KR20210079197A - 콧물 시료를 이용한 경도 인지 장애의 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 경도 인지 장애의 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비침습적 체외진단을 위한 경도 인지 장애 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 구체적으로 비침습적 생물학적 시료인 분리된 콧물 시료를 이용한 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 경도 인지 장애 진단용 바이오마커 조성물, 이를 포함하는 경도 인지 장애 진단용 키트, 및 경도 인지 장애 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바이오마커 조성물 및 키트는 소량의 콧물만으로도 경도 인지 장애를 진단할 수 있어 간편성, 및 경제성 측면에서 매우 우수하고, 알츠하이머 질병을 가진 환자 군과 경도 인지 장애 환자를 식별할 수 있어 경도인지장애의 치료 계획을 세우는 데에 효과적으로 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 바이오마커 조성물 및 키트는 소량의 콧물만으로도 경도 인지 장애를 진단할 수 있어 간편성, 및 경제성 측면에서 매우 우수하고, 알츠하이머 질병을 가진 환자 군과 경도 인지 장애 환자를 식별할 수 있어 경도인지장애의 치료 계획을 세우는 데에 효과적으로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 비침습적 체외진단을 위한 경도 인지 장애 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 구체적으로 비침습적 생물학적 시료인 분리된 콧물 시료를 이용한 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 경도 인지 장애 진단용 바이오마커 조성물, 이를 포함하는 경도 인지 장애 진단용 키트, 및 경도 인지 장애 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바이오마커 조성물 및 키트는 소량의 콧물만으로도 경도 인지 장애를 진단할 수 있어 간편성, 및 경제성 측면에서 매우 우수하고, 알츠하이머 질병을 가진 환자 군과 경도 인지 장애 환자를 식별할 수 있어 경도인지장애의 치료 계획을 세우는 데에 효과적으로 이용될 수 있다.
세계적으로 평균수명이 늘어나고 노인 인구가 증가하는 고령화 사회로의 변화에서, 알츠하이머병으로 대표되는 노인성 치매, 뇌졸중 또는 파킨슨병과 같은 뇌신경 질환의 발병률이 크게 증가하고 있다. 보건사회연구원 조사 통계에 따르면 우리나라의 노인 인구는 2000년에 7%를 넘어 고령사회에 진입한 이래 2003년 397만 명으로 노인 인구의 비율이 8.3%에 이르렀고 2019년에는 14.4%에 이르러 완전고령사회에 진입할 것으로 예견되고 있다. 퇴행성 뇌질환(degenerative brain disease)은 나이가 들어감에 따라 뇌에서 발생하는 질환을 뜻한다. 현재까지 잘 알려지지 않은 원인으로 뇌에서 특정 뇌세포군이 서서히 그 기능을 잃고 뇌신경계의 정보전달에 가장 중요한 뇌신경세포의 사멸, 뇌신경세포와 뇌신경세포 사이의 정보를 전달하는 시냅스의 형성이나 기능상의 문제 또는 뇌신경의 전기적 활동성의 이상적 증가나 감소로 인하여 야기되는 것으로 알려져 있다. 퇴행성 뇌질환은 나타나는 주요 증상과 침범되는 뇌 부위를 고려하여 구분할 수 있으며, 알츠하이머병과 경도 인지 장애는 다른 뇌질환과 비교하여 질환 특이적 단백질 발현, 특이적 세포군의 사멸과 이를 통한 특이적 증상이 확인된다.
경도 인지 장애(Mild cognitive impairment)는 정상과 치매를 연결하는 인지기능 연장선에서 중간 단계에 해당하며, 기본 개념은 '인지기능 감퇴가 예상보다 심하지만 치매라고 할 정도는 아닌 상태'이다. 85세 이상의 성인이라면 삼분의 일의 확률로 경도인지장애의 위험이 있으며, 빠른 진단이 인지 장애가 치매로 향하는 것을 가장 효과적으로 막는 방법이다.
