KR20140125803A - 성장 분화 인자 15(gdf-15) 폴리펩타이드들 - Google Patents

성장 분화 인자 15(gdf-15) 폴리펩타이드들 Download PDF

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Abstract

GDF15 폴리펩타이드들, GDF15를 포함하는 구조체들, 및 이들의 돌연변이체들이 제공된다. 다양한 구현예들에서 GDF15 폴리펩타이드들, GDF15를 포함하는 구조체들, 및 이들의 돌연변이체들은 대사 질환을 치료하거나 완화시키는데 사용될 수 있다. 다양한 구현예들에서 대사 질병 또는 질환은 제2형 당뇨병들, 비만, 이상지질혈증, 상승된 글루코즈 수준들, 상승된 인슐린 수준들 및 당뇨병성 신장병이다.

Description

성장 분화 인자 15(GDF-15) 폴리펩타이드들{GROWTH DIFFERENTIATION FACTOR 15(GDF-15) POLYPEPTIDES}
본 기재내용은 GDF15 폴리펩타이드들, GDF15를 포함하는 폴리펩타이드들, 및 당해 생성 및 이들의 용도에 관한 것이다. 본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 양식으로 제출되고 이의 전문이 본원에 참조로 혼입된 서열 목록을 포함한다. 2013년 1월 28일자로 생성된 당해 ASCII 카피는 A1682WOP.txt로 명명되며 크기는 253,155 바이트들이다.
성장 분화 인자 15(GDF15)는 TGFβ상과(superfamily)의 분기된 구성원이다. 이는 또한 대식세포 억제성 사이토카인 1(MIC1)(참조: Bootcov MR, 1997, Proc Natl Acad Sci 94:11514-9.), 태반 골 형태형성 인자(PLAB)(참조: Hromas R 1997, Biochim Biophys Acta. 1354:40-4), 태반 형질전환 성장 인자 베타(PTGFB)(참조: Lawton LN 1997, Gene. 203:17-26), 전립선 기원한 인자(PDF)(참조: Paralkar VM 1998, J Biol Chem . 273:13760-7), 및 비스테로이드성 소염 약물-활성화된 유전자(NAG-1)(참조: Baek SJ 2001, J Biol Chem . 276: 33384-92)로 불린다.
사람 GDF15 유전자는 염색체 19p13.2-13.1에 위치하며; 랫트 GDF15 유전자는 염색체 16에 위치하고; 마우스 GDF15 유전자는 염색체 8에 위치한다. GDF15 개방 판독 프레임들은 2개의 엑손들에 걸쳐있다(참조: Bottner M 1999, Gene. 237:105-11 및 NCBI). 성숙한 GDF15 펩타이드는 다른 과 구성원들과 낮은 상동성을 공유한다(참조: Katoh M 2006, Int J Mol Med . 17:951-5.).
GDF15는 이염기성 절단 부위에서 절단되어 카복시말단의 성숙한 펩타이드를 방출하는 거대한 전구체 단백질로서 합성된다. 마우스 및 랫트 GDF15 프레프로(prepro)-펩타이드들 둘 다는 303개의 아미노산들을 함유한다. 사람의 완전한 길이의 전구체는 308개의 아미노산들을 함유한다. 설치류의 성숙한 펩타이드들은 RGRR(서열번호 1) 절단 부위에서 프로세싱 후에 115개의 아미노산들을 함유한다. 사람의 성숙한 펩타이드는 RGRRRAR(서열번호 2) 절단 부위에서 프로세싱 후에 112개의 아미노산들을 함유한다. 사람의 성숙한 GDF15 펩타이드는 랫트 및 마우스의 성숙한 GDF15 펩타이드들과 66.1% 및 68.1%의 서열 유사성을 공유한다(참조: Bottner M 1999, Gene. 237:105-11; Bauskin AR 2000, EMBO J. 19:2212-20; NCBI). 성숙한 GDF15 펩타이드내에는 글리코실화 부위가 존재하지 않는다.
성숙한 GDF15 펩타이드는 시스테인 노트 모티프(cystein knot motif)(3개의 쇄간 이황화물 결합들을 가짐) 및 TGF 상과 구성원들에 대해 전형적인 단일의 쇄간 이황화물 결합의 형성에 요구되는 7개의 보존된 시스테인 잔기들을 함유한다. 성숙한 GDF15 펩타이드는 제4의 쇄간 이황화물 결합을 형성하는 2개의 추가의 시스테인 잔기들을 추가로 함유한다. 생물학적으로 활성인 GDF15는 하나의 쇄간 이황화물 결합들에 의해 공유결합적으로 연결된 성숙한 펩타이드의 25KD의 단독 이량체이다.
GDF15 순환 수준들은 다수의 병리학적 및 생리학적 상태들, 가장 주목하게는 임신(참조: Moore AG 2000. J Clin Endocrinol Metab 85: 4781-4788), β-지중해빈혈(참조: Tanno T 2007, Nat Med 13:1096-101)(Zimmermann MB, 2008 Am J Clin Nutr 88:1026-31), 및 선천성 이적혈구생성 빈혈(참조: Tamary H 2008, Blood . 112:5241-4) 중에 상승하는 것으로 보고되어 왔다. GDF15는 또한 문헌 보고들에서 다수의 생물학적 활성들과 관련시켜 왔다. GDF15 녹아웃(knockout) 및 유전자이식 마우스들의 연구들은, GDF15가 허혈성/재관류- 또는 과부하-유도된 심장 손상에 대해 보호성이고(참조: Kempf T, 2006, Circ Res .98:351-60) (Xu J, 2006, Circ Res . 98:342-50), 노화-관련된 운동 뉴우런 및 감각 뉴우런 손실에 대해 보호성이며(참조: Strelau J, 2009, J Neurosci. 29 :13640-8), 신장에서 대사산증에 대해 약하게 보호성일 수 있으며, 암 환자들에서 악액질을 유발할 수 있음(참조: Johnen H 2007 Nat Med . 11:1333-40)을 제안하였다. 많은 그룹들은 또한 세포 세포자멸사 및 증식에 있어서 GDF15의 역할을 연구하였으며 상이한 세포 배양물 및 이종이식 모델들을 사용하여 논란의 소지가 많은 결과들을 보고하였다. 유전자이식 마우스들의 연구들은, GDF15가 장 및 폐에서 발암물질 또는 Apc 돌연변이 유발된 신생물에 대해 보호성임을 나타내었다(참조: Baek SJ 2006, Gastroenterology. 131:1553-60; Cekanova M 2009, Cancer Prev Res 2:450-8).
발명의 요약
GDF15 폴리펩타이드 및 1개 이상의 Fc 서열들을 포함하는 구조체가 본원에 제공된다. 하나의 구현예에서, 당해 구조체는 2개 이상의 Fc 서열들을 포함한다. 추가의 구현예에서, Fc 서열들 중 1개 이상은 독립적으로 서열 번호들 18, 19, 85, 86, 89, 90, 91, 99, 100, 108, 109 및 111로 이루어진 그룹에서 선택된 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, Fc 서열들 중 2개 이상은 연합되어 있다. 여전히 추가의 구현예에서, GDF15 폴리펩타이드 및 Fc 서열들 중 1개 이상은 인접한 서열을 형성한다. 여전히 다른 구현예에서, GDF15 폴리펩타이드 및 Fc 서열은 링커에 의해 결합되어 있다. 다른 구현예에서, 구조체는 서열 번호들 44, 50, 57, 61, 65, 69, 74, 79, 84, 95 및 104로 이루어진 그룹에서 선택된 서열을 포함한다. 여전히 추가의 구현예에서, 구조체는 서열 번호들 18, 19, 85, 86, 89, 90, 91, 99, 100, 108, 109 및 110으로 이루어진 그룹에서 선택된 서열을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 구조체들을 포함하는 이량체가 제공된다. 특수 구현예에서, 구조체는: (a) 서열번호 18 포함하는 서열 및 서열번호 44를 포함하는 서열; (b) 서열번호 86을 포함하는 서열 및 서열번호 50을 포함하는 서열; (c) 서열번호 18을 포함하는 서열 및 서열번호 57을 포함하는 서열; (d) 서열번호 86을 포함하는 서열 및 서열번호 61을 포함하는 서열; (e) 서열번호 86을 포함하는 서열 및 서열번호 65를 포함하는 서열; (f) 서열번호 86을 포함하는 서열 및 서열번호 69를 포함하는 서열; (g) 서열번호 86을 포함하는 서열 및 서열번호 74를 포함하는 서열; (h) 서열번호 86을 포함하는 서열 및 서열번호 79를 포함하는 서열; (i) 서열번호 86을 포함하는 서열 및 서열번호 84를 포함하는 서열; (j) 서열번호 91을 포함하는 서열 및 서열번호 95를 포함하는 서열; 또는 (k) 서열번호 100을 포함하는 서열 및 서열번호 104를 포함하는 서열, 및 또한 당해 구조체를 포함하는 이량체를 포함한다.
GDF15 폴리펩타이드 및 2개 이상의 Fc 서열들을 포함하는 구조체가 또한 본원에 제공되며, 여기서 1개 이상의 Fc 서열들은 서열 번호들 23, 110, 114 및 115로 이루어진 그룹에서 선택된 서열을 독립적으로 포함한다. 하나의 구현예에서, 2개 이상의 Fc 서열들은 연합되어 있다. 추가의 구현예에서, GDF15 폴리펩타이드 및 Fc 서열들 중 1개 이상은 인접한 서열을 형성한다. 여전히 다른 구현예에서, GDF15 폴리펩타이드 및 Fc 서열은 링커에 의해 결합되어 있다. 여전히 추가의 구현예에서, 구조체는 서열번호 113을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 구조체들을 포함하는 이량체가 제공된다. 특수 구현예에서, 구조체는 서열번호 110을 포함하는 서열 및 서열번호 113을 포함하는 서열, 및 또한 구조체를 포함하는 이량체를 포함한다.
GDF15 폴리펩타이드 및 2개 이상의 Fc 서열들을 포함하는 구조체가 또한 본원에 제공되며, 여기서 Fc 서열들은 서열번호 28 및 서열번호 30을 포함한다. 하나의 구현예에서 2개의 Fc 서열들은 링커에 의해 결합된다. 다른 구현예에서, 링커는 서열 번호들 87, 88 및 131로 이루어진 그룹에서 선택된 서열을 포함한다. 여전히 추가의 구현예에서, 제1의 Fc 서열의 C-말단은 제2의 Fc 서열의 N-말단에 결합된다. 여전히 다른 구현예에서, GDF15 폴리펩타이드 및 Fc 서열들 중 1개 이상은 인접한 서열을 형성한다. 여전히 추가의 구현예에서, GDF15 폴리펩타이드 및 Fc 서열은 링커에 의해 결합되어 있다. 다른 구현예에서, 링커는 서열번호 31을 포함한다. 여전히 추가의 구현예에서, 본원에 기술된 구조체들의 이량체를 포함하는 구조체가 제공된다. 특수 구현예에서, 구조체는 서열 번호들 33, 123 및 128로 이루어진 그룹에서 선택된 서열, 및 또한 구조체를 포함하는 이량체를 포함한다.
도 1은 하전된 쌍(delHinge) 구조체 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+)(도 1a); 하전된 쌍 구조체 CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+)(도 1b); 및 헤미 구조체(hemi construct) Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 (도 1c)의 배열을 나타내는 일련의 도식들이다. 도 1은 "(G4S)4" (서열번호 20), "GS(G4S)4" (서열번호 31) 및 "(G4S)8" (서열번호 34)을 기재한다.
도 2는, 다음의 GDF15 구조체들의 이량체들이 연구된 과식증 ob/ob 마우스들에서 사료 섭취 검정의 결과들을 나타내는 표이다: DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+), DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(-), DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+), DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(H6D):DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(N3Q):DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-GDF15:DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-G4-GDF15:DhCpmFc(-),DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF15:DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)-(G4Q)4-GDF15:DhCpmFc(-),DhCpmFc(+)-(1K)-GDF15:DhCpmFc(-), DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(L351C), DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(Y349C) CpmFc(+)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(-);Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15, Fc-(G4S)3-Fc-GS(G4S)4-GDF15, Fc-(G4S)5-Fc-GS(G4S)4-GDF15, GDF15 및 GDF15 (H6D) 변이체.
도 3은 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체를 사용한 사료 섭취에 있어서의 효과(투여량의 함수(log [단백질 g /체중(BW) kg]로서 ob/ob 마우스들의 사료 g /체중(BW) g)를 나타내는 플롯이다.
도 4는 DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(-) 구조체의 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 5는 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 6은 DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(H6D):DhCpmFc(-) 구조체의 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 7은 DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(N3Q):DhCpmFc(-) 구조체의 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 8은 DhCpmFc(+)-GDF15:DhCpmFc(-) 구조체의 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 9는 DhCpmFc(+)-G4-GDF15:DhCpmFc(-) 구조체의 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 10은 DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF15:DhCpmFc(-) 구조체의 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 11은 DhCpmFc(+)-(G4Q)4-GDF15:DhCpmFc(-) 구조체의 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 12는 DhCpmFc(+)-(1K)-GDF15:DhCpmFc(-) 구조체의 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 13은 DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(L351C) 구조체의 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 14는 DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(Y349C) 구조체의 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 15는 CpmFc(+)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(-) 구조체의 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 16은 Fc-G(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 17은 Fc-G(G4S)3-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 18은 Fc-G(G4S)5-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 19는 천연의 성숙한 GDF15 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 20은 천연의 성숙한 hGDF15 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 21은 성숙한 hGDF15(H6D) 변이체 이량체를 사용한 투여량의 함수로서 ob/ob 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 22는 천연의 성숙한 GDF15 이량체(1 mg/kg, i.v.), Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체(1 mg/kg, i.v.) 및 대조군에 대한 트리글리세라이드(mg/dL)에 있어서의 효과를 나타내는 지질 내성 검정의 결과들의 막대 그래프이다.
도 23은 투여량의 함수(log[구조체의 g / BW의 kg])로서 트리글리세라이드(mg/dL)에 있어서의 효과를 나타내는, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체를 사용한 지질 내성 검정의 결과들의 플롯이다.
도 24는 천연의 성숙한 hGDF15의 이량체를 사용한 지질 내성 검정의 결과들을 나타내는 플롯이다.
도 25는 성숙한 hGDF15(H6D) 변이체의 이량체를 사용한 지질 내성 검정의 결과들을 나타내는 플롯이다.
도 26은 DIO(식이-유도된 비만) 마우스들에서 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)을 사용하여 수행된 2주의 OGTT의 결과들을 나타내는 플롯이다.
도 27은 AUC 데이터 형태의 도 26의 데이터를 요약하는 막대 그래프이다.
도 28은 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)을 사용하여 수행된 5주의 OGTT의 결과들을 나타내는 플롯이다.
도 29는 AUC 데이터 형태의 도 28의 데이터를 요약하는 막대 그래프이다.
도 30은 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)의 DIO 마우스들의 체중(g)에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 31은 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)의 DIO 마우스들의 사료 섭취(사료 g / 동물 / 일)에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 32는 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)의 4시간 절식 후 DIO 마우스들의 글루코즈 수준들(mg/dL)에 있어서의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 33은 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)의 4시간 절식 후 DIO 마우스들의 인슐린 수준들 (ng/mL)에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 34는 밤새 절식 후 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)을 투여한 DIO 마우스들의 인슐린 수준들(ng/mL)에 있어서의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 35는 4시간 절식 후 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)을 투여한 DIO 마우스들의 트리글리세라이드 수준들(mg/dL)에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 36은 밤새 절식 후 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)을 투여한 DIO 마우스들의 트리글리세라이드 수준들(mg/dL)에 있어서의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 37은 4시간 절식 후 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)을 투여한 DIO 마우스들의 총 콜레스테롤 수준들(mg/dL)에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 38은 밤새 절식 후 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi) 을 투여한 DIO 마우스들의 총 콜레스테롤 수준들(mg/dL)에 있어서의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 39는 4시간 절식 후 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+) 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)을 투여한 DIO 마우스들에서 수행된 2주 OGTT의 결과들을 나타내는 플롯이다.
도 40은 AUC 데이터 형태의 도 39의 데이터를 요약하는 막대 그래프이다.
도 41은 밤새 절식 후 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+) 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)을 투여한 DIO 마우스들에서 수행된 5주 OGTT의 결과들을 나타내는 플롯이다.
도 42는 AUC 데이터 형태의 도 41의 데이터를 요약하는 막대 그래프이다.
도 43은 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+)구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)을 투여한 DIO 마우스들의 체중에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 44는 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+) 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)을 투여한 DIO 마우스들의 사료 섭취에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 45는 4시간 절식 후 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+) 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)을 투여한 DIO 마우스들의 글루코스 수준들(mg/dL)에 있어서의 효과를 나타내는 막대그래프이다.
도 46은 4시간 절식 후 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+) 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)을 투여한 DIO 마우스들의 인슐린 수준들(ng/mL)에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 47은 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+) 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)을 사용하여 무제한 공급한 DIO 마우스들의 인슐린 수준들에 있어서의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 48은 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+) 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)의 밤새 절식 후 DIO 마우스들의 인슐린 수준들(ng/ml)에 있어서의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 49는 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+) 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)의 4시간 절식 후 DIO 마우스들의 트리글리세라이드 수준들(mg/dL)에 있어서의 효과를 나타내는 막대그래프이다.
도 50은 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+) 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)을 무제한으로 공급한 DIO 마우스들의 트리글리세라이드 수준들(mg/dL)에 있어서의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 51은 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+) 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)의 밤새 절식 후 DIO 마우스들의 트리글리세라이드 수준들(mg/dL)에 있어서의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 52는 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+) 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)의 4시간 절식 후 DIO 마우스들의 총 콜레스테롤 수준들(mg/dL)에 있어서의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 53은 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+) 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)을 무제한으로 공급한 DIO 마우스들의 총 콜레스테롤 수준들(mg/dL)에 있어서의 효과를 나타내는 플롯이다.
도 54는 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+) 구조체의 이량체 및 로시글리티존(Rosi)의 밤새 절식 후 DIO 마우스들의 총 콜레스테롤 수준들(mg/dL)에 있어서의 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 55는 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체 및 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체를 사용하여 비만 시노몰구스 ( cynomolgous ) 원숭이들에서 수행된 5주 치료에 대한 연구 설계를 그래프로 나타내는 도해이다.
도 56은 연구된 시노몰구스 원숭이들에서 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체 및 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체의 혈청 수준들(ng/mL)을 나타내는 플롯이다.
도 57은 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체 및 비히클을 사용하여 시노몰구스 원숭이들에서 수행된 밤새 절식 후 적응 OGTT의 결과들을 나타내는, 글루코즈 AUC 데이터의 형태의 막대 그래프이다.
도 58은 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체 및 비히클의 2주 투여후 시노몰구스 원숭이들에서 수행된 밤새 절식 후 OGTT의 결과들을 나타내는, 글루코즈 AUC 데이터의 형태의 막대 그래프이다,
도 59는 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체 및 비히클의 5주 투여후 시노몰구스 원숭이들에서 수행된 밤새 절식 후 OGTT의 결과들을 나타내는, 글루코즈 AUC 데이터의 형태의 막대 그래프이다.
도 60은 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체 및 비히클을 사용하여 4주 세척 후 시노몰구스 원숭이들에서 수행된 밤새 절식 후 OGTT의 결과들을 나타내는, 글루코즈 AUC 데이터의 형태의 막대 그래프이다.
도 61은 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체 및 비히클을 사용하여 시노몰구스 원숭이들에서 수행된 밤새 절식 후 적응 OGTT의 결과들을 나타내는, 인슐린 AUC 데이터의 형태의 막대 그래프이다.
도 62는 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체 및 비히클의 2주 투여 후 시노몰구스 원숭이들에서 수행된 밤새 절식 후 OGTT의 결과들을 나타내는, 인슐린 AUC 데이터 형태의 막대 그래프이다.
도 63은 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체 및 비히클의 5주 투여 후 시노몰구스 원숭이들에서 수행된 밤새 절식 후 OGTT의 결과들을 나타내는, 인슐린 AUC 데이터 형태의 막대 그래프이다.
도 64는 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhFc(+) 구조체의 이량체 및 비히클의 4주 세척 후 시노몰구스 원숭이들에서 수행된 밤새 절식 후 OGTT의 결과들을 나타내는, 인슐린 AUC 데이터 형태의 막대 그래프이다.
도 65는 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체 및 비히클을 사용하여 시노몰구스 원숭이들에서 수행된 30일 처리 및 후속적인 세척 기간 동안, 이전 달에 수집한 시간(일들)의 함수로서 체중(kg)의 플롯이다.
도 66은 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체 및 비히클을 사용하여 시노몰구스 원숭이들에서 수행된 5주 치료 및 후속적인 4주 세척 기간 동안, 이전의 주에 수집된 시간(일들)의 함수로서 매일 사료 섭취(g)의 플롯이다.
도 67은 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체 및 비히클을 사용하여 시노몰구스 원숭이들에서 수행된 5주 치료 및 후속적인 4주 세척 기간 동안, 이전 주에 수집된 시간(일들)의 함수로서 절식 트리글리세라이드(mg/dL)의 플롯이다.
도 68은 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체 및 비히클을 사용하여 시노몰구스 원숭이들에서 수행된 5주 치료 및 후속적인 4주 세척 기간 동안, 이전 주에 수집된 시간(일들)의 함수로서 절식 인슐린(ng/dL)의 플롯이다.
본 기재내용은 GDF15 폴리펩타이드들 및, GDF15 폴리펩타이드들을 포함하는 구조체들을 제공한다. 또한, 예를 들면 제2형 당뇨병들, 상승된 글루코즈 수준들, 상승된 인슐린 수준들, 이상지질혈증 또는 비만과 같은 대사 질환을 치료하는데 있어서, 기재된 분자들의 생성 및 용도들을 제공한다.
실시예들에서를 포함하는, 본원에서 사용된 재조합체 폴리펩타이드 및 핵산 방법들은 일반적으로 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 또는 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994)에 기재된 것들이며, 이들 문헌 둘 다는 어떠한 목적으로도 참조로 본원에 혼입되어 있다.
I. 일반적인 정의들
관례에 따라서, 본원에 사용된 것으로서 단수(“a” 및 “an”)는 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 "하나 이상"을 의미한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어들 “아미노산” 및 “잔기”는 상호교환가능하며, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 맥락에서 사용되는 경우, 천연적으로 존재하는 아미노산들 및 합성 아미노산들 둘 다, 및 또한 아미노산 유사체들, 아미노산 모사체들 및 천연적으로 존재하는 아미노산들과 화학적으로 유사한 비-천연적으로 존재하는 아미노산들을 말한다.
용어들 “천연적으로 존재하는 아미노산” 및 “천연적으로 암호화된 아미노산”은 상호교환적으로 사용되며 유전 코드에 의해 암호화된 아미노산, 및 또한 합성 후 변형된 유전 코드에 의해 암호화된 아미노산들, 예를 들면, 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, 및 O-포스포세린을 말한다.
“아미노산 유사체”는 천연적으로 존재하는 아미노산과 동일한 기본의 화학 구조를 갖는 화합물, 즉, 수소, 카복실 그룹, 아미노 그룹, 및 R 그룹에 결합된 α 탄소, 예를 들면, 호모세린, 노르루이신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄이다. 이러한 유사체들은 변형된 R 그룹들 (예를 들면, 노르루이신) 또는 변형된 펩타이드 골격들을 가질 수 있지만, 천연적으로 존재하는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유할 것이다.
“아미노산 모사체”는 아미노산의 일반적인 화학 구조와는 상이하지만, 천연적으로 존재하는 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학 화합물이다. 예들은 아미드의 메타크릴로일 또는 아크릴로일 유도체, β-, γ-, δ-이미노산들(예를 들면, 피페리딘-4-카복실산) 등을 포함한다.
용어들 “비-천연적으로 존재하는 아미노산” 및 “비-천연적으로 암호화된 아미노산”은 상호교환적으로 사용되며 천연적으로 존재하는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 가지지만, 해독 복합체에 의해 성장하는 폴리펩타이드 쇄 내로 혼입되지 않는 화합물을 말한다. “비-천연적으로 존재하는 아미노산”은 또한 천연적으로 암호화된 아미노산(20개의 일반적인 아미노산들을 포함하나, 이에 한정되지 않음)의 변형(예를 들면, 해독 후 변형들)에 의해 발생하지만 자체로서 해독 복합체에 의해 성장하는 폴리펩타이드 쇄 내로 천연적으로 혼입되지 않는 아미노산들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 폴리펩타이드 서열내로 삽입될 수 있거나 폴리펩타이드 서열내에서 야생형 잔기대신 치환될 수 있는 비-천연적으로 존재하는 아미노산들의 예들의 비-제한된 목록들은 β-아미노산들, 호모아미노산들, 사이클릭 아미노산들 및 유도체화된 측쇄들을 갖는 아미노산들을 포함한다. 예들은 (L-형태 또는 D-형태; 괄호들안에 약술함): 시트룰린(Cit), 호모시트룰린(hCit), Nα-메틸시트룰린(NMeCit), Nα-메틸호모시트룰린(Nα-MeHoCit), 오르니틴(Orn), Nα-메틸오르니틴(Nα-MeOrn 또는 NMeOrn), 사르코신(Sar), 호모라이신(hLys 또는 hK), 호모아르기닌(hArg 또는 hR), 호모글루타민(hQ), Nα-메틸아르기닌(NMeR), Nα-메틸루이신(Nα-MeL 또는 NMeL), N-메틸호모라이신(NMeHoK), Nα-메틸글루타민(NMeQ), 노르루이신(Nle), 노르발린(Nva), 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린(Tic), 옥타하이드로인돌-2-카복실산(Oic), 3-(1-나프틸)알라닌(1-Nal), 3-(2-나프틸)알라닌(2-Nal), 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린(Tic), 2-인다닐글리신(IgI), 파라-요오도 페닐알라닌(pI-Phe), 파라-아미노페닐알라닌(4AmP 또는 4-아미노-Phe), 4-구아니디노 페닐알라닌(Guf), 글리실라이신(“K(Nε-글리실)” 또는 “K(글리실)” 또는 “K(gly)”로 약술됨), 니트로페닐알라닌(니트로phe),아미노페닐알라닌(아미노phe 또는 아미노-Phe), 벤질페닐알라닌(벤질phe), γ-카복시글루탐산(γ-카복시glu), 하이드록시프롤린(하이드록시pro), p-카복실-페닐알라닌(Cpa), α-아미노아디프산(Aad), Nα-메틸 발린(NMeVal), N-α-메틸 루이신(NMeLeu), Nα-메틸노르루이신 (NMeNle), 사이클로펜틸글리신(Cpg), 사이클로헥실글리신(Chg), 아세틸아르기닌(아세틸arg), α,β-디아미노프로피온산(Dpr), α,γ-디아미노부티르산(Dab), 디아미노프로피온산(Dap), 사이클로헥실알라닌(Cha), 4-메틸-페닐알라닌(MePhe), β,β-디페닐-알라닌(BiPhA), 아미노부티르산(Abu), 4-페닐-페닐알라닌(또는 비페닐알라닌; 4Bip), α-아미노-이소부티르산(Aib), 베타-알라닌, 베타 아미노프로피온산, 피페리딘산, 아미노카프리오산, 아미노헵타노산, 아미노피멜산, 데스모신, 디아미노피멜산, N-에틸글리신, N-에틸아스파르긴, 하이드록실라이신, 알로-하이드록실라이신, 이소데스모신, 알로-이소루이신, N-메틸글리신, N-메틸이소루이신, N-메틸발린, 4-하이드록시프롤린(Hyp), γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸 라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록실라이신, ω-메틸아르기닌, 4-아미노-O-프탈산(4APA), N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코실아미닐-L-트레오닌, O-포스포타이로신 및 다른 유사한 아미노산들, 및 구체적으로 나열된 것들 중 어느 것의 유도체화된 형태들을 포함한다.
“비-천연적으로 존재하는 아미노산”의 정의 속에는 다음 구조를 포함하는 어떠한 아미노산도 또한 포함된다.
Figure pct00001
여기서 R 그룹은 20개의 천연 아미노산들에 사용된 것 이외의 어떠한 치환체이다.
일부 구현예들에서, 비-천연적으로 암호화된 아미노산은 카보닐 그룹을 포함한다. 일부 구현예들에서, 비-천연적으로 암호화된 아미노산은 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00002
여기서 n은 0 내지 10이고; R1 은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이며; R2 는 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 및 치환된 아릴이고; R3 는 H, 아미노산, 폴리펩타이드, 또는 아미노 말단 변형 그룹이며; R4 는 H, 아미노산, 폴리펩타이드, 또는 카복시 말단 변형 그룹이다.
일부 구현예들에서, 비-천연적으로 암호화된 아미노산은 아미노옥시 그룹을 포함한다. 일부 구현예들에서, 비-천연적으로 암호화된 아미노산은 하이드라지드 그룹을 포함한다. 일부 구현예들에서, 비-천연적으로 암호화된 아미노산은 하이드라진 그룹을 포함한다. 일부 구현예들에서, 비-천연적으로 암호화된 아미노산 잔기는 세미카르바지드 그룹을 포함한다.
일부 구현예들에서, 비-천연적으로 암호화된 아미노산 잔기는 아지드 그룹을 포함한다. 일부 구현예들에서, 비-천연적으로 암호화된 아미노산은 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00003
여기서 n은 0 내지 10이고; R1 은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴이거나 존재하지 않고; X는 O, N, S이거나 존재하지 않으며; m은 0 내지 10이고; R2 는 H, 아미노산, 폴리펩타이드, 또는 아미노 말단 변형 그룹이고, R3 는 H, 아미노산, 폴리펩타이드, 또는 카복시 말단 변형 그룹이다.
일부 구현예들에서, 비-천연적으로 암호화된 아미노산은 알킨 그룹을 포함한다. 일부 구현예들에서, 비-천연적으로 암호화된 아미노산은 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00004
여기서 n은 0 내지 10이고; R1 은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이고; X는 O, N, S이거나 존재하지 않으며; m은 0 내지 10이고, R2 는 H, 아미노산, 폴리펩타이드, 또는 아미노 말단 변형 그룹이며, R3 는 H, 아미노산, 폴리펩타이드, 또는 카복시 말단 변형 그룹이다.
