヒト 表皮に似ている。従って本発明者らは、ハイスループット in situハイブリダィゼーショ ン (HT-ISH)における遺伝子の層特異的発現を同定するために、、マウス足躕表皮 (8週齢 Balb/cマウス)切片を使用した。切片を 96-ゥエルプラスチックプレートの各ゥェ ル（100プレート；計 9600切片）上に配置した後、均等化 cDNAライブラリ一力も調製し た DIG-標識した cRNAプローブを、ハイブリダィズした。切片 9600個の中で、およそ一 1000個でハイブリダィゼーシヨンシグナルが認められた。
[0134] その後の配列決定によって、一 600の重複した cDNAクローンが除かれ、独立した遺 伝子が残った。本発明者らはこれらの遺伝子に対する in situノヽイブリダィゼーシヨン の再現性について評価し、核染色したクローンを除外した後、マウス足躕表皮の特 異的な層において発現した 116種の独自のクローンを最終的に選択した。これらのク ローンはもちろん以前に十分に特徴付けがなされた遺伝子を含んで 、た。シクロフィ リン A、 Kdap、プロチモシン a、ジァゼパム結合インヒビター、チューブリン 13 -2鎖ホモ ログ、ラミン A、核分布 Cホモログ、デスモプラキン、ケラチン関連タンパク質 16- 5、ヌク レオシドニリン酸キナーゼじ、スモールプロリンリッチ様 2、および口リクリンに対する HT-ISHシグナルは、例として図 1Bに示した。以前の報告と同じぐシクロフイリン 、 Kdap、および口リクリンの発現はそれぞれ、基底層 Z基底層上、基底層上および顆 粒層に限局した（AL- Daraji WI, Grant KR, Ryan K, Sacton A, Reynolds NJ:
Localization of calcinurin/ NFAT in human skin and psoriasis and inhibition of calcinurin/ NFAT activation in human keratinocytes by cyclosporin A. J. Invest. Dermatol. 118: 779—788, 2002. ; Oomizu S, Sahuc F, Asahina K, Inamatsu M, Matsuzaki Γ, Sasaki M, Obara , oshizato K: Kdap, a novel gene associated with the stratification of the epithelium. Gene. 256: 19—27, 2000. ; Mehrel T, Hohl D, Rothnagel JA, Longley MA, Bundman D, Cheng C, Lichti U, Bisher ME, Steven AC, Steinert PM et al. : Identification of a major keratinocyte cell envelope protein, loricrin. Cell 61 : 1103-1112, 1990.)。これらの発見は HT-ISHスクリーニングが上手く 行なわれたことを示すものである。
[0135] [有棘層にお 、て発現された新規遺伝子の同定]
本発明者らは、これらの 116種の cDNAクローン中で、有棘層において in situハイブ リダィゼーシヨンシグナルが特異的に検出された新規 cDNA断片 (SK063F08)を同定 した (図 2A)。その新規 cDNAクローンの全長を得るために、マウスの公開された利用 可能な ESTデータベースを検索し、 SK063F08の全配列を有する ESTクローン（ AK003695)を同定した (図 2B)。マウス皮膚における AK003695の発現は、 RT-PCRに より確認した。この AK003695 ESTは、 22bpの短い 5'-非翻訳領域 (UTR)、アミノ酸 104 個のアミノ酸（配列番号： 53)をコードして!/、る 315bpのオープンリーディングフレーム (ORF)、およびポリアデ-ル化シグナルを含む 324bpの 3'-UTRから構成されて!、た。
[0136] 更に、データベースで別のより長い EST (AK081753)を発見した。これは 3'末端（
98-657bp)で AK003695として同じ配列をシェアしていた。これは、これらの ESTがスプ ライシングバリアントであることを示して 、る（図 2B)。マウス皮膚における AK081753の 発現も、 RT-PCRにより確認された。 AK081753に対応するいくつかのクローニングさ れた cDNAのヌクレオチド配列の close examinationにより、 AK081753の 743bpの部分 に 1個のヌクレオチド欠失、 1132bpと 1133bpの間に 27bpの挿入、及び 1197-1244bpの 間の 48bpの欠失が同定された。補正した AK081753 EST配列は、 170bpの短い 5'-UTR、 517アミノ酸のタンパク質をコードする 1554bpの ORF、およびポリアデュル化 シグナルを含む 320bpの 3'-UTRを有して!/、た（図 2B)。
[0137] ヒト ESTデータベースにお!/、て、マウス EST (AK003695および AK081753)の各々に 対して相同なふたつの EST (AL832080および BC035311)を同定した (図 2B)。これら はヌクレオチド配列レベルでおよそ 63%および 55%同一であり、アミノ酸配列レベル ではいずれも 54%同一であった (図 2B、 C)。開始コドン周辺のマウスおよびヒト ESTで ある AK003695、 AK081753, AL832080および BC035311に隣接する配列は、コザック により提唱された翻訳開始部位と一致していた (Kozak, M: Nucleic Acids Res.