경도 인지 장애와 알츠하이머병의 spherical harmonics(SPHARM)을 이용한 연구결과에서 해마 세포의 형상 차이가 확연한 점, 경도 인지 장애를 진단받은 사람들이 반드시 알츠하이머 병으로 이어지는 것이 아니고, 10-15% 정도만이 알츠하이머로 진행되며, 20%는 1-2년 후 인지 기능을 회복하고, 40-70%의 환자는 10년 후에도 치매로 진행되지 않았다는 점에서 양자는 구분된다.
알츠하이머 병은 지금까지 뚜렷한 치료법이 확인되지 않았고, 따라서 대부분의 학자들도 예방의 중요성에 주목하고 있다. 경도 인지 장애 환자들은 알츠하이머 고 위험군이지만, 동시에 정상 인지 기능을 회복할 수 있다는 점에서, 알츠하이머 병의 예방과 치료에 있어 중요한 시점으로 주목받고 있다. 따라서 기존의 경도 알츠하이머와 경도 인지 장애의 개념의 혼동을 막으려는 노력과 동시에 개념 정립이 이루어져 두 개의 다른 병으로 인정받고 있으며, 경도 인지 장애에서 미리 진단받아 더 적은 경제적 노력으로 적극적인 치료를 받을 수 있다는 사회적, 경제적 실익 또한 크다.
또한 경도 인지 장애는 단순히 알츠하이머병의 전 단계를 의미하지는 않으며, 반드시 기억적인 결함만을 의미하지도 않는다. 경도 인지 장애의 유형에는 크게 기억상실형 경도 인지 장애와, 비기억상실형 경도 인지 장애가 있다. 보다 자세하게는 세 유형으로 분류되는데, 기억적인 결함만을 가지는 유형(Amnestic Type), 기억적인 결함과 다른 인지 결함까지 포함하는 유형(Multiple domains, mild impairment Type), 비기억적 결함을 가지는 유형(Single non-memory domain type)이 그것이다. 연구결과에 따르면 기억상실형 경도 인지 장애 유형의 경우 알츠하이머 병으로 진행될 확률이 높고, 비기억상실형 경도인지장애의 경우 레비소체치매나 전두측두엽변성 같은 비알츠하이머 치매로 진행할 가능성이 높다.
모든 경도 인지 장애가 알츠하이머병으로 이어지는 것이 아닌데도 불구하고, 기존의 경도 인지 장애 진단법은 알츠하이머 진단의 연장선인 경우가 대부분이었고, 존재하는 방법들도 침습적이거나 많은 시간과 경비가 소요되는 것이 대부분이었다.
대표적으로, 노인 우울 척도(Short Form of Geriatric Depression Scale; GDS) 또는 간이 정신 상태 검사(mini-mental state examination; MMSE)나 특화된 MRI 촬영과 같은 방법들이 그것이다. 더불어 기존의 진단 방법 중 고해상도 뇌영상 촬영장치를 이용한 뇌영상 촬영 기법의 경우, 알츠하이머병 의심환자를 대상으로 뇌 촬영을 실시하는 방법이다. 조기에도 진단이 가능하다는 장점이 있으나 이러한 영상기반 진단 방법은 환자에게 고비용을 요구할 뿐만 아니라, 이미 뇌수축 또는 손상이 진행된 상태에서 판별이 이루어지므로 병의 탐지가 늦게 된다.
또 다른 기존의 대표적 진단 방법으로는 척수액을 진단하는 것으로서 뇌척수 내의 베타 아밀로이드 단백질 양의 변화를 측정하여 조기 알츠하이머를 진단하는 것이 있다. 하지만 뇌척수 검사방법 자체가 환자에게는 너무나 고통스러운 방법일 뿐만 아니라, 검사시 위험성이 동반된다는 한계가 있다.