용어 “치환된”은, 분자 또는 그룹 위의 수소 원자가, 치환체로 언급되는 그룹 또는 원자로 대체됨을 의미한다. 전형적인 치환체들은 할로겐, C1-8알킬, 하이드록실, C1-8알콕시, -NRxRx, 니트로, 시아노, 할로 또는 퍼할로C1-8알킬, C2-8알케닐, C2-8알키닐, -SRx, -S(=O)2Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)Rx을 포함하고, 여기서 각각의 Rx은 독립적으로 수소 또는 C1-C8 알킬이다. 치환체가 -NRxRx인 경우, Rx 그룹들은 질소 원자와 함께 결합하여 환을 형성할 수 있음에 주목한다.
용어 "알킬"은 직쇄 또는 측쇄 탄화수소를 의미한다. 알킬 그룹들의 대표적인 예들은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3급-부틸, 2급-부틸, 펜틸 및 헥실을 포함한다. 전형적인 알킬 그룹들은, 탄소수가 1 내지 8인 알킬 그룹들이고, 당해 그룹들은 C1-8알킬로서 일반적으로 나타낸다.
용어 "알콕시"는 산소 원자에 결합된 알킬 그룹을 의미한다. 알콕시 그룹들의 대표적인 예들은 메톡시, 에톡시, 3급-부톡시, 프로폭시 및 이소부톡시를 포함한다. 일반적인 알콕시 그룹들은 C1-8알콕시이다.
용어 "할로겐" 또는 “할로”는 염소, 불소, 브롬 또는 요오드를 의미한다.
용어 "알케닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합들을 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소를 의미한다. 대표적인 예들의 알케닐 그룹들은 에테닐, 프로페닐, 알릴, 부테닐 및 4-메틸부테닐을 포함한다. 일반적인 알케닐 그룹들은 C2-8알케닐이다.
용어 "알키닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합들을 갖는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소를 의미한다. 알키닐 그룹들의 대표적인 예들은 에티닐, 프로피닐(프로파르길) 및 부티닐을 포함한다. 일반적인 알키닐 그룹들은 C2-8 알키닐이다.
용어 "사이클로알킬"은 사이클릭, 비방향족 탄화수소를 의미한다. 사이클로알킬 그룹들의 예들은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 및 사이클로헵틸을 포함한다. 사이클로알킬 그룹은 하나 이상의 이중 결합을 함유할 수 있다. 이중 결합들을 함유하는 사이클로알킬 그룹들의 예들은 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐, 사이클로헥사디에닐 및 사이클로부타디에닐을 포함한다. 일반적인 사이클로알킬 그룹들은 C3-8 사이클로알킬 그룹들이다.
용어 "퍼플루오로알킬"은, 수소 원자들 모두가 불소 원자들로 대체된 알킬 그룹을 의미한다. 일반적인 퍼플루오로알킬 그룹들은 C1-8퍼플루오로알킬이다. 일반적인 퍼플루오로알킬 그룹의 예는 -CF3이다.
용어 "아실"은 하이드록시 그룹(-OH)의 제거에 의해 유기산으로부터 기원한 그룹을 의미한다. 예를 들면, 아실 그룹 CH3C(=O)_ 은 CH3C(=O)OH로부터 하이드록시 그룹의 제거로 형성된다.
용어 “아릴”은 사이클릭, 방향족 탄화수소를 의미한다. 아릴 그룹들의 예들은 페닐 및 나프틸을 포함한다. 일반적인 아릴 그룹들은 6 내지 13원 환들이다.
본원에 사용된 것으로서 용어 “헤테로원자”는 산소, 질소 또는 황 원자를 의미한다.
용어 "헤테로아릴"은, 아릴 그룹의 하나 이상의 탄소 원자들이 헤테로원자로 대체된 사이클릭, 방향족 탄화수소를 의미한다. 헤테로아릴 그룹이 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 경우, 헤테로원자들은 동일하거나 상이할 수 있다. 헤테로아릴 그룹들의 예들은 피리딜, 피리미디닐, 이미다졸릴, 티에닐, 푸릴, 피라지닐, 피롤릴, 인돌릴, 트리아졸릴, 피리다지닐, 인다졸릴, 푸리닐, 퀴놀리지닐, 이소퀴놀릴, 퀴놀릴, 나프티리디닐, 퀴녹살리닐, 이소티아졸릴 및 벤조[b]티에닐을 포함한다. 일반적인 헤테로아릴 그룹들은 1 내지 4개의 헤테로원자들을 함유하는 5 내지 13원 환들이다. 1 내지 3개의 헤테로원자들을 함유하는 5 및 6원 환들인 헤테로아릴 그룹들이 특히 일반적이다.
용어 "헤테로사이클로알킬"은, 하나 이상의 탄소 원자들이 헤테로원자로 대체된 사이클로알킬 그룹을 의미한다. 헤테로사이클로알킬 그룹이 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 경우, 헤테로원자들은 동일하거나 상이할 수 있다. 헤테로사이클로알킬 그룹들의 예들은 테트라하이드로푸릴, 모르폴리닐, 피페라지닐, 피페리디닐 및 피롤리디닐을 포함한다. 헤테로사이클로알킬 그룹이 하나 이상의 이중 결합들을 가지지만, 방향족이 아닌 것도 또한 가능하다. 이중 결합들을 함유하는 헤테로사이클로알킬 그룹들의 예들은 디하이드로푸란을 포함한다. 일반적인 헤테로사이클로알킬 그룹들은 1 내지 4개의 헤테로원자들을 함유하는 3 내지 10원 환들이다. 1 내지 2개의 헤테로원자들을 함유하는 5 및 6원 환들인 헤테로사이클로알킬 그룹들이 특히 일반적이다.
사이클릭 환 그룹들, 즉, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 및 헤테로사이클로알킬이 하나 이상의 환을 포함할 수 있음에 또한 주목한다. 예를 들면, 나프틸 그룹은 융합된 비사이클릭 환 시스템이다. 본 발명이 브릿징 원자들(bridging atoms)을 갖는 환 그룹들, 또는 스피로 배향을 갖는 환 그룹들을 포함하는 것 또한 의도된다.
임의로 1개 또는 2개의 헤테로원자들을 갖는 5 내지 6원 방향족 환들의 대표적인 예들은 페닐, 푸릴, 티에닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 이속사졸릴, 이소티아졸릴, 피리디닐, 피리디아지닐, 피리미디닐, 및 피라지닐이다.
임의로 1 내지 3개의 헤테로원자들을 갖는, 부분 포화되거나, 완전히 포화되거나 완전히 불포화된 5 내지 8원 환들의 대표적인 예들은 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸 및 페닐이다. 추가의 예시적인 5원 환들은 푸릴, 티에닐, 피롤릴, 2-피롤리닐, 3-피롤리닐, 피롤리디닐, 1,3-디옥솔라닐, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 2H-이미다졸릴, 2-이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피라졸릴, 2-피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이속사졸릴, 이소티아졸릴, 1,2-디티올릴, 1,3-디티올릴, 3H-1,2-옥사티올릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,2,5-옥사디아졸릴, 1,3,4-옥사디아졸릴, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 3H-1,2,3-디옥사졸릴, 1,2,4-디옥사졸릴, 1,3,2-디옥사졸릴, 1,3,4-디옥사졸릴, 5H-1,2,5-옥사티아졸릴, 및 1,3-옥사티올릴이다.
추가의 예시적인 6원 환들은 2H-피라닐, 4H-피라닐, 피리디닐, 피페리디닐, 1,2-디옥시닐, 1,3-디옥시닐, 1,4-디옥사닐, 모르폴리닐, 1,4-디티아닐, 티오모르폴리닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 피페라지닐, 1,3,5-트리아지닐, 1,2,4-트리아지닐, 1,2,3-트리아지닐, 1,3,5-트리티아닐, 4H-1,2-옥사지닐, 2H-1,3-옥사지닐, 6H-1,3-옥사지닐, 6H-1,2-옥사지닐, 1,4-옥사지닐, 2H-1,2-옥사지닐, 4H-1,4-옥사지닐, 1,2,5-옥사티아지닐, 1,4-옥사지닐, o-이속사지닐, p-이속사지닐, 1,2,5-옥사티아지닐, 1,2,6-(3 옥사티아지닐, 및 1,4,2-옥사디아지닐이다.
추가의 예시적인 7원 환들은 아제피닐, 옥세피닐, 티에피닐 및 1,2,4-트리아제피닐이다.
추가의 예시적인 8원 환들은 사이클로옥틸, 사이클로옥테닐 및 사이클로옥타디에닐이다.
임의로 1 내지 4개의 헤테로원자들을 갖는, 2개의 융합된 부분 포화되거나, 완전 포화되거나 완전불포화된 5원 및/또는 6원 환들로 이루어진 예시적인 비사이클릭 환들은 인돌리지닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 인돌리닐, 사이클로펜타(b)피리디닐, 피라노(3,4-b)피롤릴, 벤조푸릴, 이소벤조푸릴, 벤조(b)티에닐, 벤조(c)티에닐, 1H-인다졸릴, 인독사지닐, 벤족사졸릴, 안트라닐릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조티아졸릴, 푸리닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 1,8-나프티리디닐, 프테리디닐, 인데닐, 이소인데닐, 나프틸, 테트랄리닐, 데칼리닐, 2H-1-벤조피라닐, 피리도(3,4-b)피리디닐, 피리도(3,2-b)피리디닐, 피리도(4,3-b)-피리디닐, 2H-1,3-벤족사지닐, 2H-1,4-벤족사지닐, 1H-2,3-벤족사지닐, 4H-3,1-벤족사지닐, 2H-1,2-벤족사지닐 및 4H-1,4-벤족사지닐이다.
사이클릭 환 그룹은 하나 이상의 방식으로 다른 그룹에 결합될 수 있다. 특수한 결합 배열이 명시되지 않는 경우, 모든 가능한 배열들이 의도된다. 예를 들면, 용어 "피리딜"은 2-, 3-, 또는 4-피리딜을 포함하며, 용어 "티에닐"은 2-, 또는 3-티에닐을 포함한다.
용어 “분리된 핵산 분자”는 적어도 약 50 퍼센트의 폴리펩타이드들, 펩타이드들, 지질들, 탄수화물들, 폴리뉴클레오타이드들 또는 전체 핵산이 공급원 세포들로부터 분리되는 경우 핵산과 함께 천연적으로 발견되는 다른 물질들로부터 분리된, 5’ 내지 3’ 말단으로부터 판독된 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 염기들(예를 들면, 본원에 제공된 GDF15 핵산 서열)의 일본쇄 또는 이본쇄 중합체, 또는 이의 유사체를 말한다. 바람직하게는, 분리된 핵산 분자는 어떠한 다른 오염시키는 핵산 분자들 또는 폴리펩타이드 생산 또는 이의 치료, 진단, 예방 또는 조사 용도에 있어서 이의 사용을 방해할 수 있는 핵산의 천연 환경에서 발견된 다른 분자들을 실질적으로 함유하지 않는다.
용어 “분리된 폴리펩타이드”는 적어도 약 50 퍼센트의 폴리펩타이드들, 펩타이드들, 지질들, 탄수화물들, 폴리뉴클레오타이드들, 또는 공급원 세포로부터 분리되는 경우 폴리펩타이드와 함께 천연적으로 발견되는 다른 물질들로부터 분리된 폴리펩타이드(예를 들면, 본원에 제공된 GDF15 폴리펩타이드 서열)을 말한다. 바람직하게는, 분리된 폴리펩타이드는 어떠한 다른 오염시키는 폴리펩타이드들 또는 이의 치료, 진단, 예방 또는 조사 용도를 방해할 수 있는 이의 천연 환경에서 발견되는 다른 오염물질들을 실질적으로 함유하지 않는다.
용어 “암호화하는”은 하나 이상의 아미노산들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 말한다. 당해 용어는 출발 또는 정지 코돈을 필요로 하지 않는다. 아미노산 서열은 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 제공된 상이한 판독 프레임들 중 어느 하나에 암호화될 수 있다.
2개 이상의 핵산들 또는 폴리펩타이드 서열들과 관련하여, 용어들 “동일한” 및 “동일성” 퍼센트는 동일한 2개 이상의 서열들 또는 소서열들을 말한다. “동일성 퍼센트”는 비교된 분자들내 아미노산들 또는 뉴클레오타이드들 사이의 동일한 잔기들의 퍼센트를 의미하며 비교되는 분자들 중의 가장 작은 것의 크기를 기준으로 계산된다. 이들 계산들에서, 정렬들내 갭들(존재하는 경우)은 특수한 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, “알고리즘”)에 의해 다루어질 수 있다. 정렬된 핵산들 또는 폴리펩타이드들의 동일성을 계산하는데 사용될 수 있는 방법들은 문헌[참조: Computational Molecular Biology, (참조: Lesk, A. M., ed.), (1988) New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., (1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; 및 Carillo et al ., (1988) SIAM J. Applied Math . 48:1073]에 기술된 것들을 포함한다.
동일성 퍼센트를 계산하는데 있어서, 비교되는 서열들은 서열들 사이에 가장 큰 조화를 제공하는 방식으로 정렬된다. 동일성 퍼센트를 측정하는데 사용된 컴퓨터 프로그램은 GCG 프로그램 패키지이며, 이는 GAP를 포함한다(참조: Devereux et al., (1984) Nucl . Acid Res . 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). 컴퓨터 알고리즘 GAP를 사용하여 서열 동일성 퍼센트가 측정되어야 하는 2개의 폴리펩타이드들 또는 폴리뉴클레오타이드들을 정렬한다. 서열들은 이들 각각의 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 최적의 조화(알고리즘에 의해 측정된 것으로서 “조화된 폭(span)”)를 위해 정렬된다. 갭 개방 패널티(gap opening penalty)(이는 평균 사선의 3x로서 계산되며, 여기서 “평균 사선”은 사용되는 비교 매트릭스의 사선의 평균이며; “사선”은 특수한 비교 매트릭스에 의해 각각의 완전한 아미노산 조화에 지정된 점수 또는 수이다) 및 갭 연장 패널티(이는 일반적으로 갭 개방 패널티의 1/10배이다), 및 PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 비교 매트릭스를 알고리즘과 함께 사용한다. 특정의 구현예들에서, 표준 비교 매트릭스(참조, PAM 250 비교 매트릭스의 경우 Dayhoff et al ., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352; BLOSUM 62 비교 매트릭스의 경우 Henikoff et al ., (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 89:10915-10919)를 알고리즘에 의해 또한 사용한다.
GAP 프로그램을 사용하여 폴리펩타이드들 또는 뉴클레오타이드 서열들에 대한 동일성 퍼센트를 측정하기 위한 추천된 매개변수들은 다음과 같다:
알고리즘: Needleman et al ., 1970, J. Mol . Biol . 48:443-453;
비교 매트릭스: BLOSUM 62 from Henikoff et al ., 1992, supra;
갭 패널티: 12(그러나 말단 갭들에 대해서는 패널티가 없음)
갭 길이 패널티: 4
유사성의 한계(threshold): 0
2개의 아미노산 서열들을 정렬하기 위한 특정의 정렬 개략도들은 2개의 서열들의 짧은 영역만의 조화를 생성할 수 있으며, 이러한 작은 정렬된 영역은 2개의 완전한 길이의 서열들 사이에 유의적인 관계가 없다고 해도 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 선택된 정렬 방법(예를 들면, GAP 프로그램)을 경우에 따라 조절하여 표적 폴리뉴클레오타이드의 적어도 50개의 인접한 아미노산들 범위의 정렬을 생성할 수 있다.
용어들 “GDF15 폴리펩타이드” 및 “GDF15 단백질”은 상호교환적으로 사용되며 사람 또는 마우스와 같은 포유동물에서 발현된 천연적으로 발생하는 야생형 폴리펩타이드를 의미한다. 본 기재내용의 목적들의 경우, 용어 “GDF15 폴리펩타이드”는 상호교환적으로 사용되어 어떠한 완전한 길이의 GDF15 폴리펩타이드, 예를 들면, 308개의 아미노산 잔기들로 이루어지고 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 3에 의해 암호화된 서열번호 4; 폴리펩타이드의 활성 및 프로도메인들을 포함하는 어떠한 형태, 예를 들면, 279개 아미노산 잔기들로 이루어지고 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 7에 의해 암호화되며, 여기서 완전한 길이의 GDF15 폴리펩타이드(즉, 시그날 펩타이드를 구성하는)의 아미노-말단에서 29개 아미노산 잔기들이 제거된, 서열번호 8; 및 프로도메인 및 시그날 서열이 제거된 활성 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 어떠한 형태, 예를 들면, 112개의 아미노산 잔기들로 이루어지고 시그날 서열 및 프로도메인이 제거된 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 11에 의해 암호화된 서열번호 12를 말한다. GDF15 폴리펩타이드들은 그러나, 가공에 의해 또는 세균 발현 공정의 결과로서 도입될 수 있는, 아미노-말단 메티오닌을 포함할 필요가 없을 수 있다.
용어 “GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드”는, 천연적으로 존재하는 GDF15 폴리펩타이드 서열 (예를 들면, 서열 번호들 4, 8 또는 12)이 변형된 GDF15 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 변형들은 비-천연적으로 존재하는 아미노산들, 비-천연적으로-존재하는 아미노산 유사체들 및 아미노산 모사체들에 의한 치환들을 포함하는 하나 이상의 아미노산 치환들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
하나의 국면에서, 용어 “GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드”는, 천연의 GDF15 폴리펩타이드의 제공된 위치에서 일반적으로 발견된 적어도 하나의 잔기가 결실되거나 천연의 GDF15 서열내 당해 위치에서 일반적으로 발견되지 않는 잔기로 대체된 GDF15 폴리펩타이드 서열(예를 들면, 서열 번호들 4, 8 또는 12)를 말한다. 일부 경우들에서, 천연의 GDF15 폴리펩타이드의 제공된 위치에서 일반적으로 발견된 단일의 잔기를 당해 위치에서 일반적으로 발견되지 않는 하나 이상의 잔기로 대체하는 것이 바람직할 것이며; 여전히 다른 경우들에서, 천연의 GDF15 폴리펩타이드 서열을 유지하고 단백질내 제거된 위치에서 하나 이상의 잔기들을 삽입하는 것이 바람직할 수 있으며; 여전히 다른 경우들에서 제공된 잔기를 전적으로 제거하는 것이 바람직할 수 있고; 이들 구조체들 모두는 용어 “GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드”에 포함된다.
다양한 구현예들에서, GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드는 천연적으로 존재하는 GDF15 폴리펩타이드(예를 들면, 서열 번호들 4, 8 또는 12)에 대해 적어도 약 85 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예들에서, GDF15 폴리펩타이드는 천연적으로 존재하는 GDF15 폴리펩타이드 아미노산 서열(예를 들면, 서열 번호들 4, 8 또는 12)에 대해 적어도 약 90 퍼센트, 또는 약 95, 96, 97, 98, 또는 99 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드들은 바람직하게는 혈당, 인슐린, 트리글리세라이드, 또는 콜레스테롤 수준들을 저하시키는 능력; 체중을 감소시키는 능력; 또는 글루코즈 내성, 에너지 소비, 또는 인슐린 민감성을 증강시키는 능력과 같은, 야생형 GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드의 적어도 하나의 능력을 지니지만, 필요하지는 않다. 본 발명은 또한 이러한 GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드 서열들을 암호화하는 핵산 분자들을 포함한다.
본원에 기술된 것으로서, GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드는 시그날 서열(서열번호 4의 1 내지 29번 잔기들)을 포함할 수 있거나 시그날 서열이 제거되어 있을 수 있다(서열번호 8로 제공함). 다른 구현예들에서, GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드는, 시그날 서열이 제거될 수 있으며 또한 196번 잔기에서 절단되어 활성 도메인의 주요 서열로부터 프로도메인의 주요 서열(서열번호 4의 30 내지 196번 잔기들)을 분리할 수 있다. GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드의 천연적으로 존재하는 생물학적으로 활성인 형태는 프로세싱된 성숙한 펩타이드(서열번호 12; 서열번호 4의 197 내지 308번 잔기들)를 포함하는 단독이량체이다. GDF15 폴리펩타이드들 및 GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드들, 및 이러한 폴리펩타이드들을 포함하는 구조체들이 사람 GDF15의 측면에서 주로 기재되어 있다 해도, 본 발명은 이렇게 한정되지 않으며 GDF15 폴리펩타이드들 및 GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드들이 다른 종들 (예를 들면, 시노몰구스 원숭이들, 마우스들 및 랫트들)로부터 기원하는 GDF15 폴리펩타이드들 및 GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드들 및 이러한 폴리펩타이드들을 포함하는 구조체들로 확장된다. 일부 예들에서, 피검자에서 대사 질환을 치료하거나 완화시키는데 사용될 수 있는 GDF15 폴리펩타이드 또는 GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드는 대상체와 동일한 종들로부터 기원한 GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드의 성숙한 형태이다.
GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드는 바람직하게는 생물학적으로 활성이다. 다양한 각각의 구현예들에서, GDF15 폴리펩타이드 또는 GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드는 성숙한 GDF15 단백질의 천연적으로 존재하는 형태 또는 시그날 펩타이드가 완전한 길이의 GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드 서열의 N-말단으로부터 제거되고 여기서 프로도메인이 활성 도메인으로부터 절단된(그러나 이로부터 필수적으로 제거되지는 않는다) GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드의 생물학적 활성과 동일하거나, 이보다 크거나 이보다 작다. 생물학적 활성들의 예들은 혈당, 인슐린, 트리글리세라이드, 또는 콜레스테롤 수준들을 저하시키는 능력; 체중을 감소시키는 능력; 또는 글루코즈 내성, 지질 내성, 또는 인슐린 민감성을 증진시키는 능력; 뇨당 및 단백질 배출을 저하시키는 능력을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어들 “치료학적 유효 투여량” 및 “치료학적 유효량”은 치료중인 질병또는 질환의 증상들의 경감 또는 완화를 포함하는, 연구자, 의학자, 또는 다른 임상의가 추구하는 조직 시스템, 동물, 또는 사람에 있어서 생물학적 또는 의학적 반응을 유발하는 GDF15 또는 GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드의 양, 즉, 하나 이상의 요구되는 생물학적 또는 의학적 반응의 관찰가능한 수준을 지지하는, 예를 들면 혈당, 인슐린, 트리글리세라이드, 또는 콜레스테롤 수준들을 저하시키거나; 체중을 감소시키거나; 당 내성, 에너지 소비, 또는 인슐린 민감성을 증진시키는 GDF15 또는 GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드의 양을 의미한다.
II . 이들의 돌연변이체 형태들을 포함하는, GDF15 폴리펩타이드들 및 GDF15 를 포함하는 구조체들, 및 폴리뉴클레오타이드들
광범위한 GDF15 폴리펩타이드들 및 GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체들이 본원에 제공된다. 이들 분자들 중 일부는 하기 본원에 나타낸 실시예들에서 기술한 바와 같이, 각종 검정들에서 연구되었다. 본원에 제공된 GDF15 폴리펩타이드들 및 GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체들 중의 일부 는 하기 기술된 것들을 포함한다.
II .A. 천연의 성숙한 GDF15 및 돌연변이체들
II.A.1 천연의 성숙한 GDF15
GDF15의 생물학적으로 활성인 형태는 단독이량체를 포함하며, 본 기재내용에서 “천연의 성숙한 GDF15 이량체”로 지정된 구조체는 각각 서열번호 12를 포함하는, 2개의 성숙한 GDF15 단량체들을 포함하는 단독이량체를 말한다. 천연의 성숙한 GDF15 이량체를 형성하기 위해 단독이량체화하는 단량체는 다음의 핵산 서열에의해 암호화되며:
gcgcgcaacggggaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatatga (서열번호 11)
다음의 아미노산 서열을 포함한다:
ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 12).
따라서, “천연의 성숙한 GDF15 이량체”는 서열번호 12를 포함하는 2개의 공유결합적으로 연합된 단량체들을 포함한다.
일부 구현예들에서, 리더, 또는 시그날 서열을 사용하여 폴리펩타이드의 분비를 지시할 수 있다. 시그날 서열은 폴리펩타이드 암호화 영역의 5’ 말단 내에 또는 5’ 말단에 직접 위치할 수 있다. 많은 시그날 서열들, 예를 들면, 절단된 VH21 시그날 서열(참조: VH21 시그날 서열의 토론에 대해서는 제EP2330197호)이 확인되어 왔으며 발현을 위해 사용된 숙주 세포를 기준으로 선택될 수 있다.
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 단독이량체화하여 천연의 성숙한 GDF15 이량체를 형성하는 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되며(VH21 시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgaccggtgtccactccgcgcgcaacggggaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatatga (서열번호 15)
다음의 아미노산 서열(절단된 VH21 시그날 서열은 밑줄쳐져 있다)을 포함한다:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 16)
II.A.2 성숙한 GDF15(H6D) 변이체
GDF15(H6D) 변이체는 C→G 다형성으로 인하여, 완전한 길이의 펩타이드(서열번호 4)내 202번 잔기; 성숙한 펩타이드(서열번호 12)내 6번 잔기에서 His의 Asp로의 변화를 일으키는, 천연적으로 존재하는 사람 GDF15 변이체이다.
본 기재내용에서 “성숙한 GDF15(H6D) 이량체”로 지정된 구조체는 각각 서열번호 38을 포함하는, 2개의 성숙한 GDF15(H6D) 단량체들을 포함하는 단독이량체를 말한다. 단독이량체화되어 성숙한 GDF15(H6D) 이량체를 형성하는 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되며:
gcgcgcaacggggacgattgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatatga (서열번호 37)
다음의 아미노산 서열을 포함한다:
ARNGDDCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 38)
따라서, “성숙한 GDF15(H6D) 이량체”는 서열번호 38을 포함하는 2개의 공유결합적으로 연합된 단량체들을 포함한다.
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 단독이량체화하여 성숙한 GDF15(H6D) 이량체를 형성하는 단량체는 다음의 핵산 서열(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다)에 의해 암호화되고:
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgaccggtgtccactccgcgcgcaacggggacgattgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatatga (서열번호 35)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSARNGDDCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 36)
II.A.3 성숙한 GDF15(N3Q) 변이체
GDF15(N3Q) 변이체는, 성숙한 펩타이드(서열번호 12)의 3번 잔기에서 Asn이 Gln으로 대체되어 잠재적인 N 탈아미드화가 방지된 사람 GDF15 돌연변이체이다.
본 기재내용에서 “성숙한 GDF15(N3Q) 이량체”로 지정된 구조체는, 각각 서열번호 42를 포함하는 2개의 성숙한 GDF15(N3Q) 단량체들을 포함하는 단독이량체를 말한다. 단독이량체화되어 성숙한 GDF15(N3Q) 이량체를 형성하는 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
gcgcgccagggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (서열번호 41)
다음의 아미노산 서열을 포함한다:
ARQGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 42)
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 단독이량체화되어 천연의 성숙한 GDF15 이량체를 형성하는 단량체는 다음의 핵산 서열(밑줄쳐진, 절단된 VH21 시그날 서열을 포함한다)에 의해 암호화되고:
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgaccggtgtccactccgcgcgccagggagaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata (서열번호 39)
다음의 아미노산 서열(절단된 VH21 시그날 서열은 밑줄쳐져 있다)을 포함한다:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSARQGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 40).
따라서, “성숙한 GDF15(N3Q) 이량체”는 서열번호 42를 포함하는 2개의 공유결합적으로 연합된 단량체들을 포함한다.
II .B. 하전된 쌍 ( delHinge ) 구조체들
본 기재내용에서 “하전된 쌍(delHinge)” 또는 “하전된 쌍(delHinge) Fc”로 지정된 구조체들은 (i) 힌지 영역을 결여하고 하전된 쌍 돌연변이를 포함하는 “음으로 하전된” Fc 서열 및 (ii) 힌지 영역을 결여하고 하전된 쌍 돌연변이를 포함하는 “양으로 하전된” Fc 서열을 포함하는 구조체를 말한다. 용어들 “양으로 하전된” 및 “음으로 하전된”은 용이한 참조 (즉, Fc 서열들내 하전쌍 돌연변이들의 특성을 기술하기 위하여)를 위한 것이며 필수적인 전체 서열 또는 구조체가 양성 또는 음성 전하를 가짐을 나타내지 않는다.
아스파르트산의-라이신으로의 돌연변이 (E356K) 및 글루탐산의-라이신으로의 돌연변이(D399K)를 힌지 영역을 결여하는 변형되지 않은 Fc 서열내로 도입하는 것은 힌지 영역을 결여한 양으로 하전된 Fc 서열(본원에서 “DhCpmFc(+)”로 언급함)을 제공한다. 2개의 라이신의-아스파르테이트로의 돌연변이들(K392D, K409D)을 힌지 영역을 결여한 변형되지 않은 Fc 서열내로 도입하는 것은 힌지 영역을 결여한 음으로 하전된 Fc 서열(본원에서 “DhCpmFc(-)”로 언급)을 제공한다. C-말단 라이신(K477)은 임의로, 음으로 하전된 DhCpmFc(-) 서열, 양으로 하전된 DhCpmFc(+) 서열, 또는 이들 서열 둘 다에서 또한 결실될 수 있다. 참조: 예를 들면, 서열번호 18, 19, 85, 86, 89, 90, 91, 99, 100, 108, 109 및 111 (DhCpmFc 서열들).
함께 항온처리되는 경우, 아스파르테이트 잔기들은 정전기력을 통해 라이신 잔기들과 연합하여, DhCpmFc(+) 서열들과 DhCpmFc(-) 서열들 사이에 Fc 이종이량체들의 형성을 촉진하고, DhCpmFc(+) 서열들 사이에 또는 DhCpmFc(-) 서열들 사이에 Fc 단독이량체들의 형성을 감소시키거나 방지한다.
일부 구현예들에서 이종이량체는 (i) 직접 또는 링커를 통해 DhCpmFc(-)의 C-말단에 연결된 성숙한 GDF15 서열 및 (ii) DhCpmFc(+)를 포함한다. 다른 구현예들에서 이종이량체는 (i) 직접 또는 링커를 통해 DhCpmFc(+)의 C-말단에 연결된 성숙한 GDF15 서열 및 (ii) DhCpmFc(-)를 포함한다. 어느 경우에도, 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 사량체를 형성하며, 여기서 상기 이종이량체들은 2개의 GDF15 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합들을 경유해 연결된다. 2개의 사람 GDF15 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합을 통해 연결된 2개의 이종이량체들을 포함하는 사량체의 그래프적 묘사에 대해서 도 1을 참조하며, 여기서 각각의 이종이량체는 본 기재내용에서 “DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(-)”로 지정된 하전된 쌍 (delHinge) 구조체(즉, 여기서 각각의 이종이량체는 (i) (G4S)4(서열번호 20) 링커를 통해 DhCpmFc(-) 서열의 C-말단에 연결된 성숙한 GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 제1의 단량체 및 (ii) DhCpmFc(+) 서열을 포함하는 제2의 단량체를 포함한다)이다.
