JP2022532092A - 再灌流傷害の処置のためのbnip3ペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、BNIP3、BAXおよびミトコンドリアの個々の活性および経路間コミュニケーションを阻害することができるペプチドを提供する。本ペプチドは、細胞損傷および細胞死を予防することが望ましい対象における疾患または状態を処置する方法において使用することができる。本発明は、モノマーとしてならびにそれらのホモオリゴマーおよびヘテロオリゴマーとしてのBNIP3およびBAXに結合するペプチドを提供し、これは、BNIP3およびBAXの個々の活性およびオリゴマー活性を回避することにより幅広い連続的な活性を示す。心臓および脳組織ならびにヒト人工多能性幹細胞由来のヒト心室心筋細胞を再灌流傷害から保護することによって証明されるように、有効性は器官または種に制約されない。心筋梗塞サイズもブタにおいて著しく減少した。
Description
本発明は、再灌流傷害の処置に関する。特に、本発明は、ミトコンドリアにおけるBNIP3およびBAXの活性を低下させることによって細胞損傷および細胞死を予防するBNIP3由来ペプチドを提供する。
血管の閉塞は、組織の一部への血液の停止を引き起こし、これは特に、不十分な酸素供給、栄養素の利用可能性の低下および代謝老廃物の不十分な除去をもたらして、細胞を著しく破壊し、その後、細胞を死滅させる。急性の閉塞は予測可能でも回避可能でもないが、血管開存性の回復は実現可能であり、患者の転帰のために不可欠である1。適時の再灌流レジメンは推奨される治療であるが、血液および特にO2供給の急速な回復は、組織に現在のところ利用可能な処置は存在しない傷害を与える。再灌流の初期段階は、高酸素状態、活性酸素種の急激な発生およびアシドーシスを伴わないカルシウムレベルの増加をもたらす高レベルの酸素を特徴とする。再灌流傷害の病態は、心臓、脳、肝臓および腎臓において認知されており、冬眠心筋、急性心不全、脳機能障害、胃腸機能障害、腎機能障害、全身性炎症反応症候群および多臓器機能障害症候群を含む重篤な臨床所見に関連している。したがって、再灌流傷害は、重要な治療上の課題を提起する重大な医学的状態である。心筋梗塞(MI)は突然の時間的に予測不可能な事象であり、ここで、再灌流が生存のために不可欠であるが、これが最終的な梗塞サイズの最大50%を決定する2。この運命は、移植された臓器にも当てはまる。MIは心不全症例の最も一般的な原因であり、したがって、再灌流傷害を軽減するための治療的介入は、生存能力のある心筋を救済し、MIサイズを制限し、心機能を保存し、心不全の発生率に影響を与える機会を提供する3。再灌流によって誘発される梗塞の進行においては、2つの形態の細胞死、すなわちネクローシスおよびアポトーシスが本質的な役割を果たす。ネクローシス性の心筋細胞死は、初期の梗塞領域中で主に観察され得る。ネクローシスは、炎症、マトリックスリモデリングおよびその後の線維症などの下流の組織応答を誘導する4。アポトーシスは、梗塞領域および梗塞周囲領域中で起こり、初期の梗塞後リモデリングの主たる要素である5。
がん患者にとっては、心臓損傷も重大な問題である。スクリーニングおよび処置戦略の進歩により、がん生存者の集団は過去30年間にわたって着実に増大した。5年全生存率は、10年間の追跡調査で50~70%に改善した。その結果、がん治療の副作用、特に心血管毒性の有病率が増加している。従来の化学療法(例えば、アントラサイクリン)は、左室駆出率(LVEF)の無症候性および症候性の低下、心筋症および心不全(HF)の原因であると広く認識されてきた、多くのがんに対して一般的に使用されている治療である。がんによって媒介される心筋症は、典型的には不可逆的である、活性酸素種(ROS)によって媒介されるLV収縮機能の用量依存的な減少を特徴とする。現在のところ、アントラサイクリン化学療法またはその他のがん治療を受けている患者における心毒性副作用(例えば、心機能の低下、心筋症など)を効果的に低減するための予防的アプローチも治療法も存在しない。この医学的な要望に取り組むことを目標にしたいくつかの研究は、不完全な結果/利益を得るに留まった。CECCY試験は、乳がん患者におけるカルベジオールの利益を示すことはできなかったが、トロポニンの低下による保護は示された6。PRADA試験は、カンデサルタンおよびメトプロロールの評価を行い、心筋症の予防に対するカンデサルタンの有意な利益を明らかにしたが、心毒性の現行の定義によれば本試験は十分な検出力がなかった7。MANTICORE試験の初期の結果は、左心室の直径の変化であった。β遮断薬もACE阻害薬もこの転帰尺度に対して有意な影響を有さなかったが、二次的転帰としての心不全を有意に予防した8。まとめると、既存の文献は心不全療法の潜在的な利益を示しているが、現在のところ、がん患者における心毒性の予防における現在のガイドラインによって規定される最先端の心不全治療の価値を綿密に評価した研究は存在しない。
ミトコンドリアは、ネクローシス性シグナル伝達およびアポトーシス性シグナル伝達の両方の中心を成す9。これらには、電子伝達、酸化的リン酸化およびATP合成の破壊、DNA断片化、タンパク質および脂質の損傷、ならびにROSの過剰な生成が含まれる。
ミトコンドリアにおけるネクローシスの決定的事象は、ミトコンドリア内膜(MIM)内の孔、いわゆるミトコンドリア膜透過性遷移孔(mPTP)の開口である。これは、エネルギー崩壊およびミトコンドリア内への浸透圧調節物質の流入と溶質との迅速な交換をもたらす。その後のマトリックスの膨潤は、ミトコンドリア外膜の破裂、細胞膨潤および細胞破壊をもたらす10。Ca2+などのネクローシス性刺激は、mPTPの開口を誘発することが示唆されており、ROSによって増強され得る10。広範な調査にもかかわらず、トランスジェニック動物研究では、アデニンヌクレオチドトランスロカーゼ11、電位依存性アニオンチャネル12、ミトコンドリアリン酸キャリアー13(SLC25A3)およびシクロフィリンD14を含むいくつかの推定成分を除き、mPTPの成分は不明のままである。ごく最近では、ATPシンターゼのc-サブユニットが内膜に孔を形成することが示唆されている15、16。シクロスポリンAなどの薬理学的阻害剤を使用したmPTP開口の防止は、I/R傷害の前臨床モデルにおいて梗塞サイズを減少させることが報告されている17、18。より大規模な臨床試験では、その効果は中立的であった19。ミトコンドリアを標的とするペプチドであるエラミプレチド(以前は、ベンダビアまたはMTP-131と呼ばれていた)およびミトコンドリアを標的とする薬物であるTRO40303は、再灌流の開始時に投与すると、ミトコンドリア由来のROSの産生を減弱させることによって梗塞サイズを減少させることが動物研究で実証されている20~22。しかしながら、STEMI患者研究では、PPCIの前に投与された静脈内エラミプレチド20およびTRO40303のいずれも、梗塞サイズを減少させることができなかった23。特に、プラセボ群と比較した場合、TRO40303を服用した患者ではより多くの有害事象が報告され、それにより、この治療的アプローチの臨床適用が制限された。Na+/H+交換阻害剤24、スーパーオキシドジスムターゼなどの抗酸化物質25および様々な抗好中球抗体26、27も同様に効果がないようであった。
梗塞領域および梗塞周囲領域中で起こるアポトーシス性細胞死は、シトクロムc、アポトーシス誘導因子、SMAC/DIABLO(Second Mitochondria-derived Activator of Caspases/Direct IAP Binding Protein with Low PI)およびエンドヌクレアーゼGなどのアポトーシス促進性タンパク質の膜間腔から細胞質ゾル中への放出を可能にするミトコンドリア外膜(MOM)透過化によって開始され、カスパーゼおよびDNA断片化を介した細胞死カスケードの開始をもたらす28~30。
死促進性(pro-death)BCL-2タンパク質であるBNIP3(BCL-2アデノウイルスE1B 19kDa相互作用タンパク質-3)およびBAX(BCL-2関連Xタンパク質)はMOM透過化を誘導し、MOM中へ転位してヘテロ二量体を形成することでミトコンドリアのアポトーシスを媒介する、代表的な媒介物質および下流エフェクターである31~35。さらに、BNIP3およびBAXはMIMの擾乱を制御し、それによってネクローシスの重要な活性化因子として機能する5、36。
本発明は、BNIP3およびBAX相互作用活性の阻害剤を提供することによって、中心的な梗塞領域中の急性傷害およびすぐ近傍の領域中のその後の細胞死のいずれもを最適に改善することの必要性に対処し、ここで、心臓、脳、肝臓および腎臓における再灌流傷害、および他の適応症(ミトコンドリアの擾乱が、例えば、心不全、臓器移植、心停止または外科的および薬理学的介入に起因する細胞損傷および細胞死、ならびに脳卒中、がんおよびがん治療によって誘発される心臓損傷などを引き起こす)を処置するために、個々としてまたは3つの組としてBNIP3、BAXおよびミトコンドリア間での経路内および経路間コミュニケーションが妨げられる。。
本発明は、モノマーとしてならびにそれらのホモオリゴマーおよびヘテロオリゴマーとしてのBNIP3およびBAXに結合するペプチドを提供し、これは、BNIP3およびBAXの個々の活性およびオリゴマー活性を回避することにより幅広い連続的な活性を示す。心臓および脳組織ならびにヒト人工多能性幹細胞由来のヒト心室心筋細胞を再灌流傷害から保護することによって証明されるように、有効性は器官または種に制約されない。心筋梗塞サイズもブタにおいて著しく減少した。
ペプチドはBNIP3のN末端部分に由来し、BNIP3のアミノ酸13~20からなる8アミノ酸区間が最も活性であることが証明された。このような短いペプチドがBNIP3およびBAX活性を阻害し、これらのタンパク質のホモオリゴマー化およびヘテロオリゴマー化の形成を遮断し、細胞内でのこれらのホモオリゴマーおよびヘテロオリゴマーの立体構造変化を誘導することができたことは非常に驚くべきことであった。ペプチド配列中のある特定の変異は、その有効性をさらに高めた。
これらの結果に照らして、本発明は、第1の態様において、
(i)細胞取り込みシグナルと、
(ii)BNIP3の13~20位を含むBNIP3断片またはこれに由来するアミノ酸配列と、
を含む、ペプチドを提供する。
(i)細胞取り込みシグナルと、
(ii)BNIP3の13~20位を含むBNIP3断片またはこれに由来するアミノ酸配列と、
を含む、ペプチドを提供する。
ペプチドは特に、50、特に40アミノ酸またはそれ未満の長さを有する。
第2の態様において、本発明は、第1の態様によるペプチドを含む医薬組成物、ならびに再灌流関連および/またはミトコンドリア関連障害およびがん治療誘発性心毒性の処置およびこれらの予防におけるその使用を提供する。
第3の態様において、本発明は、細胞損傷または細胞死を予防するための方法であって、前記細胞を第1の態様によるペプチドと接触させることを含む、方法を提供する。
さらに、本発明は、第4の態様において、再灌流傷害および/またはミトコンドリア関連障害および/またはがん治療誘発性心毒性の予防に適した化合物をスクリーニングする方法であって、
(i)1またはそれを超える候補化合物を提供することと、
(ii)前記候補化合物のBNIP3とBAXの結合に干渉する能力を決定することと、
(iii)BNIP3とBAXの結合に干渉する候補化合物を選択することと、
を含む、方法を対象とする。
(i)1またはそれを超える候補化合物を提供することと、
(ii)前記候補化合物のBNIP3とBAXの結合に干渉する能力を決定することと、
(iii)BNIP3とBAXの結合に干渉する候補化合物を選択することと、
を含む、方法を対象とする。
本発明の他の目的、特徴、利点および態様は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかになるであろう。しかしながら、本出願の好ましい実施形態を示す以下の説明、添付の特許請求の範囲および具体例は、例示としてのみ与えられることを理解されたい。開示された発明の趣旨および範囲内での様々な変更および修正は、以下を読むことによって当業者に容易に明らかになるであろう。
本発明は、細胞損傷および細胞死を防ぐために、BCL-2アデノウイルスE1B 19kDa相互作用タンパク質-3(BNIP3)、BCL-2関連Xタンパク質(BAX)およびミトコンドリアの個々の活性および経路間コミュニケーションを阻害することが望ましい、対象中の疾患または状態を処置する方法、化合物および組成物を提供する。
一態様において、本発明は、細胞損傷および細胞死カスケードを活性化するBNIP3、BAXおよびミトコンドリアの三者を阻害するペプチドである。本発明のペプチドは、細胞取り込みシグナルと、BNIP3の13~20位を含むBNIP3断片またはこれに由来するアミノ酸配列と、を含み、特に、50アミノ酸、特に40アミノ酸またはそれ未満の長さを有する。
BNIP3断片
BNIP3断片
本発明によるペプチド内のBNIP3断片は、特に、BAXおよび/またはBNIP3に結合することができる。特に、BNIP3断片は、BAXのアミノ酸108~164の領域などのBAXのBNIP3結合領域に結合することができる。BNIP3断片は、特に、BNIP3とBAXとの相互作用に干渉または阻害することができる。
ある特定の実施形態において、BNIP3断片は、20アミノ酸またはそれ未満の長さを有する。特に、BNIP3断片は、15アミノ酸もしくはそれ未満、または10アミノ酸もしくはそれ未満の長さを有する。特定の実施形態において、BNIP3断片は、8アミノ酸の長さを有する。
具体的な実施形態において、BNIP3断片は、BNIP3タンパク質のアミノ酸配列を有する。本明細書で使用される「BNIP3」という用語は、特に、配列番号1のアミノ酸配列を有するマウスBCL-2アデノウイルスE1B 19kDa相互作用タンパク質-3を指す。したがって、BNIP3断片は、アミノ酸位置13~20の配列を含む、配列番号1のアミノ酸配列の連続する部分と同一であるアミノ酸配列を有し得る。例えば、BNIP3断片は、配列番号1の1~20位のアミノ酸配列を有し得る。ある特定の実施形態において、BNIP3断片は、配列番号1の4~20位、配列番号1の11~20位、配列番号1の12~20位および配列番号1の13~20位からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。具体的な実施形態において、BNIP3断片は、配列番号1の13~20位のアミノ酸配列からなる。これらの実施形態において、BNIP3断片は、特に、さらなるアミノ酸残基を一切含まない。マウスBNIP3の13~20位のアミノ酸配列は、ヒトBNIP3(配列番号2)の73~80位のアミノ酸配列と同一である。本明細書で言及されるマウスBNIP3のアミノ酸配列の代わりに、ヒトBNIP3の対応するアミノ酸配列も使用することができる。
さらなる実施形態において、BNIP3断片は、BNIP3に由来するアミノ酸配列を有する。標的アミノ酸配列が、その全長にわたって、参照アミノ酸配列の対応する部分と、少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%の相同性または同一性を共有する場合に、標的アミノ酸配列は、参照アミノ酸配列に「由来」し、または参照アミノ酸配列に「対応」する。特定の実施形態において、参照アミノ酸配列に「由来」する、または参照アミノ酸配列に「対応」する標的アミノ酸配列は、その全長にわたって、参照アミノ酸配列の対応する部分と100%相同である、または特に100%同一である。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「相同性」または「同一性」は、好ましくは、本発明によれば、参照配列の全長にわたって、または相同性もしくは同一性が定義される配列に対応する参照配列の対応する部分の全長にわたって決定される。特に、BNIP3断片は、上記のBNIP3断片の1つに由来し得る。例えば、BNIP3断片は、配列番号1の1~20位、配列番号1の4~20位、配列番号1の11~20位、配列番号1の12~20位および配列番号1の13~20位からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%同一、特に少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を有し得る。具体的な実施形態において、BNIP3断片は、配列番号1の13~20位と少なくとも60%同一であるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、BNIP3断片は、BNIP3の13~20位と比較して1、2または3個のアミノ酸置換を必要に応じて含むBNIP3の13~20位を含む。BNIP3は、特に配列番号1のアミノ酸配列を有する。これらの実施形態において、1、2または3個のアミノ酸置換は、好ましくは、BNIP3の13、15、17、18、19および20位、特にBNIP3の15、17および19位に対応する位置の1またはそれより多くに存在する。特に、アミノ酸置換は、
(i)BNIP3の15位のグルタミン酸のフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、チロシン、システイン、ヒスチジン、アルギニンまたはトレオニンへの置換、
(ii)BNIP3の17位のヒスチジンのバリンへの置換、および
(iii)BNIP3の19位のセリンのチロシン、システイン、フェニルアラニンまたはヒスチジンへの置換、
からなる群から選択される。
(i)BNIP3の15位のグルタミン酸のフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、チロシン、システイン、ヒスチジン、アルギニンまたはトレオニンへの置換、
(ii)BNIP3の17位のヒスチジンのバリンへの置換、および
(iii)BNIP3の19位のセリンのチロシン、システイン、フェニルアラニンまたはヒスチジンへの置換、
からなる群から選択される。
特定の実施形態において、BNIP3断片は、BNIP3の13~20位と比較して1または2個のアミノ酸置換を含むBNIP3の13~20位を含み、アミノ酸置換は、
(i)BNIP3の15位のグルタミン酸のヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリンまたはチロシンへの置換、および
(ii)BNIP3の19位のセリンのチロシン、システインまたはフェニルアラニンへの置換、
からなる群から選択される。
(i)BNIP3の15位のグルタミン酸のヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリンまたはチロシンへの置換、および
(ii)BNIP3の19位のセリンのチロシン、システインまたはフェニルアラニンへの置換、
からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、BNIP3の19位のセリンは、チロシン、システインまたはフェニルアラニン、特にフェニルアラニンに置換されている。
具体的な実施形態において、BNIP3断片は、配列番号3~17からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、または配列番号3~17からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。特別な実施形態において、BNIP3断片は、配列番号7または8、特に8のアミノ酸配列からなる。
BNIP3断片は、BNIP3に由来するさらなるアミノ酸残基を必要に応じて含み得る。特に、BNIP3断片全体は、BNIP3の連続するアミノ酸配列に由来する。特に、BNIP3断片全体は、BNIP3のアミノ酸位置1~20、またはBNIP3の少なくとも13~20位を含むその一部に由来する。BNIP3断片は、BNIP3の対応する部分と同一のアミノ酸配列を有し得る、または1~8個のアミノ酸置換、特に1~6個のアミノ酸置換を有し得る。BNIP3断片は、例えば、BNIP3の12~20位と比較して1、2、3もしくは4個のアミノ酸置換を必要に応じて含むBNIP3の12~20位を含み得るか、またはBNIP3断片は、BNIP3の4~20位と比較して1、2、3、4、5もしくは6個のアミノ酸置換を必要に応じて含むBNIP3の4~20位を含み得るか、またはBNIP3断片は、BNIP3の1~20位と比較して1、2、3、4、5もしくは6個のアミノ酸置換を必要に応じて含むBNIP3の1~20位を含み得る。特に、これらのアミノ酸置換の1、2または3つは13~20位にあり、残りのアミノ酸置換は1~12位にある。これらの実施形態において、アミノ酸置換は、好ましくは、BNIP3の4、11、12、13、15、17、18、19および20位、特にBNIP3の4、11、12、15、17および19位に対応する位置の1またはそれより多くに存在する。
具体的な実施形態において、BNIP3断片は、配列番号18~30および70~75からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
置換されたアミノ酸残基は、特に、別の天然に存在するアミノ酸残基に置換される。本明細書で使用される「置換」という語句は、そのようなポリペプチドが必要な活性を発揮することを条件として、誘導体化されていない残基に代えて化学的に誘導体化された残基を使用することも含む。本明細書で使用される「誘導体」という用語は、官能性側鎖の反応によって化学的に誘導体化された1またはそれを超える残基を有するペプチドを指す。このような誘導体化された分子としては、例えば、アミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するように、遊離のアミノ基が誘導体化されている分子が挙げられる。遊離のカルボキシル基は、塩、メチルおよびエチルエステルもしくはその他の種類のエステルまたはヒドラジドを形成するように誘導体化され得る。遊離のヒドロキシル基は、O-アシルまたはO-アルキル誘導体を形成するように誘導体化され得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、N-im-ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化され得る。20個の標準アミノ酸の1またはそれを超える天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドも誘導体として含まれる。例えば、プロリンを4-ヒドロキシプロリンに置換し得る;リジンを5ヒドロキシリジンに置換し得る;ヒスチジンを3-メチルヒスチジンに置換し得る;セリンをホモセリンに置換し得る;リジンをオルニチンに置換し得る。
いくつかの実施形態において、「置換」という用語は、2またはそれを超える置換されたアミノ酸残基の連結を含む。特に、2またはそれを超えるアミノ酸残基は、架橋可能な部分で置換され得および/または連結され得、それぞれは、置換された、必要に応じてヘテロ-低級アルキル、特に必要に応じて置換された、必要に応じてヘテロ-メチル、エチル、プロピルおよびブチルから選択される追加のα-炭素置換を必要に応じて含む。さらに、2つの置換されたアミノ酸残基は、環および尾部環状ペプチドを生成するために、ジスルフィド架橋を介して接続されたホモシステインで置換され得る。あるいは、2またはそれを超える置換されたアミノ酸残基は、リンカーによって置き換えられ得る。この点における適切なリンカーとしては、例えば、ラクタムペプチドを形成する-(CH2)nONHCOX(CH2)m-(式中、XはCH2、NHまたはOであり、mおよびnは整数1~4である);エーテルペプチドを形成する-CH2OCH2CHCHCH2OCH2-;またはステープルドペプチドを形成する-(CH2)nCHCH(CH2)m-が挙げられる。
ある特定の実施形態において、BNIP3断片は、BNIP3の配列に関して置換E15Y、S19FおよびS19Yの少なくとも1つを含む。
細胞取り込みシグナル
細胞取り込みシグナル
本発明によるペプチド内の細胞取り込みシグナルは、特に、標的細胞中へのペプチドの取り込みを媒介することができる。特に、細胞取り込みシグナルは、哺乳動物細胞、特にヒト細胞中への取り込みを媒介することができる。
ある特定の実施形態において、細胞取り込みシグナルはペプチドである。特に、細胞取り込みシグナルは、細胞透過性ペプチドまたはタンパク質形質導入ドメインである。細胞取り込みシグナルは、5~30アミノ酸、特に8~20アミノ酸または10~16アミノ酸の長さを有し得る。
細胞取り込みシグナルは、例えば、親水性ペプチドまたは両親媒性ペプチドであり得る。細胞取り込みシグナルの例としては、HIVのTATタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン(特に、アミノ酸残基48~59)、ペネトラチン、アンテナペディアPTD、SynB1、SynB3、PTD-4、PTD-5、FHVコート-(35~49)、BMV Gag-(7~25)、HTLV-II Rex-(4~16)、D-Tat、R9-Tat、トランスポータン、MAP、SBP、FBP、MPG、MPG(ΔNLS)、Pep-1、Pep-2、ポリアルギニンおよびポリリジンが挙げられる。ある特定の実施形態において、細胞取り込みシグナルは、配列番号31~50からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドである。
細胞取り込みシグナルは、天然に存在するアミノ酸残基から構成され得、必要に応じて、本明細書に記載の化学的に誘導体化されたアミノ酸残基を含むペプチド誘導体であり得る。さらに、細胞取り込みシグナルはペプチド模倣物であり得、またはD-レトロ-インベルソ配列を含み得る。ある特定の実施形態において、細胞取り込みシグナルは、本明細書に開示される細胞透過性ペプチドのD-レトロ-インベルソ配列を含む。
ペプチド
ペプチド
本発明によるペプチドは、細胞取り込みシグナルとBNIP3断片とを含む。本明細書で使用される「含む(comprise)」という表現は、その字義通りの意味に加えて、「から本質的になる(consist essentially of)」および「からなる(consist of)」という表現も含み、これらの表現を具体的に指す。したがって、「含む」という表現は、具体的に列挙された要素を「含む」主題がさらなる要素を包含し得るおよび/または実際に包含する実施形態のみならず、具体的に列挙された要素を「含む」主題がさらなる要素を含まない実施形態も指す。同様に、「有する(have)」という表現は、「含む」という表現として理解されるべきであり、「から本質的になる」および「からなる」という表現も含み、これらの表現を具体的に指す。「から本質的になる」という用語は、可能な場合には、特に、主題がその要素から本質的になる具体的に列挙された要素に加えて、主題が20%もしくはそれ未満、特に15%もしくはそれ未満、10%もしくはそれ未満または特に5%もしくはそれ未満のさらなる要素を含む実施形態を指す。
ある特定の実施形態において、本発明によるペプチドは、細胞取り込みシグナルとBNIP3断片からなる。
さらなる実施形態において、本発明によるペプチドは、細胞取り込みシグナルと、BNIP3断片と、細胞取り込みシグナルとBNIP3断片との間のリンカーとを含む。特に、本発明によるペプチドは、細胞取り込みシグナルと、BNIP3断片と、細胞取り込みシグナルとBNIP3断片との間のリンカーと、からなる。リンカーは、アミノ酸から構成されるペプチドリンカーまたは化学的リンカーであり得る。リンカーは、特に、小さなサイズを有する。例えば、リンカーは、10個もしくはそれ未満のアミノ酸、例えば8個もしくはそれ未満、6個もしくはそれ未満または5個もしくはそれ未満のアミノ酸を有するペプチドリンカーである。化学的リンカーは、例えば、1,500Daもしくはそれ未満、例えば1,000Daもしくはそれ未満、750Daもしくはそれ未満または500Daもしくはそれ未満の分子量を有する。細胞取り込みシグナルがペプチド部分である実施形態において、リンカーは、好ましくはペプチドリンカーである。
ある特定の実施形態において、本発明によるペプチドは、40アミノ酸またはそれ未満の長さを有する。具体的な実施形態において、本発明によるペプチドは、35アミノ酸またはそれ未満、特に30アミノ酸またはそれ未満の長さを有する。本発明によるペプチドは、例えば、25アミノ酸またはそれ未満、例えば約20アミノ酸の長さを有し得る。より短いペプチドは、より容易に製造し、製剤化し、取り扱うことができるので、特に望ましい。したがって、本発明によるペプチドは、好ましくは、35アミノ酸またはそれ未満、特に25アミノ酸またはそれ未満の長さを有する。これは、特に、細胞取り込みシグナルがペプチド部分である実施形態を指す。具体的な実施形態において、本発明によるペプチドは、10,000Daもしくはそれ未満、特に5,000Daもしくはそれ未満、4,000Daもしくはそれ未満または3,000Daもしくはそれ未満の分子量を有する。
ある特定の実施形態において、本発明によるペプチドは、配列番号51~67からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
一般に、本発明によるペプチドは、天然に存在するL-アミノ酸から構成される。ある特定の実施形態において、ペプチドは、人工のアミノ酸も含み得る。例えば、ペプチドは、1またはそれを超える、D-アミノ酸、E-β-ホモアミノ酸および/もしくはN-メチル化されたアミノ酸を含み得る、またはこれらから構成され得る。ある特定の実施形態において、細胞取り込みシグナルおよび/またはBNIP3断片は、D-レトロ-インベルソ配列、特に本明細書に記載されているアミノ酸配列のD-レトロ-インベルソ配列である。例えば、ペプチドは、QPRRRQRRKKRG-NSFHLEVWSGQLNEEGSQSM(配列番号68)またはQPRRRQRRKKRG-NSFHLEVW(配列番号69)のD-レトロ-インベルソ配列を有する。
ある特定の実施形態において、ペプチドは、アセチル化、アシル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、硫酸化、ニトロソ化、グリコシル化、スオミル化(suomylated)、ヒドロキシル化、アルキル化および/または異性化される。例えば、ペプチドは、N末端の、アセチル、ホルミル、ミリストル、パルミトイル、カルボキシルもしくは2-フロシル基、および/またはC末端の、ヒドロキシル、アミド、エステルもしくはチオエステル基を含み得る。さらに、ペプチドは環化され得る。
具体的な実施形態において、本発明によるペプチドは、本明細書に記載されているペプチドのいずれかのペプチド模倣物である。本明細書で使用される「ペプチド模倣物」という用語は、分子間の相互作用においてペプチドの代替物として機能する構造物を指す。ペプチド模倣物には、アミノ酸および/またはペプチド結合を含んでもよくまたは含まなくてもよいが、BNIP3ペプチドの構造的および機能的特徴を保持する合成構造物が含まれる。ペプチド模倣物には、他の機能的要素を有するより大きな分子中にペプチドを組み込む分子、ペプトイド、オリゴペプトイド、および本発明のペプチドに対応するアミノ酸のすべての可能な配列を表す設計された長さのペプチドを含有するペプチドライブラリも含まれる。これらのペプチドのすべておよびこれらのペプチドと実質的に相同な、相補的な、またはその他機能的にもしくは構造的に等価な分子が、本発明のために使用され得る。
ある特定の実施形態において、本発明によるペプチドは、ナノ粒子をさらに含む組成物中に存在する。特に、ペプチドはナノ粒子内に存在する。ナノ粒子は、ペプチドを被包するのに適した任意のナノ粒子であり得る。例示的なナノ粒子としては、リポソーム、ナノエマルジョン、固液ナノ粒子、ナノ構造化された脂質担体、ポリマーナノ粒子およびデンドリマーが挙げられる。ある特定の実施形態において、ナノ粒子は、本発明のペプチドを所望の細胞または組織に標的化することを可能にする、ペプチド、リガンドまたは抗体などの標的化分子をナノ粒子の外面上に含む。
具体的な実施形態において、ナノ粒子は、標的細胞中への本発明によるペプチドの取り込みを可能にする。これらの実施形態において、ナノ粒子は、細胞取り込みシグナルの役割を果たし、特に細胞取り込みシグナルであり得る、または細胞取り込みシグナルを置き換え得る。したがって、本発明はまた、本明細書で定義されるBNIP3断片を含むナノ粒子も提供する。
ペプチドの治療的使用
ペプチドの治療的使用
本発明は、BNIP3、BAXおよびミトコンドリアの個々の活性および経路間コミュニケーションを阻害することが望ましい、対象中の疾患または状態を処置する方法、化合物および組成物であって、対象中の前記疾患または状態を処置するのに有効な量の前記化合物を前記対象に投与することを含む、方法、化合物および組成物を提供する。
本発明は、本発明によるペプチドを含む医薬組成物も提供する。特に、医薬組成物は、単位投与量、投与可能形態で本発明によるペプチドを含む。本発明はさらに、細胞損傷および細胞死を阻害する方法であって、細胞損傷および細胞死を阻害することを必要とするヒトに有効量の本発明によるペプチドを投与することを含む、方法を提供する。本発明は、医薬における、特に、それぞれ、再灌流関連および/またはミトコンドリア関連障害ならびにがん治療誘発性心毒性の処置およびこれらの予防における、本発明によるペプチドまたは本発明によるペプチドを含む医薬組成物の使用も提供する。
本発明は、あたかもそれぞれの組み合わせが苦労して別々に列挙されているかのように、列挙された特定の実施形態のすべての組み合わせを含む。
本発明は、対象においてBNIP3を阻害する方法であって、BNIP3を、BNIP3を阻害するのに有効な量で、本明細書に開示されるペプチドまたは医薬組成物のいずれかの1またはそれより多くと接触させることを含む、方法も提供する。好ましくは、BNIP3は対象内にあり、1またはそれを超える前記ペプチドまたは組成物は対象に投与される。
本発明は、対象においてBAXを阻害する方法であって、BAXを、BAXを阻害するのに有効な量で、本明細書に開示されるペプチドまたは医薬組成物のいずれかの1またはそれより多くと接触させることを含む、方法も提供する。好ましくは、BAXは対象内にあり、1またはそれを超える前記ペプチドまたは組成物は対象に投与される。
本発明は、対象においてBNIP3/BAXダイマーおよび/またはオリゴマー活性を阻害する方法であって、BNIP3/BAXダイマーおよび/またはオリゴマーを、BNIP3/BAXダイマー/オリゴマー活性を阻害するのに有効な量で、本明細書に開示されるペプチドまたは医薬組成物のいずれかの1またはそれより多くと接触させることを含む、方法も提供する。好ましくは、BNIP3およびBAXは対象内にあり、1またはそれを超える前記ペプチドまたは組成物は対象に投与される。
本発明は、対象中の再灌流関連および/またはミトコンドリア関連障害を処置する方法であって、本発明によるペプチドまたは医薬組成物を治療有効量で対象に投与することを含む、方法も提供する。
本発明は、対象中のミトコンドリア誘発性アポトーシスまたはネクローシスによる組織損傷を処置または予防する方法であって、本発明によるペプチドまたは医薬組成物を治療有効量で対象に投与することを含む、方法も提供する。ペプチドは、細胞死または損傷の発生前、発生中および/または発生後に対象に投与され得る。
ペプチドまたは医薬組成物が投与され、処置されている対象は、例えば、低酸素および/または虚血の細胞;心臓、脳、肝臓、腎臓、腸、四肢の虚血、四肢の血管閉塞;心臓、脳、肝臓および腎臓、腸、四肢の再灌流傷害;心筋梗塞および再灌流傷害;化学療法、放射線療法、標的療法および免疫療法誘発性心毒性;アテローム性動脈硬化症;心不全;心臓、肝臓、腎臓移植;動脈瘤;慢性肺疾患;虚血性心疾患;高血圧;肺高血圧症;塞栓;血栓症;心筋症;脳卒中(stroke);神経変性疾患または障害;免疫学的障害;腎低酸素症;肝炎;肝疾患;腎疾患;小脳変性;臓器移植拒絶、ならびに細胞死および/または組織損傷を伴う疾患または障害からなる群から選択される疾患または状態を有し得る。ある特定の実施形態において、対象は、特に血管閉塞、特に心筋梗塞、虚血性脳卒中、急性腎傷害、外傷、循環停止および臓器移植中の虚血後に、虚血、再灌流および/またはミトコンドリア関連障害を有する。さらなる実施形態において、対象は、がん治療誘発性心毒性、例えば化学療法、放射線療法、免疫療法および/または標的療法によって誘発される心毒性を罹患している。または、対象は、任意の種類のがん治療を受けてもよく、治療は心毒性の予防のために適用され得る。化学療法は、特に、ドキソルビシンによる治療などのアントラサイクリンに基づく化学療法を指す。具体的な実施形態において、対象は、ドキソルビシンを用いた化学療法などのアントラサイクリンに基づく化学療法によって誘発される心毒性を罹患している。
再灌流関連障害は、一般に、再灌流傷害を伴う障害を指し得る。再灌流傷害は、例えば、虚血の期間後に血液供給が組織に戻るときに引き起こされる組織損傷であり、循環の回復は、正常な機能の回復ではなく酸化的ストレスの誘導を介して炎症および酸化的損傷をもたらす。本発明は、したがって、対象中の再灌流傷害を処置する方法であって、本発明によるペプチドまたは医薬組成物を治療有効量で対象に投与することを含む、方法を提供する。
本発明は、対象中の急性心筋梗塞、心筋再灌流傷害または心不全を処置する方法であって、急性心筋梗塞、心筋再灌流傷害または心不全を処置することを必要とする対象中の急性心筋梗塞、心筋再灌流傷害または心不全を処置するのに有効な量で本明細書に開示されるペプチドまたは医薬組成物の1またはそれより多くを対象に投与することを含む方法も提供する。好ましくは、1またはそれを超えるペプチドまたは医薬組成物は、対象において、それぞれBNIP3、BAXまたはBNIP3/BAXダイマー/オリゴマー活性を阻害するのに有効な量で投与される。
ある特定の実施形態において、処置は、再灌流およびミトコンドリア関連傷害の緩和および/または予防を含む。さらなる実施形態において、処置は、がん治療誘発性心毒性の緩和および/または予防を含む。
対象は、例えば哺乳動物であり得、好ましくはヒトである。
本明細書で使用される場合、疾患または障害を「処置している(treating)」または「処置する(treat)」とは、処置されている疾患または障害の徴候または症候を緩和または改善または除去することを意味する。ペプチドまたは組成物が疾患または障害の発症前または発症時に対象に投与される場合、ペプチドまたは組成物は、疾患または障害の重症度を抑制または軽減することができる。例えば、対象へのペプチドまたは組成物の投与は、化学療法、放射線療法、標的療法または免疫療法誘発性心毒性などのがん治療誘発性心毒性の重症度を抑制または軽減することができる。これらの実施形態において、本発明によるペプチドは、がん治療の前、間および/または後に投与することができる。ペプチドの投与は、予防的および/または治療的投与を含むことができる。
本発明のペプチドおよび組成物は、当技術分野で公知の投与経路を使用して対象に投与することができる。投与は、全身的であってもよく、または(of)特定の部位に局在化させてもよい。投与経路には、静脈内、筋肉内、心臓内、髄腔内または皮下注射、経口または直腸投与、および特定の部位への注射が含まれるが、これらに限定されない。
具体的な実施形態において、本発明によるペプチドまたは医薬組成物は、血液供給障害、虚血または血管閉塞の発生中または発生後に、特に血管閉塞によって影響を受けた組織の再灌流の前に、対象に投与される。ある特定の実施形態において、ペプチドまたは医薬組成物は、再灌流前6時間以内、特に再灌流前4時間以内、2時間以内または1時間以内に投与される。具体的な実施形態において、ペプチドまたは医薬組成物は、再灌流前45分以内に、特に30分以内に投与される。
本明細書に記載された様々な要素のすべての組み合わせは、本明細書に別段の指示がない限り、またはその他文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明の範囲内である。
この方法は、有効量の本発明によるペプチドを細胞中で発現させることを含み得、アポトーシス、ネクローシスまたはこれらの組み合わせは、対照細胞と比較して前記細胞において改変される。発現させることは、例えば、ペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞中に導入することを含み得る。細胞は、エクスビボまたはインビボであり得、心臓細胞であり得る。アポトーシス、ネクローシスまたはこれらの組み合わせは、細胞において減少し得る。
本発明は、有効量の、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を、投与を必要とする対象に投与することを含む方法であって、アポトーシス、ネクローシスまたはこれらの組み合わせは、前記対象において増加する、方法を提供する。投与は、心臓組織、脳組織、肝臓組織および腎臓組織へのポリヌクレオチドの送達を含み得る。対象は、急性梗塞、低酸素、虚血、脳卒中、または血管疾患から選択される疾患の徴候を有し得る、またはそのリスクがある。本方法は、疾患の徴候の軽減をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかである任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指し、二本鎖および一本鎖のRNAおよびDNAの両方を含む。ポリヌクレオチドは、天然源から直接得ることができ、または組換え、酵素的もしくは化学的技術を用いて調製することができる。ポリヌクレオチドのトポロジーは、直鎖状または環状であり得る。ポリヌクレオチドは、例えば、発現ベクターもしくはクローニングベクターなどのベクターの一部、または断片であり得る。ポリヌクレオチドは、例えば、コード領域および調節領域などの非コード領域を含む、異なる機能を有するヌクレオチド配列を含み得る。
本明細書中で使用される場合、「遺伝子」とは、mRNAをコードするヌクレオチド配列を指す。遺伝子は、その5’末端に転写開始部位を有し、その3’末端に転写ターミネーターを有する。本明細書中で使用される場合、「標的遺伝子」とは、その発現が本明細書中に記載されるようなポリヌクレオチドによって阻害される特異的遺伝子を指す。本明細書で使用される場合、「標的mRNA」は、標的遺伝子によってコードされるmRNAである。別段の明記がない限り、標的遺伝子は、エクソンの異なる組み合わせの使用によって区別される複数のmRNAをもたらすことができる。このような関連するmRNAは、遺伝子のスプライスバリアントまたは転写物バリアントと呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「コード領域」および「コード配列」という用語は互換的に使用され、ポリペプチドをコードし、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にコードされたポリペプチドを発現するヌクレオチド配列を指す。コード領域の境界は、一般に、その5’末端の翻訳開始コドンおよびその3’末端の翻訳停止コドンによって決定される。「調節配列」は、調節配列が機能的に連結されているコード配列の発現を調節するヌクレオチド配列である。調節配列の非限定的な例としては、プロモーター、エンハンサー、転写開始部位、翻訳開始部位、翻訳停止部位および転写ターミネーターが挙げられる。「機能的に連結された」という用語は、構成要素がその意図された様式で機能することができる関係性にあるような、構成要素の並置を表す。調節配列の適合する条件下でコード領域の発現が達成されるように調節配列が結合されている場合に、調節配列はコード領域に「機能的に連結」されている。
コード領域を含むポリヌクレオチドは、コード領域の片側または両側に隣接する異種ヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される場合、「異種ヌクレオチド」は、野生型細胞中に存在するコード領域に通常、隣接して存在しないヌクレオチドを指す。例えば、野生型微生物中に存在し、ポリペプチドをコードするコード領域には、相同配列が隣接しており、コード領域に隣接する任意の他のヌクレオチド配列は、異種であると考えられる。異種ヌクレオチドの例としては、調節配列が挙げられるが、これに限定されない。典型的には、異種ヌクレオチドは、当業者に周知の標準的な遺伝的および/または組換え方法論の使用によって本発明のポリヌクレオチド中に存在する。本発明のポリヌクレオチドは、適切なベクター中に含まれ得る。本明細書中に記載されるポリヌクレオチドの片側または両側に隣接する異種ヌクレオチドの存在は、ヒトの操作に起因する。
本明細書で使用される「相補物」および「相補的」という用語は、2つの一本鎖ポリヌクレオチドが互いと塩基対形成する能力を指し、ポリヌクレオチドの一方の鎖上のアデニンは、第2のポリヌクレオチドの鎖上のチミンまたはウラシルと塩基対形成し、ポリヌクレオチドの一方の鎖上のシトシンは、第2のポリヌクレオチドの鎖上のグアニンと塩基対形成する。1つのポリヌクレオチド中のヌクレオチド配列が第2のポリヌクレオチド中のヌクレオチド配列と塩基対を形成することができる場合、2つのポリヌクレオチドは互いに相補的である。例えば、5’-ATGCと5’-GCATは相補的である。本明細書で使用される「実質的な相補物」という用語およびその関連語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で指定のポリヌクレオチドに選択的にハイブリッド形成することができるポリヌクレオチドを指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、多数のpH、塩および温度条件下で行うことができる。pHは、6~9、好ましくは6.8~8.5を変動することができる。塩濃度は、0.15Mのナトリウム~0.9Mのナトリウムを変動することができ、イオン強度がナトリウムについて指定されたものと同等である限り、他のカチオンを使用することができる。ハイブリダイゼーション反応の温度は、30℃~80℃、好ましくは45℃~70℃を変動することができる。さらに、室温または室温に近い温度などのより低い温度での特異的ハイブリダイゼーションを促進するために、他の化合物をハイブリダイゼーション反応に添加することができる。温度要件を低下させるために想定される化合物としては、ホルムアミドがある。したがって、ポリヌクレオチドと第2のポリヌクレオチドの間でハイブリダイゼーションが起これば、ポリヌクレオチドは、通例、第2のポリヌクレオチドに対して実質的に相補的である。本明細書中で使用される場合、「特異的ハイブリダイゼーション」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での2つのポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを指す。
コード領域を含むポリヌクレオチドは、コード領域の片側または両側に隣接する異種ヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される場合、「異種ヌクレオチド」は、野生型細胞中に存在するコード領域に通常、隣接して存在しないヌクレオチドを指す。例えば、野生型微生物中に存在し、ポリペプチドをコードするコード領域には、相同配列が隣接しており、コード領域に隣接する任意の他のヌクレオチド配列は、異種であると考えられる。異種ヌクレオチドの例としては、調節配列が挙げられるが、これに限定されない。典型的には、異種ヌクレオチドは、当業者に周知の標準的な遺伝的および/または組換え方法論の使用によって本発明のポリヌクレオチド中に存在する。本発明のポリヌクレオチドは、適切なベクター中に含まれ得る。本明細書中に記載されるポリヌクレオチドの片側または両側に隣接する異種ヌクレオチドの存在は、ヒトの操作に起因する。
本発明は、さらに、細胞損傷または細胞死を予防するための方法であって、前記細胞を本発明によるペプチドと接触させることを含む、方法を提供する。この方法は、インビトロまたはインビボで実施され得る、特にエクスビボで実施される。
さらに、本発明は、再灌流傷害および/またはミトコンドリア関連障害および/またはがん治療誘発性心毒性の予防に適した化合物をスクリーニングする方法であって、
(i)1またはそれを超える候補化合物を提供することと、
(ii)前記候補化合物がBNIP3とBAXの結合に干渉する能力を決定することと、
(iii)BNIP3とBAXの結合に干渉する候補化合物を選択することと、
を含む、方法を対象とする。
(i)1またはそれを超える候補化合物を提供することと、
(ii)前記候補化合物がBNIP3とBAXの結合に干渉する能力を決定することと、
(iii)BNIP3とBAXの結合に干渉する候補化合物を選択することと、
を含む、方法を対象とする。
候補化合物は、特にペプチドおよび小分子化合物を含む任意の適切な化合物であり得る。
[実施例1] BNIP3は、代表的なI/R傷害の治療上の標的である
ネクローシス性心筋細胞死とアポトーシス性心筋細胞死の組み合わせは、再灌流傷害の初期段階の顕著な特徴である。ミトコンドリアが、両過程において主要な役割を果たしている。BHのみのBCL2ファミリーメンバーであるBNIP3は、細胞培養および単離されたラット心臓におけるミトコンドリア駆動性のネクローシス性およびアポトーシス性細胞死カスケードの活性化因子である可能性がある31、32、36~38。BNIP3は、急性心筋梗塞後の左室リモデリングおよび駆出率が保存された心不全への関与が以前より示唆されている33、39、40。I/R傷害におけるBNIP3の関与およびBNIP3が治療的介入のための魅力的な標的となるかどうかを調べるために、臨床的に適切なインビボモデルにおいて左前下行冠動脈の閉塞後に、野生型マウスおよびBNIP3欠損マウスを24時間の再灌流に供した41~44(図1A)。非罹患ゾーンから罹患領域を描出するために、エバンスブルー色素を大動脈および冠動脈中に注入した。生存不可能な心筋、リスクゾーン内の梗塞領域を画定するために、心臓切片をトリフェニルテトラゾリウムクロリドによって染色した(図1B)。十分に確立されたBNIP3のドミナントネガティブ阻害剤を使用した単離されたラット心臓における以前の研究31と一致して、BNIP3の遺伝的除去は、野生型マウスと比較して梗塞サイズを46%有意に減少させた(図1C)。これに対応して、BNIP3欠損マウスへのBNIP3の復帰は、野生型マウスと同等の梗塞サイズを用量依存的に引き起こし、BNIP3の遺伝的欠失の起こり得る副作用を取り除いた(図1C)。これらの結果は、BNIP3がインビボでの梗塞の進展において重要な役割を果たすことを示している。
[実施例2] BNIP3は、I/R傷害におけるBAX誘導性細胞死の媒介物質である
ネクローシス性心筋細胞死とアポトーシス性心筋細胞死の組み合わせは、再灌流傷害の初期段階の顕著な特徴である。ミトコンドリアが、両過程において主要な役割を果たしている。BHのみのBCL2ファミリーメンバーであるBNIP3は、細胞培養および単離されたラット心臓におけるミトコンドリア駆動性のネクローシス性およびアポトーシス性細胞死カスケードの活性化因子である可能性がある31、32、36~38。BNIP3は、急性心筋梗塞後の左室リモデリングおよび駆出率が保存された心不全への関与が以前より示唆されている33、39、40。I/R傷害におけるBNIP3の関与およびBNIP3が治療的介入のための魅力的な標的となるかどうかを調べるために、臨床的に適切なインビボモデルにおいて左前下行冠動脈の閉塞後に、野生型マウスおよびBNIP3欠損マウスを24時間の再灌流に供した41~44(図1A)。非罹患ゾーンから罹患領域を描出するために、エバンスブルー色素を大動脈および冠動脈中に注入した。生存不可能な心筋、リスクゾーン内の梗塞領域を画定するために、心臓切片をトリフェニルテトラゾリウムクロリドによって染色した(図1B)。十分に確立されたBNIP3のドミナントネガティブ阻害剤を使用した単離されたラット心臓における以前の研究31と一致して、BNIP3の遺伝的除去は、野生型マウスと比較して梗塞サイズを46%有意に減少させた(図1C)。これに対応して、BNIP3欠損マウスへのBNIP3の復帰は、野生型マウスと同等の梗塞サイズを用量依存的に引き起こし、BNIP3の遺伝的欠失の起こり得る副作用を取り除いた(図1C)。これらの結果は、BNIP3がインビボでの梗塞の進展において重要な役割を果たすことを示している。
[実施例2] BNIP3は、I/R傷害におけるBAX誘導性細胞死の媒介物質である
死促進性BCL-2ファミリーメンバーであるBAXは、エフェクタータンパク質として、ミトコンドリア依存性ネクローシスとアポトーシスの交点に位置しているようである5。このため、サイトゾルからミトコンドリアへのBAXの転位は、重要な段階である37、45、46。本発明者らは最近、インビボにおいて心筋細胞中のMOM中で起こるBAXとBNIP3との基礎的相互作用を実証した35。細胞死における最も重要な段階としてのミトコンドリアへのBAXの転位がI/Rにおいて起こり、BNIP3に依存するかどうかを決定するために、ミトコンドリアのBAXおよびBNIP3濃度の最初の変化を調査した。血管閉塞後の10分間の再灌流後に、MOM中のBAXのレベルは、BNIP3のミトコンドリア濃度の増加と共に著しく増加する(図2AおよびB)。共免疫沈降により、BNIP3およびBAXがMOM中でヘテロ二量体を形成することが明らかになった(図2C)。次に、BNIP3欠損マウスを利用することによって、本発明者らは、BNIP3が再灌流傷害中のこの転位のためのBAXの上流媒介物質であるかどうかを調べた。ミトコンドリアのBAXの増加は、BNIP3の遺伝的除去下での再灌流の初期段階内には観察されず、BNIP3の直接的な影響を実証した(図2D)。この効果がBNIP3によって本当に達成されることを検証するために、本発明者らは、心筋梗塞手順を開始する5分前に、BNIP3をBNIP3欠損マウスの心臓に投与した。BNIP3の添加は、再灌流の初期段階におけるBNIP3欠損マウス心臓中でのBAX転位を回復させ、BNIP3の遺伝的欠失の起こり得る副作用を取り除いた(図2D)。
[実施例3] I/R傷害におけるBNIP3阻害のために必要とされる重要なBNIP3配列の同定
[実施例3] I/R傷害におけるBNIP3阻害のために必要とされる重要なBNIP3配列の同定
BAXとのBNIP3の相互作用が、共免疫沈降によって評価されたインビボでの再灌流傷害における実質的な活動として認識されたので、本発明者らは、合成された13個のBAXペプチドのライブラリを有するペプチドマイクロアレイを評価することによって、BAX中のヘリックスα5、α6、α7およびα8を結合部位の候補として同定した(図3AおよびB)。この研究のために、本発明者らは、Modeller9.15を使用する相同性モデリングによってインシリコでBNIP3の3D構造を予測した47(図3C)。NAMD2.9およびCHARMM36力場を使用して、作成されたモデルをエネルギー最小化した。このBNIP3モデルは、64%に相当する様々な長さの9個のαヘリックス、これに続くランダムコイル19%および未同定の構造17%を示し、これは円二色性分光法によって確認された(図3D)。計算によるドッキングシミュレーションは、相互作用部位としてBAXのヘリックスα5、α6、α7およびα8ならびにBNIP3配列MSQSGEENLQGSWVELHFSN(アミノ酸1~20;配列番号20)を示唆したが(図3E)、最初の10アミノ酸のみではBAXに結合できなかった(図3F)。本発明者らは、BNIP3のアミノ酸1~20がBNIP3の活性を拮抗するのに十分であり得ると仮定したので、BNIP3のアミノ酸1~20に由来する20個のアミノ酸に共有結合を介して結合されたHIV-1 TATタンパク質形質導入ドメイン(PTD、GRKKRRQRRRPQ(配列番号31)、図3G)48、49から構成される細胞透過性ペプチド、TAT-BNIP3-20Aペプチドを設計した(図3H)。BNIP3のアミノ酸42~61を使用して、対照ペプチド、TAT-BNIP3-20C(図3I)を生成した。ペプチド断片のN末端をアセチル基で、C末端をアミド基でキャップした。野生型マウスをTAT-BNIP3-20Aで処理することにより、このペプチドが心筋によって取り込まれ(図3J)、そこで内因性BNIP3と相互作用することが実証された。
臨床診療に適した時点である再灌流の5分前に与えられたTAT-BNIP3-20Aが、インビボでBNIP3活性に拮抗し、再灌流傷害を減少させる能力を有するかどうかを調べるために、本発明者らはマウスにおいて所定の心筋梗塞モデルを使用した(図4A)。TAT-BNIP3-20Aでの処置は、37%の梗塞サイズの減少をもたらしたが、ビヒクルおよびTAT-BNIP3-20Cでの処置はいずれも減少をもたらさなかった(図4B)。これは、TAT-BNIP3-20Aペプチド断片によるミトコンドリアへのBNIP3転位の抑制によるものであり(図4C)、ミトコンドリア膜擾乱後のI/Rにおける重要な事象である、顕著に阻害されたカスパーゼ-3活性をもたらした(図4D)。
[実施例4] TAT-BNIP3-20Aペプチド断片はアポトーシス性およびネクローシス性ヒト心筋細胞死を阻害する
[実施例4] TAT-BNIP3-20Aペプチド断片はアポトーシス性およびネクローシス性ヒト心筋細胞死を阻害する
橋渡しの必要性を満たすために、ヒト人工多能性幹細胞由来のヒト心室心筋細胞(ヒトCM)における再酸素化実験を行った(図5A)。低酸素後に、ヒトCMを2時間の再酸素化に曝露した。特筆すべきことに、ヒトCMにおいてさえ、TAT-BNIP3-20Aはその保護特性を示す。BNIP3-20Aは、ミトコンドリアへのヒトBNIP3の転位を抑制することができ(図5B)、低いミトコンドリア内膜脱分極(図5C)ならびにより少ないアポトーシス性細胞およびネクローシス性細胞(図5D)によって証明されるミトコンドリアのかなりの保護をもたらす。
[実施例5] BNIP3/BAX活性のペプチド断片阻害剤の同定および設計
[実施例5] BNIP3/BAX活性のペプチド断片阻害剤の同定および設計
BNIP3-20Aペプチド配列のN末端切断とそれに続く単一残基の交換により、19位のSerのPheへの置換と組み合わせてアミノ酸13~20を含有するペプチドがペプチドマイクロアレイにおいて大幅により高いBNIP3結合を示すことが明らかになった(表1参照)。
表1:BNIP3への最高結合能力を示す切断型BNIP3-20A断片
表1:BNIP3への最高結合能力を示す切断型BNIP3-20A断片
これらの結果に基づいて、本発明者らは、Ser-19からPhe-19への置換を有するBNIP3のアミノ酸13~20に由来する8個のアミノ酸(WVELHFFN(配列番号8);図6A)への共有結合を介して結合されたPTDから構成されるBNIP3-8Bペプチドを設計した。ペプチド配列中の残基フェニルアラニンの必要性を実証するために、本発明者らは、Phe-18をAla-18に、さらにHis-17をAla-17に置換し、BNIP3-8Cペプチドを生成した(図6B)。BNIP3-8Bの円二色性スペクトルは、このペプチドがランダムコイル立体構造を示すことを示した(図6C)。
さらに、BNIP3 1-20の野生型配列の単一残基が18の中性アミノ酸に交換されたBNIP3-20Aペプチドを用いて、BNIP3/BNIP3相互作用研究を行った。特定のアミノ酸置換を有するBNIP3ペプチドは、BNIP3への増加した結合能力を示した(例示的なデータを表2に示す)。
表2:BNIP3への最高結合能力を示す置換されたBNIP3-20Aペプチド
[実施例6] TAT-BNIP3-8Bペプチド断片の取り込み、毒性および安定性のインビトロおよびインビボ効果
表2:BNIP3への最高結合能力を示す置換されたBNIP3-20Aペプチド
まず、本発明者らは、心臓内注射におけるインビボでの所望の効果の時点でのBNIP3-8Bの分布および存在を評価した。次に、本発明者らは、ヒト血清、血漿および全血中のTAT-BNIP3-8Bの薬物動態プロファイルを評価し、単離された成体心筋細胞における毒性を評価した。TAT-BNIP3-8Bは、心臓、脾臓および肝臓によって取り込まれ、血漿中に存在する(図7A)。したがって、TAT-BNIP3-8Bは、BNIP3-BAX-ミトコンドリアトライアングル細胞死カスケードが起こる時点である再灌流の10分後には、心臓中に存在する。心筋細胞は明白な毒性の徴候を示さず(図7B)、ヒト血清、血漿および全血中のTAT-BNIP3-8Bの半減期はそのインビボ阻害能を可能にする(図8A~C)。プロテイナーゼKとのTAT-BNIP3-8Bのインキュベーションを対照とした。
[実施例7] TAT-BNIP3-8Bペプチドの作用機序
[実施例7] TAT-BNIP3-8Bペプチドの作用機序
TAT-BNIP3-8Bは、BNIP3およびBAXのモノマーおよびホモダイマーに、ならびにBNIP3/BAXヘテロダイマーおよびヘテロオリゴマーに結合してそれらの活性を妨げると仮定した。TAT-BNIP3-8Bの相互作用挙動を評価するために、BNIP3/TAT-BNIP3-8BおよびBAX/TAT-BNIP3-8Bオーバーレイアッセイおよびドッキングシミュレーションを行った。結果はいずれも、TAT-BNIP3-8BがBNIP3およびBAXに結合することを示唆した(データは示さず)。
特に、心筋梗塞モデル(図9A)では、再灌流の5分後に、内因性BNIP3およびBAXモノ、ホモおよびヘテロダイマーが蛍光標識されたTAT-BNIP3-8Bと共免疫沈降した(図9B)。さらに、再灌流は、BNIP3および3つのBAXからなるオリゴマーの大規模形成によって証明されるように、BNIP3およびBAXをオリゴマー化させた(図9C)。SDS-PAGEおよび共免疫沈降実験は、高次オリゴマー複合体におけるBNIP3/BAXヘテロ相互作用を明らかにし、このオリゴマー化は、TAT-BNIP3-8Bでの処理によって強く阻害された(図9C)。
[実施例8] TAT-BNIP3-8Bは、心筋梗塞サイズを減少させる
[実施例8] TAT-BNIP3-8Bは、心筋梗塞サイズを減少させる
次いで、本発明者らは、適切な心筋梗塞モデル(図9A)において再灌流を開始する5分前に与えられたTAT-BNIP3-8B処理の有効性および効果を研究した。特に、TAT-BNIP3-8Bは、ビヒクルおよびTAT-β-Gal処理と比較して、梗塞サイズを用量依存的に最大40%減少させる(図9DおよびE)。TAT-BNIP3-8C処理は、TAT-BNIP-8Bと比較して梗塞サイズに明確に影響を及ぼさず、フェニルアラニン残基の重要性を指摘している(図9D)。
[実施例9] TAT-BNIP3-8Bはミトコンドリアの擾乱および細胞死カスケードを減少させる
[実施例9] TAT-BNIP3-8Bはミトコンドリアの擾乱および細胞死カスケードを減少させる
ミトコンドリアの損傷は、ミトコンドリア内膜(MIM)およびMOMの擾乱によって起こり得る。ネクローシスにおける重要なミトコンドリアの事象は、MIM中のミトコンドリア膜透過性遷移孔(mPTP)の早期の開口であり50、MIM全体にわたる電位差の時間依存性の散逸を引き起こし、続いてミトコンドリアの膨潤および細胞破壊を引き起こす。アポトーシスにおける重要なミトコンドリアの事象は、BAXの膜貫通ドメイン曝露を誘導するBAX活性化、ならびにアポトーシス刺激物質(apoptogen;例えば、シトクロムc)放出を可能にするMOM透過化、およびその後のカスパーゼ活性化である51。インビボで所定のI/Rモデルにおいて再灌流の5分前に左心室中に注射されたTAT-BNIP3-8Bは、ミトコンドリアへのBNIP3およびBAXの転位を抑制し、ミトコンドリアの膨潤、BAX活性化、シトクロムc放出およびカスパーゼ-3活性を含む下流細胞死機構の阻害をもたらす。
[実施例10] TAT-BNIP3-8Bはアポトーシス性およびネクローシス性ヒト心筋細胞死を阻害する
[実施例10] TAT-BNIP3-8Bはアポトーシス性およびネクローシス性ヒト心筋細胞死を阻害する
TAT-BNIP3-8BがヒトCMにおける細胞死を阻害することができるかどうかを試験した。低酸素後に、ヒトCMを2時間の再酸素化に曝露した(図11A)。BNIP3-8Bは、ネクローシス性細胞死およびアポトーシス性細胞死(図11B)ならびにミトコンドリア内膜電位(図11C)の喪失を顕著に阻害する。
[実施例11] TAT-BNIP3-8Bは、脳梗塞サイズを減少させる
[実施例11] TAT-BNIP3-8Bは、脳梗塞サイズを減少させる
BNIP3は脳虚血において重要な役割を果たすことが示唆されているので38、本発明者らは、局所的な脳再灌流のマウスモデルにおける臨床転帰に対するBNIP3-8Bペプチドの効果も評価した。本発明者らは、30分間の一過性中大脳動脈閉塞(tMCAO)後に、マウスを24時間の再灌流に供した。tMCAO直後のBNIP3-8B処置は、梗塞サイズを52%著しく減少させる(図12)。
[実施例12] TAT-BNIP3-8Bは、ブタにおいて心筋梗塞サイズを減少させる
[実施例12] TAT-BNIP3-8Bは、ブタにおいて心筋梗塞サイズを減少させる
次いで、本発明者らは、ブタにおける心筋梗塞モデルにおいて再灌流を開始する5分前に与えられたTAT-BNIP3-8B処理の有効性および効果を研究した。ブタを左前下行冠動脈の60分間の閉塞に供し、続いて4時間の再灌流に供した。特に、TAT-BNIP3-8Bは、ビヒクルと比較して、梗塞サイズを56%著しく減少させる(図13)。
[実施例13] TAT-BNIP3-8Bは、ドキソルビシンによって誘発されたミトコンドリアの損傷から保護する。
[実施例13] TAT-BNIP3-8Bは、ドキソルビシンによって誘発されたミトコンドリアの損傷から保護する。
本発明者らは、HL-1細胞におけるドキソルビシンによって誘発されたミトコンドリアの損傷に対するBNIP3-8Bペプチドの効果を評価した。ミトコンドリアの膨潤をモニターするために、HL-1細胞を5μMドキソルビシンで処理し、患者において標準的な注入によって到達した血漿ピーク濃度を再現した。ミトコンドリアの膨潤を540nmでの光学密度によって測定した(膨潤による増加したミトコンドリアの体積は低下した光学密度をもたらす)。ドキソルビシンと同時に与えられたTAT-BNIP3-8Bは、増加したOD540によって示されるように、ミトコンドリアの膨潤を抑制する(図14)。これらのデータは、TAT-BNIP3-8Bが、アントラサイクリンなどの化学療法によって媒介される損傷からミトコンドリアを保護することができることを示している。
[実施例14] 方法
[実施例14] 方法
化学物質はSigma Aldrichから入手した。BNIP3、チューブリン、シトクロムcおよびBAXに対する抗体はAbcamから入手し、活性化されたBAXについてはEnzoから入手した。
動物。同様の年齢(12±3週)および30gの平均体重を有する雄マウスを使用した。C57BL/6野生型マウスをJackson Laboratory(Bar Harbor、ME、USA)から入手し、馴化のために地元の動物舎で1週間飼育した。
C57BL/6J-TgH(Bnip3-/-)マウスは、小児分子心血管研究開発センター(シンシナティ大学、シンシナティ、オハイオ州、米国)のGerald W.Dorn教授から入手した。エクソン2および3をネオマイシン耐性カセットで置き換えることによってマウスを作製した33。マウスは、エッセン大学病院の地元の動物舎で飼育された。すべての実験は、実験およびその他の科学的目的のために使用される脊椎動物の保護に関する欧州条約(指令2010/63/EU)に従って、現地の倫理委員会によって承認された。
マウスにおけるインビボ心筋梗塞モデル。ケタミン(100mg/kg)およびキシラジン(10mg/kg)の腹腔内注射によって、野生型およびBnip3欠損(Bnip3-/-)マウスを麻酔し、挿管した。マウスミニ人工呼吸器を使用して、人工呼吸パラメータを2.1~2.5mlの一回換気量および140呼吸/分の呼吸数に設定した。2体積%イソフルランを換気気体に添加することによって深い麻酔を維持した。側方開胸術(第3および第4肋骨間の1cmの左側方切開)によって胸部を開いた。6-0プロレン縫合糸を左冠動脈(LCA)の周りに配置し、1片の柔らかいシリコン管を動脈の上に配置した。縫合糸を締め付けて縛ることによって、冠動脈閉塞を達成した。閉塞の30分後に、シリコン管を除去し、縫合糸を定位置に残した。より長い再灌流時間のために、4-0プロレンを用いて胸部を閉じた。血管閉塞の5分前に、2、6および9nmol(50μlの0.9%塩化ナトリウム中)のBNIP3を左心室腔中に注射した。NaCl中の、20アミノ酸を有するペプチド(2nmol/50μl)および8アミノ酸を有するペプチド(8nmol/50μl)を再灌流の5分前に注射した。塩化ナトリウム注射(50μl)を対照処置とした。
ブタにおけるインビボ心筋梗塞モデル。麻酔の導入後、大腿動脈および大腿静脈上に小さな切開を施し、血管を単離した。動脈内に小さな開口部を作り、シースを導入した。さらに、必要であれば、緊急薬物投与を可能にするために、大腿静脈または他の適切な静脈中にシースを配置した。ヘパリンの投与前に血液試料を採取し、記録されたベースライン活性化凝固時間(ACT)を確立するために使用した。続いて、外科医によって指示されたとおりに、必要に応じてヘパリン(250~350IU/kg)を投与して、ベースラインACTのレベルの2倍のACTを達成および維持した。ヘパリンの初回ボーラス後、ACTを再度記録し、その後、手術の完了まで少なくとも60分毎にモニターした。
蛍光透視法によって与えられる視覚的誘導を使用して、適切なガイドカテーテルを左前下行動脈(LAD)の小孔内に前進させた。非イオン性造影剤をすべての手順に使用した。ガイドカテーテルを通して左前下行(LAD)冠動脈までバルーンカテーテルを前進させることによって、バルーンカテーテルを導入した。LADの第1対角枝の上の適切な場所まで、ガイドカテーテルを介してバルーンを冠動脈内に前進させた。次いで、動脈の完全な閉塞を確保するのに十分な圧力まで、バルーンを膨張させた。蛍光透視法を用いて動脈の閉塞を確認した。閉塞の確認後、バルーンを動脈内で60分間膨張させたままにした。発生支持薬および除細動を研究記録に記録した。再灌流の5分前に、ペプチドおよびビヒクルをそれぞれ静脈内注射によって投与した。血管閉塞期間の終わりに、バルーンを収縮させ、虚血領域を再灌流させた。完全なバルーン収縮を蛍光透視法で確認した。手順の最後に、すべてのカテーテルを取り出し、動脈および静脈を結紮し、切開部を標準的な様式で閉鎖した。再灌流の4時間後、動物を安楽死させた。
梗塞サイズの測定。梗塞サイズの分析のために、マウスを24時間の再灌流後に安楽死させ、心臓を摘出し、PBSで5分間灌流した。灌流後、以前に詳説したように、同じ位置でLCAを再結紮した。非虚血ゾーンから虚血性AARを描出するために、エバンスブルー色素(1mlの1%溶液)を大動脈および冠動脈に注射した。組織をきれいな食品ラップで包み、-20℃の冷凍庫中で1時間保存した。次いで、心臓を長軸に対して垂直に1mmのスライスに連続的に切片化し、各スライスを秤量した。リスクゾーン内の生存心筋と非生存心筋の境界を画定するために、切片を1%TTC中、37℃で5分間インキュベートした。試料の正体を盲検化した観察者によって、コンピュータ支援面積測定法を用いて、梗塞、AARおよび非虚血性左心室を評価した。心筋梗塞のサイズをAARの百分率として表した。
免疫ブロッティング。組織およびヒトCM細胞をRIPS緩衝液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.5mM EDTA、1% NP-40ならびにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤、pH7.4)中で溶解した。Mito-lyse緩衝液(200mMスクロース、10mM HEPES、1mM EGTA、1% Triton(登録商標)-X 100ならびにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤、pH7.4)中に、単離されたミトコンドリアを溶解した。遠心分離(20.000xg、15分、4°C)によって可溶化液を清澄化した。上清中のタンパク質濃度を、DCタンパク質アッセイ(Bio-Rad)を使用して測定した。4×LDS試料緩衝液および10×還元剤(Invitrogen)中に試料を希釈し、95°Cに5分間加熱することによってSDS-PAGE用に調製した。4~12%のBis-Trisゲル(Invitrogen)を用いて等量のタンパク質を分離し、ニトロセルロース上に転写し、一次抗体で免疫ブロットした。使用した二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合したヤギ抗マウスまたは抗ウサギIgG(Invitrogen)であった。ECL(Thermo Scientific)によって免疫ブロッティングを検出し、Imager 600(Amersham)で画像化した。
相互作用研究。タンパク質-ペプチド相互作用研究のために、ペプチドライブラリを合成し、マイクロアレイスライド上に固定化した。組換えBNIP3を1μg/mlの濃度で使用した。ペプチドを合成し、(i)BNIP3/BAX相互作用研究;(ii)BNIP3 1-20の野生型配列のC末端、N末端またはC/N末端切断を行ったBNIP3/BNIP3相互作用研究;および(iii)BNIP3 1-20の野生型配列の単一残基を18の中性アミノ酸に交換したBNIP3/BNIP3相互作用研究のために固定化した。
マイクロアレイ。タンパク質-ペプチド結合研究のために、組換えBNIP3(cusabio)およびBAX(MyBioSource)をそれぞれ10μg/mlおよび1μm/mlの濃度で使用した。標識キットとして、標識Dylight 650を含むDyLight Microscale Antibody Labeling Kit(Thermo)を使用した。アッセイは、自動化されたTECAN HS4800マイクロアレイ処理ステーションを使用して行った。ブロッキング緩衝液中に希釈された顧客提供の試料と共に、マイクロアレイを30℃で2時間インキュベートした。各工程の前に、マイクロアレイを洗浄緩衝液で洗浄した。高分解能蛍光スキャナを用いてマイクロアレイを走査した。レーザ設定および適用された解像度は、実行されたすべての測定について同一であった。スポット認識ソフトウェアGenePix(Molecular Devices)を使用して、得られた画像を分析および定量化した。各スポットについて、平均シグナル強度を抽出した(0~65535任意単位の間)。さらなるデータ評価のために、いわゆるMMC2値を決定した。変動係数(CV)(標準偏差を平均値で割ったもの)が0.5より大きい場合を除いて、MMC2は、マイクロアレイ上の3つの事例すべての平均値に等しい。この場合には、2つの最も近い値の平均(MC2)がMMC2に割り当てられる。すべての工程は、JPT Peptide Technologies(Berlin、Germany)によって実施した。
インシリコでのBNIP3の三次元(3D)構造モデリング。BNIP3の予測されたインシリコ3D構造は、Modeller9.15を使用した相同性モデリングによって得られ、作成されたモデルは、NAMD2.9およびCHARMM36力場を使用してエネルギー最小化された。
円二色性(CD)分光法。BNIP3タンパク質およびBNIP3-8BペプチドのCDスペクトルを、37℃、pH=7.4、1×PBSでJasco J-715分光偏光計で記録した。
ドッキングシミュレーション。実験は、Autodock Vina52およびHADDOCK53を用いて行った。BAXの構造(pdb-ID:4S0O)は、Protein Data Bankから入手したが、BNIP3およびペプチドBNIP3-8Bの構造は、Modeller9.15を用いてモデル化した47。テンプレート構造は、PDBコード2k7wおよび2ka1に対応する。NAMD2.954およびCHARMM36力場を使用して、作成されたモデルをエネルギー最小化した。
免疫沈降。免疫沈降は、プロテインG結合Dynabeads(Invitrogen)を使用して行った。1mM DTT、0.005% Brij35およびプロテアーゼ-ホスファターゼ阻害剤を含有するPBS緩衝液中で振盪しながら、4°Cで一晩、500μgの溶解されたタンパク質を2μgの抗体と共にインキュベートした。翌日、20μlのDynabeadsを添加し、溶液を再び1時間インキュベートした。沈殿した免疫複合体を2回洗浄し、次いで、LDS-試料緩衝液(1:4)およびPBS中の還元剤(1:10)(Invitrogen)を含有する溶出緩衝液に再懸濁し、95℃で5分間加熱した。Dynabeadsを除去した後、免疫ブロッティングによって溶出液を分析した。
Abcamからのカスパーゼ-3アッセイキット(#ab39401)を使用してカスパーゼ-3活性を測定した。30分間の虚血および4時間の再灌流後に齧歯類の心臓を採取し、リスク領域を単離し、含有緩衝液中に溶解し、製造業者の指示に従ってアッセイを実施した。
細胞培養。ヒトiPSC由来心室心筋細胞(ヒトCM)を(axol)から入手し、製造業者の仕様に従って培養した。
血管閉塞をシミュレートするために、1% O2、37°C下の緩衝液(113mM NaCl、4.7mM KCl、12mM HEPES、1.2mM MgSO4、30mMタウリン、1.3mM CaCl2、pH7.4)中で細胞をインキュベートした。21% O2、37°C下、5.5mMグルコースを補充した緩衝液中で、再酸素化を行った。
製造業者のプロトコルに従って、Claycomb培地中でHL-1細胞を培養した。5μMドキソルビシンおよび2nmol TAT-BNIP3-8Bで細胞を30分間処理した。
JC-1アッセイ。ヒトCM細胞におけるミトコンドリア内膜電位を分析するために、5’,6,6’-テトラクロロ-1,1’,3,3’-テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンヨウ素(JC-1)で染色した。培地中の6μM JC-1と共に細胞を37°Cで30分間インキュベートした。37°CのPBS緩衝液で細胞を洗浄した後、4% PFAを用いて室温で15分間細胞を固定した。DAPI染色を行い、EVOS FL(life Technologies)を用いて細胞を分析した。
膨潤アッセイ。室温でのマイクロプレート吸光度リーダーFLUOstar Omega(BMG Labtech)中において、540nmでの光散乱によってミトコンドリアの膨潤を測定した。最終アッセイ体積は200μlであり、250mMスクロース、10mM HEPES、1m EGTA、pH7.4を含有する緩衝液中に0.5mg/mlでミトコンドリアを含有した。
ペプチド。ペプチドは、樹脂合成手順(JPT International、Berlin、Germany)によって生成した。ペプチドのN末端をアセチル基で、C末端をアミド(ameide)でキャップした。送達のために、ペプチドをTAT配列GRKKRRQRRRPQ(配列番号31)に共有結合を介して結合させた。取り込みおよび結合研究のために、ペプチドをフルオロフォアで標識した。完全なペプチドリストを別表1として添付する。
Claims (19)
- ペプチドであって、
(i)細胞取り込みシグナルと、
(ii)BNIP3の13~20位を含むBNIP3断片またはこれに由来するアミノ酸配列と、
を含み、
前記ペプチドは、50アミノ酸またはそれ未満の長さを有する、ペプチド。 - 前記BNIP3断片が、12アミノ酸またはそれ未満、特に10アミノ酸またはそれ未満、特に8アミノ酸の長さを有する、請求項1に記載のペプチド。
- 前記BNIP3断片が、BNIP3の13~20位と比較して1、2または3個のアミノ酸置換を必要に応じて含むBNIP3の13~20位を含む、請求項1または2に記載のペプチド。
- 前記アミノ酸置換が、BNIP3の15、17および19位に対応する位置の1またはそれより多くに存在する、請求項3に記載のペプチド。
- 前記アミノ酸置換が、
(i)BNIP3の15位のグルタミン酸からフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、チロシン、システイン、ヒスチジン、アルギニンまたはトレオニン、および
(ii)BNIP3の17位のヒスチジンからバリン、および
(iii)BNIP3の19位のセリンからチロシン、システイン、フェニルアラニンまたはヒスチジン;
から選択される、請求項3または4に記載のペプチド。 - 前記BNIP3断片が、BNIP3の19位に対応する位置にフェニルアラニン残基を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記BNIP3断片が、
(i)BNIP3の12~20位と比較して1、2、3もしくは4個のアミノ酸置換を必要に応じて含むBNIP3の12~20位を含む、
(ii)BNIP3の4~20位と比較して1、2、3、4、5もしくは6個のアミノ酸置換を必要に応じて含むBNIP3の4~20位を含む、
(iii)BNIP3の1~20位と比較して1、2、3、4、5もしくは6個のアミノ酸置換を必要に応じて含むBNIP3の1~20位を含む、または
(iv)配列番号3~30からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、
請求項1~6のいずれか一項に記載のペプチド。 - 前記BNIP3断片が、BNIP3の13~20位のD-レトロ-インベルソ配列、または請求項2~7に記載のアミノ酸配列のいずれかのD-レトロ-インベルソ配列を含む、請求項1に記載のペプチド。
- 前記細胞取り込みシグナルが、
(i)5~30アミノ酸、特に8~20アミノ酸もしくは10~16アミノ酸、特に12アミノ酸の長さを有するペプチドであり、
(ii)HIVのTATタンパク質のタンパク質形質導入ドメインであり、および/または
(iii)配列番号31~50からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項1~8のいずれか一項に記載のペプチド。 - 前記細胞取り込みシグナルが、細胞透過性ペプチド、特に請求項9に記載の細胞透過性ペプチドのD-レトロ-インベルソ配列を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記細胞取り込みシグナルおよび前記BNIP3断片からなり、前記細胞取り込みシグナルと前記BNIP3断片との間に必要に応じてリンカーを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のペプチド。
- 40アミノ酸またはそれ未満、特に35アミノ酸またはそれ未満、特に30アミノ酸またはそれ未満の長さを有する、請求項1~11のいずれか一項に記載のペプチド。
- 請求項1~12のいずれか一項に記載のペプチドを含む医薬組成物。
- 再灌流関連および/またはミトコンドリア関連障害ならびにがん治療誘発性心毒性の処置において使用するための、請求項1~12のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記再灌流関連および/またはミトコンドリア関連障害が、心筋梗塞、脳卒中、急性腎傷害、外傷、循環停止および臓器移植中の血流の停止からなる群から選択される、請求項14に記載の使用のためのペプチド。
- 前記ペプチドが、血液供給障害の発生中または発生後に、特に虚血によって影響を受けた組織の再灌流の前に患者に投与される、請求項14または15に記載の使用のためのペプチド。
- 前記ペプチドが、再灌流前2時間以内、特に再灌流前30分以内に前記患者に投与される、請求項16に記載の使用のためのペプチド。
- ミトコンドリア誘発性アポトーシスまたはネクローシスによる組織損傷の処置または予防において使用するための、請求項1~12のいずれか一項に記載のペプチド。
- 再灌流傷害および/またはミトコンドリア誘発性障害および/またはがん治療誘発性心毒性の予防に適した化合物をスクリーニングする方法であって、
(i)1またはそれを超える候補化合物を提供することと、
(ii)前記候補化合物がBNIP3とBAXの結合に干渉する能力を決定することと、
(iii)BNIP3とBAXの結合に干渉する候補化合物を選択することと、
を含む、方法。
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