ES2924495T3 - GDF15 en glaucoma y métodos de uso de este - Google Patents
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Abstract
La presente descripción proporcionó métodos para determinar la gravedad del glaucoma usando los niveles de expresión de GDF15. Determinar la gravedad del glaucoma ayuda en las decisiones de tratamiento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
GDF15 en glaucoma y métodos de uso de este
Derechos gubernamentales
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo el documento EY019287 otorgado por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene determinados derechos en la invención.
Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 62/289,030, presentada el 29 de enero de 2016.
Campo de la invención
La presente descripción proporcionó métodos para determinar la gravedad del glaucoma mediante el uso de los niveles de expresión de GDF15. Determinar la gravedad del glaucoma ayuda en las decisiones de tratamiento. Antecedentes de la invención
El glaucoma es un grupo de enfermedades que dañan el nervio óptico del ojo y pueden provocar pérdida de la visión y ceguera. Sin embargo, con la detección y el tratamiento tempranos, los ojos pueden protegerse contra la pérdida de la visión grave. Actualmente no hay biomarcadores disponibles que detecten la gravedad o progresión del glaucoma. El Tgfb2 puede causar glaucoma, pero no es un biomarcador para glaucoma. Actualmente, el tratamiento para glaucoma se decide en base a la presión intraocular (IOP) y la perimetría. Sin embargo, la IOP tiene una gran variación de un paciente a otro y la perimetría es una prueba subjetiva. Por lo tanto, se necesita un biomarcador que ayude en las decisiones de tratamiento para el glaucoma.
Resumen de la invención
En un aspecto, la descripción proporciona un método para determinar la gravedad del glaucoma en un sujeto diagnosticado con glaucoma. El método comprende: (a) medir la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en una muestra biológica obtenida del sujeto; (b) comparar la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en la muestra biológica con un valor de referencia y (c) determinar la gravedad del glaucoma en base a la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 con relación al valor de referencia.
En otro aspecto, la descripción proporciona un método para determinar el tratamiento en un sujeto diagnosticado con glaucoma. El método comprende: (a) medir la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en una muestra biológica obtenida del sujeto; (b) comparar la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en la muestra biológica con un valor de referencia, en donde la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 por encima del valor de referencia indica la gravedad del glaucoma y (c) determinar el tratamiento del sujeto en base a la gravedad del glaucoma detectado.
En otro aspecto más, la descripción proporciona un método para monitorear la progresión del glaucoma en un sujeto. El método comprende: (a) medir la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en una primera muestra biológica obtenida del sujeto; (b) medir la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en una segunda muestra biológica obtenida del sujeto en un momento posterior; (c) comparar la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en la primera muestra biológica con la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en la primera muestra biológica y (d) determinar la progresión del glaucoma si la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en la segunda muestra biológica aumenta con relación a la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en la primera muestra biológica.
En otro aspecto aún más, la descripción proporciona un método para monitorear la respuesta al tratamiento del glaucoma en un sujeto. El método comprende: (a) medir la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en una primera muestra biológica obtenida del (b) medir la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en una segunda muestra biológica obtenida del sujeto en un momento posterior después del tratamiento; (c) comparar la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en la primera muestra biológica con la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en la primera muestra biológica; y (d) determinar la respuesta al tratamiento si la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en la segunda muestra biológica disminuye con relación a la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en la primera muestra biológica.
Breve descripción de las figuras
El archivo de la solicitud contiene al menos un dibujo hecho a color. Las copias de esta publicación de la solicitud de patente con el(los) dibujo(s) a color se proporcionarán por la Oficina bajo petición y pago de la tarifa necesaria.
La Figura 1 representa un diagrama de Venn que muestra los genes regulados positivamente que se superponen entre el modelo de aplastamiento del nervio óptico (ONC), el modelo de uveítis inducida por endotoxinas (EIU) y el modelo de degeneración retiniana inducida por exposición a la luz (LE).
La Figura 2 representa un diagrama de Venn que muestra los genes regulados negativamente que se superponen entre ONC, EIU y LE.
La Figura 3A, la Figura 3B y la Figura 3C representan gráficos que muestran los niveles de expresión génica de gdf15 en ONC (Figura 3A), EIU (Figura 3B) y LE (Figura 3C). La expresión génica de Gdg15 solo está regulada positivamente en el modelo ONC.
La Figura 4A, la Figura 4B y la Figura 43C representan gráficos que muestran los niveles de expresión génica de tgfb2 en ONC (Figura 4A), EIU (Figura 4B) y LE (Figura 4C). El Tgfb2 es equivalente al control en todos los modelos.
La Figura 5A, la Figura 5B, la Figura 5C, la Figura 5D, la Figura 5E, la Figura 5F, la Figura 5G, la Figura 5H, la Figura 5I y la Figura 5J representan gráficos que muestran que ninguno de los otros genes de gfd están alterados en el modelo ONC. (Figura 5A) gdfl; (Figura 5B) gdf2; (Figura 5C) gdf3; (Figura 5D) gdf5; (Figura 5E) gdf6; (Figura 5F) gdf7; (Figura 5G) gdf8; (Figura 5H) gdf9; (Figura 5I) gdf10; y (Figura 5J) gdf11.
La Figura 6 representa un gráfico que muestra que la proteína GDF15 estaba elevada en el modelo de ratón de ONC.
La Figura 7A y la Figura 7B muestran gráficos que muestran que gdf15 estaba regulado positivamente de manera significativa en ONC (Figura 7A) y tgfb2 se mantuvo sin cambios en ONC (Figura 7B). La Figura 7C representa un gráfico que muestra que la expresión de la proteína GDF15, detectada a través de un ensayo ELISA realizado en el humor acuoso, también está regulada positivamente en el modelo de rata de ONC.
La Figura 8A, la Figura 8B y la Figura 8C representan gráficos que muestran la expresión a las 6 horas de gdf15 en el segmento anterior, cristalino y retina, respectivamente. Los resultados mostraron que no hubo una regulación positiva significativa en ningún tejido ocular. La Figura 8D, la Figura 8E y la Figura 8F representan gráficos que muestran que la expresión de gdf15 estaba regulada positivamente de manera significativa en la retina (Figura 8F), pero no en el segmento anterior ni en el cristalino (Figura 8D, Figura 8E,respectivamente). La Figura 9Arepresenta un gráfico que muestra que no hay una diferencia significativa en los macrófagos en el control frente al modelo ONC. La Figura 9B y la Figura 9C representan gráficos que muestran que los modelos EIU y LE, respectivamente, muestran un aumento significativo en los macrófagos con relación al control.
La Figura 10 representa un gráfico que muestra que hay un aumento significativo en la expresión de GDF15 en los pacientes con glaucoma con relación a los pacientes de control.
La Figura 11 representa un gráfico que muestra que la expresión de GDF15 se correlaciona con la gravedad de la enfermedad. A medida que la gravedad del glaucoma progresa del grado I al grado II al grado III, aumenta la cantidad de GDF15 detectada. Comparación múltiple de Turkey *p<0,05 **p<0,01.
La Figura 12 representa una imagen que muestra la hibridación in situ (ISH) de tejido control y tejido ONC. i GDF15 está regulado positivamente de manera específica en la capa de células ganglionares (GCL) con relación a la capa nuclear externa (ONL) y la capa nuclear interna (INL) en el tejido ONC.
Descripción detallada de la invención
La presente descripción proporciona una relación estadísticamente significativa entre los aumentos en las concentraciones de proteína GDF15 en el humor acuoso y un aumento en la gravedad del glaucoma. El factor de crecimiento/diferenciación 15 (GDF15) es una proteína que pertenece a la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta. GDF15 también puede denominarse factor de crecimiento/diferenciación 15, TGF-PL, MIC-1, PDF, PLAB, NAG-1 y PTGFB. La secuencia de aminoácidos de GDF15 puede encontrarse en el número de acceso de GenBank NP_004855.2 y la secuencia de ARNm puede encontrarse en el número de acceso de GenBank NM_004864.3. Un experto en la técnica podría determinar las secuencias en base al número de acceso de GenBank proporcionado. Era impredecible que los niveles de proteína GDF15 se elevaran en el glaucoma debido al daño crónico de las células ganglionares de la retina y que la elevación de GDF15 se correlacionara específicamente con el grado de glaucoma. Sorprendentemente, GDF15 es el único gen específico que está regulado positivamente con la lesión de las células ganglionares de la retina. En consecuencia, en la presente descripción se proporcionan métodos que utilizan esta relación para proporcionar medios inventivos para determinar la gravedad del glaucoma y ayudar en las decisiones de tratamiento.
