CN111574597B - 一种经大分子量peg修饰的抗hiv多肽及其制备方法和用途 - Google Patents

一种经大分子量peg修饰的抗hiv多肽及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及经PEG修饰的抗HIV多肽。具体而言，在C34多肽的N端、C端或第10位添加半胱氨酸，并通过Michael加成反应将具有马来酰胺修饰的聚乙二醇基团偶联至所述半胱氨酸，对C34多肽进行PEG化修饰，其中，PEG部分的分子量为10000以上，优选为10000‑100000，更优选为10000‑50000。该经修饰的C34肽具有明显增加的水溶性和大鼠血浆半衰期，更易进入淋巴结且对急性感染SHIVSF162P3的恒河猴具有较强的抗HIV病毒活性。本发明还涉及该经PEG修饰的抗HIV多肽的制备方法及用途。

Description

一种经大分子量PEG修饰的抗HIV多肽及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及经聚乙二醇(PEG)修饰的抗HIV多肽及其制备方法和用途。
背景技术
艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的具有极高致死率的疾病，HIV会导致全身免疫系统的严重损害，给人类生命健康安全造成极大威胁。自1981年首次被发现以来，其防治一直没能获得有效的解决。目前在全球范围内艾滋病已经呈现出了爆发性流行的趋势，全世界HIV携带者已达到3400万人左右。据我国卫生部统计估算，截至2011年底，中国存活艾滋病病毒携带者和艾滋病病人(PLHIV)已达到78万人(62～94万人)。由于该病毒的高突变率，目前尚未寻找到有效的治愈艾滋病的方法。
目前上市的HIV的治疗性药物多为针对病毒逆转录酶、整合酶、蛋白酶等的一些小分子酶抑制剂。由于HIV的超高突变性，使得这些小分子特效药物正在逐渐退化为常效、甚至无效药物。近年来，随着HIV入侵宿主细胞分子机制的逐步阐明，抑制该过程的多肽药物逐渐成为艾滋病防治领域的研究热点。这类多肽药物例如第一代侵入抑制剂C34和T20，其作用机理在于可特异性结合HIV囊膜上的融合蛋白，从而抑制病毒进入宿主细胞。
C34分子被用作第一代融合抑制剂，其存在水溶性差和半衰期短等问题，许多学者曾对C34分子进行多种基团修饰来改善这些问题，但关于大分子修饰的研究较少。
本课题组在专利申请201810547641.7公开了经修饰的C34肽，其中，经PEG化修饰的C34肽的水溶性由≤1mg/mL提高至3mg/mL以上，从而延长了C34分子在大鼠体内的血浆半衰期。该研究主要集中在PEG分子量为700-5000的修饰。
本发明人经过进一步的研究发现，以更大分子量的PEG对C34肽进行PEG修饰，可使其水溶性获得很大程度的改善，在SD大鼠体内的血浆半衰期得到明显延长，且对急性感染SHIV病毒的恒河猴有显著的保护效果。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种经修饰的C34肽，所述经修饰的C34肽具有式I的结构：
Ac-BpWMEWDREINNcBdYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLBq-NH2式I；
其中，c为0或1；d为0或1；p为0或1；q为0或1；c和d不同时为0；p、q和d不同时为0；Ac表示式I肽链的N端带有乙酰化修饰；NH2表示式I肽链的C端带有酰胺化修饰；B为式II的基团
Figure BDA0002480047480000021
式II中，Z为半胱氨酸，所述半胱氨酸通过酰胺键与式I肽链中的氨基酸相连；Y为式III的基团：
mPEG 式III；
式III中，m为甲氧基，
其中，所述PEG的分子量为10000以上。
在优选地实施方式中，所述PEG的分子量为约10000-100000，优选为10000-50000。
在第二方面，本发明提供了制备如第一方面所述的经PEG修饰的C34肽的方法，所述方法包括：
(1)提供式V以及式VI的化合物
Figure BDA0002480047480000022
Ac-ZpWMEWDREINNcZdYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLZq-NH2 式VI；
式VI中，Z为半胱氨酸，所述半胱氨酸通过酰胺键与式VI肽链中的氨基酸相连；c为0或1；d为0或1；p为0或1；q为0或1；c和d不同时为0；p、q和d不同时为0；Ac表示式VI肽链的N端带有乙酰化修饰；NH2表示式VI肽链的C端带有酰胺化修饰；
式V中，Y为式III的基团：
mPEG 式III；
式III中，m为甲氧基，其中，所述PEG的分子量为10000以上；
(2)使得式VI化合物中Z的巯基与式V中的马来酰胺发生加成反应，获得所述经PEG修饰的C34肽。
