CN116732159A - 青光眼中的gdf15及其使用方法 - Google Patents

青光眼中的gdf15及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116732159A
CN116732159A CN202310039351.2A CN202310039351A CN116732159A CN 116732159 A CN116732159 A CN 116732159A CN 202310039351 A CN202310039351 A CN 202310039351A CN 116732159 A CN116732159 A CN 116732159A
Authority
CN
China
Prior art keywords
glaucoma
amount
nucleic acid
gdf
gdf15 protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310039351.2A
Other languages
English (en)
Inventor
勒让德·S·阿普特
詹·约施诺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhan Yueshinuo
Le RangdeSApute
Original Assignee
Zhan Yueshinuo
Le RangdeSApute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhan Yueshinuo, Le RangdeSApute filed Critical Zhan Yueshinuo
Publication of CN116732159A publication Critical patent/CN116732159A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/16—Ophthalmology
    • G01N2800/168—Glaucoma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Abstract

本公开涉及青光眼中的GDF15及其使用方法。本公开提供了使用GDF15的表达水平确定青光眼严重度的方法。确定青光眼的严重度有助于治疗决策。

Description

青光眼中的GDF15及其使用方法
本申请为分案申请，原申请的申请日为2017年1月30日，申请号为201780021280.6(PCT/US2017/015643)，发明名称为“青光眼中的GDF15及其使用方法”。
政府权利
本发明是在国立卫生研究院授予的EY019287下借助政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年1月29日提交的美国临时申请号62/289,030的权益，所述美国临时申请的公开内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本公开提供了使用GDF15的表达水平确定青光眼严重度的方法。确定青光眼的严重度有助于治疗决策。
发明背景
青光眼是一组损害眼睛的视神经并且可导致视力丧失和失明的疾病。然而，通过早期检测和治疗，可以保护眼睛免受严重的视力丧失。目前没有可用的检测青光眼严重度或进展的生物标志物。Tgfb2可引起青光眼，但其不是青光眼的生物标志物。目前，青光眼的治疗是基于眼内压(IOP)和视野检查来决定的。然而，IOP在患者与患者之间存在巨大差异，并且视野检查是一种主观测试。因此，需要有助于青光眼的治疗决策的生物标志物。
发明内容
在一个方面，本公开提供了确定被诊断患有青光眼的受试者中的青光眼严重度的方法。该方法包括：(a)测量从受试者获得的生物样品中gdf15核酸或GDF15蛋白的量；(b)将生物样品中gdf15核酸或GDF15蛋白的量与参考值进行比较；和(c)基于相对于参考值的gdf15核酸或GDF15蛋白的量确定青光眼的严重度。
在另一方面，本公开提供了确定被诊断患有青光眼的受试者的治疗的方法。该方法包括：(a)测量从受试者获得的生物样品中gdf15核酸或GDF15蛋白的量；(b)将生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量与参考值进行比较，其中高于参考值的gdf15核酸或GDF15蛋白的量指示青光眼的严重度；和(c)基于检测到的青光眼严重度确定受试者的治疗。
在另一方面，本公开提供了监测受试者中的青光眼进展的方法。该方法包括：(a)测量从受试者获得的第一生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量；(b)测量在稍后时间从受试者获得的第二生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量；(c)将第一生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量与第一生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量进行比较；和(d)如果第二生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量相对于第一生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量增加，则确定青光眼进展。
在另一方面，本公开提供了监测受试者对青光眼治疗的响应的方法。该方法包括：(a)测量从受试者获得的第一生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量；(b)治疗该受试者；(c)测量在稍后时间从受试者获得的第二生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量；(d)将第一生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量与第一生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量进行比较；和(e)如果第二生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量相对于第一生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量减少，则确定对治疗的响应。
附图说明
申请文件包含至少一个彩色附图。具有彩色附图的本专利申请出版物的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。
图1描绘显示在视神经挤压模型(ONC)、内毒素诱导的葡萄膜炎模型(EIU)和光暴露诱导的视网膜变性模型(LE)之间重叠的上调的基因的维恩图。
图2描绘显示在ONC、EIU和LE之间重叠的下调的基因的维恩图。
图3A、图3B和图3C描绘显示ONC(图3A)、EIU(图3B)和LE(图3C)中gdf15的基因表达水平的图。Gdg15基因表达仅在ONC模型中上调。