15:8125-8148, 1987.)。
[0138] AK003695, AK081753, AL832080および BC035311の推定アミノ酸配列は、
GenBankのあらゆる他の配列との類似性を示さなかった。 dermokine- j8において、 2 つの保存されたシスティン残基（図 2C中の矢印）および保存された潜在的な N-ダリ コシレーシヨン部位（図 2C中の矢頭）、および dermokine- oV- jSにおいていくつかの 潜在的な N-ミリストイレーシヨン部位があった。興味深いことに、 SignalP serverは、こ れら全ての ESTから推定されたアミノ酸配列から、それらの N-末端の典型的シグナル 配列を推定した (http：〃 www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP- 2.0/#submission)。更に 2 つのスプライシングバリアント（splicing variant)による C末側の共有部分は、非常に高 い pi値を示し (pl=10.3 ;図 2B、 Cおよび図 4A参照）、これは骨形成タンパク質 (BMP) 、 eotaxin、線維芽細胞増殖因子（FGF)、インターフェロン- (IFN- β )、インターロイ キン（IL)、血小板由来成長因子（PDGF)、 Wntなどの様々なサイト力イン類において 共通していた。従って以下に説明するように、これらのペプチドの mRNAは皮膚にお いて大量に発現されていることを考慮して、本発明者らは暫定的に、短いおよび長い スプライシングバリアントを、それぞれ「dermokine aおよび j8」と命名した (図 2C)。
[0139] [dermokine ~ / 遺伝子の構成]
Ensembl Human Genome Browseri 、染色体 19ql3.1上【こヒト dermokine— αおよ Ό、 - j8に対する遺伝子を位置づけ (ENSG00000161249)、それは一 14-kbの範囲に広が つている。図 3Aに示すように、ヒト dermokine- αおよび- j8は、それぞれ 6個および 16 個のェキソンからなる。興味深いことに、 dermokine- α遺伝子のェキソン 1は、推定翻 訳開始部位およびシグナル配列の両方を有し、 dermokine- 18遺伝子のェキソン 11お よび 12の間に存在し、それらは別のプロモーターによって転写されることを示唆して いる。推定終止コドンは dermokine- aのェキソン 5、すなわち dermokine- のェキソン 15内に含まれた。マウスの dermokine- a /- j8遺伝子は、 Ensembl Mouse Genome Browserにおいて ENSMUSG00000036665として、ヒトにおける 19ql3.1とシンテューを 共有した領域である染色体 7上にマッピングされた。マウス dermokine- j8遺伝子の正 確なゲノム構成は、入手可能なゲノムデータベース由来の情報が不完全であるため に、決定されていないが、同じゲノム構成がマウス dermokine- α遺伝子座の周辺に 確認された。
[0140] ヒト染色体 19ql3.1とマウス 7番染色体において、 dermokine遺伝子の両側にケラチノ サイト-関連ペプチドである suprabasinおよびケラチノサイト分化-関連タンパク質 (Kdap)についてふたつの遺伝子力 マッピングされており (図 3B) :最近、両タンパク 質は重層上皮において高度に発現されることが報告された (Oomizu S, Sahuc F, Asahina K, Inamatsu M, Matsuzaki T, basaki M, Obara M, Yoshizato K: Kdap, a novel gene associated with the stratification of the epithelium. Gene. 256:19—27, 2000. ; Park GT, Lim SE, Jang S, Morasso MI: Suprabasin, a novel epidermal differentiation marker and potential cornified envelope precursor. J. Biol. Chem. 277:45195-45202, 2002.)。興味深いことに、 suprabasinゝ dermokine- α /- j8および Kdap遺伝子は、転写と同じ方向にこの順番で並んでいる。ケラチノサイト特異的タン ノ ク質をコードして ヽな 、精巣特異的なダリセルアルデヒド- 3-リン酸デヒドロゲナー ゼおよびュビキタスに発現する GPR43に対する遺伝子は、各々、 suprabasinの上流お よび Kdapの下流に位置しているが (Welch JE, Schatte EC, O'Brien DA, Eddy EM: Expression of a glyceraldehyde 3— phosphate dehydrogenase gene specific to mouse spermatogenic cells. Biol. Reprod. 46:869-878, 1992. ; Sawazdargoら、 1997)、しかし これらの遺伝子は、 suprabasin, dermokine- a /- j8および Kdapとは反対方向に転写 される。これらの知見、すなわちケラチノサイト-関連遺伝子の新規クラスターが存在 するということは、 suprabasin、 dermokine— α /— j8および Kdap mRNAの転写が、同調 された方法で調節されることを示唆して!/ヽる。