在第三方面，本发明提供了第一方面所述的经PEG修饰的C34肽在制备抗HIV病毒的药物中的应用。
在第四方面，本发明提供了第一方面所述的经PEG修饰的C34肽在制备抗HIV病毒的药物组合物中的应用。
有益效果
本发明人发现相比现有技术中报道的PEG修饰的C34肽，采用分子量更大的PEG(例如，分子量在10000以上的PEG)修饰的C34肽具有明显增加的水溶性和大鼠血浆半衰期，更易进入淋巴结且对急性感染SHIVSF162P3的恒河猴具有较强的抗HIV病毒活性。尤其是PEG40k修饰的C34肽，相比具有更小分子量的PEG(PEG2000、PEG5000等)修饰的C34肽，其水溶性以及体内半衰期得到明显改善，这使得其更易于成药，并且使得C34肽的体内长效稳定性得到显著提升。
附图说明
图1为根据实施例1制备的PEG10kNC的MALDI-TOF质谱图。
图2为根据实施例2制备的PEG20kNC的MALDI-TOF质谱图。
图3为根据实施例3制备的PEG40kNC的MALDI-TOF质谱图。
图4为示出了使用给药后各个时间点采集的大鼠血清抑制50％病毒所需的稀释度的图。
图5为示出了给药后各个时间点采集的大鼠血清中C34NC或PEG40KNC的浓度的图。
图6为示出了病毒感染后不同时间点PEG40KNC实验组和生理盐水对照组的血浆SHIV RNA载量的图。
具体实施方式
在下面详细描述本发明之前，应理解的是，本发明并不局限于本文所述的特定的方法、方案和试剂，因为它们还可有所变化。还应理解的是，本文使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅为所附的权利要求所限。
不论在上文或下文中，本文引用的各文献(包括全部专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、使用说明等)均通过引用的方式整体并入本文。
除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
本文使用的术语“C34多肽”、“C34肽”或“C34”是由HIV-1跨膜蛋白gp41的CHR(C-端七价重复序列，C-terminal heptad repeat)区衍生而来的多肽，通过结合到gp41的NHR(N-端七价重复序列，N-terminal heptad repeat)区而抑制6-螺旋束的形成，从而阻止病毒的入侵。C34肽是抗HIV的第一代融合抑制剂。本领域中常用的C34肽具有如下的氨基酸序列：Ac-WMEWD REINN YTSLI HSLIE ESQNQ QEKNE QELL-NH2(SEQ ID NO:1)，其中，Ac和NH2分别表示在肽链的N端进行乙酰化修饰和在C端进行酰胺化修饰。
C34上的第10位氨基酸N是HIV跨膜蛋白gp41的C端多肽上的一个保守的天然糖基化位点。根据专利申请201810547641.7所证实的，在C34肽的N端、C端或第10位添加一个或多个半胱氨酸，并通过Michael加成反应将具有马来酰胺修饰的聚乙二醇基团偶联至该半胱氨酸，不影响C34肽的抗HIV活性。
如本文中所定义，将PEG定义为聚乙二醇(PEG)，一种广泛应用于工业生产和医学的聚醚化合物。PEG通过聚合环氧乙烷制备，并且在300g/mol至10,000,000g/mol的宽分子量范围都是可市售的。尽管具有不同分子量的PEG用于不同的应用，并且具有不同的物理特性例如粘度，归因于链长作用，其化学特性几乎是相同的。取决于用于聚合方法的引发剂，不同形式的PEG也是可得到的，最常见的PEG是单功能甲醚PEG(甲氧基聚乙二醇)，缩写为mPEG。还可以得到具有不同几何形状的PEG。分枝状或星状PEG具有从中央核心基团散发的约3至100个PEG链(臂)。梳状PEG具有通常接枝到聚合物骨架的多个PEG链。可以将任一此类PEG聚合物用于如上所定义的本发明PEG修饰的C34肽。在本发明上下文中，术语“PEG”或“PEG聚合物”优选地包含任一以上定义的聚合物。
因此，在本发明上下文中，用于如上所定义的本发明的经PEG修饰的C34肽的PEG/PEG聚合物优选地选自如上所定义的PEG聚合物，优选地在约10000g/mol至100000g/mol的分子量内，更优选地在约10000至50000Da的分子量内等，最优选地在约10k至50kDa的分子量内，例如在约10k至约40kDa的分子量内，例如约10kDa、约20kDa、约30kDa、约40kDa、约50kDa。更优选地，用于如上所定义的本发明的经PEG修饰的C34肽的PEG/PEG聚合物可选自如上所定义的任一PEG聚合物，并可具有不同的几何形状，例如如本文中所定义的具有从中央核心基团散发的约3至10个PEG链的分枝状PEG或者例如具有从中央核心基团散发的约10至100个PEG链的星状PEG。甚至更优选地，用于如上所定义的本发明的经PEG修饰的C34肽的PEG/PEG聚合物可选自如在本文中所定义的任一此类PEG聚合物，更优选地选自具有如上所定义的分子量的PEG聚合物，并且优选地，具有如本文中所定义的不同的几何形状，例如如具有从中央核心基团散发的约3至约10个PEG链(臂)，优选地具有从中央核心基团散发的约3至约5个PEG链(臂)的分枝状PEG。特别优选地用于如上所定义的本发明的分枝状PEG可以是如上所定义的PEG聚合物，其具有从中央核心基团散发的3、4、5、6、7、8、9、10或者更多的链(臂)。