图4A、图4B和图4C描绘显示ONC(图4A)、EIU(图4B)和LE(图4C)中的tgfb2的基因表达水平的图。Tgfb2在所有模型中等同于对照。
图5A、图5B、图5C、图5D、图5E、图5F、图5G、图5H、图5I和图5J描绘显示在ONC模型中没有其他gdf基因改变的图。(图5A)gdf1；(图5B)gdf2；(图5C)gdf3；(图5D)gdf5；(图5E)gdf6；(图5F)gdf7；(图5G)gdf8；(图5H)gdf9；(图5I)gdf10；和(图5J)gdf11。
图6描绘显示在ONC小鼠模型中GDF15蛋白升高的图。
图7A和图7B描绘显示gdf15在ONC中显著上调(图7A)并且tgfb2在ONC中未改变(图7B)的图。图7C描绘显示通过对房水进行的ELISA测定检测的GDF15蛋白表达在ONC的大鼠模型中也上调的图。
图8A、图8B和图8C描绘分别显示前段、晶状体和视网膜中gdf15在6小时时的表达的图。结果显示，任何眼组织中均无明显上调。图8D、图8E和图8F描绘显示gdf15表达在视网膜(图8F)中显著上调，但在前段或晶状体(分别为图8D、图8E)中未显著上调的图。
图9A描绘显示对照中的巨噬细胞相对于ONC模型中的巨噬细胞没有显著差异的图。图9B和图9C描绘显示EIU和LE模型分别显示相对于对照的巨噬细胞的显著增加的图。
图10描绘显示青光眼患者中的GDF15表达相对于对照患者的GDF15表达的显著增加的图。
图11描绘显示GDF15表达与疾病严重度相关的图。随着青光眼的严重度从Ⅰ级进展至Ⅱ级至Ⅲ级，检测到的GDF15的量增加。Turkey多重比较*p<0.05**p<0.01。
图12描绘显示对照组织和ONC组织的原位杂交(ISH)的图像。相对于ONC组织中的外核层(ONL)和内核层(INL)，iGDF15在神经节细胞层(GCL)中特异性上调。
具体实施方式
本公开提供了GDF15蛋白的房水浓度的增加与青光眼的严重度的增加之间的统计学显著关系。生长/分化因子15(GDF15)是属于转化生长因子β超家族的蛋白质。GDF15也可被称为生长/分化因子15、TGF-PL、MIC-1、PDF、PLAB、NAG-1和PTGFB。GDF15的氨基酸序列可见于GenBank登录号NP_004855.2，且mRNA序列可见于GenBank登录号NM_004864.3。技术人员将能够基于所提供的GenBank登录号确定序列。不可预测的是由于对视网膜神经节细胞的慢性损伤而导致GDF15蛋白水平将在青光眼中升高以及GDF15的升高将与青光眼的等级特异性相关。令人惊讶的是，GDF15是唯一被视网膜神经节细胞损伤上调的特定基因。因此，本文提供了利用这种关系提供确定青光眼严重度和帮助治疗决策的创造性手段的方法。
本文提供了用于检测gdf15核酸和GDF15蛋白的方法及其在对受试者的青光眼严重度分类中的用途。下面更详细地描述这些方法的各个方面。
I.方法
在一个方面，本公开提供了基于在获自受试者的生物样品中测量的gdf15核酸或GDF15蛋白的量对受试者进行分类的方法。该方法通常包括(i)测量生物样品中gdf15核酸或GDF15蛋白的量，(ii)将生物样品中gdf15核酸或GDF15蛋白的量与参考值进行比较，和(iii)基于样品中测量的gdf15核酸或GDF15蛋白的量将受试者分类为具有增加的或减少的gdf15核酸或GDF15蛋白的量。
在另一方面，本公开提供了确定被诊断为患有青光眼的受试者中青光眼严重度的方法。该方法通常包括(i)测量从受试者获得的生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量，(ii)将生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量与参考值进行比较，和(iii)基于相对于参考值的gdf15核酸或GDF15蛋白的量来确定青光眼的严重度。诊断受试者的青光眼的方法是本领域已知的，并且可包括但不限于测量眼压(眼内压(IOP)，眼压测量法)、检查眼睛的引流角(前房角镜检查法)、检查视神经(检眼镜检查法)、测试周边视觉(视野测试，周边视野检查法)以及测量角膜厚度(厚度测量法)。在某些实施方案中，受试者可能未被诊断为患有青光眼，但基于症状被怀疑患有青光眼。可导致诊断的青光眼症状的非限制性实例包括外周视野中的盲点、视力模糊、晕圈、轻度头痛、眼痛、眼睛或前额的剧烈疼痛、眼睛发红、视力下降、视觉彩虹(visionrainbows)、恶心和/或呕吐。在其他实施方案中，受试者可能未被诊断为患有青光眼但有患有青光眼的风险。青光眼风险因素的非限制性实例包括高IOP、年龄大于60岁、非裔美国人或西班牙裔、青光眼家族史、医学病况(诸如糖尿病、心脏病、高血压和镰状细胞性贫血)、眼病况诸如近视、眼外伤史或某些类型的眼科手术、早期雌激素缺乏(诸如可在43岁之前进行双侧卵巢切除术后发生)，和/或长时间服用皮质类固醇药物，特别是滴眼剂。
通常，青光眼的严重度基于ICD-9分期定义来确定。然而，本公开提供了生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量可用于确定青光眼的严重度。根据ICD-9分期定义，青光眼的严重度可能是轻度或早期青光眼(Ⅰ级)、中度期青光眼(Ⅱ级)或严重期青光眼、晚期青光眼、终末期青光眼(Ⅲ级)。轻度或早期青光眼(Ⅰ级)被定义为与青光眼相符，但无任何白底白色视野测试(white-on-whitevisualfieldtest)中的视野异常或仅在短波长自动视野检查或倍频视野检查中出现的异常的视神经异常。中度期青光眼(Ⅱ级)定义为与青光眼和一个半视野中而不是在5固定度内的青光眼视野异常相符的视神经异常。严重期青光眼、晚期青光眼、终末期青光眼(Ⅲ级)被定义为与青光眼和两个半视野中的青光眼视野异常和/或至少一个半视野中的5固定度内的视觉丧失相符的视神经异常。可以使用本领域已知的其他分期系统。技术人员将能够使ICD-9分期系统与其他分期系统发生关联。因此，基于生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量，可将受试者分为Ⅰ级、Ⅱ级或Ⅲ级青光眼。然后可基于青光眼的分期做出治疗决策。
在另一方面，本公开提供了确定被诊断为患有青光眼的受试者的治疗的方法。该方法通常包括(i)测量从受试者获得的生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量，(ii)将生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量与参考值进行比较，其中高于参考值的gdf15核酸或GDF15蛋白的量指示青光眼严重度，和(iii)基于检测到的青光眼严重度确定受试者的治疗。在某些实施方案中，受试者可能未被诊断为患有青光眼但基于症状被怀疑患有青光眼。在其他实施方案中，受试者可能未被诊断为患有青光眼但具有患有青光眼的风险。基于生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量，受试者可分为Ⅰ级、Ⅱ级或Ⅲ级青光眼。青光眼可用滴眼剂、丸剂、激光手术、切开性手术或这些方法的组合来治疗。任何治疗的目标都是防止视力丧失，因为青光眼造成的视力丧失是不可逆转的。通常，滴眼剂用于治疗低级青光眼。如果滴眼剂不能充分控制IOP，则除了滴眼剂以外还可以使用丸剂。当药物无法实现预期结果或产生无法忍受的副作用时，手术可能是下一个选择。手术可以是激光手术或切开性手术。激光手术被视为药物与切开性手术之间的中间步骤。激光手术的非限制性实例包括氩激光小梁成形术(ALT)、选择性激光小梁成形术(SLT)、激光周边虹膜切开术(LPI)和环切术(cycloablation)。切开性手术的非限制性实例包括小梁切除术、引流物植入手术、非穿透手术、ExPress微型青光眼分流术、小梁消融术(Trabectome)和管道成形术。基于根据生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量分类至Ⅰ级、Ⅱ级或Ⅲ级，可用滴眼剂、丸剂、激光手术和/或切开性手术治疗受试者。