이렇듯 최근 알츠하이머의 치료보다는 예방에 집중하면서 경도 알츠하이머로 진행할 가능성이 있는 경도 인지 장애에 대한 관심이 집중되고 있을 뿐 아니라, 일부 경도 인지 장애가 알츠하이머로 진행할 수 있지만 동시에 일부는 정상으로 회복된다는 점에서 경도 인지 장애에 대한 관심이 급증하고 있다. 결과적으로 이러한 경도 인지 장애를 특이적으로 진단하는 비침습적이고 간편하며 정확한 방법의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 발명자들은 비침습적 체외진단을 통해 진단 예민도도 우수한 경도 인지 장애 진단할 수 있는 바이오마커 및 진단 조성물을 개발하고자 노력하였다. 이에 본 발명자들은 경도 인지 장애 환자의 콧물 시료로부터 S100A9 단백질 발현이 증가하였음을 확인하였고, 알츠하이머 치매 환자의 경우 S100A9 단백질 발현이 감소하고 베타 아밀로이드 올리고머 단백질이 증가함을 확인함으로써, 단순한 콧물 감사만으로 경도 인지 장애 환자를 쉽게 선별 및 진단할 수 있다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 분리된 콧물 시료에서 S100A9 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 경도 인지 장애(Mild cognitive impairment) 진단용 바이오마커 조성물, 이를 포함하는 경도 인지 장애 진단 키트, 및 경도 인지 장애의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 비침습적 생물학적 시료인 분리된 콧물 시료로부터 경도 인지 장애 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는, 경도 인지 장애 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 분리된 콧물 시료에서 S100A9 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 시료 내 S100A9 단백질의 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군 시료와 비교하여 정상 대조군의 발현 수준보다 높은 경우에 경도 인지 장애 환자로 진단하는 단계를 포함하는 경도 인지 장애의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
일 양상에 따른 경도 인지 장애 진단용 조성물에 의하면, 비침습적인 방법인 채취된 콧물 시료만으로 조기 진단이 어려운 경도 인지 장애를 진단할 수 있다. 더불어 경도 인지 장애를 이미 진단받은 환자의 경우 경도 인지 장애에서 경도 알츠하이머 단계로 넘어가는 것을 추적할 수 있도록 하여 경도 인지 장애의 치료 계획을 세우는 데에 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 모든 알츠하이머 환자가 발현하는 단백질인 베타 아밀로이드 올리고머와 경도인지장애 특이 바이오마커 단백질 S100A9를 정상군, 경도인지장애 환자군, 및 알츠하이머 환자군으로부터 채취한 콧물 시료에서 각각 정량 분석한 결과로, 각 단백질의 발현 수준을 정량화하여 그래프로 나타낸 것이다 ( **P < 0.01, ***P < 0.001 ).
도 2는 콧물 시료에서 경도 인지 장애 진단 및 알츠하이머 진행 단계를 진단 할 수 있는 진단 키트의 도식을 나타낸 것이다.
도 2는 콧물 시료에서 경도 인지 장애 진단 및 알츠하이머 진행 단계를 진단 할 수 있는 진단 키트의 도식을 나타낸 것이다.
본 발명자들은 분리된 콧물 시료에서 S100A9 단백질이 비침습적 체외진단을 통해 경도 인지 장애 진단용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다는 것을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다. 상세하게, S100A9 단백질 농도 수준을 측정함으로써 경도인지 장애 환자를 진단하여 식별할 수 있으며, 베타아밀로이드 올리고머 단백질 농도를 함께 측정하여 비교하는 경우 알츠하이머 질병을 가진 환자 군과 경도 인지 장애 환자를 식별할 수 있는 바, 경도 인지 장애를 이미 진단받은 환자의 경우 경도 인지 장애에서 경도 알츠하이머 단계로 넘어가는 것을 추적할 수 있도록 하여 경도 인지 장애의 치료 계획을 세우는 데에 효과적으로 이용될 수 있다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 비침습적 생물학적 시료인 분리된 콧물 시료로부터 경도 인지 장애 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명의“경도 인지 장애(Mild cognitive impairment, MCI)”는 치매의 존재와 반드시 관련이 있는 것은 아닌, 경증 상태이지만 사고 능력의 측정 가능한 장애에 의해 특징화되는 증상이다. 경도 인지 장애는 반드시는 아니지만 빈번히 알츠하이머 질환으로 진행될 수 있다.