在本发明中，除非另有明确说明，PEG的分子量意指PEG的平均分子量。
本发明的所述经修饰的C34肽具有式I的结构：
Ac-BpWMEWDREINNcBdYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLBq-NH2 式I；
其中，c为0或1；d为0或1；p为0或1；q为0或1；c和d不同时为0；p、q和d不同时为0；Ac表示式I肽链的N端带有乙酰化修饰；NH2表示式I肽链的C端带有酰胺化修饰；B为式II的基团
Figure BDA0002480047480000051
式II中，Z为半胱氨酸，所述半胱氨酸通过酰胺键与式I肽链中的氨基酸相连；Y为式III的基团：
mPEG 式III；
式III中，m为甲氧基，
其中，所述PEG的分子量为10000以上、优选10000-100000、更优选10000-50000。
在优选的实施方式中，p、q和d之和为1。
在优选的实施方式中，c为0，d为1。在优选的实施方式中，c为0，d为1，并且p和q均为0。
在优选的实施方式中，c为1，d为0；并且p和q之一为1，另一个为0。例如，c为1，d为0；并且p为1，q为0。例如，c为1，d为0；并且p为0，q为1。
在本发明中，当所述PEG为如上所述的分枝状PEG时，在连接有N-取代的马来酰胺之外的所有PEG链末端均具有甲氧基。
例如，在一个实施方式中，式II中的Y可为下式所示的PEG或PEG聚合物中的一种或多种：
Figure BDA0002480047480000061
/>
其中，n为整数，n的取值取决于所需的PEG的分子量，并且在上述式中，n可彼此相同或不同。
在优选的实施方式中，本发明所述的经PEG修饰的C34肽具有选自于如下的任一种结构：
Figure BDA0002480047480000062
/>
Figure BDA0002480047480000071
在更优选的实施方式中，本发明所述的经PEG修饰的C34肽具有选自于如下的任一种结构：
Figure BDA0002480047480000081
在上述结构中，PEG10000、PEG20000、PEG40000和/或PEG10K、PEG20K、PEG40K分别指平均分子量为10000、20000和40000的聚乙二醇。
在另一方面，本发明提供了制备如第一方面所述的经PEG修饰的C34肽的方法，所述方法包括：
(1)提供式V以及式VI的化合物
Figure BDA0002480047480000082
Ac-ZpWMEWDREINNcZdYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLZq-NH2 式VI；
式VI中，Z为半胱氨酸，所述半胱氨酸通过酰胺键与式VI肽链中的氨基酸相连；c为0或1；d为0或1；p为0或1；q为0或1；c和d不同时为0；p、q和d不同时为0；Ac表示式VI肽链的N端带有乙酰化修饰；NH2表示式VI肽链的C端带有酰胺化修饰；
式V中，Y为式III的基团：
mPEG 式III；
式III中，m为甲氧基，其中，所述PEG的分子量为10000以上；
(2)使得式VI化合物中Z的巯基与式V中的马来酰胺发生加成反应，获得所述经PEG修饰的C34肽。
在本发明中，Y(即式III)所示的PEG如上所定义。可根据需求，通过商购获得不同分子量的PEG。在本发明中，可基于现有技术合成式V所示的化合物。
在本发明中，所述式VI的化合物具有如下的任一序列：
Ac-CWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH2 (SEQ ID NO:2)；
Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLC-NH2 (SEQ ID NO:3)；
Ac-WMEWDREINCYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH2 (SEQ ID NO:4)。
优选地，所述加成反应在8.0-9.0的pH下进行。在一些方式中，所述加成反应在8.0、8.5或9.0的pH下进行。最优选地，所述加成反应在8.5的pH下进行。
优选地，所述加成反应在室温(例如20℃-30℃)下进行。
优选地，所述加成反应在缓冲液中进行。优选地，所述缓冲液为弱酸和/或弱碱盐缓冲液、例如为磷酸盐缓冲液。优选地，所述磷酸盐缓冲液为50mM磷酸二氢钠和50mM磷酸氢二钠混合后的水溶液。
