JP2008530178A - 構造的に明確に定義された分枝重合体と抱合されたインスリン分泌性薬剤の誘導体 - Google Patents
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Abstract
構造的に明確に定義した重合体と抱合された新規GLP-1およびこれらの処置的使用。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
Description
本発明の分野
本発明は、一般に、真性糖尿病に罹患しているヒトを治療する方法に関する。より具体的には、本発明は、構造的に明確に定義された分枝重合体と抱合されたインスリン分泌性薬剤に関する。分枝重合体は、単量体ビルディングブロックで構成される。さらにまた、本発明は、たとえば注射によるその他のインスリン分泌性薬剤を投与する必要を減少させ、または無くすための肺を介した全身吸収のための肺送達によるこのような抱合されたインスリン分泌性薬剤の使用に、並びにこれらの化合物を含む医薬組成物に、および糖尿病に関連した疾患の治療のための化合物の使用に関する。
本発明は、一般に、真性糖尿病に罹患しているヒトを治療する方法に関する。より具体的には、本発明は、構造的に明確に定義された分枝重合体と抱合されたインスリン分泌性薬剤に関する。分枝重合体は、単量体ビルディングブロックで構成される。さらにまた、本発明は、たとえば注射によるその他のインスリン分泌性薬剤を投与する必要を減少させ、または無くすための肺を介した全身吸収のための肺送達によるこのような抱合されたインスリン分泌性薬剤の使用に、並びにこれらの化合物を含む医薬組成物に、および糖尿病に関連した疾患の治療のための化合物の使用に関する。
本発明の背景
1920年代のインスリンの導入以来、真性糖尿病の治療を改善するために絶え間ない努力がなされている。
1920年代のインスリンの導入以来、真性糖尿病の治療を改善するために絶え間ない努力がなされている。
真性糖尿病は、世界人口のおよそ6%が冒されている疾患である。さらにまた、大部分の国の人口は、高齢化しており、また糖尿病は、特に老年人口において一般的である。たいていは、この人口群は、注射によってインスリンを自己投与することが困難または不本意であるという経験がある。米国では、人口のおよそ5%が糖尿病であり、これらの糖尿病患者のおよそ1/3が、皮下注射によって1日あたり1回または複数回の用量のインスリンを自己投与する。血糖のレベルを低下させるためには、このタイプの集中療法が必要である。内因性インスリンが低レベルか、または内因性インスリンを欠いた結果である高レベルの血糖は、正常な体化学を変化させて、多くの器官における微小血管系の不全を引き起しうる。糖尿病が治療されないと、切断を受けて、失明および腎不全を経験することが多い。糖尿病の治療が不適当なことによる糖尿病の副作用の医療および生産性の損失により、米国単独で約40,000,000,000ドルの年間費用がかかると見積もられている。
糖尿病の治療に非常に重要になると予想される1つのペプチドは、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）である。ヒトGLP-1は、遠位回腸のL細胞において、膵臓において、および脳において動脈内で合成されるプレプログルカゴンから生じる37アミノ酸残基のペプチドである。GLP-1は、糖代謝並びに胃腸の分泌および代謝の調節機能をもつ重要な消化管ホルモンである。GLP-1は、グルコース依存的様式でインスリン分泌を刺激し、インスリン生合成を刺激し、β細胞救出を促進し、グルカゴン分泌、胃内容排出および摂食を減少させる。PCT公報国際公開第98/08871号および国際公開第99/43706号は、親油性置換基を有するGLP-1類似体の安定な誘導体を開示する。これらの安定なGLP-1類似体の誘導体は、対応するGLP-1類似体と比較して、遅延性の作用プロフィールを有する。
過去10年において、多くのペプチドがヒラモンスタートカゲ（アメリカドクトカゲ（Heloderma suspectum）およびメキソコドクトカゲ（Heloderma horridum）の毒液から単離された。エキセンジン-4は、アメリカドクトカゲの毒液から単離された39アミノ酸残基のペプチドであり、このペプチドは、重複領域においてGLP-1（7-37）と52%の相同性を共有する。エキセンジン-4は、イヌに注射したときに、インスリン放出および続く血糖値の低下を刺激することが示されている強力なGLP-1受容体アゴニストである。エキセンジン-4（1-39）、これらの一定の断片、これらの類似体およびこれらの誘導体の群は、強力なインスリン分泌性薬剤である。最も重要なのは、エキセンジン-4（1-39）、これらのインスリン分泌性断片、これらのインスリン分泌性類似体およびこれらのインスリン分泌性誘導体の群。
GLP-1およびエキセンジンに共通するのは、大量の変異体が合成され、特に血漿半減期に関して研究されてきたことである。血漿半減期が低いのは、ペプチダーゼ（主に、ジペプチジルアミノペプチダーゼIV）に対する化学的安定性のため、および腎クリアランスのためであろう。しかし、これらのインスリン分泌性（insulionotropic）ペプチドの類似体および誘導体は、肺経路によって投与したときに、すなわち細気管支または肺胞などを介して下気道に投与したときに、満足な生物学的利用能が不足している。国際公開第00/66629号は、腎クリアランスを減少させるために、リジン残基を経てポリエチレングリコールに結合した修飾されたエキセンジンアゴニストを開示する。
国際公開第03/40309号は、GLP-1受容体アゴニストおよびグルカゴン受容器アンタゴニストとして作用するペプチドを開示する。開示されたペプチドの中には、C末端システイン残基を経てポリエチレングリコールに結合された2つのペプチドがある。
国際公開第2004/093823号は、ポリエチレングリコール化されたGLP-1ペプチドを開示する。
GLP-1ペプチドの肺投与は、国際公開第01/51071号および国際公開第00/12116号に開示されている。
GLP-1およびエキセンジン-4に由来するインスリン分泌性ペプチドは、血漿グルコースレベルが高いときにのみインスリン放出を刺激し、したがって、低血糖イベントのリスクが減少される。したがって、本ペプチドは、特に、もはやOHA（経口高血糖薬）に応答せず、かつ厳密な医学的観点からインスリンが投与されるべきである糖尿病患者のために有用である。患者およびある程度では医師も、おそらく低血糖イベントの不安または注射／針の不安のために、これが不可欠となる前にインスリン治療を開始するのをとどまってしまう。したがって、十分に強力であり、かつ肺経路によって投与することができるインスリン分泌性ペプチドに対する需要がある。
いくつかのタンパク質は、肺から吸収できることが何年もの間知られていた。実際に、肺への吸入エアロゾルとしてのインスリンの投与は、1925年にGaensslenによって最初に報告された。
全てタンパク質が、肺で効率的に吸収することができるわけではないことは明らかである。タンパク質を、肺を介して効率的に送達することができるかどうかに影響を及ぼす多くの因子がある。肺を介した吸収は、大部分が、送達される特定の治療的タンパク質の物理的特徴に依存的である。
タンパク質の効率的な肺送達は、肺深部の肺胞上皮にタンパク質を送達する能力に依存的である。上気道上皮に沈着したタンパク質は、かなりの部分が吸収されない。これは、厚さがおよそ30〜40μmであり、かつ吸収の障壁として作用する上を覆う粘液のためである。加えて、この上皮に沈着したタンパク質は、粘膜毛様体輸送によって気道の上へ除かれ、次いで胃腸管を経て除去される。また、このメカニズムは、いくつかのタンパク質粒子の吸収が低いことにも実質的に寄与している。タンパク質が吸収されず、その代わりにこれらの経路によって除去される程度は、これらの溶解度、これらのサイズ、並びにその他のあまり理解されていない特徴に依存する。
タンパク質を肺深部の肺胞上皮に首尾よく送達することができる場合であっても、治療的タンパク質を肺から血液に迅速に輸送することができるかどうかを予測することは困難である。肺に存在するペプチダーゼが広域性であるために、吸収時間が長いほど、吸収前にタンパク質が有意に分解されるか、または粘膜毛様体輸送によって除かれる可能性が増大する。
加えて、ホルモン、可溶性受容体、サイトカイン、酵素その他などの治療上の対象のペプチドは、タンパク分解性の分解、腎臓または肝臓によるクリアランスまたは場合によっては、中和抗体の出現の結果として、体内の循環半減期が短いことが多い。これが、一般にペプチドの治療的有用性を減少させる。
しかし、ペプチドの特性は、有機鎖様分子をこれらに対してグラフトすることによって増強することができることが十分に認識されている。このようなグラフティングにより、血清中半減期、タンパク分解性の分解に対する安定性、免疫原性の減少などの薬学的特性を改善することができる。
特性を増強するために使用されることが多い有機鎖様分子は、ポリエチレングリコールに基づいた鎖またはポリエチレンに基づいた鎖、すなわち反復単位-CH2CH2O-に基づいた鎖である。以下に、略語「PEG」を、ポリエチレングリコールに対して使用してある。しかし、PEGまたはPEGに基づいた鎖、さらにかなり低分子重量のものを調製するために使用される技術には、十分に制御されていない重合工程を含み、これにより、平均値に対して広範な鎖長を有する標品を生じてしまう。従って、PEGグラフティングに基づいたペプチド抱合体は、一般に広範な分子量分布によって特徴づけられる。
Kochendoeferらは、最近、均一な重合体修飾した赤血球形成タンパク質のデザインおよび合成を記述し（Science 2003, 299, 884-887）、国際公開第02/20033号（PCT特許出願）では、明確に定義された重合体で修飾されたペプチドの合成のための一般的方法を発明した。この研究に使用されたビルディングブロックは、溶液中または固体支持体上での標準的ペプチド化学を使用する連続付加によって延長された交互の水溶性直鎖状長鎖親水性ジアミンおよびコハク酸に基づいていた。
大きな明確に定義された重合体を調製するための代わりの、およびより魅力的なストラテジーは、限られた数の連続合成工程でオリゴマー形成される二、三または多分岐した単量体の使用に依存する。重合体の質量増大は、この場合、分岐数によって決定されるべき指数をもつ指数曲線に従い、たとえば二分岐した単量体は、2乗のべき乗成長を提供し、三分岐した単量体は、3乗のべき乗成長、その他を提供する。この手順によって得られる重合体のタイプは、文献に十分に記述されており（S.M. Grayson and J.M.J. Frechet, Chem. Rev. 2001, 101, 3819）、デンドリマーとして一般に知られている。
2,2-ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸に基づき、かつカルバメート結合を経てポリエチレンオキサイドでキャップされた生体分解性の第四世代ポリエステルデンドリマーが最近報告された（E.R.Gillies and J.M.J.Frechet, J. Amer. Chem. Soc, 2002, 124, 14137-14146）。この系の建築は、ポリエチレンオキサイド尾部のための付着位置として機能する多水酸基の足場を作製するために構造の樹状部分を使用しているため、上記のとおりにKochendoeferらによって記述された系に酷似している。しかし、印象的な12kDaの構造を作製することができるが、コア構造だけが化学的に明確に定義されているだけであるので、分散度の大部分は、それぞれのポリエチレンオキサイド尾部から導入されている。
バイオ医薬品に抱合される明確に定義された重合体のための多くの可能な用途（たとえば、薬物動態および薬動力学を修飾すること）を考慮すると、正確な数の単量体単位から正確な明確に定義された様式で重合体および共重合体を調製するための技術を改善することについては、当技術分野において絶えず需要がある。
