CN102766194A

CN102766194A - 具有hiv-1蛋白酶抑制活性的寡肽化合物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102766194A
Application number: CN2012101354644A
Authority: CN
Inventors: 司书毅; 陶佩珍; 刘晓; 姜威; 董飙; 章天; 蒋建东; 余利岩; 魏玉珍; 白硕可; 樊秀勇
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2011-05-03
Filing date: 2012-05-03
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2032-05-03
Also published as: CN102766194B

Abstract

本发明提供了具有氨基酸序列Tyr-Leu-Val-Leu-His(SEQ ID NO:1)的寡肽化合物，其具有HIV-1蛋白酶抑制活性。本发明的寡肽化合物可以是化学合成的或重组产生的，或可以从微生物(特别是放线菌)提取获得。本发明还提供了从微生物(特别是放线菌)获得的、具有HIV-1蛋白酶抑制活性的提取物以及其制备方法，所述提取物包含本发明的寡肽化合物。本发明还提供了用于获得本发明的寡肽化合物或提取物的微生物(特别是放线菌，例如放线菌CGMCC 4766)。本发明的寡肽化合物或提取物可以用于预防和治疗与HIV感染相关的疾病，例如艾滋病。

Description

具有HIV-1蛋白酶抑制活性的寡肽化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域。特别地，本发明提供了具有氨基酸序列Tyr-Leu-Val-Leu-His(SEQ ID NO:1)的寡肽化合物，其具有HIV-1蛋白酶抑制活性。本发明的寡肽化合物可以是化学合成的或重组产生的，或可以从微生物(特别是放线菌)提取获得。本发明还提供了从微生物(特别是放线菌)获得的、具有HIV-1蛋白酶抑制活性的提取物以及其制备方法，所述提取物包含本发明的寡肽化合物。本发明还提供了用于获得本发明的寡肽化合物或提取物的微生物(特别是放线菌，例如放线菌CGMCC 4766)。本发明的寡肽化合物或提取物可以用于预防和治疗与HIV感染相关的疾病，例如艾滋病。

背景技术

对寡肽的药用研究在近几十年来得到不断发展。过去一直认为，蛋白质必须水解为游离氨基酸才能被吸收。然而事实上，大量寡肽可逃脱被消化成游离氨基酸的命运，而直接以肽的形式吸收进入体循环。最近一二十年来，对肽的营养研究主要集中在寡肽的吸收机制，寡肽与游离氨基酸吸收的关系，蛋白质在消化过程中寡肽的释放规律，寡肽的转运和代谢规律，寡肽对内分泌、氮沉积、组织蛋白质周转代谢的作用和影响，寡肽的生理活性作用等。

天然活性肽可介导细胞与细胞、蛋白质与蛋白质、细胞与蛋白质及其他非肽类物质、蛋白调控因子与基因表达之间的相互作用。因此，虽然生物体中活性肽的含量极少，但其活性强、作用大，是细胞分化、识别、免疫、应激、衰老及分子进化等一切生命过程的参与者或调节因子。按照其药理作用，目前寡肽可分为以下几类：肿瘤抗原肽、神经活性寡肽、心血管活性肽、酶抑制剂活性肽。

目前已知HI V-1蛋白酶可以裂解难以水解的肽键，如：Tyr-Pro和Phe-Pro。HI V-1蛋白酶在病毒复制过程中的主要作用是，将gag和gag-pol基因产物裂解成病毒成熟所需要的结构蛋白(基质、壳、核壳)和酶类(蛋白酶、整合酶、逆转录酶)。因此，HIV-1蛋白酶已被用作预防和治疗与HIV感染相关的疾病的重要靶点。

例如，已开发了多种能防止母体蛋白分裂成新的HIV感染细胞以及病毒复制的HIV-1蛋白酶抑制剂，使得艾滋病的治疗有了突破性进展。例如，目前人们已经制备了大量的肽类和非肽类HIV蛋白酶抑制剂。国际上已上市的HIV蛋白酶抑制剂都是拟肽类化合物，例如沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦等。非肽类抑制剂中发展较快的是二氢吡喃酮类和环脲类化合物。

寡肽化合物的分子空间结构与酶的活性中心比较相似，从而成为酶抑制剂的机率较大。因而，从微生物发酵产物中分离寡肽化合物是发现新型先导化合物的一个重要方法。然而，由于菌株发酵液中活性成分一般含量较少，且活性成分对热不稳定，故从菌株发酵液中提取分离得到活性成分的难度较大。因此，在本领域中，对能够预防和治疗与HIV感染相关的疾病的新型药物仍然存在着迫切需要。

本发明人发现了一种新的具有HIV-1蛋白酶抑制活性的寡肽化合物，其可从放线菌（例如放线菌CGMCC 4766）分离获得，并且可用于预防和治疗与HIV感染相关的疾病，例如艾滋病。

发明内容

在本申请中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术术语具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中使用的，术语“寡肽”一般是指含有2-10个氨基酸的肽，其中各氨基酸之间通过肽键相连。

如本文中使用的，术语“寡肽化合物”是指含有寡肽结构的化合物，其包括但不限于，寡肽以及其修饰形式。如本文中使用的，术语寡肽的“修饰形式”是指经修饰的寡肽。此类修饰包括但不限于，寡肽所包含的氨基酸的烷基化、烷氧基化、酰基化、酰氧基化、酯化、糖基化、聚乙二醇化等。

本发明的寡肽化合物可通过本领域公知的方法来制备。例如，此类寡肽化合物可以通过化学合成方法或基因工程方法来产生。用于产生该寡肽化合物的化学合成方法是本领域技术人员熟知的，参见例如Synthetic Peptides:A User′s Guide(2002)，编辑Gregory A.Grant,第二版；Solid-Phase Synthesis:A Practical Guide(2000)，编辑Steven A.Kates和Fernando Albericio。用于产生寡肽化合物的基因工程方法方法也是本领域技术人员熟知的，参见例如J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989；F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley& Sons，Inc.，1995。