本发明的经PEG修饰的C34肽具有抗HIV病毒(HIV-1NL4-3型病毒)的活性。可将本发明的经PEG修饰的C34肽用于治疗和/或预防艾滋病。就这一点而言，本发明的经PEG修饰的C34肽可作为药物或疫苗的活性成分。
本发明还提供了根据本发明的经PEG修饰的C34多肽在制备抗HIV病毒药物组合物中的应用，其中所述经PEG修饰的C34肽作为活性成分。
本文所述各方面的实施方式可由如下编号的段落说明：
1.一种经PEG修饰的C34肽，所述经PEG修饰的C34肽具有式I的结构：
Ac-BpWMEWDREINNcBdYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLBq-NH2式I；
其中，c为0或1；d为0或1；p为0或1；q为0或1；c和d不同时为0；p、q和d不同时为0；Ac表示式I肽链的N端带有乙酰化修饰；NH2表示式I肽链的C端带有酰胺化修饰；B为式II的基团
Figure BDA0002480047480000101
式II中，Z为半胱氨酸，所述半胱氨酸通过酰胺键与式I肽链中的氨基酸相连；Y为式III的基团：
mPEG 式III；
式III中，m为甲氧基，
其中，所述PEG的分子量为10000以上。
2.如段落1所述的经PEG修饰的C34肽，其特征在于，式I中，p、q、d不同时为1。
3.如段落1或2所述的经PEG修饰的C34肽，其特征在于，式I中，c、d不同时为1。
4.如段落3所述的经PEG修饰的C34肽，其特征在于，式I中，d为1，c、p、q为0。
5.如段落1-4中任一项所述的经PEG修饰的C34肽，其特征在于，所述PEG分子量为约10000-100000。
6.如段落5所述的PEG经修饰的C34肽，其特征在于，所述PEG的分子量为10000-50000。
7.如段落6所述的经PEG修饰的C34肽，其特征在于，所述PEG的分子量为10000-40000。
8.如段落5所述的经PEG修饰的C34肽，所述经PEG修饰的C34肽具有如下的任一种结构：
Figure BDA0002480047480000102
Figure BDA0002480047480000111
/>
Figure BDA0002480047480000112
以及
Figure BDA0002480047480000121
9.如段落1-4中任一项所述的经PEG修饰的C34肽，其特征在于，式II中，Y为以下中的一种或多种：
Figure BDA0002480047480000122
其中，n为不为0的整数。
10.如段落9所述的经PEG修饰的C34肽，所述经PEG修饰的C34肽具有如下的任一种结构：
Figure BDA0002480047480000123
/>
Figure BDA0002480047480000131
11.制备如段落1-10中任一项所述的经PEG修饰的C34肽的方法，所述方法包括：
(1)提供式V以及式VI的化合物
Figure BDA0002480047480000132
Ac-ZpWMEWDREINNcZdYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLZq-NH2 式VI；
式VI中，Z为半胱氨酸，所述半胱氨酸通过酰胺键与式VI肽链中的氨基酸相连；c为0或1；d为0或1；p为0或1；q为0或1；c和d不同时为0；p、q和d不同时为0；Ac表示式VI肽链的N端带有乙酰化修饰；NH2表示式VI肽链的C端带有酰胺化修饰；
式V中，Y为式III的基团：
mPEG 式III；
式III中，m为甲氧基，其中，所述PEG的分子量为10000以上；
(2)使得式VI化合物中Z的巯基与式V中的马来酰胺发生加成反应，获得所述经PEG修饰的C34肽。
12.如段落11所述的方法，其特征在于，所述加成反应在7.2-9.5的pH下进行。
13.如段落14所述的方法，其特征在于，所述加成反应在7.2、8.0或9.5的pH下进行。
14.如段落11-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述加成反应在室温下进行。
15.如段落11-14中所述的方法，其特征在于，所述加成反应在磷酸盐缓冲液中进行。
16.如段落11-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述式VI的化合物具有如下的任一序列：
Ac-CWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH2；
Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLC-NH2；以及
Ac-WMEWDREINCYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH2。
17.如段落11-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述式V的化合物具有如下的结构中的一种或多种：