在另一方面，本公开提供了用于监测受试者中的青光眼的方法。在此类实施方案中，检测gdf15核酸或GDF15蛋白的方法可用于在一个时间点评估受试者的青光眼严重度。然后，在稍后的时间，可使用检测gdf15核酸或GDF15蛋白的方法来确定受试者中青光眼严重度随时间的变化。例如，检测gdf15核酸或GDF15蛋白的方法可以在初始确定gdf15核酸或GDF15蛋白的量之后的数天、数周、数月或数年用于相同的受试者。因此，检测gdf15核酸或GDF15蛋白的方法可用于随时间跟踪受试者以确定何时发展为更严重疾病的风险高，从而需要治疗。另外，检测gdf15核酸或GDF15蛋白的方法可用于测量疾病进展的速率。例如，gdf15核酸或GDF15蛋白的减少的量可指示疾病进展的减轻。或者，gdf15核酸或GDF15蛋白的增加的量可以指示疾病进展。早期评估受试者中青光眼的严重度可通过使得能够进行改进的干预或使得能够进行早期干预来减少与青光眼相关的症状的发展和/或进展。
另外，用于监测受试者中的青光眼的方法也可用于确定对治疗的响应。如本文中所用，对治疗有响应的受试者被认为受益于治疗。在临床实践中使用测试来测量对治疗的响应，所述测试包括但不限于测量眼压(眼内压(IOP)，眼压测量法)、检查眼睛的引流角(前房角镜检查法)、检查视神经(检眼镜检查法)、测试周边视觉(视野测试，周边视野检查法)以及测量角膜厚度(厚度测量法)。这些测试在本领域中是公知的，并且旨在指技术人员在临床试验期间和临床实践中测量的特定参数。例如，可在开始治疗之前对受试者的生物样品进行检测gdf15核酸或GDF15蛋白的方法。然后在稍后的时间，可将检测gdf15核酸或GDF15蛋白的方法用于确定随时间推移对治疗的响应。例如，可在治疗开始后数天、数周、数月或数年对相同受试者的生物样品进行检测gdf15核酸或GDF15蛋白的方法。因此，可将检测gdf15核酸或GDF15蛋白的方法用于跟踪接受治疗的受试者以确定受试者是否对治疗有响应。如果gdf15核酸或GDF15蛋白的量增加或保持相同，则受试者可能对治疗没有响应。如果gdf15核酸或GDF15蛋白的量减少，则受试者可能对治疗有响应。可以重复这些步骤以确定随时间推移对治疗的响应。
合适的受试者包括但不限于人、家畜、伴侣动物、实验动物和动物园动物。在一个实施方案中，受试者可以是啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠等。在另一个实施方案中，受试者可以是家畜。合适的家畜动物的非限制性实例可包括猪、母牛、马、山羊、绵羊、美洲驼和羊驼。在另一个实施方案中，受试者可以是伴侣动物。伴侣动物的非限制性实例可包括宠物，诸如狗、猫、兔和鸟类。在另一个实施方案中，受试者可以是动物园动物。如本文中所用，“动物园动物”是指可在动物园中发现的动物。此类动物可包括非人灵长类动物、大型猫科动物、狼和熊。在优选实施方案中，动物是实验动物。实验动物的非限制性实例可包括啮齿动物、犬科动物、猫科动物和非人灵长类动物。在某些实施方案中，动物是啮齿类动物。在优选实施方案中，受试者是人。
(a)生物样品
如本文中所用，术语“生物样品”是指从受试者获得的样品。含有GDF15蛋白或gdf15核酸的任何生物样品都是合适的。许多类型的生物样品在本领域中是已知的。合适的生物样品可包括但不限于组织样品或体液。在一些实施方案中，生物样品是组织样品诸如组织活检样品。可以将活检组织固定，包埋在石蜡或塑料中，并进行切片，或者可将活检组织冷冻并进行冷冻切片。在具体实施方案中，活检组织是视网膜组织。在其他实施方案中，样品可以是体液。合适的体液的非限制性实例包括房水。在具体实施方案中，生物样品是房水。流体可以“按原样”使用，可将细胞组分与所述流体分离，或者可使用标准技术从流体中分离级分。
如将由本领域技术人员所理解的，收集生物样品的方法可以且将根据生物样品的性质和要进行的分析类型而变化。可使用本领域公知的多种方法中的任一种来收集生物样品。一般而言，该方法优选保持样品的完整性，使得可以准确地检测gdf15核酸或GDF15蛋白，并根据本公开测量量。在具体实施方案中，在手术开始时收集房水。
在一些实施方案中，从受试者获得单个样品以检测样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白。或者，可在随时间推移从受试者获得的样品中检测gdf15核酸或GDF15蛋白。因此，可随时间推移从受试者收集多于一个样品。例如，可随时间推移从受试者收集2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或更多个样品。在一些实施方案中，随时间推移从受试者收集2个、3个、4个、5个或6个样品。在其他实施方案中，随时间推移从受试者收集6个、7个、8个、9个或10个样品。在其他实施方案中，随时间推移从受试者收集10个、11个、12个、13个或14个样品。在其他实施方案中，随时间推移从受试者收集14个、15个、16个或更多个样品。
当随时间推移从受试者收集多于一个样品时，可以每1天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天、每8天、每9天、每10天、每11天、每12天或更多天收集样品。在一些实施方案中，约每6天收集样品。在一些实施方案中，每1天、每2天、每3天、每4天或每5天收集样品。在其他实施方案中，每5天、每6天、每7天、每8天或每9天收集样品。在其他实施方案中，每9天、每10天、每11天、每12天或更多天收集样品。在其他实施方案中，每隔一个月、每隔3个月、每隔6个月、每隔1年、每隔2年、每隔5年天、每隔10年或更长时间收集样品。
(b)检测gdf15核酸或GDF15蛋白
一旦获得样品，就将其在体外处理以检测和测量gdf15核酸或GDF15蛋白的量。本领域技术人员已知的用于检测和测量gdf15核酸或GDF15蛋白的量的所有合适方法均包括在本发明的范围内。下面详细描述检测核酸表达和蛋白质表达的方法。
i.核酸表达
在一个实施方案中，可以测量gdf15核酸表达以确定生物样品中gdf15核酸的量。在具体实施方案中，可测量gdf15 mRNA以确定生物样品中gdf15核酸的量。
用于评估样品中核酸表达量的方法是本领域熟知的，并且本领域技术人员已知的用于评估核酸表达量的所有合适方法都涵盖在本发明的范围内。如本文中所用，术语“核酸表达量”或“核酸表达水平”是指可测量的核酸表达水平，诸如但不限于表达的信使RNA(mRNA)转录物或mRNA的特定变体或其他部分、核酸的酶活性或其他活性的水平以及特定代谢物的水平。术语“核酸”包括DNA和RNA，可以是双链或单链的。评估核酸表达量的合适方法的非限制性实例可包括阵列，诸如微阵列、PCR诸如RT-PCR(包括定量RT-PCR)、核酸酶保护测定和RNA印迹分析。在具体实施方案中，确定靶核酸的表达量部分地包括测量靶核酸mRNA表达的水平。