본 발명의 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.
또한, 본 발명은 비침습적 생물학적 시료인 콧물 시료로부터 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 경도 인지 장애 진단 진단용 키트를 제공한다.
상기 제제는 S100A9 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 또는 S100A9 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물일 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 베타아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligimer) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출할 수 있는 제제를 추가적으로 더 포함할 수 있다.
상기 제제는 베타아밀로이드 올리고머 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 또는 베타아밀로이드 올리고머 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물일 수 있다.
본 발명에서“프라이머”는 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산서열로서 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 말한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명에서“프로브”는 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 mRNA의 존재유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.
본 발명에서“항체”는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 S100A9 또는 베타아밀로이드 올리고머에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명에서 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로, 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
본 발명에서 "앱타머(aptamer)"는, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
본 발명에서“키트”는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명에서 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로서 RT-PCR 키트의 경우, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 간암의 진단용 유전자를 검출하기 위한 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
아울러, 상기 분리된 콧물 시료로 부터 베타 아밀로이드 올리고머와 S100A9 단백질의 발현 또는 활성 수준을 교차로 측정하는 경우, 경도 인지 장애를 더 정확하게 진단할 수 있다. 상세하게, 상기 키트는 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준과 베타아밀로이드 올리고머 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 각각 측정하고, 이들의 결과를 바탕으로 정상 대조군에 비해 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현 수준만 증가하는 경우 경도 인지 장애로 결정하고, 정상 대조군에 비해 베타아밀로이드 올리고머 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자;와 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 모두 발현 수준이 증가하는 경우 알츠하이머로 결정할 수 있다.
이에, 상기 키트는 정상 대조군에 비해 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준만 증가하는 경우 경도 인지 장애로 결정하고, 정상 대조군에 비해 베타아밀로이드 올리고머 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자;와 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 모두 발현 수준이 증가하는 경우 알츠하이머로 결정하는 것을 지시하는 설명서를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환 수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 분리된 콧물 시료에서 S100A9 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 시료 내 S100A9 단백질의 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군 시료와 비교하여 정상 대조군의 발현 수준보다 높은 경우에 경도 인지 장애 환자로 진단하는 단계를 포함하는 경도 인지 장애의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 측정된 S100A9 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상 대조군 시료와 비교하여 높은 경우 경도 인지 장애로 판단할 수 있다.
상기 분리된 콧물 시료에서 S100A9 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계는 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상세하게, 상기 발현 또는 활성 수준의 측정은 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 이용하여 수행될 수 있으나, 반드시 이에 한정하지 않는다.
또한, 상기 (a) 단계는 S100A9 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정과 함께 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 것을 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 (b) 단계는 정상 대조군에 비해 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준만 증가하는 경우 경도 인지 장애로 진단하고, 정상 대조군에 비해 베타아밀로이드 올리고머 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자;와 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 모두 발현 수준이 증가하는 경우 알츠하이머로 진단함으로써 경도 인지 장애와 알츠하이머 환자를 구별할 수 있다. 즉, 본 발명은 베타 아밀로이드 올리고머와 S100A9 단백질의 발현 또는 활성 수준을 교차로 측정하는 경우, 경도 인지 장애를 더 정확하게 진단할 수 있다.