II.B.1 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+)
본 기재내용에서 “DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+)”로 지정된 하전된 쌍 (delHinge) 구조체는 (i) (G4S)4 (서열번호 20) 링커를 경유하여 DhCpmFc(-) 서열의 C-말단에 연결된 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 제1의 단량체 및 (ii) DhCpmFc(+) 서열을 포함하는 제2의 단량체를 포함하는, 이종이량체를 포함하는 구조체를 말한다. 음으로 하전된 DhCpmFc(-)-(G4S)4-hGDF15 쇄는 음으로 하전된 DhCpmFc(-) 쇄와 연합하여 이종이량체를 형성한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 사량체를 형성하며 여기서 당해 이종이량체들은 2개의 사람 GDF15 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합을 통해 연결된다.
보다 특히, 특수한 구현예에서, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체는:
(a) 다음의 서열을 포함하는 가공된 양으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 18),
(b) 다음의 서열을 포함하는 가공된 음으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 19),
및
(c) 서열번호 12를 포함하는 천연의 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체)를 포함한다.
GDF15 폴리펩타이드는 서열:
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 20)
을 포함하는 링커를 통해 GDF15 폴리펩타이드의 N-말단에서 펩타이드 결합을 통해 음으로 하전된 Fc 서열에 융합된다.
이의 최종 형태에서, 다른 이러한 이종이량체와 함께 사량체를 형성하는, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
caaagactgccactgcatatga (서열번호 43)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(링커는 밑줄쳐져 있다):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 44).
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이의 최종 형태로, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다)을 포함하고:
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactcccaaagactgccactgcatatga (서열번호 21)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 한줄로 밑줄쳐져 있고 링커 서열은 기울여지고 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 22).
이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgaagtccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (서열번호 46)
서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다.
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고 (시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccgcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgaagtccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (서열번호 17)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 45).
제1 및 제2의 단량체들은 연합하여 이종이량체를 형성한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 최종의 사량체를 형성한다. 따라서, 수득되는 사량체(DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체)는 서열번호 18을 포함하는 2개의 단량체들 및 서열번호 44를 포함하는 2개의 단량체들을 포함한다.
II.B.2 DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(-)
본 기재내용에서 “DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(-)”로 지정된 하전된 쌍(delHinge) 구조체는 (i) (G4S)4(서열번호 20) 링커를 경유하여 DhCpmFc(+) 서열의 C-말단에 연결된 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 제1의 단량체 및 (ii) DhCpmFc(-) 서열을 포함하는 제2의 단량체를 포함하는, 이종이량체를 포함하는 구조체를 말한다. 양으로 하전된 DhCpmFc(+)-(G4S)4-hGDF15 쇄는 음으로 하전된 DhCpmFc(-) 쇄와 연합하여 이종이량체를 형성한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 사량체를 형성하며 여기서 당해 이종이량체들은 2개의 사람 GDF15 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합들을 통해 연결된다.
보다 특히, 구체적인 구현예에서, DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(-) 사량체는:
(a) 다음의 서열을 포함하는 가공된 양으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 85)
(b) 다음 서열을 포함하는 가공된 음으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 86),
및
(c) 서열번호 12를 포함하는 천연의 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체)를 포함한다.
GDF15 폴리펩타이드는 서열번호 20을 포함하는 링커를 경유하여 GDF15 폴리펩타이드의 N-말단에서 펩타이드 결합을 통해 양으로 하전된 Fc 서열에 융합된다.
이의 최종 형태에서, 다른 이러한 이종이량체와 함께 사량체를 형성하는, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화된다:
caaagactgccactgcatatga (서열번호 49)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(링커는 밑줄쳐져 있다):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(서열번호 50).
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이의 최종 형태에서, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactcccaaagactgccactgcatatga (서열번호 47)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 한줄로 밑줄쳐져 있고 링커 서열은 기울여지고 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(서열번호 48).
이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (서열번호 53)
서열번호 86의 아미노산 서열을 포함한다.
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고 (시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccgcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (서열번호 51)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 52).
제1 및 제2의 단량체들은 연합하여 이종이량체를 형성한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 최종의 사량체를 형성한다. 따라서, 수득되는 사량체(DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(-) 구조체의 이량체)는 서열번호 86을 포함하는 2개의 단량체들 및 서열번호 50을 포함하는 2개의 단량체들을 포함한다.
II.B.3.DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15(H6D):DhCpmFc(+)
본 기재내용에서 “DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15(H6D):DhCpmFc(+)”로 지정된 하전된 쌍 (delHinge) 구조체는 (i) (G4S)4(서열번호 20) 링커를 경유하여 DhCpmFc(-) 서열의 C-말단에 연결된 성숙한 사람 GDF15(H6D) 폴리펩타이드를 포함하는 제1의 단량체 및 (ii) DhCpmFc(+) 서열을 포함하는 제2의 단량체를 포함하는, 이종이량체를 포함하는 구조체를 말한다. 음으로 하전된 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15(H6D) 쇄는 양으로 하전된 DhCpmFc(+) 쇄와 연합한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 사량체를 형성하며, 여기서 당해 이종이량체들은 2개의 사람 GDF15(H6D) 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합들을 통해 연결된다.
보다 특히, 구체적인 구현예에서, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15(H6D):DhCpmFc(+) 사량체는:
(a) 서열번호 18을 포함하는 가공된 양으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체),
(b) 서열번호 19를 포함하는 가공된 음으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체), 및
(c) 서열번호 38을 포함하는 성숙한 사람 GDF15(H6D) 폴리펩타이드의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체)를 포함한다.
GDF15(H6D) 폴리펩타이드는 서열번호 20을 포함하는 링커를 경유하여 GDF15(H6D) 폴리펩타이드의 N-말단에서 펩타이드 결합을 통해 음으로 하전된 Fc 서열에 융합된다.
이의 최종 형태에서, 다른 이러한 이종이량체와 함께 사량체를 형성하는, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
caaagactgccactgcatatga (서열번호 56)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(링커는 밑줄쳐져 있다):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDDCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 57).
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이의 최종 형태에서, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactcccaaagactgccactgcatatga (서열번호 54)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 밑줄쳐져 있고 링커는 기울여지고 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ARNGDDCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 55)
이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 서열번호 46의 핵산 서열에 의해 암호화되어 있고 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다.
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 서열번호 17의 핵산 서열에 의해 암호화되고 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함한다.
제1 및 제2의 단량체들은 연합하여 이종이량체를 형성한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 최종의 사량체를 형성한다. 따라서, 수득되는 사량체(DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15(H6D):DhCpmFc(+) 구조체의 이량체)는 서열번호 18을 포함하는 2개의 단량체들 및 서열번호 57을 포함하는 2개의 단량체들을 포함한다.
II.B.4.DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(H6D):DhCpmFc(-)
본 기재내용에서 “DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(H6D):DhCpmFc(-)”로 지정된 하전된 쌍(delHinge) 구조체는, (i) (G4S)4(서열번호 20) 링커를 경유하여 DhCpmFc(+) 서열의 C-말단에 연결된 성숙한 사람 GDF15(H6D) 폴리펩타이드를 포함하는 제1의 단량체 및 (ii) DhCpmFc(-) 서열을 포함하는 제2의 단량체를 포함하는, 이종이량체를 포함하는 구조체를 말한다. 양으로 하전된 DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(H6D) 쇄는 음으로 하전된 DhCpmFc(-) 쇄와 연합한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 사량체를 형성하며, 여기서 당해 이종이량체들은 2개의 사람 GDF15(H6D) 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합들을 통해 연결된다.
보다 특히, 구체적인 구현예에서, DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(H6D):DhCpmFc(-) 사량체는:
(a) 서열번호 85를 포함하는 가공된 양으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체),
(b) 서열번호 86을 포함하는 가공된 음으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체), 및
(c) 서열번호 38을 포함하는 성숙한 사람 GDF15(H6D) 폴리펩타이드의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체)를 포함한다.
GDF15(H6D) 폴리펩타이드는 서열번호 20을 포함하는 링커를 경유하여 GDF15(H6D) 폴리펩타이드의 N-말단에서 펩타이드 결합을 통해 양으로 하전된 Fc 서열에 융합된다.
이의 최종 형태에서, 다른 이러한 이종이량체와 함께 사량체를 형성하는, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
caaagactgccactgcatatga (서열번호 60)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(링커는 밑줄쳐져 있다):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDDCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 61).
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이의 최종 형태에서, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactcccaaagactgccactgcatatga (서열번호 58)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 한줄로 밑줄쳐져 있고 링커는 기울여지고 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ARNGDDCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 59).
이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 서열번호 53의 핵산에 의해 암호화되고 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함한다.
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 서열번호 51의 핵산 서열에 의해 암호화되고 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함한다.
제1 및 제2의 단량체들은 연합하여 이종이량체를 형성한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 최종의 사량체를 형성한다. 따라서, 수득되는 사량체(DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(H6D):DhCpmFc(-) 구조체의 이량체)는 서열번호 86을 포함하는 2개의 단량체들 및 서열번호 61을 포함하는 2개의 단량체들을 포함한다.
II.B.5.DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(N3Q):DhCpmFc(-)
본 기재내용에서 “DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(N3Q):DhCpmFc(-)”로 지정된 하전된 쌍(delHinge) 구조체는, (i) (G4S)4(서열번호 20) 링커를 경유하여 DhCpmFc(+)”) 서열의 C-말단에 연결된 성숙한 사람 GDF15(N3Q) 폴리펩타이드를 포함하는 제1의 단량체 및 (ii) DhCpmFc(-) 서열을 포함하는 제2의 단량체를 포함하는, 이종이량체를 포함하는 구조체를 말한다. 양으로 하전된 DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(N3Q) 쇄는 이후에 음으로 하전된 DhCpmFc(-) 쇄와 연합한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 사량체를 형성하며, 여기서 당해 이종이량체들은 2개의 사람 GDF15(N3Q) 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합들을 통해 연결된다.
보다 특히, 구체적인 구현예에서, DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(N3Q):DhCpmFc(-) 사량체는:
(a) 서열번호 85를 포함하는 가공된 양으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체)
(b) 서열번호 86을 포함하는 가공된 음으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체), 및
(c) 서열번호 42를 포함하는 성숙한 사람 GDF15(N3Q) 폴리펩타이드의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체)를 포함한다.
GDF15(N3Q) 폴리펩타이드는 서열번호 20을 포함하는 링커를 경유하여 GDF15(N3Q) 폴리펩타이드의 N-말단에서 펩타이드 결합을 통해 양으로 하전된 Fc 서열에 융합된다.
이의 최종 형태에서, 다른 이러한 이종이량체와 함께 사량체를 형성하는, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
caaagactgccactgcatatga (서열번호 64)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(링커 서열은 밑줄쳐져 있다):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARQGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 65)
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이의 최종 형태에서, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactcccaaagactgccactgcatatga (서열번호 62)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 한줄로 밑줄쳐져 있고 링커 서열은 기울여지고 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ARQGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 63)
이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 서열번호 53의 핵산에 의해 암호화되고 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함한다.
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 서열번호 51의 핵산 서열에 의해 암호화되고 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함한다.
제1 및 제2의 단량체들은 연합하여 이종이량체를 형성한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 최종의 사량체를 형성한다. 따라서, 수득되는 사량체(DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(N3Q):DhCpmFc(-) 구조체의 이량체)는 서열번호 86을 포함하는 2개의 단량체들 및 서열번호 65를 포함하는 2개의 단량체들을 포함한다.
II.B.6. DhCpmFc(+)-GDF15:DhCpmFc(-)
본 기재내용에서 “DhCpmFc(+)-GDF15:DhCpmFc(-)”로 지정된 하전된 쌍 (delHinge) 구조체는, (i) DhCpmFc(+) 서열의 C-말단에 연결된 하나의 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 제1의 단량체 및 (ii) DhCpmFc(-) 서열을 포함하는 제2의 단량체를 포함하는, 이종이량체를 포함하는 구조체를 말한다. 양으로 하전된 DhCpmFc(+)-GDF15 쇄는 음으로 하전된 DhCpmFc(-) 쇄와 연합하여 이종이량체를 형성한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 사량체를 형성하며 여기서 당해 이종이량체들은 2개의 사람 GDF15 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합을 통해 연결된다.
보다 특히, 구체적인 구현예에서, DhCpmFc(+)-GDF15:DhCpmFc(-) 사량체는:
(a) 서열번호 85를 포함하는 가공된 양으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체)
(b) 서열번호 86을 포함하는 가공된 음으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체), 및
(c) 서열번호 12를 포함하는 천연의 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체)를 포함한다.
GDF15 폴리펩타이드는 GDF15 폴리펩타이드의 N-말단에서 펩타이드 결합을 통해 양으로 하전된 Fc 서열에 융합된다.
이의 최종 형태에서, 다른 이러한 이종이량체와 함께 사량체를 형성하는, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
gccccagagctgcttggtggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagccgaaggacaccctgatgatctcaagaactccggaagtgacttgcgtcgtcgtggacgtgtcacatgaggatccagaggtcaagttcaattggtatgtggacggagtggaagtgcataacgccaagaccaaaccccgcgaagaacagtacaatagcacctaccgcgtggtgagcgtccttactgtgctccaccaggactggcttaatgggaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaaggccctccccgctcccatcgaaaagaccatctcaaaggcaaaggggcaaccaagggaacctcaagtgtacaccctgcctccgagcaggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacttgtctcgtgaagggcttctatcccagcgatattgctgtggaatgggagtcaaatggccagcccgagaataactacaaaactaccccacccgtgctgaaatctgatgggtccttcttcctttactccaagctgaccgtggacaagagccgctggcaacaaggcaatgtctttagctgctcagtgatgcatgaggctctccataatcactacactcagaagtcactgtccctgtcacctggagcacggaacggggaccattgtcccctgggacctggtcggtgctgccggcttcacaccgtcagagcctctctggaggaccttggatgggctgattgggtgctgagccctcgggaggtgcaagtcaccatgtgcatcggggcctgccctagccagttccgcgcagccaacatgcacgctcagatcaaaacctctcttcacagactgaagcccgacaccgtgccagcaccttgctgtgtgccggcctcttataaccccatggtcctcattcagaaaaccgacaccggagtgtcacttcagacttacgatgacctcctggccaaggactgccactgtatttga (서열번호 68)
다음의 아미노산 서열을 포함한다:
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 69).
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이의 최종 형태에서, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggagtggtcttgggtctttctgttcttcctctccgtcaccaccggtgtgcattctgccccagagctgcttggtggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagccgaaggacaccctgatgatctcaagaactccggaagtgacttgcgtcgtcgtggacgtgtcacatgaggatccagaggtcaagttcaattggtatgtggacggagtggaagtgcataacgccaagaccaaaccccgcgaagaacagtacaatagcacctaccgcgtggtgagcgtccttactgtgctccaccaggactggcttaatgggaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaaggccctccccgctcccatcgaaaagaccatctcaaaggcaaaggggcaaccaagggaacctcaagtgtacaccctgcctccgagcaggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacttgtctcgtgaagggcttctatcccagcgatattgctgtggaatgggagtcaaatggccagcccgagaataactacaaaactaccccacccgtgctgaaatctgatgggtccttcttcctttactccaagctgaccgtggacaagagccgctggcaacaaggcaatgtctttagctgctcagtgatgcatgaggctctccataatcactacactcagaagtcactgtccctgtcacctggagcacggaacggggaccattgtcccctgggacctggtcggtgctgccggcttcacaccgtcagagcctctctggaggaccttggatgggctgattgggtgctgagccctcgggaggtgcaagtcaccatgtgcatcggggcctgccctagccagttccgcgcagccaacatgcacgctcagatcaaaacctctcttcacagactgaagcccgacaccgtgccagcaccttgctgtgtgccggcctcttataaccccatggtcctcattcagaaaaccgacaccggagtgtcacttcagacttacgatgacctcctggccaaggactgccactgtatttga (서열번호 66)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 67).
이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 서열번호 53의 핵산에 의해 암호화되고 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함한다.
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 서열번호 51의 핵산 서열에 의해 암호화되고 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함한다.
제1 및 제2의 단량체들은 연합하여 이종이량체를 형성한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 최종의 사량체를 형성한다. 따라서, 수득되는 사량체(DhCpmFc(+)-GDF15:DhCpmFc(-) 구조체의 이량체)는 서열번호 19를 포함하는 2개의 단량체들 및 서열번호 69를 포함하는 2개의 단량체들을 포함한다.
II.B.7.DhCpmFc(+)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)
본 기재내용에서 “DhCpmFc(+)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)”로 지정된 하전된 쌍(delHinge) 구조체는 (i) G4(서열번호 70) 링커를 경유하여 DhCpmFc(+) 서열의 C-말단에 연결된 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 제1의 단량체 및 (ii) DhCpmFc(-) 서열을 포함하는 제2의 단량체를 포함하는, 이종이량체를 포함하는 구조체를 말한다. 양으로 하전된 DhCpmFc(+)-G4-GDF15 쇄는 음으로 하전된 DhCpmFc(-) 쇄와 연합한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 사량체를 형성하며, 여기서 이종이량체들은 2개의 사람 GDF15 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합들을 통해 연결된다.
보다 특히, 구체적인 구현예에서, DhCpmFc(+)-G4-GDF15:DhCpmFc(-) 사량체는:
(a) 서열번호 85를 포함하는 가공된 양으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체),
(b) 서열번호 86을 포함하는 가공된 음으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체), 및
(c) 서열번호 12를 포함하는 천연의 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체)를 포함한다.
GDF15 폴리펩타이드는 서열
GGGG (서열번호 70)
를 포함하는 링커를 경유하여 GDF15 폴리펩타이드의 N-말단에서 펩타이드 결합을 통해 양으로 하전된 Fc 서열에 융합된다.
이의 최종 형태에서, 다른 이러한 이종이량체와 함께 사량체를 형성하는, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
gccccagagctgcttggtggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagccgaaggacaccctgatgatctcaagaactccggaagtgacttgcgtcgtcgtggacgtgtcacatgaggatccagaggtcaagttcaattggtatgtggacggagtggaagtgcataacgccaagaccaaaccccgcgaagaacagtacaatagcacctaccgcgtggtgagcgtccttactgtgctccaccaggactggcttaatgggaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaaggccctccccgctcccatcgaaaagaccatctcaaaggcaaaggggcaaccaagggaacctcaagtgtacaccctgcctccgagcaggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacttgtctcgtgaagggcttctatcccagcgatattgctgtggaatgggagtcaaatggccagcccgagaataactacaaaactaccccacccgtgctgaaatctgatgggtccttcttcctttactccaagctgaccgtggacaagagccgctggcaacaaggcaatgtctttagctgctcagtgatgcatgaggctctccataatcactacactcagaagtcactgtccctgtcacctggcggaggtggaggagcacggaacggggaccattgtcccctgggacctggtcggtgctgccggcttcacaccgtcagagcctctctggaggaccttggatgggctgattgggtgctgagccctcgggaggtgcaagtcaccatgtgcatcggggcctgccctagccagttccgcgcagccaacatgcacgctcagatcaaaacctctcttcacagactgaagcccgacaccgtgccagcaccttgctgtgtgccggcctcttataaccccatggtcctcattcagaaaaccgacaccggagtgtcacttcagacttacgatgacctcctggccaaggactgccactgtatttga (서열번호 73)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(링커 서열은 밑줄쳐져 있다):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 74).
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이의 최종 형태에서, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고(절단된 시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggagtggtcttgggtctttctgttcttcctctccgtcaccaccggtgtgcattctgccccagagctgcttggtggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagccgaaggacaccctgatgatctcaagaactccggaagtgacttgcgtcgtcgtggacgtgtcacatgaggatccagaggtcaagttcaattggtatgtggacggagtggaagtgcataacgccaagaccaaaccccgcgaagaacagtacaatagcacctaccgcgtggtgagcgtccttactgtgctccaccaggactggcttaatgggaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaaggccctccccgctcccatcgaaaagaccatctcaaaggcaaaggggcaaccaagggaacctcaagtgtacaccctgcctccgagcaggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacttgtctcgtgaagggcttctatcccagcgatattgctgtggaatgggagtcaaatggccagcccgagaataactacaaaactaccccacccgtgctgaaatctgatgggtccttcttcctttactccaagctgaccgtggacaagagccgctggcaacaaggcaatgtctttagctgctcagtgatgcatgaggctctccataatcactacactcagaagtcactgtccctgtcacctggcggaggtggaggagcacggaacggggaccattgtcccctgggacctggtcggtgctgccggcttcacaccgtcagagcctctctggaggaccttggatgggctgattgggtgctgagccctcgggaggtgcaagtcaccatgtgcatcggggcctgccctagccagttccgcgcagccaacatgcacgctcagatcaaaacctctcttcacagactgaagcccgacaccgtgccagcaccttgctgtgtgccggcctcttataaccccatggtcctcattcagaaaaccgacaccggagtgtcacttcagacttacgatgacctcctggccaaggactgccactgtatttga (서열번호 71)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 한줄로 밑줄쳐져 있고 링커 서열은 기울여지고 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGG ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 72).
이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 서열번호 53의 핵산에 의해 암호화되고 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함한다.
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 서열번호 51의 핵산 서열에 의해 암호화되고 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함한다.
제1 및 제2의 단량체들은 연합하여 이종이량체를 형성한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 최종의 사량체를 형성한다. 따라서, 수득되는 사량체(DhCpmFc(+)-G4-GDF15:DhCpmFc(-) 구조체의 이량체)는 서열번호 86을 포함하는 2개의 단량체들 및 서열번호 74를 포함하는 2개의 단량체들을 포함한다.
II.B.8.DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF15:DhCpmFc(-)
본 기재내용에서 “DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF15:DhCpmFc(-)”로 지정된 하전된 쌍(delHinge) 구조체는, (i) (G4S)2(서열번호 75) 링커를 경유하여 DhCpmFc(+) 서열의 C-말단에 연결된 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 제1의 단량체 및 (ii) DhCpmFc(-) 서열을 포함하는 제2의 단량체를 포함하는, 이종이량체를 포함하는 구조체를 말한다. 양으로 하전된 DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF15 쇄는 음으로 하전된 DhCpmFc(-) 쇄와 연합한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 사량체를 형성하며 여기서 당해 이종이량체들은 2개의 사람 GDF15 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합을 통해 연결된다.
보다 특히, 구체적인 구현예에서, DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF15:DhCpmFc(-) 사량체는:
(a) 서열번호 85를 포함하는 가공된 양으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체),
(b) 서열번호 86을 포함하는 가공된 음으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체) 및
(c) 서열번호 12를 포함하는 천연의 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체)를 포함한다.
GDF15 폴리펩타이드는 서열
GGGGSGGGGS (서열번호 75)
을 포함하는 링커를 경유하여 GDF15 폴리펩타이드의 N-말단에서 펩타이드 결합을 통해 양으로 하전된 Fc에 융합된다.
이의 최종 형태에서, 다른 이러한 이종이량체와 함께 사량체를 형성하는, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
gcgccggaactgctgggcggcccgagcgtgtttctgtttccgccgaaaccgaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtggtggatgtgagccatgaagatccggaagtgaaatttaactggtatgtggatggcgtggaagtgcataacgcgaaaaccaaaccgcgcgaagaacagtataacagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggctgaacggcaaagaatataaatgcaaagtgagcaacaaagcgctgccggcgccgattgaaaaaaccattagcaaagcgaaaggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccgcaaagaaatgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctgaaaagcgatggcagcttttttctgtatagcaaactgaccgtggataaaagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcccgggcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgcgcgcaacggcgatcattgcccgctgggcccgggccgctgctgccgcctgcataccgtgcgcgcgagcctggaagatctgggctgggcggattgggtgctgagcccgcgcgaagtgcaggtgaccatgtgcattggcgcgtgcccgagccagtttcgcgcggcgaacatgcatgcgcagattaaaaccagcctgcatcgcctgaaaccggataccgtgccggcgccgtgctgcgtgccggcgagctataacccgatggtgctgattcagaaaaccgataccggcgtgagcctgcagacctatgatgatctgctggcgaaagattgccattgcatttga (서열번호 78)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(링커 서열은 밑줄쳐져 있다):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 79).
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이의 최종 형태에서, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccgcgccggaactgctgggcggcccgagcgtgtttctgtttccgccgaaaccgaaagataccctgatgattagccgcaccccggaagtgacctgcgtggtggtggatgtgagccatgaagatccggaagtgaaatttaactggtatgtggatggcgtggaagtgcataacgcgaaaaccaaaccgcgcgaagaacagtataacagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgaccgtgctgcatcaggattggctgaacggcaaagaatataaatgcaaagtgagcaacaaagcgctgccggcgccgattgaaaaaaccattagcaaagcgaaaggccagccgcgcgaaccgcaggtgtataccctgccgccgagccgcaaagaaatgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaaaggcttttatccgagcgatattgcggtggaatgggaaagcaacggccagccggaaaacaactataaaaccaccccgccggtgctgaaaagcgatggcagcttttttctgtatagcaaactgaccgtggataaaagccgctggcagcagggcaacgtgtttagctgcagcgtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagaaaagcctgagcctgagcccgggcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgcgcgcaacggcgatcattgcccgctgggcccgggccgctgctgccgcctgcataccgtgcgcgcgagcctggaagatctgggctgggcggattgggtgctgagcccgcgcgaagtgcaggtgaccatgtgcattggcgcgtgcccgagccagtttcgcgcggcgaacatgcatgcgcagattaaaaccagcctgcatcgcctgaaaccggataccgtgccggcgccgtgctgcgtgccggcgagctataacccgatggtgctgattcagaaaaccgataccggcgtgagcctgcagacctatgatgatctgctggcgaaagattgccattgcatttga (서열번호 76)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 한줄로 밑줄쳐져 있고 링커 서열은 기울여지고 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGGS ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 77).
이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 서열번호 53의 핵산에 의해 암호화되고 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함한다.
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 서열번호 51의 핵산 서열에 의해 암호화되고 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함한다.
제1 및 제2의 단량체들은 연합하여 이종이량체를 형성한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 최종의 사량체를 형성한다. 따라서, 수득되는 사량체(DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF15:DhCpmFc(-) 구조체의 이량체)는 서열번호 86을 포함하는 2개의 단량체들 및 서열번호 79를 포함하는 2개의 단량체들을 포함한다.
II.B.9.DhCpmFc(+)-(G4Q)2-GDF15:DhCpmFc(-)
본 기재내용에서 “DhCpmFc(+)-(G4Q)4-GDF15:DhCpmFc(-)”로 지정된 하전된 쌍 (delHinge) 구조체는 (i) (G4Q)4 (서열번호 80) 링커를 경유하여 DhCpmFc(+) 서열의 C-말단에 연결된 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 제1의 단량체 및 (ii) DhCpmFc(-) 서열을 포함하는 제2의 단량체를 포함하는, 이종이량체를 포함하는 구조체를 말한다. 양으로 하전된 DhCpmFc(+)-(G4Q)4-GDF15 쇄는 음으로 하전된 DhCpmFc(-) 쇄와 연합한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 사량체를 형성하며 여기서 당해 이종이량체들은 2개의 사람 GDF15 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합을 통해 연결된다.
보다 특히, 구체적인 구현예에서, DhCpmFc(+)-(G4Q)4-GDF15:DhCpmFc(-) 사량체는:
(a) 서열번호 85를 포함하는 가공된 양으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체),
(b) 서열번호 86을 포함하는 가공된 음으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체), 및
(c) 서열번호 12를 포함하는 천연의 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체)를 포함한다.
GDF15 폴리펩타이드는 서열
GGGGQGGGGQGGGGQGGGGQ (서열번호 80)
을 포함하는 링커를 경유하여 GDF15 폴리펩타이드의 N-말단에서 펩타이드 결합을 통해 양으로 하전된 Fc에 융합된다.
이의 최종 형태에서, 다른 이러한 이종이량체와 함께 사량체를 형성하는, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
caaggactgccactgtatttga (서열번호 83)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(링커 서열은 밑줄쳐져 있다):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 84).
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이의 최종 형태에서, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggagtggtcttgggtctttctgttcttcctctccgtcaccaccggtgtgcattctcaaggactgccactgtatttga (서열번호 81)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 한줄로 밑줄쳐져 있고 링커 서열은 기울여지고 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGQGGGGQGGGGQGGGGQ ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 82).
이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 서열번호 53의 핵산에 의해 암호화되고 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함한다.
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 서열번호 51의 핵산 서열에 의해 암호화되고 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함한다.
제1 및 제2의 단량체들은 연합하여 이종이량체를 형성한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 최종의 사량체를 형성한다. 따라서, 수득되는 사량체(DhCpmFc(+)-(G4Q)4-GDF15:DhCpmFc(-) 구조체의 이량체)는 서열번호 86을 포함하는 2개의 단량체들 및 서열번호 84를 포함하는 2개의 단량체들을 포함한다.
II.B.10.DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(L351C)
본 기재내용에서 “DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(L351C)”로 지정된 하전된 쌍 (delHinge) 구조체는 (i) G4(서열번호 70) 링커를 경유하여 힌지 영역을 결여한 양으로 하전된 Fc 단량체(본원에서 “DhCpmFc(+)(L351C)”로 언급됨) 및 힌지 영역을 결여한 하나의 음으로 하전된 Fc 단량체(본원에서 “DhCpmFc(-)(L351C)”로 언급됨)의 C-말단에 연결된 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 제1의 단량체를 포함하는 이종이량체를 포함하는 구조체를 말한다.