在一个实施方案中，核酸表达量可以通过使用阵列(诸如微阵列)来确定。使用核酸微阵列的方法在本领域中是公知的。例如，可在阵列中使用与靶基因的表达产物互补或可与所述表达产物杂交的核酸探针。术语“杂交”或“可杂交的”是指与互补核酸的序列特异性非共价结合相互作用。在优选实施方案中，杂交在高度严格条件下进行。促进杂交的适当严格条件是本领域技术人员已知的，或者可见于Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.16.3.6。如本文中所用，术语“探针”是指将与核酸靶序列杂交的核酸序列。在一个实例中，探针与核酸的RNA产物或其互补核酸序列杂交。探针的长度取决于杂交条件以及探针和核酸靶序列的序列。在一个实施方案中，探针的长度为至少8个、10个、15个、20个、25个、50个、75个、100个、150个、200个、250个、400个、500个或更多个核苷酸。
在另一个实施方案中，可使用PCR确定核酸表达的量。PCR的方法在本领域中是公知的，并且可包括定量PCR、半定量PCR、多重PCR或其任意组合。具体地，可使用定量RT-PCR确定核酸表达量。进行定量RT-PCR的方法在本领域中是常见的。在此类实施方案中，用于定量RT-PCR的引物可包含靶基因的正向和反向引物。如本文中所用，术语“引物”是指当被置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(例如在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶存在的情况下并且在合适的温度和pH下)时能够充当合成点的核酸序列(无论是天然存在的(如在纯化的限制性消化物中)还是合成产生的)。引物必须足够长以在诱导剂存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于多种因素，包括温度、引物序列和使用的方法。引物通常含有15-25个或更多个核苷酸，尽管其可含有更少或更多的核苷酸。确定适当的引物长度所涉及的因素是本领域普通技术人员容易知道的。
可通过测量核酸序列的完整mRNA转录物，或测量核酸序列的mRNA转录物的一部分来测量核酸表达量。例如，如果利用核酸阵列来测量mRNA表达量，则所述阵列可包含针对目标核酸序列的mRNA的一部分的探针，或者所述阵列可包含针对目标核酸序列的完整mRNA的探针。类似地，在PCR反应中，可设计引物来扩增目标核酸序列的完整cDNA序列或cDNA序列的一部分。本领域技术人员将认识到，存在多于一组可用于扩增目标核酸序列的完整cDNA或cDNA的一部分的引物。设计引物的方法是本领域已知的。从生物样品中提取RNA的方法是本领域已知的。
可以将或可以不将表达水平针对对照核酸的水平进行标准化。这允许在不同场合进行的测定之间的比较。
ii.蛋白质表达
在另一个实施方案中，可测量GDF15蛋白表达以确定生物样品中GDF15蛋白的量。在具体实施方案中，可使用ELISA测量GDF15蛋白表达以确定生物样品中GDF15蛋白的量。
用于评估蛋白质表达量的方法是本领域公知的，并且本领域技术人员已知的用于评估蛋白质表达量的所有合适方法都涵盖在本发明的范围内。评估蛋白质表达量的合适方法的非限制性实例可包括基于表位结合剂的方法和基于质谱的方法。
在一些实施方案中，评估蛋白质表达量的方法是质谱法。通过利用质量和电荷的固有特性，质谱法(MS)可以分辨并可靠地鉴定各种复杂化合物，包括蛋白质。常规定量MS使用电喷雾电离(ESI)，然后是串联MS(MS/MS)(Chen等，2001；Zhong等，2001；Wu等，2000)，而更新的定量方法正在使用基质辅助激光解吸/电离(MALDI)，然后是飞行时间(TOF)MS来进行开发(Bucknall等，2002；Mirgorodskaya等，2000；Gobom等，2000)。根据本发明，可使用质谱法来寻找由本发明的靶核酸编码的蛋白质水平。
在一些实施方案中，评估蛋白质表达量的方法是基于表位结合剂的方法。如本文中所用，术语“表位结合剂”是指抗体、适体、核酸、寡核酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、脂质、代谢物、小分子，或其识别并能够结合靶基因蛋白的片段。核酸可包括RNA、DNA和天然存在的或合成产生的衍生物。
如本文中所用，术语“抗体”通常是指识别并可结合抗原表位的多肽或蛋白质。如本文中所用，抗体可以是本领域已知的完整抗体，即由两条重链和两条轻链组成，或者可以是具有抗原结合区的任何抗体样分子，包括但不限于抗体片段诸如Fab'、Fab、F(ab')2、单结构域抗体、Fv和单链Fv。术语抗体还指多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。用于制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术是本领域公知的。用于制备和表征抗体的方法也是本领域公知的(参见例如Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,1988；通过引用整体并入本文)。
如本文中所用，术语“适体”是指在生物化学活性、分子识别或结合属性方面具有有用生物活性的多核苷酸，通常为RNA或DNA。通常，适体具有分子活性诸如在特定表位(区域)与靶分子结合。通常认为，可通过体外进化方法合成和/或鉴定特异性结合多肽的适体。用于制备和表征适体的方法，包括通过体外进化方法，是本领域公知的(参见，例如US 7,939,313；通过引用整体并入本文)。
通常，评估蛋白质表达量的基于表位结合剂的方法包括在有效地允许在表位结合剂与多肽之间形成复合物的条件下使包含多肽的样品与对多肽特异的表位结合剂接触。基于表位结合剂的方法可以在溶液中进行，或者可将表位结合剂或样品固定在固体表面上。合适表面的非限制性实例包括微量滴定板、试管、珠粒、树脂和其他聚合物。
如本领域技术人员所理解的，可将表位结合剂多种方式附接于基底。可以首先合成表位结合剂，随后将其附接于基底，或者可在基底上直接合成表位结合剂。可用化学官能团对底物和表位结合剂进行衍生化，以便随后进行两者的附接。例如，可用化学官能团对基底进行衍生化，所述化学官能团包括但不限于氨基、羧基、氧代基或硫醇基。通过使用这些官能团，可使用官能团直接附接表位结合剂或使用接头间接附接表位结合剂。
还可将表位结合剂非共价地附接于基底。例如，可制备生物素化的表位结合剂，其可以与链霉抗生物素蛋白共价包被的表面结合，导致附接。或者，可使用技术诸如光聚合和光刻在表面上合成表位结合剂。将表位结合剂附接于固体表面的其他方法和在基底上合成生物分子的方法是本领域公知的，即来自Affymetrix的VLSIPS技术(例如，参见美国专利第6,566,495号，以及Rockett和Dix,Xenobiotica 30(2):155-177，两者均由此通过引用整体并入)。