本発明の概要
本発明は、インスリン分泌性薬剤に抱合された分枝重合体の新規種類を提供する。これらの新化合物は、下に述べた定義と共に下に述べた一般式Iを有する。式Iの化合物は、制御された数の単量体ビルディングブロック（YbおよびYtと命名した、下記）を含む。また、本発明は、医薬としての上記のような抱合体の使用を提供する。
本発明は、インスリン分泌性薬剤に抱合された分枝重合体の新規種類を提供する。これらの新化合物は、下に述べた定義と共に下に述べた一般式Iを有する。式Iの化合物は、制御された数の単量体ビルディングブロック（YbおよびYtと命名した、下記）を含む。また、本発明は、医薬としての上記のような抱合体の使用を提供する。
本発明の詳細な説明
本明細書において、以下の用語は、示された意味を有する：
本明細書に使用される「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって結合された少なくとも5つの構成アミノ酸で構成された化合物を意味する。構成アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされたアミノ酸の群に由来してもよく、これらは、遺伝暗号によってコードされない天然のアミノ酸、並びに合成アミノ酸であってもよい。遺伝暗号によってコードされない天然のアミノ酸は、たとえばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、オルニチン、ホスホセリン、D-アラニンおよびD-グルタミンである。合成アミノ酸には、化学合成によって製造されたアミノ酸、すなわちD-アラニンおよびD-ロイシンなどの遺伝暗号によってコードされるアミノ酸のD-アイソマー、Aib（α-アミノイソ酪酸）、Abu（α-アミノ酪酸）、Tle（tert-ブチルグリシン）、β-アラニン、3-アミノメチル安息香酸、アントラニル酸を含む。
本明細書において、以下の用語は、示された意味を有する：
本明細書に使用される「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって結合された少なくとも5つの構成アミノ酸で構成された化合物を意味する。構成アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされたアミノ酸の群に由来してもよく、これらは、遺伝暗号によってコードされない天然のアミノ酸、並びに合成アミノ酸であってもよい。遺伝暗号によってコードされない天然のアミノ酸は、たとえばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、オルニチン、ホスホセリン、D-アラニンおよびD-グルタミンである。合成アミノ酸には、化学合成によって製造されたアミノ酸、すなわちD-アラニンおよびD-ロイシンなどの遺伝暗号によってコードされるアミノ酸のD-アイソマー、Aib（α-アミノイソ酪酸）、Abu（α-アミノ酪酸）、Tle（tert-ブチルグリシン）、β-アラニン、3-アミノメチル安息香酸、アントラニル酸を含む。
ポリペプチドに言及して、本明細書に使用される「類似体」という用語は、ペプチドの1つもしくは複数のアミノ酸残基がその他のアミノ酸残基によって置換され、および／または1つもしくは複数のアミノ酸残基がペプチドから欠失され、およびまたは1つもしくは複数のアミノ酸残基がペプチドに付加された修飾されたペプチドを意味する。このようなアミノ酸残基の付加または欠失は、ペプチドのN末端にて、および／またはペプチドのC末端にて生じ得る。類似体を記述するために、単純な系が使用されることが多く：たとえば、[Arg34]GLP-1（7-37）Lysは、位置34の天然に存在するリジンがアルギニンで置換され、かつリジンが末端アミノ酸残基に、すなわちGly37に付加されたGLP-1（7-37）類似体を示す。光学異性体が定まっていない全てのアミノ酸例は、L-アイソマーを意味することが理解されるはずである。ヒトGLP-1は、両方ともインスリン分泌性ペプチドであるGLP-1（7-37）およびGLP-1（7-36）-アミドに加水分解される。したがって、たとえば、[Gly8]GLP-1（7-37）は、形式的に、位置8（Ala）の天然に存在するアミノ酸残基をGlyによって置換することによるGLP-1（7-37）に由来するGLP-1（7-37）の類似体を示す。同様に、GLP-1（Nε34-テトラデカノイル）[Lys34]GLP-1（7-37）は、位置34のLys残基のεアミノ基が、テトラデカノイル化されたGLP-1（7-37）を示す。本発明の側面において、GLP-1またはエキセンジン-4の類似体は、天然の配列と比較して付加され、欠失され、または交換された最大15アミノ酸を有し、本発明の側面において、最大12アミノ酸が付加され、欠失され、または交換されている。本発明の側面において、最大10アミノ酸が付加され、欠失され、または交換されている。本発明の側面において、最大8アミノ酸が付加され、欠失され、または交換されている。本発明の側面において、最大6アミノ酸が付加され、欠失され、または交換されている。本発明の側面において、最大4アミノ酸が付加され、欠失され、または交換されている。本発明の側面において、最大2アミノ酸が付加され、欠失され、または交換されている。
ペプチドに関して本明細書に使用される「誘導体」という用語は、少なくとも1つの置換基が、修飾されていないペプチドまたはこれらの類似体に存在しない化学的に修飾されたペプチドまたはこれらの類似体ペプチド、すなわち共有結合で修飾されたペプチドを意味する。典型的な修飾は、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステルその他同種のものである。GLP-1（7-37）の誘導体の例は、Nε26-（（4S）-4-（ヘキサデカノイルアミノ）-ブタノイル）[Arg34,Lys26]GLP-1（7-37）である。
本明細書に使用される「インスリン分泌性薬剤」という用語は、ヒトGLP-1受容体のアゴニストである化合物、すなわちヒトGLP-1受容体を含む適切な培地（下に開示したような培地）中でcAMPの形成を刺激する化合物を意味する。インスリン分泌性薬剤の能力は、下に記述したような用量反応曲線からEC50値を算出することによって決定される。
クローン化されたヒトGLP-1受容体（BHK-467-12A）を発現するベビーハムスター腎臓（BHK）細胞を100IU/mL ペニシリン、100μL/mL ストレプトマイシン、5%ウシ胎児血清および0.5mg/mlのジェネテシンG-418（Life Technologies）を添加したDMEM培地中で培養した。細胞をリン酸緩衝食塩水中で2回洗浄して、ベルセンで収集した。原形質膜は、緩衝液1（20mM HEPES-Na、10mM EDTA、pH 7.4）中でUltraturraxでホモジナイゼーションすることによって細胞から調製した。ホモジネートを4℃にて15分間48,000×gで遠心した。ペレットを緩衝液2（20mM HEPES-Na、0.1mM EDTA、pH 7.4）中にホモジナイゼーションすることによって懸濁し、次いで4℃にて15分間48,000×gで遠心した。洗浄手順をもう1回繰り返した。最終ペレットを緩衝液2に懸濁して、直ちにアッセイのために使用したか、または-80℃にて貯蔵した。
機能的受容体アッセイ法は、インスリン分泌性薬剤による刺激に対する応答として環状AMP（cAMP）を測定することによって行った。形成されるcAMPは、AlphaScreen（商標） cAMPキット（Perkin Elmer Life Sciences）によって定量化した。96ウェルマイクロタイタープレートの半分の領域において、50μL 緩衝液3（50mM Tris-HCl、5mM HEPES、10mM MgCl2、pH 7.4）の総容積で、以下を添加してインキュベーションを行った：1mM ATP、1μM GTP、0.5mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）、0.01% Tween-20、0.1% BSA、6μg膜標品、15μg/ml アクセプタービーズ、6nM ビオチニル-cAMPと共にプレインキュベートした20μg/mL ドナービーズ。アゴニスト活性について試験する化合物を溶解して、緩衝液3に希釈した。GTPは、それぞれの実験のために新たに調製した。プレートを暗がりでゆっくりと撹拌しながら室温にて3時間インキュベートし、続いてFusion（商標）器具（Perkin Elmer Life Sciences）で計数した。濃度‐反応曲線を個々の化合物についてプロットし、EC50値を、プリズムv. 4.0（GraphPad, Carlsbad, Ca）で4パラメーターロジスティックモデルを使用して見積もった。
本明細書に使用される「GLP-1ペプチド」という用語は、GLP-1（7-37）（配列番号1）、GLP-1（7-37）類似体、GLP-1（7-37）誘導体またはGLP-1（7-37）類似体の誘導体を意味する。一つの態様において、GLP-1ペプチドは、インスリン分泌性薬剤である。
本明細書に使用される「エキセンジン-4ペプチド」という用語は、エキセンジン-4（1-39）（配列番号：2）、エキセンジン-4（1-39）類似体、エキセンジン-4（1-39）誘導体またはエキセンジン-4（1-39）類似体の誘導体を意味する。一つの態様において、エキセンジン-4ペプチドは、インスリン分泌性薬剤である。
ポリペプチドに言及して本明細書に使用される「DPP-IV保護された」という用語は、血漿ペプチダーゼジペプチジルアミノペプチダーゼ-4（DPP-IV）に対する耐性を前記化合物に与えるために、化学的に修飾されたをポリペプチドを意味する。血漿中のDPP-IV酵素は、いくつかのペプチドホルモン、例えばGLP-1、GLP-2、エキセンジン-4などの分解に関与することが知られている。したがって、DPP-IVによる分解速度を減少させるためにDPP-IVを媒介した加水分解に感受性のポリペプチドの類似体および誘導体を開発するためには、かなりの努力がなされている。一つの態様において、DPP-IV保護されたペプチドは、DPP-IVに対してGLP-1（7-37）またはエキセンジン-4（1-39）よりも耐性である。
ジペプチジルアミノペプチダーゼIVによる分解に対するペプチドの耐性は、以下の分解アッセイ法によって決定される：
ペプチド（5nmol）のアリコートを、5mUの酵素活性に対応する精製した1μLのジペプチジルアミノペプチダーゼIVと共に37℃にて100μLの0.1M トリエチルアミン-HCl緩衝液、pH 7.4中で10〜180分間インキュベートする。5μLの10% トリフルオロ酢酸を添加することによって酵素反応を終わらせて、ペプチド分解産物を分離し、HPLC解析を使用して定量化する。この解析を行うための1つの方法は、以下のとおりである：Siegel et al., Regul. Pept. 1999；79：93-102およびMentlein et al. Eur. J. Biochem. 1993； 214： 829-35に従って、混合物をVydac C18 widepore（30nm孔、5μm粒子）250×4.6mm カラムに充填し、1ml／分の流速にてアセトニトリルの0.1% トリフルオロ酢酸溶液の直線段階勾配（0% アセトニトリル3分間、0〜24% アセトニトリル17分間、24〜48% アセトニトリル1分間）で溶出した。ペプチドおよびこれらの分解生成物を220nm（ペプチド結合）または280nm（芳香族アミノ酸）にてこれらの吸光度によってモニターしてもよく、標準のものに関してこれらのピーク面積を積分することによって定量化する。10% 未満のペプチドが加水分解を生じるインキュベーション時間にて、ジペプチジルアミノペプチダーゼIVによるペプチドの加水分解の割合を見積もる。
ペプチド（5nmol）のアリコートを、5mUの酵素活性に対応する精製した1μLのジペプチジルアミノペプチダーゼIVと共に37℃にて100μLの0.1M トリエチルアミン-HCl緩衝液、pH 7.4中で10〜180分間インキュベートする。5μLの10% トリフルオロ酢酸を添加することによって酵素反応を終わらせて、ペプチド分解産物を分離し、HPLC解析を使用して定量化する。この解析を行うための1つの方法は、以下のとおりである：Siegel et al., Regul. Pept. 1999；79：93-102およびMentlein et al. Eur. J. Biochem. 1993； 214： 829-35に従って、混合物をVydac C18 widepore（30nm孔、5μm粒子）250×4.6mm カラムに充填し、1ml／分の流速にてアセトニトリルの0.1% トリフルオロ酢酸溶液の直線段階勾配（0% アセトニトリル3分間、0〜24% アセトニトリル17分間、24〜48% アセトニトリル1分間）で溶出した。ペプチドおよびこれらの分解生成物を220nm（ペプチド結合）または280nm（芳香族アミノ酸）にてこれらの吸光度によってモニターしてもよく、標準のものに関してこれらのピーク面積を積分することによって定量化する。10% 未満のペプチドが加水分解を生じるインキュベーション時間にて、ジペプチジルアミノペプチダーゼIVによるペプチドの加水分解の割合を見積もる。
いわゆる遊離脂肪細胞アッセイ法からの結果を使用して、いずれの当業者も、たとえば医師は、GLP-1類似体を投与するとき、およびその投薬量がわかる。
「共有結合」という用語は、重合体分子およびGLP-1が、互いに直接共有結合で連結されているか、またはほかには、ブリッジ、スペーサーもしくは結合部分などの介在部分を介して互いに間接的に共有結合で連結されていることを意味する。
「分枝重合体」または「樹状重合体」または「樹状構造」または「デンドリマー」という用語は、そのうちの一部が分枝を含む単量体ビルディングブロックの選択により構築される有機ポリマーを意味する。
「抱合体」、または「抱合体GLP-1」という用語は、1つまたは複数の重合体分子に対する1つまたは複数のGLP-1類似体の共有結合によって形成された異種（複合体またはキメラという意味で）分子を示すことが意図される。
「多分散」という用語は、重合体の純度を示すために使用される。「多分散性指数」（PDI）という用語は、Mnに対するMwの比であり、式中Mwは、Σ（Mi 2Ni）/Σ（MiNi）であり、Mnは、Σ（MiNi）/Σ（Ni）であり、式中、Miは、混合物中に存在する個々分子の分子量であり、Niは、一定の分子量によって表される分子数である。PDIは、混合物中に存在する特定の重合体の分布幅の粗い指標を提供する。ある重合体のPDIが、1である場合、前記重合体は、100%の純度を有する。少ない重合体の世代、例えば1-3代については、PDIを示すことよりも（that）、純度を示すことのほうが便利であろう。しかし、より長い重合体については、PDIを使用するほうが、より便利であろう。
「単分散」という用語は、本明細書において、1.09未満のPDIを有する重合体について使用される。ある態様において、それは、1.08未満である。ある態様において、それは1.07未満および少なくとも1である。
本明細書において、生成物に関して「構造的に明確に定義された」という用語は、生成物が、高純度の、具体的に化学的に明確に定義された化合物を有することを示す。ある態様において、このような純度は、約80%以上である。ある態様において、それは、約90%以上である。ある態様において、それは、約95%以上である。ある態様において、それは、約97.5%以上である。
重合体修飾されたGLP-1の「免疫原性」とは、重合体修飾されたGLP-1が、ヒトに与えられたときに、体液性、細胞性、または両方であるかに関わらず、免疫応答を誘発する能力をいう。
「付着基」という用語は、リンカーを介して直接または間接的に重合体分子に付着することができる、GLP-1またはリンカー修飾したGLP-1上の官能基を示すことが意図される。有用な付着基は、たとえば、アミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、ケトン、スルフヒドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホンまたはハロアセテートである。
「反応性官能基」という用語は、例証であって、限定されず、-NH2、-OH、-N3、-NHR’もしくは-OR’（式中、R’は、下で定義したとおりの保護基である）、-O-NH2、アルキン、または以下のいずれかなどの基に加えて：ヒドラジン誘導体（-NH-NH2）、カルボキシル化ヒドラジン誘導体（-O-C（O）-NH-NH2）、セミカルバジド誘導体（-NH-C（O）-NH-NH2）、チオセミカルバジド誘導体（-NH-C（S）-NH-NH2）、炭酸ジヒドラジド誘導体（-NH-C（O）-NH-NH-C（O）-NH-NH2）、カルバジド誘導体（-NH-NH-C（O）-NH-NH2）、チオカルバジド誘導体（-NH-NH-C（S）-NH-NH2）、アリールヒドラジン誘導体（-NH-C（O）-C6H4-NH-NH2）、ヒドラジド誘導体（-C（O）-NH-NH2）並びに-C（O）-O-NH2、-NH-C（O）-O-NH2、および-NH-C（S）-O-NH2などのオキシルアミン誘導体に加えて、任意の遊離のアミノ基、カルボキシル基、チオール基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化アシル基、クロロホルミアート基、アリールオキシカルボナート基、ヒドロキシ基もしくはアルデヒド基、p-ニトロフェニルなどのカルボナート、またはスクシンイミジル；カルボニルイミダゾール、塩化カルボニル；インサイチューで活性化されるカルボン酸；カルボニルハライド、活性化されたエステル、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、N-ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、1,2,3-ベンゾトリアジン-4（3H）-オン、ホスホラミダイトおよびH-ホスホナートを含むエステル、インサイチューで活性化するホスホルトリエステルまたはホスホルジエステル、イソシアナートまたはイソチオシアナートを意味する。
「保護された官能基」という用語は、それを本質的に非反応性にする方法で保護された官能基を意味する。アミンのために使用される保護基の例には、tert-ブトキシカルボニル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル、アジドなどを含むが、これらに限定されるわけではない。カルボキシル基のためには、tert-ブチルまたはさらに一般的にいえばアルキル基などのその他の基が適切となる。適切な保護基は当業者に既知であり、例は、Green & Wuts “Protection groups in organic synthesis”, 3rd Edition, Wiley-interscienceにおいて見出すことができる。
「切断可能な部分」という用語は、選択的に切断して、たとえば固体支持体から分枝重合体リンカーまたは分枝重合体リンカーGLP-1を放出することができる部分を意味することが意図される。
「世代」という用語は、特定の単量体ビルディングブロックをもつ有機分子上の1つまたは複数の同一の官能基を反応することによって作製される単一の均一層をいう。デンドリマー合成は、一度に、1つの単量体層または「世代」上にデンドリマーを構築する段階的反応を介して達成される高レベルの合成制御が要求される。それぞれのデンドリマーは、それぞれの官能性部位に付着された樹状のくさびをもつ多官能性コア分子からなる。コア分子は、「0世代」と称する。全て枝分れに沿ったそれぞれの連続した反復単位は、世代が終結するまで次の世代（「1世代」、「2世代」、その他）を形成する。二分枝の単量体だけから作製されるデンドリマーでは、反応のために利用できる反応性表面基の数は、2mであり、式中mは、特定の代を表す1、2、3…8の整数である。三分枝の単量体だけから作製されるデンドリマーについては、反応基の数は、3mであり、n個の枝分れをもつ多分枝した単量体だけから作製されるデンドリマーについては、反応基の数は、nmである。それぞれの個々の代に異なる単量体を使用した分枝重合体については、特定の層または世代における反応基の数を帰納的に算出して個々の単量体の層位置および枝分れ数を知ることができる。
「機能的インビボ半減期」という用語は、その正常な意味で、すなわちGLP-1もしくは抱合体の生物活性の50%がなおも体／標的器官に存在する時間、またはGLP-1もしくは抱合体の活性がその初期値の50%である時間に使用される。機能的インビボ半減期を決定する代わりに、「血清半減期」、すなわち血漿もしくは血流中に循環するGLP-1または抱合体の分子の50%が除去される前の時間を決定してもよい。血清半減期の決定は、機能的半減期を決定するよりも簡単であることが多く、血清半減期の程度は、通常機能的インビボ半減期の程度の優れた指標である。血清半減期に対する代わりの用語は、血漿半減期、循環半減期、循環の半減期、血清除去、血漿除去および除去半減期を含む。GLP-1または抱合体は、細網内皮系（RES）、腎臓、脾臓もしくは肝臓の1つもしくは複数の作用によって、組織因子、SEC受容体もしくはその他の受容体を媒介した除去によって、または特異的もしくは非特異的タンパク質分解によって除去される。通常、除去は、GLP-1についてのサイズ（糸球体濾過のためのカットオフと比較して）、電荷、付着した糖鎖および細胞受容体の存在に依存する。保持される官能性は、通常、凝血原、タンパク質分解性、補因子結合または受容体結合活性から選択される。機能的インビボ半減期および血清半減期は、当該技術分野において既知のいずれの適切な方法によって決定してもよい。
機能的インビボ半減期または血漿半減期に使用される「増大した」という用語は、GLP-1または抱合体の相応する半減期が、参照分子のものと比較して統計学的に優位に増大したことを示すために使用される。例えば、相応する半減期は、少なくとも約50%までなど、少なくとも約10%または少なくとも25%、たとえば少なくとも約100%、150%、200%、250%または500%まで、増大してもよい。
「ハロゲン」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する。
本明細書に使用される「重原子」という用語は、炭素以上のモル重量を有する原子、例えばC、N、OおよびSを意味する。
「アルキル」、「アルキレン」、「アルカントリイル」および「アルカンテトライル」という用語は、1〜18炭素原子を有する飽和した、分枝または直鎖状の炭化水素基を表す。ある態様において、それは、1〜10炭素原子である。ある態様において、これは、それぞれ1つ、2つ、3つ、または4つの結合をもつ1〜6炭素原子である。典型的な基には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチルおよびヘキシルをを含むが、これらに限定されるわけではない。具体的なアルキレン、アルカントリイルおよびアルカンテトライル基には、対応する二価、三価および四価のラジカルを含む。
「アルケニル」および「アルケニレン」という用語は、それぞれC2-6-アルケニルおよびC2-6-アルケニレンをいい、2〜6炭素原子と少なくとも1つの二重結合とを有し、かつそれぞれ1つもしくは2つの結合を有する分枝または直鎖状の炭化水素基を表す。典型的なC2-6-アルケニル基には、エテニル、1-プロペニル、2-プロペニル、イソプロペニル、1,3-ブタジエニル、1-ブテニル、2-ブテニル、1-ペンテニル、2-ペンテニル、1-ヘキセニル、2-ヘキセニル、1-エチルプロプ-2-エニル、1,1-（ジメチル）プロプ-2-エニル、1-エチルブト-3-エニルおよび1,1-（ジメチル）ブト-2-エニルを含むが、これらに限定されるわけではない。C2-6-アルケニレン基の例には、対応する二価のラジカルを含む。
「アルキニル」または「アルキニレン」という用語は、C2-6-アルキニルまたはC2-6-アルキニレン基をいい、2〜6炭素原子と少なくとも1つの三重結合とを有し、かつそれぞれ1つもしくは2つの結合を有する分枝または直鎖状の炭化水素基を表す。典型的なC2-6-アルキニル基には、1-プロピニル、2-プロピニル、イソプロピニル、1,3-ブタジニル、1-ブチニル、2-ブチニル、1-ペンチニル、2-ペンチニル、1-ヘキシニル、2-ヘキシニル、1-エチルプロプ-2-イニル、1,1-（ジメチル）プロプ-2-イニル、1-エチルブト-3-イニル、1,1-（ジメチル）ブト-2-イニルを含むが、これらに限定されるわけではなく、またC2-6-アルキニレン基は、対応する二価のラジカルを含む。
「アルキレンオキシ」または「アルコキシ」という用語は、「C1-6-アルコキシ」またはC1-6-アルキレンオキシをいい、それぞれラジカル-O-C1-6-アルキルまたは-O-C1-6-アルキレンを表し、式中C1-6-アルキル（エン）は、上記記載のとおりである。代表例は、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ヘキソキシ、イソヘキソキシその他がある。
「アルキレンチオ」、「アルケニレンチオ」および「アルキニレンチオ」という用語は、上記記載のとおりのオキシ-ラジカルの対応するチオ類似体をいう。代表例は、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、ブチルチオ、ペンチルチオ、ヘキシルチオおよび対応する二価のラジカルであり、また、対応するアルケニルおよびアルキニル誘導体は、上に定義してある。
本明細書において、「-ジイル」、および「-トリイル」という用語は、それぞれ2つのおよび3つの付着点をもつ種々のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたは芳香族ラジカルをいう。
本明細書において、「アルカントリオキシ」という用語は、3つのアルカントリイル結合のそれぞれに付着された1つのオキシ（-O-）をもつアルカントリイル部分をいう。代表例は、プロパントリオキシ、tert-ブチルトリオキシ、その他がある。
「シクロアルキル」という用語は、C3-8-シクロアルキルをいい、3〜8炭素原子を有する単環式の炭素環式の基を表す。代表例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロ・オクチル、その他がある。
「シクロアルケニル」という用語は、C3-8-シクロアルケニルをいい、3〜8炭素原子と少なくとも1つの二重結合とを有する単環式の炭素環式の非芳香族基を表す。代表例は、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロ・ヘプテニル、シクロオクテニルその他がある。
「ポリアルコキシ」という用語は、アルコキシ部分のそれぞれの炭素原子数が同じか、または異なるアルコキシ-アルコキシ-アルコキシ-アルコキシその他を示す。ある態様において、これらは、同じである。同様に、ポリアルコキシアルキルおよびポリアルコキシアルキルカルボニルは、それぞれ（ポリアルコキシ）-アルキルおよび（ポリアルコキシ）-アルキル-CO-を示す。ポリアルコキシジイルという用語は、2つの遊離価を有するアルコキシ-アルコキシ-アルコキシ-アルコキシその他を示す。
「ポリ」という用語は、多いことを意味する。ある態様において、これは、2〜24の範囲の番号付与である。ある態様において、これは、2〜12である。ある態様において、これは、3、4または5である。
「オキシアルキル」という用語は、-O-アルキル-、すなわち二価のラジカルである。
本明細書に使用される「アリール」という用語は、フェニル、ビフェニリル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、インデニル、ペンタレニル、アズレニルその他などの炭素環式芳香環系を含むことを意図する。また、アリールは、上で列挙した炭素環式系の部分的に水素付加された誘導体を含むことが意図される。このような部分的に水素付加された誘導体の非限定の例は、1,2,3,4-テトラヒドロナフチル、1,4-ジヒドロナフチルその他がある。
「アレーントリイル」および「アレーンテトライル」という用語は、上記記載のとおりのアリールと同一の部分であるが、ただしアレーントリイルおよびアレーンテトライルにおいて、それぞれ1つでなく、3および4つの遊離価があることを条件とする。同じ条件で、アレーントリイルおよびアレーンテトライルの例は、上記のアリールについて述べたとおりである。
本明細書に使用される「ヘテロアリール」という用語は、フリル、チエニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、1,2,3-トリアゾリル、1,2,4-トリアゾリル、ピラニル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、1,2,3-トリアジニル、1,2,4-トリアジニル、1,3,5-トリアジニル、1,2,3-オキサジアゾリル、1,2,4-オキサジアゾリル、1,2,5-オキサジアゾリル、1,3,4-オキサジアゾリル、1,2,3-チアジアゾリル、1,2,4-チアジアゾリル、1,2,5-チアジアゾリル、1,3,4-チアジアゾリル、テトラゾリル、チアジアジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾチオフェニル（チアナフテニル）、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイソキサゾリル、プリニル、キナゾリニル、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、プテリジニル、カルバゾリル、アゼピニル、ジアゼピニル、アクリジニルその他などの、窒素、酸素および硫黄から選択される1つまたは複数のヘテロ原子を含む複素環式芳香環系を含むことを意図する。また、ヘテロアリールは、上に列挙した複素環式系の部分的に水素付加された誘導体を含むことが意図される。このような部分的に水素付加された誘導体の非限定の例は、2,3-ジヒドロベンゾフラニル、ピロリニル、ピラゾリニル、インドリニル、オキサゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゼピニルその他がある。
本明細書に使用されるヘテロアリール-C1-6-アルキルという用語は、上記記載の通りのヘテロアリールおよび上記記載の通りのC1-6-アルキルを意味する。
本明細書に使用される「アリール-C1-6-アルキル」、および「アリール-C2-6-アルケニル」という用語は、上記記載のとおりのアリール並びにそれぞれ上記記載のとおりのC1-6-アルキルおよびC2-6-アルケニルを意味する。
本明細書に使用される「アシル」という用語は、C1-6-アルキルが上記記載のとおりである-（C=O）-C1-6-アルキルを意味する。
上で定義された用語のいくつかは、構造式に一回以上存在してもよく、このような存在において、それぞれの用語は、その他のものとは独立して定義されるであろう。さらに、二価または三価の部分（moities）のために組み合わせた用語が使用されるときは、化学構造内のこのような組み合わせた用語の解釈は、組み合わせた用語を左から右に読むことによってなされ、またはその逆も同じである。それ故、二価のアミノアルキル部分のような用語は、アルキルアミノ部分も包含する。本明細書において、該用語部分は、好ましくは二価および三価のラジカルに関して使用される。
さらに具体的には、ここに、異なる用語の組み合わせからなるいくつかの二価部分の名称が続き、それぞれの二価部分には、[]内の代わりの定義および任意にこのような二価部分の1つまたは複数の具体例が続く：アルキレンアミノカルボニルアルキルアミノ[-アルキレン-NH-CO-アルキレン-NH-、たとえば-NH-CH2CH2-CO-NH-CH2CH2CH2CH2-]、アルキレンカルボニルアミノ（ポリアルコキシ）アルキルアミノ[-アルキレン-CO-NH-（ポリアルコキシ）-アルキレン-NH-]、アルキレンオキシアルキル[-アルキレン-O-アルキレン-、たとえばCH2CH2-O-CH2CH2-]、カルボニルアルキルアミノ[-CO-アルキレン-NH-、たとえば-NH-CH2CH2C（O）-]、カルボニルアルキルカルボニルアミノ（ポリアルコキシ）アルキルアミノ[-CO-アルキレン-CO-NH-（ポリアルコキシ）-アルキレン-NH-]、カルボニルアルコキシアルキルアミノ[-CO-アルコキシ-アルキレン-NH-]、カルボニルアルコキシアルキルカルボニルアミノ（ポリアルコキシ）アルキルアミノ[-CO-アルコキシ-アルキレン-CO-NH-（ポリアルコキシ）-アルキレン-NH-]、カルボニル（ポリアルコキシ）アルキルアミノ[-CO-（ポリアルコキシ）-アルキレン-NH-]、（ポリアルコキシ）アルキル[-（ポリアルコキシ）-アルキレン-、たとえば-CH2OCH2CH2OCH2CH2O-CH2-および-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2O-CH2-]、（ポリアルコキシ）アルキルカルボニル[-（ポリアルコキシ）-アルキレン-CO-]。角括弧内の式において、異なる部分間の結合は、「-」によって示してある。
本明細書に使用される「任意に置換された」という用語は、問題の基が非置換であるか、または特定された置換基の1つもしくは複数で置換されているかのいずれかを意味する。問題の基が複数の置換基で置換されているとき、置換基は、同じであっても、または異なっていてもよい。
本明細書に使用される「治療」という用語は、疾患、障害または状態と戦うための、患者の予防、管理および看護を意味する。本用語は、疾患の予防、疾患、障害もしくは状態の進行を遅延させること、症候および合併症を緩和または軽減すること、および／または疾患、障害もしくは状態を治癒または除去することを含むことが意図される。ある態様において、治療される患者は、哺乳類、特にヒトである。
明細書に使用される「賦形剤」という用語は、通常医薬組成物に添加される化学物質、たとえば緩衝液、張性薬剤、防腐剤その他を意味する。
明細書に使用される「有効量」という用語は、治療なしと比較して、患者の治療のために有効なほど十分な投薬量を意味する。
本明細書に使用される「医薬組成物」という用語は、緩衝液、保存剤および任意に張度調整剤および／または安定剤などの医薬賦形剤と共に、活性化合物またはこれらの塩を含む製品を意味する。したがって、医薬組成物は、当技術分野において医薬品製剤としても既知である。
本発明は、分枝重合体が正確な数の単量体ビルディングブロックで構成されているGLP-1に付着された分枝重合体に関連する。単量体ビルディングブロックは、適切な単量体保護および活性化ストラテジーを使用して、固体支持体上に、または溶液中でオリゴマー形成してもよい。また、GLP-1に付着した分枝重合体は、本明細書において、抱合されたGLP-1またはGLP-1抱合体と命名してある。下に記述した方法を使用して、分枝重合体が構造上明確に定義された抱合されたGLP-1を調製することができる。それ故、本発明の化合物は、単分散である。本明細書に記述した方法を使用して、50%を上回る純度を有する下記の一般式Iの化合物を調製することができる。ある態様において、これは、75%を上回る。ある態様において、これは、90%を上回る。ある態様において、これは、95%を上回る。ある態様において、これは、99%（重量／重量）を上回る。ある態様において、本発明は、このような高純度で単一の式Iの特定化合物を含む製品に関する。
本発明のある態様では、一般式Iによって表される上記のとおりのGLP-1抱合体を提供する：
ITA-L4-（L3）m-Y1（Y2（Y3（Y4（Y5（Y6）r）q）p）s）n （I）
式中、ITAは、水素がインスリン分泌性薬剤に存在するα-アミノ基から、またはインスリン分泌性薬剤の任意の位置のリジンに存在するεアミノ基から除去されたインスリン分泌性薬剤を表し、
二分枝の化合物の第一世代について、
Y1は、Ybであり；Y2は、Zであり；r、q、pおよびsは、全てゼロであり；並びにnは、2であり；
二分枝の化合物の第二世代について、
Y1およびY2は、Ybであり；Y3は、Zであり；r、qおよびpは、全てゼロであり；sは、4であり；並びにnは、2であり；
二分枝の化合物の第三世代について、
Y1、Y2およびY3は、全てYbであり；Y4は、Zであり；rおよびqは、ゼロであり；pは、8であり；sは、4であり；並びにnは、2であり；
二分枝の化合物の第四世代について、
Y1、Y2、Y3およびY4は、全てYbであり；Y5は、Zであり；rは、ゼロであり；qは、16であり；pは、8であり；sは、4であり；並びにnは、2であり；
並びに、二分枝の化合物の第五世代について、
Y1、Y2、Y3、Y4およびY5は、全てYbであり；Y6は、Zであり；rは、32であり；qは16である、pは8であり；sは、4であり；並びにnは、2であり；
式中
ITA-L4-（L3）m-Y1（Y2（Y3（Y4（Y5（Y6）r）q）p）s）n （I）
式中、ITAは、水素がインスリン分泌性薬剤に存在するα-アミノ基から、またはインスリン分泌性薬剤の任意の位置のリジンに存在するεアミノ基から除去されたインスリン分泌性薬剤を表し、
二分枝の化合物の第一世代について、
Y1は、Ybであり；Y2は、Zであり；r、q、pおよびsは、全てゼロであり；並びにnは、2であり；
二分枝の化合物の第二世代について、
Y1およびY2は、Ybであり；Y3は、Zであり；r、qおよびpは、全てゼロであり；sは、4であり；並びにnは、2であり；
二分枝の化合物の第三世代について、
Y1、Y2およびY3は、全てYbであり；Y4は、Zであり；rおよびqは、ゼロであり；pは、8であり；sは、4であり；並びにnは、2であり；
二分枝の化合物の第四世代について、
Y1、Y2、Y3およびY4は、全てYbであり；Y5は、Zであり；rは、ゼロであり；qは、16であり；pは、8であり；sは、4であり；並びにnは、2であり；
並びに、二分枝の化合物の第五世代について、
Y1、Y2、Y3、Y4およびY5は、全てYbであり；Y6は、Zであり；rは、32であり；qは16である、pは8であり；sは、4であり；並びにnは、2であり；
式中
三分枝の化合物の第一世代について、
Y1は、Ytであり；Y2は、Zであり；r、q、pおよびsは、全てゼロであり；並びにnは、3であり；
三分枝の化合物の第二世代について、
Y1およびY2は、Ytであり；Y3は、Zであり；r、qおよびpは、全てゼロであり；sは、9であり；並びにnは、3であり；
三分枝の化合物の第三世代について、
Y1、Y2およびY3は、全てYtであり；Y4は、Zであり；rおよびqは、ゼロであり；pは、27であり；sは、9であり；並びにnは、3であり；
並びに、三分枝の化合物の第四世代について、
Y1、Y2、Y3およびY4は、全てYtであり；Y5は、Zであり；rは、ゼロであり；qは、81であり；pは、27であり；sは、9であり；並びにnは、3であり；
式中、
Y1は、Ytであり；Y2は、Zであり；r、q、pおよびsは、全てゼロであり；並びにnは、3であり；
三分枝の化合物の第二世代について、
Y1およびY2は、Ytであり；Y3は、Zであり；r、qおよびpは、全てゼロであり；sは、9であり；並びにnは、3であり；
三分枝の化合物の第三世代について、
Y1、Y2およびY3は、全てYtであり；Y4は、Zであり；rおよびqは、ゼロであり；pは、27であり；sは、9であり；並びにnは、3であり；
並びに、三分枝の化合物の第四世代について、
Y1、Y2、Y3およびY4は、全てYtであり；Y5は、Zであり；rは、ゼロであり；qは、81であり；pは、27であり；sは、9であり；並びにnは、3であり；
式中、
式中、Aは、-CO-、-C（O）O-、-P（=O）（OR）-または-P（=S）（OR）-であり、式中Rは、水素、アルキルまたは任意に置換されたアリールであり；
およびBは、-NH-または-O-であり；
ただし、Bが-NH-であるときに、Aは、-CO-または-C（O）O-であり、かつBが-O-であるときに、Aは、-P（=O）（OR）-または-P（=S）（OR）-であることを条件とし；
並びに式中前記1つの単量体層（世代）の基B（Y1、Y2およびY3によって例証される）は、式中Yが接尾辞として後ろに数を有する（それぞれ、Y2、Y3およびY4によって例証される）隣接した次の層の前記基Aに結合されているか、またはZに結合されており；
X3は、窒素原子、アルカントリイル、アレーントリイル、アルカントリオキシ、式-CO-N＜のアミノカルボニル部分、式-CH2CO-N＜のアセトアミド部分または式
およびBは、-NH-または-O-であり；
ただし、Bが-NH-であるときに、Aは、-CO-または-C（O）O-であり、かつBが-O-であるときに、Aは、-P（=O）（OR）-または-P（=S）（OR）-であることを条件とし；
並びに式中前記1つの単量体層（世代）の基B（Y1、Y2およびY3によって例証される）は、式中Yが接尾辞として後ろに数を有する（それぞれ、Y2、Y3およびY4によって例証される）隣接した次の層の前記基Aに結合されているか、またはZに結合されており；
X3は、窒素原子、アルカントリイル、アレーントリイル、アルカントリオキシ、式-CO-N＜のアミノカルボニル部分、式-CH2CO-N＜のアセトアミド部分または式
の部分であり：
（式中、Qは、アルカントリイルである）；
X4は、アルカンテトライルまたはアレーンテトライルであり；
本発明の態様において、L1は、原子価結合、オキシ、アルキレン、アルキレンオキシアルキル、ポリアルコキシジイル、（ポリアルコキシ）アルキルカルボニル、オキシアルキルまたは（ポリアルコキシ）アルキルであり、式中最後の3つの部分の末端アルキル部分はAに結合されており；
本発明の態様において、L1は、最後の3つの部分のオキシ部分においてAに結合されている。
（式中、Qは、アルカントリイルである）；
X4は、アルカンテトライルまたはアレーンテトライルであり；
本発明の態様において、L1は、原子価結合、オキシ、アルキレン、アルキレンオキシアルキル、ポリアルコキシジイル、（ポリアルコキシ）アルキルカルボニル、オキシアルキルまたは（ポリアルコキシ）アルキルであり、式中最後の3つの部分の末端アルキル部分はAに結合されており；
本発明の態様において、L1は、最後の3つの部分のオキシ部分においてAに結合されている。
本発明の態様において、L2は、原子価結合、オキシ、アルキレン、アルキレンオキシアルキル、ポリアルコキシジイル、（ポリアルコキシ）アルキルカルボニル、オキシアルキルまたは（ポリアルコキシ）アルキルであり、式中最後の3つの部分の末端アルキル部分はBに結合されており；
本発明の態様において、L3は、原子価結合、アルキレン、オキシ、ポリアルコキシジイル、オキシアルキル、アルキルアミノ、カルボニルアルキルアミノ、アルキルアミノカルボニルアルキルアミノ、カルボニルアルキルカルボニルアミノ（ポリアルコキシ）アルキルアミノ、カルボニルアルコキシアルキルカルボニルアミノ（ポリアルコキシ）アルキルアミノ、アルキルカルボニルアミノ（ポリアルコキシ）アルキルアミノ、カルボニル（ポリアルコキシ）アルキルアミノまたはカルボニルアルコキシアルキルアミノを表し、式中最後の10の部分の末端カルボニル、アルキルおよびオキシ部分は、任意にL4部分を経てITA基に結合されており；
本発明の態様において、部分は、二価のラジカルの他端に結合されている。
本発明の態様において、L3は、原子価結合、アルキレン、オキシ、ポリアルコキシジイル、オキシアルキル、アルキルアミノ、カルボニルアルキルアミノ、アルキルアミノカルボニルアルキルアミノ、カルボニルアルキルカルボニルアミノ（ポリアルコキシ）アルキルアミノ、カルボニルアルコキシアルキルカルボニルアミノ（ポリアルコキシ）アルキルアミノ、アルキルカルボニルアミノ（ポリアルコキシ）アルキルアミノ、カルボニル（ポリアルコキシ）アルキルアミノまたはカルボニルアルコキシアルキルアミノを表し、式中最後の10の部分の末端カルボニル、アルキルおよびオキシ部分は、任意にL4部分を経てITA基に結合されており；
本発明の態様において、部分は、二価のラジカルの他端に結合されている。
mは、0、1、2または3であり；
本発明の態様において、L4は、原子価結合および式-CO-L5-CH=N-O-の部分の中で選択され、式中、L5は、原子価結合、アルキレンまたはアリーレンであり、式中前記L4部分の末端カルボニル部分は、ITA部分に結合されており；
本発明の態様において、該部分は、二価のラジカルの他端に結合されている。
本発明の態様において、L4は、原子価結合および式-CO-L5-CH=N-O-の部分の中で選択され、式中、L5は、原子価結合、アルキレンまたはアリーレンであり、式中前記L4部分の末端カルボニル部分は、ITA部分に結合されており；
本発明の態様において、該部分は、二価のラジカルの他端に結合されている。
並びに、
Zは、水素、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、ポリアルコキシ、オキシアルキル、アシル、ポリアルコキシアルキルまたはポリアルコキシアルキルカルボニルである。
Zは、水素、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、ポリアルコキシ、オキシアルキル、アシル、ポリアルコキシアルキルまたはポリアルコキシアルキルカルボニルである。
上記のとおり、L1、L2、L3およびL4は、全て二価のラジカルと解釈されるべきであり、X3は、三価のラジカルであり、X4は、四価のラジカルである。
上の式Iおよび本明細書の他の定義において、二分枝の、三分枝の、および代という3つの用語は、これについて理解を容易にするのに使用してあり、これらは、いかなる形であれ制限された解釈を生じるべきではない。
それ故、二分枝の化合物の第一世代は、式Iaによって例証することができ：
ITA-L4-（L3）m-Y1（Y2）2 （Ia）
これは、式Ia’によっても例証することができ、
ITA-L4-（L3）m-Y1（Y2）2 （Ia）
これは、式Ia’によっても例証することができ、
式中、ITA、Y1、Y2、L3、L4、m、YbおよびZは、それぞれ上記のとおりである。さらにまた、第二世代の二分枝の化合物は、式Ibによって例証することができ、
これは、式Ib’によっても例証することができ、
式中、ITA、Y1、Y2、Y3、L3、L4、m、YbおよびZは、それぞれ上記のとおりである。
あるいは、本発明は、たとえば、以下の式Icのものと同様に、第四世代の二分枝の化合物の式を描くことによって例証することができる：
式中、全て記号は、上で述べたとおりである（および垂直線は、式の一部ではなく、異なるレベルを図示する）。式Icは、本発明を例証するための試みにおいてのみ示され、保護の範囲を限定するために使用されるべきではない。
本発明の態様において、rは、ゼロである。本発明のもう一つの態様において、rおよびqは、それぞれゼロである。本発明のもう一つの態様において、nは、2（二分枝の化合物について）または3（三分枝の化合物について）である。本発明のもう一つの態様において、sは、4（二分枝の化合物について）または9（三分枝の化合物について）である。本発明のもう一つの態様において、sは、4であり、かつpは、8であるか（二分枝の化合物について）、またはsは、9であり、かつpは、27である（三分枝の化合物について）。
上述の如く、式Iの化合物は、1つまたは複数のYb部分を含む。式Iの化合物が、複数のYb部分を含む場合、これらの部分は同じであっても、または異なっていてもよい。本発明のある態様において、全てのYb部分は、同一である。本発明のもう一つの態様において、同じレベルからのYb部分は、同一であるが、1つのレベルのYb部分は、もう一つのレベルのYb部分とは異なり、それぞれのレベルは、それぞれ式Iにおいて接尾辞n、s、p、qおよびrによって同定される。特定の部分Ybにおいて、2つのB部分は、同じか、または異なる。ある態様において、このような2つのB部分は、同じである。さらにまた、ある態様において特定部分Yb、2つのL2部分は、同じか、または異なる。ある態様において、このような2つのL2部分は同じである。これは、同様に、Yt部分並びにその中に存在するBおよびL2部分にも適用される。
本発明のある態様において、これは、二分枝の化合物に関し、もう一つの態様において、これは、三分枝の化合物に関する。
任意のYbまたはYt部分に存在する2つまたは3つのL2部分は、それぞれ同じであっても、または異なっていてもよい。本発明のある態様において、任意のYbまたはYt部分に存在する2つまたは3つのL2部分は、それぞれ同じである。
少なくとも説明の便宜上、しかしまたある程度は実際に、式Iの化合物の非インスリン分泌性薬剤の主要部分は、以下の式を有する式IVbまたはIVcの化合物から構築することができる：
式中、L1、L2、X3およびX4は、上記の通りであり、式中、-A’および-B’は、反応して部分-A-B-を形成することができる基であり；式中、AおよびBは、上記のとおりである。
基A’とB’との間の反応によって形成される共有結合の性質は、A’およびB’の選択に依存し、上記のように、アミド結合、カルバメート結合、リン酸エステル結合、チオリン酸エステルエステル結合および亜リン酸エステル（phosphit）結合を含む。
ある態様において、A’は、-COOH、-COOR、-OCOOR、-OP（NR2）OR、-（O=）P（OR）2、-（S=）P（OR）（OR´）、-（S=）P（SR）（OR´）、-（S=）P（SR）（SR´）、-COCl、-COBr、-OCOBr、-P（OR）3、p-ニトロフェニルカルボナート（-OC（=O）OC6H4NO2）、スクシンイミジルカルボナート（-OC（=O）-Nhs（式中、Nhsは、N-ヒドロキシスクシンイミドである）、カルボニルイミダゾール（-C（=O）-Im（式中、Imは、イミダゾールである）、オキシカルボニルイミダゾール（-OC（=O）-Im（式中、Imは、イミダゾールである）、カルボニルクロライド（-C（=O）Cl）、クロロホルミアート（-OC（=O）Cl）、イソシアナート（-N=C=O）およびイソチオシアナート（-N=C=S）（式中、RおよびR’は、C1-6-アルキル、アリールまたは置換されたアリールを表す）からなる群より選択される。
もう一つの態様において、B’は、-NH2、-OH、-N3、-NHR’および-OR’からなる群より選択され；式中、R’が保護基である場合、たとえばペプチド化学およびオリゴヌクレオチド化学に使用されるように、段階的単量体オリゴマー形成が容易になる。
保護基の非限定の例には、9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmocと呼ばれる）、tert-ブトキシカルボニル（Bocと呼ばれる）、フタロイル、トリフェニルメチルおよび置換されたトリフェニルメチル、トリフルオロアセチルまたはトリクロロアセチルなどのトリハロアセチル、ピキシル（pixyl）、トリメチルシリル、tert-ブチルジメチルシリル、並びにtert-ブチルジフェニルシリルを含む。適切な保護基のその他の例が当業者に既知であり、示唆をGreen & Wuts “Protection groups in organic synthesis”, 3rd edition, Wiley-interscienceにおいて見つけることができる。
X3は、分枝の三価の有機ラジカル（リンカー）であってもよい。ある態様において、X3は、親水性である。ある態様において、これは、18個までを含む多様に官能性付与したアルキル基を含む。ある態様において、これは、1〜約10炭素原子を含む。もう一つの態様において、X3は、単一の窒素原子である。もう一つの態様において、X3は、アルカントリイルである。もう一つの態様において、X3は、プロパン-1,2,3-トリイルである。もう一つの態様において、X3は、アルカントリオキシである。もう一つの態様において、X3は、アルカントリイル、アルカントリオキシまたは式：-CO-NH-Q-NH-CO-（式中、Qは、アルカントリイルである）の一部であり；
並びに、さらに、X3は、式-CO-N＜のアミノカルボニル部分または式-CH2CO-N＜のアセトアミド部分であることができ、もう一つの態様において、X3は、以下の式のうちの1つを有する：
並びに、さらに、X3は、式-CO-N＜のアミノカルボニル部分または式-CH2CO-N＜のアセトアミド部分であることができ、もう一つの態様において、X3は、以下の式のうちの1つを有する：
最後の2つの部分は、（R）および（S）-1,5-ビス（アミノカルボニル）ペンチルである。
本発明の態様において、X4は、対称である。ある態様において、X4は、ベンゼン-1,3,4,5-テトライルである。
本発明のもう一つの態様において、X3またはX4は、対称である。
L1およびL2の例は、アルキレンおよび -（（CH2）m’O）n’-であり、式中、m’は2、3、4、5または6であり、n’は、0〜10の整数である。ある態様において、L1およびL2は、親水性である。本発明のもう一つの態様において、L1、L2または両方とも、原子価結合である。
本発明のもう一つの態様において、L1は、-CH2（OCH2CH2）n”-OCH2C（O）-であり、式中n’’は、0〜10の整数である。
本発明のもう一つの態様において、L1およびL2は、独立して水溶性有機二価ラジカルから選択される。本発明のもう一つの態様において、L1もしくはL2または両方とも、約1〜5個のPEG（-CH2CH2O-）基を含む二価の有機ラジカルである。本発明のもう一つの態様において、L1およびL2は、それぞれ、互いに独立に、トリ、テトラまたはペンタエチレングリコール部分、すなわち（-CH2CH2O-）3、（-CH2CH2O-）4または（-CH2CH2O-）5である。本発明のもう一つの態様において、L1は、オキシ（-O-）またはオキシメチル（-OCH2-）であり、L2は、式（-CH2CH2O-）2の一部であり、また式：
を有する。
本発明の態様において、L1は、原子価結合、オキシ、アルキレンオキシアルキル、オキシアルキルまたは（ポリアルコキシ）アルキルである。ある態様において、L1は、原子価結合、-O-または以下の3つの部分の1つである：-OCH2-、-CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2-および-CH2OCH2-。本発明のもう一つの態様において、L1は、原子価結合、オキシ、アルキレン、ポリアルコキシジイルまたはオキシアルキルである。もう一つの態様において、L1は、（ポリアルコキシ）アルキルカルボニル、オキシアルキルまたは末端アルキル部分が、好ましくはAに結合されている（ポリアルコキシ）アルキルである。ある態様において、該部分は、二価のラジカルの他端に結合されている。
本発明の態様において、L2は、アルキレン、アルキレンオキシアルキル、ポリアルコキシジイルまたは（ポリアルコキシ）アルキルである。ある態様において、L2は、以下の4つの部分のうちの1つである：部分：-CH2CH2OCH2CH2O-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2-、-CH2CH2OCH2CH2-または-CH2CH2-。本発明のもう一つの態様において、L2は、原子価結合、オキシ、アルキレン、ポリアルコキシジイルまたはオキシアルキルである。もう一つの態様において、L2は、（ポリアルコキシ）アルキルカルボニル、オキシアルキルまたは末端アルキル部分が、好ましくはBに結合されている（ポリアルコキシ）アルキルである。ある態様において、該部分は、二価のラジカルの他端に結合されている。
本発明のある態様において、X3は、窒素原子、アルカントリイル、アレーントリイルまたは式
の部分であり：
式中、Qは、アルカントリイルである。
式中、Qは、アルカントリイルである。
本発明のある態様において、Qは、1,1,5-ペンタトリイルである。
本発明のある態様において、mは、整数または1、2もしくは3である。本発明のもう一つの態様において、mは、整数である。本発明のもう一つの態様において、mは、1、2または3である。
本発明のある態様において、L3は、アルキレン、ポリアルコキシジイル、オキシ、オキシアルキルおよび原子価結合であり、L4は、結合であり、L3の一部は、以下の部分のうちの1つを含んでいてもよい：両方の異性体（synおよびanti）形態のオキシイミノアリールカルボニル（-O-N=CH-Ar-CO-）および両方の異性体（synおよびanti）形態のオキシイミノカルボニル（-O-N=CH-CO-）、この場合、穴としてのL3は、アミノアルキルオキシイミノアリールカルボニルまたはアミノポリアルコキシイミノカルボニルなどのアミノアルケニルまたはアミノポリアルコキシジイル誘導体である。本発明のもう一つの態様において、L3は、アルキレン、ポリアルコキシジイル、オキシ、オキシアルキルおよび原子価結合であり、L4は、結合であり、L3の一部は、以下の部分のうちの1つを含んでいてもよい：両方の異性体（synおよびanti）形態のオキシイミノメチルアリールカルボニル（-O-N=CH-Ar-CO-）および両方の異性体（synおよびanti）形態のオキシイミノアセチル（-O-N=CH-CO-）、この場合、穴としてのL3は、アミノアルキルオキシイミノメチルアリールカルボニルまたはアミノポリアルコキシイミノアセチルなどのアミノアルケニルまたはアミノポリアルコキシジイル誘導体である。本発明のもう一つの態様において、L3は、アルキルアミノ、カルボニルアルキルアミノまたはアルキルアミノカルボニルアルキルアミノである。ある態様において、L3は、以下の3つの部分のうちの1つである：-C（O）CH2CH2NH-、-CH2CH2CH2CH2NHC（O）CH2CH2NH-または-CH2CH2CH2CH2NH-。
ある態様において、L3は、原子価結合または以下の6つの式によって例証した二価の連結基であり：
式中、二価のラジカルのそれぞれの末端は、ITA基に付着することができる。ある態様において、ITA基は、カルボニル基を経て付着される。
ある態様において、L4および隣接したL3は、例えば以下の8つの式によって例証した二価の連結基であり：
式中、二価のラジカルのそれぞれの末端は、ITA基に接続することができる。態様において、カルボニル基は、ITA基に付着される。
本発明のある態様において、L4は、両方の異性体（synおよびanti）形態のオキシイミノアセチル（-O-N=CH-CO-）などのオキシイミノアルキルカルボニル部分である。本発明のもう一つの態様において、L4は、両方の異性体（synおよびanti）形態のオキシイミノアルキルアリールカルボニル（-O-N=CH-Ar-CO-）などのオキシイミノアルキルアリールカルボニル部分である。本発明のもう一つの態様において、L4は、原子価結合である。本発明のもう一つの態様において、L4は、式
の部分のうちの1つのsynおよびanti形態である。
本発明のもう一つの態様において、L4は、式
の部分のsynおよびanti形態である。