위에서 논의된 것으로서, 아스파르트산의-라이신으로의 돌연변이(E356K) 및 글루탐산의-라이신으로의 돌연변이(D399K)를 힌지 영역을 결여한 변형되지 않은 Fc 서열내에 도입하는 것은 양으로 하전된 DhCpmFc(+) 서열을 제공한다. 2개의 라이신의-아스파르테이트로의 돌연변이들(K392D, K409D)을 도입하는 것은 음으로 하전된 DhCpmFc(-) 서열을 제공한다. C-말단 라이신 (K477)은 임의로 또한 음으로 하전된 DhCpmFc(-) 서열, 양으로 하전된 DhCpmFc(+) 서열, 또는 둘 다에서 결실될 수 있다. 함께 항온처리하는 경우, 아스파르테이트 잔기들은 라이신 잔기들과 정전기력을 통해 연합하여, DhCpmFc(+)와 DhCpmFc(-) 서열들 사이에 Fc 이종이량체들의 형성을 촉진하고, DhCpmFc(+) 서열들 사이 또는 DhCpmFc(-) 서열들 사이에 Fc 단독이량체들의 형성을 감소시키거나 방지한다.
양으로 하전된 DhCpmFc(+) 서열 내에 루이신의-시스테인으로의 돌연변이(L351C)(본원에서 “DhCpmFc(+)(L351C)”로 언급함) 및 음으로 하전된 DhCpmFc(-) 서열 내에 루이신의-시스테인으로의 돌연변이(L351C)(본원에서 “DhCpmFc(-)(L351C)”로 언급함)를 도입하는 것은 이들 사이에 이황화물 결합[또는 “시스테인 클랩프(cystein clamp)”]의 형성에 의해 DhCpmFc(+)(L351C)와 DhCpmFc(-)(L351C) 서열들 사이에 Fc 이종이량체들의 형성을 추가로 향상시킨다. 양으로 하전된 DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15 쇄는 음으로 하전된 DhCpmFc(-)(L351C) 쇄와 연합한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 사량체를 형성하며 여기서 당해 이종이량체들은 2개의 사람 GDF15 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합을 통해 연결된다.
보다 특히, 구체적인 구현예에서, DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(L351C) 사량체는:
(a) 다음을 포함하는 가공된 양으로 하전된 Fc(L351) 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTCPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 90)
(b) 하기의 가공된 음으로 하전된 Fc(L351) 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTCPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 91)
및
(c) 서열번호 12를 포함하는 천연의 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체)를 포함한다.
GDF15 폴리펩타이드는 서열번호 70을 포함하는 링커를 경유하여 GDF15 폴리펩타이드의 N-말단에서 펩타이드 결합을 통해 양으로 하전된 Fc(L351C) 서열에 융합된다.
이의 최종 형태에서, 다른 이러한 이종이량체와 함께 사량체를 형성하는 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
gccccagagctgcttggtggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagccgaaggacaccctgatgatctcaagaactccggaagtgacttgcgtcgtcgtggacgtgtcacatgaggatccagaggtcaagttcaattggtatgtggacggagtggaagtgcataacgccaagaccaaaccccgcgaagaacagtacaatagcacctaccgcgtggtgagcgtccttactgtgctccaccaggactggcttaatgggaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaaggccctccccgctcccatcgaaaagaccatctcaaaggcaaaggggcaaccaagggaacctcaagtgtacacctgtcctccgagcaggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacttgtctcgtgaagggcttctatcccagcgatattgctgtggaatgggagtcaaatggccagcccgagaataactacaaaactaccccacccgtgctgaaatctgatgggtccttcttcctttactccaagctgaccgtggacaagagccgctggcaacaaggcaatgtctttagctgctcagtgatgcatgaggctctccataatcactacactcagaagtcactgtccctgtcacctggcggaggtggaggagcacggaacggggaccattgtcccctgggacctggtcggtgctgccggcttcacaccgtcagagcctctctggaggaccttggatgggctgattgggtgctgagccctcgggaggtgcaagtcaccatgtgcatcggggcctgccctagccagttccgcgcagccaacatgcacgctcagatcaaaacctctcttcacagactgaagcccgacaccgtgccagcaccttgctgtgtgccggcctcttataaccccatggtcctcattcagaaaaccgacaccggagtgtcacttcagacttacgatgacctcctggccaaggactgccactgcatatga (서열번호 94)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(링커 서열은 밑줄쳐져 있다):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTCPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 95).
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이의 최종 형태에서, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggaatggagctgggtctttctgttcttcctctccgtcaccaccggtgtgcattctgccccagagctgcttggtggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagccgaaggacaccctgatgatctcaagaactccggaagtgacttgcgtcgtcgtggacgtgtcacatgaggatccagaggtcaagttcaattggtatgtggacggagtggaagtgcataacgccaagaccaaaccccgcgaagaacagtacaatagcacctaccgcgtggtgagcgtccttactgtgctccaccaggactggcttaatgggaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaaggccctccccgctcccatcgaaaagaccatctcaaaggcaaaggggcaaccaagggaacctcaagtgtacacctgtcctccgagcaggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacttgtctcgtgaagggcttctatcccagcgatattgctgtggaatgggagtcaaatggccagcccgagaataactacaaaactaccccacccgtgctgaaatctgatgggtccttcttcctttactccaagctgaccgtggacaagagccgctggcaacaaggcaatgtctttagctgctcagtgatgcatgaggctctccataatcactacactcagaagtcactgtccctgtcacctggcggaggtggaggagcacggaacggggaccattgtcccctgggacctggtcggtgctgccggcttcacaccgtcagagcctctctggaggaccttggatgggctgattgggtgctgagccctcgggaggtgcaagtcaccatgtgcatcggggcctgccctagccagttccgcgcagccaacatgcacgctcagatcaaaacctctcttcacagactgaagcccgacaccgtgccagcaccttgctgtgtgccggcctcttataaccccatggtcctcattcagaaaaccgacaccggagtgtcacttcagacttacgatgacctcctggccaaggactgccactgcatatga (서열번호 92)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 한줄로 밑줄쳐져 있고 링커 서열은 기울여지고 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTCPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGG ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 93).
이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacacctgtcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (서열번호 98)
서열번호 91의 아미노산 서열을 포함한다.
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고 (시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccgcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacacctgtcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (서열번호 96)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTCPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 97)
제1 및 제2의 단량체들은 연합하여 이종이량체를 형성한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 최종의 사량체를 형성한다. 따라서, 수득되는 사량체(DhCpmFc(+)(L351C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(L351C) 구조체의 이량체)는 서열번호 91을 포함하는 2개의 단량체들 및 서열번호 95를 포함하는 2개의 단량체들을 포함한다.
II.B.11.DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(Y349C)
본 기재내용의 “DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(Y349C)”로 지정된 하전된 쌍 (delHinge) 구조체는 (i) G4 (서열번호 70) 링커를 경유하여 힌지 영역을 결여한 양으로 하전된 Fc 단량체(본원에서 “DhCpmFc(+)(S354C)”로 언급됨) 및 힌지 영역을 결여한 하나의 음으로 하전된 Fc 단량체(본원에서 “DhCpmFc(-)(Y349C)”로 언급됨)의 C-말단에 연결된 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 제1의 단량체를 포함하는, 이종이량체를 포함하는 구조체를 말한다.
위에서 논의된 것으로서, 아스파르트산의-라이신으로의 돌연변이(E356K) 및 글루탐산의-라이신으로의 돌연변이(D399K)를 힌지 영역을 결여한 변형되지 않은 Fc 서열내에 도입하는 것은 양으로 하전된 DhCpmFc(+) 서열을 제공한다. 2개의 라이신의-아스파르테이트로의 돌연변이들(K392D, K409D)을 도입하는 것은 음으로 하전된 DhCpmFc(-) 서열을 제공한다. C-말단 라이신(K477)은 임의로 또한 음으로 하전된 DhCpmFc(-) 서열, 양으로 하전된 DhCpmFc(+) 서열, 또는 둘 다에서 결실될 수 있다. 함께 항온처리하는 경우, 아스파르테이트 잔기들은 라이신 잔기들과 정전기력을 통해 연합하여, DhCpmFc(+)와 DhCpmFc(-) 서열들 사이에 Fc 이종이량체들의 형성을 촉진하고, DhCpmFc(+) 서열들 사이 또는 DhCpmFc(-) 서열들 사이에 Fc 단독이량체들의 형성을 감소시키거나 방지한다.
양으로 하전된 DhCpmFc(+) 서열 내에 루이신의-시스테인으로의 돌연변이(S354C)(본원에서 “DhCpmFc(+)(S354C)”로 언급됨) 및 음으로 하전된 DhCpmFc(-) 서열 내에 루이신의-시스테인으로의 돌연변이(Y349C)(본원에서 “DhCpmFc(-)(L351C)”로 언급됨)를 도입시키는 것은 이들 사이에 이황화물 결합(또는 “시스테인 클램프”)를 형성시킴으로써 2개의 DhCpmFc(+)(S354C)와 DhCpmFc(-)(Y349C) 서열들 사이에 Fc 이종이량체들의 형성을 추가로 향상시킨다. 양으로 하전된 DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15 쇄는 음으로 하전된 DhCpmFc(-)(Y349C) 쇄와 연합한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 사량체를 형성하며 여기서 당해 이종이량체들은 2개의 사람 GDF15 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합을 통해 연결된다.
보다 특히, 구체적인 구현예에서, DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(Y349C) 사량체는:
(a) 다음 서열을 포함하는 가공된 양으로 하전된 Fc(S354C)의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 99),
(b) 다음 서열을 포함하는 가공된 음으로 하전된 Fc(Y349C)의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 100)
및
(c) 서열번호 12를 포함하는 천연의 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드의 2개의 쇄들(각각 하나의)을 포함한다.
GDF15 폴리펩타이드는 서열번호 70을 포함하는 링커를 경유하여 GDF15 폴리펩타이드의 N-말단에서 펩타이드 결합을 통해 양으로 하전된 Fc(S354C) 서열에 융합된다.
이의 최종 형태에서, 다른 이러한 이종이량체와 함께 사량체를 형성하는, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
gccccagagctgcttggtggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagccgaaggacaccctgatgatctcaagaactccggaagtgacttgcgtcgtcgtggacgtgtcacatgaggatccagaggtcaagttcaattggtatgtggacggagtggaagtgcataacgccaagaccaaaccccgcgaagaacagtacaatagcacctaccgcgtggtgagcgtccttactgtgctccaccaggactggcttaatgggaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaaggccctccccgctcccatcgaaaagaccatctcaaaggcaaaggggcaaccaagggaacctcaagtgtacaccctgcctccgtgcaggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacttgtctcgtgaagggcttctatcccagcgatattgctgtggaatgggagtcaaatggccagcccgagaataactacaaaactaccccacccgtgctgaaatctgatgggtccttcttcctttactccaagctgaccgtggacaagagccgctggcaacaaggcaatgtctttagctgctcagtgatgcatgaggctctccataatcactacactcagaagtcactgtccctgtcacctggcggaggtggaggagcacggaacggggaccattgtcccctgggacctggtcggtgctgccggcttcacaccgtcagagcctctctggaggaccttggatgggctgattgggtgctgagccctcgggaggtgcaagtcaccatgtgcatcggggcctgccctagccagttccgcgcagccaacatgcacgctcagatcaaaacctctcttcacagactgaagcccgacaccgtgccagcaccttgctgtgtgccggcctcttataaccccatggtcctcattcagaaaaccgacaccggagtgtcacttcagacttacgatgacctcctggccaaggactgccactgcatatga (서열번호 103)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(링커 서열은 밑줄쳐져 있다):
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 104)
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이의 최종 형태에서, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggaatggagctgggtctttctgttcttcctctccgtcaccaccggtgtgcattctgccccagagctgcttggtggaccatccgtgttcctgtttcctccaaagccgaaggacaccctgatgatctcaagaactccggaagtgacttgcgtcgtcgtggacgtgtcacatgaggatccagaggtcaagttcaattggtatgtggacggagtggaagtgcataacgccaagaccaaaccccgcgaagaacagtacaatagcacctaccgcgtggtgagcgtccttactgtgctccaccaggactggcttaatgggaaggaatacaagtgtaaggtgtccaacaaggccctccccgctcccatcgaaaagaccatctcaaaggcaaaggggcaaccaagggaacctcaagtgtacaccctgcctccgtgcaggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacttgtctcgtgaagggcttctatcccagcgatattgctgtggaatgggagtcaaatggccagcccgagaataactacaaaactaccccacccgtgctgaaatctgatgggtccttcttcctttactccaagctgaccgtggacaagagccgctggcaacaaggcaatgtctttagctgctcagtgatgcatgaggctctccataatcactacactcagaagtcactgtccctgtcacctggcggaggtggaggagcacggaacggggaccattgtcccctgggacctggtcggtgctgccggcttcacaccgtcagagcctctctggaggaccttggatgggctgattgggtgctgagccctcgggaggtgcaagtcaccatgtgcatcggggcctgccctagccagttccgcgcagccaacatgcacgctcagatcaaaacctctcttcacagactgaagcccgacaccgtgccagcaccttgctgtgtgccggcctcttataaccccatggtcctcattcagaaaaccgacaccggagtgtcacttcagacttacgatgacctcctggccaaggactgccactgcatatga (서열번호 101)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 한줄로 밑줄쳐져 있고 링커 서열은 기울여지고 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGG ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 102)
이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (서열번호 107)
서열번호 100의 아미노산 서열을 포함한다.
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고 (시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccgcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgacaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcgacctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (서열번호 105)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 106)
제1 및 제2의 단량체들은 연합하여 이종이량체를 형성한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 최종의 사량체를 형성한다. 따라서, 수득되는 사량체(DhCpmFc(+)(S354C)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)(Y349C) 구조체의 이량체)는 서열번호 100을 포함하는 2개의 단량체들 및 서열번호 104를 포함하는 2개의 단량체들을 포함한다.
II .C. 하전된 쌍 구조체
본 기내내용에서 “하전된 쌍” 또는 “하전된 쌍 Fc”로 지정된 구조체들은 전하 쌍 돌연변이를 포함하는 “음으로 하전된” Fc 서열 및 (ii) 전하 쌍 돌연변이를 포함하는 양으로 하전된 Fc 서열을 포함하는 구조체를 말한다. 용어들 “양으로 하전된” 및 “음으로 하전된”을 사용하는 것은 참조의 용이성을 위한 것이며(즉, Fc 서열들내 전하 쌍 돌연변이들의 특성을 기술하기 위해) 전체 서열 또는 구조체가 양성 또는 음성 전하를 필수적으로 가지는 것을 나타내지 않음에 주목한다.
변형되지 않은 Fc 서열 내에 아스파르트산의-라이신으로의 돌연변이(E356K) 및 글루탐산의-라이신으로의 돌연변이(D399K)를 도입하는 것은 양으로 하전된 Fc 서열(본원에서 “CpmFc(+)”로 언급됨)을 제공한다. 2개의 라이신의-아스파르테이트로의 돌연변이들(K392D, K409D)을 변형되지 않은 Fc 서열로 도입하는 것은 음으로 하전된 Fc 서열(본원에서 “CpmFc(-)”로 언급됨)을 제공한다. C-말단 라이신(K477)은 임의로 또한 음으로 하전된 CpmFc(-) 서열, 양으로 하전된 CpmFc(+) 서열, 또는 둘 다에서 결실될 수 있다. 예를 들면, 서열 번호들 23, 110, 114 및 115(CpmFc 서열들)을 참조한다. 함께 항온처리하는 경우, 아스파르테이트 잔기들은 라이신 잔기들과 연합하여 CpmFc(+)와 CpmFc(-) 서열들 사이에 Fc 이종이량체들의 형성을 촉진하고, CpmFc(+)와 CpmFc(-) 서열들 사이에 Fc 단독이량체들의 형성을 감소시키거나 방지한다.
일부 구현예들에서 이종이량체는 (i) CpmFc(-)의 C-말단에 직접 또는 링커를 경유해 연결된 성숙한 GDF15 서열 및 (ii) CpmFc(+)를 포함한다. 다른 구현예들에서 이종이량체는 (i) CpmFc(+)의 C-말단에 직접 또는 링커를 경유하여 연결된 성숙한 GDF15 서열 및 (ii) CpmFc(-)를 포함한다. 어떠한 경우에도, 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 사량체를 형성하며 여기서 당해 이종이량체들은 2개의 GDF15 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합을 통해 연결된다. 2개의 사람 GDF15 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합을 통해 연결된 2개의 이종이량체들을 포함하는 사량체의 그래프적 묘사는 도 1을 참조하고, 여기서 각각의 이종이량체는 본 기재내용에서 “CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15CpmFc(-)”로 지정된 하전된 쌍 구조체 (즉, 여기서 각각의 이종이량체는 (i) (G4S)4(서열번호 20) 링커를 경유하여 CpmFc(-) 서열의 C-말단에 연결된 성숙한 GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 제1의 단량체 및 (ii) CpmFc(+) 서열을 포함하는 제2의 단량체를 포함한다)이다.
CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+)
본 기재내용에서 “CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+)”로 지정된 하전된 쌍 구조체는, (i) (G4S)4 (서열번호 20) 링커를 경유하여 CpmFc(-) 서열의 C-말단에 연결된 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 제1의 단량체 및 (ii) CpmFc(+) 서열을 포함하는 제2의 단량체를 포함하는, 이종이량체를 포함하는 구조체를 말한다. 힌지 영역이 존재한다고 해도, 음으로 하전된 CpmFc(-)-(G4S)4-hGDF15 쇄는 음으로 하전된 CpmFc(-) 쇄와 연합하여 이종이량체를 형성한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 사량체를 형성하며 여기서 당해 이종이량체들은 2개의 사람 GDF15 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합을 통해 연결된다.
보다 특히, 구체적인 구현예에서, CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+) 구조체는:
(a) 다음의 서열(괄호들로 나타낸 힌지 영역 포함)을 포함하는 가공된 양으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나의 이종이량체):
(DKTHTCPPCP)APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 110),
(b) 하기의 서열(괄호들로 나타낸 힌지 영역 포함)을 포함하는 가공된 음으로 하전된 Fc 서열의 2개의 쇄들(각각 하나):
(DKTHTCPPCP)APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 23),
및
(c) 서열번호 12를 포함하는 천연의 성숙한 사람 GDF15 폴리펩타이드의 2개의 쇄들을 포함한다.
GDF15 폴리펩타이드는 서열번호 20을 포함하는 링커를 경유하여 GDF15 폴리펩타이드의 N-말단에서 펩타이드 결합을 통해 음으로 하전된 Fc 단량체에 융합된다.
이의 최종 형태에서, 다른 이러한 이종이량체와 함께 사량체를 형성하는, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
gtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatatga(서열번호 112)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(괄호들로 나타낸 힌지 영역 및 링커 서열은 기울여지고 밑줄쳐져 있다):
(DKTHTCPPCP)APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 113)
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이의 최종 형태에서, 이종이량체를 포함하는 제1의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatatga(서열번호 24)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 한줄로 밑줄쳐져 있고, 괄호들내 힌지 영역 및 링커 서열은 기울여지고 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(DKTHTCPPCP)APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGGSGGGGSGGGG SARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 25).
이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgaagtccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (서열번호 116)
서열번호 110의 아미노산 서열을 포함한다.
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이종이량체를 포함하는 제2의 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고 (시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccggaaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgaagtccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (서열번호 26)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 밑줄쳐져 있고, 힌지 영역은 괄호들 안에 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(DKTHTCPPCP)APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 27).
제1 및 제2의 단량체들은 연합하여 이종이량체를 형성한다. 2개의 이러한 이종이량체들은 연합하여 최종의 사량체를 형성한다. 따라서, 수득되는 사량체(CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+) 구조체의 이량체)는 서열번호 110을 포함하는 2개의 단량체들 및 서열번호 113을 포함하는 2개의 단량체들을 포함한다.
II .D. 헤미Fc 구조체들
본 기재내용에서 “헤미(hemi)” or “헤미Fc”로 지정된 구조체들은 제1의 Fc 서열(예를 들면, 서열 번호들 28 또는 30)의 N-말단을 제2의 Fc 서열(예를 들면, 서열 번호들 28 또는 30)의 C-말단에 연결하는 링커에 의해 나란히 결합된 2개의 Fc 서열들을 포함하는 구조체를 말한다. 일부 구현예들에서, 단량체는 GDF15 서열의 N-말단을 제1의 Fc 서열의 C-말단에 연결하는 제1의 링커에 의해 제1의 Fc 서열에 연결된 성숙한 GDF15 서열을 포함하며, 여기서 제1의 Fc 서열은 제1의 Fc 서열의 N-말단을 제2의 Fc 서열의 C-말단에 연결하는 제2의 링커에 의해 제2의 Fc 서열에 연결된다. 제1 및 제2의 Fc 서열들은 또한 Fc 힌지 영역들에 의해 연합되어 있다. 2개의 이러한 단량체들은 연합하여 이량체를 형성하여 여기서 당해 단량체들은 2개의 GDF15 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합을 통해 연결된다. 헤미 구조체 “Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15” (즉, 각각 GS(G4S)4 링커를 경유하여 제1의 Fc 서열의 C-말단에 연결되고, 이의 N-말단은 (G4S)8 링커를 경유하여 제2의 Fc 서열의 C-말단에 연결된 성숙한 GDF15 폴리펩타이드를 포함하고; 여기서 당해 성숙한 GDF15 서열들은 쇄간 이황화물 결합을 통해 연결되는 2개의 단량체들)의 그래프적 묘사에 대해서는 도 1을 참조한다.
II.D.1 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15
본 기재내용에서 “Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15”로 지정된 헤미Fc 구조체는 사람 GDF15 서열의 N-말단을 제1의 Fc 서열의 C-말단에 연결하는 서열번호 31을 포함하는 제1의 링커 및 제1의 Fc 서열의 N-말단을 제2의 Fc 서열의 C-말단에 연결하는 다음 아미노산 서열:
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 34).
을 포함하는 제2의 링커를 경유하여 제1의 Fc 서열에 연결된 성숙한 사람 GDF15 서열을 포함하는, 단량체를 포함하는 구조체를 말한다. 제1 및 제2의 Fc 서열들은 또한 Fc 힌지 영역들에 의해 연합되어 있다. 2개의 이러한 단량체들은 연합하여 단독이량체를 형성하며 여기서 당해 단량체들은 2개의 GDF15 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합을 통해 연결된다.
보다 특히, 구체적인 구현예에서, 헤미 구조체 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15은 다음의 서열(힌지 영역은 괄호안에 있다)을 포함하는 제2의 Fc 쇄를 포함하는 단량체를 포함하며:
GGG(ERKSSVECPPCP)APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 28)
상기 서열은 다음의 링커:
GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 29)
에 의해 다음의 서열(힌지 영역은 괄호안에 있다)을 포함하는 제1의 Fc 쇄에 결합되어 있으며:
(ERKSSVECPPCP)APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 30)
이의 C-말단에 대해, 서열번호 12를 포함하는 GDF15 폴리펩타이드가 다음의 서열을 갖는 링커에 의해 결합되어 있다:
GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 31)
이의 최종 형태에서, 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
acgggaagagcagtttaactctactttccgcgtggtttctgtgctgaccgtggtgcaccaagattggctcaacggcaaggagtacaagtgcaaggtaagcaataaggggctccctgcccccattgagaagactatctccaagacaaagggacagccacgcgagccacaagtctatacactccccccttcccgcgaagaaatgaccaagaatcaggttagcctgacatgcttggttaagggtttctacccctctgacatagccgtggagtgggagagcaatggacaaccagagaacaactacaagaccaccccacccatgctggatagcgacggttcattctttctgtatagtaagcttaccgtggacaagtcccggtggcaacaaggaaatgtcttttcatgctctgtgatgcacgaggccttgcataatcactatactcagaagagcttgagcctcagccccggatctggaggtggcggatccgggggcggtggaagcggaggtggtggatcgggaggcggtggaagcgcgcgcaacggcgaccactgtccgctcgggcccggacgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatatga (서열번호 32)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(힌지 영역들은 괄호안에, 링커들 서열들은 밑줄쳐져 있다):
GGG(ERKSSVECPPCP)APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(ERKSSVECPPCP)APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 33)
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이의 최종 형태에서, 단량체는 다음의 핵산에 의해 암호화되고(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactccacgggaagagcagtttaactctactttccgcgtggtttctgtgctgaccgtggtgcaccaagattggctcaacggcaaggagtacaagtgcaaggtaagcaataaggggctccctgcccccattgagaagactatctccaagacaaagggacagccacgcgagccacaagtctatacactccccccttcccgcgaagaaatgaccaagaatcaggttagcctgacatgcttggttaagggtttctacccctctgacatagccgtggagtgggagagcaatggacaaccagagaacaactacaagaccaccccacccatgctggatagcgacggttcattctttctgtatagtaagcttaccgtggacaagtcccggtggcaacaaggaaatgtcttttcatgctctgtgatgcacgaggccttgcataatcactatactcagaagagcttgagcctcagccccggatctggaggtggcggatccgggggcggtggaagcggaggtggtggatcgggaggcggtggaagcgcgcgcaacggcgaccactgtccgctcgggcccggacgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatatga (서열번호 117)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 밑줄쳐져 있고, 힌지 영역은 괄호안에 있으며 링커 서열들은 기울여지고 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSGGG(ERKSSVECPPCP)APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (ERKSSVECPPCP)APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 118)
2개의 이러한 단량체들은 연합하여 이량체를 형성하며 여기서 2개의 hGDF15 폴리펩타이드들은 2개의 천연적으로 존재하는(즉, 가공되지 않은) 시스테인 잔기들 사이의 이황화물 결합을 통해 연결된다. 따라서, 구체적인 헤미Fc 이량체성 구조체 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15는 서열번호 33을 포함하는 2개의 단량체들을 포함한다.
II.D.2 Fc-(G4S)3-Fc-GS(G4S)4-GDF15
본 기재내용에서 “Fc(G4S)3-Fc-GS(G4S)4-GDF15”로 지정된 헤미Fc 구조체는 사람 GDF15 서열의 N-말단을 제1의 Fc 서열의 C-말단에 연결하는 서열번호 31을 포함하는 제1의 링커 및 제1의 Fc 서열의 N-말단을 제2의 Fc 서열의 C-말단에 연결하는 다음의 아미노산 서열:
GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 87).
을 포함하는 제2의 링커를 경유하여 제1의 Fc 서열에 연결된 성숙한 사람 GDF15 서열을 포함하는, 단량체를 포함하는 구조체를 말한다. 제1 및 제2의 Fc 서열들은 또한 Fc 힌지 영역들에 의해 연합되어 있다. 2개의 이러한 단량체들은 연합하여 단독이량체를 형성하며 여기서 당해 단량체들은 2개의 GDF15 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합을 통해 연결된다.
보다 특히, 구체적인 구현예에서, 헤미Fc 구조체 Fc(G4S)3-Fc-GS(G4S)4-GDF15는 다음의 링커:
GGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 119)
에 의해 서열번호 30의 서열을 포함하는 제1의 Fc 쇄에 결합되고 이의 C-말단에 대해, 서열번호 12를 포함하는 GDF15 폴리펩타이드가 서열번호 31의 서열을 갖는 링커에 의해 결합된 서열번호 28의 서열을 포함하는 제2의 Fc 쇄를 포함하는 단량체를 포함한다.
이의 최종 형태에서, 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
gaaggagtacaagtgtaaggtgtctaacaaaggcctgccggctcccatcgaaaagactatcagcaagactaaggggcaacccagagaaccccaagtctacaccctgcctccgtcacgggaggagatgaccaagaatcaggtgtccctcacctgtctggtcaagggtttctaccctagcgacattgctgtggagtgggagagcaatggacagcccgaaaacaattacaagactaccccacccatgctggactcagacggatcatttttcctctactctaagctcactgtggacaagagccggtggcagcaagggaatgtgttcagctgttcagtgatgcatgaggccctgcataaccactacacccagaagagcctttcactgtcacccgggtctggtggcggtgggtcaggtggcggaggatcaggaggaggtggaagcggcggaggaggatctgccaggaacggtgatcactgccctctgggccctggtcgctgctgtaggcttcacactgtgcgggcttccctcgaagatctgggatgggccgactgggtgctgagcccaagagaggtgcaagtgaccatgtgcatcggggcatgtccctcccaattccgcgctgcaaacatgcatgctcagattaagacttcactgcatagactgaagccagataccgtcccagcaccctgttgtgtgcccgcttcatacaaccccatggtcctgattcaaaagaccgacaccggggtgtctctccagacctatgatgatcttcttgcaaaggactgccactgcatctga (서열번호 122)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(힌지 영역들은 괄호안에, 링커 서열들은 밑줄쳐져 있다):
GGG(ERKSSVECPPCP)APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGS(ERKSSVECPPCP)APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 123).
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이의 최종 형태에서, 단량체는 다음의 핵산에 의해 암호화되고(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggaatggtcatgggtgttccttttctttctctccgtcactaccggtgtgcactccgaaggagtacaagtgtaaggtgtctaacaaaggcctgccggctcccatcgaaaagactatcagcaagactaaggggcaacccagagaaccccaagtctacaccctgcctccgtcacgggaggagatgaccaagaatcaggtgtccctcacctgtctggtcaagggtttctaccctagcgacattgctgtggagtgggagagcaatggacagcccgaaaacaattacaagactaccccacccatgctggactcagacggatcatttttcctctactctaagctcactgtggacaagagccggtggcagcaagggaatgtgttcagctgttcagtgatgcatgaggccctgcataaccactacacccagaagagcctttcactgtcacccgggtctggtggcggtgggtcaggtggcggaggatcaggaggaggtggaagcggcggaggaggatctgccaggaacggtgatcactgccctctgggccctggtcgctgctgtaggcttcacactgtgcgggcttccctcgaagatctgggatgggccgactgggtgctgagcccaagagaggtgcaagtgaccatgtgcatcggggcatgtccctcccaattccgcgctgcaaacatgcatgctcagattaagacttcactgcatagactgaagccagataccgtcccagcaccctgttgtgtgcccgcttcatacaaccccatggtcctgattcaaaagaccgacaccggggtgtctctccagacctatgatgatcttcttgcaaaggactgccactgcatctga (서열번호 120)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 한줄로 밑줄쳐져 있고 힌지 영역들은 괄호안에 있으며 링커 서열들은 기울여지고 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSGGG(ERKSSVECPPCP)APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGGSGGGGS (ERKSSVECPPCP)APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 121).