[dermokine- α /— j8、 Kdapおよび suprabasinの分泌、]
図 4Aに示したように、 SignalP serverは、 dermokine- a /- j8のみではなく、 Kdapおよ び suprabasinも、それらの N-末端に推定シグナル配列を有すると推定した (図 4A)。こ れは、以前に Kdapにおいて指摘されており (Oomizu S, Sahuc F, Asahina K, Inamatsu M, Matsuzaki T, Sasaki M, Obara M, Yoshizato K: Kdap, a novel gene associated with the stratification of the epithelium. Gene. 256:19-27, 2000.)、一方 suprabasinの N-末端疎水性配列は、潜在的な膜貫通ドメインとして考えられて!/、る (Park uT, Lim SE, Jang b, Morasso MI: Suprabasin, a novel epidermal differentiation marker and potential cornified envelope precursor. J. Biol. Chem.
277:45195-45202, 2002.)。し力し、 dermokine— α /— j8、 Kdapおよび suprabasin遺伝 子は、遺伝子複合体を形成するので、それらの産物の全てがケラチノサイトから分泌 されると推測したくなる。この考えを試験するために、ヒト dermokine-oV- jS、 Kdapお よび suprabasin (0.7-kb転写産物) cDNAを、哺乳類の発現ベクター
pcDNA3.1-SEAP(His)に挿入し、それらの C-末端を SEAP(His)でタグ付けした融合
6 6
タンパク質を発現させた。これらの融合タンパク質は、培養した 293/EBNA-1細胞に おいて一過性に発現し、培養培地において、抗 -His抗体を使用するィムノブロッティ ングにより検出された（図 4B)。興味深い点は、 SDS- PAGEゲルにおいて、培地にお いて検出された細胞は、融合タンパク質の推定分子質量と比べ、上側に有意にシフ トしていたことであり、このことは、分泌されたタンパク質力 グリコシルイ匕および Zまた は分子間ジスルフイド結合によって、もしかすると翻訳後修飾されたことを示唆して ヽ る。
[0142] 次に、 N-末端推定シグナル配列力 これらの分泌された融合タンパク質にお!/、て 取り除かれているかどうかを調べた。分泌された融合タンパク質は各々、 TALON Superflow Metal Affinity Resinにより培養培地から単一のバンドとして精製された (図 4 C)：本試験に用いたトランスフエクシヨン条件および培養条件では、 dermokine- a - SEAP(His)、 dermokine- β - SEAP(His)、 Kdap- SEAP(His)、および
6 6 6
suprabasin- SEAP(His)は各々、収量 0.15mg/L、 0.3mg/L、 13.5mg/L、および 15mg/L
6
で精製された。これらの精製タンパク質の N-末端を直接アミノ酸配列決定したところ、 これらの分泌タンパク質は、正確には図 4Aにおいて予測されたような推定 N-末端シ グナル配列を欠いていることが明らかになった（図 4C)。これらの知見は、 dermokine- α /- j8、 Kdapおよび suprabasinは、それらの N-末端において切断され、更に翻訳後 修飾を受け、その結果分泌されたことを示している。
[0143] [組織における dermokine aおよび j8、 Kdapならびに suprabasinの発現パターン] 様々なマウス組織における dermokine- α / j8、 Kdapおよび suprabasin転写産物の発 現を、ノーザンブロットにより試験した (図 5A)。 dermokine- αおよび- j8の両方にハイ ブリダィズする SK063F08プローブ (図 2B参照)は、皮膚においては強ぐ胃において は弱いふたつのバンド 0.6kbおよび 2.0kbを検出した (Dermokine- 、図 5A) ;長期 間曝露した場合、これらのバンドは、肺においても検出された (データは示さず)。それ らの大きさ力も判断して、これらのバンドは、それぞれ dermokine- αと- j8に対応して いると考えられる。実際、 dermokine- j8 -特異的プローブ（j8 -プローブ、図 2B)を使用 した背舌食前腺膣胸肺小足気膀阡ところ、 2.0- kbバンドのみを検出した (Dermokine- j8、図 5A)。 Kdapは、胃および 躕道胱腺管中暘臓胃胃