在有效条件下使样品与表位结合剂接触足以允许形成复合物的一段时间通常包括：将表位结合剂组合物添加到样品中并将混合物孵育一段足够长的时间，以便表位结合剂与任何存在的抗原结合。此后，将洗涤复合物，并可通过本领域公知的任何方法检测复合物。检测表位结合剂-多肽复合物的方法通常基于标记物或标志物的检测。如本文中所用，术语“标记物”是指附接于表位结合剂或其他基底材料的任何物质，其中该物质可通过检测方法检测。合适的标记物的非限制性实例包括发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光猝灭剂、有色分子、放射性同位素、闪烁剂、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、抗体或其片段、多组氨酸、Ni2+、Flag标签、myc标签、重金属和酶(包括碱性磷酸酶、过氧化物酶和荧光素酶)。基于标记物或标志物的检测来检测表位结合剂-多肽复合物的方法是本领域公知的。
在一些实施方案中，基于表位结合剂的方法是免疫测定。免疫测定可以以多种不同的形式进行。一般而言，免疫测定可分为两类：竞争性免疫测定和非竞争性免疫测定。在竞争性免疫测定中，样品中未标记的分析物与标记的分析物竞争结合抗体。洗去未结合的分析物并测量结合的分析物。在非竞争性免疫测定中，标记抗体而不是分析物。非竞争性免疫测定可使用一种抗体(例如标记捕获抗体)或多于一种抗体(例如至少一种未被标记的捕获抗体和至少一种被标记的“加帽”或检测抗体)。上文中描述了合适的标记物。
在一个实施方案中，表位结合剂方法是免疫测定。在另一个实施方案中，表位结合剂方法选自由以下组成的组：酶联免疫测定(ELISA)、基于荧光的测定、解离增强的镧系元素荧光免疫测定(DELFIA)、放射测定(radiometric assay)、多重免疫测定和细胞计数珠测定(CBA)。在一些实施方案中，基于表位结合剂的方法是酶联免疫测定(ELISA)。在其他实施方案中，基于表位结合剂的方法是放射免疫测定法。在其他实施方案中，基于表位结合剂的方法是免疫印迹或蛋白质印迹。在替代实施方案中，基于表位结合剂的方法是阵列。在另一个实施方案中，基于表位结合剂的方法是流式细胞术。在不同的实施方案中，基于表位结合剂的方法是免疫组织化学(IHC)。IHC使用抗体来检测和定量完整组织样品中的抗原。组织样品可以是新鲜冷冻的和/或福尔马林固定的、石蜡包埋的(或塑料包埋的)组织块，其被制备用于通过IHC进行的研究。制备用于通过IHC进行的研究的组织块的方法以及进行IHC的方法是本领域公知的。
(c)将gdf15核酸或GDF15蛋白的量与参考值进行比较
可将生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量分别与gdf15核酸或GDF15蛋白的参考值进行比较。将生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的受试者表达水平分别与gdf15核酸或GDF15蛋白的参考值进行比较，以对受试者进行分类，确定受试者中青光眼的严重度，确定受试者的治疗，监测受试者中的青光眼，和/或监测对治疗的响应。一般而言，受试者可被分类为具有增加或减少的量(与参考值相比)的gdf15核酸或GDF15蛋白，其中gdf15核酸或GDF15蛋白的增加的量是高于参考值的量并且减少的量是等于或低于参考值的量。
更具体地，将gdf15核酸或GDF15蛋白的表达水平与gdf15核酸或GDF15蛋白的参考值进行比较，以确定测试样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白是否分别相对于gdf15核酸或GDF15蛋白的参考值差异表达。如本文中所用，术语“差异地表达”或“差异表达”是指可以通过测量核酸产物的表达水平来测定的核酸表达水平的差异，诸如信使RNA转录物或其部分的表达水平或核酸的表达的蛋白质的水平的差异。
术语“表达水平的差异”是指如与参考样品中gdf15核酸或GDF15蛋白的可测量的表达水平相比的gdf15核酸或GDF15蛋白的可测量的表达水平(例如如通过生物样品中信使RNA转录物的量和/或蛋白质的量来测量的)的升高或降低。在一个实施方案中，可使用gdf15核酸或GDF15蛋白的表达水平相比于参照样品的gdf15核酸或GDF15蛋白的表达水平的比率来比较差异表达，其中该比率不等于1.0。例如，如果第一样品的表达水平相比于第二样品的比率大于或小于1.0，则核酸或蛋白质被差异表达。例如大于1、1.2、1.5、1.7、2、3、3、5、10、15、20或更多的比率，或小于1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05、0.001或更少的比率。在另一个实施方案中，使用p值测量差异表达。例如，当使用p值时，当p值小于0.1，优选小于0.05，更优选小于0.01，甚至更优选小于0.005，最优选小于0.001时，核酸或蛋白质被鉴定为在第一样品与第二样品之间差异表达。取决于用于参考值的样品，表达水平的差异可以是或可以不是统计学显著的。例如，如果用于参考值的样品来自一个或多个被诊断患有青光眼的受试者，那么当表达水平的差异没有显著不同时，受试者患有青光眼。然而，当表达水平的差异显著不同时，受试者未患有青光眼。或者，如果用于参考值的样品来自一个或多个被诊断为无疾病的受试者，则当表达水平的差异无显著不同时，受试者未患有青光眼。然而，当表达水平的差异显著不同时，受试者患有青光眼。
可使用本领域已知的任何合适的参考值。例如，合适的参考值可以是从没有疾病(即青光眼)的体征或症状的相同物种的受试者或受试者组获得的生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量。在另一个实例中，合适的参考值可以是从未被诊断为患有疾病(即青光眼)的相同物种的受试者或受试者组获得的生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量。在另一个实例中，合适的参考值可以是从具有青光眼的体征或症状的相同物种的受试者或受试者组获得的生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量。在另一个实例中，合适的参考值可以是从已被诊断为患有青光眼的相同物种的受试者或受试者组获得的生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量。在不同的实例中，合适的参考值可以是如通过本领域已知的方法所测定的分析的背景信号。在另一个不同的实例中，合适的参考值可以是存储在计算机可读介质上的非患病样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量。在另一个不同的实例中，合适的参考值可以是存储在计算机可读介质上的患病样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量。计算机可读介质的常见形式包括，例如，软盘、软磁盘、硬盘、磁带或其他磁性介质、CD-ROM、CDRW、DVD或其他光学介质、穿孔卡、纸带、光学标记片或其他具有孔或其他光学可识别标记图案的物理介质、RAM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM或其他存储器芯片或盒、载波或计算机可从其读取的其他介质。
在其他实例中，合适的参考值可以是从相同受试者获得的参照样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量。参考样品可以已从当时未被怀疑患有青光眼的受试者获得或可以未从所述受试者获得。本领域技术人员将理解，当受试者另外地健康时，从受试者获得参考样品并不总是可能的或期望的。例如，在急性情况下，参考样品可以是获自当前的受试者的第一样品。在另一个实例中，当监测疗法的有效性时，参考样品可以是在疗法开始之前从受试者获得的样品。在此类实例中，受试者可具有疑似青光眼但可能没有青光眼的其他症状或受试者可能具有疑似青光眼和青光眼的一种或多种其他症状。