Figure BDA0002480047480000141
以及
Figure BDA0002480047480000142
其中，n为大于0的整数。
18.如段落1-10中任一项所述的经PEG修饰的C34肽在制备抗HIV的药物组合物中的用途。
19.如段落20所述的用途，其中，所述HIV为HIV-1NL4-3型病毒。
20.如段落1-10中任一项所述的经PEG修饰的C34肽在制备预防或治疗艾滋病的药物组合物中的用途。
21.如段落18-20中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
22.如段落1-10中任一项所述的经PEG修饰的C34肽在制备预防或治疗艾滋病的疫苗中的用途。
实施例
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或可参照文献制备的物质。下述实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为分析纯级别。
下述实施例中如无特殊说明，所述室温反应具体为将反应温度控制在20℃-30℃范围内，包括20℃和30℃。
材料：
由北京中科亚光生物科技有限公司合成以下序列：C34以及【Ac-WMEWD REIN CYTSLI HSLIE ESQNQ QEKNE QELL-NH2】(SEQ ID NO:4)(下文称为“多肽C34NC”)，纯度为98％。
化合物mPEG10kMal、mPEG20kMal和mPEG40kMal购自赛诺邦格生物科技股份有限公司，纯度为95％。
mPEG10kMal、mPEG20kMal和mPEG40kMal的分子式如下所示：
Figure BDA0002480047480000151
其中，n为大于零的整数，使得PEG部分的分子量分别为10000、20000和40000。
磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液：50mM磷酸二氢钠，50mM磷酸氢二钠，溶于水，pH为8.0-9.0。
质谱采用MALDI-TOF质谱仪质谱仪。
实施例1：PEG化多肽PEG10kNC的制备
室温下，将10mg(0.005mmol)mPEG10kMal与10mg(0.0025mmol)多肽C34NC的混合物溶于10mL的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液(50mM，pH8.0-9.0)中，通过HPLC监测反应，直至多肽C34NC反应完全。
采用安捷伦1200反相高效液相色谱仪对所获得的经PEG修饰的多肽进行纯化。色谱柱型号：Angilent Eclipse XDB-C8 Semi-Prep，5μm，9.4×250mm；洗脱液组成：流动相A(含体积百分浓度为0.1％的三氟乙酸的水溶液)，流动相B(含体积百分浓度为0.1％的三氟乙酸的乙腈溶液)；洗脱条件：A从40％到70％线性梯度洗脱，时间11min，洗脱流速为2mL/min，紫外检测波长220nm。收集目标多肽的峰，冷冻干燥得到蓬松状态的PEG化多肽PEG10kNC纯品。
所得PEG10kNC的结构为：
Figure BDA0002480047480000161
/>
PEG10kNC的结构经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)表征验证其正确性，质谱图如图1所示。采用安捷伦1200分析型高效液相色谱仪检测PEG10kNC的纯度。色谱柱的型号：Angilent Eclipse XDB-C18 Analytical，5μm，4.6×150mm。洗脱液：流动相A(含体积百分浓度为0.1％的三氟乙酸的水溶液)和流动相B(含体积百分浓度为0.1％的三氟乙酸的乙腈溶液)；洗脱条件：由10％A到100％A线性梯度洗脱，时间25min，洗脱流速为1mL/min，紫外检测波长220nm。分析型高效液相色谱仪检测结果显示，所得PEG10kNC的纯度为96％。
实施例2：PEG化的多肽PEG20kNC的制备
除将实施例1中的mPEG10kMal换成mPEG20kMal外，按照实施例1中的方法制备、纯化以及表征，得到PEG20kNC(纯度为97.5％)，质谱结果如图2所示。
所得PEG20kNC的结构为：
Figure BDA0002480047480000162
实施例3：PEG化的多肽PEG40kNC的制备
除将实施例1中的mPEG10kMal换成mPEG40kMal外，按照实施例1中的方法制备、纯化以及表征，得到PEG40kNC(纯度为98％)，质谱结果如图3所示。
所得PEG40kNC的结构为：
Figure BDA0002480047480000171
效果例1：PEG修饰的C34肽的水溶性
对实施例1-实施例3获得的经PEG修饰的C34肽进行水溶性评价。
将1mg的C34溶解于1mL的蒸馏水中，溶液中见明显浑浊，超声后仍无变化，可见C34在水中的浓度<1mg/mL。