2개의 이러한 단량체들은 연합하여 이량체를 형성하며 여기서 2개의 hGDF15 폴리펩타이드들은 2개의 천연적으로 존재하는(즉, 가공되지 않은) 시스테인 잔기들 사이의 이황화물 결합을 통해 연결된다. 따라서, 구체적인 헤미Fc 이량체성 구조체 Fc-(G4S)3-Fc-GS(G4S)4-GDF15는 서열번호 123을 포함하는 2개의 단량체들을 포함한다.
II.D.3 Fc-(G4S)5-Fc-GS(G4S)4-GDF15
본 기재내용에서 “Fc-(G4S)5-Fc-GS(G4S)4-GDF15”로 지정된 헤미Fc 구조체는 사람 GDF15 서열의 N-말단을 제1의 Fc 서열의 C-말단에 연결시키는 서열번호 31을 포함하는 제1의 링커 및 제1의 Fc 서열의 N-말단을 제2의 Fc 서열의 C-말단에 연결하는 다음의 아미노산 서열:
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 88).
을 포함하는 제2의 링커를 경유하여 제1의 Fc 서열에 연결된 성숙한 사람 GDF15 서열을 포함하는, 단량체를 포함하는 구조체를 말한다. 제1 및 제2의 Fc 서열들은 또한 Fc 힌지 영역들에 의해 연합되어 있다. 2개의 이러한 단량체들은 연합하여 단독이량체를 형성하며 여기서 당해 단량체들은 2개의 GDF15 서열들 사이의 쇄간 이황화물 결합을 통해 연결된다.
보다 특히, 구체적인 구현예에서, 헤미Fc 구조체 Fc-(G4S)5-Fc-GS(G4S)4-GDF15은 다음의 링커:
GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGSGGGGGS (서열번호 124)
에 의해 서열번호 30의 서열을 포함하는 제1의 Fc 쇄에 결합되고 이의 C-말단에 대해, 서열번호 12를 포함하는 GDF15 폴리펩타이드가 서열번호 31의 서열을 갖는 링커에 의해 결합된 서열번호 28의 서열을 포함하는 제2의 Fc 쇄를 포함하는 단량체를 포함한다.
이의 최종 형태에서, 단량체는 다음의 핵산 서열에 의해 암호화되고:
gaccgtcgtgcaccaggactggcttaacggaaaggaatacaagtgcaaggtgtccaacaaaggccttccagctcccattgagaaaaccatctctaaaactaagggtcaaccaagggaaccccaagtctacaccctccctccgtctagagaagagatgaccaaaaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggattttacccctcagacatcgccgtggagtgggaaagcaacggacagcccgaaaacaactataagactacccctcctatgctggactcagacggatctttcttcctctatagcaagctcactgtggacaaatccagatggcaacaagggaatgtgttctcatgcagcgtgatgcacgaggctcttcacaaccactatacccagaagagcctgtctctttcacctggttccggaggtggtgggagcggagggggtggatcaggtggtggagggtccggaggcggaggatccgcacggaatggcgaccactgtccactgggacccggaagatgttgtcgcctccacaccgtgagggcctctctggaggaccttggctgggccgactgggtcctgtcacctcgggaggtccaagtcaccatgtgtatcggagcctgccccagccaattcagagcagcaaatatgcacgcacagattaagaccagcctgcatcggcttaaacctgatactgtgccggctccttgttgcgtgccagcatcttacaacccgatggtgctgatccagaaaaccgataccggtgtctccctccagacttacgacgacctccttgcaaaggactgccattgcatctga (서열번호 127)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(힌지 영역들은 괄호안에, 링커 서열들은 밑줄쳐져 있다):
GGG(ERKSSVECPPCP)APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(ERKSSVECPP)CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 128)
VH21 시그날 서열을 사용하는 하나의 구현예에서, 이의 최종 형태에서, 단량체는 다음의 핵산에 의해 암호화되고(시그날 서열은 밑줄쳐져 있다):
atggagtggagctgggtctttcttttctttctgtctgtgactaccggagtccattcagaccgtcgtgcaccaggactggcttaacggaaaggaatacaagtgcaaggtgtccaacaaaggccttccagctcccattgagaaaaccatctctaaaactaagggtcaaccaagggaaccccaagtctacaccctccctccgtctagagaagagatgaccaaaaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggattttacccctcagacatcgccgtggagtgggaaagcaacggacagcccgaaaacaactataagactacccctcctatgctggactcagacggatctttcttcctctatagcaagctcactgtggacaaatccagatggcaacaagggaatgtgttctcatgcagcgtgatgcacgaggctcttcacaaccactatacccagaagagcctgtctctttcacctggttccggaggtggtgggagcggagggggtggatcaggtggtggagggtccggaggcggaggatccgcacggaatggcgaccactgtccactgggacccggaagatgttgtcgcctccacaccgtgagggcctctctggaggaccttggctgggccgactgggtcctgtcacctcgggaggtccaagtcaccatgtgtatcggagcctgccccagccaattcagagcagcaaatatgcacgcacagattaagaccagcctgcatcggcttaaacctgatactgtgccggctccttgttgcgtgccagcatcttacaacccgatggtgctgatccagaaaaccgataccggtgtctccctccagacttacgacgacctccttgcaaaggactgccattgcatctga (서열번호 125)
다음의 아미노산 서열을 포함한다(시그날 서열은 한줄로 밑줄쳐져 있고, 힌지 영역들은 괄호안에 있으며 링커 서열들은 기울여지고 밑줄쳐져 있다):
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSGGG(ERKSSVECPPCP)APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (ERKSSVECPPCP)APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 126)
2개의 이러한 단량체들은 연합하여 이량체를 형성하며 여기서 2개의 hGDF15 폴리펩타이드들은 2개의 천연적으로 존재하는(즉, 가공되지 않은) 시스테인 잔기들 사이의 이황화물 결합을 통해 연결된다. 따라서, 구체적인 헤미Fc 이량체성 구조체 Fc-(G4S)5-Fc-GS(G4S)4-GDF15는 서열번호 128을 포함하는 2개의 단량체들을 포함한다.
III . 이들의 돌연변이체 형태들을 포함하는, GDF15 폴리펩타이드들 및 GDF15 를 포함하는 구조체들
본원에 기재된 바와 같이, 본 기재내용에 기술된 GDF15 폴리펩타이드들(완전한 길이 및 성숙한 형태들의 사람 GDF15 포함) 및 GDF15를 포함하는 구조체들은 표준 분자 생물학 방법론을 사용하여 가공하고/하거나 생산함으로써 본원에 제공된 GDF15 폴리펩타이드들 및 구조체들의 돌연변이 형태를 형성시킬 수 있다. 각종 실시예들에서, 서열 번호들 4, 8 또는 12 중의 모두 또는 일부를 포함할 수 있는, 본원에 제공된 GDF15 폴리펩타이드들의 돌연변이 형태 및 구조체들을 암호화하는 핵산 서열은 게놈 DNA, 또는 cDNA로부터 적절한 올리고뉴클레오타이드 프라이머들을 사용하여 분리하고/하거나 증폭시킬 수 있다. 프라이머들은 표준 (RT)-PCR 증폭 기술들에 따라 본원에 제공된 핵산 및 아미노산 서열들을 기준으로 설계할 수 있다. 증폭된 GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드 핵산은 이후에 적합한 벡터 내로 클로닝하여 DNA 서열 분석으로 특성화할 수 있다.
본원에 제공된 GDF15 폴리펩타이드들 및 구조체들의 돌연변이 형태 중의 모두 또는 일부를 분리하거나 증폭시키는데 있어서 프로브들로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드들은 표준 합성 기술들, 예를 들면, 자동화된 DNA 합성 장치를 사용하여 설계하고 생성시킬 수 있거나, 보다 긴 서열의 DNA로부터 분리할 수 있다.
III .A. GDF15 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열들
생체내에서, GDF15는 시그날 서열, 프로 도메인(pro domain) 및 활성 도메인을 포함하는 인접한 아미노산 서열로서 발현된다.
완전한 길이의 사람 GDF15의 308개의 아미노산 서열은:
MPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 4)
이고 다음의 DNA 서열에 의해 암호화된다:
atgcccgggcaagaactcaggacggtgaatggctctcagatgctcctggtgttgctggtgctctcgtggctgccgcatgggggcgccctgtctctggccgaggcgagccgcgcaagtttcccgggaccctcagagttgcactccgaagactccagattccgagagttgcggaaacgctacgaggacctgctaaccaggctgcgggccaaccagagctgggaagattcgaacaccgacctcgtcccggcccctgcagtccggatactcacgccagaagtgcggctgggatccggcggccacctgcacctgcgtatctctcgggccgcccttcccgaggggctccccgaggcctcccgccttcaccgggctctgttccggctgtccccgacggcgtcaaggtcgtgggacgtgacacgaccgctgcggcgtcagctcagccttgcaagaccccaggcgcccgcgctgcacctgcgactgtcgccgccgccgtcgcagtcggaccaactgctggcagaatcttcgtccgcacggccccagctggagttgcacttgcggccgcaagccgccagggggcgccgcagagcgcgtgcgcgcaacggggaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatatga (서열번호 3).
완전한 길이의 쥐 GDF15의 303개 아미노산 서열은:
MAPPALQAQPPGGSQLRFLLFLLLLLLLLSWPSQGDALAMPEQRPSGPESQLNADELRGRFQDLLSRLHANQSREDSNSEPSPDPAVRILSPEVRLGSHGQLLLRVNRASLSQGLPEAYRVHRALLLLTPTARPWDITRPLKRALSLRGPRAPALRLRLTPPPDLAMLPSGGTQLELRLRVAAGRGRRSAHAHPRDSCPLGPGRCCHLETVQATLEDLGWSDWVLSPRQLQLSMCVGECPHLYRSANTHAQIKARLHGLQPDKVPAPCCVPSSYTPVVLMHRTDSGVSLQTYDDLVARGCHCA (서열번호 6)
이고 다음의 DNA 서열에 의해 암호화된다:
atggccccgcccgcgctccaggcccagcctccaggcggctctcaactgaggttcctgctgttcctgctgctgttgctgctgctgctgtcatggccatcgcagggggacgccctggcaatgcctgaacagcgaccctccggccctgagtcccaactcaacgccgacgagctacggggtcgcttccaggacctgctgagccggctgcatgccaaccagagccgagaggactcgaactcagaaccaagtcctgacccagctgtccggatactcagtccagaggtgagattggggtcccacggccagctgctactccgcgtcaaccgggcgtcgctgagtcagggtctccccgaagcctaccgcgtgcaccgagcgctgctcctgctgacgccgacggcccgcccctgggacatcactaggcccctgaagcgtgcgctcagcctccggggaccccgtgctcccgcattacgcctgcgcctgacgccgcctccggacctggctatgctgccctctggcggcacgcagctggaactgcgcttacgggtagccgccggcagggggcgccgaagcgcgcatgcgcacccaagagactcgtgcccactgggtccggggcgctgctgtcacttggagactgtgcaggcaactcttgaagacttgggctggagcgactgggtgctgtccccgcgccagctgcagctgagcatgtgcgtgggcgagtgtccccacctgtatcgctccgcgaacacgcatgcgcagatcaaagcacgcctgcatggcctgcagcctgacaaggtgcctgccccgtgctgtgtcccctccagctacaccccggtggttcttatgcacaggacagacagtggtgtgtcactgcagacttatgatgacctggtggcccggggctgccactgcgcttga (서열번호 5).
29개 잔기의 시그날 서열의 절단 후 사람 GDF15의 아미노산 서열은:
LSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 8)
이고 다음의 DNA 서열에 의해 암호화된다:
ctgtctctggccgaggcgagccgcgcaagtttcccgggaccctcagagttgcactccgaagactccagattccgagagttgcggaaacgctacgaggacctgctaaccaggctgcgggccaaccagagctgggaagattcgaacaccgacctcgtcccggcccctgcagtccggatactcacgccagaagtgcggctgggatccggcggccacctgcacctgcgtatctctcgggccgcccttcccgaggggctccccgaggcctcccgccttcaccgggctctgttccggctgtccccgacggcgtcaaggtcgtgggacgtgacacgaccgctgcggcgtcagctcagccttgcaagaccccaggcgcccgcgctgcacctgcgactgtcgccgccgccgtcgcagtcggaccaactgctggcagaatcttcgtccgcacggccccagctggagttgcacttgcggccgcaagccgccagggggcgccgcagagcgcgtgcgcgcaacggggaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatatga (서열번호 7)
32개 잔기의 시그날 서열의 절단 후 성숙한 GDF 15의 아미노산 서열은:
SQGDALAMPEQRPSGPESQLNADELRGRFQDLLSRLHANQSREDSNSEPSPDPAVRILSPEVRLGSHGQLLLRVNRASLSQGLPEAYRVHRALLLLTPTARPWDITRPLKRALSLRGPRAPALRLRLTPPPDLAMLPSGGTQLELRLRVAAGRGRRSAHAHPRDSCPLGPGRCCHLETVQATLEDLGWSDWVLSPRQLQLSMCVGECPHLYRSANTHAQIKARLHGLQPDKVPAPCCVPSSYTPVVLMHRTDSGVSLQTYDDLVARGCHCA (서열번호 10)
이고 다음의 DNA 서열에 의해 암호화된다:
tcgcagggggacgccctggcaatgcctgaacagcgaccctccggccctgagtcccaactcaacgccgacgagctacggggtcgcttccaggacctgctgagccggctgcatgccaaccagagccgagaggactcgaactcagaaccaagtcctgacccagctgtccggatactcagtccagaggtgagattggggtcccacggccagctgctactccgcgtcaaccgggcgtcgctgagtcagggtctccccgaagcctaccgcgtgcaccgagcgctgctcctgctgacgccgacggcccgcccctgggacatcactaggcccctgaagcgtgcgctcagcctccggggaccccgtgctcccgcattacgcctgcgcctgacgccgcctccggacctggctatgctgccctctggcggcacgcagctggaactgcgcttacgggtagccgccggcagggggcgccgaagcgcgcatgcgcacccaagagactcgtgcccactgggtccggggcgctgctgtcacttggagactgtgcaggcaactcttgaagacttgggctggagcgactgggtgctgtccccgcgccagctgcagctgagcatgtgcgtgggcgagtgtccccacctgtatcgctccgcgaacacgcatgcgcagatcaaagcacgcctgcatggcctgcagcctgacaaggtgcctgccccgtgctgtgtcccctccagctacaccccggtggttcttatgcacaggacagacagtggtgtgtcactgcagacttatgatgacctggtggcccggggctgccactgcgcttga (서열번호 9)
각각의 단량체 내에 9개의 시스테인들을 포함함으로써 1개의 쇄간 이황화물 결합들 및 4개의 쇄내 이황화물 결합들을 형성하는 단독이량체를 포함하는, 사람 GDF15의 재조합체 활성 형태의 아미노산 서열(임의의 N-말단 메티오닌 잔기는 괄호안에 나타냄)은:
(M)ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (서열번호 129)
이고 다음의 DNA 서열에 의해 암호화된다(괄호안에 임의의 N-말단 메티오닌 코돈과 함께 나타냄):
(atg)gcgcgcaacggggaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcatataa (서열번호 130).
각각의 단량체 내에 9개의 시스테인들을 포함함으로써 1개의 쇄간 이황화물 결합 및 4개의 쇄내 이황화물 결합들을 형성하는 단독이량체를 포함하는, 쥐 GDF15의 재조합체 활성 형태의 아미노산 서열은:
(M)SAHAHPRDSCPLGPGRCCHLETVQATLEDLGWSDWVLSPRQLQLSMCVGECPHLYRSANTHAQIKARLHGLQPDKVPAPCCVPSSYTPVVLMHRTDSGVSLQTYDDLVARGCHCA (서열번호 14)
이고 다음의 DNA 서열에 의해 암호화된다:
(atg)agcgcgcatgcgcacccaagagactcgtgcccactgggtccggggcgctgctgtcacctggagactgtgcaggcaactcttgaagacttgggctggagcgactgggtgttgtccccgcgccagctgcagctgagcatgtgcgtgggcgagtgtccccacctgtatcgctccgcgaacacgcatgcgcagatcaaagcacgcctgcatggcctgcagcctgacaaggtgcctgccccgtgctgtgtcccctccagctacaccccggtggttcttatgcacaggacagacagtggtgtgtcactgcagacttatgatgacctggtggcccggggctgccactgcgcttga (서열번호 13).
본원에 기술된 것으로서, 용어 “GDF15 폴리펩타이드”는 사람 아미노산 서열들인 서열 번호들 4, 8 및 12를 포함하는 GDF 폴리펩타이드를 말한다. 그러나, 용어 “GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드”는 천연적으로 존재하는 GDF 폴리펩타이드 서열, 예를 들면, 서열 번호들 4, 8 및 12의 아미노산 서열들로부터 하나 이상의 아미노산들이 상이함으로써, 당해 서열이 서열 번호들 4, 8 및 12와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드들을 포함한다. GDF15 폴리펩타이드들은 GDF15 폴리펩타이드의 특수한 위치들에서 보존적이거나 비-보존적인, 하나 이상의 아미노산 치환들을 도입하거나 천연적으로 또는 비-천연적으로 존재하는 아미노산들을 사용하거나, 또는 특수 잔기들 또는 잔기들의 길이들을 결실시킴으로써 생성시킬 수 있다.
“보존적 아미노산 치환”은 천연의 아미노산 잔기 (즉, 야생형 GDF15 폴리펩타이드 서열의 제공된 위치에서 발견된 잔기)를 비-천연 잔기 (즉, 야생형 GDF15 폴리펩타이드 서열의 제공된 위치에서 발견되지 않는 잔기)로 치환함으로써 당해 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 영향을 거의 미치지 않거나 전혀 미치지 않도록 하는 것을 포함할 수 있다. 보존적 아미노산 치환들은 또한 생물학적 시스템들내 합성에 의한 것 보다는 화학적 펩타이드 합성에 의해 전형적으로 도입된 비-천연적으로 존재하는 아미노산 잔기들(본원에 정의된 것으로서)을 또한 포함한다. 이들은 펩티도미메틱스(peptidomimetics), 및 아미노산 잔기들의 다른 반전된 또는 역전된 형태들을 포함한다
천연적으로 존재하는 잔기들은 다음의 일반적인 측쇄 특성들을 기준으로 한 부류들로 나누어질 수 있다:
(1)소수성: 노르루이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2)중성의 친수성: Cys, Ser, Thr;
(3)산성: Asp, Glu;
(4)염기성: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5)쇄 배향에 영향을 미치는 잔기들: Gly, Pro; 및
(6)방향족: Trp, Tyr, Phe.
아미노산들의 추가의 그룹들은 또한 예를 들면, 문헌[참조: Creighton (1984) PROTEINS: STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES (2d Ed. 1993), W.H. Freeman and Company]에 기술된 원리들을 사용하여 제형화할 수 있다. 일부 예들에서 이는 2개 이상의 이러한 특징들을 기본으로 한 치환들을 추가로 특성화하는데 유용할 수 있다(예를 들면, Thr 잔기와 같은 “소 극성” 잔기에 의한 치환은 적절한 내용에서 고도로 보존적인 치환을 나타낼 수 있다).
보존적 치환들은 이들 부류들 중의 하나의 구성원이 동일한 부류의 다른 구성원으로 교환되는 것을 포함할 수 있다. 비-보존적 치환들은, 이들 부류들 중 하나의 구성원이 다른 부류로부터의 구성원으로 교환되는 것을 포함할 수 있다.
위에서 기술한 그룹화의 것들과 유사한 공지된 이화학적 특성들을 갖는 합성의, 드물거나, 변형된 아미노산 잔기들은 서열내 특수한 아미노산 잔기에 대해 “보존적” 치환으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, D-Arg 잔기는 전형적인 L-Arg 잔기의 치환으로 사용될 수 있다. 이는 또한, 특수한 치환이 2개 이상의 위에서 기술한 부류들의 측면에서 기술될 수 있는 경우일 수 있다(예를 들면, 작고 소수성인 잔기로의 치환은 하나의 아미노산을 위에서 기술된 부류들 둘 다에서 발견된 잔기(들) 또는 정의들 둘 다를 충족하는 이러한 잔기들에 대해 유사한 이화학적 특성들을 갖는 것으로 당해 분야에 공지된 다른 합성의, 드문, 또는 변형된 잔기들로 치환하는 것을 의미한다).
본원에 제공된 GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열들, 예를들어 서열번호 3, 7, 11 및 15로 변성되는 것들, 및 서열번호 4, 8 및 12의 폴리펩타이드 변이체들을 암호화하는 것들은, 본 기재내용의 다른 국면들을 형성한다.
III .B. 이들의 돌연변이체 형태를 포함하여, GDF15 폴리펩타이드들 및 GDF15 를 포함하는 구조체들을 발현하는데 유용한 벡터들
본원에 제공된 GDF15 폴리펩타이드들 및 GDF15를 포함하는 구조체를 암호화하는 핵산 서열들을 발현시키기 위하여, 적절한 암호화 서열들, 예를 들면, 서열번호 3, 7, 11, 15, 17, 21, 24, 26 및 32를 적합한 벡터내로 클로닝시키고 적합한 숙주내에서 도입한 후, 당해 서열을 발현시켜 표준 클로닝 및 발현 기술들에 따라 암호화된 폴리펩타이드를 생산할 수 있으며, 이러한 표준 클로닝 및 발현 기술들은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌: Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989에 기술되어 있다). 본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 이러한 벡터들에 관한 것이다.
“벡터”는 (a) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 증진시키고/시키거나; (b) 이로부터 폴리펩타이드의 생산을 증진시키고/시키거나; (c) 이를 사용한 표적 세포들의 형질감염/형질전환을 증진시키고/시키거나; (d) 핵산 서열의 복제를 증진시키고/시키거나; (e) 핵산의 안정성을 증진시키고/시키거나; (f) 핵산 및/또는 형질전환된/형질감염된 세포들의 검출을 증진시키고/시키거나; (g) 또한 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 유리한 생물학적 및/또는 이화학적 기능을 부여하는 전달 비히클을 말한다. 벡터는 염색체, 비-염색체를 포함하는 어떠한 적합한 벡터, 및 합성 핵산 벡터들(발현 조절 성분들의 적합한 세트를 포함하는 핵산 서열)일 수 있다. 이러한 벡터들의 예들은 SV40의 유도체들, 세균 플라스미드들, 파아지 DNA, 바큘로바이러스 , 효모 플라스미드들, 플라스미드들과 파아지 DNA의 조합들로부터 기원한 벡터들, 및 바이러스 핵산(RNA 또는 DNA) 벡터들을 포함한다.
재조합체 발현 벡터는 GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드의 발현을 위해 원핵 세포들(예를 들면, 이. 콜라이(E. coli)) 또는 진핵 세포들(예를 들면, 바큘로바이러스 발현 벡터들을 사용하는 곤충 세포들, 효모 세포들, 또는 포유동물 세포들)의 발현을 위해 설계할 수 있다. 대표적인 숙주 세포들은 클로닝 및 발현에 전형적으로 사용된 숙주들, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주들 TOP10F', TOP10, DH10B, DH5a, HB101, W3110, BL21(DE3) 및 BL21 (DE3)pLysS, BLUESCRIPT(제조원: Stratagene), 포유동물 세포주들 CHO, CHO-K1, HEK293, 293-EBNA pIN 벡터들(참조: Van Heeke & Schuster, J. Biol . Chem . 264: 5503-5509 (1989); pET 벡터들(제조원: Novagen, Madison Wis.)을 포함한다. 달리는, 재조합체 발현 벡터는 시험관내에서, 예를 들면 T7 프로모터 조절 서열들 및 T7 폴리머라제 및 시험관내 해독 시스템을 사용하여 전사하고 해독할 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 클로닝 부위의 프로모터 상부를 함유한다. 스위치 온(switch on) 및 스위치 오프(switch off)될 수 있는 프로모터들의 예들은 lac 프로모터, T7 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터 및 trp 프로모터를 포함한다.
따라서, 목적한 폴리펩타이드 또는 구조체의 발현을 촉진하는, 이들의 돌연변이체 형태들을 포함하는, GDF15 폴리펩타이드 또는 GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터들이 본원에 제공된다. 다양한 구현예들에서, 벡터들은 GDF15 폴리펩타이드 또는 이의 돌연변이체 형태를 포함하는 GDF15 폴리펩타이드 구조체의 발현을 조절하는 작동적으로 연결된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 벡터는 어떠한 적합한 프로모터, 인핸서, 및 다른 발현을 촉진하는 성분들을 포함하거나 이들과 연합할 수 있다. 이러한 성분들의 예들은 강력한 발현 프로모터들 (예를 들면, 사람 CMV IE 프로모터/인핸서, RSV 프로모터, SV40 프로모터, SL3-3 프로모터, MMTV 프로모터, 또는 HIV LTR 프로모터, EF1알파 프로모터, CAG 프로모터), 효과적인 폴리 (A) 종결 서열들, 이. 콜라이 내에서 플라스미드 생산을 위한 복제 오리진, 선택가능한 마커로서의 항생제 내성 유전자, 및/또는 편리한 클로닝 부위(예를 들면, 폴리링커)를 포함한다. 벡터들은 또한 CMV IE와 같은 구성적 프로모터와 대치되는 것으로서 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 하나의 국면에서, 간 또는 췌장 조직과 같은 대사적으로 관련된 조직 내에서 서열의 발현을 촉진하는 조직 특이적인 프로모터에 작동적으로 연결된, GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산이 제공된다.
III .C. 숙주 세포들
본 기재내용의 다른 국면에서, 본원에 기재된 핵산들 및 벡터들을 포함하는 숙주 세포들이 제공된다. 다양한 구현예들에서, 벡터 또는 핵산은 숙주 세포 게놈 내로 통합되며, 다른 구현예들에서 당해 벡터 또는 핵산은 염색체 외에 존재한다.
이러한 핵산, 벡터, 또는 이의 하나 또는 둘 다의 조합들을 포함하는, 재조합 세포들, 예를 들면, 효모, 세균 (예를 들면, 이. 콜라이), 및 포유동물 세포들(예를 들면, 무한증식 포유동물 세포들)이 제공된다. 다양한 구현예들에서, GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태의 발현을 암호화하는 서열을 포함하는, 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 또는 선형의 발현 성분과 같은 통합되지 않은 핵산을 포함하는 세포들이 제공된다.
본원에 제공된 GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터는 형질전환 또는 형질감염에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 세포를 발현 벡터로 형질전환시키는 방법들은 잘 공지되어 있다.
GDF15 폴리펩타이드-, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터를 통해 숙주 세포 또는 숙주 동물 내에 위치시키고/시키거나 이에 전달할 수 있다. 어떠한 적합한 바이러스 벡터도 당해 능력으로 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 특정한 수의 바이러스 폴리뉴클레오타이드들을, 단독으로 또는 요구된 숙주 세포 내에서 본 발명의 핵산의 전달, 복제 및/또는 발현을 촉진하는 하나 이상의 바이러스 단백질들과 함께 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 모두 또는 일부, 바이러스 단백질/핵산 접합체, 바이러스-유사입자(VLP), 또는 바이러스 핵산들 및 GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 완전한 바이러스 입자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 바이러스 입자 바이러스 벡터는 야생형 바이러스 입자 또는 변형된 바이러스 입자를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 복제 및/또는 발현을 위한 다른 벡터 또는 야생형 바이러스의 존재를 필요로 하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터는 헬퍼(helper)-의존성 바이러스일 수 있다), 예를 들면 아데노바이러스 벡터 암플리콘(amplicon)일 수 있다. 전형적으로, 이러한 바이러스 벡터들은 야생형 바이러스 입자, 또는 이의 단백질 및/또는 핵산 성분에 있어 변형되어 이식유전자 능력을 증가시키거나 핵산의 형질감염 및/또는 발현을 보조하는 바이러스 입자로 이루어진다(이러한 벡터들의 예들은 헤르페스 바이러스/AAV 암플리콘들을 포함한다). 전형적으로, 바이러스 벡터는 사람들을 정상적으로 감염시키는 바이러스와 유사하고/하거나 이로부터 기원한다. 당해 국면에서 적합한 바이러스 벡터 입자들은 예를 들면, 아데노바이러스 벡터 입자들(아데노비리다에(adenoviridae)의 어떠한 바이러스 또는 당해 바이러스로부터 기원한 어떠한 바이러스 포함), 아데노-관련된 바이러스 벡터 입자들(AAV 벡터 입자들) 또는 다른 파르보바이러스들 및 파르보바이러스 벡터 입자들, 파필로마바이러스 벡터 입자들, 플라비바이러스 벡터들, 알파바이러스 벡터들, 헤르페스 바이러스 벡터들, 폭스 바이러스 벡터들, 레트로바이러스 벡터들, 예를 들면, 렌티바이러스 벡터들을 포함한다.
III .D. GDF15 폴리펩타이드 , GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태의 분리
본원에 기술된 바와 같이 발현된 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태는 표준 단백질 정제 방법들을 사용하여 분리할 수 있다. GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태는 가공되어 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체또는 이의 돌연변이체 형태를 발현할 수 있는 세포, 예를 들면 천연의 GDF15를 자연적으로 발현하지 않는 세포로부터 분리할 수 있다.
GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드, 및 관련된 물질들 및 시약들을 분리하는데 사용될 수 있는 단백질 정제 방법들은 당해 분야에 공지되어 있다. GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 정제하는 예시적인 방법들은 본원의 하기 실시예들에서 제공된다. GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 분리하는데 유용할 수 있는 추가의 정제 방법들은 Bootcov MR, 1997, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:11514-9, Fairlie WD, 2000, Gene 254: 67-76과 같은 참조 문헌들에서 찾을 수 있다.
IV . GDF15 폴리펩타이드 , GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 포함하는 약제학적 조성물들
GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 포함하는 약제학적 조성물들이 제공된다. 이러한 폴리펩타이드 약제학적 조성물들은 투여 방식과의 적합성을 위해 선택된 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 제형 제제들과 혼합된 치료학적 유효량의 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서 용어 “약제학적으로 허용되는 담체” 또는 “생리학적으로 허용되는 담체”는 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 사람 또는 비-사람 피검자의 신체 내로 전달하는 것을 달성하거나 향상시키는데 적합한 하나 이상의 제형 제제들을 말한다. 상기 용어는 생리학적으로 허용되는 특정의 및 모든 용매들, 분산 매질, 피복제들, 항세균 및 항진균제들, 등장성 및 흡수 지연제들 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체들의 예들은 물, 염수, 인산염 완충된 염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등, 및 이들의 조합들 중 하나 이상을 포함한다. 일부 경우들에서, 등장성 제제들 예를 들면, 슈가들, 만니톨, 소르비톨과 같은 다가알코올들, 또는염화나트륨을 약제학적 조성물 속에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태의 반감기 또는 효능을 향상시키는, 습윤 또는 소량의 보조 물질들, 예를 들면, 습윤 또는 유화제들, 방부제들 또는 완충제들과 같은 약제학적으로 허용되는 물질들은 또한 담체로서 작용하거나, 담체의 성분을 형성할 수 있다. 허용되는 약제학적으로 허용되는 담체들은 사용된 용량들 및 농도들에서 수용체들에게 바람직하게는 무독성이다.