在具体实施方案中，参考值可以是未患病样品中的GDF15蛋白的量。例如，GDF15蛋白的合适参考值可以是约10pg/ml、约11pg/ml、约12pg/ml、约13pg/ml、约14pg/ml、约15pg/ml、约16pg/ml、约17pg/ml、约18pg/ml、约19pg/ml或约20pg/ml。具体地，实施例中呈现的数据显示没有青光眼的受试者的平均GDF15为8.9±SE 7.7pg/ml。根据本公开，高于参考值的GDF15蛋白的量指示Ⅰ级、Ⅱ级或Ⅲ级青光眼。例如，约20pg/ml至约80pg/ml的GDF15蛋白的量指示Ⅰ级青光眼；约80pg/ml至约160pg/ml的GDF15蛋白的量指示Ⅱ级青光眼；以及约160pg/ml或更高的GDF15蛋白的量指示Ⅲ级青光眼。应理解，这些值可由于额外的实验数据而改变。在示例性实施方案中，约46.4±12.1pg/ml的GDF15蛋白的量指示Ⅰ级青光眼；约129.5±38.0pg/ml的GDF15蛋白的量指示Ⅱ级青光眼；以及约190±48.7pg/ml或更高的GDF15蛋白质的量指示Ⅲ级青光眼。
相对于参考值的gdf15核酸或GDF15蛋白的增加的量指示青光眼的严重度增加。具体地，当GDF15蛋白的量大于约10pg/ml且小于约80pg/ml时，受试者可患有Ⅰ级青光眼。在某些实施方案中，当GDF15蛋白的量大于约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20pg/ml并且小于约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75、约76、约77、约78、约79或约80pg/ml时，受试者可患有Ⅰ级青光眼。在一个实施方案中，当GDF15蛋白的量大于约10pg/ml且小于约50pg/ml，大于约20pg/ml且小于约50pg/ml，大于约10pg/ml且小于约60pg/ml，大于约20pg/ml且小于约60pg/ml，大于约10pg/ml且小于约70pg/ml，大于约20pg/ml且小于约70pg/ml，大于约10pg/ml且小于约80pg/ml，或大于约20pg/ml且小于约80pg/ml时，受试者可患有Ⅰ级青光眼。在具体实施方案中，当GDF15蛋白的量大于约20pg/ml且小于约80pg/ml时，受试者可患有Ⅰ级青光眼。
或者，当GDF15蛋白的量在约50pg/ml与约180pg/ml之间时，受试者可患有Ⅱ级青光眼。在某些实施方案中，当GDF15蛋白的量在约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75、约76、约77、约78、约79、约80、约81、约82、约83、约84、约85、约87、约88、约89或约90pg/ml与约150、约151、约152、约153、约154、约155、约156、约157、约158、约159、约160、约161、约162、约163、约164、约165、约166、约167、约168、约169、约170、约171、约172、约173、约174、约175、约176、约177、约178、约179或约180pg/ml之间时，受试者可患有Ⅱ级青光眼。在一个实施方案中，当GDF15蛋白的量大于约50pg/ml且小于约170pg/ml、大于约50pg/ml且小于约160pg/ml、大于约50pg/ml且小于约150pg/ml、大于约60pg/ml且小于约180pg/ml、大于约60pg/ml且小于约170pg/ml、大于约60pg/ml且小于约160pg/ml、大于约60pg/ml且小于约150pg/ml、大于约70pg/ml且小于约180pg/ml、大于约70pg/ml且小于约170pg/ml、大于约70pg/ml且小于约160pg/ml、大于约70pg/ml且小于约150pg/ml、大于约80pg/ml且小于约180pg/ml、大于约80pg/ml且小于约170pg/ml、大于约80pg/ml且小于约160pg/ml、大于约80pg/ml且小于约150pg/ml、大于约90pg/ml且小于约180pg/ml、大于约90pg/ml且小于约170pg/ml、大于约90pg/ml且小于约160pg/ml或大于约90pg/ml且小于约150pg/ml时，受试者可患有Ⅱ级青光眼。在具体实施方案中，当GDF15蛋白的量大于约80pg/ml且小于约160pg/ml时，受试者可患有Ⅱ级青光眼。
此外，当GDF15蛋白的量大于160pg/ml时，受试者可患有Ⅲ级青光眼。在某些实施方案中，当GDF15蛋白的量大于约140、约145、约150、约155、约160、约165、约170、约175、约180、约185、约190、约195、约200、约205、约210、约215、约220、约225、约230、约235或约240pg/ml时，受试者可患有Ⅲ级青光眼。在具体实施方案中，当GDF15蛋白的量大于约140pg/ml时，受试者可患有Ⅲ级青光眼。
(d)治疗
青光眼严重度的确定可用于选择对于青光眼受试者的治疗。如本文所解释的，gdf15核酸和GDF15蛋白可将受试者分类为患有Ⅰ级、Ⅱ级或Ⅱ级青光眼，并且分入可以受益于疗法或确定受试者的适当青光眼治疗的组。在一个实施方案中，可治疗分类为患有Ⅰ级、Ⅱ级或Ⅲ级青光眼的受试者。技术人员将能够确定Ⅰ级、Ⅱ级或Ⅲ级青光眼的标准治疗。因此，本文公开的方法可用于选择对于青光眼受试者的治疗。在一个实施方案中，基于gdf15核酸和GDF15蛋白的量相对于参考值的差异来治疗受试者。该分类可用于鉴定需要治疗或不需要治疗或需要更积极治疗的组。如本文中所用，术语“治疗”或“疗法”是指适用于治疗青光眼的任何治疗。治疗可由青光眼的标准治疗组成。青光眼的标准治疗的非限制性实例包括滴眼剂、丸剂、激光手术、切开性手术或这些方法的组合。通常，滴眼剂用于治疗低度青光眼。如果滴眼剂不能充分控制IOP，除了滴眼剂以外还可使用丸剂。当药物无法实现预期结果或产生无法忍受的副作用时，手术可以是下一个选择。手术可以是激光手术或切开性手术。激光手术被视为药物与切开性手术之间的中间步骤。激光手术的非限制性实例包括氩激光小梁成形术(ALT)、选择性激光小梁成形术(SLT)、激光周边虹膜切开术(LPI)和环切术。切开性手术的非限制性实例包括小梁切除术、引流物植入手术、非穿透手术、ExPress微型青光眼分流术、小梁消融术和管道成形术。基于根据生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量分类至Ⅰ级、Ⅱ级或Ⅲ级，可用滴眼剂、丸剂、激光手术和/或切开性手术治疗受试者。另外，可以基于从一级至下一级的进展的证据来做出治疗决策。
实施例
包括以下实施例来说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术，因此可被认为是构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对所公开的具体实施方案进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。
实施例1.