En la presente descripción se proporcionan métodos para detectar ácido nucleico gdf15 y proteína GDF15 y su uso para clasificar la gravedad del glaucoma en un sujeto. Diversos aspectos de estos métodos se describen con más detalle más abajo.
I. Métodos
En un aspecto, la descripción proporciona un método para clasificar un sujeto en base a la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 medida en una muestra biológica obtenida del sujeto. El método generalmente comprende (i) medir la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en la muestra biológica, (ii) comparar la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en la muestra biológica con un valor de referencia y (iii) clasificar al sujeto según tenga una cantidad aumentada o disminuida de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en base a la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 medidos en la muestra.
En otro aspecto, la descripción proporciona un método para determinar la gravedad del glaucoma en un sujeto diagnosticado con glaucoma. El método generalmente comprende (i) medir la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en una muestra biológica obtenida del sujeto, (ii) comparar la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en la muestra biológica con un valor de referencia y (iii) determinar la gravedad del glaucoma en base a la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 con relación al valor de referencia. Los métodos para diagnosticar glaucoma en un sujeto son conocidos en la técnica y pueden incluir, pero no se limitan a, medir la presión del ojo (presión del ojo intraocular (IOP), tonometría), inspeccionar el ángulo de drenaje del ojo (gonioscopía), inspeccionar el nervio óptico (oftalmoscopía), pruebas de visión periférica (prueba de campo visual, perimetría) y medir el grosor de la córnea (paquimetría). En ciertas modalidades, el sujeto puede no ser diagnosticado con glaucoma pero se sospecha que tiene glaucoma en base a los síntomas. Los ejemplos no limitantes de síntomas de glaucoma que pueden conducir a un diagnóstico incluyen puntos ciegos en la vista periférica, visión borrosa, halos, dolores de cabeza leves, dolor ocular, dolor intenso en el ojo o la frente, enrojecimiento del ojo, disminución de la visión, visión arcoíris, náuseas y/o vómitos. En otras modalidades, el sujeto puede no ser diagnosticado con glaucoma pero corre el riesgo de tener glaucoma. Los ejemplos no limitantes de factores de riesgo para el glaucoma incluyen IOP alta, edad mayor de 60 años, afroamericano o hispano, antecedentes familiares de glaucoma, afecciones médicas como diabetes, enfermedad cardíaca, presión arterial alta y anemia de células falciformes, afecciones oculares como miopía, antecedentes de lesión ocular o ciertos tipos de cirugía ocular, deficiencia temprana de estrógeno, tal como la que puede ocurrir después de una ovariectomía bilateral antes de los 43 años, y/o tomar corticosteroides, especialmente gotas para los ojos, durante un tiempo prolongado.
En general, la gravedad del glaucoma se determina en base a las definiciones de estadificación de la ICD-9. Sin embargo, la presente descripción establece que la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en una muestra biológica pueden usarse para determinar la gravedad del glaucoma. De acuerdo con las definiciones de estadificación de la ICD-9, la gravedad del glaucoma puede ser glaucoma leve o en etapa temprana (grado I), glaucoma en etapa moderada (grado II) o glaucoma en etapa grave, glaucoma en etapa avanzada, glaucoma en etapa terminal (grado III). El glaucoma leve o en etapa temprana (grado I) se define como anomalías del nervio óptico compatibles con glaucoma pero sin anomalías del campo visual en ninguna prueba de campo visual blanco sobre blanco, o anomalías presentes solo en la perimetría automatizada de longitud de onda corta o en la perimetría de duplicación de frecuencia. El glaucoma en etapa moderada (grado II) se define como anomalías del nervio óptico compatibles con glaucoma y anomalías glaucomatosas del campo visual en un hemicampo y no dentro de los 5 grados de fijación. El glaucoma en etapa grave, el glaucoma en etapa avanzada, el glaucoma en etapa terminal (grado III) se define como anomalías del nervio óptico compatibles con glaucoma y anomalías glaucomatosas del campo visual en ambos hemicampos y/o pérdida dentro de los 5 grados de fijación en al menos un hemicampo. Pueden usarse otros sistemas de estadificación conocidos en la técnica. Un experto en la técnica podría correlacionar el sistema de estadificación de la ICD-9 con otros sistemas de estadificación. En consecuencia, en base a la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en la muestra biológica, un sujeto puede clasificarse en glaucoma de grado I, grado II o grado III. Luego, las decisiones de tratamiento pueden tomarse en base a la etapa del glaucoma.
En otro aspecto más, la descripción proporciona un método para determinar el tratamiento de un sujeto diagnosticado con glaucoma. El método generalmente comprende (i) medir la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en una muestra biológica obtenida del sujeto, (ii) comparar la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en la muestra biológica con un valor de referencia, en donde la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 por encima del valor de referencia indica la gravedad del glaucoma y (iii) determinar el tratamiento del sujeto en base a en la gravedad del glaucoma detectada. En ciertas modalidades, el sujeto puede no ser diagnosticado con glaucoma pero se sospecha que tiene glaucoma en base a los síntomas. En otras modalidades, el sujeto puede no ser diagnosticado con glaucoma pero corre el riesgo de tener glaucoma. En base a la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en la muestra biológica, un sujeto puede clasificarse en glaucoma de grado I, grado II o grado III. El glaucoma puede tratarse con gotas para los ojos, píldoras, cirugía con láser, cirugía de incisión o una combinación de estos métodos. El objetivo de cualquier tratamiento es prevenir la pérdida de la visión, ya que la pérdida de la visión por glaucoma es irreversible. Generalmente, las gotas para los ojos se usan para tratar el glaucoma de bajo grado. Si las gotas para los ojos no controlan suficientemente la IOP, pueden usarse píldoras además de las gotas para los ojos. Cuando los medicamentos no logran los resultados deseados o tienen efectos secundarios intolerables, la cirugía puede ser la siguiente opción. La cirugía puede ser cirugía con láser o cirugía de incisión. La cirugía con láser se considera una etapa intermedia entre la medicación y la cirugía de incisión. Los ejemplos no limitantes de cirugía con láser incluyen trabeculoplastia con láser de argón (ALT), trabeculoplastia con láser selectivo (SLT), iridotomía periférica con láser (LPI) y cicloablación. Los ejemplos no limitantes de cirugía de incisión incluyen trabeculectomía, cirugía de implante de drenaje, cirugía no penetrante, derivación exprés mini para glaucoma, trabectoma y canaloplastia. En base a la clasificación en grado I, grado II o grado III en base a la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en una muestra biológica, el sujeto puede tratarse con gotas para los ojos, píldoras, cirugía con láser y/o cirugía de incisión.
En otro aspecto aún más, la descripción proporciona un método para monitorear el glaucoma en un sujeto. En dicha modalidad, un método para detectar ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 pueden usarse para evaluar la gravedad del glaucoma en un sujeto en un momento dado. Luego, en un momento posterior, el método para
detectar ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 puede usarse para determinar el cambio en la gravedad del glaucoma en el sujeto a lo largo del tiempo. Por ejemplo, el método para detectar ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 puede usarse en el mismo sujeto días, semanas, meses o años después de la determinación inicial de la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15. En consecuencia, el método para detectar ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 puede usarse para seguir a un sujeto a lo largo del tiempo para determinar cuándo el riesgo de progresar a una enfermedad más grave es alto y de esta manera requiere tratamiento. Adicionalmente, el método para detectar ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 puede usarse para medir la velocidad de progresión de la enfermedad. Por ejemplo, una cantidad disminuida de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 pueden indicar una disminución de la progresión de la enfermedad. Alternativamente, una cantidad aumentada de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 pueden indicar progresión de la enfermedad. La evaluación temprana de la gravedad del glaucoma en el sujeto puede reducir el desarrollo y/o la progresión de los síntomas asociados con el glaucoma al permitir intervenciones mejoradas o permitir intervenciones más tempranas.