皮膚に部皮皮おいて大量に発現され、肺において少量発現された (Kdap、図 5A)。
膚
suprabasin遺伝子の 0.7-kbおよび 2.2-kbスプライシングバリアントの発現パターンは、 dermokine- a /- j8のそれと非常に類似していた (Suprabasin図 5A)。更に、本発明者 らは、定量的 RT- PCR(qRT-PCR)により、これらのタンパク質の発現を調べた (表 1)。
[0144] 表 1は、様々な上皮組織における dermokine- a、- β、 Kdapおよび suprabasinの発 現を定量的リアルタイム RT-PCRで解析した結果を示す。総 RNAは 8週齢雌 Balb/cマ ウスからの様々な上皮組織から調整し、マウス dermokine- α - j8 Kdap,および suprabasinに特異的なプライマーを用いて SYBR Greenベース定量的リアルタイム RT-PCRを行なった。全データは内部 GAPDH mRNA対照について標準化した。 GAPDH (xl0— 3)に対する比：- = 0— 0.1 ; + = 0.1—1； ++ = 1—10 ; +++ = 10— 100 ; ++++ = 100— 1000 ; +++++ = 1000— 2000 ; ++++++ = 2000— 3000
[0145] [表 1] 組織 Dermokine-α Dermokine- β Kdap Suprabasin
+++ ++++ +++ +++
++++ +++++ ++++ +++■
+++ ++++ +++ +++
+++ ++++ ++++ +++
++++ ++++++ +++++ +++■
++ ++ ++ +
+++ +++ +++ ++
++++ +++ ++ ++
+++ +++ - ++
++ ++ + +
これはノーザンブロットの結果と非常に良く一致し、 dermokine- α / j8 Kdapおよび suprabasinは、皮膚、舌、食道、前胃部、および膣などの重層上皮において大量に発 現していた。これらは、気管および膀胱、更には胸腺において発現され、このことは、 Kdapが気管および膀胱で発現され、 suprabasinは胸腺で発現されたと 、う報告 (Oomizu, S., Sahuc, F., Asahina, K., Inamatsu, M., Matsuzaki, T., Sasaki, M., Obara, M., Yoshizato, K. (2000) Gene 256, 19—27、 Park GT, Lim SE, Jang S, Morasso MI: J. Biol. Chem. 277:45195-45202, 2002)と一致している。たとえ RT-PCRであっても、肝臓や小腸のような典型的単層上皮においては、これらは検出 不可能であった。従って、 dermokine- α / j8、 Kdapおよび suprabasinは、若干の例外 はあるものの重層上皮特異的に分泌されるタンパク質であると本発明者らは結論付 けた。この結論は、染色体上で複合体を形成しているこれらの遺伝子の発現は、重 層上皮に特異的方式で調和を持って調節されて 、ると 、う注目点に一致して 、る。 従って本発明者らはここで、この遺伝子複合体は、 SSC (重層上皮分泌ペプチド複合 体、 stratined epitnenum secreted peptides complex/)と称することを 唱す 。
[0147] 次に本発明者らは、重層上皮内で、 SSC産物の発現を、詳細に比較し、マウス足躕 表皮の連続切片について、 in situハイブリダィゼーシヨン解析を行った。 8個の表皮 の連続切片を、 dermokine- α / j8、 Kdapおよび suprabasinについてのアンチセンスま たはセンス cRNAプローブとハイブリダィズした。図 5B〖こ示したよう〖こ、 dermokine- α /- β (SK063F08,図 2B)、 dermokine— j8プローブ（j8 probe,図 2B)および suprabasin のアンチセンスプローブは、表皮有棘層を通じて均等に、ハイブリダィゼーシヨンシグ ナルを生じた。対照的に、 Kdap-特異的プローブは、先に Oomizuらが報告したように 、専ら有棘層の基底上部にハイブリダィズした (Oomizu S, Sahuc F, Asahina K, Inamatsu M, Matsuzaki T, Sasaki M, Obara M, Yoshizato K: Kdap, a novel gene associated with the stratification of the epithelium. Gene. 256:19—27, 2000.)。これら の結果は、 SSC産物の発現は、表皮内におけるケラチノサイト (keratinocyte)が重層 化分ィ匕を開始する際に活性化されたことを示唆している。
[0148] [SSC産物およびケラチノサイト分化]
胚の発生時における dermokine- a /- j8の発現を、 SK063F08プローブを使用し、ノ 一ザンブロットにより試験した。図 6Aに示したように、 dermokine- j8は、 E15.5で発現 され始め、この時期は、表皮層化とほぼ同時である。 dermokine- αは、 E16.5で検出 可能であり、 E17.5まで増加し、 E18.5までに減少する。これらの知見は、 dermokine- a /- j8は、マウス発生初期において、 in vivoにおける表皮の重層化に関連している ことを示唆している。
[0149] 最後に、 SSC産物とケラチノサイト分ィ匕の間の関係を更に試験するために、初代培 養ヒトケラチノサイトの in vitro分化の期間の SSC産物発現レベルの変化を、 qRT-PCR により追跡した。この分化は、 Ca2+濃度の上昇 (0.15mMから 1.50mM)による力、または 0.15mM Ca2+での細胞密度の上昇 (2日間培養から 6日間培養)により、誘導された。ヒ トケラチノサイトにおいて、後者の方法は、終末分化の誘導に関してより有効であるこ とが報告されており (Poumay Y, Pittelkow MR: Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differntiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. J. Invest. Dermatol. 104:271-276, 1995.)、このことは、 qRT— PCR により、ケラチン 10、 TGase 1、およびインボルクリンの mRNAレベルを測定することに より確認された (図 6B)。興味深いことに、 SSC産物の発現は全て、終末分化が in vitro にお 、て進行して 、る限りは、明確に誘導された。
[0150] [Dermokine- aがケラチノサイトの分化に及ぼす影響]
次にケラチノサイトの分化に Dermokine- αが及ぼす影響を調べた。 12 well dish中 に 0.15mM Ca2+存在下で、 2500 cells/cm2で培養したケラチノサイトに対して、ヒト Dermokine- αの C末端側に HA-tagをつけた cDNAを一過性に transfectionにより発現 させた。その結果、 6日後に total RNAを回収すると、 Dermokine- aを発現させたケラ チノサイトは Mockに比べて、有意に total RNAの回収量が低かった（図 7A)。この事 は、増殖が抑制されていることを示唆している。
また、重層上皮の分化マーカーである、インボルクリンに対するプライマーでそのよ うな RNA力も qRT-PCR法によりその発現量を GAPDHを標準として定量したところ、 Mockに比べて、有意に上昇していた（図 7B)。この事は Dermokine- αの発現により ケラチノサイトの分ィ匕が促進された事を示唆した。以上の事から、 Dermokine- αはケ ラチノサイトの増殖、分化の遂行に重要な役割を果たす事が示唆された。
[0151] [SSCタンパク質群に対する抗体の作成]
ヒト dermokine- α、- j8、 Kdap、 Suprabasinに対するゥサギポリクローナル抗体を作 成する為に図 4で用いた、 PCDNA3.1- SEAP(His) vectorにヒト dermokine- α、 Kdap、 Suprabasinを導入したもの、及び、 Dermokine- βから、 dermokine- との共通部分を 欠失したもの（dermokine- j8 - Δ C)を作成し（図 8A)、 293/EBNA-1にお!/、て一過性 に発現させた。得られた培養培地から TALON Superflow Metal Affinity Resinにより、 単一のバンドとして精製した（図 8B)。これらの融合タンパク質をゥサギに免疫し、抗 血清を得た。得られた抗血清を用いて、同じく 293/EBNA-1に一過性にヒト dermokine- α、- j8、- j8 - A C、 Kdap、 Suprabasinを発現させた培養上清に対して immunoblotを行った。その結果、抗血清はこれらの四種類のタンパク質に対して反応 する事が明ら力となった（図 8C)。
[0152] [モノクローナル抗体の作製]
モノクローナル抗体の抗原を作製する為に、 pcDNA3.1-SEAP(His)ベクターにヒト /
6
マウス dermokine- βの C末欠損型 (dermokine- j8 Δ C) cDNAを挿入した発現ベクター を、 293/EBNA-1に導入し一過性に発現させた。得られた培養上清力も TALON Superflow Metal Affinity Resinにより、ヒト /マウス dermokine— j8 Δ C— SEAP(His)蛋白
6 質を精製した。この融合蛋白質をヒト dermokine- j8 A C- SEAP(His)はマウス（Balb/C
6
female)に、マウス dermokine— β A C— SEAP(His)6はラット（Wister rat female)に免疫し 、モノクローナル抗体（それぞれ Anti-hDK mAb, Anti-mDK mAbと称す）を作製した。
[0153] [293細胞培養上清の Immunoblotting]
293細胞で発現させたヒト及びマウス dermokine- β /- β A Cを immunoblotにより解 祈した。
pcDNA3.1 -human dermokine- β、 pcDNA3.1 -human dermokine- β A C、 pcDNA3.1— mouse dermokine- β、 pcDNA3.1— mouse dermokine- β A Cを
293/EBNA- 1細胞に transfectionし、得られた培養上清を SDS- PAGEに供し、ニトロセ ルロース膜へ transferした。その膜に Anti- hDK mAb, Anti-mDK mAbを反応させて immunoblotを行つた。
結果を図 9右 (マウス)及び図 9左（ヒト）に示す CBBでは培養上清中の多くの蛋白質 が染色された力 immunoblotでは 80kDa付近に特異的にバンドが検出され、 Anti- hDK mAb, Anti-mDK mAbはそれぞれ、 dermokine- β /- β A Cを特異的に認 識した。 [0154] [Dermokineの ELISA]
ELISA用 96穴マイクロプレート（Nunc社製）の各ゥエルに PBSで希釈した 2 μ g/mlの 抗ラット IgGポリクローナル抗体を 50 1カ卩え、 37°Cで 1時間インキュベートし、マイクロ プレートに吸着させた。ポリクローナル抗体溶液を除き、次いで各ゥエルにブロッキン グ試薬 (Block-Ace,大日本製薬株式会社製)を 100 μ 1加えて、室温で 1時間インキュ ペートし抗体が結合していない部分をブロックした。各ゥエルを、 0.02% Tween20を含 有するリン酸緩衝液（0.02% T-PBS)で 1回洗浄し、作製した Anti-hDK mAb及び Anti-mDK mAb (ノヽイブリドーマ無血清培養上清）を 50 μ 1加え、室温で 1時間インキュ ペートした。各ゥエルの溶液を捨て、 0.02% T-PBSで 3回洗浄して抗体を固相化した。 次に各ゥエルに 65°C、 10分処理を行い、 PBSで希釈した、 6.25— 50 nMのヒト /マウス dermokine- β— SEAP(His)もしくはヒト /マウス dermokine— β A C— SEAP(His) 50 μ 1を
6 6 加え、室温で 1時間インキュベートした。マイクロプレートを 0.02% T-PBSで 5回洗浄し て、 AURORA AP Chemiluminescent Reporter Gene Assay Kit (ICN)を用いて、固相 化抗体に結合したヒト /マウス dermokine- β - SEAP(His)もしくは dermokine- β A
6
C-SEAP(His)のアルカリフォスファターゼ活性を検出した。反応液は 1420 ARVOマ
6
ルチラベルカウンター、 Wallacl420 Managerにて 460nmで測定した。
図 10A (マウス）及び図 10B (ヒト）に、 dermokine- β - SEAP(His) (-參-)もしくは
6
dermokine- β A C-SEAP(His) (-〇-)を結合させた結果を示した。固相化した
6
Anti-hDK mAb, Anti-mDK mAbは供に濃度依存的に dermokine- j8に結合した。な お、 SEAPのみの recombinant蛋白質は殆ど固相化した抗体には結合しなかった。
[0155] [組換えヒト dermokine— j8 /demokine— j8 A Cの精製]
pcDNA3.1 -human dermokine- β、 pcDNA3.1 -human dermokine- β A Cを 293/EBNA- 1細胞に transfectionし、得られた培養上清（培地： Opti- MEM I; GIBCO) に NaClを終濃度 0.5 Mとなるように加え、 0.5 M NaClを含む 20 mM HEPES (pH 7.5) 緩衝液で平衡化した Lentyl Lectin Sepharose 4B (アマシャム'バイオサイエンス社製 )ビーズに通してタンパク質を吸着させた。その後 1 M NaClを含む 20 mM Tris- HC1 ( pH 7.5)で非特異的吸着タンパク質を洗浄した後、 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)でさら に洗浄し、 1 Mメチル- a -D-マンノピラノシド（ a -MM)、 0.6% CHAPSを含む 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)で結合タンパク質を溶出した。次に、この溶出液を 0.6% CHAPSを 含む 20 mM Tris- HCl (pH 7.5)で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーである HiTrap Q HPカラム（アマシャム'バイオサイエンス社製）に供し、同緩衝液で洗浄後 、 0— 0.2 M NaClの濃度勾配で溶出した。カラム操作は、 AKTAexplorerlOSシステム（ P- 903ポンプ、 UV- 900モニター、 pH/C- 900モニター、 Frac- 901フラクションコレクタ 一；アマシャム ·バイオサイエンス社製）を用 、て 4°Cにて行つた。各フラクション中のタ ンパク質を 15%のアクリルアミドゲルで SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（
SDS-PAGE)を行い分離した。電気泳動後のゲルは、硝酸銀による染色 (2D-銀染色 試薬 · Π「第一」キット；第一科学薬品社製)でタンパク質バンドを明視化した。また-ト ロセルロース膜に転写したタンパク質バンドに対し Anti-hDK mAbを反応させて (ィム ノブロット)、フラクション 11一 23にヒト dermokine- j8及びヒト dermokine- j8 A Cの溶出を 確認した。
各段階（培養上清： CM、 Lentyl Lectin Sepharose 4B : Lentyl Lectin, HiTrap Q HP カラム： Q)の銀染色像と、 Anti-hDK mAbによる immunoblot像を示した（図 11)。
dermokine- j8は doubletのバンドが検出されたが（図 11左）、 demokine- j8 A C (図 11 右）は singleバンドで検出された。
産業上の利用可能性
本発明により、 SSCが、多層化された上皮において発現され、かつ分化特異的様式 で誘導されることが示された。したがって、 SSCが上皮ケラチノサイトの分ィ匕および Z または増殖に関与することが考えられる。 dermokineノックアウトマウスの作出により、 SSCの正確な生理的役割を検討することができる。加えてこの遺伝子は、皮膚および 他の多層化された上皮の疾患の特徴決定における新規マーカーとして利用され得る

Claims

請求の範囲
[1] 下記 (a)— (d)の 、ずれかに記載のポリヌクレオチド。
(a)配列番号： 2、 4、 6または 8のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なるポリべプチ ドをコードするポリヌクレオチド
(b)配列番号： 1、 3、 5または 7のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むポ リヌタレ才チド
(c)配列番号： 2、 4、 6または 8のいずれかに記載のアミノ酸配列において、 1もしくは 複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列からなるポ リペプチドであって、ケラチノサイトに発現させることにより該ケラチノサイトを重層上皮 細胞へ分ィ匕させる活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(d)配列番号： 1、 3、 5または 7のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAとストリン ジヱントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドであって、ケラチノサイトに発 現させることにより該ケラチノサイトを重層上皮細胞へ分化させる活性を有するポリべ プチドをコードするポリヌクレオチド
[2] ケラチノサイトの分ィ匕または増殖に関与する遺伝子であって、分泌タンパク質をコー ドする請求項 1に記載のポリヌクレオチド。
[3] 請求項 1または 2に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
[4] 請求項 1または 2に記載のポリヌクレオチドが挿入されたベクター。
[5] 請求項 1もしくは 2に記載のポリヌクレオチド、または請求項 4に記載のベクターを保 持する宿主細胞。
[6] 請求項 5に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産生 させたポリペプチドを回収する工程を含む、請求項 3に記載のポリペプチドの製造方 法。
[7] 共通の遺伝子発現調節下にあることを特徴とする遺伝子複合体であって、 ( 1) Kdap遺伝子、 (2) dermokine- 遺 1zS子、 (3) dermokine- β遺 is子、および {4) suprabasin遺伝子の各遺伝子カゝら構成されるケラチノサイトの分ィ匕または増殖に関与 する遺伝子複合体。
[8] 請求項 1または 2に記載のポリヌクレオチドと特異的にノ、イブリダィズするポリヌクレ ォチドであって、少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を持つポリヌクレオチド。