目前没有检测青光眼严重度或进展的可用生物标志物。虽然Tgfb2可引起青光眼，但其不是青光眼的生物标志物。目前，青光眼的治疗是基于眼内压(IOP)和视野检查来决定的。然而，IOP在患者与患者之间变化很大，并且视野检查是主观测试。因此，需要有助于青光眼的治疗决策的生物标志物。
为了鉴定青光眼的生物标志物，本发明人试图鉴定反映视网膜神经节细胞(RGC)死亡的生物标志物。检查眼泪、房水、玻璃体和血清(血浆)。使用不同的视网膜细胞死亡模型进行评估88个基因的细胞因子阵列(表1)。从细胞因子阵列获得的数据分析显示，8个基因在视神经挤压模型(ONC)中上调，0个基因下调，15个基因在内毒素诱导的葡萄膜炎模型(EIU)中上调，1个基因下调并且22个基因在光暴露诱导的视网膜变性模型(LE)中上调并且8个基因下调。图1显示了在不同疾病模型之间重叠的上调的基因。一个基因在ONC中但不在EIU或LE中特异性上调。表2呈现了这些基因的列表，显示gdf15仅在ONC中上调。图2显示了在不同疾病模型之间重叠的下调基因，表3呈现了这些基因的列表。
/>
/>
鉴于gdf15对于ONC是独特的，因此在每种疾病模型中进一步评估gdf15的表达谱。图3显示了ONC(图3A)、EIU(图3B)和LE(图3C)中gdf15的基因表达水平。Gdg15基因表达仅在ONC模型中上调。相比之下，tgfb2在所有模型中等于对照(图4A、图4B、图4C)。这些结果证实gdf15基因表达对ONC具有特异性。
Gdf是tgfb超家族的一部分。为了确定其他gdf家族成员是否在ONC中改变，在ONC模型中在24小时时评估了gdf1、gdf2、gdf3、gdf5、gdf6、gdf7、gdf8、gdf9、gdf10和gdf11基因表达。图5A、图5B、图5C、图5D、图5E、图5F、图5G、图5H、图5I和图5J显示其他gdf基因在ONC模型中均未改变。
鉴于gdf15基因表达在ONC中上调，确定在ONC小鼠模型中在房水中是否可检测到升高的GDF15蛋白水平。使用ELISA测定检测GDF15蛋白，发现GDF15蛋白在ONC小鼠模型中升高(图6)。然后在ONC的大鼠模型中评估GDF15蛋白和gdf15核酸表达。gdf15和tgfb2核酸表达的评估显示gdf15在ONC中显著上调，并且tgfb2在ONC中未改变(图7A，图7B)。另外，通过对房水进行的ELISA测定评估GDF15蛋白表达显示GDF15蛋白在ONC的大鼠模型中也上调(图7C)。
然后在眼内的各个区域评估Gdf15核酸表达。具体地，评估了gdf15在前段、晶状体和视网膜中的表达。结果显示，在6小时时，在任何眼组织中都没有显著上调(图8A、图8B、图8C)。然而，在24小时时，gdf15表达在视网膜中显著上调(图8F)，但在前段或晶状体中未显著上调(分别为图8D、图8E)。这些数据表明gdf15表达对视网膜是特异性的。此外，使用原位杂交(ISH)，容易地观察到GDF15，相对于在ONC模型中的外核层(ONL)和内核层(INL)中，在神经节细胞层(GCL)中特异性上调(图12)。
接下来确定GDF15表达是否可以与疾病模型中巨噬细胞的增加相关联。将F4/80抗原用于检测巨噬细胞。图9A显示对照组中的巨噬细胞相对于ONC模型中的巨噬细胞没有显著差异。相反，EIU和LE模型均显示相对于对照的巨噬细胞的显著增加(分别为图9B、图9C)。
挤压神经模型是对视网膜神经节细胞的急性损伤的模型。虽然该模型用于研究青光眼，但不能知道该模型概括了青光眼中发生的情况，因为青光眼是一种慢性疾病，因此导致视网膜神经节细胞的慢性损伤。因此，由于不能知道ONC中GDF15的上调转化为人青光眼中的上调，因此评估人样品的GDF15蛋白表达。从青光眼患者收集房水，通过ELISA测量GDF15的量。图10显示相对于对照患者，青光眼患者中GDF15表达显著增加。因此，这些结果能够显示GDF15在人青光眼中上调。重要的是，我们显示GDF15表达与疾病严重度相关(图11)。随着青光眼的严重度从Ⅰ级进展至Ⅱ级至Ⅲ级，检测到的GDF15的量增加。因此，这些结果表明GDF15将是青光眼进展的灵敏且特异的标志物，并将指导治疗决策。

Claims (12)

1.用于测量gdf15核酸或GDF15蛋白的量的试剂在制备用于在确定被诊断为患有青光眼的受试者的青光眼严重度的方法中使用的组合物中的用途，所述方法包括：
a)测量从所述受试者获得的生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的所述量；
b)将所述生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的所述量与参考值进行比较；以及
c)基于相对于所述参考值的gdf15核酸或GDF15蛋白的所述量确定青光眼的严重度。
2.根据权利要求1所述的用途，其中基于相对于所述参考值的gdf15核酸或GDF15蛋白的所述量，确定所述受试者患有Ⅰ级、Ⅱ级或Ⅲ级青光眼。
3.根据权利要求2所述的用途，其中20pg/ml至80pg/ml的GDF15蛋白的量指示所述受试者患有Ⅰ级青光眼；80pg/ml至160pg/ml的GDF15蛋白的量指示所述受试者患有Ⅱ级青光眼；以及160pg/ml或更高的GDF15蛋白的量指示所述受试者患有Ⅲ级青光眼。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的用途，其中基于青光眼的所述等级用所述组合物治疗所述受试者。
5.用于测量gdf15核酸或GDF15蛋白的量的试剂在制备用于在监测受试者的青光眼进展的方法中使用的组合物中的用途，所述方法包括：
a)测量从所述受试者获得的第一生物样品中gdf15核酸或GDF15蛋白的量；
b)测量在稍后的时间从所述受试者获得的第二生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的量；
c)将所述第一生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的所述量与所述第一生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的所述量进行比较；以及
d)如果所述第二生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的所述量相对于所述第一生物样品中的gdf15核酸或GDF15蛋白的所述量增加，则确定青光眼进展。
6.根据权利要求5所述的用途，其中检测GDF15蛋白。
7.根据权利要求6所述的用途，其中高于参考值的GDF15蛋白的所述量指示Ⅰ级、Ⅱ级或Ⅲ级青光眼。
8.根据权利要求7所述的用途，其中20pg/ml至80pg/ml的GDF15蛋白的量指示所述受试者患有Ⅰ级青光眼；80pg/ml至160pg/ml的GDF15蛋白的量指示所述受试者患有Ⅱ级青光眼；以及160pg/ml或更高的GDF15蛋白的量指示所述受试者患有Ⅲ级青光眼。
9.根据权利要求8所述的用途，其中46.4±12.1pg/ml的GDF15蛋白的量指示Ⅰ级青光眼；129.5±38.0pg/ml的GDF15蛋白的量指示Ⅱ级青光眼；以及
190±48.7pg/ml或更高的GDF15蛋白的量指示Ⅲ级青光眼。
10.根据权利要求8所述的用途，其中通过使所述样品与GDF15特异性抗体接触并且定量与所述抗体结合的GDF15的量来检测GDF15蛋白的所述量。
11.根据权利要求10所述的用途，其中通过选自由以下组成的组的方法检测GDF15蛋白的所述量：免疫测定、酶联免疫测定、基于荧光的测定、解离增强的镧系元素荧光免疫测定、放射测定、多重免疫测定和细胞计数珠测定。
12.根据权利要求11所述的用途，其中通过酶联免疫测定检测GDF15蛋白的所述量。
CN202310039351.2A 2016-01-29 2017-01-30 青光眼中的gdf15及其使用方法 Pending CN116732159A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662289030P 2016-01-29 2016-01-29
US62/289030 2016-01-29
CN201780021280.6A CN109476717B (zh) 2016-01-29 2017-01-30 青光眼中的gdf15及其使用方法
PCT/US2017/015643 WO2017132673A1 (en) 2016-01-29 2017-01-30 Gdf15 in glaucoma and methods of use thereof

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780021280.6A Division CN109476717B (zh) 2016-01-29 2017-01-30 青光眼中的gdf15及其使用方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116732159A true CN116732159A (zh) 2023-09-12

Family

ID=59399001

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780021280.6A Active CN109476717B (zh) 2016-01-29 2017-01-30 青光眼中的gdf15及其使用方法
