JP2022532092A - 再灌流傷害の処置のためのｂｎｉｐ３ペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＢＮＩＰ３、ＢＡＸおよびミトコンドリアの個々の活性および経路間コミュニケーションを阻害することができるペプチドを提供する。本ペプチドは、細胞損傷および細胞死を予防することが望ましい対象における疾患または状態を処置する方法において使用することができる。本発明は、モノマーとしてならびにそれらのホモオリゴマーおよびヘテロオリゴマーとしてのＢＮＩＰ３およびＢＡＸに結合するペプチドを提供し、これは、ＢＮＩＰ３およびＢＡＸの個々の活性およびオリゴマー活性を回避することにより幅広い連続的な活性を示す。心臓および脳組織ならびにヒト人工多能性幹細胞由来のヒト心室心筋細胞を再灌流傷害から保護することによって証明されるように、有効性は器官または種に制約されない。心筋梗塞サイズもブタにおいて著しく減少した。
Description
本発明は、再灌流傷害の処置に関する。特に、本発明は、ミトコンドリアにおけるＢＮＩＰ３およびＢＡＸの活性を低下させることによって細胞損傷および細胞死を予防するＢＮＩＰ３由来ペプチドを提供する。
血管の閉塞は、組織の一部への血液の停止を引き起こし、これは特に、不十分な酸素供給、栄養素の利用可能性の低下および代謝老廃物の不十分な除去をもたらして、細胞を著しく破壊し、その後、細胞を死滅させる。急性の閉塞は予測可能でも回避可能でもないが、血管開存性の回復は実現可能であり、患者の転帰のために不可欠である１。適時の再灌流レジメンは推奨される治療であるが、血液および特にＯ２供給の急速な回復は、組織に現在のところ利用可能な処置は存在しない傷害を与える。再灌流の初期段階は、高酸素状態、活性酸素種の急激な発生およびアシドーシスを伴わないカルシウムレベルの増加をもたらす高レベルの酸素を特徴とする。再灌流傷害の病態は、心臓、脳、肝臓および腎臓において認知されており、冬眠心筋、急性心不全、脳機能障害、胃腸機能障害、腎機能障害、全身性炎症反応症候群および多臓器機能障害症候群を含む重篤な臨床所見に関連している。したがって、再灌流傷害は、重要な治療上の課題を提起する重大な医学的状態である。心筋梗塞（ＭＩ）は突然の時間的に予測不可能な事象であり、ここで、再灌流が生存のために不可欠であるが、これが最終的な梗塞サイズの最大５０％を決定する２。この運命は、移植された臓器にも当てはまる。ＭＩは心不全症例の最も一般的な原因であり、したがって、再灌流傷害を軽減するための治療的介入は、生存能力のある心筋を救済し、ＭＩサイズを制限し、心機能を保存し、心不全の発生率に影響を与える機会を提供する３。再灌流によって誘発される梗塞の進行においては、２つの形態の細胞死、すなわちネクローシスおよびアポトーシスが本質的な役割を果たす。ネクローシス性の心筋細胞死は、初期の梗塞領域中で主に観察され得る。ネクローシスは、炎症、マトリックスリモデリングおよびその後の線維症などの下流の組織応答を誘導する４。アポトーシスは、梗塞領域および梗塞周囲領域中で起こり、初期の梗塞後リモデリングの主たる要素である５。
がん患者にとっては、心臓損傷も重大な問題である。スクリーニングおよび処置戦略の進歩により、がん生存者の集団は過去３０年間にわたって着実に増大した。５年全生存率は、１０年間の追跡調査で５０～７０％に改善した。その結果、がん治療の副作用、特に心血管毒性の有病率が増加している。従来の化学療法（例えば、アントラサイクリン）は、左室駆出率（ＬＶＥＦ）の無症候性および症候性の低下、心筋症および心不全（ＨＦ）の原因であると広く認識されてきた、多くのがんに対して一般的に使用されている治療である。がんによって媒介される心筋症は、典型的には不可逆的である、活性酸素種（ＲＯＳ）によって媒介されるＬＶ収縮機能の用量依存的な減少を特徴とする。現在のところ、アントラサイクリン化学療法またはその他のがん治療を受けている患者における心毒性副作用（例えば、心機能の低下、心筋症など）を効果的に低減するための予防的アプローチも治療法も存在しない。この医学的な要望に取り組むことを目標にしたいくつかの研究は、不完全な結果／利益を得るに留まった。ＣＥＣＣＹ試験は、乳がん患者におけるカルベジオールの利益を示すことはできなかったが、トロポニンの低下による保護は示された６。ＰＲＡＤＡ試験は、カンデサルタンおよびメトプロロールの評価を行い、心筋症の予防に対するカンデサルタンの有意な利益を明らかにしたが、心毒性の現行の定義によれば本試験は十分な検出力がなかった７。ＭＡＮＴＩＣＯＲＥ試験の初期の結果は、左心室の直径の変化であった。β遮断薬もＡＣＥ阻害薬もこの転帰尺度に対して有意な影響を有さなかったが、二次的転帰としての心不全を有意に予防した８。まとめると、既存の文献は心不全療法の潜在的な利益を示しているが、現在のところ、がん患者における心毒性の予防における現在のガイドラインによって規定される最先端の心不全治療の価値を綿密に評価した研究は存在しない。
ミトコンドリアは、ネクローシス性シグナル伝達およびアポトーシス性シグナル伝達の両方の中心を成す９。これらには、電子伝達、酸化的リン酸化およびＡＴＰ合成の破壊、ＤＮＡ断片化、タンパク質および脂質の損傷、ならびにＲＯＳの過剰な生成が含まれる。
ミトコンドリアにおけるネクローシスの決定的事象は、ミトコンドリア内膜（ＭＩＭ）内の孔、いわゆるミトコンドリア膜透過性遷移孔（ｍＰＴＰ）の開口である。これは、エネルギー崩壊およびミトコンドリア内への浸透圧調節物質の流入と溶質との迅速な交換をもたらす。その後のマトリックスの膨潤は、ミトコンドリア外膜の破裂、細胞膨潤および細胞破壊をもたらす１０。Ｃａ２＋などのネクローシス性刺激は、ｍＰＴＰの開口を誘発することが示唆されており、ＲＯＳによって増強され得る１０。広範な調査にもかかわらず、トランスジェニック動物研究では、アデニンヌクレオチドトランスロカーゼ１１、電位依存性アニオンチャネル１２、ミトコンドリアリン酸キャリアー１３（ＳＬＣ２５Ａ３）およびシクロフィリンＤ１４を含むいくつかの推定成分を除き、ｍＰＴＰの成分は不明のままである。ごく最近では、ＡＴＰシンターゼのｃ－サブユニットが内膜に孔を形成することが示唆されている１５、１６。シクロスポリンＡなどの薬理学的阻害剤を使用したｍＰＴＰ開口の防止は、Ｉ／Ｒ傷害の前臨床モデルにおいて梗塞サイズを減少させることが報告されている１７、１８。より大規模な臨床試験では、その効果は中立的であった１９。ミトコンドリアを標的とするペプチドであるエラミプレチド（以前は、ベンダビアまたはＭＴＰ－１３１と呼ばれていた）およびミトコンドリアを標的とする薬物であるＴＲＯ４０３０３は、再灌流の開始時に投与すると、ミトコンドリア由来のＲＯＳの産生を減弱させることによって梗塞サイズを減少させることが動物研究で実証されている２０～２２。しかしながら、ＳＴＥＭＩ患者研究では、ＰＰＣＩの前に投与された静脈内エラミプレチド２０およびＴＲＯ４０３０３のいずれも、梗塞サイズを減少させることができなかった２３。特に、プラセボ群と比較した場合、ＴＲＯ４０３０３を服用した患者ではより多くの有害事象が報告され、それにより、この治療的アプローチの臨床適用が制限された。Ｎａ＋／Ｈ＋交換阻害剤２４、スーパーオキシドジスムターゼなどの抗酸化物質２５および様々な抗好中球抗体２６、２７も同様に効果がないようであった。
梗塞領域および梗塞周囲領域中で起こるアポトーシス性細胞死は、シトクロムｃ、アポトーシス誘導因子、ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅｓ／Ｄｉｒｅｃｔ ＩＡＰ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ Ｌｏｗ ＰＩ）およびエンドヌクレアーゼＧなどのアポトーシス促進性タンパク質の膜間腔から細胞質ゾル中への放出を可能にするミトコンドリア外膜（ＭＯＭ）透過化によって開始され、カスパーゼおよびＤＮＡ断片化を介した細胞死カスケードの開始をもたらす２８～３０。
死促進性（ｐｒｏ－ｄｅａｔｈ）ＢＣＬ－２タンパク質であるＢＮＩＰ３（ＢＣＬ－２アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質－３）およびＢＡＸ（ＢＣＬ－２関連Ｘタンパク質）はＭＯＭ透過化を誘導し、ＭＯＭ中へ転位してヘテロ二量体を形成することでミトコンドリアのアポトーシスを媒介する、代表的な媒介物質および下流エフェクターである３１～３５。さらに、ＢＮＩＰ３およびＢＡＸはＭＩＭの擾乱を制御し、それによってネクローシスの重要な活性化因子として機能する５、３６。
本発明は、ＢＮＩＰ３およびＢＡＸ相互作用活性の阻害剤を提供することによって、中心的な梗塞領域中の急性傷害およびすぐ近傍の領域中のその後の細胞死のいずれもを最適に改善することの必要性に対処し、ここで、心臓、脳、肝臓および腎臓における再灌流傷害、および他の適応症（ミトコンドリアの擾乱が、例えば、心不全、臓器移植、心停止または外科的および薬理学的介入に起因する細胞損傷および細胞死、ならびに脳卒中、がんおよびがん治療によって誘発される心臓損傷などを引き起こす）を処置するために、個々としてまたは３つの組としてＢＮＩＰ３、ＢＡＸおよびミトコンドリア間での経路内および経路間コミュニケーションが妨げられる。。
本発明は、モノマーとしてならびにそれらのホモオリゴマーおよびヘテロオリゴマーとしてのＢＮＩＰ３およびＢＡＸに結合するペプチドを提供し、これは、ＢＮＩＰ３およびＢＡＸの個々の活性およびオリゴマー活性を回避することにより幅広い連続的な活性を示す。心臓および脳組織ならびにヒト人工多能性幹細胞由来のヒト心室心筋細胞を再灌流傷害から保護することによって証明されるように、有効性は器官または種に制約されない。心筋梗塞サイズもブタにおいて著しく減少した。
ペプチドはＢＮＩＰ３のＮ末端部分に由来し、ＢＮＩＰ３のアミノ酸１３～２０からなる８アミノ酸区間が最も活性であることが証明された。このような短いペプチドがＢＮＩＰ３およびＢＡＸ活性を阻害し、これらのタンパク質のホモオリゴマー化およびヘテロオリゴマー化の形成を遮断し、細胞内でのこれらのホモオリゴマーおよびヘテロオリゴマーの立体構造変化を誘導することができたことは非常に驚くべきことであった。ペプチド配列中のある特定の変異は、その有効性をさらに高めた。
これらの結果に照らして、本発明は、第１の態様において、
（ｉ）細胞取り込みシグナルと、
（ｉｉ）ＢＮＩＰ３の１３～２０位を含むＢＮＩＰ３断片またはこれに由来するアミノ酸配列と、
を含む、ペプチドを提供する。
（ｉ）細胞取り込みシグナルと、
（ｉｉ）ＢＮＩＰ３の１３～２０位を含むＢＮＩＰ３断片またはこれに由来するアミノ酸配列と、
を含む、ペプチドを提供する。
ペプチドは特に、５０、特に４０アミノ酸またはそれ未満の長さを有する。
第２の態様において、本発明は、第１の態様によるペプチドを含む医薬組成物、ならびに再灌流関連および／またはミトコンドリア関連障害およびがん治療誘発性心毒性の処置およびこれらの予防におけるその使用を提供する。
第３の態様において、本発明は、細胞損傷または細胞死を予防するための方法であって、前記細胞を第１の態様によるペプチドと接触させることを含む、方法を提供する。
さらに、本発明は、第４の態様において、再灌流傷害および／またはミトコンドリア関連障害および／またはがん治療誘発性心毒性の予防に適した化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）１またはそれを超える候補化合物を提供することと、
（ｉｉ）前記候補化合物のＢＮＩＰ３とＢＡＸの結合に干渉する能力を決定することと、
（ｉｉｉ）ＢＮＩＰ３とＢＡＸの結合に干渉する候補化合物を選択することと、
を含む、方法を対象とする。