Adicionalmente, también puede usarse un método para monitorear el glaucoma en un sujeto para determinar la respuesta al tratamiento. Como se usa en la presente descripción, se dice que los sujetos que responden al tratamiento se han beneficiado del tratamiento. Las respuestas al tratamiento se miden en la práctica clínica mediante el uso de pruebas que incluyen, pero no se limitan a, medir la presión del ojo (presión del ojo intraocular (IOP), tonometría), inspeccionar el ángulo de drenaje del ojo (gonioscopía), inspeccionar el nervio óptico (oftalmoscopía), pruebas de visión periférica (prueba de campo visual, perimetría) y medir el grosor de la córnea (paquimetría). Estas pruebas se conocen bien en la técnica y pretenden referirse a parámetros específicos medidos durante ensayos clínicos y en la práctica clínica por un experto en la técnica. Por ejemplo, un método para detectar ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 puede realizarse en la muestra biológica del sujeto antes del inicio del tratamiento. Luego, en un momento posterior, un método para detectar ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 puede usarse para determinar la respuesta al tratamiento a lo largo del tiempo. Por ejemplo, un método para detectar ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 puede realizarse en la muestra biológica del mismo sujeto días, semanas, meses o años después del inicio del tratamiento. En consecuencia, un método para detectar ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 pueden usarse para seguir a un sujeto que recibe tratamiento para determinar si el sujeto responde al tratamiento. Si la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 aumenta o permanece igual, entonces el sujeto puede no responder al tratamiento. Si la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 disminuye, entonces el sujeto puede responder al tratamiento. Estas etapas pueden repetirse para determinar la respuesta a la terapia a lo largo del tiempo.
Los sujetos adecuados incluyen, pero no se limitan a, un ser humano, un animal de granja, un animal de compañía, un animal de laboratorio y un animal de zoológico. En una modalidad, el sujeto puede ser un roedor, por ejemplo, un ratón, una rata, un conejillo de indias, etc. En otra modalidad, el sujeto puede ser un animal de granja. Los ejemplos no limitantes de animales de granja adecuados pueden incluir cerdos, vacas, caballos, cabras, ovejas, llamas y alpacas. En otra modalidad más, el sujeto puede ser un animal de compañía. Los ejemplos no limitantes de animales de compañía pueden incluir mascotas tales como perros, gatos, conejos y pájaros. En otra modalidad más, el sujeto puede ser un animal de zoológico. Como se usa en la presente descripción, un "animal de zoológico" se refiere a un animal que puede encontrarse en un zoológico. Dichos animales pueden incluir primates no humanos, grandes felinos, lobos y osos. En modalidades preferidas, el animal es un animal de laboratorio. Los ejemplos no limitantes de un animal de laboratorio pueden incluir roedores, caninos, felinos y primates no humanos. En ciertas modalidades, el animal es un roedor. En una modalidad preferida, el sujeto es un ser humano.
(a) muestra biológica
Como se usa en la presente descripción, el término "muestra biológica" se refiere a una muestra obtenida de un sujeto. Cualquier muestra biológica que contiene proteína GDF15 o ácido nucleico gdf15 es adecuada. En la técnica se conocen numerosos tipos de muestras biológicas. La muestra biológica adecuada puede incluir, pero no se limita a, muestras de tejido o fluidos corporales. En algunas modalidades, la muestra biológica es una muestra de tejido tal como una biopsia de tejido. El tejido de la biopsia puede fijarse, incluirse en parafina o plástico y seccionarse, o el tejido de la biopsia puede congelarse y crioseccionarse. En una modalidad específica, el tejido de la biopsia es tejido de la retina. En otras modalidades, la muestra puede ser un fluido corporal. Los ejemplos no limitantes de fluidos corporales adecuados incluyen humor acuoso. En una modalidad específica, la muestra biológica es humor acuoso. El fluido puede usarse "tal cual", los componentes celulares pueden aislarse del fluido, o una fracción puede aislarse del fluido mediante el uso de técnicas estándar.
Como apreciará un experto en la técnica, el método para recolectar una muestra biológica puede variar y variará en dependencia de la naturaleza de la muestra biológica y del tipo de análisis a realizar. Puede utilizarse cualquiera de una variedad de métodos generalmente conocidos en la técnica para recolectar una muestra biológica. En términos generales, el método preferentemente mantiene la integridad de la muestra de manera que el ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 pueden detectarse con precisión y la cantidad puede medirse de acuerdo con la descripción. En una modalidad específica, el humor acuoso se recolecta al comienzo de la cirugía.
En algunas modalidades, se obtiene una sola muestra de un sujeto para detectar ácido nucleicogdf15o proteína GDF15 en la muestra. Alternativamente, el ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 pueden detectarse en muestras
obtenidas a lo largo del tiempo de un sujeto. Como tal, puede recolectarse más de una muestra de un sujeto a lo largo del tiempo. Por ejemplo, pueden recolectarse 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o más muestras de un sujeto a lo largo del tiempo. En algunas modalidades, se recolectan 2, 3, 4, 5 o 6 muestras de un sujeto a lo largo del tiempo. En otras modalidades, se recolectan 6, 7, 8, 9 o 10 muestras de un sujeto a lo largo del tiempo. En otras modalidades más, se recolectan 10, 11, 12, 13 o 14 muestras de un sujeto a lo largo del tiempo. En otras modalidades, se recolectan 14, 15, 16 o más muestras de un sujeto a lo largo del tiempo.
Cuando se recolecta más de una muestra de un sujeto a lo largo del tiempo, las muestras pueden recolectarse cada I, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más días. En algunas modalidades, se recolecta una muestra aproximadamente cada 6 días. En algunas modalidades, las muestras se recolectan cada 1, 2, 3, 4 o 5 días. En otras modalidades, las muestras se recolectan cada 5, 6, 7, 8 o 9 días. En otras modalidades más, las muestras se recolectan cada 9, 10, I I , 12 o más días. En aún otras modalidades, las muestras se recolectan con un mes de diferencia, con 3 meses de diferencia, con 6 meses de diferencia, con 1 año de diferencia, con 2 años de diferencia, con 5 años de diferencia, con 10 años de diferencia o más.
(b) detectar ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15
Una vez que se obtiene una muestra, se procesa in vitro para detectar y medir la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15. Todos los métodos adecuados para detectar y medir una cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 conocidos por uno de los expertos en la técnica se contemplan dentro del alcance de la invención. Los métodos para detectar la expresión de ácidos nucleicos y la expresión de proteínas se describen en detalle más abajo.
i. expresión de ácido nucleico
En una modalidad, la expresión de ácido nucleico gdf15 puede medirse para determinar la cantidad de ácido nucleico gdf15 en una muestra biológica. En una modalidad específica, el ARNm de gdf15 puede medirse para determinar la cantidad de ácido nucleico gdf15 en una muestra biológica.
Los métodos para evaluar una cantidad de expresión de ácido nucleico en una muestra se conocen bien en la técnica y todos los métodos adecuados para evaluar una cantidad de expresión de ácido nucleico conocidos por uno de los expertos en la técnica se contemplan dentro del alcance de la invención. El término "cantidad de expresión de ácido nucleico" o "nivel de expresión de ácido nucleico", como se usa en la presente descripción, se refiere a un nivel medible de expresión de los ácidos nucleicos, tales como, sin limitación, el nivel de transcrito de ARN mensajero (ARNm) expresado o un variante específica u otra porción del ARNm, las actividades enzimáticas u otras de los ácidos nucleicos y el nivel de un metabolito específico. El término "ácido nucleico" incluye ADN y ARN y puede ser monocatenario o bicatenario. Los ejemplos no limitantes de métodos adecuados para evaluar una cantidad de expresión de ácido nucleico pueden incluir matrices, como micromatrices, PCR, tales como RT-PCR (que incluye la RT-PCR cuantitativa), ensayos de protección de nucleasas y análisis de transferencia Northern. En una modalidad específica, determinar la cantidad de expresión de un ácido nucleico diana comprende, en parte, medir el nivel de expresión del ARNm del ácido nucleico diana.
En una modalidad, la cantidad de expresión de ácido nucleico puede determinarse mediante el uso de una matriz, como una micromatriz. Los métodos para usar una micromatriz de ácido nucleico son bien y ampliamente conocidos en la técnica. Por ejemplo, en la matriz puede usarse una sonda de ácido nucleico que sea complementaria o hibridable con un producto de expresión de un gen diana. El término "hibridar" o "hibridable" se refiere a la interacción de una unión no covalente específica de secuencia con un ácido nucleico complementario. En una modalidad preferida, la hibridación es en condiciones de alta rigurosidad. Las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación son conocidas para los expertos en la técnica, o puede encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 6.3.6. El término "sonda" como se usa en la presente descripción se refiere a una secuencia de ácido nucleico que hibridará con una secuencia diana de ácido nucleico. En un ejemplo, la sonda se hibrida con un producto de a Rn del ácido nucleico o una secuencia de ácido nucleico complementaria de este. La longitud de la sonda depende de las condiciones de hibridación y las secuencias de la sonda y la secuencia diana de ácido nucleico. En una modalidad, la sonda es de al menos 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 400, 500 o más nucleótidos de longitud.