本発明のある態様において、Aは、-CO-、-C（O）O-、-P（=O）（OR）-または-P（=S）（OR）-であり、式中、Rは、水素である。ある態様において、Aは、-CO-、-C（O）O-、-P（O）O--または-P（S）O--である。
本発明のある態様において、Bは、-NH-または-O-である。
本発明のある態様において、Zは、水素、アルキル、アシルまたはポリアルコキシアルキルカルボニルであり、ある態様において、Zは、H-、CH3OCH2CH2OCH2CH2OCH2C（O）-、CH3-またはC6H5C（O）-である。ある態様において、Zは、水素または3つの基：CH3OCH2CH2OCH2CH2OCH2C（O）-、CH3-およびC6H5C（O）-のうちの1つである。
本発明のある態様において、A’は、カルボキシル基であり、B’は、脱保護後にそのカルボキシ基を経て同一構造の新たな単量体に結合してアミドを形成し得る保護アミノ基である。より大きな重合体を、標準的なオリゴペプチド合成から既知のように反復様式で構築することができる。本発明のもう一つの態様において、A’は、p-ニトロフェニルカルボナート（-C（O）-O-pC4H6NO2）、カルボニルイミダゾール（-C（O）-Im）、-COOHまたは-C（O）Clである。本発明のもう一つの態様において、B’は、N3-、FmocNH-または式：
の一つの基である
ある態様において、L3は、アミノアルキルであり、これらの炭素原子は、ITA-L4部分を含む式Iの部分に結合している。ある態様において、L3はオキシアルキルであり、これらの炭素原子は、ITA-L4部分を含む式Iの部分に結合している。ある態様において、L1は、ポリアルコキシジイル、ポリアルコキシアルキルまたはオキシアルキルであり、これらの末端アルキレン部分は、A部分に結合されている。ある態様において、L2は、ポリアルコキシジイルまたはオキシアルキルであり、これらのオキシ部分は、X3およびX4部分に結合されている。
ある態様において、L3は、アミノアルキルであり、これらの炭素原子は、ITA-L4部分を含む式Iの部分に結合している。ある態様において、L3はオキシアルキルであり、これらの炭素原子は、ITA-L4部分を含む式Iの部分に結合している。ある態様において、L1は、ポリアルコキシジイル、ポリアルコキシアルキルまたはオキシアルキルであり、これらの末端アルキレン部分は、A部分に結合されている。ある態様において、L2は、ポリアルコキシジイルまたはオキシアルキルであり、これらのオキシ部分は、X3およびX4部分に結合されている。
本発明のもう一つの態様において、A’は、ホスホラミダイトであり、B’は、適切に保護されたヒドロキシル基であり、これは、脱保護により、同一形式のもう一つの単量体に結合して亜リン酸トリエステルを形成することができ、その後に酸化されて安定なリン酸トリエステルまたはチオリン酸トリエステルを形成する。したがって、より大きな重合体は、標準的なオリゴヌクレオチド合成から既知のように反復様式で構築することができる。
もう一つの態様において、A’は、ニトロフェニルカルボナートなどの反応性カルボナートであり、B’は、アミノ基である。ある態様において、これは、その保護された形態で存在する。したがって、より大きな重合体は、標準的なオリゴカルバメート合成から既知のように反復様式で構築することができる。
もう一つの態様において、A’は、-COClまたは-COBrなどのハロゲン化アシルであり、B’は、アミノ基である。ある態様において、これは、その保護された形態で存在する。
ある態様において、Aは、3つの部分：-CO-、-P（O）O-および-P（S）O-のうちの1つである。
ある態様において、Bは、オキシまたは部分-NH-である。
ある態様において、本発明の化合物の分枝重合体は、約500Daを超える分子量を有する。ある態様において、これは、約3kDaを上回る。ある態様において、これは、約5kDaを上回る。
ある態様において、本発明の化合物の分枝重合体は、約10kDaを下回る分子量を有する。ある態様において、それは、約7kDaを下回る。
ある態様において、本発明の化合物は、約3〜約7の間の等電点を有する。
ある態様において、本発明の化合物は、生理学的条件下で実行負電荷を有する。
更なる態様において、式A’-L1-X3-（L2-B’）2の単量体ビルディングブロックは、
である。
もう一つの態様において、式A’-L1-X3-（L2-B’）2の単量体ビルディングブロックは、
である。
もう一つの態様において、式A’-L1-X3-（L2-B’）2の単量体ビルディングブロックは、
である。
ある態様において、L3は、例えば以下の3つの式の二価の連結基である：
ある態様において、Zは、末端アミノ基またはヒドロキシ基と反応することができるキャッピング剤である。ある態様において、Zは、以下の3つの例を含む：
ある態様において、二分枝の化合物について、式Iの化合物の非ITA部分の主要部分は、式A’-L1-X3-（L2-B’）2の単量体から構築される：
本発明のある態様において、三分枝の化合物について、式Iの化合物の非ITA部分の主要部分は、式A’-L1-X4-（L2-B’）3の単量体から構築される：
一つの態様において、ITAは、水素原子が上で述べたように除去されている、いずれかの天然の種由来のGLP-1およびこれらの塩からの、GLP-1の活性な誘導体またはGLP-1類似体である。さらなる態様において、ITAは、水素原子が上で述べたように除去されている、下記の実施例において具体的に言及したGLP-1分子のいずれかである。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、27〜45アミノ酸残基の間の長さを有するペプチドであって、最初の28アミノ酸残基のうちの22個は、GLP-1（7-37）（配列番号1）対応する位置において、またはエキセンジン-4（1-39）（配列番号2）の対応する位置において見出されるものと同一であるペプチドに由来する。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、27〜45アミノ酸残基の間の長さを有するペプチドであって、最初の28アミノ酸残基のうちの22個は、GLP-1（7-37）（配列番号1）に対応する位置において、またはエキセンジン-4（1-39）（配列番号2）の対応する位置において見出されるものと同一であるペプチドに由来する。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、式（II）のアミノ酸配列を含むペプチドから選択され：
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46
式（II）（配列番号3）
式中、Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニンまたは4-ピリジルアラニンであり；
Xaa8は、Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、（1-アミノシクロプロピル）カルボン酸、（1-アミノシクロブチル）カルボン酸、（1-アミノシクロペンチル）カルボン酸、（1-アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（1-アミノシクロヘプチル）カルボン酸または（1-アミノシクロオクチル）カルボン酸であり；
Xaa16は、ValまたはLeuであり；
Xaa18は、Ser、LysまたはArgであり；
Xaa19は、TyrまたはGlnであり；
Xaa20は、LeuまたはMetであり；
Xaa22は、Gly、GluまたはAibであり；
Xaa23は、Gln、Glu、LysまたはArgであり；
Xaa25は、AlaまたはValであり；
Xaa26は、Lys、GluまたはArgであり；
Xaa27は、GluまたはLeuであり；
Xaa30は、Ala、GluまたはArgであり；
Xaa33は、ValまたはLysであり；
Xaa34は、Lys、Glu、AsnまたはArgであり；
Xaa35は、GlyまたはAibであり；
Xaa36は、Arg、GlyまたはLysであり；
Xaa37は、Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、アミドであるか、または存在せず；
Xaa38は、Lys、Ser、アミドであるか、または存在しない。
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46
式（II）（配列番号3）
式中、Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニンまたは4-ピリジルアラニンであり；
Xaa8は、Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、（1-アミノシクロプロピル）カルボン酸、（1-アミノシクロブチル）カルボン酸、（1-アミノシクロペンチル）カルボン酸、（1-アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（1-アミノシクロヘプチル）カルボン酸または（1-アミノシクロオクチル）カルボン酸であり；
Xaa16は、ValまたはLeuであり；
Xaa18は、Ser、LysまたはArgであり；
Xaa19は、TyrまたはGlnであり；
Xaa20は、LeuまたはMetであり；
Xaa22は、Gly、GluまたはAibであり；
Xaa23は、Gln、Glu、LysまたはArgであり；
Xaa25は、AlaまたはValであり；
Xaa26は、Lys、GluまたはArgであり；
Xaa27は、GluまたはLeuであり；
Xaa30は、Ala、GluまたはArgであり；
Xaa33は、ValまたはLysであり；
Xaa34は、Lys、Glu、AsnまたはArgであり；
Xaa35は、GlyまたはAibであり；
Xaa36は、Arg、GlyまたはLysであり；
Xaa37は、Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、アミドであるか、または存在せず；
Xaa38は、Lys、Ser、アミドであるか、または存在しない。
Xaa39は、Ser、Lys、アミドであるか、または存在せず；
Xaa40は、Gly、アミドであるか、または存在せず；
Xaa41は、Ala、アミドであるか、または存在せず；
Xaa42は、Pro、アミドであるか、または存在せず；
Xaa43は、Pro、アミドであるか、または存在せず；
Xaa44は、Pro、アミドであるか、または存在せず；
Xaa45は、Ser、アミドであるか、または存在せず；
Xaa46は、アミドであるか、または存在せず；
ただし、Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45またはXaa46が存在しない場合、下流のそれぞれのアミノ酸残基も存在しないことを条件とする。
Xaa40は、Gly、アミドであるか、または存在せず；
Xaa41は、Ala、アミドであるか、または存在せず；
Xaa42は、Pro、アミドであるか、または存在せず；
Xaa43は、Pro、アミドであるか、または存在せず；
Xaa44は、Pro、アミドであるか、または存在せず；
Xaa45は、Ser、アミドであるか、または存在せず；
Xaa46は、アミドであるか、または存在せず；
ただし、Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45またはXaa46が存在しない場合、下流のそれぞれのアミノ酸残基も存在しないことを条件とする。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、式（III）のアミノ酸配列を含むペプチドである：
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38
式（III）（配列番号4）