약제학적 조성물은 예를 들면, 조성물의 pH, 삼투성, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 향, 멸균성, 안정성, 분해 또는 방출 속도, 흡수, 또는 침투를 변형시키거나, 유지하거나, 보존하는 제형화제(들)을 함유할 수 있다. 적합한 제형화제들은 아미노산(예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 라이신), 항미생물제들, 항산화제들(예를 들면, 아스코브산, 아황산나트륨, 또는 아황산수소나트륨), 완충제들(예를 들면, 붕산염, 중탄산염, 트리스-HCl, 시트르산염, 인산염, 또는 다른 유기산들), 증량제들(예를 들면, 만니톨 또는 글리신), 킬레이팅제들(예를 들면, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)), 착화제들(예를 들면, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린, 또는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린), 충전제들, 단당류들, 이당류들, 및 다른 탄수화물들(예를 들면, 글루코즈, 만노즈, 또는 덱스트린들), 단백질들(예를 들면, 유리 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린들), 착색, 풍미 및 희석제들, 유화제들, 친수성 중합체들(예를 들면, 폴리비닐피롤리돈), 저 분자량 폴리펩타이드들, 염-형성 역이온들(예를 들면, 나트륨), 방부제들(예를 들면, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산, 또는 과산화수소), 용매들(예를 들면, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 폴리에틸렌 글리콜), 당 알코올들(예를 들면, 만니톨 또는 소르비톨), 현탁화제들, 표면활성제들 또는 습윤제들(예를 들면, 플루로닉스; PEG; 소르비탄 에스테르들; 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80과 같은 폴리소르베이트; 트리톤; 트로메타민; 레시틴; 콜레스테롤 또는 틸록사팔), 안정성 향상제들(예를 들면, 슈크로즈 또는 소르비톨), 강직성 향상제들(예를 들면, 알칼리 금속 할라이드들-바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨- 또는 만니톨 소르비톨), 전달 비히클들, 희석제들, 부형제들 및/또는 약제학적 보조제들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(참조: 예를 들면, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, 19th edition, (1995); Berge et al., J. Pharm. Sci., 6661), 1-19 (1977)). 추가의 관련된 원칙들, 방법들, 및 제제들은 예를 들면, Lieberman et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS-DISPERSE SYSTEMS (2nd ed., vol. 3, 1998); Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS & DRUG DELIVERY SYSTEMS (7th ed. 2000); Martindale, THE EXTRA PHARMACOPEIA (31st edition), Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES (16th-20th and subsequent editions); The Pharmacological Basis Of Therapeutics, Goodman and Gilman, Eds. (9th ed.--1996); Wilson and Gisvolds’ TEXTBOOK OF ORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY, Delgado and Remers, Eds. (10th ed., 1998)에 기술되어 있다. 약제학적으로 허용되는 조성물들을 제형화하는 원리들은 또한 예를 들면, 어떠한 목적으로도 본원에 참조로 혼입된, Aulton, PHARMACEUTICS: THE SCIENCE OF DOSAGE FORM DESIGN, Churchill Livingstone (New York) (1988), EXTEMPORANEOUS ORAL LIQUID DOSAGE PREPARATIONS, CSHP (1998)에 기술되어 있다.
최적의 약제학적 조성물은 예를 들면, 의도된 투여 경로, 전달 양식, 및 바람직한 용량에 따라 숙련가에 의해 결정될 것이다(참조: 예를 들면, Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES, 상기 참조). 이러한 조성물들은 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도, 및 생체내 청소율에 영향을 미칠 수 있다.
약제학적 조성물 중 주요 비히클 또는 담체는 천연적으로 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들면, 주사용으로 적합한 비히클 또는 담체는 비경구 투여용 조성물들에서 일반적인 다른 물질들이 가능하게는 보충된 물, 생리학적 염 용액, 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성의 완충된 염수 또는 유리 혈청 알부민과 혼합된 염수가 추가의 예시적인 비히클들이다. 다른 예시적인 약제학적 조성물들은, 소르비톨 또는 적합한 대체물을 추가로 포함할 수 있는, pH가 약 7.0 내지 8.5인 트리스 완충액, 또는 pH가 약 4.0 내지 5.5인 아세테이트 완충액을 포함한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 포함하는 조성물들은 바람직한 순도를 가진 선택된 조성물을 임의의 제형화제들(참조: Remington’s PHARMACEUTICAL SCIENCES, 상기 참조)과 혼합함으로써 동결건조된 케이크 또는 수용액 형태의 저장용으로 제조될 수 있다. 또한, GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 포함하는 생성물은 슈크로즈와 같은 적절한 부형제들을 사용하여 동결건조제로서 제형화할 수 있다.
폴리펩타이드 약제학적 조성물들은 비경구 전달을 위해 선택될 수 있다. 달리는, 당해 조성물들은 경구와 같이 소화관을 통한 전달용 또는 흡입용으로 선택될 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 조성물들의 제조는 당해 분야의 기술 내에 있다.
당해 제형은 투여 부위에 허용되는 농도들로 존재한다. 예를 들면, 완충제들을 사용하여 당해 조성물을 생리학적 pH 또는 약간 낮은 pH, 전형적으로 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내에서 유지한다.
비경구 투여가 고려되는 경우, 본 발명에서 사용하기 위한 치료학적 조성물들은 바람직한 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 약제학적으로 허용되는 비히클 속에 포함하는 발열질이 없는, 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 수 있다. 특히 적합한 비경구 주사용 비히클은 멸균 증류수이며 여기서 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태는 적절하게 보존된 멸균성의, 등장성 용액으로 제형화된다. 여전히 다른 제제는 목적한 분자와 이후에 데포트 주입(depot injection)을 통해 전달될 수 있는 생성물의 조절된 또는 지속적인 방출을 제공하는, 주사가능한 미세구체들(microspheres), 생-침식성(bio-erodible) 입자들, 중합체성 화합물들(예를 들면, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드들, 또는 리포좀들과 같은 제제의 제형을 포함할 수 있다. 하이알루론산을 또한 사용할 수 있으며, 이는 순환시 지속적인 약효시간의 효과를 가질 수 있다. 목적한 분자의 도입을 위한 다른 적합한 수단들은 이식가능한 약물 전달 장치들을 포함한다.
하나의 구현예에서, 약제학적 조성물은 흡입용으로 제형화될 수 있다. 예를 들면, GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드는 흡입용 무수 분말로 제형화될 수 있다. GDF15 폴리펩타이드 흡입 용액들은 또한 에어로졸 전달용 추진제와 함께 제형화될 수 있다. 여전히 다른 구현예에서, 용액들은 분무화될 수 있다. 폐 투여는 화학적으로 변형된 단백질들의 폐 전달을 기술하는 국제 특허공보 제WO 94/20069호에 추가로 기술되어 있다.
특정의 제형들이 경구적으로 투여될 수 있다는 것도 또한 고려된다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 당해 방식으로 투여되는 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태는 정제들 및 캅셀제들과 같은 고체 용량형들의 화합에 통상적으로 사용된 담체들의 존재 또는 부재하에서 제형화될 수 있다. 예를 들면, 캅셀제는, 생이용성이 극대화되고 전-시스템적 분해가 최소화되는 경우 소화관 내 시점에서 제형의 활성 부위를 방출하도록 설계될 수 있다. 추가의 제제들은 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태의 흡수를 촉진하기 위해 포함될 수 있다. 희석제들, 풍미제들, 저 융점 왁스들, 야채 오일들, 윤활제들, 현탁화제들, 정제 붕해제들, 및 결합제들 또한 사용할 수 있다.
다른 약제학적 조성물은 유효량의 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 정제들의 제조에 적합한 비-독성 부형제들과의 혼합물로서 포함할 수 있다. 멸균수, 또는 다른 적절한 비히클 속에 정제들을 용해시킴으로써, 용액들은 단일-투여량 형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제들은 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토즈, 또는 인산칼슘과 같은 불활성 희석제들; 또는 전분, 젤라틴, 또는 아카시아와 같은 결합제들; 또는 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 또는 활석과 같은 윤활제들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
지연된- 또는 조절된-전달 제형들로서 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 포함하는 제형들을 포함하는, GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 포함하는 추가의 약제학적 조성물들은 당해 분야의 숙련가들에게 명백할 것이다. 리포좀 담체들, 생-침식가능한 미세입자들 또는 다공성 비드들 및 데포트 주사제들과 같은, 다양한 다른 지연된- 또는 조절된-전달 수단들을 제형화하기 위한 기술들은 당해 분야의 숙련가들에게 또한 공지되어 있다(참조: 예를 들면, 약제학적 조성물들의 전달을 위한 다공성 중합체성 미세입자들의 조절된 방출을 기술하는 국제 특허공보 제WO 93/15722호, 및 미세구체/미세입자 제조 및 용도를 논의하고 있는, Wischke & Schwendeman, 2008, Int. J. Pharm. 364: 298-327, 및 Freiberg & Zhu, 2004, Int. J. Pharm. 282: 1-18). 본원에 기술된 것으로서, 하이드로겔은 지연되거나 조절된 전달 제형의 예이다.
지연된 방출 제제들의 추가의 예들은 성형된 제품들, 예를 들면, 필름들, 또는 미세캅셀들의 형태의 반투과성 중합체 매트릭스들을 포함한다. 지연된 방출 매트릭스들은 폴리에스테르들, 하이드로겔들, 폴리락타이드들(미국 특허 제3,773,919호 및 유럽 특허 제0 058 481호), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체들(참조: Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-56), 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트)(참조: Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 및 Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), 에틸렌 비닐 아세테이트(참조: Langer et al., 상기 참조) 또는 폴리-D(-)-3-하이드록시부티르산(참조: 유럽 특허 제0 133 988호)를 포함할 수 있다. 지연된 방출 조성물들은 또한 당해 분야에 공지된 수개의 방법들 중 어느 것에 의해서도 제조할 수 있는, 리포좀들을 포함할 수 있다(참조: 예를 들면, Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-92; 및 유럽 특허 제 0 036 676호, 제0 088 046호, 및 제0 143 949호).
생체내 투여용으로 사용될 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 포함하는 약제학적 조성물은 전형적으로 멸균될 수 있다. 이는 멸균 여과 막들을 통한 여과에 의해 달성할 수 있다. 조성물이 동결건조되는 경우, 당해 방법을 사용한 멸균을 동결건조 및 재구성 전, 또는 후에 수행할 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 동결건조 형태 또는 용액으로 저장할 수 있다. 또한, 비경구 조성물들은 일반적으로 멸균 수용가능한 포트, 예를 들면, 피하 주사 침에 의해 뚫어질 수 있는 스토퍼(stopper)를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 둘 수 있다.
일단 약제학적 조성물이 제형화되면, 이는 액제, 현탁제, 겔제, 유제, 고형제로서, 또는 탈수되거나 동결건조된 산제로서 멸균 바이알들 속에 저장할 수 있다. 이러한 제형들은 사용 준비가 된 형태 또는 투여 전에 재구성을 필요로 하는 형태(예를 들면, 동결건조된)로 저장할 수 있다.
구체적인 구현예에서, 본 발명은 단일 투여량 투여 단위를 생산하기 위한 키트들에 관한 것이다. 당해 키트들은 건조된 단백질을 갖는 제1의 용기 및 수성 제형을 갖는 제2의 용기 둘 다를 각각 함유할 수 있다. 단일 및 다중-챔버의 예비-충전된 주사기들(예를 들면, 액체 주사기들 및 동결주사기들(lyosyringes))을 함유하는 키트들이 본 발명의 영역 내에 또한 포함된다.
치료학적으로 사용되어야 할, GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 포함하는 약제학적 조성물의 유효량은 예를 들면, 치료학적 내용 및 목적들에 의존할 것이다. 따라서, 당해 분야의 숙련가는 치료를 위한 적절한 용량 수준들이 전달될 분자, GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태가 사용되어야 할 처방, 투여 경로, 및 환자의 체격(체중, 체표면 또는 기관 크기) 및 상태(연령 및 일반적인 건강)에 따라 부분적으로 변할 것임을 인지할 것이다. 따라서, 임상의는 용량을 적정하고 투여 경로를 조절하여 최적의 치료 효과를 수득할 수 있다. 일반적인 투여량은 위에서 언급한 요인에 따라 약 0.1 μg/kg 에서 약 100 mg/kg 또는 그 이상에 이르기까지 다양할 수 있다. 다른 구현예들에서, 당해 용량은 0.1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg; 또는 1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg; 또는 5 μg/kg, 10 μg/kg, 15 μg/kg, 20 μg/kg, 25 μg/kg, 30 μg/kg, 35 μg/kg, 40 μg/kg, 45 μg/kg, 50 μg/kg, 55 μg/kg, 60 μg/kg, 65 μg/kg, 70 μg/kg, 75 μg/kg, 100 μg/kg, 200 μg/kg 또는 약 10 mg/kg 이하의 범위일 수 있다.
투여 빈도는 사용되는 제형 속의 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태의 약력학적 매개변수들에 의존할 것이다. 전형적으로, 임상의는, 바람직한 효과를 달성하는 용량이 달성될 때까지 조성물을 투여할 것이다. 따라서, 상기 조성물은 단일 투여량으로서, 2개 이상의 투여량들로서(이는 동일한 양의 목적한 분자를 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다) 시간에 걸쳐, 또는 이식 장치 또는 카테테르(catheter)를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 적절한 용량의 추가의 정제는 당해 분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 제조되며 이들이 통상적으로 수행한 업무들의 영역 내에 있다. 적절한 용량들은 적절한 투여량-반응 데이터의 사용을 통해 추정할 수 있다.
약제학적 조성물의 투여 경로로는 공지된 방법들, 예를 들면, 경구적으로; 정맥내, 복강내, 뇌내(실질내), 뇌실내, 근육내, 안내, 동맥내, 문맥내, 또는 병변내 경로들에 의한; 지연된 방출 시스템들(이는 또한 주사될 수 있다)에 의한; 또는 이식 장치들에 의한 주사를 통한다. 경우에 따라, 상기 조성물들은 일시 주사에 의해 또는 주입에 의해 연속적으로, 또는 이식 장치에 의해 투여될 수 있다.
달리는 또는 추가로, 상기 조성물은, 바람직한 분자가 흡수되거나 봉입된 막, 스폰지, 또는 다른 적절한 물질의 이식을 통해 국소적으로 투여될 수 있다. 이식 장치가 사용되는 경우, 장치는 임의의 적합한 조직 또는 장기에 이식 될 수 있으며, 원하는 분자의 전달은 확산, 시간에 따른 방출성 알약, 또는 연속 투여를 통해 할 수 있다.
약물, 예를 들면, GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를, 약물 농도가 연장된 기간에 걸쳐 요구된 치료학적으로 유효한 수준에서 유지될 수 있는 예정된 속도에서 전달하기 위하여, 각종의 상이한 시도들을 사용할 수 있다. 하나의 예에서, 젤라틴(예를 들면, 소 젤라틴, 사람 젤라틴, 또는 다른 공급원으로부터의 젤라틴)과 같은 중합체 또는 천연적으로 존재하거나 합성적으로 생성된 중합체를 포함하는 하이드로겔을 사용할 수 있다. 중합체(예를 들면, 젤라틴)의 어떠한 퍼센트, 예를 들면 5, 10, 15 또는 20%도 하이드로겔 속에서 사용할 수 있다. 적절한 농도의 선택은 목적한 치료학적 프로파일 및 치료학적 분자의 약동학적 프로파일과 같은 다양한 인자들에 의존할 수 있다.
하이드로겔 내로 혼입될 수 있는 중합체들의 예들은 폴리에틸렌 글리콜(“PEG”), 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌 옥사이드-공-폴리프로필렌 옥사이드, 공-폴리에틸렌 옥사이드 블록 또는 무작위 공중합체들, 폴리비닐 알코올, 폴리(비닐 피롤리디논), 폴리(아미노산들), 덱스트란, 헤파린, 다당류들, 폴리에테르들 등을 포함한다.
하이드로겔 제형을 생성할 때 고려될 수 있는 다른 인자는 하이드로겔 및 가교결합제내 가교결합의 정도이다. 하나의 양태에서, 가교-결합은 메타크릴산 무수물을 포함하는 메타크릴화 반응을 통해 달성될 수 있다. 일부 상황들에서, 고도의 교차-연결이 바람직하지만 다른 상황들에서 보다 낮은 정도의 교차결합도 바람직하다. 일부 경우들에서 보다 높은 정도의 가교결합은 보다 긴 지속적인 방출을 제공한다. 보다 높은 정도의 가교결합은, 보다 견고한 하이드로겔 및 약물이 전달되는 보다 긴 기간을 제공할 수 있다.
중합체 대 가교결합제(예를 들면, 메타크릴산 무수물)의 어떠한 비도 사용하여 바람직한 특성들을 갖는 하이드로겔을 생성할 수 있다. 예를 들면, 중합체 대 가교결합제의 비는, 예를 들면, 8:1, 16:1, 24:1, 또는 32:1일 수 있다. 예를 들면, 하이드로겔 중합체가 젤라틴이고 가교결합제가 메타크릴레이트인 경우, 8:1, 16:1, 24:1, 또는 32:1의 메타크릴산 무수물:젤라틴의 비가 사용될 수 있다.
V. GDF15 폴리펩타이드 , GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태의 치료학적 용도
GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 사용하여 대사 상태 또는 질환을 치료하거나, 진단하거나 완화시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 치료될 대사 질환은 당뇨병들, 예를 들면, 제2형 당뇨병들이다. 다른 구현예에서, 대사 상태 또는 질환은 비만이다. 다른 구현예들에서 대사 상태 또는 질환은 이상지질혈증, 상승된 글루코즈 수준들, 상승된 인슐린 수준들 또는 당뇨병성 신장병이다. 예를 들면, GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 사용하여 치료될 수 있거나 완화될 수 있는 대사 상태 또는 질환은, 사람 피검자의 절식 글루코즈 수준이 125 mg/dL 이상, 예를 들면 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 , 200 또는 200 mg/dL 이상인 상태를 포함한다. 혈당 수준들은 식후 또는 절식 상태, 또는 무작위로 측정할 수 있다. 대사 상태 또는 질환은 또한, 피검자가 대사 상태로 진전될 위험이 증가되어 있는 상태를 포함할 수 있다. 사람 피검자의 경우, 이러한 상태들은, 100 mg/dL의 절식 혈당 수준을 포함한다. GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 상태들은 또한 본원에 참조로 혼입된, 문헌(참조: American Diabetes Association Standards of Medical Care in Diabetes Care-2011, American Diabetes Association, Diabetes Care Vol. 34, No. Supplement 1, S11-S61, 2010)에서 찾을 수 있다.
본원에서, 제2형 당뇨병들, 증가된 글루코즈 수준들, 증가된 인슐린 수준들, 이상지질혈증, 비만, 또는 당뇨병성 신장병과 같은 대사 질환 또는 상태는 치료학적 유효 투여량의 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 치료할 수 있다. 투여는 정제 또는 액체 제형의 형태의 IV 주사, 복강내(IP) 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 또는 경구와 같이, 본원에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 일부 상황들에서, GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태의 치료학적으로 효과적이거나 바람직한 투여량은 임상의에 의해 결정될 수 있다. 치료학적 유효 투여량의 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태는, 특히, 투여 스케쥴, 투여된 제제의 단위 투여량, GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태가 다른 치료제들과 함께 투여되는지의 여부, 수용체의 면역 상태 및 건강에 의존할 것이다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 “치료학적 유효 투여량”은 치료되는 질병 또는 질환의 증상들의 완화 또는 경감을 포함하는, 조사자, 의사, 또는 다른 임상의에 의해 고려되는 조직 시스템, 동물, 또는 사람 내에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유발하는 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태의 양, 즉, 하나 이상의 목적한 생물학적 또는 의학적 반응의 관측가능한 수준을 지지하는, 예를 들면 혈당, 인슐린, 트리글리세라이드, 또는 콜레스테롤 수준들을 저하시키거나; 체중을 감소시키거나; 글루코즈 내성, 에너지 소비, 또는 인슐린 민감성을 증진시키는, GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태의 양을 의미한다.
GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태의 치료학적 유효량은 또한 바람직한 결과로 변할 수 있음에 주목한다. 따라서, 예를 들면, 보다 낮은 수준의 혈당을 나타내는 상황들에서, GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드의 투여량은, 비교가능하게 보다 낮은 수준의 혈당이 요구되는 투여량보다 상응하게 더 높을 것이다. 역으로, 보다 높은 수준의 혈당을 나타내는 상황들에서 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태의 투여량은, 비교가능하게 더 높은 수준의 혈당이 바람직한 투여량보다 상응하게 더 낮을 것이다.
각종 양태들에서, 혈당 수준이 100 mg/dL 이상인 사람인 피검자를 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태로 치료할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 기재내용의 방법은 우선 글루코즈, 인슐린, 콜레스테롤, 지질과 같은 하나 이상의 대사적으로 관련된 화합물들의 기본선 수준을 피검자 내에서 측정함을 포함한다. 이후에, GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 포함하는 약제학적 조성물은 피검자에게 투여된다. 목적한 기간 후, 피검자에서 하나 이상의 대사적으로 관련된 화합물들(예를 들면, 혈당, 인슐린, 콜레스테롤, 지질)을 다시 측정한다. 이후에, 상기 2개 수준들을 비교하여 피검자에서 대사적으로 관련된 화합물에 있어서의 상대적인 변화를 측정할 수 있다. 이러한 비교의 결과에 따라서 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 포함하는 약제학적 조성물의 다른 투여량을 투여하여 하나 이상의 대사적으로 관련된 화합물의 목적한 수준을 달성할 수 있다.
GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 포함하는 약제학적 조성물은 다른 화합물과 함께 공-투여될 수 있다. GDF15 돌연변이체 폴리펩타이드와 함께 공-투여된 화합물의 동일성 및 특성들은 치료되거나 완화될 상태의 특성에 의존할 것이다. GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 포함하는 약제학적 조성물과 함께 투여될 수 있는 화합물들의 예들의 비-제한적 목록은 로시글리티존, 피오글리티존, 레파글리니드, 나테글리티니드, 메트포르민, 엑세나티드, 스티아글립틴, 프라믈린티드, 글리피지드, 글리메프리리데아카르보스 및 미글리톨을 포함한다.
VI . 키트들
기재된 방법들을 실시하기 위한 키트들이 또한 제공된다. 이러한 키트들은 멸균 용기 속에 제공될 수 있는, 본원에 제공된 펩타이드들 또는 단백질들을 암호화하는 핵산들, 이러한 핵산들을 포함하는 벡터들 및 세포들을 포함하는, 본원에 기재된 것들과 같은 약제학적 조성물, 및 이러한 핵산을 함유하는 화합물들을 포함하는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 임의로, 제공된 약제학적 조성물을 대사 질환의 치료에 사용하기 위한 방법에 대한 지시들이 또한 포함되거나 환자에게 또는 의학 서비스 제공자에게 이용가능하도록 할 수 있다.
하나의 국면에서, 키트는 (a) 치료학적 유효량의 GDF15 폴리펩타이드, GDF15 폴리펩타이드를 포함하는 구조체 또는 이들의 돌연변이체 형태를 포함하는 약제학적 조성물; 및 (b) 약제학적 조성물을 위한 하나 이상의 용기들을 포함한다. 이러한 키트는 또한 이의 사용을 위한 지시들을 포함할 수 있으며; 당해 지시들은 치료되는 정밀한 대사 질환에 따라 조절될 수 있다. 상기 지시들은 키트 속에 제공된 물질들의 용도 및 특성을 기술할 수 있다. 특정 구현예들에서, 키트들은 환자를 위해 상승된 글루코즈 수준들, 상승된 인슐린 수준들, 비만, 제2형 당뇨병들, 이상지질혈증 또는 당뇨병성 신장병과 같은, 대사 질환을 치료하기 위한 투여를 수행하기 위한 지시들을 포함한다.
지시들은 종이 또는 플라스틱 등과 같은 기판에 인쇄될 수 있으며, 키트의 용기 또는 이의 성분들의 표지 시(예를 들면, 포장과 연합된), 포장 삽입물로서 키트들 속에 존재할 수 있다. 다른 구현예들에서, 당해 지시들은 적합한 컴퓨터 판독가능한 저장 매체, 예를 들면, CD-ROM, 디스켓 등 위에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재한다. 여전히 다른 구현예들에서, 실제 지시들은 키트 속에 존재하지 않지만, 인터넷을 통하는 것과 같이, 원격 공급원으로부터 지시들을 수득하기 위한 수단들을 제공한다. 당해 구현예의 예는, 지시들을 볼 수 있고/있거나 이로부터 지시들을 다운로드 할 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다.
흔히, 키트의 일부 또는 모든 성분들은 적합한 포장 속에 포장되어 멸균성을 유지하는 것이 바람직할 것이다. 키트의 성분들은 키트 용기 성분 속에 포장되어 단일의, 용이하게 취급가능한 단위로 제조될 수있으며, 여기서 당해 키트 용기 성분, 예를 들어, 박스 또는 유사한 구조들은 밀폐 용기 속에 존재하거나 존재하지 않음으로써, 예를 들면, 키트의 성분들 중의 일부 또는 모두의 멸균성을 추가로 보존할 수 있다.
실시예들
수행된 실시예들 및 달성된 결과들을 포함하는, 다음의 실시예들은 단지 나열 목적들을 위해 제공되며 본 발명을 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다.
실시예 1
천연의 GDF15 폴리펩타이드들의 제조
CHO-S 안정한 세포주 성장 및 형질감염을 형질감염 배지 (CD-CHO, 4x L-글루타민, 1x HT, 1x P/S/G)를 함유하는 6-웰 플레이트들을 사용하여 수행하였다. 형질감염 전일에, 배양된 세포들을 5e5 생존성 세포들(vc)/ml의 농도로 나누었다. 형질감염 복합체 형성을 4 μg의 선형 DNA/500의 Optimem, 10μl의 LF-LTX/500 μl의 Optimem을 사용하여 20분의 항온처리 기간 동안 이루었다. 이후에 세포들을 1e6 vc/웰에서 원심분리에 의해 제조하고, DPBS 속에 세척하고, 1 ml의 Optimem 속에 재현탁시켰다. 다음에, 1 ml의 형질감염 복합체를 6-웰 플레이트들 속의 1e6 세포들에 가하고 2 ml의 MIX-6 배지(항생제를 포함하지 않음)를 첨가한 후 진탕하면서 6시간 동안 항온처리하였다. 선택을 2일째에 6 μg/ml의 푸로마이신이 들어있는 MIX-6 배지를 사용하고 배지를 매 2 내지 3일마다 10 내지 12일 동안 세포들을 원심분리하고 배지 속에서 재-현탁시킴으로써 교체하면서 개시하였다.
친화성 태그를 사용하여 작제한 GDF15 발현 벡터로 형질감염된 세포들을 600 nm에서 9의 광학 밀도로 성장시킨 후 유도하고 6시간 후 원심분리에 의해 63의 광학 밀도에서 수거하였다. 동결된 세포 플레이트를 동결시키고 완충액내로 15 % (wt./vol.)에서 저 전단 균질화기를 사용하여 슬러리가 균질화될 때까지 재-현탁시켰다. 다음에, 세포들을 고 전단 균질화기에 적용시켜 파괴시키고 열어 생성물을 함유하는 봉입체들(inclusion bodies)을 방출시켰다. 이후에, 수득되는 균질화물을 5,000 x g에서 1시간 동안 5 C에서 원심분리하여 봉입체들을 펠렛으로서 수거하고, 버리는 상층액 속에 세포질성 오염물질들을 남겼다. 잔류하는 세포질은 펠렛을 급냉시킨 물 및 저 전단 균질화기를 사용하여 원래의 균질물 용적으로 균질하게 재-현탁시킨 후 앞서와 같이 원심분리시킴으로써 봉입체들로부터 세척하였다. 수득되는 펠렛인, 세척된 봉입체들(WIBS)을 이후에 -80 C에서 동결시켰다.
충분한 양의 WIBS 및 구아니딘 하이드로클로라이드(GnHCl)를 pH 8.5에서 환원-가용화 시 사용하여 적절하게는 25 mg/ml의 환원된 생성물 및 6M GnHCl의 최종 농도들을 수득하였다. 가용화를 이후에 산화환원 시약들, 카오트로프(chaotrope) 및 공-용매들을 함유하는 리폴딩 완충액 내로 알칼리성 pH에서 교반하면서 25-배로 신속하게 희석시켰다. 리폴드 용액을 6 C 에서 72 시간 동안 또는 당해 용액이 엘만 시약(Ellman’s reagent)에 대해 음성이 될 때까지 온화하게 교반시키고 공기 산화시켰다. 5 C에서 리폴드 용액을 깊은 여과에 의해 10-배 한외 여과 농도 및 50 mM 인산나트륨 및 pH 8.5에서 낮은 카오트로프 농도를 함유하는 완충액 내로 후속적인 디아필트레이션(diafiltration)을 허용하도록 함으로써 투명화시켰다. 후속적인 농축물을 25 C로 가온시킨 후 pH를 산성 범위로 저하시켜 오염물질들의 침전을 유발하였다. 침전물을 5,000 xg에서 30분 동안 25 C에서 원심분리하여 제거하고 수득되는 상층액을 0.45 ? 여과에 의해 추가로 투명하게 하였다. 이후에, 여액(AP)을 pH 8.5, 및 낮은 염 농도로 조절하여 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)를 포함하는 제1의 정제 단계를 허용하였다.
단백질 폴딩 및 AP 후, GDF15를 2-단계 크로마토그래피 트레인을 사용하여 정제하였다. 조절된 AP를 pH 8.5에서 저 염 농도를 함유하는 완충된 카오트로프로 평형화시킨 IMAC 컬럼에 적용시켰다. 컬럼을 다음에 평형 완충액을 사용하여 기본 자외선(UV) 수준이 수득될 때까지 세척하였다. 생성물 및 오염물들을 교체기 농도를 단계별로 증가시켜 용출시키고 용출물들을 수집하고 후속적으로 꼬마지에-염색된 SDS-PAGE(나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동)으로 후속적으로 검정하여 어느 용출물 분획들이 GDF15의 예측된 분자량에서 이동하는 폴리펩타이드를 함유하였는지를 확인하였다. IMAC가 완료된 후, 생성물을 함유하는 혼주된 분획을 pH 7.2 및 5 mM EDTA로 25 C에서 조절하였다. 당해 생성물을 저 농도의 효소를 가하여 25 C에서 수 시간들 동안 친화성 태그를 절단 제거함으로써 성숙한 길이의 GDF15로 전환시켰다. 절단 반응 혼합물을 아세트산 및 유기 용매를 첨가시킴으로써 유기 개질제 및 산성 pH를 사용하여 조절하였다. 이는 25 C에서 수행된 역상 컬럼으로부터의 생성물의 선형 구배 용출로 이루어진 최종의 크로마토그래피 단계를 허용하였다. 크로마토그래피로부터의 용출물을 분획들로서 수집한 후 SDS-PAGE로 검정하여 적절한 분획들을 측정함으로써 균질한 생성물에 대해 혼주시켰다. 수득되는 혼주물을 약 산성 완충액 내로 한외여과함으로써 완충액 교환하고, 한외-여과에 의해 원심분리하고, 멸균 여과하며, 최종적으로 5 C에서 저장하거나 동결시켰다.
실시예 2
Fc 융합 GDF15 단백질들에 의한 과식증 ob / ob 마우스들에서 사료 섭취의 억제
GDF15는 과식증 ob/ob 마우스들에서 사료 섭취를 감소시키고, 사료 섭취 검정을 사용하여 GDF15 유사체들의 상이한 형태들의 효능을 평가하였다. 마우스에서 사람 GDF15 폴리펩타이드의 반감기는 대략 3시간인 것으로 관측되었으므로, Fc 융합 전략을 사용하여 단백질 반감기를 연장시켰다. 상이한 Fc 융합 GDF15 폴리펩타이드들을 생성시키고, Fc 융합 GDF15 및 야생형 GDF15 폴리펩타이드들을 과식증 렙틴-결핍성 ob/ob 마우스들 내로 도입하고, 이들 동물들에서 사료 섭취를 억제하는 특수한 Fc 융합 GDF15 폴리펩타이드의 능력을 측정함으로써, 생체내 GDF15 활성에 대해 분석하였다. 시험할 Fc 융합 GDF15 폴리펩타이드를 7 내지 8주령의 ob/ob 마우스(제조원: Jackson Laboratory)에게 0일째에 4 내지 5pm으로 피하 주사하였다. 동물들에게 주사한 후 사료를 사전측정한 우리들로 이전시키고, 사료 섭취를 다음날 오전 9 내지 10시 사이에서 측정하였다.
야생형 GDF15 및 각각의 Fc 융합 GDF15 폴리펩타이드에 대한 대표적인 실험들의 결과들을 도들 3 내지 21에 제공하며, 당해 도들은 하전된 쌍의 이량체(delHinge) 구조체들: DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+); DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(-); DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+); DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(H6D):DhCpmFc(-); DhCpmFc(+)-(G4S)4-GDF15(N3Q):DhCpmFc(-); DhCpmFc(+)-GDF15:DhCpmFc(-); DhCpmFc(+)-G4-GDF15:DhCpmFc(-); DhCpmFc(+)-(G4S)2-GDF15:DhCpmFc(-); DhCpmFc(+)-(G4Q)4-GDF15:DhCpmFc(-); DhCpmFc(+)-(1K)-GDF15:DhCpmFc(-); DhCpmFc(+)(L351C)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(-)(L351C); 및 DhCpmFc(+)(S354C)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(-)(Y349C); 하전된 쌍 구조체의 이량체들DhCpmFc(+)(S354C)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(-)(Y349C); 헤미Fc 구조체들의 이량체 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15; Fc-(G4S)3-Fc-GS(G4S)4-GDF15; 및 Fc-(G4S)5-Fc-GS(G4S)4-GDF15; 천연의 성숙한 hGDF15 단독이량체; 및 성숙한 hGDF15(H6D) 변이체 단독이량체에 대한 사료 섭취 검정에 있어서 투여량 반응 곡선들을 나타낸다.
이들 실험들은, 하전된 쌍의 이량체들(delHinge), 하전된 쌍 및 헤미Fc 구조체들이 천연의 성숙한 hGDF15 단독이량체의 효능보다 더 큰 효능으로, ob/ob 마우스들에서 사료 섭취의 감소를 나타냄을 입증하였다. 사료 섭취 측정은 당해 폴리펩타이드들의 단일 주사 후 17시간째에 하였으며, 보다 강력한 잠재능 및 효능은 Fc 융합 폴리펩타이드들의 연장된 반감기로부터 초래되었다.
실시예 3
Fc 융합 GDF15 구조체들에 의한 지질 내성의 개선
하전된 쌍의 이량체들(delHinge) 및 헤미Fc 구조체들을 생체내 GDF15 활성에 대해, 이들 구조체들, 및 천연의 성숙한 hGDF15 단독이량체를 비만 B6D2F1 마우스들(비만은 마우스들에게 60%의 고 지방 식이를 공급함으로써 유도하였다)내로 도입하고, 이들 동물들에서 경구 지질 내성을 증진시키는 각각의 특수한 폴리펩타이드 또는 구조체의 능력을 측정함으로써 분석하였다.
수컷 B6D2F1 마우스에게 60%의 고 지방 식이(Research Diets D12492i)를 5주령째에 6 내지 10주들 동안 공급하고 연구 전 2 내지 4일째에 체중 및 3시간 절식 혈청 트리글리세라이드 수준들에 의해 계층화하였다. 연구 당일에, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체(참조: 단락 II.B.1), Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체(참조: 단락 II.D.1), 및 천연의 성숙한 hGDF15 단독이량체를 3시간 동안 절식시킨 마우스들 내로 정맥내 주사하였다. 천연의 성숙한 hGDF15 또는 성숙한 hGDF15(H6D) 변이체에 대한 투여량 반응 연구들에 있어서, 단백질들을 피하 주사하였다. 단백질 주사 후 3시간째에, 20%의 인트라리피드(Intralipid)를 20ml/kg에서 경구 투여하였다. 다른 90분 후, 혈액 시료들을 꼬리 방혈을 통해 수집하고 혈청 트리글리세라이드 수준들을 측정하였다.
천연의 성숙한 hGDF15 단독이량체, 성숙한 hGDF15(H6D) 변이체 단독이량체, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체, 및 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체를 포함하는 대표적인 실험들의 결과들을 도 22 내지 25에 나타낸다. 도 23 내지 25에서, 천연의 성숙한 hGDF15 단독이량체, 성숙한 hGDF15(H6D) 변이체 및 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체는 투여량 의존적인 양식으로 지질 내성을 개선시켰다. 도 22에서, 천연의 성숙한 hGDF15 단독이량체 및 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체는 1 mg/kg IV 투여량에서 동일한 검정시 유효함을 입증한다.
실시예 4
DIO 마우스들에서 hGDF15 및 hGDF15 를 포함하는 구조체들의 만성 효능
GDF15는 혈당, 인슐린, 트리글리세라이드, 또는 콜레스테롤 수준들을 저하시키거나; 체중을 감소시키거나; 글루코즈 내성 및 인슐린 민감성을 증진시킨다. 이들 매개변수들을 증진시키기 위한 hGDF15 및 각종의 Fc 융합 GDF15 구조체들의 능력을 평가하기 위하여, 만성 연구들을 수행하였다.
실시예 4.1 연구 설계
2개의 별개의 연구들을 수행하여 상이한 Fc 융합 GDF15 폴리펩타이드들의 만성 효능을 평가하였다. 제1의 연구(연구 #1)는 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체(참조: 단락 II.B.1) 및 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체(참조: 단락 II.D.1)을 포함하였다. 당해 연구에서, 하전된 쌍(delHinge) 구조체의 이량체 및 헤미Fc 구조체들의 이량체를 4주령째에 16주 동안 60Kcal%의 고 지방 식이(제조원: Research Diets)을 먹인 수컷 C57Bl/6 마우스들 (HAR)에게 만성적으로 및 피하 투여하였다. 동물들은 6주 동안 단일의 우리 환경들에 순응시켰다. 매주 취급 및 염수의 피하 주사를 어떠한 시험 화합물의 투여 전 3주 동안 수행하였다. 마우스들을 제1의 단백질 주사들 전 2일째에 주당 사료 섭취, 및 체중, 4시간 절식 혈당 수준들, 4시간 절식 혈청 인슐린 수준들, 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 수준들을 기준으로 12마리의 7개 그룹들 및 6마리의 1개 그룹으로 나누었다. 3개의 상이한 투여량 수준들을 선택하였으며: 10, 1, 0.1nmol/kg, 이는 하전된 쌍(delhinge) 구조체의 이량체의 경우 1.29, 0.129, 0.0129 mg/kg, 또는 헤미Fc 구조체의 이량체의 경우 1.35, 0.135, 0.0135mg/kg와 동등하다. 주당 투여의 투여량 섭생을 마우스 PK 데이터를 기준으로 선택하였다. 12마리 동물들의 1개 그룹에게 대조군 그룹으로서 비히클 완충액을 피하 주사하였다. 6마리 동물들의 1개 그룹에게 비히클 완충액을 피하 주사하고 0.014% 로지글리타존을 함유하는식이를 제공하여 양성 대조군으로서 10mg/kg의 경구 1일 투여량을 표적화하였다. 연구들을 28일째에 마지막 투여량과 함께, 5주 동안 수행하였다. 당해 결과들은 도 26 내지 38에 나타낸다.
제2의 연구(연구 #2)는 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체(참조: 단락 II.B.1) 및 CpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+) 구조체의 이량체(참조: 단락 II.C)를 포함하였다. 당해 연구에서, 하전된 쌍(delHinge) 구조체의 이량체 및 하전된 쌍 구조체의 이량체를 60Kcal%의 고 지방 식이(제조원: Research Diets)를 공급한 수컷 C57Bl/6 마우스들(HAR)내로 4주령째에 15주 동안 만성적으로 및 피하 투여하였다. 동물들을 5주 동안 단일의 우리 조건들에 적응시켰다. 매주 취급 및 염수의 피하 주사를 어떠한 시험 화합물의 투여 전 3주 동안 수행하였다. 마우스들을 주당 사료 섭취, 및 최초의 단백질을 주사하기 4일 전 체중, 4시간 절식 혈당 수준들, 4시간 절식 혈청 인슐린, 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 수준들을 기준으로 12개 그룹으로 나누었다. 3개의 상이한 투여량 수준들을 하전된 쌍 구조체의 이량체에 대해 1.25, 0.125 및 0.0125 mg/kg과 동등한 10, 1 및 0.1 nmol/kg에서 선택하였다. 2개의 상이한 투여량 수준들을 하전된 쌍(delHinge) 구조체의 이량체에 대해 1.29 및 0.129 mg/kg과 동등한 10 및 1 nmol/kg에서 선택하였다. 주당 투여의 투여 요법을 마우스 PK 데이터를 기준으로 선택하였다. 12마리 동물들의 1개 그룹에게 대조군 그룹으로서 비히클 완충액을 피하 주사하였다. 6마리 동물들의 1개 그룹에게 비히클 완충액을 피하 주사하고 0.014% 로지글리타존을 함유하는식이를 제공하여 양성 대조군으로서 10mg/kg의 경구 1일 투여량을 표적화하였다. 연구들을 28일째에 마지막 투여량과 함께 5주 동안 수행하였다. 당해 결과들은 도 39 내지 54에 나타낸다.
체중 및 사료 섭취를 연구 전체에서 매주 측정하였다. 1회의 경구 글루코즈 내성 시험들(OGTT)을 4시간 동안 절식시킨 동물들에서 제1의 단백질 주사 후 2주째에 수행하였다. 1회의 경구 글루코즈 내성 시험들(OGTT)을 16시간 동안 절식시킨 동물들에서 제1의 단백질 주사 후 5주째에 수행하였다. 혈액 시료들을 최초의 단백질 주사 후 2주 및 4주째에 4시간 절식된 동물들로부터, 최초의 단백질 주사 후 3주째에 사료에 자유롭게 접근하도록 한 동물들로부터, 및 최초의 단백질 주사 후 5주째에 16시간 동안 절식시킨 동물들로부터 수집하였다. 혈청 시료들을 사용하여 인슐린, 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 수준들, 및 시험 화합물의 수준들을 측정하였다.
실시예 4.2 체중에 있어서 시험 화합물들의 효과
체중을 시험 화합물들의 투여 전 및 투여 후 둘 다에서, 연구 전체에서 매주 측정하였다. 도 30 및 43에 나타난 바와 같이, 비히클을 투여한 동물들의 기본선으로부터 체중은 시간에 따라 증가하였지만, 10 또는 1 nmol/kg의 하전된 쌍(delHinge) 구조체의 이량체, 하전된 쌍 구조체의 이량체 및 헤미Fc 구조체의 이량체로 처리한 동물들의 체중은 5주 처리 기간의 과정에 걸쳐 감소하였으며 화합물 세척-제거상 동안 역전하기 시작하였다. 1 nmol/kg의 하전된 쌍(delHinge) 구조체의 이량체, 하전된 쌍 구조체의 이량체 및 헤미Fc 구조체들의 이량체로 처리한 동물들에서 체중의 변화는 통계적인 유의성에 도달하지 못하였다.
실시예 4.3 사료 섭취에 있어서 시험 화합물들의 효과
사료 섭취를 매주 측정하였다. 평균 1일 사료 섭취는 주당 사료 섭취를 7로 나누어서 계산하였다. 도 31 및 도 44에서 입증되는 바와 같이, 10 nmol/kg에서, 하전된 쌍(delHinge) 구조체의 이량체, 하전된 쌍 구조체의 이량체 및 헤미Fc 구조체의 이량체는 사료 섭취를 저하시켰으며, 대부분 매주 측정들에서 통계적으로 유의적이었다. 1 nmol/kg의 투여량에서의 효과는 유의적이지 않았지만, 경향은 명확하였다. 1nmol/kg의 각각의 3개의 구조체들(즉, 하전된 쌍(delHinge) 구조체의 이량체, 하전된 쌍 구조체의 이량체 및 헤미Fc 구조체들의 이량체)을 비히클 완충액으로 처리한 동물들에서의 사료 섭취와 비교하여 더 낮았다.
실시예 4.4 글루코즈 및 OGTT 에 있어서 시험 화합물들의 효과
OGTT들(OGTT1 및 OGTT2)를 처리를 개시한 후에 수행하였다. OGTT1을 오전 6시로부터 4시간 동안 절식시킨 동물들에서, 최초의 단백질 주사 후 14일 동안 수행하였다. 경구 글루코즈 챌린지 전 4시간 절식 글루코즈 수준들을 단백질 주사 전 2일 및 4일째에 측정한 기본선 4시간 절식 글루코즈 수준들과 비교하였다(도 32 및 45). OGTT1의 글루코즈 프로파일은 도 26, 27, 39 및 40에 나타낸다. OGTT 전 및 동안 글루코즈 수준들 및 OGTT 동안 글루코즈 AUC에 의해 입증되는 바와 같이, 10 및 1 nmol/kg의 하전된 쌍(delHinge) 구조체의 이량체, 하전된 쌍 Fc-hGDF15 구조체의 이량체 또는 헤미Fc 구조체들의 이량체로 처리한 동물들은 비히클 처리된 동물들과 비교하는 경우 증진된 글루코즈 수준들 및 경구 글루코즈 내성을 나타내었다. 0.1nmol/kg의 하전된 쌍(delHinge) 구조체의 이량체, 하전된 쌍 구조체의 이량체 및 헤미Fc 구조체의 이량체로 처리한 동물들은 증진된 글루코즈 내성을 나타내었지만, 이들 동물들에서 글루코즈 수준들에 있어서의 증진은 유의적이지 않았다. 제1의 단백질 주사 후 2주째에 0.1nmol/kg의 헤미Fc 구조체의 이량체로 처리한 동물들에 있어서 증진된 글루코즈 내성은 체중 또는 사료 섭취 변화들과는 별개의 증진된 글루코즈 내성의 지표인데, 이는, 이들 동물들이 비히클 처리된 동물들과 유사한 체중 및 사료 섭취를 가지기 때문이다.
OGTT2를 경구 글루코즈 챌린지 전날에 오후 5시로부터 16시간 동안 절식시킨 동물들에서, 제1의 단백질 주사 후 35일째, 마지막 단백질 주사 후 7일째에 수행하였다. OGTT2의 글루코즈 프로파일은 도 28, 29, 41 및 42에 나타낸다. 10, 1, 또는 0.1 nmol/kg의 각각의 3개의 구조체들(즉, 하전된 쌍(delHinge) 구조체의 이량체, 하전된 쌍 구조체의 이량체 및 헤미Fc 구조체의 이량체)을 5주 동안 사용한 치료는 OGTT 동안 글루코즈 수준들 및 글루코즈 곡선 AUC에 의해 입증되는 바와 같이, 경구 글루코즈 내성을 유의적으로 개선시켰다.
실시예 4.5 인슐린에 있어서 시험 화합물들의 효과
인슐린 수준들을 4일, 14일 및 28일째에 4시간 절식시킨 동물들로부터, 21일째에 사료에 자유로이 접근시킨 동물들로부터, 및 35일째에 16시간 동안 절식시킨 동물들로부터 수집한 혈액 시료들에서 측정하였다. 마우스들은 암 주기 동안 이들의 사료의 대부분을 소비한다. 오전 6시로부터 4시간 절식의 프로토콜을 동일한 그룹내에서 장기간 비교를 위해 사용하여 광 주기 동안 사료를 조금씩 먹어 유도된 변화를 제거하였다. 관찰된 인슐린 수준들은 도 33, 34 및 도 46 내지 48에 나타낸다.
비히클 처리된 동물들에서 4시간 절식 인슐린 수준들은, 인슐린 내성이 이들 동물들에서 추가로 진행되면서, 시간에 따라 증가하였다. 10 또는 1 nmol/kg의 하전된 쌍(delHinge) 구조체의 이량체, 하전된 쌍 구조체의 이량체 또는 헤미Fc 구조체의 이량체를 사용한 처리는 인슐린 수준들을, 처리를 개시하기 전에 동물들이 개시한 경우보다 더 낮은 수준이 되도록 하였으며, 이는 고 지방 식이에 의해 유도된 인슐린 내성의 역전의 지표이다. 0.1 nmol/kg의 용량은 시간에 걸쳐 인슐린 수준들의 증가를 방지하였다.
모든 3개의 Fc 융합 GDF15 구조체들은 또한 35일째에 밤새 절식시킨 동물들에서 인슐린 수준들에 있어서의 유사한 투여량-의존성 증진을 입증하였다. 연구 #2를 위해 수집한 데이터는, 하전된 쌍(delHinge) 구조체의 이량체 및 하전된 쌍 구조체의 이량체가 사료에 자유롭게 접근한 동물들에서 인슐린 수준들을 저하시킴을 입증하였다.
실시예 4.6 트리글리세라이드 수준들에 있어서 시험 화합물들의 효과
트리글리세라이드 수준들을 -4일, 14일 및 28일째에 4시간 절식된 동물들로부터, 21일째에 사료에 자유롭게 접근한 동물들로부터, 및 35일째에 16시간 동안 절식시킨 동물들로부터 수집한 혈액 시료들에서 측정하였다. 마우스들은 암 주기 동안 이들의 사료의 대부분을 소비한다. 오전 6시로부터 4시간 절식의 프로토콜을 동일한 그룹내에서 장기간 비교를 위해 사용하여 광 주기 동안 사료를 조금씩 먹어 유도된 변화를 제거하였다.
도 35, 36, 49 및 51에서 입증된 바와 같이, 4시간 또는 16시간 동안 절식시킨 동물들에서 트리글리세라이드 수준들에 있어서 하전된 쌍(delHinge) 구조체의 이량체, 하전된 쌍 구조체의 이량체 및 헤미Fc 구조체들의 이량체의 효과는 양호하지 않았으나 통계적으로 유의적이었다. 10nmol/kg에서, 하전된 쌍(delHinge) Fc-구조체의 이량체는 28일 및 35일째에 혈청 트리글리세라이드 수준들을 지속적으로 저하시켰다. 연구 #2로부터 수집한 데이터는, 사료에 자유롭게 접근한 동물들에서, 10 및 1 nmol/kg의 하전된 쌍(delHinge) 구조체의 이량체 및 하전된 쌍 구조체의 이량체 둘 다는 도 50에 나타낸 바와 같이, 통계적으로 유의적임을 입증하였다. 본 발명자들은, GDF15가 경구 지질 내성을 증진시킴을 앞서의 단락들에서 입증하였다. 사료에 자유롭게 접근한 동물들에서 혈청 트리글리세라이드 수준들을 저하시키는데 있어서 보다 강력한 효능의 관찰은, 식후 지질 프로파일의 증진을 나타낼 수 있으며 경구/식이 지질 내성에 있어서의 증진으로부터 수득될 수 있다.
실시예 4.7 콜레스테롤 수준들에 있어서 시험 화합물들의 효과
총 콜레스테롤 수준들을 -4일, 14일 및 28일째에 4시간 절식된 동물들로부터, 21일째에 사료에 자유롭게 접근한 동물들로부터, 및 35일째에 16시간 절식시킨 동물들로부터 수집한 혈액 시료들에서 측정하였다. 마우스들은 암 주기 동안 이들의 사료의 대부분을 소비한다. 오전 6시로부터 4시간 절식의 프로토콜을 동일한 그룹내에서 장기간 비교를 위해 사용하여 광 주기 동안 사료를 조금씩 먹어 유도된 변화를 제거하였다.
모든 3개의 구조체들(즉, 하전된 쌍(delHinge) 구조체의 이량체, 하전된 쌍 구조체의 이량체 및 헤미Fc 구조체의 이량체)은 도 37, 38 및 52 내지 54에서 입증되는 바와 같이, 총 콜레스테롤 수준들을 투여량-의존적으로 저하시켰으며, 당해 효과는 동물들의 절식 상태에 의해 영향받았다.
실시예 4로부터의 결론들
모든 3개의 구조체들, 즉 하전된 쌍(delHinge) 구조체의 이량체, 하전된 쌍 구조체의 이량체 및 헤미Fc 구조체의 이량체는 체중, 혈당 수준들 및 글루코즈 내성, 혈청 인슐린 수준들, 혈청 콜레스테롤 수준들, 혈청 트리글리세라이드 수준들 및 경구 지질 내성을 포함하는 다양한 대사 매개변수들을 증진시키는데 있어서의 효능을 입증하였다. 폴리펩타이드들을 주당 1회 주사하였으며, 효능은 투여량-의존적이었고, 10nom/kg의 투여량은 가장 강력한 효능을 입증한다.
실시예 5
hGDF15 및 hGDF15 를 포함하는 구조체들의 비만 시노몰구스 원숭이에서의 만성 효능
하전된 쌍 (delHinge) 구조체 “DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+)” 및 헤미Fc 구조체 “Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15”를, 이들 구조체들, 및 비히클(A4.5Su)을 비만 시노몰구스 원숭이들에게 도입함으로써 생체내 GDF15 활성에 대해 분석하였다.
실시예 5.1 연구 설계
당해 연구는 시노몰구스 원숭이들에서 수행되었다. 원숭이들은 11 내지 14세이었다. 이들의 체중은 7 내지 10 kg 범위였으며 BMI는 38 내지 58 kg/m2의 범위였다. 40마리의 원숭이들을 화합물 투여 개시 전 6주 동안 적응시켰다. 적응 기간 동안, 원숭이들을 주당 4회씩 6주 동안 훈련시켜 의자-규제(chair-restrain), 피하 주사(PBS, 0.1 ml/kg), 위관영양법(gavage)(물, 10 ml/kg), 비 OGTT 및 OGTT 시료들에 대한 혈액 채취를 포함하는 과정들에 익숙해지도록 하였다. 6주의 훈련 동안, 기본선 OGTT 및 혈장 대사 매개변수들을 측정하였다. 40마리의 원숭이들 중 30마리를 선택하여 3개 처리 그룹들로 무작위 처리함으로서 체중, OGTT AUC 반응, 및 혈장 글루코즈, 인슐린 및 트리글리세라이드 수준들의 유사한 기본선 수준들을 달성하였다.
당해 연구는 맹검 방식으로 수행하였다. 비히클(n=10), DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+)구조체의 이량체 (n=10) 및 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체(n=10)를 화합물 A, B 및 C로 표지하고 주당 1회 피하 주사로 투여하였다. 화합물들을 1.5 mg/kg/주에서 제공하였다. 6주간의 화합물 처리들 후, 동물들을 처리들로부터 화합물 세척 및 회수에 대해 추가로 5주 동안 모니터하였다. 사료 섭취, 체중, 임상 화학 및 OGTT를 연구 전체에서 모니터하였다. 사료 섭취는 매 식이에서 측정하였다. 체중을 매주 측정하였다. 혈액 시료들을 각각의 주사 후 6일째에 매주 수집하여 글루코즈, 트리글리세라이드를 측정하였다. OGTT들은 처리들의 개시 후 13, 34 및 55일째에 수행하였다. 치료를 개시하는 날을 0으로 지정하고 세부적인 연구 설계는 도 55에 나타낸다.
당해 실시예에서 나타낸 결과들은 6주 처리의 말기 및 세척 제거 동안 수집한 데이터다.
실시에 5.2 화합물들 노출
화합물들(DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+)구조체의 이량체 및 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체) 노출 측정들을 밤새 절식시킨 후 및 절식시키지 않은 동물들에서 수집한 시료들에서 수행하였다. 이들 측정들을 처리 및 세척 상 동안 매주 수행하였다. DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체는 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체보다 더 큰 노출을 나타내었다. DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+)구조체의 이량체 그룹에서 10마리의 동물들 중 2마리는 항체를 나타낸 반면 10마리의 동물들 중 5마리는 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체 그룹에서 확인되었다. 항체를 지닌 예측된 동물들에서 약동학적 반응들의 손실은 약물 노출의 손실과 관련되어 있다. 각 화합물의 노출 수준은 도 56에 나타낸다.
실시예 5.3 경구 글루코즈 내성 시험( OGTT )에 있어서 시험 화합물들의 효과
OGTT들을 처리들 개시 전 및 후에 수행하였다. 도 57 내지 64는 OGTT 곡선하 전- 및 후-OGTT 부위(AUC)를 나타낸다. OGTT의 적응은 처리를 개시하기 전에 수행하였으며, OGTT들의 후-투여량은 2주 및 5주째에 수행하였으며 OGTT의 세척은 8주째에(최종 투여량 후 3주) 수행하였다. 글루코즈 및 인슐린(AUC)을 글루코즈(도 57 내지 60) 및 인슐린(도 61 내지 64)에 대해 측정하였다. DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+)구조체의 이량체는 2주째에 OGTT 글루코즈 AUC를 유의적으로 개선시켰으며 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체는 5주째에 OGTT 글루코즈 AUC를 유의적으로 개선시켰다. OGTT 글루코즈 AUC는 8주째까지 여전히 증진되었다(Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체를 사용한 세척 상 동안). OGTT 인슐린 AUC은 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체의 경우 2주 및 5주째에 및 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+)구조체의 이량체의 경우 2주째에만 유의적으로 완화되었다.
실시예 5.4 절식 인슐린 수준들에서 시험 화합물들의 효과
혈액을 밤새 절식한 동물들로부터 수집하였다. 혈액 채혈을 각각의 주사 후 6일째에 매주 수행하였다. DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체 및 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체는 절식 혈액 인슐린 수준들을 감소시켰다. 당해 효과는 세척 기간 동안 관찰되지 않았다. 도 68은 연구 과정 동안 절식 인슐린의 수준들을 나타낸다.
실시예 5.5 사료 섭취에 있어서 시험 화합물들의 효과
동물들에게 1일 2회 사료를 공급하고 사료 섭취를 각각의 식이에서 기록하였다. 사료 공급 시간들은 오전 8:00시 내지 오전 9:00시(±30 분들)이었으며 이후 오후 4:00시 내지 오후 5:00시(±30분들)이었다. 사과(150 g)를 각각의 동물에게 매일 오후 1시 30분 내지 2시 30분(±30 분들)에 공급하였다.
비히클과 비교하여, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체 및 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체 둘 다는 원숭이들에서 사료 섭취를 감소시켰다(도 66). 그러나, 처리한지 약 30일 후에 효과는 약화되었고 사료 섭취는 기본선 또는 대조군 수준들에 근접하게 회복되었다.
실시예 5.6 트리들리세라이드 수준들에 있어서 시험 화합물들의 효과
혈액을 밤새 절식한 동물들로부터 수집하였다. 혈액 채혈을 각각의 주사 후 6일째에 매주 수행하였다. 트리글리세라이드 수준들은 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체 및 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체로 처리한 동물들에서 처리상 전체에서 유의적으로 감소하였다. 당해 효과는 세척 기간 동안 약화되었다. 도 67은 연구 과정 동안 절식 혈장 트리글리세라이드들의 수준들을 나타낸다.
실시예 5.7은 체중에 있어서 시험 화합물들의 효과를 나타낸다.
체중을 연구 전체에서 매주 모니터하였다. 6주 처리의 과정에 걸쳐, 비히클로 처리한 동물들의 체중은 일정하게 남아있거나 약간 증가하였지만 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체 및 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체로 처리한 동물들의 체중은 도 65에 나타낸 바와 같이 점진적으로 감소하였다.
실시예 5로부터의 결론들
수컷 비만 시노몰구스 원숭이들에서 수행한 연구에서, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체 및 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체로 처리한 동물들은 증진된 대사 매개변수들을 나타내었다. 체중은 감소하였다. 사료 섭취의 단시간 감소가 관찰되었으며 연구의 중간 기간에 당해 효과는 약화되고 사료 섭취는 기본선 또는 대조군 수준들로 회복하였다. 절식 트리글리세라이드 수준들은 또한 화합물들, DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+) 구조체의 이량체 및 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 구조체의 이량체 둘 다에 의해 감소되었다. OGTT 글루코즈 및 인슐린 AUC는 증진되었다.