En otra modalidad, la cantidad de expresión de ácido nucleico puede determinarse mediante el uso de PCR. Los métodos de PCR son bien y ampliamente conocidos en la técnica y pueden incluir PCR cuantitativa, PCR semicuantitativa, PCR múltiple o cualquier combinación de estas. Específicamente, la cantidad de expresión de ácido nucleico puede determinarse mediante el uso de RT-PCR cuantitativa. Los métodos para realizar RT-PCR cuantitativa son comunes en la técnica. En dicha modalidad, los cebadores usados para la RT-PCR cuantitativa pueden comprender un cebador directo e inverso para un gen diana. El término "cebador", como se usa en la presente descripción, se refiere a una secuencia de ácido nucleico, ya sea que se produzca de forma natural como en un digerido de restricción purificado o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como un punto de síntesis cuando se coloca en condiciones en las que la síntesis de un producto de extensión de cebador, que es complementario a una hebra de ácido nucleico (por ejemplo, en presencia de nucleótidos y un agente inductor como
la ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados). El cebador debe ser suficientemente largo para iniciar la síntesis del producto de extensión deseado en presencia del agente inductor. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, que incluyen la temperatura, secuencias de los cebadores y los métodos usados. Un cebador típicamente contiene de 15-25 o más nucleótidos, aunque puede contener menos o más. Los factores implicados en la determinación de la longitud apropiada del cebador son fácilmente conocidos por uno de los expertos en la técnica.
La cantidad de expresión de ácido nucleico puede medirse al medir un transcrito de ARNm completo para una secuencia de ácido nucleico, o al medir una porción del transcrito de ARNm para una secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, si se utiliza una matriz de ácido nucleico para medir la cantidad de expresión de ARNm, la matriz puede comprender una sonda para una porción del ARNm de la secuencia de ácido nucleico de interés, o la matriz puede comprender una sonda para el ARNm completo de la secuencia de ácido nucleico de interés. De manera similar, en una reacción de PCR, los cebadores pueden diseñarse para amplificar la secuencia de ADNc completa de la secuencia de ácido nucleico de interés, o una porción de la secuencia de ADNc. Un experto en la técnica reconocerá que hay más de un conjunto de cebadores que pueden usarse para amplificar el ADNc completo o una porción del ADNc para una secuencia de ácido nucleico de interés. Los métodos para diseñar cebadores son conocidos en la técnica. Los métodos para extraer ARN de una muestra biológica son conocidos en la técnica.
El nivel de expresión puede normalizarse o no al nivel de un ácido nucleico de control. Esto permite comparaciones entre ensayos que se realizan en diferentes ocasiones.
ii. expresión de proteína
En otra modalidad, puede medirse la expresión de la proteína GDF15 para determinar la cantidad de proteína GDF15 en una muestra biológica. En una modalidad específica, la expresión de la proteína GDF15 puede medirse mediante el uso de un ELISA para determinar la cantidad de proteína GDF15 en una muestra biológica.
Los métodos para evaluar una cantidad de expresión de proteína se conocen bien en la técnica y todos los métodos adecuados para evaluar la cantidad de expresión de proteína conocidos por uno de los expertos en la técnica se contemplan dentro del alcance de la invención. Los ejemplos no limitantes de métodos adecuados para evaluar una cantidad de expresión de proteína pueden incluir métodos basados en agentes de unión a epítopos y métodos basados en espectrometría de masas.
En algunas modalidades, el método para evaluar una cantidad de expresión de proteína es la espectrometría de masas. Al explotar las propiedades intrínsecas de la masa y la carga, la espectrometría de masas (MS) puede resolver e identificar con confianza una amplia variedad de compuestos complejos, que incluyen las proteínas. La MS cuantitativa tradicional ha usado ionización por electropulverización (ESI) seguida de MS en tándem (MS/MS) (Chen y otros, 2001; Zhong y otros, 2001; Wu y otros, 2000), mientras que se han desarrollado métodos cuantitativos más nuevos mediante el uso de matriz desorción/ionización asistida con láser (MALDI) seguida por MS de tiempo de vuelo (TOF) (Bucknall y otros, 2002; Mirgorodskaya y otros, 2000; Gobom y otros, 2000). De acuerdo con la presente invención, puede usarse la espectrometría de masas para buscar el nivel de proteína codificada a partir de un ácido nucleico diana de la invención.
En algunas modalidades, el método para evaluar una cantidad de expresión de proteína es un método basado en un agente aglutinante de epítopos. Como se usa en la presente descripción, el término "agente aglutinante de epítopos" se refiere a un anticuerpo, un aptámero, un ácido nucleico, un ácido oligonucleico, un aminoácido, un péptido, un polipéptido, una proteína, un lípido, un metabolito, una molécula pequeña o un fragmento de este que reconoce y es capaz de unirse a una proteína del gen diana. Los ácidos nucleicos pueden incluir ARN, ADN y derivados naturales o creados sintéticamente.
Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo" generalmente significa un polipéptido o proteína que reconoce y puede unirse a un epítopo de un antígeno. Un anticuerpo, como se usa en la presente descripción, puede ser un anticuerpo completo como se entiende en la técnica, es decir, que consiste de dos hebras pesadas y dos hebras ligeras, o puede ser cualquier molécula similar a un anticuerpo que tenga una región de unión al antígeno e incluya, pero sin limitarse a, fragmentos de anticuerpos tales como Fab', Fab, F(ab')2, anticuerpos de dominio único, Fv y Fv de hebra única. El término anticuerpo también se refiere a un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado. Las técnicas para preparar y usar diversos constructos y fragmentos basados en anticuerpos se conocen bien en la técnica. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos también se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
Como se usa en la presente descripción, el término "aptámero" se refiere a un polinucleótido, generalmente un ARN o ADN que tiene una actividad biológica útil en términos de actividad bioquímica, reconocimiento molecular o atributos de unión. Por lo general, un aptámero tiene una actividad molecular tal como unirse a una molécula diana en un epítopo (región) específico. Generalmente se acepta que un aptámero, que es específico en su unión a un polipéptido, puede sintetizarse y/o identificarse mediante métodos de evolución in vitro. Los medios para preparar y
caracterizar aptámeros, que incluyen los métodos de evolución in vitro, se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, el documento e E. UU. 7,939,313.
En general, un método basado en un agente aglutinante de epítopos para evaluar una cantidad de expresión de proteína comprende poner en contacto una muestra que comprende un polipéptido con un agente aglutinante de epítopos específico para el polipéptido en condiciones efectivas para permitir la formación de un complejo entre el agente aglutinante de epítopos y el polipéptido. Los métodos basados en un agente aglutinante de epítopos pueden ocurrir en solución, o el agente aglutinante de epítopos o la muestra pueden inmovilizarse sobre una superficie sólida. Los ejemplos no limitantes de superficies adecuadas incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, perlas, resinas y otros polímeros.
Un agente aglutinante de epítopos puede unirse al sustrato en una amplia variedad de formas, como apreciarán los expertos en la técnica. El agente aglutinante de epítopos puede sintetizarse primero, con la unión posterior al sustrato, o puede sintetizarse directamente sobre el sustrato. El sustrato y el agente aglutinante de epítopos pueden derivatizarse con grupos funcionales químicos para la unión posterior de los dos. Por ejemplo, el sustrato puede derivatizarse con un grupo funcional químico que incluye, pero no se limita a, grupos amino, grupos carboxilo, grupos oxo o grupos tiol. Mediante el uso de estos grupos funcionales, el agente aglutinante de epítopos puede unirse directamente mediante el uso de los grupos funcionales o indirectamente mediante el uso de enlazadores. El agente aglutinante de epítopos también puede unirse al sustrato de forma no covalente. Por ejemplo, puede prepararse un agente aglutinante de epítopos biotinilado, que puede unirse a superficies recubiertas covalentemente con estreptavidina, lo que da como resultado la unión. Alternativamente, puede sintetizarse un agente aglutinante de epítopos en la superficie mediante el uso de técnicas tales como fotopolimerización y fotolitografía. Se conocen bien en la técnica métodos adicionales para unir agentes aglutinantes de epítopos a superficies sólidas y métodos para sintetizar biomoléculas en sustratos, es decir, la tecnología VLSIPS de Affymetrix (por ejemplo, véase la patente de EE. UU. Núm. 6,566,495 y Rockett y Dix, Xenobiotica 30(2):155-177.
Poner en contacto la muestra con un agente aglutinante de epítopos en condiciones efectivas durante un período de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo generalmente implica añadir la composición del agente aglutinante de epítopos a la muestra e incubar la mezcla durante un período de tiempo lo suficientemente largo para el agente aglutinante de epítopos unirse a cualquier antígeno presente. Después de este tiempo, el complejo se lavará y el complejo podrá detectarse por cualquier método bien conocido en la técnica. Los métodos para detectar el complejo polipéptido-agente aglutinante de epítopos se basan generalmente en la detección de una etiqueta o marcador. El término "marcador", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier sustancia unida a un agente aglutinante de epítopos, u otro material de sustrato, en el que la sustancia es detectable mediante un método de detección. Los ejemplos no limitantes de marcadores adecuados incluyen moléculas luminiscentes, moléculas quimioluminiscentes, fluorocromos, agentes de apagado fluorescentes, moléculas coloreadas, radioisótopos, centelleantes, biotina, avidina, estrepavidina, proteína A, proteína G, anticuerpos o fragmentos de estos, polihistidina, Ni2+, etiquetas Flag, etiquetas myc, metales pesados y enzimas (que incluyen la fosfatasa alcalina, la peroxidasa y la luciferasa). Los métodos para detectar un complejo polipéptido-agente aglutinante de epítopos en base a la detección de una etiqueta o marcador se conocen bien en la técnica.
En algunas modalidades, un método basado en un agente aglutinante de epítopos es un inmunoensayo. Los inmunoensayos pueden ejecutarse en una serie de formatos diferentes. En términos generales, los inmunoensayos pueden dividirse en dos categorías: inmunoensayos competitivos e inmunoensayos no competitivos. En un inmunoensayo competitivo, un analito no marcado en una muestra compite con el analito marcado para unirse a un anticuerpo. El analito no unido se elimina por lavado y el analito unido se mide. En un inmunoensayo no competitivo, se marca el anticuerpo, no el analito. Los inmunoensayos no competitivos pueden usar un anticuerpo (por ejemplo, el anticuerpo de captura está marcado) o más de un anticuerpo (por ejemplo, al menos un anticuerpo de captura que no está marcado y al menos un anticuerpo de "protección" o detección que está marcado). Se describen arriba marcadores adecuados.
En una modalidad, el método del agente aglutinante de epítopos es un inmunoensayo. En otra modalidad, el método del agente aglutinante de epítopos se selecciona del grupo que consiste en un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA), un ensayo basado en fluorescencia, un fluoroinmunoensayo de lantánidos potenciado por disociación (DELFIA), un ensayo radiométrico, un inmunoensayo múltiple y un ensayo de perlas de citometría (CBA). En algunas modalidades, el método basado en un agente aglutinante de epítopos es un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA). En otras modalidades, el método basado en un agente aglutinante de epítopos es un radioinmunoensayo. En aún otras modalidades, el método basado en un agente aglutinante de epítopos es una inmunotransferencia o transferencia Western. En modalidades alternativas, el método basado en un agente aglutinante de epítopos es una matriz. En otra modalidad, el método basado en un agente aglutinante de epítopos es citometría de flujo. En diferentes modalidades, el método basado en un agente aglutinante de epítopos es inmunohistoquímica (IHC). La IHC usa un anticuerpo para detectar y cuantificar antígenos en muestras de tejido intacto. Las muestras de tejido pueden ser bloques de tejido recién congelados y/o fijados en formalina, incluidos en parafina (o incluidos en plástico) preparados para estudio por IHC. Los métodos para preparar el bloque de tejido para estudio por IHC, así como también los métodos para realizar IHC, se conocen bien en la técnica.
(c) comparar la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 con un valor de referencia
La cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en la muestra biológica puede compararse con un valor de referencia para ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15, respectivamente. Los niveles de expresión del sujeto de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en una muestra biológica se comparan con un valor de referencia para ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15, respectivamente, para clasificar un sujeto, determinar la gravedad del glaucoma en un sujeto, determinar el tratamiento de un sujeto, monitorear el glaucoma en un sujeto y/o monitorear la respuesta al tratamiento. En términos generales, un sujeto puede clasificarse como que tiene una cantidad aumentada o disminuida de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en comparación con un valor de referencia, en donde una cantidad aumentada de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 es una cantidad por encima del valor de referencia y una cantidad reducida es una cantidad igual o más abajo al valor de referencia.
Más específicamente, el nivel de expresión de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 se compara con el valor de referencia del ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 para determinar si el ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en la muestra de prueba se expresa diferencialmente con relación al valor de referencia del ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15, respectivamente. El término "expresado diferencialmente" o "expresión diferencial", como se usa en la presente descripción, se refiere a una diferencia en el nivel de expresión de los ácidos nucleicos que pueden ensayarse al medir el nivel de expresión de los productos de los ácidos nucleicos, tales como la diferencia en nivel de expresión del transcrito de ARN mensajero o de una porción de este o de proteínas expresadas de los ácidos nucleicos.
El término "diferencia en el nivel de expresión" se refiere a un aumento o disminución en los niveles de expresión medibles de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15, por ejemplo, medido por la cantidad de transcrito de ARN mensajero y/o la cantidad de proteína en una muestra biológica comparado con el nivel de expresión medible de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en una muestra de referencia. En una modalidad, la expresión diferencial puede compararse mediante el uso de la relación del nivel de expresión de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 comparado con el nivel de expresión de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 de una muestra de referencia, en donde la relación no es igual a 1,0. Por ejemplo, un ácido nucleico o proteína se expresan diferencialmente si la relación del nivel de expresión de una primera muestra comparada con una segunda muestra es mayor o menor que 1,0. Por ejemplo, una relación mayor que 1, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 3, 5, 10, 15, 20 o más, o una relación menor que 1, 0,8, 0,6, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,001 o menos. En otra modalidad, la expresión diferencial se mide mediante el uso de un valor de p. Por ejemplo, cuando mediante el uso de un valor de p, se identifica un ácido nucleico o proteína como que se expresa diferencialmente entre una primera muestra y una segunda muestra cuando el valor de p es menor que 0,1, preferentemente menor que 0,05, con mayor preferencia menor que 0,01, aún con mayor preferencia menor que 0,005, con la máxima preferencia menor que 0,001. En dependencia de la muestra usada para el valor de referencia, la diferencia en el nivel de expresión puede o no ser estadísticamente significativa. Por ejemplo, si la muestra usada para valor de referencia es de un sujeto o sujetos diagnosticados con glaucoma, entonces, cuando la diferencia en el nivel de expresión no es significativamente diferente, el sujeto tiene glaucoma. Sin embargo, cuando la diferencia en el nivel de expresión es significativamente diferente, el sujeto no tiene glaucoma. Alternativamente, si la muestra usada para el valor de referencia es de un sujeto o sujetos diagnosticados sin enfermedad, entonces cuando la diferencia en el nivel de expresión no es significativamente diferente, el sujeto no tiene glaucoma. Sin embargo, cuando la diferencia en el nivel de expresión es significativamente diferente, el sujeto tiene glaucoma.
Puede usarse cualquier valor de referencia adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, un valor de referencia adecuado puede ser la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en una muestra biológica obtenida de un sujeto o grupo de sujetos de la misma especie que no presentan signos o síntomas de enfermedad (es decir, glaucoma). En otro ejemplo, un valor de referencia adecuado puede ser la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en una muestra biológica obtenida de un sujeto o grupo de sujetos de la misma especie que no se han diagnosticados con la enfermedad (es decir, glaucoma). En otro ejemplo más, un valor de referencia adecuado puede ser la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en una muestra biológica obtenida de un sujeto o grupo de sujetos de la misma especie que presentan signos o síntomas de glaucoma. En aún otro ejemplo más, un valor de referencia adecuado puede ser la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en una muestra biológica obtenida de un sujeto o grupo de sujetos de la misma especie que se han diagnosticado con glaucoma. En un ejemplo diferente, un valor de referencia adecuado puede ser la señal de fondo del ensayo determinada por métodos conocidos en la técnica. En otro ejemplo diferente, un valor de referencia adecuado puede ser la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en una muestra sana almacenada en un medio legible por computadora. En aún otro ejemplo diferente, un valor de referencia adecuado puede ser la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en una muestra enferma almacenada en un medio legible por computadora. Las formas comunes de medios legibles por computadora incluyen, por ejemplo, un disquete, un disco flexible, un disco duro, una cinta magnética u otro medio magnético, un CD-ROM, CDRW, DVD u otro medio óptico, tarjetas perforadas, cinta de papel, hojas de marcas ópticas u otro medio físico con patrones de agujeros u otras marcas codificadas ópticamente reconocibles, una RAM, una PROM y una EPROM, una FLASH-EPROM u otro chip o cartucho de memoria, una onda portadora u otro medio desde el cual una computadora puede leer.
En otros ejemplos, un valor de referencia adecuado puede ser la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en una muestra de referencia obtenida del mismo sujeto. La muestra de referencia puede o no haberse obtenido del
sujeto cuando no se sospechaba de glaucoma. Un experto en la técnica apreciará que no siempre es posible o deseable obtener una muestra de referencia de un sujeto cuando, el sujeto está de cualquier otra manera, sano. Por ejemplo, en un ajuste agudo, una muestra de referencia puede ser la primera muestra obtenida del sujeto en el momento de la presentación. En otro ejemplo, cuando se monitorea la efectividad de una terapia, una muestra de referencia puede ser una muestra obtenida de un sujeto antes de que comenzara la terapia. En dicho ejemplo, un sujeto puede tener sospecha de glaucoma pero puede no tener otros síntomas de glaucoma o el sujeto puede tener sospecha de glaucoma y uno o más de otros síntomas de glaucoma.
En una modalidad específica, un valor de referencia puede ser la cantidad de proteína GDF15 en una muestra sana. Por ejemplo, un valor de referencia adecuado para la proteína GDF15 puede ser aproximadamente 10 pg/ml, aproximadamente 11 pg/ml, aproximadamente 12 pg/ml, aproximadamente 13 pg/ml, aproximadamente 14 pg/ml, aproximadamente 15 pg/ml, aproximadamente 16 pg/ml, aproximadamente 17 pg/ml, aproximadamente 18 pg/ml, aproximadamente 19 pg/ml o aproximadamente 20 pg/ml. Específicamente, los datos presentados en los ejemplos muestran que los sujetos sin glaucoma tenían un GDF15 promedio de 8,9 ± SE 7,7 pg/ml. De acuerdo con la descripción, la cantidad de proteína GDF15 por encima del valor de referencia indica glaucoma de grado I, grado II o grado III. Por ejemplo, una cantidad de proteína GDF15 de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 80 pg/ml indica glaucoma de grado I; una cantidad de proteína GDF15 de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 160 pg/ml indica glaucoma de grado II y una cantidad de proteína GDF15 de aproximadamente 160 pg/ml o mayor indica glaucoma de grado III. Debe entenderse que estos valores pueden cambiar debido a datos experimentales adicionales. En una modalidad ilustrativa, una cantidad de proteína GDF15 de aproximadamente 46,4 ± 12,1 pg/ml indica glaucoma de grado I; una cantidad de proteína GDF15 de aproximadamente 129,5 ± 38,0 pg/ml indica glaucoma de grado II y una cantidad de proteína GDF15 de aproximadamente 190 ± 48,7 pg/ml o mayor indica glaucoma de grado III.
Una cantidad aumentada de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 con relación a un valor de referencia indica una gravedad del glaucoma aumentada. Específicamente, un sujeto puede tener glaucoma de grado I cuando la cantidad de proteína GDF15 es mayor que aproximadamente 10 pg/ml y menor que aproximadamente 80 pg/ml. En ciertas modalidades, un sujeto puede tener glaucoma de grado I cuando la cantidad de proteína GDF15 es mayor que aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19 o aproximadamente 20 pg/ml y menor que aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, aproximadamente 40, aproximadamente 41, aproximadamente 42, aproximadamente 43, aproximadamente 44, aproximadamente 45, aproximadamente 46, aproximadamente 47, aproximadamente 48, aproximadamente 49, aproximadamente 50, aproximadamente 51, aproximadamente 52, aproximadamente 53, aproximadamente 54, aproximadamente 55, aproximadamente 56, aproximadamente 57, aproximadamente 58, aproximadamente 59, aproximadamente 60, aproximadamente 61, aproximadamente 62, aproximadamente 63, aproximadamente 64, aproximadamente 65, aproximadamente 66, aproximadamente 67, aproximadamente 68, aproximadamente 69, aproximadamente 70, aproximadamente 71, aproximadamente 72, aproximadamente 73, aproximadamente 74, aproximadamente 75, aproximadamente 76, aproximadamente 77, aproximadamente 78, aproximadamente 79 o aproximadamente 80 pg/ml. En una modalidad, un sujeto puede tener glaucoma de grado I cuando la cantidad de proteína GDF15 es mayor que aproximadamente 10 pg/ml y menor que aproximadamente 50 pg/ml, mayor que aproximadamente 20 pg/ml y menor que aproximadamente 50 pg/ml, mayor que aproximadamente 10 pg/ml y menor que aproximadamente 60 pg/ml, mayor que aproximadamente 20 pg/ml y menor que aproximadamente 60 pg/ml, mayor que aproximadamente 10 pg/ml y menor que aproximadamente 70 pg/ml, mayor que aproximadamente 20 pg/ml y menor que aproximadamente 70 pg/ml, mayor que aproximadamente 10 pg/ml y menor que aproximadamente 80 pg/ml o mayor que aproximadamente 20 pg/ml y menor que aproximadamente 80 pg/ml. En una modalidad específica, un sujeto puede tener glaucoma de grado I cuando la cantidad de proteína GDF15 es mayor que aproximadamente 20 pg/ml y menor que aproximadamente 80 pg/ml
Alternativamente, un sujeto puede tener glaucoma de grado II cuando la cantidad de proteína GDF15 está entre aproximadamente 50 pg/ml y aproximadamente 180 pg/ml. En ciertas modalidades, un sujeto puede tener glaucoma de grado II cuando la cantidad de proteína GDF15 está entre aproximadamente 50, aproximadamente 51, aproximadamente 52, aproximadamente 53, aproximadamente 54, aproximadamente 55, aproximadamente 56, aproximadamente 57, aproximadamente 58, aproximadamente 59, aproximadamente 60, aproximadamente 61, aproximadamente 62, aproximadamente 63, aproximadamente 64, aproximadamente 65, aproximadamente 66, aproximadamente 67, aproximadamente 68, aproximadamente 69, aproximadamente 70, aproximadamente 71, aproximadamente 72, aproximadamente 73, aproximadamente 74, aproximadamente 75, aproximadamente 76, aproximadamente 77, aproximadamente 78, aproximadamente 79, aproximadamente 80, aproximadamente 81, aproximadamente 82, aproximadamente 83, aproximadamente 84, aproximadamente 85, aproximadamente 87, aproximadamente 88, aproximadamente 89, o aproximadamente 90 pg/ml y aproximadamente 150, aproximadamente 151, aproximadamente 152, aproximadamente 153, aproximadamente 154, aproximadamente 155, aproximadamente 156, aproximadamente 157, aproximadamente 158, aproximadamente 159, aproximadamente 160, aproximadamente 161, aproximadamente 162, aproximadamente 163, aproximadamente 164, aproximadamente 165, aproximadamente 166, aproximadamente 167, aproximadamente 168,
aproximadamente 169, aproximadamente 170, aproximadamente 171, aproximadamente 172, aproximadamente 173, aproximadamente 174, aproximadamente 175, aproximadamente 176, aproximadamente 177, aproximadamente 178, aproximadamente 179 o aproximadamente 180 pg/ml. En una modalidad, un sujeto puede tener glaucoma de grado II cuando la cantidad de proteína GDF15 es mayor que aproximadamente 50 pg/ml y menor que aproximadamente 170 pg/ml, mayor que aproximadamente 50 pg/ml y menor que aproximadamente 160 pg/ml, mayor que aproximadamente 50 pg/ml y menor que aproximadamente 150 pg/ml, mayor que aproximadamente 60 pg/ml y menor que aproximadamente 180 pg/ml, mayor que aproximadamente 60 pg/ml y menor que aproximadamente 170 pg/ml, mayor que aproximadamente 60 pg/ml y menor que aproximadamente 160 pg/ml, mayor que aproximadamente 60 pg/ml y menor que aproximadamente 150 pg/ml, mayor que aproximadamente 70 pg/ml y menor que aproximadamente 180 pg/ml, mayor que aproximadamente 70 pg/ml y menor que aproximadamente 170 pg/ml, mayor que aproximadamente 70 pg/ml y menor que aproximadamente 160 pg/ml, mayor que aproximadamente 70 pg/ml y menor que aproximadamente 150 pg/ml, mayor que aproximadamente 80 pg/ml y menor que aproximadamente 180 pg/ml, mayor que aproximadamente 80 pg/ml y menor que aproximadamente 170 pg/ml, mayor que aproximadamente 80 pg/ml y menor que aproximadamente 160 pg/ml, mayor que aproximadamente 80 pg/ml y menor que aproximadamente 150 pg/ml, mayor que aproximadamente 90 pg/ml y menor que aproximadamente 180 pg/ml, mayor que aproximadamente 90 pg/ml y menor que aproximadamente 170 pg/ml, mayor que aproximadamente 90 pg/ml y menor que aproximadamente 160 pg/ml o mayor que aproximadamente 90 pg/ml y menor que aproximadamente 150 pg/ml. En una modalidad específica, un sujeto puede tener glaucoma de grado II cuando la cantidad de proteína GDF15 es mayor que aproximadamente 80 pg/ml y menor que aproximadamente 160 pg/ml.
Además, un sujeto puede tener glaucoma de grado III cuando la cantidad de proteína GDF15 es mayor que 160 pg/ml. En ciertas modalidades, un sujeto puede tener glaucoma de grado III cuando la cantidad de proteína GDF15 es mayor que aproximadamente 140, aproximadamente 145, aproximadamente 150, aproximadamente 155, aproximadamente 160, aproximadamente 165, aproximadamente 170, aproximadamente 175, aproximadamente 180, aproximadamente 185, aproximadamente 190, aproximadamente 195, aproximadamente 200, aproximadamente 205, aproximadamente 210, aproximadamente 215, aproximadamente 220, aproximadamente 225, aproximadamente 230, aproximadamente 235 o aproximadamente 240 pg/ml. En una modalidad específica, un sujeto puede tener glaucoma de grado III cuando la cantidad de proteína GDF15 es mayor que aproximadamente 140 pg/ml.
(d) tratamiento
La determinación de la gravedad del glaucoma puede usarse para seleccionar el tratamiento para sujetos con glaucoma. Como se explica en la presente descripción, el ácido nucleico gdf15 y la proteína GDF15 pueden clasificar a un sujeto como que tiene glaucoma de grado I, grado II o grado II y en grupos que podrían beneficiarse de la terapia o determinar el tratamiento del glaucoma apropiado para el sujeto. En una modalidad, puede tratarse un sujeto clasificado como que tiene glaucoma de grado I, grado II o grado III. Un experto en la técnica podría determinar el tratamiento estándar para el glaucoma de grado I, grado II o grado III. En consecuencia, los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para seleccionar el tratamiento para sujetos con glaucoma. En una modalidad, el sujeto se trata en base a la diferencia en la cantidad de ácido nucleico gdf15 y proteína GDF15 con relación al valor de referencia. Esta clasificación puede usarse para identificar grupos que necesitan tratamiento o no, o que necesitan un tratamiento más agresivo. El término "tratamiento" o "terapia", tal Como se usa en la presente descripción, significa cualquier tratamiento adecuado para el tratamiento del glaucoma. El tratamiento puede consistir en tratamientos estándar para el glaucoma. Los ejemplos no limitantes de tratamiento estándar para el glaucoma incluyen gotas para los ojos, píldoras, cirugía con láser, cirugía de incisión o una combinación de estos métodos. Generalmente, las gotas para los ojos se usan para tratar el glaucoma de bajo grado. Si las gotas para los ojos no controlan suficientemente la IOP, pueden usarse píldoras además de las gotas para los ojos. Cuando los medicamentos no logran los resultados deseados o tienen efectos secundarios intolerables, la cirugía puede ser la siguiente opción. La cirugía puede ser cirugía con láser o cirugía de incisión. La cirugía con láser se considera una etapa intermedia entre la medicación y la cirugía de incisión. Los ejemplos no limitantes de cirugía con láser incluyen trabeculoplastia con láser de argón (ALT), trabeculoplastia con láser selectivo (SLT), iridotomía periférica con láser (LPI) y cicloablación. Los ejemplos no limitantes de cirugía de incisión incluyen trabeculectomía, cirugía de implante de drenaje, cirugía no penetrante, derivación exprés mini para glaucoma, trabectoma y canaloplastia. En base a la clasificación en grado I, grado II o grado III en base a la cantidad de ácido nucleico gdf15 o proteína GDF15 en una muestra biológica, el sujeto puede tratarse con gotas para los ojos, píldoras, cirugía con láser y/o cirugía de incisión. Adicionalmente, la decisión del tratamiento puede tomarse en base a la evidencia de progresión de un grado al siguiente.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes se incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la invención.
Ejemplo 1.
Actualmente no hay biomarcadores disponibles que detecten la gravedad o progresión del glaucoma. A pesar de que Tgfb2 puede causar glaucoma, no es un biomarcador de glaucoma. Actualmente, el tratamiento para glaucoma se decide en base a la presión intraocular (IOP) y la perimetría. Sin embargo, la IOP es ampliamente variable de un paciente a otro y la perimetría es una prueba subjetiva. Por lo tanto, se necesita un biomarcador que ayude en las decisiones de tratamiento para el glaucoma.
Con el fin de identificar un biomarcador para el glaucoma, los inventores buscaron identificar un biomarcador que refleje la muerte de las células ganglionares de la retina (RGC). Se examinaron lágrimas, humor acuoso, vítreo y suero (plasma). Se realizó una matriz de citocinas que evaluó 88 genes mediante el uso de diferentes modelos de muerte de células de la retina (tabla 1). El análisis de los datos obtenidos de la matriz de citocinas reveló que 8 genes estaban regulados positivamente en el modelo de aplastamiento del nervio óptico (ONC) y 0 genes estaban regulados negativamente, 15 genes estaban regulados positivamente en el modelo de uveítis inducida por endotoxinas (EIU) y 1 gen estaba regulado negativamente y 22 genes estaban regulados positivamente en el modelo de degeneración retiniana inducida por exposición a la luz (LE) y 8 genes estaban regulados negativamente. La Figura 1 muestra los genes regulados positivamente que se superponen entre los diferentes modelos de enfermedades. Un gen está regulado positivamente de manera específica en ONC, pero no en EIU o LE. La tabla 2 presenta una lista de estos genes que muestra que gdf15 solo está regulado positivamente en ONC. La Figura 2muestra los genes regulados negativamente que se superponen entre los diferentes modelos de enfermedades y la tabla 3 presenta una lista de estos genes.
Dado que gdf15 era exclusivo de ONC, el perfil de expresión de gdf15 se evaluó además en cada uno de los modelos de enfermedad. La Figura 3 muestra los niveles de expresión génica de gdf15 en ONC (Figura 3A), EIU (Figura 3B) y LE (Figura 3C). La expresión génica de Gdg15 solo está regulada positivamente en el modelo ONC. En comparación, tgfb2 es equivalente al control en todos los modelos (Figura 4a , Figura 4B, Figura 4C). Estos resultados confirmaron que la expresión génica de gdf15 es específica de ONC.
Gdf es parte de la superfamilia tgfb. Para determinar si otros miembros de la familia gdf fueron alterados en ONC, la expresión génica de gdfl, gdf2, gdf3, gdf5, gdf6, gdf7, gdf8, gdf9, gdf10 y gdf11 se evaluó a las 24 horas en el modelo ONC. La Figura 5A, la Figura 5B, la Figura 5C, la Figura 5D, la Figura 5E, la Figura 5F, la Figura 5G, la Figura 5H, la Figura 5I y la Figura 5J muestran que ninguno de los otros genes gdf están alterados en el modelo ONC.
Dado que la expresión génica de gdf15 está regulada positivamente en ONC, se determinó si los niveles elevados de proteína GDF15 son detectables en el humor acuoso en un modelo de ratón de ONC. Mediante el uso de un ensayo ELISA para detectar la proteína GDF15, se encontró que la proteína GDF15 estaba elevada en el modelo de ratón de ONC (Figura 6). Luego se evaluó la expresión de proteína GDF15 y ácido nucleico gdf15 en un modelo de rata de ONC. La evaluación de la expresión de ácidos nucleicos gdf15 y tgfb2 mostró que gdf15 estaba regulado positivamente de manera significativa en ONC y tgfb2 se mantuvo sin cambios en ONC (Figura 7A, Figura 7B). Adicionalmente, la evaluación de la expresión de la proteína GDF15 a través de un ensayo ELISA realizado en el humor acuoso mostró que la proteína GDF15 también está regulada positivamente en el modelo de rata de ONC (Figura 7C).
Luego se evaluó la expresión de ácido nucleico de gdf15 en diversas regiones dentro del ojo. Específicamente, se evaluó la expresión de gdf15 en el segmento anterior cristalino y retina. Los resultados mostraron que a las 6 horas no hubo una regulación positiva significativa en ningún tejido ocular (Figura 8A, Figura 8B, Figura 8C). Sin embargo, a las 24 horas, la expresión de gdf15 estaba regulada positivamente de manera significativa en la retina (Figura 8F), pero no en el segmento anterior ni en el cristalino (Figura 8D, Figura 8E, respectivamente). Estos datos sugieren que la expresión de gdf15 es específica de la retina. Además, mediante el uso de la hibridación in situ (ISH), se observa fácilmente que GDF15 está regulada positivamente de manera específica en la capa de células ganglionares (GCL) con relación a la capa nuclear externa (ONL) y la capa nuclear interna (INL) en el modelo ONC (Figura 12).
A continuación, se determinó si la expresión de GDF15 podría estar relacionada con un aumento de macrófagos en el modelo de la enfermedad. Se usó antígeno F4/80 para detectar macrófagos. La Figura 9A muestra que no hay una diferencia significativa en los macrófagos en el control frente al modelo ONC. Por el contrario, los modelos EIU y
LE muestran un aumento significativo de macrófagos con relación al control (Figura 9B, Figura 9C, respectivamente).
El modelo de nervio aplastado es un modelo de lesión aguda en las células ganglionares de la retina. Aunque este modelo se usa para estudiar el glaucoma, no puede saberse que este modelo recapitule lo que ocurre en el glaucoma, ya que el glaucoma es una enfermedad crónica y, por lo tanto, da como resultado una lesión crónica en las células ganglionares de la retina. Por lo tanto, dado que no puede saberse que la regulación positiva de GDF15 en ONC se traduce en una regulación positiva en el glaucoma humano, se evaluaron muestras humanas para determinar la expresión de la proteína GDF15. Se recolectó humor acuoso de pacientes con glaucoma y se midió la cantidad de GDF15 mediante ELISA. La Figura 10 muestra que hubo un aumento significativo en la expresión de GDF15 en los pacientes con glaucoma con relación a los pacientes de control. En consecuencia, estos resultados pudieron mostrar que GDF15 está regulada positivamente en el glaucoma humano. Es importante destacar que demostramos que la expresión de GDF15 se correlacionaba con la gravedad de la enfermedad (Figura 11). A medida que la gravedad del glaucoma avanzaba desde el grado I hasta el grado II y el grado III, aumentaba la cantidad de GDF15 detectada. En consecuencia, estos resultados demuestran que GDF15 será un marcador sensible y específico de la progresión del glaucoma y guiará la toma de decisiones terapéuticas.
Claims (16)
1. Un método para determinar la gravedad del glaucoma en un sujeto diagnosticado con glaucoma, el método comprende:
a) medir la cantidad de ácido nucleico de factor de crecimiento/diferenciación 15 (gdf15) o proteína GDF15 en una muestra biológica obtenida del sujeto, en donde la muestra es de humor acuoso o comprende tejido de la retina;
b) comparar la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en la muestra biológica con un valor de referencia; y
c) determinar la gravedad del glaucoma en base a la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 con relación al valor de referencia, en donde cuanto mayor sea el aumento en la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en la muestra biológica con relación al valor de referencia, mayor es la gravedad del glaucoma.
2. El método de la reivindicación 1, en donde se determina que el sujeto tiene glaucoma de grado I, grado II o grado III en base a la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 con relación al valor de referencia, y/o en donde la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 por encima del valor de referencia indica glaucoma de grado I, grado II o grado III, y en donde el sujeto se trata además en base al grado de glaucoma.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la muestra biológica es humor acuoso o comprende tejido de la retina, y en donde el humor acuoso se recolecta al comienzo de la cirugía.
4. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde una cantidad de proteína GDF15 de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 80 pg/ml indica glaucoma de grado I; una cantidad de proteína GDF15 de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 160 pg/ml indica glaucoma de grado II y una cantidad de proteína GDF15 de aproximadamente 160 pg/ml o mayor indica glaucoma de grado III, en donde la muestra es humor acuoso puro.
5. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde una cantidad de proteína GDF15 de aproximadamente 46,4 ± 12,1 pg/ml indica glaucoma de grado I; una cantidad de proteína GDF15 de aproximadamente 129,5 ± 38,0 pg/ml indica glaucoma de grado II y una cantidad de proteína GDF15 de aproximadamente 190 ± 48,7 pg/ml o mayor indica glaucoma de grado III, en donde la muestra es humor acuoso puro.
6. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el sujeto se trata en base a la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 por encima del valor de referencia.
7. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el valor de referencia es de aproximadamente 20 pg/ml y la muestra es humor acuoso puro o en donde el valor de referencia es de aproximadamente 8,9 ± 7,7 pg/ml y la muestra es humor acuoso puro.
8. Un método para determinar el tratamiento en un sujeto diagnosticado con glaucoma, el método comprende: a) medir la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en una muestra biológica obtenida del sujeto, en donde la muestra es de humor acuoso o comprende tejido de la retina;
b) comparar la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 en la muestra biológica con un valor de referencia, en donde la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 por encima del valor de referencia indica la gravedad del glaucoma; y
c) determinar el tratamiento del sujeto en base a la gravedad del glaucoma detectado.
9. El método de la reivindicación 8, en donde se determina que el sujeto tiene glaucoma de grado I, grado II o grado III en base a la cantidad de ácido nucleico de gdf15 o proteína GDF15 con relación a el valor de referencia.
10. El método de la reivindicación 8 o 9, en donde una cantidad de proteína GDF15 de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 80 pg/ml indica glaucoma de grado I; una cantidad de proteína GDF15 de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 160 pg/ml indica glaucoma de grado II y una cantidad de proteína GDF15 de aproximadamente 160 pg/ml o mayor indica glaucoma de grado III, y en donde la muestra es humor acuoso puro.
11. El método de la reivindicación 9 o 10, en donde el sujeto se trata en base al grado de glaucoma y/u opcionalmente en donde el tratamiento se selecciona del grupo que consiste en gotas para los ojos, píldoras, cirugía con láser, cirugía de incisión y sus combinaciones.
12. Un método para monitorear la progresión del glaucoma en un sujeto, el método comprende:
a) medir la cantidad de proteína GDF15 en una primera muestra biológica obtenida del sujeto, en donde la muestra es de humor acuoso;
b) medir la cantidad de proteína GDF15 en una segunda muestra biológica obtenida del sujeto en un momento posterior, en donde la muestra es de humor acuoso;
c) comparar la cantidad de proteína GDF15 en la segunda muestra biológica con la cantidad de proteína GDF15 en la primera muestra biológica; y
d) determinar la progresión del glaucoma si la cantidad de proteína GDF15 en la segunda muestra biológica aumenta con relación a la cantidad de proteína GDF15 en la primera muestra biológica y ambas cantidades son superiores a los valores de referencia normales para GDF15 en el humor acuoso.
13. Un método para monitorear la respuesta al tratamiento del glaucoma en un sujeto, el método comprende:
a) medir la cantidad de proteína GDF15 en una primera muestra biológica obtenida del sujeto, en donde la muestra es de humor acuoso;
b) medir la cantidad de proteína GDF15 en una segunda muestra biológica obtenida del sujeto en un momento posterior, en donde la muestra es de humor acuoso;
c) comparar la cantidad de proteína GDF15 en la segunda muestra biológica con la cantidad de proteína GDF15 en la primera muestra biológica; y
d) determinar la respuesta al tratamiento si la cantidad de proteína GDF15 en la segunda muestra biológica disminuye con relación a la cantidad de proteína GDF15 en la primera muestra biológica, en donde una disminución en la cantidad de GDF15 entre la primera muestra y la segunda muestra indica que el sujeto responde al tratamiento.
14. El método de la reivindicación 12 o 13, en donde una cantidad de proteína GDF15 en la primera muestra o segunda muestra de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 80 pg/ml indica glaucoma de grado I; una cantidad de proteína GDF15 de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 160 pg/ml indica glaucoma de grado II y una cantidad de proteína GDF15 de aproximadamente 160 pg/ml o mayor indica glaucoma de grado III, en donde la muestra es humor acuoso puro.
15. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la cantidad de proteína GDF15 se detecta mediante un método seleccionado del grupo que consiste en un inmunoensayo, un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA), un ensayo basado en fluorescencia, un fluoroinmunoensayo de lantánidos potenciado por disociación (DELFIA), un ensayo radiométrico, un inmunoensayo múltiple y un ensayo de perlas de citometría (CBA).
16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el valor de referencia es la cantidad de GDF15 en una muestra o muestras de humor acuoso o que comprenden tejido de la retina, obtenidas de un sujeto sano.
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