（ｉ）１またはそれを超える候補化合物を提供することと、
（ｉｉ）前記候補化合物のＢＮＩＰ３とＢＡＸの結合に干渉する能力を決定することと、
（ｉｉｉ）ＢＮＩＰ３とＢＡＸの結合に干渉する候補化合物を選択することと、
を含む、方法を対象とする。
本発明の他の目的、特徴、利点および態様は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかになるであろう。しかしながら、本出願の好ましい実施形態を示す以下の説明、添付の特許請求の範囲および具体例は、例示としてのみ与えられることを理解されたい。開示された発明の趣旨および範囲内での様々な変更および修正は、以下を読むことによって当業者に容易に明らかになるであろう。
本発明は、細胞損傷および細胞死を防ぐために、ＢＣＬ－２アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質－３（ＢＮＩＰ３）、ＢＣＬ－２関連Ｘタンパク質（ＢＡＸ）およびミトコンドリアの個々の活性および経路間コミュニケーションを阻害することが望ましい、対象中の疾患または状態を処置する方法、化合物および組成物を提供する。
一態様において、本発明は、細胞損傷および細胞死カスケードを活性化するＢＮＩＰ３、ＢＡＸおよびミトコンドリアの三者を阻害するペプチドである。本発明のペプチドは、細胞取り込みシグナルと、ＢＮＩＰ３の１３～２０位を含むＢＮＩＰ３断片またはこれに由来するアミノ酸配列と、を含み、特に、５０アミノ酸、特に４０アミノ酸またはそれ未満の長さを有する。
ＢＮＩＰ３断片
ＢＮＩＰ３断片
本発明によるペプチド内のＢＮＩＰ３断片は、特に、ＢＡＸおよび／またはＢＮＩＰ３に結合することができる。特に、ＢＮＩＰ３断片は、ＢＡＸのアミノ酸１０８～１６４の領域などのＢＡＸのＢＮＩＰ３結合領域に結合することができる。ＢＮＩＰ３断片は、特に、ＢＮＩＰ３とＢＡＸとの相互作用に干渉または阻害することができる。
ある特定の実施形態において、ＢＮＩＰ３断片は、２０アミノ酸またはそれ未満の長さを有する。特に、ＢＮＩＰ３断片は、１５アミノ酸もしくはそれ未満、または１０アミノ酸もしくはそれ未満の長さを有する。特定の実施形態において、ＢＮＩＰ３断片は、８アミノ酸の長さを有する。
具体的な実施形態において、ＢＮＩＰ３断片は、ＢＮＩＰ３タンパク質のアミノ酸配列を有する。本明細書で使用される「ＢＮＩＰ３」という用語は、特に、配列番号１のアミノ酸配列を有するマウスＢＣＬ－２アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質－３を指す。したがって、ＢＮＩＰ３断片は、アミノ酸位置１３～２０の配列を含む、配列番号１のアミノ酸配列の連続する部分と同一であるアミノ酸配列を有し得る。例えば、ＢＮＩＰ３断片は、配列番号１の１～２０位のアミノ酸配列を有し得る。ある特定の実施形態において、ＢＮＩＰ３断片は、配列番号１の４～２０位、配列番号１の１１～２０位、配列番号１の１２～２０位および配列番号１の１３～２０位からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。具体的な実施形態において、ＢＮＩＰ３断片は、配列番号１の１３～２０位のアミノ酸配列からなる。これらの実施形態において、ＢＮＩＰ３断片は、特に、さらなるアミノ酸残基を一切含まない。マウスＢＮＩＰ３の１３～２０位のアミノ酸配列は、ヒトＢＮＩＰ３（配列番号２）の７３～８０位のアミノ酸配列と同一である。本明細書で言及されるマウスＢＮＩＰ３のアミノ酸配列の代わりに、ヒトＢＮＩＰ３の対応するアミノ酸配列も使用することができる。
さらなる実施形態において、ＢＮＩＰ３断片は、ＢＮＩＰ３に由来するアミノ酸配列を有する。標的アミノ酸配列が、その全長にわたって、参照アミノ酸配列の対応する部分と、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の相同性または同一性を共有する場合に、標的アミノ酸配列は、参照アミノ酸配列に「由来」し、または参照アミノ酸配列に「対応」する。特定の実施形態において、参照アミノ酸配列に「由来」する、または参照アミノ酸配列に「対応」する標的アミノ酸配列は、その全長にわたって、参照アミノ酸配列の対応する部分と１００％相同である、または特に１００％同一である。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「相同性」または「同一性」は、好ましくは、本発明によれば、参照配列の全長にわたって、または相同性もしくは同一性が定義される配列に対応する参照配列の対応する部分の全長にわたって決定される。特に、ＢＮＩＰ３断片は、上記のＢＮＩＰ３断片の１つに由来し得る。例えば、ＢＮＩＰ３断片は、配列番号１の１～２０位、配列番号１の４～２０位、配列番号１の１１～２０位、配列番号１の１２～２０位および配列番号１の１３～２０位からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％同一、特に少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有し得る。具体的な実施形態において、ＢＮＩＰ３断片は、配列番号１の１３～２０位と少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、ＢＮＩＰ３断片は、ＢＮＩＰ３の１３～２０位と比較して１、２または３個のアミノ酸置換を必要に応じて含むＢＮＩＰ３の１３～２０位を含む。ＢＮＩＰ３は、特に配列番号１のアミノ酸配列を有する。これらの実施形態において、１、２または３個のアミノ酸置換は、好ましくは、ＢＮＩＰ３の１３、１５、１７、１８、１９および２０位、特にＢＮＩＰ３の１５、１７および１９位に対応する位置の１またはそれより多くに存在する。特に、アミノ酸置換は、
（ｉ）ＢＮＩＰ３の１５位のグルタミン酸のフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、チロシン、システイン、ヒスチジン、アルギニンまたはトレオニンへの置換、
（ｉｉ）ＢＮＩＰ３の１７位のヒスチジンのバリンへの置換、および
（ｉｉｉ）ＢＮＩＰ３の１９位のセリンのチロシン、システイン、フェニルアラニンまたはヒスチジンへの置換、
からなる群から選択される。
（ｉ）ＢＮＩＰ３の１５位のグルタミン酸のフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、チロシン、システイン、ヒスチジン、アルギニンまたはトレオニンへの置換、
（ｉｉ）ＢＮＩＰ３の１７位のヒスチジンのバリンへの置換、および
（ｉｉｉ）ＢＮＩＰ３の１９位のセリンのチロシン、システイン、フェニルアラニンまたはヒスチジンへの置換、
からなる群から選択される。
特定の実施形態において、ＢＮＩＰ３断片は、ＢＮＩＰ３の１３～２０位と比較して１または２個のアミノ酸置換を含むＢＮＩＰ３の１３～２０位を含み、アミノ酸置換は、
（ｉ）ＢＮＩＰ３の１５位のグルタミン酸のヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリンまたはチロシンへの置換、および
（ｉｉ）ＢＮＩＰ３の１９位のセリンのチロシン、システインまたはフェニルアラニンへの置換、
からなる群から選択される。
（ｉ）ＢＮＩＰ３の１５位のグルタミン酸のヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリンまたはチロシンへの置換、および
（ｉｉ）ＢＮＩＰ３の１９位のセリンのチロシン、システインまたはフェニルアラニンへの置換、
からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、ＢＮＩＰ３の１９位のセリンは、チロシン、システインまたはフェニルアラニン、特にフェニルアラニンに置換されている。
具体的な実施形態において、ＢＮＩＰ３断片は、配列番号３～１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、または配列番号３～１７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。特別な実施形態において、ＢＮＩＰ３断片は、配列番号７または８、特に８のアミノ酸配列からなる。
ＢＮＩＰ３断片は、ＢＮＩＰ３に由来するさらなるアミノ酸残基を必要に応じて含み得る。特に、ＢＮＩＰ３断片全体は、ＢＮＩＰ３の連続するアミノ酸配列に由来する。特に、ＢＮＩＰ３断片全体は、ＢＮＩＰ３のアミノ酸位置１～２０、またはＢＮＩＰ３の少なくとも１３～２０位を含むその一部に由来する。ＢＮＩＰ３断片は、ＢＮＩＰ３の対応する部分と同一のアミノ酸配列を有し得る、または１～８個のアミノ酸置換、特に１～６個のアミノ酸置換を有し得る。ＢＮＩＰ３断片は、例えば、ＢＮＩＰ３の１２～２０位と比較して１、２、３もしくは４個のアミノ酸置換を必要に応じて含むＢＮＩＰ３の１２～２０位を含み得るか、またはＢＮＩＰ３断片は、ＢＮＩＰ３の４～２０位と比較して１、２、３、４、５もしくは６個のアミノ酸置換を必要に応じて含むＢＮＩＰ３の４～２０位を含み得るか、またはＢＮＩＰ３断片は、ＢＮＩＰ３の１～２０位と比較して１、２、３、４、５もしくは６個のアミノ酸置換を必要に応じて含むＢＮＩＰ３の１～２０位を含み得る。特に、これらのアミノ酸置換の１、２または３つは１３～２０位にあり、残りのアミノ酸置換は１～１２位にある。これらの実施形態において、アミノ酸置換は、好ましくは、ＢＮＩＰ３の４、１１、１２、１３、１５、１７、１８、１９および２０位、特にＢＮＩＰ３の４、１１、１２、１５、１７および１９位に対応する位置の１またはそれより多くに存在する。
具体的な実施形態において、ＢＮＩＰ３断片は、配列番号１８～３０および７０～７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
置換されたアミノ酸残基は、特に、別の天然に存在するアミノ酸残基に置換される。本明細書で使用される「置換」という語句は、そのようなポリペプチドが必要な活性を発揮することを条件として、誘導体化されていない残基に代えて化学的に誘導体化された残基を使用することも含む。本明細書で使用される「誘導体」という用語は、官能性側鎖の反応によって化学的に誘導体化された１またはそれを超える残基を有するペプチドを指す。このような誘導体化された分子としては、例えば、アミン塩酸塩、ｐ－トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ－ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するように、遊離のアミノ基が誘導体化されている分子が挙げられる。遊離のカルボキシル基は、塩、メチルおよびエチルエステルもしくはその他の種類のエステルまたはヒドラジドを形成するように誘導体化され得る。遊離のヒドロキシル基は、Ｏ－アシルまたはＯ－アルキル誘導体を形成するように誘導体化され得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、Ｎ－ｉｍ－ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化され得る。２０個の標準アミノ酸の１またはそれを超える天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドも誘導体として含まれる。例えば、プロリンを４－ヒドロキシプロリンに置換し得る；リジンを５ヒドロキシリジンに置換し得る；ヒスチジンを３－メチルヒスチジンに置換し得る；セリンをホモセリンに置換し得る；リジンをオルニチンに置換し得る。