CN202310039351.2A Pending CN116732159A (zh) 2016-01-29 2017-01-30 青光眼中的gdf15及其使用方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780021280.6A Active CN109476717B (zh) 2016-01-29 2017-01-30 青光眼中的gdf15及其使用方法

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11137408B2 (zh)
EP (2) EP4006049A1 (zh)
JP (2) JP6968430B2 (zh)
CN (2) CN109476717B (zh)
CA (1) CA3017915A1 (zh)
ES (1) ES2924495T3 (zh)
PT (1) PT3408287T (zh)
WO (1) WO2017132673A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109476717B (zh) 2016-01-29 2023-02-17 勒让德·S·阿普特 青光眼中的gdf15及其使用方法
KR102010652B1 (ko) * 2017-08-21 2019-08-13 서울대학교병원 간질환 예측 또는 진단용 조성물 및 이를 이용한 간질환 예측 또는 진단 방법

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
CN101208437B (zh) 2003-12-12 2012-07-04 圣路易斯大学 检测大分子和其它分析物的生物传感器
US8815946B2 (en) * 2008-01-25 2014-08-26 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Inhibition of proliferation and fibrotic response of activated corneal stromal cells
EP2103943A1 (en) * 2008-03-20 2009-09-23 F. Hoffman-la Roche AG GDF-15 for assessing a cardiovascular risk with respect to the administration of antiinflammatory drugs
WO2013012648A1 (en) * 2011-07-15 2013-01-24 Emory University Gdf15 in diagnostic and therapeutic applications
EP2807266B1 (en) * 2012-01-26 2020-01-15 Amgen Inc. Growth differentiation factor 15 (gdf-15) polypeptides
CN104721136A (zh) * 2013-02-21 2015-06-24 四川大学 一种布佐林胺眼用纳米混悬剂及其制备方法
EP2770326B1 (en) * 2013-02-26 2019-09-11 Instituto Oftalmologico Fernandez - Vega, S.L. Method for the diagnosis of glaucoma based on the determination of serum protein levels
US20150315645A1 (en) * 2014-05-03 2015-11-05 The Regents Of The University Of California Methods of identifying biomarkers associated with or causative of the progression of disease
US20170137506A1 (en) * 2014-06-20 2017-05-18 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Treatment of chronic kidney disease and other renal dysfunction using a gdf15 modulator
TWI750129B (zh) * 2015-08-03 2021-12-21 瑞士商諾華公司 作為血液學毒性生物標記之ｇｄｆ-１５
CN109476717B (zh) 2016-01-29 2023-02-17 勒让德·S·阿普特 青光眼中的gdf15及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20190011458A1 (en) 2019-01-10
WO2017132673A1 (en) 2017-08-03
ES2924495T3 (es) 2022-10-07
EP3408287B1 (en) 2022-04-13
EP3408287A4 (en) 2019-10-02
US11933791B2 (en) 2024-03-19
US11137408B2 (en) 2021-10-05
JP7318978B2 (ja) 2023-08-01
EP3408287A1 (en) 2018-12-05
JP2019508064A (ja) 2019-03-28
EP4006049A1 (en) 2022-06-01
US20210389332A1 (en) 2021-12-16
CN109476717B (zh) 2023-02-17
CA3017915A1 (en) 2017-08-03
JP6968430B2 (ja) 2021-11-17
CN109476717A (zh) 2019-03-15
JP2022028664A (ja) 2022-02-16
PT3408287T (pt) 2022-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7075894B2 (ja) 虚血を有する患者の診断およびリスク層別化のための方法およびキット
US9238837B2 (en) Biomarkers for determination of temporal phase of acute kidney injury
JP7318978B2 (ja) 緑内障におけるｇｄｆ１５及びその使用方法
JP2011507509A (ja) Ｉｂｄとｉｂｓとの区別、ｉｂｄの疾患タイプ間の更なる識別における使用する方法およびキット
KR101945348B1 (ko) 혈액 내 chi3l1 발현 수준을 이용한 정상압 수두증 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법
US20140179552A1 (en) Methods and compositions for diagnosing osteoarthritis in a feline
JP2012050369A (ja) ＩｇＧ４関連疾患診断用マーカー及びその利用
WO2017159771A1 (ja) 肝細胞増殖因子（ｈｇｆ）のｐｄマーカー
US8263355B2 (en) Method and kit for detection of autoimmune chronic urticaria
US20230083393A1 (en) Multiple biomarkers for diagnosing lung cancer and use thereof
US20130095490A1 (en) Composition for diagnosis of lung cancer and diagnosis kit of lung cancer
KR102638210B1 (ko) 갑상선 안병증의 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도
KR102326119B1 (ko) 암의 면역 치료 후 예후 예측용 바이오 마커
KR102136747B1 (ko) 장형 위암의 예후 진단 마커
WO2024049764A1 (en) Biomarkers for detecting and/or determining a treatment regimen for alzheimer&#39;s disease
KR20210079197A (ko) 콧물 시료를 이용한 경도 인지 장애의 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 경도 인지 장애의 진단 방법
CN115058512A (zh) 铁死亡相关基因在鉴定缺血性脑卒中的应用
JPWO2020004528A1 (ja) グリオーマ検出用バイオマーカー
KR20210121802A (ko) Mrgprx2를 이용한 즉시형 과민 반응 환자를 판별하는 방법
Naranjo et al. Methods for the prognosus and suagnosis of neurodegenerative diseases
US20120301879A1 (en) Novel use of ca-125
EP2784163A1 (en) Methods for the prognosis and diagnosis of neurodegenerative diseases

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination