CN108178786B - 抗hiv多肽及它的长效抗hiv衍生物与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗HIV多肽及它的长效抗HIV衍生物与应用。该抗HIV多肽的名称为CT105M，其氨基酸序列为序列表中的序列1。其长效抗HIV衍生物的名称为CT105ML‑2，是该抗HIV多肽被马来酰亚胺修饰得到的化合物。实验证明，与CT105相比，CT105M和CT105ML‑2均保留了良好的抗病毒活性；CT105ML‑2的末端消除半衰期是CT105和CT105M的10倍。用本发明的CT105M制备的长效抑制HIV病毒与宿主细胞融合的修饰肽CT105ML‑2，水溶性好、活性高、半衰期长。

Description

抗HIV多肽及它的长效抗HIV衍生物与应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域中一种抗HIV多肽及它的长效抗HIV衍生物与应用。

背景技术

艾滋病，即获得性免疫缺陷综合症(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的传染病。虽然现有的抗病毒药物对于艾滋病的治疗取得了疗效并一定程度地抑制了艾滋病的蔓延，但到彻底消除病毒并终止艾滋病的传播仍距离尚远。此外药物治疗带来的重大经济负担，长期治疗的药物副作用以及病毒耐药株的出现等问题均增加了控制艾滋病的难度。

HIV-1与宿主细胞的融合是HIV-1感染的第一步。当病毒包膜蛋白gp120与细胞受体CD4及辅助受体CCR5、CXCR4结合后，gp41自我折叠，促使细胞膜与病毒包膜融合，从而导致病毒进入宿主细胞。针对融合过程的药物被称为融合抑制剂。

T20是目前为止唯一被批准上市的融合抑制剂。由于T20的多肽属性，该药在体内的代谢快，生物利用率低，患者需每日注射两针，且注射部位会出现红肿痛痒，甚至引起严重过敏，因此只用于耐药后的晚期治疗。此外T20较易产生耐药性，对靶点突变的敏感性较高。靶点的单个氨基酸突变就会导致T20活性降低。

此外，其他具有抗病毒活性多肽作为融合抑制剂也被研究。C34是一种衍生于gp41C末端重复序列(C-terminal heptad repeat,CHR)的多肽。X射线晶体衍射研究发现C34可以与来源于gp41N末端重复序列(N-terminal heptad repeat,NHR)的N36结合，形成六聚体。其”WWI”基序可以与gp41NHR高度保守的疏水口袋结合，因此不易产生耐药性。但由于C34水溶性极差，很难将其发展成为药物。因此C34常作为多肽融合抑制剂的模板进行新序列的设计。

申请号为201310671634.5、公开号为CN 103724404B的中国发明专利公开了抑制HIV与宿主细胞融合的非对映体多肽CT105，CT105与gp41NHR结合阻碍gp41核心区域形成六螺旋束，阻断病毒进入宿主细胞。CT105水溶性较好、活性高、不易被蛋白酶水解。

发明内容

公开号为CN 103724404B的中国发明专利多肽CT105尽管有良好的抗病毒活性，本申请的发明人在后续实验证明其生物利用率低，半衰期短。此外，其序列上的半胱氨酸残基含有还原型巯基，对后续修饰肽设计带来技术难题。

本发明所要解决的技术问题是如何延长CT105的半衰期。

为了延长CT105的半衰期，本发明将CT105中的半胱氨酸残基替换为谷氨酸残基，得到氨基酸序列为序列表中序列1的多肽，其名称为CT105M。CT105M或其药用盐均属于本发明的保护范围。

为了延长CT105的半衰期，本发明还提供了CT105M的衍生物或其药用盐。

本发明所提供的CT105M的衍生物或其药用盐中，所述衍生物可为d1-d7中任一种；

所述d1为CT105M被马来酰亚胺修饰得到的化合物；

所述d2为在所述d1的氨基末端连接氨基端保护基和/或在所述d1的羧基末端连接羧基端保护基得到的化合物；

所述d3为在CT105M的氨基末端连接氨基端保护基和/或在所述CT105M的羧基末端连接羧基端保护基得到的化合物；

所述d4为所述d1被蛋白质或聚乙二醇修饰得到的化合物；

所述d5为CT105M被蛋白质或聚乙二醇修饰得到的化合物；

所述d6为在所述d1的氨基末端和/或羧基末端连接亲脂性化基团得到的化合物；

所述d7为在CT105M的氨基末端和/或羧基末端连接亲脂性基团得到的化合物。

上述CT105M的衍生物或其药用盐中，所述d1中，通过将序列表中的序列1的第15位的赖氨酸残基与马来酰亚胺基团连接完成马来酰亚胺修饰(序列1中的其它氨基酸残基均没有与马来酰亚胺基团连接)。所述d1具体可为式Ⅰ所示的CT105ML-1：

本文的多肽序列中的所有氨基酸可为L型氨基酸，其中的一个或多个(如2-5个、2-4个或2-3个)氨基酸也可以用构象为D型的氨基酸、人工修饰的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸等进行替换，以提高多肽的生物利用度、稳定性和/或抗病毒活性。其中D型氨基酸是指与组成蛋白质的L型氨基酸相对应的氨基酸；人工修饰的氨基酸指经过甲基化、磷酸化等修饰的组成蛋白质的常见L型氨基酸；自然界存在的稀有氨基酸包括组成蛋白质的不常见氨基酸和不组成蛋白质的氨基酸，例如5-羟基赖氨酸、甲基组氨酸、γ氨基丁酸、高丝氨酸等。

本发明的药用盐，包括醋酸盐(acetate)、乳糖醛酸盐(lactobionate)、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、月桂酸酯(laurate)、安息香酸盐(benzoate)、苹果酸盐(malate)、重碳酸盐(bicarbonate)、马来酸盐(maleate)、硫酸氢盐(bisulfate)、扁桃酸盐(mandelate)、酒石酸氢盐(bitartrate),甲磺酸盐(mesylate),硼酸盐(borate),溴甲烷(methylbromide),溴化物(bromide),硝酸甲酯(methylnitrate),依地酸钙(calciumedetate),甲基硫酸盐(methylsulfate),右旋樟脑磺酸(camsylate),粘酸盐(mucate),碳酸盐(carbonate),萘磺酸盐(napsylate),氯化物(chloride),硝酸盐(nitrate),棒酸盐(clavulanate),N-甲葡糖胺(N-methylglucamine),柠檬酸盐(citrate),铵盐(ammoniumsalt),二氢氯化物(dihydrochloride),油酸盐(oleate),乙二胺四乙酸盐(edetate),草酸盐(oxalate),乙二磺酸盐(edisylate),扑酸盐(pamoate)(双羟萘酸盐embonate),丙酸酯月桂硫酸酯(estolate),棕榈酸盐(palmitate),乙磺酸酯(esylate),泛酸盐(pantothenate),延胡索酸盐(fumarate),磷酸盐/二磷酸(phosphate/diphosphate),葡庚糖酸盐(gluceptate),聚半乳糖醛酸盐(polygalacturonate),葡(萄)糖酸盐(gluconate),水杨酸盐(salicylate),谷氨酸盐(glutamate),硬脂酸盐(stearate),对羟乙酰氨基苯胂酸(glycollylarsanilate),硫酸盐(sulfate),羟基苯甲酸盐(hexylresorcinate),碱式乙酸盐(subacetate),海巴(hydrabamine),琥珀酸盐(succinate),氢溴酸盐(hydrobromide),丹宁酸盐(tannate),氢氯化物(hydrochloride),酒石酸盐(tartrate),羟萘酸盐(hydroxynaphthoate),8-氯茶碱盐(teoclate),碘化物(iodide),甲苯磺酸盐(tosylate),三乙基碘(triethiodide),乳酸(lactate),戊酸盐(valerate)等。取决于用途，药用盐可以由阳离子如钠(sodium)、钾(potassium)、铝(aluminum)、钙(calcium)、锂(lithium)、锰(magnesium)和锌(zinc)、铋(bismuth)等所形成，也可由碱如氨、乙二胺(ethylenediamine)、N-甲基-谷氨酰胺(N-methyl-glutamine)、赖氨酸(lysine)、精氨酸(arginine)、鸟氨酸(ornithine)、胆碱(choline)、N,N'-二苄基乙二胺(N,N'-dibenzylethylene-diamine),氯普鲁卡因(chloroprocaine),二乙醇氨(diethanolamine),普鲁卡因(procaine),二乙胺(diethylamine),哌嗪(piperazine),三羟甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane)和羟化四甲铵(tetramethylammonium hydroxide)等所形成。这些盐可以采用标准方法制备，例如通过游离酸与有机或无机碱的反应。在一个碱性基团如氨基存在的情况下，酸性盐如氢氯化物(hydrochloride)、氢溴化物(hydrobromide)、醋酸盐(acetate)、扑酸盐(pamoate)等等可用作剂型；在一个酸性基团(如-COOH)或醇基存在的情况下，可药用的酯如醋酸酯(acetate)、马来酸酯(maleate)、三甲基乙酸氯甲酯(pivaloyloxymethyl)等、以及文献中公知的用于改善可溶性和水解性的酯可以用作持续释放和前体药制剂。

上文中，亲脂性化合物可以连接在末端氨基酸的侧链上，也可直接连接在肽链上。

上述衍生物中，所述氨基端保护基可为乙酰基、氨基、马来酰基、琥珀酰基、叔丁氧羰基或苄氧或其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团；所述羧基端保护基可为氨基、酰胺基、羧基、或叔丁氧羰基或其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团。

在一个具体实施方式中，CT105ML-1的氨基末端进行乙酰化修饰、羧基末端进行酰胺化修饰，得到式Ⅱ所示的CT105ML-2：

上述CT105M的衍生物或其药用盐中，所述d2具体可为式Ⅱ所示的CT105ML-2。

在实际应用中，上述CT105M的衍生物或其药用盐中，所述d1和所述d2可通过其上的马来酰亚胺基团与血液中的蛋白质(如血清白蛋白或免疫球蛋白等)上的还原型巯基共价结合。所述d1和所述d2也可体外与载体蛋白共价结合得到偶合物。

由所述d1或d2与载体蛋白偶合(共价结合)得到的偶合物也属于本发明的保护范围。

上述偶合物中，所述载体蛋白为下述一种或其任意组合：

P1.血清白蛋白；

P2.免疫球蛋白；

P3.铁蛋白；

P4.转铁蛋白；

P5.α-2-巨球蛋白；

P6.甲状腺素结合蛋白；

P7.类固醇结合蛋白。

上述偶合物中，所述载体蛋白可为人源的蛋白质，也可为其它动物源的蛋白质。

包含下述C1)和C2)的组合物也属于本发明的保护范围：C1)为C11)、C12)、C13或/和C14)；所述C11)为CT105M或其药用盐；所述C12)为所述衍生物或其药用盐；所述C13)为所述偶合物；所述C14)为所述多聚体；

C2)药学上可接受的载体或辅料。

上述组合物中，所述组合物具有下述F1)-F3)中的至少一种功能：

F1)抗HIV；

F2)治疗和/或预防和/或辅助治疗HIV感染所致疾病；

F3)抑制HIV侵入细胞。

上述C11)、C12)、C13)、C14)或/和C15)在制备E1)-E3)中至少一种产品中的应用也属于本发明的保护范围：

所述C15)为上述组合物；

所述E1)为抗HIV的产品，如药物或疫苗；

所述E2)为治疗和/或预防和/或辅助治疗HIV感染所致疾病的产品，如药物或疫苗；

所述E3)为抑制HIV侵入细胞的产品，如药物或疫苗。

上述应用中，所述产品与CT105相比，半衰期延长。

所述产品的活性成分可按照包括如下步骤的方法制备：将所述d1或所述d2溶于溶剂中，得到所述产品的活性成分；所述溶剂为含有人血清白蛋白的溶液。

上述C11)、C12)、C13)、C14)或/和C15)在制备延长CT105的半衰期的产品中的应用也属于本发明的保护范围：

所述产品可为上述E1)、E2)或E3)的产品。

本发明所提供的多肽或其药用盐、其衍生物或其药用盐、上述偶合物、上述多聚体和上述组合物，可以用于HIV感染的治疗，也可以用HIV感染的预防，包括暴露前或可疑暴露后，例如输血、器官移植、体液交换、咬伤、意外针刺或手术中暴露于病人血液等。

在实际应用中，可以将本发明的多肽或其药用盐、其衍生物或其药用盐、上述偶合物、上述多聚体和上述组合物作为药物直接给予病人、或者与适宜的载体或赋形剂混合后给予病人，以达到治疗和/或预防HIV感染的目的。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。其中，栓剂可为阴道栓剂，也可以是阴道环，也可以是适于阴道应用的药膏、乳霜或凝胶。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腹腔注射、脑池内注射或灌输等；腔道给药，如经直肠、阴道和舌下；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。上述给药途径优选的是注射给药，优选的注射途径是皮下注射。

本发明的多肽或其药用盐、其衍生物或其药用盐、上述偶合物、上述多聚体和上述组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体活性成分，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体活性成分的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体活性成分的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体活性成分组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，活性成分的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

本发明的多肽或其药用盐、其衍生物或其药用盐、上述偶合物、上述多聚体和上述组合物可以直接单独用于HIV感染者的治疗和预防，也可以与一种或多种抗HIV感染药物联合使用，可以同时使用，也可以间隔使用，以达到提高整体治疗效果的目的。

本发明中，所述抗病毒活性也可称为抑制病毒活性，具体可为抑制病毒侵入细胞。所述HIV具体可为HIV-1。

实验证明，与CT105相比，CT105M和CT105ML-2均保留了良好的抗病毒活性；CT105ML-2的末端消除半衰期是CT105和CT105M的10倍。用本发明的CT105M制备的长效抑制HIV病毒与宿主细胞融合的修饰肽CT105ML-2，水溶性好、活性高、半衰期长。

附图说明

图1为T20、CT105、CT105M和CT105ML-2对HIV-1_R3A的抑制率(A)和对HIV-1_JRCSF的抑制率(B)。图1中，CT105ML为CT105ML-2。

图2为CT105、CT105M和CT105ML-2尾缘静脉注射后在大鼠体内的血药浓度。图2中，CT105ML为CT105ML-2。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。

另外，需要注意的是，除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是本领域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得；所用方法均为本领域技术人员公知的常规方法或按照厂商所建议的条件。

下述实施例中的PBS均为浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液，配制方法如下：8.5g NaCl、0.2g KCl、2.9g Na₂HPO₄·12H₂O、0.59g NaH₂PO₄·2H₂O，1L去离子水。

下述实施例中的抗体稀释液为在浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液中加入FBS和酪蛋白至FBS的含量为2％(体积百分含量)和酪蛋白的含量为2.5％得到的液体。

下述实施例中所用的多肽及其衍生物的序列结构如表1所示。

表1.CT105、CT105M和CT105ML-2的结构

表1中所有多肽和衍生物的氨基末端均进行了乙酰化修饰(Ac-)、羧基末端均进行了酰胺化修饰(-NH₂)。

表1中的多肽CT105按照申请号为201310671634.5、公开号为CN 103724404B的中国发明专利中的方法合成。

实施例1、多肽CT105M合成

多肽CT105M采用经典的固相肽合成法。下列被保护的氨基酸按照表1中CT105M的氨基酸序列顺序依次被加到树脂上：Fmoc-L-Leu-OH,Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-L-Lys(Boc)-OH,Fmoc-L-Ala-OH,Fmoc-L-Asn(Trt)-OH,Fmoc-L-Gln(Trt)-OH,Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-L-Ile-OH,Fmoc-L-Thr(tBu)-OH,Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-L-Trp(Boc)-OH,Boc-L-Met-OH。将上述被保护的氨基酸溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并按照顺序用0-苯并三唑-1-基-N，N，N’,N’-四甲基-脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)和二异丙基乙基胺进行缩合反应。30分钟后用20％哌啶DMF溶液去除Fmoc保护基。反应至最后一个氨基酸时，用85％TFA/5％三异丙基硅烷(TIPS)/5％苯硫基三异丙基硅烷(TIPS)/5％苯硫基甲烷和5％苯酚将多肽从固相树脂上切割，后用氮气吹干，用乙醚洗六次，常温挥干，得到具有表1中序列结构的多肽CT105M，其氨基酸序列为序列表中的序列1。CT105M的纯度均大于95％。

实施例2、多肽修饰物CT105ML-2合成

下列被保护的氨基酸按照表1中CT105M的氨基酸序列顺序依次被加到树脂上：Fmoc-L-Leu-OH,Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-L-Lys(Boc)-OH,Fmoc-L-Ala-OH,Fmoc-L-Asn(Trt)-OH,Fmoc-L-Gln(Trt)-OH,Fmoc-L-Lys(DDE)-OHFmoc-L-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-L-Ile-OH,Fmoc-L-Thr(tBu)-OH,Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-L-Trp(Boc)-OH,Boc-L-Met-OH。将上述被保护的氨基酸溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并按照顺序用0-苯并三唑-1-基-N，N，N’,N’-四甲基-脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)和二异丙基乙基胺进行缩合反应。含支链的氨基酸(序列表中的序列1的第15位的赖氨酸残基)使用Fmoc-L-Lys(DDE)-OH，最后一个氨基酸使用Boc-L-Met-OH。30分钟后用20％哌啶DMF溶液去除Fmoc保护基。反应至最后一个氨基酸后，使用2％水合肼DMF溶液脱除赖氨酸保护基DDE。后添加Fmoc-NH-PEG4-CH₂CH₂COOH，用DMF洗涤树脂一次，甲醇洗涤树脂两次，DMF洗涤树脂两次。添加3-马来酰亚胺丙酸。用95％TFA/1％水/2％EDT/2％TIS将多肽从固相树脂上切割，切割时间120min。后用氮气吹干，用乙醚洗六次，常温挥干，得到具有表1中序列结构的多肽CT105ML-2，其氨基酸序列为序列表中的序列1。

实施例3、抗病毒活性的测定。

Tzm-bl细胞是由HeLa细胞改造的贴壁细胞，可高表达HIV包膜蛋白识别的CD4受体、CCR5、CXCR4辅助受体。该细胞含有经Tat调控表达的β-半乳糖苷酶与荧光素酶基因。经HIV感染后，通过检测β-半乳糖苷酶或荧光素酶基因的表达情况测定病毒感染情况。因此利用Tzm-bl细胞针对HIV-1_R3A(由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供)和HIV-1_JRCSF检测CT105、CT105M和CT105ML-2抗病毒活性，T20作为阳性药物。在抗病毒检测前通过混合使得CT105ML-2与人血清白蛋白(HSA)结合，该混合方式是6mg CT105ML-2溶于用PBS配制的1ml 25％(质量百分含量)HSA(人血清白蛋白)溶液中。HIV-1_JRCSF按照如下方法制备：采用转染试剂将编码HIV-1病毒株JRCSF的分子克隆质粒pYK-JRCSF(美国NIH艾滋病试剂和参照物项目，目录号：2708))转染293T细胞，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育6小时后换液，然后继续培养48小时。用移液器轻轻收集含有HIV-1_JRCSF病毒颗粒的细胞培养上清，经0.45微米滤器过滤取上清，加入20％胎牛血清(FBS)后分装于聚丙烯管中，放置-80℃保存备用或直接进行病毒滴定。

用含10％进口胎牛血清、1％青链霉素、1％谷氨酰胺的DMEM培养基将Tzm-bl细胞重悬稀释。计数后接种于96孔板中，每孔添加15000个细胞。细胞在37℃培养24小时，细胞完全贴壁后，每孔加入50μl不同浓度药物的无血清DMEM培养基。随后配制用含40μg/ml DEAE的无血清培养基将病毒稀释成2000TCID₅₀/ml病毒稀释液，每孔加入50μl。同时设立病毒阳性对照组(药物为T20)和病毒阴性对照组(每孔只加入50微升无血清DMEM培养基，不含药物)。37℃培养48h后，使用Promega BrightGlo检测试剂盒检测细胞内荧光素酶表达情况。结果如图1和表2，表明与CT105相比，CT105M和CT105ML-2均保留了良好的抗病毒活性。IC₅₀为病毒的半数抑制浓度。

表2.CT105、CT105M或CT105ML-2的抗病毒活性

实施例4、CT105ML-2显著延长了CT105的末端消除半衰期

进行下述步骤1至步骤3的平行实验。

1、CT105M在SD大鼠体内血药浓度检测

将多肽CT105M溶于PBS中，配制1mg/ml多肽溶液。选取四只雄性SD大鼠，体重(180±10)g，作为实验动物。采取尾缘静脉注射单独剂量给药，给药剂量以多肽计为5.8mg/kg体重。在给药前，给药后5min，15min，30min，1h，2h，4h，8h分别静脉采血，并将血样储存在经EDTA浸润的收集管中。静置1h后，2500rpm离心10分钟，移取上清液并保存。

应用竞争ELISA方法测定血浆样品中的多肽药物浓度。用PBS配制含系列浓度多肽CT105M作为标准品。取偶联CT105M的BSA溶于0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6，作为包被缓冲液，以100μl每孔添加至96孔酶标板。4℃孵育过夜后，弃去孔内包被液，用5％脱脂奶封闭酶标板，每孔添加200μl，37℃孵育2h。PBST(PBS添加Tween至Tween的含量为0.05％的液体)洗板三次，并甩干。每孔分别添不同浓度的标准品50μl，以及50倍稀释的血浆样品，每孔50μl。使用抗体稀释液稀释抗CT105M兔多克隆抗体，每孔加入50μl。37℃孵育35min后，用PBST洗板3次。使用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的抗兔多克隆抗体。将稀释后的抗体加入酶标板。每孔添加100μl。37℃孵育30min后，PBST洗板三次。每孔加入TMB底物缓冲液100μl，孵育十分钟左右，每孔加入50μl 2M硫酸溶液终止反应。酶标仪记录OD450处吸光值。以不同浓度标准品OD450吸光度值与多肽阴性孔读数的比值做y值，多肽浓度的log₁₀值做X值，绘制标准曲线。利用标准曲线计算血样中的多肽浓度的对数值。经计算得到CT105M的末端消除半衰期为2.58h。

2、CT105在SD大鼠体内血药浓度检测

参照步骤1，将步骤1中的CT105M均替换为CT105，其它操作均相同。经计算得到CT105的末端消除半衰期为2.70h。

3、CT105ML-2在SD大鼠体内血药浓度检测

选取四只雄性SD大鼠，体重(180±10)g，作为实验动物。将6mg CT105ML-2溶于用PBS配制的1ml 25％(质量百分含量)HSA(人血清白蛋白)溶液，37℃孵育4小时，作为CT105ML-2贮存液用于稀释后给药和标准品配制。采取尾缘静脉注射单独剂量给药，每只大鼠给药剂量以CT105ML-2计为6mg/kg体重。在给药前，给药后5min，15min，30min，1h，2h，4h，8h，12h，24h,48h,96h分别尾静脉采血，并将血样储存在经EDTA浸润的收集管中。静置1h后，2500rpm离心10分钟，移取上清液并保存。

应用竞争ELISA方法测定血浆样品中的修饰肽药物浓度。将CT105ML-2贮存液稀释至不同浓度作为标准品。取偶联CT105ML-2的BSA溶于0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6，作为包被缓冲液，以100μl每孔添加至96孔酶标板。4℃孵育过夜后，弃去孔内包被液，用5％脱脂奶封闭酶标板，每孔添加200μl，37℃孵育2h。PBST(PBS添加Tween至Tween的含量为0.05％的液体)洗板三次，并甩干。每孔分别添不同浓度的标准品50μl，以及500倍稀释的血浆样品，每孔50μl。使用抗体稀释液稀释抗CT105ML-2鼠多克隆抗体，每孔加入50μl。37℃孵育1h后，用PBST洗板3次。使用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的抗鼠多克隆抗体。将稀释后的抗体加入酶标板。每孔添加100μl。37℃孵育30min后，PBST洗板三次。每孔加入TMB底物缓冲液100μl，孵育十分钟左右，每孔加入50μl 2M硫酸溶液终止反应。酶标仪记录OD450处吸光值。以不同浓度标准品OD450吸光度值与多肽阴性孔读数的比值做y值，以标准品浓度的log₁₀值做X值，绘制标准曲线。利用标准曲线计算血样中的CT105ML-2的血药浓度的对数值。经计算得到CT105ML-2的末端消除半衰期为26.9h。原始多肽序列CT105末端消除半衰期为2.70h(图2)。CT105ML-2的末端消除半衰期是CT105和CT105M的10倍，说明CT105ML-2在大鼠体内代谢的情况显著优于原始多肽CT105与改造肽CT105M。

序列表

<110> 北京工业大学

<120> 抗HIV多肽及它的长效抗HIV衍生物与应用

<130> GNCFH180414

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Trp Glu Asp Trp Arg Asp Glu Ile Glu Arg Tyr Thr Lys Lys

1 5 10 15

Ile Glu Glu Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Trp Gln Glu Lys Asn Glu

20 25 30

Ala Ala Leu Lys Glu Leu

35

Claims (18)

1.多肽或其药用盐，其氨基酸序列为序列表中的序列1。

2.权利要求1所述的多肽的衍生物或其药用盐，所述衍生物为d1-d7中任一种；

所述d1为所述多肽被马来酰亚胺修饰得到的化合物；

所述d2为在所述d1的氨基末端连接氨基端保护基和/或在所述d1的羧基末端连接羧基端保护基得到的化合物；

所述d3为在所述多肽的氨基末端连接氨基端保护基和/或在所述多肽的羧基末端连接羧基端保护基得到的化合物；

所述d4为所述d1被载体蛋白质或聚乙二醇修饰得到的化合物；

所述d5为所述多肽被载体蛋白质或聚乙二醇修饰得到的化合物；

所述d6为在所述d1的氨基末端和/或羧基末端连接亲脂性化基团得到的化合物；

所述d7为在所述多肽的氨基末端和/或羧基末端连接亲脂性基团得到的化合物。

3.根据权利要求2所述的衍生物或其药用盐，其特征在于：所述d1中，通过将序列表中的序列1的第15位的赖氨酸残基与马来酰亚胺基团连接完成马来酰亚胺修饰。

4.由权利要求2或3中所述d1或d2与载体蛋白偶合得到的偶合物。

5.根据权利要求4所述的偶合物，其特征在于：载体蛋白为下述一种或其任意组合：

P1.血清白蛋白；

P2.免疫球蛋白；

P3.铁蛋白；

P4.转铁蛋白；

P5.α-2-巨球蛋白；

P6.甲状腺素结合蛋白；

P7.类固醇结合蛋白。

6.一种组合物，其包含C1)和C2)：C1)为C11)、C12)或/和C13；所述C11)为权利要求1所述的多肽或其药用盐；所述C12)为权利要求2或3所述的衍生物或其药用盐；所述C13)为权利要求4或5所述的偶合物；C2)药学上可接受的载体或辅料。

7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于：所述组合物具有抗HIV的功能。

8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于：所述抗HIV为治疗和/或预防HIV感染所致疾病。

9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于：所述治疗和/或预防HIV感染所致疾病为辅助治疗HIV感染所致疾病。

10.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于：所述抗HIV为抑制HIV侵入细胞。

11.C11)、C12)、C13)或/和C15)在制备抗HIV的产品中的应用：

所述C11)为权利要求1所述的多肽或其药用盐；所述C12)为权利要求2或3所述的衍生物或其药用盐；所述C13)为权利要求4或5所述的偶合物；所述C15)为权利要求6-10中任一所述的组合物。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述抗HIV为治疗和/或预防HIV感染所致疾病。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述治疗和/或预防HIV感染所致疾病为辅助治疗HIV感染所致疾病。

14.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述抗HIV为抑制HIV侵入细胞。

15.CT105ML-2在制备延长CT105的半衰期的产品中的应用：

所述CT105ML-2的结构式为式Ⅱ：

所述CT105的结构式为Ac-MTWCDWRDEIERYTKKIEELIRAAQEWQEKNEAALKEL-NH₂；

所述产品为抗HIV的产品。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于：所述抗HIV为治疗和/或预防HIV感染所致疾病。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于：所述治疗和/或预防HIV感染所致疾病为辅助治疗HIV感染所致疾病。

18.根据权利要求15所述的应用，其特征在于：所述抗HIV为抑制HIV侵入细胞。

Images