いくつかの実施形態において、「置換」という用語は、２またはそれを超える置換されたアミノ酸残基の連結を含む。特に、２またはそれを超えるアミノ酸残基は、架橋可能な部分で置換され得および／または連結され得、それぞれは、置換された、必要に応じてヘテロ－低級アルキル、特に必要に応じて置換された、必要に応じてヘテロ－メチル、エチル、プロピルおよびブチルから選択される追加のα－炭素置換を必要に応じて含む。さらに、２つの置換されたアミノ酸残基は、環および尾部環状ペプチドを生成するために、ジスルフィド架橋を介して接続されたホモシステインで置換され得る。あるいは、２またはそれを超える置換されたアミノ酸残基は、リンカーによって置き換えられ得る。この点における適切なリンカーとしては、例えば、ラクタムペプチドを形成する－（ＣＨ２）ｎＯＮＨＣＯＸ（ＣＨ２）ｍ－（式中、ＸはＣＨ２、ＮＨまたはＯであり、ｍおよびｎは整数１～４である）；エーテルペプチドを形成する－ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨＣＨＣＨ２ＯＣＨ２－；またはステープルドペプチドを形成する－（ＣＨ２）ｎＣＨＣＨ（ＣＨ２）ｍ－が挙げられる。
ある特定の実施形態において、ＢＮＩＰ３断片は、ＢＮＩＰ３の配列に関して置換Ｅ１５Ｙ、Ｓ１９ＦおよびＳ１９Ｙの少なくとも１つを含む。
細胞取り込みシグナル
細胞取り込みシグナル
本発明によるペプチド内の細胞取り込みシグナルは、特に、標的細胞中へのペプチドの取り込みを媒介することができる。特に、細胞取り込みシグナルは、哺乳動物細胞、特にヒト細胞中への取り込みを媒介することができる。
ある特定の実施形態において、細胞取り込みシグナルはペプチドである。特に、細胞取り込みシグナルは、細胞透過性ペプチドまたはタンパク質形質導入ドメインである。細胞取り込みシグナルは、５～３０アミノ酸、特に８～２０アミノ酸または１０～１６アミノ酸の長さを有し得る。
細胞取り込みシグナルは、例えば、親水性ペプチドまたは両親媒性ペプチドであり得る。細胞取り込みシグナルの例としては、ＨＩＶのＴＡＴタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン（特に、アミノ酸残基４８～５９）、ペネトラチン、アンテナペディアＰＴＤ、ＳｙｎＢ１、ＳｙｎＢ３、ＰＴＤ－４、ＰＴＤ－５、ＦＨＶコート－（３５～４９）、ＢＭＶ Ｇａｇ－（７～２５）、ＨＴＬＶ－ＩＩ Ｒｅｘ－（４～１６）、Ｄ－Ｔａｔ、Ｒ９－Ｔａｔ、トランスポータン、ＭＡＰ、ＳＢＰ、ＦＢＰ、ＭＰＧ、ＭＰＧ（ΔＮＬＳ）、Ｐｅｐ－１、Ｐｅｐ－２、ポリアルギニンおよびポリリジンが挙げられる。ある特定の実施形態において、細胞取り込みシグナルは、配列番号３１～５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドである。
細胞取り込みシグナルは、天然に存在するアミノ酸残基から構成され得、必要に応じて、本明細書に記載の化学的に誘導体化されたアミノ酸残基を含むペプチド誘導体であり得る。さらに、細胞取り込みシグナルはペプチド模倣物であり得、またはＤ－レトロ－インベルソ配列を含み得る。ある特定の実施形態において、細胞取り込みシグナルは、本明細書に開示される細胞透過性ペプチドのＤ－レトロ－インベルソ配列を含む。
ペプチド
ペプチド
本発明によるペプチドは、細胞取り込みシグナルとＢＮＩＰ３断片とを含む。本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という表現は、その字義通りの意味に加えて、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」という表現も含み、これらの表現を具体的に指す。したがって、「含む」という表現は、具体的に列挙された要素を「含む」主題がさらなる要素を包含し得るおよび／または実際に包含する実施形態のみならず、具体的に列挙された要素を「含む」主題がさらなる要素を含まない実施形態も指す。同様に、「有する（ｈａｖｅ）」という表現は、「含む」という表現として理解されるべきであり、「から本質的になる」および「からなる」という表現も含み、これらの表現を具体的に指す。「から本質的になる」という用語は、可能な場合には、特に、主題がその要素から本質的になる具体的に列挙された要素に加えて、主題が２０％もしくはそれ未満、特に１５％もしくはそれ未満、１０％もしくはそれ未満または特に５％もしくはそれ未満のさらなる要素を含む実施形態を指す。
ある特定の実施形態において、本発明によるペプチドは、細胞取り込みシグナルとＢＮＩＰ３断片からなる。
さらなる実施形態において、本発明によるペプチドは、細胞取り込みシグナルと、ＢＮＩＰ３断片と、細胞取り込みシグナルとＢＮＩＰ３断片との間のリンカーとを含む。特に、本発明によるペプチドは、細胞取り込みシグナルと、ＢＮＩＰ３断片と、細胞取り込みシグナルとＢＮＩＰ３断片との間のリンカーと、からなる。リンカーは、アミノ酸から構成されるペプチドリンカーまたは化学的リンカーであり得る。リンカーは、特に、小さなサイズを有する。例えば、リンカーは、１０個もしくはそれ未満のアミノ酸、例えば８個もしくはそれ未満、６個もしくはそれ未満または５個もしくはそれ未満のアミノ酸を有するペプチドリンカーである。化学的リンカーは、例えば、１，５００Ｄａもしくはそれ未満、例えば１，０００Ｄａもしくはそれ未満、７５０Ｄａもしくはそれ未満または５００Ｄａもしくはそれ未満の分子量を有する。細胞取り込みシグナルがペプチド部分である実施形態において、リンカーは、好ましくはペプチドリンカーである。
ある特定の実施形態において、本発明によるペプチドは、４０アミノ酸またはそれ未満の長さを有する。具体的な実施形態において、本発明によるペプチドは、３５アミノ酸またはそれ未満、特に３０アミノ酸またはそれ未満の長さを有する。本発明によるペプチドは、例えば、２５アミノ酸またはそれ未満、例えば約２０アミノ酸の長さを有し得る。より短いペプチドは、より容易に製造し、製剤化し、取り扱うことができるので、特に望ましい。したがって、本発明によるペプチドは、好ましくは、３５アミノ酸またはそれ未満、特に２５アミノ酸またはそれ未満の長さを有する。これは、特に、細胞取り込みシグナルがペプチド部分である実施形態を指す。具体的な実施形態において、本発明によるペプチドは、１０，０００Ｄａもしくはそれ未満、特に５，０００Ｄａもしくはそれ未満、４，０００Ｄａもしくはそれ未満または３，０００Ｄａもしくはそれ未満の分子量を有する。
ある特定の実施形態において、本発明によるペプチドは、配列番号５１～６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
一般に、本発明によるペプチドは、天然に存在するＬ－アミノ酸から構成される。ある特定の実施形態において、ペプチドは、人工のアミノ酸も含み得る。例えば、ペプチドは、１またはそれを超える、Ｄ－アミノ酸、Ｅ－β－ホモアミノ酸および／もしくはＮ－メチル化されたアミノ酸を含み得る、またはこれらから構成され得る。ある特定の実施形態において、細胞取り込みシグナルおよび／またはＢＮＩＰ３断片は、Ｄ－レトロ－インベルソ配列、特に本明細書に記載されているアミノ酸配列のＤ－レトロ－インベルソ配列である。例えば、ペプチドは、ＱＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ－ＮＳＦＨＬＥＶＷＳＧＱＬＮＥＥＧＳＱＳＭ（配列番号６８）またはＱＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ－ＮＳＦＨＬＥＶＷ（配列番号６９）のＤ－レトロ－インベルソ配列を有する。
ある特定の実施形態において、ペプチドは、アセチル化、アシル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、硫酸化、ニトロソ化、グリコシル化、スオミル化（ｓｕｏｍｙｌａｔｅｄ）、ヒドロキシル化、アルキル化および／または異性化される。例えば、ペプチドは、Ｎ末端の、アセチル、ホルミル、ミリストル、パルミトイル、カルボキシルもしくは２－フロシル基、および／またはＣ末端の、ヒドロキシル、アミド、エステルもしくはチオエステル基を含み得る。さらに、ペプチドは環化され得る。
具体的な実施形態において、本発明によるペプチドは、本明細書に記載されているペプチドのいずれかのペプチド模倣物である。本明細書で使用される「ペプチド模倣物」という用語は、分子間の相互作用においてペプチドの代替物として機能する構造物を指す。ペプチド模倣物には、アミノ酸および／またはペプチド結合を含んでもよくまたは含まなくてもよいが、ＢＮＩＰ３ペプチドの構造的および機能的特徴を保持する合成構造物が含まれる。ペプチド模倣物には、他の機能的要素を有するより大きな分子中にペプチドを組み込む分子、ペプトイド、オリゴペプトイド、および本発明のペプチドに対応するアミノ酸のすべての可能な配列を表す設計された長さのペプチドを含有するペプチドライブラリも含まれる。これらのペプチドのすべておよびこれらのペプチドと実質的に相同な、相補的な、またはその他機能的にもしくは構造的に等価な分子が、本発明のために使用され得る。
ある特定の実施形態において、本発明によるペプチドは、ナノ粒子をさらに含む組成物中に存在する。特に、ペプチドはナノ粒子内に存在する。ナノ粒子は、ペプチドを被包するのに適した任意のナノ粒子であり得る。例示的なナノ粒子としては、リポソーム、ナノエマルジョン、固液ナノ粒子、ナノ構造化された脂質担体、ポリマーナノ粒子およびデンドリマーが挙げられる。ある特定の実施形態において、ナノ粒子は、本発明のペプチドを所望の細胞または組織に標的化することを可能にする、ペプチド、リガンドまたは抗体などの標的化分子をナノ粒子の外面上に含む。
具体的な実施形態において、ナノ粒子は、標的細胞中への本発明によるペプチドの取り込みを可能にする。これらの実施形態において、ナノ粒子は、細胞取り込みシグナルの役割を果たし、特に細胞取り込みシグナルであり得る、または細胞取り込みシグナルを置き換え得る。したがって、本発明はまた、本明細書で定義されるＢＮＩＰ３断片を含むナノ粒子も提供する。
ペプチドの治療的使用
ペプチドの治療的使用
本発明は、ＢＮＩＰ３、ＢＡＸおよびミトコンドリアの個々の活性および経路間コミュニケーションを阻害することが望ましい、対象中の疾患または状態を処置する方法、化合物および組成物であって、対象中の前記疾患または状態を処置するのに有効な量の前記化合物を前記対象に投与することを含む、方法、化合物および組成物を提供する。
本発明は、本発明によるペプチドを含む医薬組成物も提供する。特に、医薬組成物は、単位投与量、投与可能形態で本発明によるペプチドを含む。本発明はさらに、細胞損傷および細胞死を阻害する方法であって、細胞損傷および細胞死を阻害することを必要とするヒトに有効量の本発明によるペプチドを投与することを含む、方法を提供する。本発明は、医薬における、特に、それぞれ、再灌流関連および／またはミトコンドリア関連障害ならびにがん治療誘発性心毒性の処置およびこれらの予防における、本発明によるペプチドまたは本発明によるペプチドを含む医薬組成物の使用も提供する。
本発明は、あたかもそれぞれの組み合わせが苦労して別々に列挙されているかのように、列挙された特定の実施形態のすべての組み合わせを含む。
本発明は、対象においてＢＮＩＰ３を阻害する方法であって、ＢＮＩＰ３を、ＢＮＩＰ３を阻害するのに有効な量で、本明細書に開示されるペプチドまたは医薬組成物のいずれかの１またはそれより多くと接触させることを含む、方法も提供する。好ましくは、ＢＮＩＰ３は対象内にあり、１またはそれを超える前記ペプチドまたは組成物は対象に投与される。