而分别将20mg的PEG10KNC、PEG20KNC、PEG40KNC溶解于100μL的蒸馏水中，溶液澄清，可见本发明所制备的经大分子量PEG修饰的C34在水中的浓度可达200mg/mL。在相同的条件下，专利申请201810547641.7制备的C34NCPEG2000(PEG分子量为2000)在水中的浓度最多可为10mg/mL。
因此，经大分子量PEG(分子量在10000以上)修饰的C34的水溶性明显大于未经修饰的C34，也大于以较小的分子量进行PEG化修饰的C34(例如，分子量低于10000，包括2000、5000等)。
效果例2：本发明的经PEG修饰的多肽对HIV-1NL4-3型病毒的体外抑制作用
为了评估由实施例1-实施例3制备的抗HIV多肽对HIV病毒的抑制作用，在HIV-1NL4-3型病毒中进行了测试。HIV-1NL4-3型病毒从NIH AIDS Research and ReferenceReagent Program获得。
将TZM-bl细胞(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)以104/孔接种于96孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。培养基为DMEM培养基。用DMEM培养基将肽样品(即实施例1-实施例3制备的PEG10KNC、PEG20KNC和PEG40KNC，以及C34和C34NC)稀释成8个稀释度(浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5nM)。用DEAE培养液(含20μg/ml的DEAE-dextran)将待测病毒(即HIV-1NL4-3型病毒)稀释成2000TICD50/mL。弃去96孔板中的培养基，依次缓慢加入稀释后的药物，每孔100μL并设3个复孔。接着将稀释好的HIV-1NL4-3病毒缓慢加入各孔中，每孔100μL(即200TICD50/孔)。同时设立病毒对照组(VC，仅加入100μL的DMEM培养基和100μL的稀释后的病毒)和细胞对照组(CC，仅加入200μL的DMEM培养基)。
将96孔板四周贴好封口膜，置于37℃，5％CO2培养箱中培养48小时，然后取出96孔板，每孔吸取100μL培养液，加入100μL发光检测液(Perkin Elmer公司)，室温避光放置2min，吸取150μL上清转移至黑色96孔板中，于发光检测仪(1420VICTOR D MultilabelCounter，型号1420-020)中检测，获得各个样品的发光值。
根据Reed and Muench法计算药物的抑制率，其中发光值为使用3个复孔所测发光值的均值：
Figure BDA0002480047480000181
然后根据获得的抑制率使用GraphPad Prism Software 5.0软件的非线性回归计算每种多肽样品的EC50值和EC90值。结果如表1所示。
表1：各样品的EC50值和EC90值
肽样品 EC<sub>50</sub>(nM) EC<sub>90</sub>(nM)
C34 1.71±0.34 11.01±4.09
C34NC 0.67±0.29 3.80±0.62
PEG<sub>10K</sub>NC 7.10±4.42 57.97±20.64
PEG<sub>20K</sub>NC 22.20±13.42 101.42±24.04
PEG<sub>40K</sub>NC 18.51±10.87 132.49±31.59
表1的结果表明，因用于修饰的基团PEG的分子量(40K)大于C34的分子量(4K)，PEG化修饰C34之后，其体外抗HIVNL4-3活性有所下降，但从PEG10KNC、PEG20KNC、PEG40KNC的活性的变化趋势来看，PEG20KNC活性比PEG10KNC下降了两倍，同等情况下，PEG40KNC活性和PEG20KNC相比理论上也应下降两倍，但实际上相差不大甚至略高。考虑到分子量更高的PEG更易进入动物淋巴结，所以选择PEG40KNC研究其体内半衰期和抗病毒作用。
效果例4：PEG40KNC在SD大鼠体内的血浆半衰期
实验方法：
动物实验：试验动物为来自北京维通利华实验动物技术有限公司的SD大鼠(7周龄)，体重180-200克。将4只SD大鼠随机分为2组，每组2只(1只雄性和1只雌性)，用于收集血浆。每组大鼠分别以1.7μmol/kg的剂量单次皮下注射C34NC和PEG40KNC(生理盐水中加入少量pH 9.5的硼砂缓冲液作为增溶剂)。
样品采集：将给药前记为零时刻，分别在零时刻和给药后的不同时间点从尾静脉收集全血(300μL)，其中C34NC组的时间点为0.5h、1.0h、肝素钠2.0h、4.0h、6.0h、8.0h、10.0h；PEG40KNC组的时间点为3h、6h、9h、20h、23h、29h、48h、72h。将各全血样品加入含有50μL肝素钠(83U/Ml)和10μL抑肽酶(5ug/mL)的EP管中，4℃，4500g离心10min，收集上层血清样品并置于-80℃冰箱保存。