따라서, 본 발명은 비침습적 생물학적 시료인 분리된 콧물 시료로부터 S100A9 단백질 농도 수준을 측정함으로써 경도인지 장애 환자를 진단하여 식별할 수 있다. 베타아밀로이드 올리고머 단백질 농도를 별도로 측정하여 S100A9 단백질 발현과 비교함으로써 알츠하이머 질병을 가진 환자 군과 경도 인지 장애 환자를 식별할 수 있어, 경도 인지 장애의 치료 계획을 세우는 데에 효과적으로 이용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 피험자 선정 및 체액 체취
정상 대조군은 신경심리검사(SNSB)상 정상 인지능력을 보유하고 있는, 기타 제외기준에 해당하지 않는 만 60세 이상의 사람을 선택하였고, 경도의 알츠하이머 치매 환자와 경도 인지 장애 환자는 NINCDS/ADRDA 진단 기준에 따른 환자를 선택하였다. 경도의 알츠하이머 환자는 기억력을 포함한 두 가지 이상의 인지영역에서의 저하가 있는 사람, 신경심리검사를 통해 다른 원인이 아닌, 인지기능저하로 일상생활에 지장이 있는 것으로 확인된 사람, 기타 제외기준에 해당하지 않는 사람을 선택하였다. 제외 기준은 뇌영상 (MRI나 CT) 검사를 통해 뇌의 구조적인 문제가 없는 것으로 확인된 사람, 다른 퇴행성 뇌질환이 없는 사람, 인지기능장애를 일으킬 수 있는 뇌혈관질환이 없는 사람, 갑상선 질환을 포함한 대사성 뇌질환이 없는 사람, 알코올이나 약물중독이 없는 사람 및 두부외상이나 정신과적 질환이 없는 사람이다.
외래 방문 시, 정상인과 환자를 대상으로 1회 내원 시 신경심리검사, 영상검사를 시행하였고, 검사결과를 확인한 후 선정된 피험자의 콧물을 채취하였다. 선정된 피험자는 총 2회 방문하였다. 또한, 피험자의 샘플을 채취하는 자 및 실험을 진행하는 자에게 정상인과 환자에 대한 정보가 노출되지 않도록 무작위배정과 눈 가림법으로 정보관리를 철저히 하면서 연구를 진행하였다.
피험자의 콧물은 다음과 같은 프로토콜로 채취하였다. 먼저, 식염수를 콧속에 스프레이한 후, 콧물 흡입기를 이용하여 콧물을 채취하고 이를 50ml 튜브에 저장하였다. 상기 방법으로 실패했을 시, 식염수를 눈에 흘려보낸 후, 흐르는 콧물을 채취 하여, 50ml 튜브에 저장하였다. 분석시까지 -20℃ 냉장고에 보관하였다.
실험 시, 시료 50 μl를 10초간 음파처리하고, 웨스턴 블롯 및 ELISA를 통하여 타겟하는 단백질을 검출하여 양적인 비교를 통해 진단하였다.
실시예 2. 경도 인지 장애의 진단
웨스턴 블롯을 통해 상기 실시예 1에서 채취한 환자의 콧물 시료에서 경도인지 장애의 진단을 위한 S100A9 단백질 발현 수준을 분석하였다.
웨스턴블롯을 수행하기 위하여 우선 동결 보관되어 있던 환자 샘플을 프로테아제 억제제가 포함된 세포 용해 버퍼에 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응시킨 혼합액을 원심분리기를 이용하여 30분 동안 13,000 rpm으로 분리한 다음 상층액만 추출하고, 조직으로부터 추출된 단백질을 12% SDS-PAGE를 이용하여 단백질들을 분리하였다. 분리된 단백질들을 nitrocellulose membrane(Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)에 옮기고, 이를 차단 버퍼[1% 스킴 밀크가 포함된 TBS-T(10mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl; pH 7.4)]로 상온에서 1시간 동안 차단시켰다. 차단이 끝난 후 TBS-T 버퍼로 10분 동안 3번 멤브레인을 세척한 다음 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체로는 polyclonal rabbit Anti- S100A9 (abcam ab63818)(1:1000)를 3% BSA가 함유된 TBS-T 버퍼에 혼합하여 4℃에서 6시간 반응시킨 후, 2차 항체는 HRP가 연결된 항-토끼 IgG(1:5000)를 상온에서 2시간 동안 반응하였다. 각 반응은 모두 TBS-T를 이용하여 15분간 3회 세척하여 비특이반응을 제거하였으며, ECL(Amersham)을 이용하여 확인하였다.