本発明は、対象においてＢＡＸを阻害する方法であって、ＢＡＸを、ＢＡＸを阻害するのに有効な量で、本明細書に開示されるペプチドまたは医薬組成物のいずれかの１またはそれより多くと接触させることを含む、方法も提供する。好ましくは、ＢＡＸは対象内にあり、１またはそれを超える前記ペプチドまたは組成物は対象に投与される。
本発明は、対象においてＢＮＩＰ３／ＢＡＸダイマーおよび／またはオリゴマー活性を阻害する方法であって、ＢＮＩＰ３／ＢＡＸダイマーおよび／またはオリゴマーを、ＢＮＩＰ３／ＢＡＸダイマー／オリゴマー活性を阻害するのに有効な量で、本明細書に開示されるペプチドまたは医薬組成物のいずれかの１またはそれより多くと接触させることを含む、方法も提供する。好ましくは、ＢＮＩＰ３およびＢＡＸは対象内にあり、１またはそれを超える前記ペプチドまたは組成物は対象に投与される。
本発明は、対象中の再灌流関連および／またはミトコンドリア関連障害を処置する方法であって、本発明によるペプチドまたは医薬組成物を治療有効量で対象に投与することを含む、方法も提供する。
本発明は、対象中のミトコンドリア誘発性アポトーシスまたはネクローシスによる組織損傷を処置または予防する方法であって、本発明によるペプチドまたは医薬組成物を治療有効量で対象に投与することを含む、方法も提供する。ペプチドは、細胞死または損傷の発生前、発生中および／または発生後に対象に投与され得る。
ペプチドまたは医薬組成物が投与され、処置されている対象は、例えば、低酸素および／または虚血の細胞；心臓、脳、肝臓、腎臓、腸、四肢の虚血、四肢の血管閉塞；心臓、脳、肝臓および腎臓、腸、四肢の再灌流傷害；心筋梗塞および再灌流傷害；化学療法、放射線療法、標的療法および免疫療法誘発性心毒性；アテローム性動脈硬化症；心不全；心臓、肝臓、腎臓移植；動脈瘤；慢性肺疾患；虚血性心疾患；高血圧；肺高血圧症；塞栓；血栓症；心筋症；脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）；神経変性疾患または障害；免疫学的障害；腎低酸素症；肝炎；肝疾患；腎疾患；小脳変性；臓器移植拒絶、ならびに細胞死および／または組織損傷を伴う疾患または障害からなる群から選択される疾患または状態を有し得る。ある特定の実施形態において、対象は、特に血管閉塞、特に心筋梗塞、虚血性脳卒中、急性腎傷害、外傷、循環停止および臓器移植中の虚血後に、虚血、再灌流および／またはミトコンドリア関連障害を有する。さらなる実施形態において、対象は、がん治療誘発性心毒性、例えば化学療法、放射線療法、免疫療法および／または標的療法によって誘発される心毒性を罹患している。または、対象は、任意の種類のがん治療を受けてもよく、治療は心毒性の予防のために適用され得る。化学療法は、特に、ドキソルビシンによる治療などのアントラサイクリンに基づく化学療法を指す。具体的な実施形態において、対象は、ドキソルビシンを用いた化学療法などのアントラサイクリンに基づく化学療法によって誘発される心毒性を罹患している。
再灌流関連障害は、一般に、再灌流傷害を伴う障害を指し得る。再灌流傷害は、例えば、虚血の期間後に血液供給が組織に戻るときに引き起こされる組織損傷であり、循環の回復は、正常な機能の回復ではなく酸化的ストレスの誘導を介して炎症および酸化的損傷をもたらす。本発明は、したがって、対象中の再灌流傷害を処置する方法であって、本発明によるペプチドまたは医薬組成物を治療有効量で対象に投与することを含む、方法を提供する。
本発明は、対象中の急性心筋梗塞、心筋再灌流傷害または心不全を処置する方法であって、急性心筋梗塞、心筋再灌流傷害または心不全を処置することを必要とする対象中の急性心筋梗塞、心筋再灌流傷害または心不全を処置するのに有効な量で本明細書に開示されるペプチドまたは医薬組成物の１またはそれより多くを対象に投与することを含む方法も提供する。好ましくは、１またはそれを超えるペプチドまたは医薬組成物は、対象において、それぞれＢＮＩＰ３、ＢＡＸまたはＢＮＩＰ３／ＢＡＸダイマー／オリゴマー活性を阻害するのに有効な量で投与される。
ある特定の実施形態において、処置は、再灌流およびミトコンドリア関連傷害の緩和および／または予防を含む。さらなる実施形態において、処置は、がん治療誘発性心毒性の緩和および／または予防を含む。
対象は、例えば哺乳動物であり得、好ましくはヒトである。
本明細書で使用される場合、疾患または障害を「処置している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置する（ｔｒｅａｔ）」とは、処置されている疾患または障害の徴候または症候を緩和または改善または除去することを意味する。ペプチドまたは組成物が疾患または障害の発症前または発症時に対象に投与される場合、ペプチドまたは組成物は、疾患または障害の重症度を抑制または軽減することができる。例えば、対象へのペプチドまたは組成物の投与は、化学療法、放射線療法、標的療法または免疫療法誘発性心毒性などのがん治療誘発性心毒性の重症度を抑制または軽減することができる。これらの実施形態において、本発明によるペプチドは、がん治療の前、間および／または後に投与することができる。ペプチドの投与は、予防的および／または治療的投与を含むことができる。
本発明のペプチドおよび組成物は、当技術分野で公知の投与経路を使用して対象に投与することができる。投与は、全身的であってもよく、または（ｏｆ）特定の部位に局在化させてもよい。投与経路には、静脈内、筋肉内、心臓内、髄腔内または皮下注射、経口または直腸投与、および特定の部位への注射が含まれるが、これらに限定されない。
具体的な実施形態において、本発明によるペプチドまたは医薬組成物は、血液供給障害、虚血または血管閉塞の発生中または発生後に、特に血管閉塞によって影響を受けた組織の再灌流の前に、対象に投与される。ある特定の実施形態において、ペプチドまたは医薬組成物は、再灌流前６時間以内、特に再灌流前４時間以内、２時間以内または１時間以内に投与される。具体的な実施形態において、ペプチドまたは医薬組成物は、再灌流前４５分以内に、特に３０分以内に投与される。
本明細書に記載された様々な要素のすべての組み合わせは、本明細書に別段の指示がない限り、またはその他文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明の範囲内である。
この方法は、有効量の本発明によるペプチドを細胞中で発現させることを含み得、アポトーシス、ネクローシスまたはこれらの組み合わせは、対照細胞と比較して前記細胞において改変される。発現させることは、例えば、ペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞中に導入することを含み得る。細胞は、エクスビボまたはインビボであり得、心臓細胞であり得る。アポトーシス、ネクローシスまたはこれらの組み合わせは、細胞において減少し得る。
本発明は、有効量の、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を、投与を必要とする対象に投与することを含む方法であって、アポトーシス、ネクローシスまたはこれらの組み合わせは、前記対象において増加する、方法を提供する。投与は、心臓組織、脳組織、肝臓組織および腎臓組織へのポリヌクレオチドの送達を含み得る。対象は、急性梗塞、低酸素、虚血、脳卒中、または血管疾患から選択される疾患の徴候を有し得る、またはそのリスクがある。本方法は、疾患の徴候の軽減をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかである任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指し、二本鎖および一本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む。ポリヌクレオチドは、天然源から直接得ることができ、または組換え、酵素的もしくは化学的技術を用いて調製することができる。ポリヌクレオチドのトポロジーは、直鎖状または環状であり得る。ポリヌクレオチドは、例えば、発現ベクターもしくはクローニングベクターなどのベクターの一部、または断片であり得る。ポリヌクレオチドは、例えば、コード領域および調節領域などの非コード領域を含む、異なる機能を有するヌクレオチド配列を含み得る。
本明細書中で使用される場合、「遺伝子」とは、ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を指す。遺伝子は、その５’末端に転写開始部位を有し、その３’末端に転写ターミネーターを有する。本明細書中で使用される場合、「標的遺伝子」とは、その発現が本明細書中に記載されるようなポリヌクレオチドによって阻害される特異的遺伝子を指す。本明細書で使用される場合、「標的ｍＲＮＡ」は、標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡである。別段の明記がない限り、標的遺伝子は、エクソンの異なる組み合わせの使用によって区別される複数のｍＲＮＡをもたらすことができる。このような関連するｍＲＮＡは、遺伝子のスプライスバリアントまたは転写物バリアントと呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「コード領域」および「コード配列」という用語は互換的に使用され、ポリペプチドをコードし、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にコードされたポリペプチドを発現するヌクレオチド配列を指す。コード領域の境界は、一般に、その５’末端の翻訳開始コドンおよびその３’末端の翻訳停止コドンによって決定される。「調節配列」は、調節配列が機能的に連結されているコード配列の発現を調節するヌクレオチド配列である。調節配列の非限定的な例としては、プロモーター、エンハンサー、転写開始部位、翻訳開始部位、翻訳停止部位および転写ターミネーターが挙げられる。「機能的に連結された」という用語は、構成要素がその意図された様式で機能することができる関係性にあるような、構成要素の並置を表す。調節配列の適合する条件下でコード領域の発現が達成されるように調節配列が結合されている場合に、調節配列はコード領域に「機能的に連結」されている。
コード領域を含むポリヌクレオチドは、コード領域の片側または両側に隣接する異種ヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される場合、「異種ヌクレオチド」は、野生型細胞中に存在するコード領域に通常、隣接して存在しないヌクレオチドを指す。例えば、野生型微生物中に存在し、ポリペプチドをコードするコード領域には、相同配列が隣接しており、コード領域に隣接する任意の他のヌクレオチド配列は、異種であると考えられる。異種ヌクレオチドの例としては、調節配列が挙げられるが、これに限定されない。典型的には、異種ヌクレオチドは、当業者に周知の標準的な遺伝的および／または組換え方法論の使用によって本発明のポリヌクレオチド中に存在する。本発明のポリヌクレオチドは、適切なベクター中に含まれ得る。本明細書中に記載されるポリヌクレオチドの片側または両側に隣接する異種ヌクレオチドの存在は、ヒトの操作に起因する。
本明細書で使用される「相補物」および「相補的」という用語は、２つの一本鎖ポリヌクレオチドが互いと塩基対形成する能力を指し、ポリヌクレオチドの一方の鎖上のアデニンは、第２のポリヌクレオチドの鎖上のチミンまたはウラシルと塩基対形成し、ポリヌクレオチドの一方の鎖上のシトシンは、第２のポリヌクレオチドの鎖上のグアニンと塩基対形成する。１つのポリヌクレオチド中のヌクレオチド配列が第２のポリヌクレオチド中のヌクレオチド配列と塩基対を形成することができる場合、２つのポリヌクレオチドは互いに相補的である。例えば、５’－ＡＴＧＣと５’－ＧＣＡＴは相補的である。本明細書で使用される「実質的な相補物」という用語およびその関連語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で指定のポリヌクレオチドに選択的にハイブリッド形成することができるポリヌクレオチドを指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、多数のｐＨ、塩および温度条件下で行うことができる。ｐＨは、６～９、好ましくは６．８～８．５を変動することができる。塩濃度は、０．１５Ｍのナトリウム～０．９Ｍのナトリウムを変動することができ、イオン強度がナトリウムについて指定されたものと同等である限り、他のカチオンを使用することができる。ハイブリダイゼーション反応の温度は、３０℃～８０℃、好ましくは４５℃～７０℃を変動することができる。さらに、室温または室温に近い温度などのより低い温度での特異的ハイブリダイゼーションを促進するために、他の化合物をハイブリダイゼーション反応に添加することができる。温度要件を低下させるために想定される化合物としては、ホルムアミドがある。したがって、ポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドの間でハイブリダイゼーションが起これば、ポリヌクレオチドは、通例、第２のポリヌクレオチドに対して実質的に相補的である。本明細書中で使用される場合、「特異的ハイブリダイゼーション」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での２つのポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを指す。
コード領域を含むポリヌクレオチドは、コード領域の片側または両側に隣接する異種ヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される場合、「異種ヌクレオチド」は、野生型細胞中に存在するコード領域に通常、隣接して存在しないヌクレオチドを指す。例えば、野生型微生物中に存在し、ポリペプチドをコードするコード領域には、相同配列が隣接しており、コード領域に隣接する任意の他のヌクレオチド配列は、異種であると考えられる。異種ヌクレオチドの例としては、調節配列が挙げられるが、これに限定されない。典型的には、異種ヌクレオチドは、当業者に周知の標準的な遺伝的および／または組換え方法論の使用によって本発明のポリヌクレオチド中に存在する。本発明のポリヌクレオチドは、適切なベクター中に含まれ得る。本明細書中に記載されるポリヌクレオチドの片側または両側に隣接する異種ヌクレオチドの存在は、ヒトの操作に起因する。
本発明は、さらに、細胞損傷または細胞死を予防するための方法であって、前記細胞を本発明によるペプチドと接触させることを含む、方法を提供する。この方法は、インビトロまたはインビボで実施され得る、特にエクスビボで実施される。
さらに、本発明は、再灌流傷害および／またはミトコンドリア関連障害および／またはがん治療誘発性心毒性の予防に適した化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）１またはそれを超える候補化合物を提供することと、
（ｉｉ）前記候補化合物がＢＮＩＰ３とＢＡＸの結合に干渉する能力を決定することと、
（ｉｉｉ）ＢＮＩＰ３とＢＡＸの結合に干渉する候補化合物を選択することと、
を含む、方法を対象とする。
（ｉ）１またはそれを超える候補化合物を提供することと、
（ｉｉ）前記候補化合物がＢＮＩＰ３とＢＡＸの結合に干渉する能力を決定することと、
（ｉｉｉ）ＢＮＩＰ３とＢＡＸの結合に干渉する候補化合物を選択することと、
を含む、方法を対象とする。
候補化合物は、特にペプチドおよび小分子化合物を含む任意の適切な化合物であり得る。
［実施例１］ ＢＮＩＰ３は、代表的なＩ／Ｒ傷害の治療上の標的である
ネクローシス性心筋細胞死とアポトーシス性心筋細胞死の組み合わせは、再灌流傷害の初期段階の顕著な特徴である。ミトコンドリアが、両過程において主要な役割を果たしている。ＢＨのみのＢＣＬ２ファミリーメンバーであるＢＮＩＰ３は、細胞培養および単離されたラット心臓におけるミトコンドリア駆動性のネクローシス性およびアポトーシス性細胞死カスケードの活性化因子である可能性がある３１、３２、３６～３８。ＢＮＩＰ３は、急性心筋梗塞後の左室リモデリングおよび駆出率が保存された心不全への関与が以前より示唆されている３３、３９、４０。Ｉ／Ｒ傷害におけるＢＮＩＰ３の関与およびＢＮＩＰ３が治療的介入のための魅力的な標的となるかどうかを調べるために、臨床的に適切なインビボモデルにおいて左前下行冠動脈の閉塞後に、野生型マウスおよびＢＮＩＰ３欠損マウスを２４時間の再灌流に供した４１～４４（図１Ａ）。非罹患ゾーンから罹患領域を描出するために、エバンスブルー色素を大動脈および冠動脈中に注入した。生存不可能な心筋、リスクゾーン内の梗塞領域を画定するために、心臓切片をトリフェニルテトラゾリウムクロリドによって染色した（図１Ｂ）。十分に確立されたＢＮＩＰ３のドミナントネガティブ阻害剤を使用した単離されたラット心臓における以前の研究３１と一致して、ＢＮＩＰ３の遺伝的除去は、野生型マウスと比較して梗塞サイズを４６％有意に減少させた（図１Ｃ）。これに対応して、ＢＮＩＰ３欠損マウスへのＢＮＩＰ３の復帰は、野生型マウスと同等の梗塞サイズを用量依存的に引き起こし、ＢＮＩＰ３の遺伝的欠失の起こり得る副作用を取り除いた（図１Ｃ）。これらの結果は、ＢＮＩＰ３がインビボでの梗塞の進展において重要な役割を果たすことを示している。
［実施例２］ ＢＮＩＰ３は、Ｉ／Ｒ傷害におけるＢＡＸ誘導性細胞死の媒介物質である
ネクローシス性心筋細胞死とアポトーシス性心筋細胞死の組み合わせは、再灌流傷害の初期段階の顕著な特徴である。ミトコンドリアが、両過程において主要な役割を果たしている。ＢＨのみのＢＣＬ２ファミリーメンバーであるＢＮＩＰ３は、細胞培養および単離されたラット心臓におけるミトコンドリア駆動性のネクローシス性およびアポトーシス性細胞死カスケードの活性化因子である可能性がある３１、３２、３６～３８。ＢＮＩＰ３は、急性心筋梗塞後の左室リモデリングおよび駆出率が保存された心不全への関与が以前より示唆されている３３、３９、４０。Ｉ／Ｒ傷害におけるＢＮＩＰ３の関与およびＢＮＩＰ３が治療的介入のための魅力的な標的となるかどうかを調べるために、臨床的に適切なインビボモデルにおいて左前下行冠動脈の閉塞後に、野生型マウスおよびＢＮＩＰ３欠損マウスを２４時間の再灌流に供した４１～４４（図１Ａ）。非罹患ゾーンから罹患領域を描出するために、エバンスブルー色素を大動脈および冠動脈中に注入した。生存不可能な心筋、リスクゾーン内の梗塞領域を画定するために、心臓切片をトリフェニルテトラゾリウムクロリドによって染色した（図１Ｂ）。十分に確立されたＢＮＩＰ３のドミナントネガティブ阻害剤を使用した単離されたラット心臓における以前の研究３１と一致して、ＢＮＩＰ３の遺伝的除去は、野生型マウスと比較して梗塞サイズを４６％有意に減少させた（図１Ｃ）。これに対応して、ＢＮＩＰ３欠損マウスへのＢＮＩＰ３の復帰は、野生型マウスと同等の梗塞サイズを用量依存的に引き起こし、ＢＮＩＰ３の遺伝的欠失の起こり得る副作用を取り除いた（図１Ｃ）。これらの結果は、ＢＮＩＰ３がインビボでの梗塞の進展において重要な役割を果たすことを示している。
［実施例２］ ＢＮＩＰ３は、Ｉ／Ｒ傷害におけるＢＡＸ誘導性細胞死の媒介物質である
死促進性ＢＣＬ－２ファミリーメンバーであるＢＡＸは、エフェクタータンパク質として、ミトコンドリア依存性ネクローシスとアポトーシスの交点に位置しているようである５。このため、サイトゾルからミトコンドリアへのＢＡＸの転位は、重要な段階である３７、４５、４６。本発明者らは最近、インビボにおいて心筋細胞中のＭＯＭ中で起こるＢＡＸとＢＮＩＰ３との基礎的相互作用を実証した３５。細胞死における最も重要な段階としてのミトコンドリアへのＢＡＸの転位がＩ／Ｒにおいて起こり、ＢＮＩＰ３に依存するかどうかを決定するために、ミトコンドリアのＢＡＸおよびＢＮＩＰ３濃度の最初の変化を調査した。血管閉塞後の１０分間の再灌流後に、ＭＯＭ中のＢＡＸのレベルは、ＢＮＩＰ３のミトコンドリア濃度の増加と共に著しく増加する（図２ＡおよびＢ）。共免疫沈降により、ＢＮＩＰ３およびＢＡＸがＭＯＭ中でヘテロ二量体を形成することが明らかになった（図２Ｃ）。次に、ＢＮＩＰ３欠損マウスを利用することによって、本発明者らは、ＢＮＩＰ３が再灌流傷害中のこの転位のためのＢＡＸの上流媒介物質であるかどうかを調べた。ミトコンドリアのＢＡＸの増加は、ＢＮＩＰ３の遺伝的除去下での再灌流の初期段階内には観察されず、ＢＮＩＰ３の直接的な影響を実証した（図２Ｄ）。この効果がＢＮＩＰ３によって本当に達成されることを検証するために、本発明者らは、心筋梗塞手順を開始する５分前に、ＢＮＩＰ３をＢＮＩＰ３欠損マウスの心臓に投与した。ＢＮＩＰ３の添加は、再灌流の初期段階におけるＢＮＩＰ３欠損マウス心臓中でのＢＡＸ転位を回復させ、ＢＮＩＰ３の遺伝的欠失の起こり得る副作用を取り除いた（図２Ｄ）。
［実施例３］ Ｉ／Ｒ傷害におけるＢＮＩＰ３阻害のために必要とされる重要なＢＮＩＰ３配列の同定
［実施例３］ Ｉ／Ｒ傷害におけるＢＮＩＰ３阻害のために必要とされる重要なＢＮＩＰ３配列の同定
ＢＡＸとのＢＮＩＰ３の相互作用が、共免疫沈降によって評価されたインビボでの再灌流傷害における実質的な活動として認識されたので、本発明者らは、合成された１３個のＢＡＸペプチドのライブラリを有するペプチドマイクロアレイを評価することによって、ＢＡＸ中のヘリックスα５、α６、α７およびα８を結合部位の候補として同定した（図３ＡおよびＢ）。この研究のために、本発明者らは、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ９．１５を使用する相同性モデリングによってインシリコでＢＮＩＰ３の３Ｄ構造を予測した４７（図３Ｃ）。ＮＡＭＤ２．９およびＣＨＡＲＭＭ３６力場を使用して、作成されたモデルをエネルギー最小化した。このＢＮＩＰ３モデルは、６４％に相当する様々な長さの９個のαヘリックス、これに続くランダムコイル１９％および未同定の構造１７％を示し、これは円二色性分光法によって確認された（図３Ｄ）。計算によるドッキングシミュレーションは、相互作用部位としてＢＡＸのヘリックスα５、α６、α７およびα８ならびにＢＮＩＰ３配列ＭＳＱＳＧＥＥＮＬＱＧＳＷＶＥＬＨＦＳＮ（アミノ酸１～２０；配列番号２０）を示唆したが（図３Ｅ）、最初の１０アミノ酸のみではＢＡＸに結合できなかった（図３Ｆ）。本発明者らは、ＢＮＩＰ３のアミノ酸１～２０がＢＮＩＰ３の活性を拮抗するのに十分であり得ると仮定したので、ＢＮＩＰ３のアミノ酸１～２０に由来する２０個のアミノ酸に共有結合を介して結合されたＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ（配列番号３１）、図３Ｇ）４８、４９から構成される細胞透過性ペプチド、ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－２０Ａペプチドを設計した（図３Ｈ）。ＢＮＩＰ３のアミノ酸４２～６１を使用して、対照ペプチド、ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－２０Ｃ（図３Ｉ）を生成した。ペプチド断片のＮ末端をアセチル基で、Ｃ末端をアミド基でキャップした。野生型マウスをＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－２０Ａで処理することにより、このペプチドが心筋によって取り込まれ（図３Ｊ）、そこで内因性ＢＮＩＰ３と相互作用することが実証された。
臨床診療に適した時点である再灌流の５分前に与えられたＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－２０Ａが、インビボでＢＮＩＰ３活性に拮抗し、再灌流傷害を減少させる能力を有するかどうかを調べるために、本発明者らはマウスにおいて所定の心筋梗塞モデルを使用した（図４Ａ）。ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－２０Ａでの処置は、３７％の梗塞サイズの減少をもたらしたが、ビヒクルおよびＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－２０Ｃでの処置はいずれも減少をもたらさなかった（図４Ｂ）。これは、ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－２０Ａペプチド断片によるミトコンドリアへのＢＮＩＰ３転位の抑制によるものであり（図４Ｃ）、ミトコンドリア膜擾乱後のＩ／Ｒにおける重要な事象である、顕著に阻害されたカスパーゼ－３活性をもたらした（図４Ｄ）。
［実施例４］ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－２０Ａペプチド断片はアポトーシス性およびネクローシス性ヒト心筋細胞死を阻害する
［実施例４］ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－２０Ａペプチド断片はアポトーシス性およびネクローシス性ヒト心筋細胞死を阻害する
橋渡しの必要性を満たすために、ヒト人工多能性幹細胞由来のヒト心室心筋細胞（ヒトＣＭ）における再酸素化実験を行った（図５Ａ）。低酸素後に、ヒトＣＭを２時間の再酸素化に曝露した。特筆すべきことに、ヒトＣＭにおいてさえ、ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－２０Ａはその保護特性を示す。ＢＮＩＰ３－２０Ａは、ミトコンドリアへのヒトＢＮＩＰ３の転位を抑制することができ（図５Ｂ）、低いミトコンドリア内膜脱分極（図５Ｃ）ならびにより少ないアポトーシス性細胞およびネクローシス性細胞（図５Ｄ）によって証明されるミトコンドリアのかなりの保護をもたらす。
［実施例５］ ＢＮＩＰ３／ＢＡＸ活性のペプチド断片阻害剤の同定および設計
［実施例５］ ＢＮＩＰ３／ＢＡＸ活性のペプチド断片阻害剤の同定および設計
ＢＮＩＰ３－２０Ａペプチド配列のＮ末端切断とそれに続く単一残基の交換により、１９位のＳｅｒのＰｈｅへの置換と組み合わせてアミノ酸１３～２０を含有するペプチドがペプチドマイクロアレイにおいて大幅により高いＢＮＩＰ３結合を示すことが明らかになった（表１参照）。
表１：ＢＮＩＰ３への最高結合能力を示す切断型ＢＮＩＰ３－２０Ａ断片
表１：ＢＮＩＰ３への最高結合能力を示す切断型ＢＮＩＰ３－２０Ａ断片
これらの結果に基づいて、本発明者らは、Ｓｅｒ－１９からＰｈｅ－１９への置換を有するＢＮＩＰ３のアミノ酸１３～２０に由来する８個のアミノ酸（ＷＶＥＬＨＦＦＮ（配列番号８）；図６Ａ）への共有結合を介して結合されたＰＴＤから構成されるＢＮＩＰ３－８Ｂペプチドを設計した。ペプチド配列中の残基フェニルアラニンの必要性を実証するために、本発明者らは、Ｐｈｅ－１８をＡｌａ－１８に、さらにＨｉｓ－１７をＡｌａ－１７に置換し、ＢＮＩＰ３－８Ｃペプチドを生成した（図６Ｂ）。ＢＮＩＰ３－８Ｂの円二色性スペクトルは、このペプチドがランダムコイル立体構造を示すことを示した（図６Ｃ）。
さらに、ＢＮＩＰ３ １－２０の野生型配列の単一残基が１８の中性アミノ酸に交換されたＢＮＩＰ３－２０Ａペプチドを用いて、ＢＮＩＰ３／ＢＮＩＰ３相互作用研究を行った。特定のアミノ酸置換を有するＢＮＩＰ３ペプチドは、ＢＮＩＰ３への増加した結合能力を示した（例示的なデータを表２に示す）。
表２：ＢＮＩＰ３への最高結合能力を示す置換されたＢＮＩＰ３－２０Ａペプチド
［実施例６］ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂペプチド断片の取り込み、毒性および安定性のインビトロおよびインビボ効果
表２：ＢＮＩＰ３への最高結合能力を示す置換されたＢＮＩＰ３－２０Ａペプチド
まず、本発明者らは、心臓内注射におけるインビボでの所望の効果の時点でのＢＮＩＰ３－８Ｂの分布および存在を評価した。次に、本発明者らは、ヒト血清、血漿および全血中のＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂの薬物動態プロファイルを評価し、単離された成体心筋細胞における毒性を評価した。ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂは、心臓、脾臓および肝臓によって取り込まれ、血漿中に存在する（図７Ａ）。したがって、ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂは、ＢＮＩＰ３－ＢＡＸ－ミトコンドリアトライアングル細胞死カスケードが起こる時点である再灌流の１０分後には、心臓中に存在する。心筋細胞は明白な毒性の徴候を示さず（図７Ｂ）、ヒト血清、血漿および全血中のＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂの半減期はそのインビボ阻害能を可能にする（図８Ａ～Ｃ）。プロテイナーゼＫとのＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂのインキュベーションを対照とした。
［実施例７］ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂペプチドの作用機序
［実施例７］ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂペプチドの作用機序
ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂは、ＢＮＩＰ３およびＢＡＸのモノマーおよびホモダイマーに、ならびにＢＮＩＰ３／ＢＡＸヘテロダイマーおよびヘテロオリゴマーに結合してそれらの活性を妨げると仮定した。ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂの相互作用挙動を評価するために、ＢＮＩＰ３／ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８ＢおよびＢＡＸ／ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂオーバーレイアッセイおよびドッキングシミュレーションを行った。結果はいずれも、ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８ＢがＢＮＩＰ３およびＢＡＸに結合することを示唆した（データは示さず）。
特に、心筋梗塞モデル（図９Ａ）では、再灌流の５分後に、内因性ＢＮＩＰ３およびＢＡＸモノ、ホモおよびヘテロダイマーが蛍光標識されたＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂと共免疫沈降した（図９Ｂ）。さらに、再灌流は、ＢＮＩＰ３および３つのＢＡＸからなるオリゴマーの大規模形成によって証明されるように、ＢＮＩＰ３およびＢＡＸをオリゴマー化させた（図９Ｃ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび共免疫沈降実験は、高次オリゴマー複合体におけるＢＮＩＰ３／ＢＡＸヘテロ相互作用を明らかにし、このオリゴマー化は、ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂでの処理によって強く阻害された（図９Ｃ）。
［実施例８］ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂは、心筋梗塞サイズを減少させる
［実施例８］ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂは、心筋梗塞サイズを減少させる
次いで、本発明者らは、適切な心筋梗塞モデル（図９Ａ）において再灌流を開始する５分前に与えられたＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂ処理の有効性および効果を研究した。特に、ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂは、ビヒクルおよびＴＡＴ－β－Ｇａｌ処理と比較して、梗塞サイズを用量依存的に最大４０％減少させる（図９ＤおよびＥ）。ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｃ処理は、ＴＡＴ－ＢＮＩＰ－８Ｂと比較して梗塞サイズに明確に影響を及ぼさず、フェニルアラニン残基の重要性を指摘している（図９Ｄ）。
［実施例９］ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂはミトコンドリアの擾乱および細胞死カスケードを減少させる
［実施例９］ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂはミトコンドリアの擾乱および細胞死カスケードを減少させる
ミトコンドリアの損傷は、ミトコンドリア内膜（ＭＩＭ）およびＭＯＭの擾乱によって起こり得る。ネクローシスにおける重要なミトコンドリアの事象は、ＭＩＭ中のミトコンドリア膜透過性遷移孔（ｍＰＴＰ）の早期の開口であり５０、ＭＩＭ全体にわたる電位差の時間依存性の散逸を引き起こし、続いてミトコンドリアの膨潤および細胞破壊を引き起こす。アポトーシスにおける重要なミトコンドリアの事象は、ＢＡＸの膜貫通ドメイン曝露を誘導するＢＡＸ活性化、ならびにアポトーシス刺激物質（ａｐｏｐｔｏｇｅｎ；例えば、シトクロムｃ）放出を可能にするＭＯＭ透過化、およびその後のカスパーゼ活性化である５１。インビボで所定のＩ／Ｒモデルにおいて再灌流の５分前に左心室中に注射されたＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂは、ミトコンドリアへのＢＮＩＰ３およびＢＡＸの転位を抑制し、ミトコンドリアの膨潤、ＢＡＸ活性化、シトクロムｃ放出およびカスパーゼ－３活性を含む下流細胞死機構の阻害をもたらす。
［実施例１０］ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂはアポトーシス性およびネクローシス性ヒト心筋細胞死を阻害する
［実施例１０］ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂはアポトーシス性およびネクローシス性ヒト心筋細胞死を阻害する
ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８ＢがヒトＣＭにおける細胞死を阻害することができるかどうかを試験した。低酸素後に、ヒトＣＭを２時間の再酸素化に曝露した（図１１Ａ）。ＢＮＩＰ３－８Ｂは、ネクローシス性細胞死およびアポトーシス性細胞死（図１１Ｂ）ならびにミトコンドリア内膜電位（図１１Ｃ）の喪失を顕著に阻害する。
［実施例１１］ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂは、脳梗塞サイズを減少させる
［実施例１１］ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂは、脳梗塞サイズを減少させる
ＢＮＩＰ３は脳虚血において重要な役割を果たすことが示唆されているので３８、本発明者らは、局所的な脳再灌流のマウスモデルにおける臨床転帰に対するＢＮＩＰ３－８Ｂペプチドの効果も評価した。本発明者らは、３０分間の一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）後に、マウスを２４時間の再灌流に供した。ｔＭＣＡＯ直後のＢＮＩＰ３－８Ｂ処置は、梗塞サイズを５２％著しく減少させる（図１２）。
［実施例１２］ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂは、ブタにおいて心筋梗塞サイズを減少させる
［実施例１２］ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂは、ブタにおいて心筋梗塞サイズを減少させる
次いで、本発明者らは、ブタにおける心筋梗塞モデルにおいて再灌流を開始する５分前に与えられたＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂ処理の有効性および効果を研究した。ブタを左前下行冠動脈の６０分間の閉塞に供し、続いて４時間の再灌流に供した。特に、ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂは、ビヒクルと比較して、梗塞サイズを５６％著しく減少させる（図１３）。
［実施例１３］ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂは、ドキソルビシンによって誘発されたミトコンドリアの損傷から保護する。
［実施例１３］ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂは、ドキソルビシンによって誘発されたミトコンドリアの損傷から保護する。
本発明者らは、ＨＬ－１細胞におけるドキソルビシンによって誘発されたミトコンドリアの損傷に対するＢＮＩＰ３－８Ｂペプチドの効果を評価した。ミトコンドリアの膨潤をモニターするために、ＨＬ－１細胞を５μＭドキソルビシンで処理し、患者において標準的な注入によって到達した血漿ピーク濃度を再現した。ミトコンドリアの膨潤を５４０ｎｍでの光学密度によって測定した（膨潤による増加したミトコンドリアの体積は低下した光学密度をもたらす）。ドキソルビシンと同時に与えられたＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂは、増加したＯＤ５４０によって示されるように、ミトコンドリアの膨潤を抑制する（図１４）。これらのデータは、ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂが、アントラサイクリンなどの化学療法によって媒介される損傷からミトコンドリアを保護することができることを示している。
［実施例１４］ 方法
［実施例１４］ 方法
化学物質はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。ＢＮＩＰ３、チューブリン、シトクロムｃおよびＢＡＸに対する抗体はＡｂｃａｍから入手し、活性化されたＢＡＸについてはＥｎｚｏから入手した。
動物。同様の年齢（１２±３週）および３０ｇの平均体重を有する雄マウスを使用した。Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から入手し、馴化のために地元の動物舎で１週間飼育した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－ＴｇＨ（Ｂｎｉｐ３－／－）マウスは、小児分子心血管研究開発センター（シンシナティ大学、シンシナティ、オハイオ州、米国）のＧｅｒａｌｄ Ｗ．Ｄｏｒｎ教授から入手した。エクソン２および３をネオマイシン耐性カセットで置き換えることによってマウスを作製した３３。マウスは、エッセン大学病院の地元の動物舎で飼育された。すべての実験は、実験およびその他の科学的目的のために使用される脊椎動物の保護に関する欧州条約（指令２０１０／６３／ＥＵ）に従って、現地の倫理委員会によって承認された。
マウスにおけるインビボ心筋梗塞モデル。ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって、野生型およびＢｎｉｐ３欠損（Ｂｎｉｐ３－／－）マウスを麻酔し、挿管した。マウスミニ人工呼吸器を使用して、人工呼吸パラメータを２．１～２．５ｍｌの一回換気量および１４０呼吸／分の呼吸数に設定した。２体積％イソフルランを換気気体に添加することによって深い麻酔を維持した。側方開胸術（第３および第４肋骨間の１ｃｍの左側方切開）によって胸部を開いた。６－０プロレン縫合糸を左冠動脈（ＬＣＡ）の周りに配置し、１片の柔らかいシリコン管を動脈の上に配置した。縫合糸を締め付けて縛ることによって、冠動脈閉塞を達成した。閉塞の３０分後に、シリコン管を除去し、縫合糸を定位置に残した。より長い再灌流時間のために、４－０プロレンを用いて胸部を閉じた。血管閉塞の５分前に、２、６および９ｎｍｏｌ（５０μｌの０．９％塩化ナトリウム中）のＢＮＩＰ３を左心室腔中に注射した。ＮａＣｌ中の、２０アミノ酸を有するペプチド（２ｎｍｏｌ／５０μｌ）および８アミノ酸を有するペプチド（８ｎｍｏｌ／５０μｌ）を再灌流の５分前に注射した。塩化ナトリウム注射（５０μｌ）を対照処置とした。
ブタにおけるインビボ心筋梗塞モデル。麻酔の導入後、大腿動脈および大腿静脈上に小さな切開を施し、血管を単離した。動脈内に小さな開口部を作り、シースを導入した。さらに、必要であれば、緊急薬物投与を可能にするために、大腿静脈または他の適切な静脈中にシースを配置した。ヘパリンの投与前に血液試料を採取し、記録されたベースライン活性化凝固時間（ＡＣＴ）を確立するために使用した。続いて、外科医によって指示されたとおりに、必要に応じてヘパリン（２５０～３５０ＩＵ／ｋｇ）を投与して、ベースラインＡＣＴのレベルの２倍のＡＣＴを達成および維持した。ヘパリンの初回ボーラス後、ＡＣＴを再度記録し、その後、手術の完了まで少なくとも６０分毎にモニターした。
蛍光透視法によって与えられる視覚的誘導を使用して、適切なガイドカテーテルを左前下行動脈（ＬＡＤ）の小孔内に前進させた。非イオン性造影剤をすべての手順に使用した。ガイドカテーテルを通して左前下行（ＬＡＤ）冠動脈までバルーンカテーテルを前進させることによって、バルーンカテーテルを導入した。ＬＡＤの第１対角枝の上の適切な場所まで、ガイドカテーテルを介してバルーンを冠動脈内に前進させた。次いで、動脈の完全な閉塞を確保するのに十分な圧力まで、バルーンを膨張させた。蛍光透視法を用いて動脈の閉塞を確認した。閉塞の確認後、バルーンを動脈内で６０分間膨張させたままにした。発生支持薬および除細動を研究記録に記録した。再灌流の５分前に、ペプチドおよびビヒクルをそれぞれ静脈内注射によって投与した。血管閉塞期間の終わりに、バルーンを収縮させ、虚血領域を再灌流させた。完全なバルーン収縮を蛍光透視法で確認した。手順の最後に、すべてのカテーテルを取り出し、動脈および静脈を結紮し、切開部を標準的な様式で閉鎖した。再灌流の４時間後、動物を安楽死させた。
梗塞サイズの測定。梗塞サイズの分析のために、マウスを２４時間の再灌流後に安楽死させ、心臓を摘出し、ＰＢＳで５分間灌流した。灌流後、以前に詳説したように、同じ位置でＬＣＡを再結紮した。非虚血ゾーンから虚血性ＡＡＲを描出するために、エバンスブルー色素（１ｍｌの１％溶液）を大動脈および冠動脈に注射した。組織をきれいな食品ラップで包み、－２０℃の冷凍庫中で１時間保存した。次いで、心臓を長軸に対して垂直に１ｍｍのスライスに連続的に切片化し、各スライスを秤量した。リスクゾーン内の生存心筋と非生存心筋の境界を画定するために、切片を１％ＴＴＣ中、３７℃で５分間インキュベートした。試料の正体を盲検化した観察者によって、コンピュータ支援面積測定法を用いて、梗塞、ＡＡＲおよび非虚血性左心室を評価した。心筋梗塞のサイズをＡＡＲの百分率として表した。
免疫ブロッティング。組織およびヒトＣＭ細胞をＲＩＰＳ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ－４０ならびにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤、ｐＨ７．４）中で溶解した。Ｍｉｔｏ－ｌｙｓｅ緩衝液（２００ｍＭスクロース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ １００ならびにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤、ｐＨ７．４）中に、単離されたミトコンドリアを溶解した。遠心分離（２０．０００ｘｇ、１５分、４°Ｃ）によって可溶化液を清澄化した。上清中のタンパク質濃度を、ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して測定した。４×ＬＤＳ試料緩衝液および１０×還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に試料を希釈し、９５°Ｃに５分間加熱することによってＳＤＳ－ＰＡＧＥ用に調製した。４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて等量のタンパク質を分離し、ニトロセルロース上に転写し、一次抗体で免疫ブロットした。使用した二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合したヤギ抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。ＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって免疫ブロッティングを検出し、Ｉｍａｇｅｒ ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で画像化した。
相互作用研究。タンパク質－ペプチド相互作用研究のために、ペプチドライブラリを合成し、マイクロアレイスライド上に固定化した。組換えＢＮＩＰ３を１μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ペプチドを合成し、（ｉ）ＢＮＩＰ３／ＢＡＸ相互作用研究；（ｉｉ）ＢＮＩＰ３ １－２０の野生型配列のＣ末端、Ｎ末端またはＣ／Ｎ末端切断を行ったＢＮＩＰ３／ＢＮＩＰ３相互作用研究；および（ｉｉｉ）ＢＮＩＰ３ １－２０の野生型配列の単一残基を１８の中性アミノ酸に交換したＢＮＩＰ３／ＢＮＩＰ３相互作用研究のために固定化した。
マイクロアレイ。タンパク質－ペプチド結合研究のために、組換えＢＮＩＰ３（ｃｕｓａｂｉｏ）およびＢＡＸ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）をそれぞれ１０μｇ／ｍｌおよび１μｍ／ｍｌの濃度で使用した。標識キットとして、標識Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０を含むＤｙＬｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用した。アッセイは、自動化されたＴＥＣＡＮ ＨＳ４８００マイクロアレイ処理ステーションを使用して行った。ブロッキング緩衝液中に希釈された顧客提供の試料と共に、マイクロアレイを３０℃で２時間インキュベートした。各工程の前に、マイクロアレイを洗浄緩衝液で洗浄した。高分解能蛍光スキャナを用いてマイクロアレイを走査した。レーザ設定および適用された解像度は、実行されたすべての測定について同一であった。スポット認識ソフトウェアＧｅｎｅＰｉｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、得られた画像を分析および定量化した。各スポットについて、平均シグナル強度を抽出した（０～６５５３５任意単位の間）。さらなるデータ評価のために、いわゆるＭＭＣ２値を決定した。変動係数（ＣＶ）（標準偏差を平均値で割ったもの）が０．５より大きい場合を除いて、ＭＭＣ２は、マイクロアレイ上の３つの事例すべての平均値に等しい。この場合には、２つの最も近い値の平均（ＭＣ２）がＭＭＣ２に割り当てられる。すべての工程は、ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって実施した。