본 발명을 각종 양태들의 측면에서 기술하였지만, 변화들 및 변형들이 당해 분야의 숙련가들에게서 일어날 수 있을 것임은 이해된다. 따라서, 첨부된 특허청구범위는 특허청구된 본 발명의 영역내에 있는 이러한 등가의 변화들 모두를 포함한다. 또한, 본원에 사용된 단락 제목들은 단지 구조화 목적들을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 고려되지 않아야 한다.
본 출원에서 인용된 모든 참조문헌들은 어떠한 목적으로도 본원에 참조로 표현하여 혼입되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. <120> GROWTH DIFFERENTIATION FACTOR 15 (GDF-15) POLYPEPTIDES <130> A-1682-WO-PCT <140> <141> <150> 61/591,161 <151> 2012-01-26 <160> 130 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Rodent mature GDF15 cleavage site peptide <400> 1 Arg Gly Arg Arg 1 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg 1 5 <210> 3 <211> 927 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgcccgggc aagaactcag gacggtgaat ggctctcaga tgctcctggt gttgctggtg 60 ctctcgtggc tgccgcatgg gggcgccctg tctctggccg aggcgagccg cgcaagtttc 120 ccgggaccct cagagttgca ctccgaagac tccagattcc gagagttgcg gaaacgctac 180 gaggacctgc taaccaggct gcgggccaac cagagctggg aagattcgaa caccgacctc 240 gtcccggccc ctgcagtccg gatactcacg ccagaagtgc ggctgggatc cggcggccac 300 ctgcacctgc gtatctctcg ggccgccctt cccgaggggc tccccgaggc ctcccgcctt 360 caccgggctc tgttccggct gtccccgacg gcgtcaaggt cgtgggacgt gacacgaccg 420 ctgcggcgtc agctcagcct tgcaagaccc caggcgcccg cgctgcacct gcgactgtcg 480 ccgccgccgt cgcagtcgga ccaactgctg gcagaatctt cgtccgcacg gccccagctg 540 gagttgcact tgcggccgca agccgccagg gggcgccgca gagcgcgtgc gcgcaacggg 600 gaccactgtc cgctcgggcc cgggcgttgc tgccgtctgc acacggtccg cgcgtcgctg 660 gaagacctgg gctgggccga ttgggtgctg tcgccacggg aggtgcaagt gaccatgtgc 720 atcggcgcgt gcccgagcca gttccgggcg gcaaacatgc acgcgcagat caagacgagc 780 ctgcaccgcc tgaagcccga cacggtgcca gcgccctgct gcgtgcccgc cagctacaat 840 cccatggtgc tcattcaaaa gaccgacacc ggggtgtcgc tccagaccta tgatgacttg 900 ttagccaaag actgccactg catatga 927 <210> 4 <211> 308 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg Thr Val Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu 1 5 10 15 Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu 20 25 30 Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Glu Leu His Ser 35 40 45 Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu 50 55 60 Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu 65 70 75 80 Val 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cacgcatgcg cagatcaaag cacgcctgca tggcctgcag 780 cctgacaagg tgcctgcccc gtgctgtgtc ccctccagct acaccccggt ggttcttatg 840 cacaggacag acagtggtgt gtcactgcag acttatgatg acctggtggc ccggggctgc 900 cactgcgctt ga 912 <210> 6 <211> 303 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 6 Met Ala Pro Pro Ala Leu Gln Ala Gln Pro Pro Gly Gly Ser Gln Leu 1 5 10 15 Arg Phe Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Trp Pro 20 25 30 Ser Gln Gly Asp Ala Leu Ala Met Pro Glu Gln Arg Pro Ser Gly Pro 35 40 45 Glu Ser Gln Leu Asn Ala Asp Glu Leu Arg Gly Arg Phe Gln Asp Leu 50 55 60 Leu Ser Arg Leu His Ala Asn Gln Ser Arg Glu Asp Ser Asn Ser Glu 65 70 75 80 Pro Ser Pro Asp Pro Ala Val Arg Ile Leu Ser Pro Glu Val Arg Leu 85 90 95 Gly Ser His Gly Gln Leu Leu Leu Arg Val Asn Arg Ala Ser Leu Ser 100 105 110 Gln Gly Leu Pro Glu Ala Tyr Arg Val His Arg Ala Leu Leu Leu Leu 115 120 125 Thr Pro Thr Ala Arg Pro Trp Asp Ile Thr Arg Pro Leu Lys Arg Ala 130 135 140 Leu Ser Leu Arg Gly Pro Arg Ala Pro Ala Leu Arg Leu Arg Leu Thr 145 150 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tgcgtatctc tcgggccgcc 240 cttcccgagg ggctccccga ggcctcccgc cttcaccggg ctctgttccg gctgtccccg 300 acggcgtcaa ggtcgtggga cgtgacacga ccgctgcggc gtcagctcag ccttgcaaga 360 ccccaggcgc ccgcgctgca cctgcgactg tcgccgccgc cgtcgcagtc ggaccaactg 420 ctggcagaat cttcgtccgc acggccccag ctggagttgc acttgcggcc gcaagccgcc 480 agggggcgcc gcagagcgcg tgcgcgcaac ggggaccact gtccgctcgg gcccgggcgt 540 tgctgccgtc tgcacacggt ccgcgcgtcg ctggaagacc tgggctgggc cgattgggtg 600 ctgtcgccac gggaggtgca agtgaccatg tgcatcggcg cgtgcccgag ccagttccgg 660 gcggcaaaca tgcacgcgca gatcaagacg agcctgcacc gcctgaagcc cgacacggtg 720 ccagcgccct gctgcgtgcc cgccagctac aatcccatgg tgctcattca aaagaccgac 780 accggggtgt cgctccagac ctatgatgac ttgttagcca aagactgcca ctgcatatga 840 <210> 8 <211> 279 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Leu Ser Leu Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Glu 1 5 10 15 Leu His Ser Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu 20 25 30 Asp Leu Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp Glu Asp Ser Asn 35 40 45 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cggtggttct tatgcacagg acagacagtg gtgtgtcact gcagacttat 780 gatgacctgg tggcccgggg ctgccactgc gcttga 816 <210> 10 <211> 271 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 10 Ser Gln Gly Asp Ala Leu Ala Met Pro Glu Gln Arg Pro Ser Gly Pro 1 5 10 15 Glu Ser Gln Leu Asn Ala Asp Glu Leu Arg Gly Arg Phe Gln Asp Leu 20 25 30 Leu Ser Arg Leu His Ala Asn Gln Ser Arg Glu Asp Ser Asn Ser Glu 35 40 45 Pro Ser Pro Asp Pro Ala Val Arg Ile Leu Ser Pro Glu Val Arg Leu 50 55 60 Gly Ser His Gly Gln Leu Leu Leu Arg Val Asn Arg Ala Ser Leu Ser 65 70 75 80 Gln Gly Leu Pro Glu Ala Tyr Arg Val His Arg Ala Leu Leu Leu Leu 85 90 95 Thr Pro Thr Ala Arg Pro Trp Asp Ile Thr Arg Pro Leu Lys Arg Ala 100 105 110 Leu Ser Leu Arg Gly Pro Arg Ala Pro Ala Leu Arg Leu Arg Leu Thr 115 120 125 Pro Pro Pro Asp Leu Ala Met Leu Pro Ser Gly Gly Thr Gln Leu Glu 130 135 140 Leu Arg Leu Arg Val Ala Ala Gly Arg Gly Arg Arg Ser Ala His Ala 145 150 155 160 His Pro Arg Asp Ser Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys His Leu 165 170 175 Glu Thr Val Gln Ala 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300 agctacaatc ccatggtgct cattcaaaag accgacaccg gggtgtcgct ccagacctat 360 gatgacttgt tagccaaaga ctgccactgc atatga 396 <210> 16 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 16 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg 20 25 30 Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp 35 40 45 Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile 50 55 60 Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile 65 70 75 80 Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys 85 90 95 Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp 100 105 110 Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys 115 120 125 His Cys Ile 130 <210> 17 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 17 atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccgca 60 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 120 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 180 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 240 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 300 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 360 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 420 cccccatccc ggaaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 480 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 540 aagaccacgc ctcccgtgct gaagtccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc 600 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 660 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 711 <210> 18 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 18 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 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216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 19 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 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gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 480 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 540 gacaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag cgacctcacc 600 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 660 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtggagg tggtggatcc 720 ggaggcggtg gaagcggagg tggtggatct ggaggcggtg gaagcgcgcg caacggagac 780 cactgtccgc tcgggcccgg gcgttgctgc cgtctgcaca cggtccgcgc gtcgctggaa 840 gacctgggct gggccgattg ggtgctgtcg ccacgggagg tgcaagtgac catgtgcatc 900 ggcgcgtgcc cgagccagtt ccgggcggca aacatgcacg cgcagatcaa gacgagcctg 960 caccgcctga agcccgacac ggtgccagcg ccctgctgcg tgcccgccag ctacaatccc 1020 atggtgctca ttcaaaagac cgacaccggg gtgtcgctcc agacctatga tgacttgtta 1080 gccaaagact gccactgcat atga 1104 <210> 22 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 22 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 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<400> 24 atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccgac 60 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 120 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 180 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 240 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 300 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 360 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 420 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 480 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 540 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac gacaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 600 ggctccttct tcctctatag cgacctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 660 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 720 tccctgtctc cgggtggagg tggtggatcc ggaggcggtg gaagcggagg tggtggatct 780 ggaggcggtg gaagcgcgcg caacggagac cactgtccgc tcgggcccgg gcgttgctgc 840 cgtctgcaca 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Ala Arg Asn Gly Asp Asp Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg 20 25 30 Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp 35 40 45 Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile 50 55 60 Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile 65 70 75 80 Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys 85 90 95 Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp 100 105 110 Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys 115 120 125 His Cys Ile 130 <210> 37 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 37 gcgcgcaacg gggacgattg tccgctcggg cccgggcgtt gctgccgtct gcacacggtc 60 cgcgcgtcgc tggaagacct gggctgggcc gattgggtgc tgtcgccacg ggaggtgcaa 120 gtgaccatgt gcatcggcgc 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polynucleotide <400> 39 atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgaccggtgt ccactccgcg 60 cgccagggag accactgtcc gctcgggccc gggcgttgct gccgtctgca cacggtccgc 120 gcgtcgctgg aagacctggg ctgggccgat tgggtgctgt cgccacggga ggtgcaagtg 180 accatgtgca tcggcgcgtg cccgagccag ttccgggcgg caaacatgca cgcgcagatc 240 aagacgagcc tgcaccgcct gaagcccgac acggtgccag cgccctgctg cgtgcccgcc 300 agctacaatc ccatggtgct cattcaaaag accgacaccg gggtgtcgct ccagacctat 360 gatgacttgt tagccaaaga ctgccactgc ata 393 <210> 40 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 40 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Ala Arg Gln Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg 20 25 30 Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp 35 40 45 Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile 50 55 60 Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile 65 70 75 80 Lys Thr Ser 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cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 300 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 360 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 420 cccccatccc ggaaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 480 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 540 aagaccacgc ctcccgtgct gaagtccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc 600 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 660 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtggagg tggtggatcc 720 ggaggcggtg gaagcggagg tggtggatct ggaggcggtg gaagcgcgcg caacggagac 780 cactgtccgc tcgggcccgg gcgttgctgc cgtctgcaca cggtccgcgc gtcgctggaa 840 gacctgggct gggccgattg ggtgctgtcg ccacgggagg tgcaagtgac catgtgcatc 900 ggcgcgtgcc cgagccagtt ccgggcggca aacatgcacg cgcagatcaa gacgagcctg 960 caccgcctga agcccgacac ggtgccagcg ccctgctgcg tgcccgccag ctacaatccc 1020 atggtgctca ttcaaaagac cgacaccggg gtgtcgctcc agacctatga tgacttgtta 1080 gccaaagact gccactgcat atga 1104 <210> 48 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<400> 49 gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 300 cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 360 ctgcccccat cccggaagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480 tacaagacca cgcctcccgt gctgaagtcc gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc 540 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtgg aggtggtgga 660 tccggaggcg gtggaagcgg aggtggtgga tctggaggcg gtggaagcgc gcgcaacgga 720 gaccactgtc cgctcgggcc cgggcgttgc tgccgtctgc acacggtccg cgcgtcgctg 780 gaagacctgg gctgggccga ttgggtgctg tcgccacggg aggtgcaagt gaccatgtgc 840 atcggcgcgt 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tagcgacctc 540 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atga 654 <210> 54 <211> 1104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 54 atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccgca 60 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 120 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 180 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 240 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 300 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 360 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 420 cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 480 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 540 gacaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag cgacctcacc 600 gtggacaaga 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gagaaccaca ggtgtacacc 360 ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480 tacgacacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta tagcgacctc 540 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtgg aggtggtgga 660 tccggaggcg gtggaagcgg aggtggtgga tctggaggcg gtggaagcgc gcgcaacgga 720 gacgactgtc cgctcgggcc cgggcgttgc tgccgtctgc acacggtccg cgcgtcgctg 780 gaagacctgg gctgggccga ttgggtgctg tcgccacggg aggtgcaagt gaccatgtgc 840 atcggcgcgt gcccgagcca gttccgggcg gcaaacatgc acgcgcagat caagacgagc 900 ctgcaccgcc tgaagcccga cacggtgcca gcgccctgct gcgtgcccgc cagctacaat 960 cccatggtgc tcattcaaaa gaccgacacc ggggtgtcgc tccagaccta tgatgacttg 1020 ttagccaaag actgccactg catatga 1047 <210> 57 <211> 348 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 57 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 60 gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 300 cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 360 ctgcccccat cccggaagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480 tacaagacca cgcctcccgt gctgaagtcc gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc 540 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtgg aggtggtgga 660 tccggaggcg gtggaagcgg aggtggtgga tctggaggcg gtggaagcgc gcgcaacgga 720 gacgactgtc cgctcgggcc cgggcgttgc tgccgtctgc acacggtccg cgcgtcgctg 780 gaagacctgg 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 67 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 20 25 30 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 35 40 45 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 50 55 60 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 65 70 75 80 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 85 90 95 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 100 105 110 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 115 120 125 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 130 135 140 Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 165 170 175 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser 180 185 190 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 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ttctgtatag caaactgacc 600 gtggataaaa gccgctggca gcagggcaac gtgtttagct gcagcgtgat gcatgaagcg 660 ctgcataacc attataccca gaaaagcctg agcctgagcc cgggcggcgg cggcggcagc 720 ggcggcggcg gcagcgcgcg caacggcgat cattgcccgc tgggcccggg ccgctgctgc 780 cgcctgcata ccgtgcgcgc gagcctggaa gatctgggct gggcggattg ggtgctgagc 840 ccgcgcgaag tgcaggtgac catgtgcatt ggcgcgtgcc cgagccagtt tcgcgcggcg 900 aacatgcatg cgcagattaa aaccagcctg catcgcctga aaccggatac cgtgccggcg 960 ccgtgctgcg tgccggcgag ctataacccg atggtgctga ttcagaaaac cgataccggc 1020 gtgagcctgc agacctatga tgatctgctg gcgaaagatt gccattgcat ttga 1074 <210> 77 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 77 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 20 25 30 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 35 40 45 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 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aatgaccaaa aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaaa 420 ggcttttatc cgagcgatat tgcggtggaa tgggaaagca acggccagcc ggaaaacaac 480 tataaaacca ccccgccggt gctgaaaagc gatggcagct tttttctgta tagcaaactg 540 accgtggata aaagccgctg gcagcagggc aacgtgttta gctgcagcgt gatgcatgaa 600 gcgctgcata accattatac ccagaaaagc ctgagcctga gcccgggcgg cggcggcggc 660 agcggcggcg gcggcagcgc gcgcaacggc gatcattgcc cgctgggccc gggccgctgc 720 tgccgcctgc ataccgtgcg cgcgagcctg gaagatctgg gctgggcgga ttgggtgctg 780 agcccgcgcg aagtgcaggt gaccatgtgc attggcgcgt gcccgagcca gtttcgcgcg 840 gcgaacatgc atgcgcagat taaaaccagc ctgcatcgcc tgaaaccgga taccgtgccg 900 gcgccgtgct gcgtgccggc gagctataac ccgatggtgc tgattcagaa aaccgatacc 960 ggcgtgagcc tgcagaccta tgatgatctg ctggcgaaag attgccattg catttga 1017 <210> 79 <211> 338 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 79 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 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gaactccgga agtgacttgc gtcgtcgtgg acgtgtcaca tgaggatcca 180 gaggtcaagt tcaattggta tgtggacgga gtggaagtgc ataacgccaa gaccaaaccc 240 cgcgaagaac agtacaatag cacctaccgc gtggtgagcg tccttactgt gctccaccag 300 gactggctta atgggaagga atacaagtgt aaggtgtcca acaaggccct ccccgctccc 360 atcgaaaaga ccatctcaaa ggcaaagggg caaccaaggg aacctcaagt gtacaccctg 420 cctccgagca ggaaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacttgtct cgtgaagggc 480 ttctatccca gcgatattgc tgtggaatgg gagtcaaatg gccagcccga gaataactac 540 aaaactaccc cacccgtgct gaaatctgat gggtccttct tcctttactc caagctgacc 600 gtggacaaga gccgctggca acaaggcaat gtctttagct gctcagtgat gcatgaggct 660 ctccataatc actacactca gaagtcactg tccctgtcac ctggaggtgg cggagggcag 720 ggtggtggag gtcagggagg cggaggacag ggaggaggtg gacaagcacg gaacggggac 780 cattgtcccc tgggacctgg tcggtgctgc cggcttcaca ccgtcagagc ctctctggag 840 gaccttggat gggctgattg ggtgctgagc cctcgggagg tgcaagtcac catgtgcatc 900 ggggcctgcc ctagccagtt ccgcgcagcc aacatgcacg ctcagatcaa aacctctctt 960 cacagactga agcccgacac 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 89 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Cys Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 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aacctcaagt gtacacctgt 420 cctccgagca ggaaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacttgtct cgtgaagggc 480 ttctatccca gcgatattgc tgtggaatgg gagtcaaatg gccagcccga gaataactac 540 aaaactaccc cacccgtgct gaaatctgat gggtccttct tcctttactc caagctgacc 600 gtggacaaga gccgctggca acaaggcaat gtctttagct gctcagtgat gcatgaggct 660 ctccataatc actacactca gaagtcactg tccctgtcac ctggcggagg tggaggagca 720 cggaacgggg accattgtcc cctgggacct ggtcggtgct gccggcttca caccgtcaga 780 gcctctctgg aggaccttgg atgggctgat tgggtgctga gccctcggga ggtgcaagtc 840 accatgtgca tcggggcctg ccctagccag ttccgcgcag ccaacatgca cgctcagatc 900 aaaacctctc ttcacagact gaagcccgac accgtgccag caccttgctg tgtgccggcc 960 tcttataacc ccatggtcct cattcagaaa accgacaccg gagtgtcact tcagacttac 1020 gatgacctcc tggccaagga ctgccactgc atatga 1056 <210> 93 <211> 351 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 93 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Ala Pro 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ttaatgggaa ggaatacaag tgtaaggtgt ccaacaaggc cctccccgct 300 cccatcgaaa agaccatctc aaaggcaaag gggcaaccaa gggaacctca agtgtacacc 360 tgtcctccga gcaggaagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacttg tctcgtgaag 420 ggcttctatc ccagcgatat tgctgtggaa tgggagtcaa atggccagcc cgagaataac 480 tacaaaacta ccccacccgt gctgaaatct gatgggtcct tcttccttta ctccaagctg 540 accgtggaca agagccgctg gcaacaaggc aatgtcttta gctgctcagt gatgcatgag 600 gctctccata atcactacac tcagaagtca ctgtccctgt cacctggcgg aggtggagga 660 gcacggaacg gggaccattg tcccctggga cctggtcggt gctgccggct tcacaccgtc 720 agagcctctc tggaggacct tggatgggct gattgggtgc tgagccctcg ggaggtgcaa 780 gtcaccatgt gcatcggggc ctgccctagc cagttccgcg cagccaacat gcacgctcag 840 atcaaaacct ctcttcacag actgaagccc gacaccgtgc cagcaccttg ctgtgtgccg 900 gcctcttata accccatggt cctcattcag aaaaccgaca ccggagtgtc acttcagact 960 tacgatgacc tcctggccaa ggactgccac tgcatatga 999 <210> 95 <211> 332 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 95 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Cys Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu 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caaggacacc 60 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 300 cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 360 tgtcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480 tacgacacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta tagcgacctc 540 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atga 654 <210> 99 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 99 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp 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ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag cgacctcacc 600 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 660 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 711 <210> 106 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 106 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 20 25 30 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 35 40 45 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 50 55 60 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 65 70 75 80 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 85 90 95 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 100 105 110 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 115 120 125 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg 130 135 140 Glu 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ccgaggtcca gttcaactgg 240 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaaac cacgggagga gcagttcaac 300 agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 360 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 420 aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 480 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 540 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg 600 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 660 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 720 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtgga ggtggcggta gcggtggcgg aggttcaggt 780 ggtggcggtt ctggcggagg tggcagtggc ggtggcggat caggtggcgg tggcagcggt 840 ggcggcggaa gcggtggagg aggttcagag cggaaatcca gcgttgaatg tcctccgtgc 900 cctgctccac ccgtcgcggg gcctagtgtc ttccttttcc ctccaaaacc aaaggataca 960 ctgatgatca gccggacccc cgaggttacg tgcgtcgtcg tcgatgtctc ccacgaggat 1020 ccagaggtcc aattcaactg gtacgtggac ggggtcgagg tgcataatgc 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 126 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gly Gly Gly Glu Arg Lys Ser Ser Val Glu Cys Pro Pro 20 25 30 Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 35 40 45 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 50 55 60 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 65 70 75 80 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 85 90 95 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val 100 105 110 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 115 120 125 Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 130 135 140 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 145 150 155 160 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 165 170 175 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 180 185 190 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 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ctcacccgga ggaggaggcg gttctggtgg aggagggtct 720 ggaggtggag ggagcggcgg aggcgggtct ggcggtggtg ggtctgagag gaagtcatca 780 gtggaatgcc caccatgccc tgctcctccc gtggccggtc cgagcgtgtt tctcttccca 840 cctaagccca aggacactct gatgatctca cggactccgg aagtgacttg tgtggtggtg 900 gacgtgtctc atgaggaccc tgaagtgcag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 960 cacaatgcta agaccaagcc tagagaggaa cagttcaatt ccacctttcg cgtggtgagc 1020 gtcctgaccg tcgtgcacca ggactggctt aacggaaagg aatacaagtg caaggtgtcc 1080 aacaaaggcc ttccagctcc cattgagaaa accatctcta aaactaaggg tcaaccaagg 1140 gaaccccaag tctacaccct ccctccgtct agagaagaga tgaccaaaaa ccaggtgtcc 1200 ctgacctgtc tggtgaaggg attttacccc tcagacatcg ccgtggagtg ggaaagcaac 1260 ggacagcccg aaaacaacta taagactacc cctcctatgc tggactcaga cggatctttc 1320 ttcctctata gcaagctcac tgtggacaaa tccagatggc aacaagggaa tgtgttctca 1380 tgcagcgtga tgcacgaggc tcttcacaac cactataccc agaagagcct gtctctttca 1440 cctggttccg gaggtggtgg gagcggaggg ggtggatcag gtggtggagg gtccggaggc 1500 ggaggatccg cacggaatgg cgaccactgt ccactgggac ccggaagatg ttgtcgcctc 1560 cacaccgtga gggcctctct ggaggacctt ggctgggccg actgggtcct gtcacctcgg 1620 gaggtccaag tcaccatgtg tatcggagcc tgccccagcc aattcagagc agcaaatatg 1680 cacgcacaga ttaagaccag cctgcatcgg cttaaacctg atactgtgcc ggctccttgt 1740 tgcgtgccag catcttacaa cccgatggtg ctgatccaga aaaccgatac cggtgtctcc 1800 ctccagactt acgacgacct ccttgcaaag gactgccatt gcatctga 1848 <210> 128 <211> 615 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 128 Gly Gly Gly Glu Arg Lys Ser Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 65 70 75 80 Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 225 230 235 240 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 245 250 255 Arg Lys Ser Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala 260 265 270 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 275 280 285 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 290 295 300 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 305 310 315 320 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe 325 330 335 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 340 345 350 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile 355 360 365 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 370 375 380 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 385 390 395 400 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 405 410 415 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 420 425 430 Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 435 440 445 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 450 455 460 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 465 470 475 480 Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 485 490 495 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu 500 505 510 Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu 515 520 525 Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val 530 535 540 Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met 545 550 555 560 His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val 565 570 575 Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile 580 585 590 Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu 595 600 605 Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 610 615 <210> 129 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Met Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp 20 25 30 Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala 35 40 45 Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr 50 55 60 Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val 65 70 75 80 Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly 85 90 95 Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys 100 105 110 Ile <210> 130 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 130 atggcgcgca acggggacca ctgtccgctc gggcccgggc gttgctgccg tctgcacacg 60 gtccgcgcgt cgctggaaga cctgggctgg gccgattggg tgctgtcgcc acgggaggtg 120 caagtgacca tgtgcatcgg cgcgtgcccg agccagttcc gggcggcaaa catgcacgcg 180 cagatcaaga cgagcctgca ccgcctgaag cccgacacgg tgccagcgcc ctgctgcgtg 240 cccgccagct acaatcccat ggtgctcatt caaaagaccg acaccggggt gtcgctccag 300 acctatgatg acttgttagc caaagactgc cactgcatat aa 342

Claims (29)

  1. GDF15 폴리펩타이드 및 1개 이상의 Fc 서열들을 포함하는 구조체.
  2. 제1항에 있어서, 2개 이상의 Fc 서열들을 포함하는 것인 구조체.
  3. 제2항에 있어서, Fc 서열들 중 1개 이상이 서열번호 18, 19, 85, 86, 89, 90, 91, 99, 100, 108, 109 및 111로 이루어진 그룹에서 선택된 서열을 독립적으로 포함하는 것인 구조체.
  4. 제3항에 있어서, Fc 서열들 중 2개 이상이 연합되어 있는 것인 구조체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 GDF15 폴리펩타이드 및 Fc 서열들 중 1개 이상이 인접한 서열을 형성하는 구조체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 GDF15 폴리펩타이드 및 Fc 서열이 링커에 의해 결합되어 있는 것인 구조체.
  7. 제6항에 있어서, 서열번호 44, 50, 57, 61, 65, 69, 74, 79, 84, 95 및 104로 이루어진 그룹에서 선택된 서열을 포함하는 구조체.
  8. 제7항에 있어서, 서열번호 18, 19, 85, 86, 89, 90, 91, 99, 100, 108, 109 및 110으로 이루어진 그룹에서 선택된 서열을 추가로 포함하는 구조체.
  9. 제8항에 따른 구조체를 포함하는 이량체.
  10. 제1항에 있어서,
    (a) 서열번호 18을 포함하는 서열 및 서열번호 44를 포함하는 서열;
    (b) 서열번호 86을 포함하는 서열 및 서열번호 50을 포함하는 서열;
    (c) 서열번호 18을 포함하는 서열 및 서열번호 57을 포함하는 서열;
    (d) 서열번호 86을 포함하는 서열 및 서열번호 61을 포함하는 서열;
    (e) 서열번호 86을 포함하는 서열 및 서열번호 65를 포함하는 서열;
    (f) 서열번호 86을 포함하는 서열 및 서열번호 69를 포함하는 서열;
    (g) 서열번호 86을 포함하는 서열 및 서열번호 74를 포함하는 서열;
    (h) 서열번호 86을 포함하는 서열 및 서열번호 79를 포함하는 서열
    (i) 서열번호 86을 포함하는 서열 및 서열번호 84를 포함하는 서열
    (j) 서열번호 91을 포함하는 서열 및 서열번호 95를 포함하는 서열; 또는
    (k) 서열번호 100을 포함하는 서열 및 서열번호 104를 포함하는 서열
    로 이루어진 그룹에서 선택된 구조체를 포함하는 구조체.
  11. 제10항에 따른 구조체를 포함하는 이량체를 포함하는 구조체.
  12. 제2항에 있어서, 1개 이상의 Fc 서열들이 서열번호 23, 110, 114 및 115로 이루어진 그룹에서 선택된 서열을 독립적으로 포함하는 것인 구조체.
  13. 제12항에 있어서, 2개 이상의 Fc 서열들이 연합되어 있는 것인 구조체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 GDF15 폴리펩타이드 및 Fc 서열들 중 1개 이상이 인접한 서열을 형성하는 것인 구조체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 GDF15 폴리펩타이드 및 Fc 서열이 링커에 의해 결합되어 있는 것인 구조체.
  16. 제15항에 있어서, 서열번호 113을 포함하는 구조체.
  17. 제16항에 따른 구조체를 포함하는 이량체.
  18. 제12항에 있어서, 서열번호 110을 포함하는 서열 및 서열번호 113을 포함하는 서열을 포함하는 구조체.
  19. 제18항에 따른 구조체를 포함하는 이량체.
  20. 제2항에 있어서, Fc 서열들 중 1개 이상이 서열번호 28 및 30으로 이루어진 그룹에서 선택된 서열을 독립적으로 포함하는 것인 구조체.
  21. 제20항에 있어서, Fc 서열들 중 2개 이상이 링커에 의해 결합된 것인 구조체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 링커가 서열번호 87, 88 및 131로 이루어진 그룹에서 선택된 서열을 포함하는 것인 구조체.
  23. 제22항에 있어서, 제1의 Fc 서열의 C-말단이 제2의 Fc 서열의 N-말단에 결합된 것인 구조체.
  24. 제23항에 있어서, 상기 GDF15 폴리펩타이드 및 Fc 서열들 중 1개 이상이 인접한 서열을 형성하는 것인 구조체.
  25. 제24항에 있어서, 상기 GDF15 폴리펩타이드 및 Fc 서열이 링커에 의해 결합되어 있는 것인 구조체.
  26. 제25항에 있어서, 상기 링커가 서열번호 31을 포함하는 것인 구조체.
  27. 제26항에 따른 구조체를 포함하는 이량체.
  28. 제20항에 있어서, 서열번호 33, 123 및 128로 이루어진 그룹에서 선택된 서열을 포함하는 구조체.
  29. 제28항에 따른 구조체를 포함하는 이량체.
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