通过测定收集的血清样品对HIVNL4-3型病毒的体外抑制情况来推算不同时间点处样品的浓度。具体实验步骤如下：将生长良好的TZM-bl细胞消化后铺96孔板(104个/孔)，37℃，CO2培养箱过夜培养；第二天，用细胞完全培养基DMEM稀释血清，第一孔血清终稀释度为10倍稀释，然后依次连续2倍稀释，共8个稀释梯度；吸弃细胞培养基，每孔加入100μL稀释好的血清，每孔加入100μl含200TCID50的病毒，37℃，CO2培养48h；每孔小心吸弃100μL培养上清，加入100μL发光检测液(Perkin Elmer公司)，室温避光裂解2min，混匀后吸取150μl上清转移至黑色96孔板中检测荧光表达情况。计算50％抑制病毒感染所需的血清稀释度。
另外，各时间点药物浓度依据标准曲线得到，药动力学参数由Winnonlin药动力学软件中的非房室模型计算得出。
同时，基于相同的实验条件，对基于专利申请201810547641.7制备的C34NCPEG2000和C34NCPEG5000(即，由PEG2000修饰的C34肽和由PEG5000修饰的C34肽)的在SD大鼠体内的血浆半衰期进行了分析。
实验结果：各个时间点处50％抑制病毒感染所需的血清的稀释度以及C34NC或PEG40KNC在血清中的浓度分别如图4和图5所示。PEG40KNC的半衰期T1/2(h)为10.39h，而C34NCPEG2000和C34NCPEG5000的半衰期仅为2.59h和2.21h。在4h时，C34NC在血浆中已不存在，而PEG40KNC在70h后在血浆中仍存在。由此可知，多肽经PEG40K修饰后，在SD大鼠体内的血浆半衰期得到特别显著的延长，进而说明其药效在SD大鼠体内能得到明显延长。
效果例5：PEG40KNC对急性感染SHIVSF162P3的恒河猴的治疗作用
实验方法：
动物实验：筛选8只未感染SV、SIV、SRV-1或TB的成年中国恒河猴(3kg-4kg，购自中国医学科学院医学实验动物研究所)，之后以单次剂量100TCID50对8只恒河猴静脉注射SHIVSF162P3型病毒。将上述8只恒河猴随机分为急性感染治疗组(n＝4)和对照组(n＝4)，治疗组自接种病毒后第7天开始每天皮下注射1.38μmol/kg的PEG40KNC(生理盐水溶液)，连续注射28天；对照组自接种病毒后第7天开始每天用0.9％生理盐水溶液连续皮下注射28天。
样品采集：于接种病毒后的第1、4、7、11、14、18、21、25、28、32、36、42、49和70天采集恒河猴的血样。使用QIAmp病毒RNA minikit(Qiagen，Valencia，CA)从无细胞血浆中提取并纯化病毒RNA，之后用洗脱缓冲液(Qiagen，Valencia，CA)洗脱RNA并立即进行分析。通过实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)测定法测量在不同时间点感染了SHIV的恒河猴的血浆病毒载量，对每个样品进行双重测试反应，结果以log10RNA copies/mL为指标。RNA标准品(103-1013copies/ml)是实验室制备并保存的。实验中采用TaKaRa提供的一步PrimeScript RT-PCR Kit，实验仪器使用Perkin-Elmer ABI7500。
实验结果：
如图6所示，图中3log10 RNA copies/mL处的水平虚线表示测定的病毒载量的灵敏度极限。可见，在药物治疗过程中(病毒感染后7-36天)，PEG40KNC实验组的血浆SHIV RNA载量明显低于生理盐水对照组(P＝0.0126)，特别是在第11天，生理盐水组血浆SHIV RNA载量达到峰值(急性感染的建立)，而此时PEG40KNC实验组明显低于峰值，说明PEG40KNC能够显著降低急性感染SHIVSF162P3的恒河猴血浆中的病毒载量，从而对SHIVSF162P3的急性感染有显著的保护作用。
因此，本发明所提供的经大分子量的PEG修饰的C34肽能够更显著地增加C34肽的水溶性，并且具有显著延长的大鼠体内的血浆半衰期，且有较好的体内抗HIV活性。本发明提供的经大分子量PEG(分子量在10000以上)修饰的C34肽有望成为水溶性好且长效的抗HIV多肽药物。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所; 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心
<120> 一种经大分子量PEG修饰的抗HIV多肽及其制备方法和用途
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His
1 5 10 15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu
20 25 30
Leu Leu