[9] 請求項 1もしくは 2に記載のポリヌクレオチドまたはその一部に対するアンチセンス ポリヌクレオチド。
[10] 請求項 3に記載のポリペプチドに結合する抗体。
[11] dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質を有効成分として含む、ケ ラチノサイト分化誘導剤。
[12] 以下の (a)— (d)からなる群より選択される化合物を含む、ケラチノサイト分ィ匕抑制 剤。
(a) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の転写産物に対するアンチセ ンス核酸
(b) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の転写産物を特異的に開裂 するリボザィム活性を有する核酸
(c) dermokine- a遺伝子もしくは dermokine- β遺伝子の発現を、 RNAi効果による阻 害作用を有する核酸
(d) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質と結合する抗体
[13] 以下の工程 (a)一 (c)を含む、ケラチノサイト分化誘導剤のスクリーニング方法。
(a) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質を発現する細胞と、被検 化合物を接触させる工程
(b)該細胞における dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質の発現 量または活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、前記発現量または活性を上昇させ る化合物を選択する工程
[14] 以下の工程 (a)一 (c)を含む、ケラチノサイト分ィ匕抑制剤のスクリーニング方法。
(a) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質を発現する細胞と、被検 化合物を接触させる工程
(b)該細胞における dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質の発現 量または活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させな!ヽ場合と比較して、前記発現量または活性を低下させ る化合物を選択する工程
[15] 以下の工程 (a)一 (c)を含む、ケラチノサイト分化誘導剤のスクリーニング方法。
(a) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質、またはそれらを発現す る細胞と、ケラチノサイト及び被検化合物を共存させる工程
(b)ケラチノサイトの重層上皮細胞への分ィ匕を測定する工程
(c)被検化合物を共存させな!/、場合と比較して、重層上皮細胞への分化を上昇させ る化合物を選択する工程
[16] 以下の工程 (a)一 (c)を含む、ケラチノサイト分ィ匕抑制剤のスクリーニング方法。
(a) dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質、またはそれらを発現す る細胞と、ケラチノサイト及び被検化合物を共存させる工程
(b)ケラチノサイトの重層上皮細胞への分ィ匕を測定する工程
(c)被検化合物を共存させない場合と比較して、重層上皮細胞への分化を低下させ る化合物を選択する工程
[17] 以下の工程 (a)および (b)を含む、被検細胞について、重層上皮から派生した癌細 胞か否かを検査する方法。
(a)被検細胞について、 dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質の 発現量または活性を測定する工程
(b)対照と比較して、前記発現量または活性が変化している場合に、被検細胞は重 層上皮から派生した癌細胞であるものと判定する工程
[18] 以下の工程 (a)および (b)を含む、被検者につ!、て、扁平上皮癌または基底細胞 癌の診断方法。
(a)被検者カも調製された細胞試料について、請求項 17に記載の方法により、重層 上皮から派生した癌細胞力否かを判定する工程、
(b)前記工程により、重層上皮力 派生した癌細胞であるものと判定された場合に、 被検者は、扁平上皮癌または基底細胞癌に罹患して 、るものと判定する工程
[19] 以下の工程 (a)および (b)を含む、被検者につ!、て、皮膚疾患の診断方法。
(a)被検者から調製された被検試料にっ 、て、 dermokine- aタンパク質もしくは dermokine- βタンパク質の発現量または活性を測定する工程 (b)対照と比較して、前記発現量または活性が変化している場合に、被検者は皮膚 疾患に罹患して！、るものと判定する工程
皮膚疾患が乾皮症、乾癬、または魚鱗癬である、請求項 19に記載の診断方法。
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