インシリコでのＢＮＩＰ３の三次元（３Ｄ）構造モデリング。ＢＮＩＰ３の予測されたインシリコ３Ｄ構造は、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ９．１５を使用した相同性モデリングによって得られ、作成されたモデルは、ＮＡＭＤ２．９およびＣＨＡＲＭＭ３６力場を使用してエネルギー最小化された。
円二色性（ＣＤ）分光法。ＢＮＩＰ３タンパク質およびＢＮＩＰ３－８ＢペプチドのＣＤスペクトルを、３７℃、ｐＨ＝７．４、１×ＰＢＳでＪａｓｃｏ Ｊ－７１５分光偏光計で記録した。
ドッキングシミュレーション。実験は、Ａｕｔｏｄｏｃｋ Ｖｉｎａ５２およびＨＡＤＤＯＣＫ５３を用いて行った。ＢＡＸの構造（ｐｄｂ－ＩＤ：４Ｓ０Ｏ）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋから入手したが、ＢＮＩＰ３およびペプチドＢＮＩＰ３－８Ｂの構造は、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ９．１５を用いてモデル化した４７。テンプレート構造は、ＰＤＢコード２ｋ７ｗおよび２ｋａ１に対応する。ＮＡＭＤ２．９５４およびＣＨＡＲＭＭ３６力場を使用して、作成されたモデルをエネルギー最小化した。
免疫沈降。免疫沈降は、プロテインＧ結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。１ｍＭ ＤＴＴ、０．００５％ Ｂｒｉｊ３５およびプロテアーゼ－ホスファターゼ阻害剤を含有するＰＢＳ緩衝液中で振盪しながら、４°Ｃで一晩、５００μｇの溶解されたタンパク質を２μｇの抗体と共にインキュベートした。翌日、２０μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓを添加し、溶液を再び１時間インキュベートした。沈殿した免疫複合体を２回洗浄し、次いで、ＬＤＳ－試料緩衝液（１：４）およびＰＢＳ中の還元剤（１：１０）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する溶出緩衝液に再懸濁し、９５℃で５分間加熱した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓを除去した後、免疫ブロッティングによって溶出液を分析した。
Ａｂｃａｍからのカスパーゼ－３アッセイキット（＃ａｂ３９４０１）を使用してカスパーゼ－３活性を測定した。３０分間の虚血および４時間の再灌流後に齧歯類の心臓を採取し、リスク領域を単離し、含有緩衝液中に溶解し、製造業者の指示に従ってアッセイを実施した。
細胞培養。ヒトｉＰＳＣ由来心室心筋細胞（ヒトＣＭ）を（ａｘｏｌ）から入手し、製造業者の仕様に従って培養した。
血管閉塞をシミュレートするために、１％ Ｏ２、３７°Ｃ下の緩衝液（１１３ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１２ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、３０ｍＭタウリン、１．３ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中で細胞をインキュベートした。２１％ Ｏ２、３７°Ｃ下、５．５ｍＭグルコースを補充した緩衝液中で、再酸素化を行った。
製造業者のプロトコルに従って、Ｃｌａｙｃｏｍｂ培地中でＨＬ－１細胞を培養した。５μＭドキソルビシンおよび２ｎｍｏｌ ＴＡＴ－ＢＮＩＰ３－８Ｂで細胞を３０分間処理した。
ＪＣ－１アッセイ。ヒトＣＭ細胞におけるミトコンドリア内膜電位を分析するために、５’，６，６’－テトラクロロ－１，１’，３，３’－テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンヨウ素（ＪＣ－１）で染色した。培地中の６μＭ ＪＣ－１と共に細胞を３７°Ｃで３０分間インキュベートした。３７°ＣのＰＢＳ緩衝液で細胞を洗浄した後、４％ ＰＦＡを用いて室温で１５分間細胞を固定した。ＤＡＰＩ染色を行い、ＥＶＯＳ ＦＬ（ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて細胞を分析した。
膨潤アッセイ。室温でのマイクロプレート吸光度リーダーＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）中において、５４０ｎｍでの光散乱によってミトコンドリアの膨潤を測定した。最終アッセイ体積は２００μｌであり、２５０ｍＭスクロース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．４を含有する緩衝液中に０．５ｍｇ／ｍｌでミトコンドリアを含有した。
ペプチド。ペプチドは、樹脂合成手順（ＪＰＴ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって生成した。ペプチドのＮ末端をアセチル基で、Ｃ末端をアミド（ａｍｅｉｄｅ）でキャップした。送達のために、ペプチドをＴＡＴ配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ（配列番号３１）に共有結合を介して結合させた。取り込みおよび結合研究のために、ペプチドをフルオロフォアで標識した。完全なペプチドリストを別表１として添付する。
参考文献一覧
Claims (19)
- ペプチドであって、
（ｉ）細胞取り込みシグナルと、
（ｉｉ）ＢＮＩＰ３の１３～２０位を含むＢＮＩＰ３断片またはこれに由来するアミノ酸配列と、
を含み、
前記ペプチドは、５０アミノ酸またはそれ未満の長さを有する、ペプチド。 - 前記ＢＮＩＰ３断片が、１２アミノ酸またはそれ未満、特に１０アミノ酸またはそれ未満、特に８アミノ酸の長さを有する、請求項１に記載のペプチド。
- 前記ＢＮＩＰ３断片が、ＢＮＩＰ３の１３～２０位と比較して１、２または３個のアミノ酸置換を必要に応じて含むＢＮＩＰ３の１３～２０位を含む、請求項１または２に記載のペプチド。
- 前記アミノ酸置換が、ＢＮＩＰ３の１５、１７および１９位に対応する位置の１またはそれより多くに存在する、請求項３に記載のペプチド。
- 前記アミノ酸置換が、
（ｉ）ＢＮＩＰ３の１５位のグルタミン酸からフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、チロシン、システイン、ヒスチジン、アルギニンまたはトレオニン、および
（ｉｉ）ＢＮＩＰ３の１７位のヒスチジンからバリン、および
（ｉｉｉ）ＢＮＩＰ３の１９位のセリンからチロシン、システイン、フェニルアラニンまたはヒスチジン；
から選択される、請求項３または４に記載のペプチド。 - 前記ＢＮＩＰ３断片が、ＢＮＩＰ３の１９位に対応する位置にフェニルアラニン残基を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記ＢＮＩＰ３断片が、
（ｉ）ＢＮＩＰ３の１２～２０位と比較して１、２、３もしくは４個のアミノ酸置換を必要に応じて含むＢＮＩＰ３の１２～２０位を含む、
（ｉｉ）ＢＮＩＰ３の４～２０位と比較して１、２、３、４、５もしくは６個のアミノ酸置換を必要に応じて含むＢＮＩＰ３の４～２０位を含む、
（ｉｉｉ）ＢＮＩＰ３の１～２０位と比較して１、２、３、４、５もしくは６個のアミノ酸置換を必要に応じて含むＢＮＩＰ３の１～２０位を含む、または
（ｉｖ）配列番号３～３０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、
請求項１～６のいずれか一項に記載のペプチド。 - 前記ＢＮＩＰ３断片が、ＢＮＩＰ３の１３～２０位のＤ－レトロ－インベルソ配列、または請求項２～７に記載のアミノ酸配列のいずれかのＤ－レトロ－インベルソ配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
- 前記細胞取り込みシグナルが、
（ｉ）５～３０アミノ酸、特に８～２０アミノ酸もしくは１０～１６アミノ酸、特に１２アミノ酸の長さを有するペプチドであり、
（ｉｉ）ＨＩＶのＴＡＴタンパク質のタンパク質形質導入ドメインであり、および／または
（ｉｉｉ）配列番号３１～５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項１～８のいずれか一項に記載のペプチド。 - 前記細胞取り込みシグナルが、細胞透過性ペプチド、特に請求項９に記載の細胞透過性ペプチドのＤ－レトロ－インベルソ配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記細胞取り込みシグナルおよび前記ＢＮＩＰ３断片からなり、前記細胞取り込みシグナルと前記ＢＮＩＰ３断片との間に必要に応じてリンカーを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のペプチド。
- ４０アミノ酸またはそれ未満、特に３５アミノ酸またはそれ未満、特に３０アミノ酸またはそれ未満の長さを有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載のペプチド。
- 請求項１～１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む医薬組成物。
- 再灌流関連および／またはミトコンドリア関連障害ならびにがん治療誘発性心毒性の処置において使用するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記再灌流関連および／またはミトコンドリア関連障害が、心筋梗塞、脳卒中、急性腎傷害、外傷、循環停止および臓器移植中の血流の停止からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用のためのペプチド。
- 前記ペプチドが、血液供給障害の発生中または発生後に、特に虚血によって影響を受けた組織の再灌流の前に患者に投与される、請求項１４または１５に記載の使用のためのペプチド。
- 前記ペプチドが、再灌流前２時間以内、特に再灌流前３０分以内に前記患者に投与される、請求項１６に記載の使用のためのペプチド。
- ミトコンドリア誘発性アポトーシスまたはネクローシスによる組織損傷の処置または予防において使用するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載のペプチド。
- 再灌流傷害および／またはミトコンドリア誘発性障害および／またはがん治療誘発性心毒性の予防に適した化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）１またはそれを超える候補化合物を提供することと、
（ｉｉ）前記候補化合物がＢＮＩＰ３とＢＡＸの結合に干渉する能力を決定することと、
（ｉｉｉ）ＢＮＩＰ３とＢＡＸの結合に干渉する候補化合物を選択することと、
を含む、方法。
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