<210> 2
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Cys Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile
1 5 10 15
His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln
20 25 30
Glu Leu Leu
35
<210> 3
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His
1 5 10 15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu
20 25 30
Leu Leu Cys
35
<210> 4
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Cys Tyr Thr Ser Leu Ile His
1 5 10 15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu
20 25 30
Leu Leu

Claims (12)

1.一种经PEG修饰的C34肽，所述经PEG修饰的C34肽具有式I的结构：
Ac-BpWMEWDREINNcBdYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLBq-NH2式I；
其中，c为0；d为1；p为0；q为0；Ac表示式I肽链的N端带有乙酰化修饰；NH2表示式I肽链的C端带有酰胺化修饰；B为式II的基团
Figure FDA0003979471720000011
式II中，Z为半胱氨酸，所述半胱氨酸通过酰胺键与式I肽链中的氨基酸相连；Y为式III的基团：
mPEG式III；
式III中，m为甲氧基，
其中，所述PEG的分子量为30000-40000；
式II中，Y为如下结构：
Figure FDA0003979471720000012
其中，n为不为0的整数。
2.如权利要求1所述的经PEG修饰的C34肽，其特征在于，所述经PEG修饰的C34肽具有如下的结构：
Figure FDA0003979471720000021
3.制备如权利要求1或2所述的经PEG修饰的C34肽的方法，所述方法包括：
(1)提供式V以及式VI的化合物
Figure FDA0003979471720000022
Ac-ZpWMEWDREINNcZdYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLZq-NH2式VI；
式VI中，Z为半胱氨酸，所述半胱氨酸通过酰胺键与式VI肽链中的氨基酸相连；c为0；d为1；p为0；q为0；Ac表示式VI肽链的N端带有乙酰化修饰；NH2表示式VI肽链的C端带有酰胺化修饰；
式V中，Y为式III的基团：
mPEG式III；
式III中，m为甲氧基，其中，所述PEG的分子量30000-40000；
式V的化合物具有如下的结构：
Figure FDA0003979471720000023
其中，n为大于0的整数；
(2)使得式VI化合物中Z的巯基与式V中的马来酰胺发生加成反应，获得所述经PEG修饰的C34肽。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述加成反应在7.2-9.5的pH下进行。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述加成反应在7.2、8.0或9.5的pH下进行。
6.如权利要求3-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述加成反应在20℃-30℃下进行。
7.如权利要求3-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述加成反应在磷酸盐缓冲液中进行。
8.如权利要求1或2所述的经PEG修饰的C34肽在制备抗HIV的药物组合物中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述HIV为HIV-1NL4-3型病毒。
10.如权利要求1或2所述的经PEG修饰的C34肽在制备预防或治疗艾滋病的药物组合物中的用途。
11.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1或2所述的经PEG修饰的C34肽，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
12.如权利要求1或2所述的经PEG修饰的C34肽在制备预防或治疗艾滋病的疫苗中的用途。
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