본 실시예에서는 정상 대조군(normal), 경도 인지 장애 환자군(MCI), 및 경도 알츠하이머 환자군(AD)의 콧물 시료에서 S100A9 및 베타 아밀로이드 올리고머를 각각 정량 분석 하였다. 구체적으로, S100A9에 대한 항체, 및 베타 아밀로이드 올리고머에 대한 항체를 사용하여 수행하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
그 결과, 베타 아밀로이드 올리고머는 알츠하이머 질환의 진행 단계에 따라 서로 다른 레인에서 특징적으로 나타나지만 모든 알츠하이머 환자군에서 발현되나, 정상 대조군과 경도 인지 장애 환자에게는 발현되지 않았다. S100A9 단백질의 경우, 일반인과 경도 알츠하이머 환자에게는 발현되지 않으나, 경도 인지 장애에서 높은 수준으로 발현되었다. 즉, S100A9 단백질은 경도 인지 장애 환자에서는 발현되나, 경도 알츠하이머 환자에서는 유의적인 수준의 발현 변화가 나타나지 않음을 알 수 있었고, 따라서, S100A9 단백질은 경도 인지 장애를 진단하는 바이오마커로 활용될 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 베타 아밀로이드 올리고머는 알츠하이머 질환의 진행 단계에 상관없이 모든 알츠하이머 환자에서 발현되므로, 알츠하이머를 진단하는 바이오마커로 활용될 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 베타 아밀로이드 올리고머와 S100A9 단백질의 발현 또는 활성 수준을 교차로 측정하는 경우, 경도 인지 장애를 더 정확하게 진단할 수 있다.
Claims (10)
- S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 비침습적 생물학적 시료인 분리된 콧물 시료를 이용한 경도 인지 장애 진단용 바이오마커 조성물.
- 비침습적 생물학적 시료인 콧물 시료로부터 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 경도 인지 장애 진단 진단용 키트.
- 제 2 항에 있어서,
상기 제제는 S100A9 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 또는 S100A9 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물 중 어느 하나인, 경도 인지 장애 진단용 키트.
- 제 2 항에 있어서,
상기 키트는 베타아밀로이드 올리고머(beta amyloid oligimer) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출할 수 있는 제제를 추가적으로 포함하는 것인, 경도 인지 장애 진단용 키트.
- 제 4 항에 있어서,
상기 제제는 베타아밀로이드 올리고머 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 또는 베타아밀로이드 올리고머 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물 중 어느 하나인, 경도 인지 장애 진단용 키트.
- 제 2 항에 있어서,
상기 키트는 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준과 베타아밀로이드 올리고머 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정 결과를 바탕으로,
정상 대조군에 비해 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준만 증가하는 경우 경도 인지 장애로 결정하고,
정상 대조군에 비해 베타아밀로이드 올리고머 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자;와 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 모두 발현 수준이 증가하는 경우 알츠하이머로 결정하는 것을 지시하는 설명서를 포함하는, 경도 인지 장애 진단용 키트.
- (a) 분리된 콧물 시료에서 S100A9 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 시료 내 S100A9 단백질의 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군 시료와 비교하여 정상 대조군의 발현 수준보다 높은 경우에 경도 인지 장애 환자로 진단하는 단계;
를 포함하는 경도 인지 장애의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
- 제 7 항에 있어서,
상기 (a) 단계는 S100A9 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정과 함께 베타 아밀로이드 올리고머의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 것을 더 포함하는 것인, 경도 인지 장애의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
- 제 7 항에 있어서,
상기 (b) 단계는 정상 대조군에 비해 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준만 증가하는 경우 경도 인지 장애로 진단하고,
정상 대조군에 비해 베타아밀로이드 올리고머 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자;와 S100A9 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 모두 발현 수준이 증가하는 경우 알츠하이머로 진단하는 것인, 경도 인지 장애의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
- 제 7 항에 있어서,
상기 발현 또는 활성 수준의 측정은 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), 또는 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 이용하여 수행되는 것인, 경도 인지 장애의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
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| Markus P. Kummer et al., ‘Mrp14 Deficiency Ameliorates Amyloid Burden by Increasing Microglial Phagocytosis and Modulation of Amyloid Precursor Protein Processing’, The Journal of Neuroscience, 2012,* * |
Also Published As
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