此外，本发明的寡肽化合物还可通过本领域公知的提取和/或分离方法，例如常规用于从微生物发酵液中分离水溶性和/或非水溶性成分的方法（例如大孔吸附树脂处理、反相ODS-A柱层析、Sephadex LH-20柱层析、制备型高效液相色谱法等），从各种来源例如微生物（例如放线菌）获得。这些提取和/或分离方法在本领域技术人员的知识范围内，并且可参见例如，天然药物化学，吴立军主编，人民卫生出版社，第五版。在本申请的实施例中给出了本发明的寡肽化合物的示例性提取和/或分离方法。

如本文中使用的，术语“药学上可接受的盐”意指在合理的医学判断范围内适于人类和更低等的动物使用而没有不适当的副作用并与合理的利益/风险比相称的化合物的盐，所述副作用例如，毒性、刺激性、变应性反应等。

药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences,1977,66，1-19（其通过引用并入本申请）中详细描述了药学上可接受的盐。本文描述的化合物的药学上可接受的盐包括从适合的无机酸与有机酸以及无机碱与有机碱衍生的那些。

药学上可接受的无毒的酸加成盐的实例是与无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或与有机酸(如醋酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)形成的氨基盐，或通过使用本领域所用的其它方法(如离子交换)形成的氨基盐。其它药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、门冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐(digluconate)、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、羟乙酸盐、葡萄糖酸盐、羟乙酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐（palmoate）、果胶脂酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对-甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。

碱加成盐的实例包括药学上可接受的金属和胺盐。适宜的金属盐包括钠盐、钾盐、钙盐、钡盐、锌盐、镁盐和铝盐。通常优选钠盐和钾盐。在适当时，其它药学上可接受的盐包括无毒的铵盐、季铵盐和胺阳离子盐，其利用抗衡离子生成，例如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐。从金属碱制备适宜的无机碱加成盐，所述金属碱包括氢化钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化锌等。从胺制备适宜的胺碱加成盐。因为它们的低毒性和医用可接受性，所述胺经常用于医学化学，例如氨、乙二胺、N-甲基-葡萄糖胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙基胺、二乙胺、哌嗪、三(羟甲基)-氨基甲烷、四甲基氢氧化铵、三乙基胺、二苄基胺、二苯羟甲胺、脱氢松香基胺、N-乙基哌啶、苄基胺、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、碱性的氨基酸、二环己基胺等。

应理解本发明包括不同药学上可接受的盐的混合物/组合，以及游离形式的化合物和药学上可接受的盐的混合物/组合。

如本文中使用的，术语“HIV-1蛋白酶”是指与逆转录酶和整合酶一起共同负责HIV-1基因组复制过程的蛋白酶（GenBank登录号为AF033819）。在本申请中，HIV-1蛋白酶可以是天然来源的或重组产生的，例如采用大肠杆菌重组表达的HIV-1蛋白酶。HIV-1蛋白酶的酶切位点为Tyr-Pro，其底物例如但不限于，用于高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型的Dabcyl-γ-Abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Edans。

关于高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型的详细描述可参见例如，董飙，硫代反义寡核苷酸在鸭体内外对DHBV DNA复制的影响及高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型的建立，中国协和医科大学，中国医学科学院，2004(该论文可从http://so.med.wanfangdata.com.cn/获得)。该模型的一个优选实施方案如下：用Edans和Dabcyl这两种发色团分别标记HIV-1蛋白酶的多肽底物的酶切位点两侧。由于Edans的荧光发色光谱与Dabcyl的吸收光谱是重叠的，因而当Edans和Dabcyl处于邻近位置（例如位于多肽底物的的酶切位点两侧）时，经激发的Edans的发射光将被Dabcyl吸收。在这种情况下，将检测不到Edans的发射光（通过FRET由Dabcyl产生荧光淬灭）。相反地，当HIV-1蛋白酶的多肽底物被HIV-1蛋白酶切开后，Edans和Dabcyl将彼此分离，从而将能够检测到Edans在490nm处产生的发射光（脱离了Dabcyl的荧光淬灭）。该实施方案的示意图参见图6，其可用于分析酶系统和研发酶的抑制剂。

如本文中使用的，术语“分离的”是指本发明的寡肽化合物与其天然环境相分离，即与其天然环境中的通常混合或以其他方式结合的物质部分分离或基本上分离。例如，从微生物中提取获得的和/或化学合成的和/或重组产生的和/或经纯化的本发明的寡肽化合物是分离的。优选地，本发明的寡肽化合物是经纯化的，例如，其纯度可以为至少50％，优选至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或者100％。

如本文中使用的，“放线菌CGMCC 4766”是指在2011年04月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC 4766的放线菌菌株。常规用于放线菌的培养条件和培养基可用于放线菌CGMCC 4766的培养，并且这样的培养条件和培养基能够由本领域技术人员从文献中获得（参见例如，Shirling E B,Gottlieb D.Methods for characterization of streptomycess pecies.Int Syst Bacteriol，1966，16：313）。本申请在实施例中示例性提供了此类培养基和培养条件的一个实施方案。

如本文中使用的，术语“菌丝体的裂解液”是指使用本领域公知的裂解方法裂解放线菌菌丝体后获得的溶液；术语“菌丝体的提取液”是指，用有机溶剂浸泡放线菌菌丝体并将所述有机溶剂去除（例如，挥发）而获得的溶液，所述有机溶剂包括但不限于，丙酮，甲醇或其任何混合物。

如本文中使用的，术语“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。例如，治疗疾病（例如艾滋病）有效量是指，能够有效治疗，缓解，减轻或治愈艾滋病的症状的量。例如，抑制HIV-1蛋白酶的有效量是指，能够显著抑制，降低，或消除HIV-1蛋白酶的活性的量。测定这样的有效量在本领域技术人员的能力范围之内。

如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。

如本文中使用的，术语“与HIV感染相关的疾病”是指，由于受试者感染了HIV而导致的疾病，其包括但不限于艾滋病。

本发明人开创性地发现了一种新的具有HIV-1蛋白酶抑制活性的寡肽化合物，其可从放线菌（例如放线菌CGMCC 4766）分离获得，并且可用于预防和治疗与HIV感染相关的疾病，例如艾滋病。

因此，在一个方面，本发明提供了一种分离的寡肽化合物或其药学上可接受的盐，所述寡肽化合物具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列：Tyr-Leu-Val-Leu-His。

在一个优选实施方案中，本发明的寡肽化合物是未经修饰的寡肽。

在另一个优选的实施方案中，本发明的寡肽化合物是含有经修饰的氨基酸残基的寡肽。在进一步优选的实施方案中，本发明的寡肽化合物含有至少一个（例如2个，3个，4个或5个）经修饰的氨基酸残基。

在一个优选的实施方案中，本发明的寡肽化合物含有经取代的酪氨酸残基（Tyr），例如N-取代的酪氨酸残基，N,N-二取代的酪氨酸残基或N,N,N-三取代的酪氨酸残基。酪氨酸残基上的此类取代基包括但不限于，低级烷基例如C_1-4烷基（例如甲基，乙基，正丙基，异丙基或丁基），低级烷氧基例如C_1-4烷氧基。在一个优选的实施方案中，经取代的酪氨酸残基是N,N,N-三甲基取代的酪氨酸残基。

在另一个优选的实施方案中，本发明的寡肽化合物含有经修饰的组氨酸残基（His）。在一个优选的实施方案中，经修饰的组氨酸残基是脱氢组氨酸残基（-2H-His）。

在一个优选的实施方案中，本发明的寡肽化合物的位置2－4的氨基酸残基都是L－构型的氨基酸残基。

在一个优选的实施方案中，本发明的寡肽化合物具有下式的结构：

在一个优选的实施方案中，本发明的寡肽化合物是通过化学合成方法或基因工程方法获得的。

在一个优选的实施方案中，本发明的寡肽化合物是从放线菌，例如放线菌CGMCC 4766提取获得的。

在一个优选的实施方案中，本发明的寡肽化合物是通过以下步骤获得的：

(1)培养放线菌，并分别收集上清液和菌丝体；

(2)对步骤1获得的上清液和/或获得的菌丝体的裂解液和/或提取液进行层析，跟踪并收集具有HIV-1蛋白酶抑制活性的洗脱级分；

(3)使用制备型高效液相色谱法对步骤2收集的洗脱级分进行纯化，从而获得所述寡肽化合物。

在一个优选实施方案中，步骤1中的放线菌是放线菌CGMCC 4766。

在另一个优选实施方案中，在步骤2中对上清液和/或菌丝体的裂解液和/或提取液进行一次或多次层析，例如使用大孔吸附树脂和反相或者正相硅胶对所述溶液进行层析（例如柱层析）。在进一步的优选实施方案中，使用高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型对各个洗脱级分进行活性跟踪，以收集具有HIV-1蛋白酶抑制活性的洗脱级分。在一个优选实施方案中，通过用丙酮浸泡菌丝体，然后将菌丝体和丙酮去除来获得菌丝体的提取液。

在另一个优选实施方案中，在低温环境下进行步骤2，以避免本发明的寡肽化合物的活性丧失。

在另一个方面，本发明提供了一种获自放线菌的提取物，其包含本发明的寡肽化合物。

在一个优选实施方案中，本发明的提取物获自放线菌CGMCC 4766。

在一个优选实施方案中，本发明的提取物所包含的寡肽化合物具有下式的结构：

在一个优选实施方案中，本发明的提取物通过下述方法获得：

(1)培养放线菌，并分别收集上清液和菌丝体；

(2)对步骤1获得的上清液和/或获得的菌丝体的裂解液和/或提取液进行层析，跟踪并收集具有HIV-1蛋白酶抑制活性的洗脱级分，从而获得本发明的提取物。

任选地，所述方法还包括下述步骤：

(3)对步骤2获得的提取物进行进一步的纯化。

在一个优选实施方案中，在步骤2中对上清液和/或菌丝体的裂解液和/或提取液进行一次或多次层析，例如使用大孔吸附树脂和反相或者正相硅胶对所述溶液进行层析（例如柱层析）。在进一步的优选实施方案中，使用高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型对各个洗脱级分进行活性跟踪，以收集具有HIV-1蛋白酶抑制活性的洗脱级分。在一个优选实施方案中，通过用丙酮浸泡菌丝体，然后将菌丝体和丙酮去除来获得菌丝体的提取液。

在一个优选实施方案中，在低温环境下进行步骤2，以避免本发明的提取物中所包含的寡肽化合物的活性丧失。

在一个优选实施方案中，在步骤3中使用制备型高效液相色谱法，对步骤2获得的提取物进行进一步的纯化。

在另一个方面，本发明提供了制备本发明的寡肽化合物的方法，其包括以下步骤：

(1)培养放线菌，并分别收集上清液和菌丝体；

(3)使用制备型高效液相色谱法对步骤2获得的洗脱级分进行纯化，从而获得所述寡肽化合物。

例如，在一个实施方案中，使用大孔吸附树脂和反相(或正相)硅胶对上清液和/或菌丝体的裂解液和/或提取液进行层析，并使用高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型跟踪和收集具有HIV-1蛋白酶抑制活性的层析洗脱级分，从而初步去除杂质；最后，使收集到的洗脱级分经历制备型高效液相色谱法，以获得高纯度（例如纯度大于95％）的寡肽化合物。

在另一个优选实施方案中，在低温环境下进行步骤2，以避免所述寡肽化合物的活性丧失。

在另一个方面，本发明提供了通过上述方法获得的寡肽化合物。

在另一个方面，本发明提供了制备本发明的提取物的方法，其包括以下步骤：

(1)培养放线菌，并分别收集上清液和菌丝体；

任选地，所述方法还包括下述步骤：

(3)对步骤2获得的提取物进行进一步的纯化。

在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的寡肽化合物或提取物或者通过本发明的方法获得的寡肽化合物或提取物，以及药学上可接受的载体、助剂或赋形剂。

药学上可接受的载体、助剂或赋形剂包括任何及所有溶剂、稀释剂或其它液体赋形剂、分散剂或助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，只要其适于所需的特定剂型。Remington′s Pharmaceutical Sciences，第十六版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980)公开了在药学上可接受的组合物中所用的各种载体以及用于制备它们的已知技术。应理解，不会与本发明的寡肽化合物不相容(如产生任何不希望的生物作用或以有害的方式与药学上可接受的组合物中的任何其它组分另外相互作用)的任何常规载体介质的使用在本发明的范围之内。如本文使用的，术语“副作用”包括预防或治疗时所不期望的和相反的作用。副作用通常是不期望的，其可能是有害的或不舒服的或有风险的。

药学上可接受的载体可以包含惰性成分，其不过度地抑制所述寡肽化合物的生物活性。药学上可接受的载体应是生物相容性的，例如，无毒、非炎性、不致免疫或者在向受试者给药时没有其它不希望的反应或副作用。

可用作药学上可接受的载体的物质的一些实例包括但不限于，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白（如人血清白蛋白）、缓冲物质（如吐温80、磷酸盐、甘氨酸、山梨酸或山梨酸钾）、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质（如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠或锌盐）、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羊毛脂、糖（如乳糖、葡萄糖和蔗糖）、淀粉（如玉米淀粉和马铃薯淀粉）、纤维素及其衍生物（如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素）、粉状黄蓍胶、明胶、滑石粉、赋形剂（如可可脂和栓剂蜡）、油（如花生油、棉籽油；红花油；芝麻油；橄榄油；玉米油和豆油）、二醇类（如丙二醇或聚乙二醇）、酯类（如油酸乙酯和月桂酸乙酯）、琼脂、缓冲剂（如氢氧化镁和氢氧化铝）、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇和磷酸盐缓冲溶液以及其它无毒相容的润滑剂（如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁）。需要时，着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。

根据所治疗的疾病的性质和严重性，本发明的寡肽化合物、提取物以及其药学上可接受的组合物可以经口服、经直肠、胃肠外、阴道内、腹膜内、局部(例如通过粉剂、软膏或滴剂)、经口腔施用于人类和其他动物。如本文使用的，术语“胃肠外”包括但不限于，皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、腱鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或灌注技术。优选地，口服或静脉内施用组合物。

任何口服可接受的剂型可以用于口服施用，所述剂型包括但不限于，胶囊、片剂、水性混悬剂或溶液。就口服用片剂而言，常用的载体包括但不限于，乳糖和玉米淀粉。还可以加入润滑剂例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服施用需要水性混悬剂时，活性成分与乳化剂和助悬剂结合。如果需要，也可加入某些甜味剂、芳香剂或着色剂。

口服给药用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除活性化合物(例如上文所述的寡肽化合物)外，液体剂型还可以包含本领域中常用的惰性稀释剂，例如，水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯类及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可以包括佐剂，所述佐剂例如湿润剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒。在此类固体剂型中，将活性化合物与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体混合，例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或：a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂，例如，例如羧甲基纤维素、藻酸盐(酯)、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)保湿剂，例如甘油；d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶解阻滞剂，例如石蜡；f)吸收促进剂，例如季铵化合物；g)湿润剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸收剂，例如高岭土和膨润粘土；以及i)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇类、十二烷基硫酸钠及其混合物。就胶囊、片剂和丸剂而言，剂型还可以包括缓冲剂。

相似类型的固体组合物也可以用作软和硬胶囊中的填充剂，所述软和硬胶囊使用赋形剂例如乳糖以及高分子量聚乙二醇等。可以使用包衣衣料和壳，例如肠溶衣和其他制药领域众所周知的包衣衣料制备片剂、锭剂、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型。它们可以任选包含遮光剂并且还可以具有仅或优先在肠道某些部位任选以延缓方式释放活性成分的组分。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡。相似类型的固体组合物也可以用作软和硬胶囊中的填充剂，所述软和硬胶囊使用赋形剂例如乳糖以及高分子量聚乙二醇等。

可以使用适合的分散剂、湿润剂或助悬剂，按照已知技术配制可注射制剂，例如无菌可注射的水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的赋形剂和溶剂包括例如水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，可采用无菌的非挥发性油作为溶剂或悬浮介质。例如，可以采用任何温和的非挥发性油，包括合成的单酸甘油酯或二酸甘油酯。另外，在注射剂的制备中也可以使用脂肪酸，例如油酸。还可以采用天然、药用可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，特别是它们的聚氧乙基化形式。这些油溶液或混悬剂也可以包含长链醇稀释剂或分散剂，例如羰甲基纤维素或类似的分散剂，其通常用于制备药学上可接受的剂型，包括乳剂和混悬剂。为了制备目的，也可使用其他通常使用的表面活性剂（例如吐温、司盘）和其他乳化剂或生物利用度增强剂，其通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其他剂型。

可注射制剂可以通过如下方式进行灭菌：例如(1)通过细菌截留性滤器过滤，或者(2)掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂，然后在使用前将其溶解或分散在无菌的水或其它无菌可注射介质中。

为了延长施用的活性化合物的作用，经常需要延缓化合物在皮下或肌内注射后的吸收。这可以利用水溶性差的晶体或无定形物质的液体悬浮液来实现。另外，还可以将化合物溶解或悬浮在油类赋形剂中，实现肠胃外给药的化合物形式的延迟吸收。还可以通过在生物可降解的聚合物(例如聚丙交酯-聚乙醇酸交酯)中形成化合物的微囊基质，从而制备可注射的储库形式。根据化合物与聚合物的比例和所采用特定聚合物的性质，可以控制化合物的释放速率。其他生物可降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库型可注射制剂也可以通过将化合物包埋在与机体组织相容的脂质体或微乳中来制备。

直肠或阴道给药的组合物（特别是栓剂）可以如下制备：将活性化合物与适合的无刺激性赋形剂或载体混合，所述赋形剂或载体例如可可脂、聚乙二醇或栓剂用蜡，它们在环境温度下是固体，但是在体温下是液体，从而在直肠或阴道腔中融化，并释放出活性化合物。

局部或经皮施用的剂型包括软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。将活性化合物在无菌条件下与药学上可接受的载体和任何必需的防腐剂或缓冲剂（根据需要而定）混合。眼科制剂、滴耳剂和滴眼剂也被涵盖在本发明的范围内。另外，本发明涵盖透皮贴剂的使用，它们能够提供化合物向机体的受控递送。这类剂型可以通过将化合物溶解或分散在恰当的介质中来制备。还可以使用吸收增强剂，以增加化合物穿过皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜或者将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制速率。

还可以通过经鼻气雾剂或吸入剂施用上文所述的寡肽化合物、提取物以及其药学上可接受的组合物。按照药物制剂领域熟知的技术制备这类组合物，并可以将其制成盐水溶液。还可以向这类组合物中加入苯甲醇或其它适合的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其它常规的增溶剂或分散剂。

可以将上文所述的寡肽化合物、提取物以及其药学上可接受的组合物制为单位剂型。术语“单位剂型”是指物理上离散的单位，其适于作为单位剂量用于接受治疗的受试者，并且各单位包含预定量的活性物质，该预定量的物质经计算可以产生希望的治疗作用。所述单位剂型可以用于每日一次给药或每日多次给药(例如，每日约1至4次或更多次)。当使用每日多次给药时，对各次给药而言，单位剂型可以相同或不同。

施用的活性化合物的量可以根据例如，所治疗的受试者的体重、年龄和总体健康状况、所治疗的疾病的性质和严重性、以及特定的给药模式而变化，并且可由主治医师进行判断。

已证实，本发明的寡肽化合物和提取物均能够抑制HIV-1蛋白酶的活性。在一个优选的实施方案中，本发明的寡肽化合物抑制HIV-1蛋白酶活性的IC₅₀为10-25nM。

因此，在本发明的另一个方面，提供了本发明的寡肽化合物或提取物或者通过本发明的方法获得的寡肽化合物或提取物用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗与HIV感染相关的疾病，例如艾滋病。

在本发明的另一个方面，提供了本发明的寡肽化合物或提取物或者通过本发明的方法获得的寡肽化合物或提取物用于制备药物的用途，所述药物用于抑制HIV-1蛋白酶的活性。

在另一个方面，本发明还涉及预防或治疗与HIV感染相关的疾病，例如艾滋病的方法，其包括给有此需要的受试者施用有效量的本发明的寡肽化合物或提取物，或者通过本发明的方法获得的寡肽化合物或提取物，或者本发明的药物组合物。

在另一个方面，本发明还涉及抑制HIV-1蛋白酶活性的方法，其包括给有此需要的细胞或受试者施用有效量的本发明的寡肽化合物或提取物，或者通过本发明的方法获得的寡肽化合物或提取物，或者本发明的药物组合物。

在另一个方面，本发明还涉及放线菌（例如放线菌CGMCC 4766）用于制备本发明的寡肽化合物、提取物或药物组合物的用途。

在另一个方面，本发明还提供用于制备本发明的寡肽化合物、提取物或药物组合物的放线菌，例如放线菌CGMCC 4766。

发明的有益效果

本发明人开创性地发现了一种新的具有HIV-1蛋白酶抑制活性的寡肽化合物，从而为抑制HIV-1蛋白酶的活性和/或预防或治疗艾滋病提供了新的治疗选择。

关于序列表的说明

本发明的寡肽化合物所包含的氨基酸序列（SEQ ID NO:1）：Tyr-Leu-Val-Leu-His。

关于生物材料保藏的说明

本发明涉及生物材料，链霉菌(Streptomyces sp.)IMB1101，其于2011年04月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC 4766。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1为从放线菌CGMCC 4766分离本发明的寡肽化合物4862F的示例性流程图。图中的数字1，2，3分别表示，第1、2、3个柱体积的相应洗脱液。

图2为本发明的寡肽化合物4862F的液相色谱图。从图中可以看出，当在280nm波长条件下检测时，本发明的寡肽化合物4862F的保留时间为6.237分钟(min)，并且本发明的寡肽化合物的峰的面积百分比大于95％（接近100.00％）。

图3显示了本发明的寡肽化合物4862F的紫外吸收光谱，其最大吸收波长为218nm，227nm,278nm。由此推测，寡肽化合物4862F的结构中含有苯环。

图4显示了本发明的寡肽化合物4862F的HR-ESI/MS图，其显示寡肽化合物4862F的准分子离子峰为m/z 684.40954[M+H]⁺和m/z342.70860[M+2H]²⁺。

图5显示了本发明的寡肽化合物4862F的¹H-NMR图(图5A)，4862F的¹³C-NMR(CD₃OD)图(图5B)，4862F的DEPT(CD₃OD)图(图5C)，4862F的HSQC(CD₃OD)图(图5D)，4862F的¹H-¹H COSY(CD₃OD)图(图5E)，4862F的HMBC(CD₃OD)图(图5F)，4862F的ROESY(CD₃OD)图(图5G)，根据2D NMR数据(图5A-5G)得出的4862F的选择性相关图(图5H)，4862F的二级质谱(MS/MS)峰图(图5I)，4862F的三级质谱(MS/MS/MS)峰图(图5J)，以及4862F的结构和质谱裂解图(图5K)。

图6为HIV-1蛋白酶抑制剂筛选方法的原理示意图。

图7为本发明的寡肽化合物4862F在高通量荧光底物HIV-1蛋白酶抑制剂筛选模型上的活性评价图。从图中可以看出，寡肽化合物4862F的IC₅₀为15.26nM（阳性对照茚地那韦的IC₅₀为4.6nM，数据未显示）。

具体实施方式

缩略语

FDAA 2,4-二硝基-1-氟苯基-5-L-丙氨酰胺

1-Fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alaninamide

HR-ESI(+)/MS 高分辨电喷雾质谱正离子模式

High Resolution Elect rospray Ionization(Positive Ion)Mass Spect rometry

HSQC 异核单量子相干

Heteronuclear Single Quantum Coherence

DEPT 极化转移无歧变增强

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

HMBC 异核多键相关

Heteronuclear Multiple Bonds Cohenrence

ROESY 旋转坐标系欧沃豪斯增益谱

Rotating Frame Overhauser Enhancement Spect roscopy

TOCSY 全相关谱

Total Correlated Spectroscopy

CGMCC 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

实施例1

用于放线菌CGMCC 4766的培养基和培养条件如下：

1.放线菌CGMCC 4766的斜面培养基：酵母膏(北京双旋微生物培养基制品厂，BR)0.4%；麦芽膏(北京双旋微生物培养基制品厂，BR)1%；葡萄糖(北京化工厂，AR)0.4%；琼脂(北京双旋微生物培养基制品厂，BR)1.2%。

2.放线菌CGMCC 4766的液体培养基：

葡萄糖(北京化工厂，AR)0.5%；酵母膏(北京双旋微生物培养基制品厂，BR)0.5%；蛋白胨(北京双旋微生物培养基制品厂，BR)0.5%；牛肉膏(北京双旋微生物培养基制品厂，BR)0.5%；玉米浆(北京双旋微生物培养基制品厂，BR)0.4%；黄豆粉(北京双旋微生物培养基制品厂，BR)1%；可溶性淀粉(北京化工厂，AR)2%；CaCO₃0.4%；COCl₂(北京化工厂，AR)0.002%；用1N NaOH调整PH值为7.2。

3.放线菌CGMCC 4766的培养条件：

将在28℃培养8天的放线菌CGMCC 4766斜面培养物接种于250mL摇瓶中的50mL液体培养基中，并在28℃回旋振荡（190转/分）培养48小时。然后将获得的摇瓶培养物以5%的接种量接种于5000mL立瓶中的1000mL液体培养基中，并于28℃下，在往复式摇床（TS-1112F）上培养96小时。

实施例2

寡肽化合物的分离纯化

使用实施例1所获得的放线菌发酵液（即，放线菌培养物），通过如下步骤进行寡肽化合物的分离和纯化：

1.使用例如布氏漏斗进行抽滤，将发酵液分为上清液和菌丝体。

2.用丙酮浸泡菌丝体24小时，过滤并将滤液中的丙酮挥发掉，获得菌丝体的提取液。

3.使用大孔吸附树脂（购自北京绿百草科技发展有限公司）对步骤1的上清液和/或步骤2的菌丝体提取液进行柱层析。树脂采用hp-20（三菱，DIANON）。用去离子水平衡层析柱，并且用去离子水、30%丙酮、50%丙酮、70%丙酮、100%丙酮进行洗脱（每个流分的洗脱体积为3个柱体积，流速为每小时0.3个柱体积）。分离过程中采用高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型对各个洗脱级分进行活性跟踪。收集具有HIV-1蛋白酶抑制活性的洗脱级分，其主要集中于50%丙酮的洗脱级分中。

4.使用反相硅胶（购自北京绿百草科技发展有限公司）对步骤3获得的洗脱级分进行柱层析。填料为ODS-A（孔径为

）。洗脱剂分别为40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、100%甲醇（每个流分的洗脱体积为3个柱体积，流速为每小时0.5个柱体积）。分离过程中采用高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型对各个洗脱级分进行活性跟踪。收集具有HIV-1蛋白酶抑制活性的洗脱级分，其主要集中于60%甲醇的洗脱级分中。

5.按照厂商的说明书，使用制备型高效液相色谱（Agilent）对步骤4获得的洗脱级分进行纯化。柱型号为Agilent ZORBAX SB-C18880975.202（9.4×250mm）。

6.使用冷冻干燥设备（Christ-Alpha 1-4，德国Martin Christ公司）对步骤5获得的产物进行冷冻干燥，获得白色絮状物，并命名为4862F。

上述从放线菌CGMCC 4766分离寡肽化合物4862F的示意性流程图显示于图1中。

实施例3

纯度测定

使用高效液相面积归一化定量法（分析化学手册（第二版）第5分册，气相色谱分析）来测定寡肽化合物4862F的纯度。所使用的色谱条件如下：柱为Shimadzu Shimpack VP-ODS 0122358(150×4.6mm)；流动相为45%CH₃OH；流速为1.0mL/min；柱的温度为40℃；检测器为Sh imadzu SPD-M10A检测器，检测波长为280nm。检测的结果示于图2。

图2为寡肽化合物4862F的液相色谱图。从图2中可知，寡肽化合物4862F的保留时间为6.237分钟。根据高效液相面积百分比法可测定，寡肽化合物4862F的纯度大于95%（接近100.00％）。

实施例4

寡肽化合物4862F的鉴定

1.寡肽化合物4862F的紫外吸收光谱

依据厂商的说明书，使用Shimadzu SPD-M10A检测器测定实施例2中得到的化合物4862F的紫外吸收光谱。测定结果示于图3中，其显示，化合物4862F的最大吸收波长为218nm，227nm，278nm。由此推测，化合物4862F的结构中含有苯环。

2.寡肽化合物4862F的质谱分析

依据厂商的说明书，使用Thermo LTQ ORBITRAP XL对实施例2中得到的化合物4862F进行HR-ESI(+)/MS质谱检测。检测结果示于图4中，其显示，化合物4862F的准分子离子峰为，m/z 684.40954[M+H]⁺和m/z 342.70860[M+2H]²⁺。

3.寡肽化合物4862F的核磁共振波谱分析

依据厂商的说明书，使用Varian Mercury-500MHz来测定实施例2中得到的化合物4862F的¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、¹H-¹H COSY、HSQC、HMBC、TOCSY、ROESY数据。

化合物4862F的¹H-NMR图、¹³C-NMR图、DEPT图、HSQC图、¹H-¹HCOSY图、HMBC图、ROESY图分别示于图5A-5G中，并且其¹H-NMR、 ¹³C-NMR、DEPT、HSQC、¹H-¹H COSY、TOCSY和HMBC数据示于表1中。

分析化合物4862F的¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT和HSQC数据发现，化合物4862F含有5个羰基（δ_C:166.164-174.520）、9个甲基（包括3个N-甲基）、3个亚甲基、14个次甲基（4个与杂原子相连）和9个季碳原子、8个芳香碳、1个与氧相连的芳香季碳。根据这些数据可以推断，化合物4862F是一种寡肽化合物。

分析寡肽化合物4862F的¹H-¹H COSY，TOCSY，HSQC和HMBC数据发现，化合物4862F含有一个缬氨酸（Val）、两个亮氨酸（Leu）、一个N,N,N-三甲基取代的酪氨酸（N,N,N-trimethylated-Tyr）和一个脱氢组氨酸（-2H-His）。由此推断，寡肽化合物4862F为由上述四种氨基酸组成的五肽。另外，由于酪氨酸残基的N原子被三个甲基取代（即，该N原子形成一个正离子），因此，寡肽化合物4862F为季铵盐。

进一步，根据N-甲基、各α-H和β-H与相邻羰基的HMBC和ROESY相关性(参见表1和图5B)，确定了寡肽化合物4862F中各氨基酸的连接顺序。特别地，Leu¹的α-H(4.363)与N,N,N-trimethylated-Tyr的羰基（166.550）相关，这表明Leu¹与N,N,N-trimethylated-Tyr 相连；Val的α-H（4.005）与Leu¹的羰基（172.756）相关，这表明Val与Leu¹相连；Leu²的α-H（4.335）与Val羰基（174.520）相关，这表明Leu²与Val相连；-2H-His的β-H（7.409）与Leu²羰基（174.101）相关，这表明-2H-His与Leu²相连。此外，由于酪氨酸残基的N原子被三个甲基取代，无法形成酰胺，因此，酪氨酸残基位于寡肽化合物的N-末端。根据这些结果可以得出，化合物4862F中的氨基酸残基的线性顺序为N,N,N-(trimethyl)-Tyr-Leu¹-Val-Leu²-(-2H)-His。因此，寡肽化合物4862F的分子式为C₃₅H₅₃N₇O₇，不饱和度为13，并且其为一个内盐（N-端氨基为三甲基化的季铵盐正离子，C-末端羧基为负离子）。该结果与HR-ESI/MS结果中的准分子离子峰相吻合（见下文）。

根据图5A-5G中的2D NMR数据以及上述分析结果，确定了化合物4862F的选择性相关图(图5H)。

进一步根据厂商的说明书，使用Thermo LTQ ORBITRAP XL获得了化合物4862F的二级和三级质谱数据(参见图5I和图5J)。结合之前获得的核磁数据，对化合物4862F的二级和三级质谱峰进行分析。结果显示，这些二级和三级质谱峰对应于之前通过核磁数据建立的化合物结构的各种碎片(参见图5K)：

m/z 625.16对应于准分子离子脱去三甲胺分子生成的碎片峰；

m/z 531.24对应于准分子离子脱去脱氢组氨酸（即-2H-His）分子生成的碎片峰；

m/z 472.13对应于m/z 531.24峰脱去三甲胺分子生成的碎片峰；

m/z 444.19对应于m/z 472.13峰脱去一氧化碳分子生成的碎片峰；

m/z 359.04对应于m/z 472.13峰脱去亮氨酸（即Leu²）生成的碎片峰；

m/z 331.18对应于m/z 359.04峰脱去一氧化碳分子生成的碎片峰；

m/z 260.05对应于m/z 359.04峰脱去缬氨酸（即Val）生成的碎片峰；

m/z 146.90对应于m/z 260.05峰脱去亮氨酸（即Leu¹）生成的碎片峰。

因此，这些二级和三级质谱数据进一步证实了寡肽化合物4862F中各氨基酸片段的连接顺序，再次确证了寡肽化合物4862F的结构。

表1：4862F的NMR数据（CD₃OD）

注：^a记录于125MHz；^b记录于500MHz；^c多重态（由于重叠）。

4.寡肽化合物4862F中各氨基酸残基α-C的构型的确定应用Marfey反应（Zou X,Niu S,Ren J,et al.Verrucamides A-D,Antibacterial Cyclopeptides from Myrothecium verrucaria[J].J Nat Prod,2011,74(5):1111-1116；Marfey P.Determination of D-amino acids.II.Use of a bifunctional reagent,1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene[J].Carlsberg Res Commun,1984,49(6):591-596），确定了寡肽化合物4862F中的Leu¹、Val、Leu²的相对构型。

简而言之，取1mg寡肽化合物4862F，加入2.0mL 6N HCl，并在110℃温育24h。温育结束后，挥干溶剂以除去过量的HCl，并将干燥的水解产物置于两个1.5mL EP管中。用丙酮将FDAA(1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺)配制成浓度为1%（w/v）的溶液，将100μL该FDAA溶液加入含有4862F的水解产物的反应瓶中，并加入1.0N NaHCO₃溶液40μL，然后将该反应混合物在45℃加热反应1.5h。冷却后，向反应混合物中加入2.0N HCl溶液20μL进行酸化，获得4862F的水解产物的FDAA衍生物。用相同的方法处理标准的D-型和L-型氨基酸，作为对照。然后，使用HPLC（YMC C₁₈ column：5μm，4.6×150mm；所用流动相为A:H₂O（0.1%HCOOH），B：乙腈；洗脱条件为15%-50%乙腈/水梯度，洗脱时间50min，流速为1.0mL/min;检测波长为340nm；柱温为35℃）分析4862F的水解产物和标准D-型和L-型氨基酸的FDAA衍生物，并比较它们的保留时间(t_R)，以确定4862F的水解产物的氨基酸构型。

结果示于表2中。

表2：化合物4862F的水解产物与标准氨基酸的FDAA衍生物的HPLC分析

表2的分析结果表明，寡肽混合物4862F中的Leu¹、Val、Leu²均为L-构型。

另外，上述结果还证实了本发明的分离方法的有效性。特别地，通过使用实施例2的方法，可以获得纯度大于95%的寡肽化合物4862F。

实施例5

4862F的体外生物活性：

采用高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型来测定4862F的体外生物活性。简言之，该测定方法包括以下步骤：

1)制备经优化的、提供水解环境的反应混合物，其中反应混合物包含：

^*括号中的浓度为终浓度。荧光底物为购自Molecular Probe公司的H-2930，纯度＞91%。

将290ul反应混合物转移至96孔板的每一个孔中。

2)向96孔板的每一个孔中分别加入0.5～1.0μl的待测样品4862F（溶于H₂O，浓度范围为1.875～1000ng/mL）。使用茚地那韦（购自武汉驰飞化工有限公司，含量99.5%）作为阳性对照，浓度范围为1.875～1000ng/mL）。使用水作为阴性对照（未加入待测样品）。

3)均匀混合，并将96孔板置于37℃至少15分钟。

4)根据董飙，2004（同上）中描述的方法，使用10μl HIV-1蛋白酶起始反应，并在荧光检测仪（BMG Polarstar Galaxy多功能分析测试仪）中以355nm激发光和490nm发射光进行连续的读数测定。然后，通过下式来计算各个样品的HIV-1蛋白酶抑制%：

HIV-1蛋白酶抑制%=（未加待测样品的荧光吸收值-加入待测样品后的荧光吸收值）/未加待测样品的荧光吸收值*100% 测定结果示于图7和表3中。

表3.4862F的HIV-1蛋白酶抑制活性的测定。

测试浓度（ng/mL）	4862F的HIV-1蛋白酶抑制%
		1000	94.7
500	93.55
		250	87.25
125	82
		60	73.7
30	58.95
		15	46.1
7.5	49.5
		3.75	38.35
1.875	32.6

从图7和表3可知，寡肽化合物4862F能够显著抑制HIV-1蛋白酶的活性，并且该抑制是剂量依赖性的。特别地，根据图7可知，4862F抑制HIV-1蛋白酶的IC₅₀为15.26nM，而阳性对照茚地那韦的IC₅₀为4.6nM（数据未显示）。由此可知，本发明的寡肽化合物4862F是一种有效的HIV-1蛋白酶抑制剂，并且与茚地那韦类似，可用于抑制HIV-1蛋白酶和治疗艾滋病。

此外，还采用CPE法(阎祖炜;朱欣;李闻文.MTT法、CPE观察法用于药物细胞毒性实验的比较与分析[D].中国科学院上海冶金研究所,2000年.)测定化合物4862F的细胞毒性。结果显示，寡肽化合物4862F对MDCK细胞的半数有毒浓度CC₅₀大于292.83μM，这表明寡肽化合物4862F的细胞毒性很小，不会导致严重的副作用。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解，根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些修改和变动均在本发明的范围之内。本发明的范围不以任何方式受实施例的限制，并且由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.一种分离的寡肽化合物或其药学上可接受的盐，所述寡肽化合物具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列：Tyr-Leu-Val-Leu-His，

优选地，所述寡肽化合物是未经修饰的寡肽，或者是含有经修饰的氨基酸残基的寡肽；

优选地，所述寡肽化合物含有至少一个（例如2个，3个，4个或5个）经修饰的氨基酸残基；

优选地，所述寡肽化合物含有经取代的酪氨酸残基，例如N-取代的酪氨酸残基，N,N-二取代的酪氨酸残基或N,N,N-三取代的酪氨酸残基；优选地，所述酪氨酸残基上的取代基包括但不限于，低级烷基例如C_1-4烷基（例如甲基，乙基，正丙基，异丙基或丁基），低级烷氧基例如C_1-4烷氧基；优选地，经取代的酪氨酸残基是N,N,N-三甲基取代的酪氨酸残基；

优选地，所述寡肽化合物含有经修饰的组氨酸残基，例如脱氢组氨酸残基；

优选地，所述寡肽化合物具有下式的结构：

2.一种获自放线菌的提取物，其包含权利要求1的寡肽化合物，优选地，所述提取物获自放线菌CGMCC 4766；

优选地，所述寡肽化合物具有下式的结构：

3.制备权利要求1的寡肽化合物的方法，其包括以下步骤：

(1)培养放线菌，并分别收集上清液和菌丝体；

(3)使用制备型高效液相色谱法对步骤2获得的洗脱级分进行纯化，从而获得所述寡肽化合物；

优选地，步骤1中的放线菌是放线菌CGMCC 4766；

优选地，在步骤2中对上清液和/或菌丝体的裂解液和/或提取液进行一次或多次层析，例如使用大孔吸附树脂和反相或者正相硅胶对所述溶液进行层析（例如柱层析）；

优选地，使用高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型对各个洗脱级分进行活性跟踪，以收集具有HI V-1蛋白酶抑制活性的洗脱级分；

优选地，通过用丙酮浸泡菌丝体，然后将菌丝体和丙酮去除来获得菌丝体的提取液；

优选地，在低温环境下进行步骤2，以避免所述寡肽化合物的活性丧失。

4.制备权利要求2的提取物的方法，其包括以下步骤：

(1)培养放线菌，并分别收集上清液和菌丝体；

(2)对步骤1获得的上清液和/或获得的菌丝体的裂解液和/或提取液进行层析，跟踪并收集具有HIV-1蛋白酶抑制活性的洗脱级分，从而获得本发明的提取物；

任选地，所述方法还包括下述步骤：

(3)对步骤2获得的提取物进行进一步的纯化；

优选地，步骤1中的放线菌是放线菌CGMCC 4766；

优选地，使用高通量荧光底物HIV-1蛋白酶模型对各个洗脱级分进行活性跟踪，以收集具有HIV-1蛋白酶抑制活性的洗脱级分；

优选地，在低温环境下进行步骤2，以避免所述提取物中所包含的寡肽化合物的活性丧失；

优选地，在步骤3中使用制备型高效液相色谱法，对步骤2获得的提取物进行进一步的纯化。

5.一种药物组合物，其包含权利要求1的寡肽化合物或其药学上可接受的盐，或权利要求2的提取物，或者通过权利要求3的方法获得的寡肽化合物，或通过权利要求4的方法获得的提取物，以及药学上可接受的载体、助剂或赋形剂。

6.权利要求1的寡肽化合物或其药学上可接受的盐，或权利要求2的提取物，或者通过权利要求3的方法获得的寡肽化合物，或通过权利要求4的方法获得的提取物用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗与HI V感染相关的疾病，例如艾滋病。

7.权利要求1的寡肽化合物或其药学上可接受的盐，或权利要求2的提取物，或者通过权利要求3的方法获得的寡肽化合物，或通过权利要求4的方法获得的提取物用于制备药物的用途，所述药物用于抑制HIV-1蛋白酶的活性。

8.抑制HIV-1蛋白酶活性的方法，其包括给有此需要的细胞或受试者施用有效量的权利要求1的寡肽化合物或其药学上可接受的盐，或权利要求2的提取物，或者通过权利要求3的方法获得的寡肽化合物，或通过权利要求4的方法获得的提取物，或权利要求5的药物组合物。

9.放线菌（例如放线菌CGMCC 4766）用于制备权利要求1的寡肽化合物，或权利要求2的提取物的用途。

10.放线菌CGMCC 4766，其能产生权利要求1的寡肽化合物。