式中、Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニンまたは4-ピリジルアラニンであり；
Xaa8は、Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、（1-アミノシクロプロピル）カルボン酸、（1-アミノシクロブチル）カルボン酸、（1-アミノシクロペンチル）カルボン酸、（1-アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（1-アミノシクロヘプチル）カルボン酸または（1-アミノシクロオクチル）カルボン酸であり；
Xaa18は、Ser、LysまたはArgであり；
Xaa22は、Gly、GluまたはAibであり；
Xaa23は、Gln、Glu、LysまたはArgであり；
Xaa26は、Lys、GluまたはArgであり；
Xaa30は、Ala、GluまたはArgであり；
Xaa34は、Lys、GluまたはArgであり；
Xaa35は、GlyまたはAibであり；
Xaa36は、ArgまたはLysであり；
Xaa37は、Gly、Ala、GluまたはLysであり；
Xaa38は、Lys、アミドであるか、または存在しない。
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38
式（III）（配列番号4）
式中、Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニンまたは4-ピリジルアラニンであり；
Xaa8は、Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、（1-アミノシクロプロピル）カルボン酸、（1-アミノシクロブチル）カルボン酸、（1-アミノシクロペンチル）カルボン酸、（1-アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（1-アミノシクロヘプチル）カルボン酸または（1-アミノシクロオクチル）カルボン酸であり；
Xaa18は、Ser、LysまたはArgであり；
Xaa22は、Gly、GluまたはAibであり；
Xaa23は、Gln、Glu、LysまたはArgであり；
Xaa26は、Lys、GluまたはArgであり；
Xaa30は、Ala、GluまたはArgであり；
Xaa34は、Lys、GluまたはArgであり；
Xaa35は、GlyまたはAibであり；
Xaa36は、ArgまたはLysであり；
Xaa37は、Gly、Ala、GluまたはLysであり；
Xaa38は、Lys、アミドであるか、または存在しない。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、GLP-1（7-35）、GLP-1（7-36）、GLP-1（7-36）-アミド、GLP-1（7-37）、GLP-1（7-38）、GLP-1（7-39）、GLP-1（7-40）、GLP-1（7-41）またはこれらの類似体から選択される。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、GLP-1（7-37）（配列番号1）と比較して交換され、付加され、もしくは欠失された15アミノ酸以下の残基、またはGLP-1（7-37）（配列番号1）と比較して交換され、付加され、もしくは欠失された10アミノ酸以下の残基を含む。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、GLP-1（7-37）（配列番号1）と比較して交換され、付加され、もしくは欠失された6アミノ酸以下の残基を含む。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、遺伝暗号によってコードされない4アミノ酸以下の残基を含む。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、N末端からの2番目のアミノ酸残基としてAib残基を含む。
本発明のもう一つの態様において、前記インスリン分泌性薬剤のN末端アミノ酸残基（式IIおよびIIIの位置7）は、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニンおよび4-ピリジルアラニンからなる群より選択される。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、[Arg34]GLP-1（7-37）、[Arg26,34]GLP-1（7-37）Lys、[Lys36Arg26,34]GLP-1（7-36）、[Aib8,22,35]GLP-1（7-37）、[Aib8,35]GLP-1（7-37）、[Aib8,22]GLP-1（7-37）、[Aib8,22,35 Arg26,34]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,35 Arg26,34]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22 Arg26,34]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22,35 Arg26,34]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,35 Arg26,34]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22,35 Arg26]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,35 Arg26]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22 Arg26]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22,35 Arg34]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,35Arg34]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22Arg34]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22,35Ala37]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,35Ala37]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22Ala37]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22,35 Lys37]GLP-1（7-37）、[Aib8,35Lys37]GLP-1（7-37）、[Aib8,22Lys37]GLP-1（7-37）またはC末端がアミド化されたこれらの誘導体からなる群より選択される。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、少なくとも1つのAib残基を含む。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、2つのAib残基を含む。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、エキセンジン-4（1-39）を基準として位置12に対応するGLP-1（7-37）（配列番号1）を基準として位置18のセリン残基を含む。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、エキセンジン-4（1-39）を基準として位置13に対応するGLP-1（7-37）（配列番号1）を基準として位置19のチロシン残基を含む。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、エキセンジン-4（1-39）を基準として位置16に対応するGLP-1（7-37）（配列番号1）を基準として位置22のグリシン残基を含む。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、エキセンジン-4（1-39）を基準として位置17に対応するGLP-1（7-37）（配列番号1）を基準として位置23のグルタミン残基を含む。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、エキセンジン-4（1-39）を基準として位置20に対応するGLP-1（7-37）（配列番号1）を基準として位置26のリジン残基を含む。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、エキセンジン-4（1-39）を基準として位置21に対応するGLP-1（7-37）（配列番号1）を基準として位置27のグルタミン酸残基を含む。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、エキセンジン-4（1-39）である。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、ZP-10、すなわち[Ser38Lys39]エキセンジン-4（1-39）LysLysLysLysLys-アミド（配列番号5）である。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、アミノ酸配列配列番号1を基準として位置25〜45のアミノ酸残基を経て分枝重合体に付着される。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、10個のC末端アミノ酸残基のうちの1つから選択されるアミノ酸残基を経て分枝重合体に付着される。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、アミノ酸配列配列番号1を基準として位置23、26、34、36または38のアミノ酸残基を経て分枝重合体に付着される。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、アミノ酸配列配列番号2を基準として位置17、20、28、30または32のアミノ酸残基を経て分枝重合体に付着される。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、C末端アミノ酸残基を経て分枝重合体に付着される。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、カルボキシル基、アミノ基、ケト基、ヒドロキシル基、チオール基またはヒドラジド基を経て分枝重合体に付着される。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、リジン残基上のイプシロン-アミノ基を経て分枝重合体に付着される。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、1つのリジン残基のみを含む。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、前記インスリン分泌性薬剤のC末端アミノ酸残基である1つのリジン残基のみを含む。
もう一つの態様において、本発明に従った化合物は、本明細書に開示した機能的受容体アッセイ法によって決定すると1000pM未満、500pM未満、300pM未満、200pM未満、100pM未満、50pM未満または10pM未満のEC50を有する。
もう一つの態様において、本発明に従った化合物は、以下からなる群より選択される。
GLP-1類似体は、古典的ペプチド合成、たとえばt-BocもしくはF-Moc化学を使用する固相ペプチド合成またはその他の十分に確立された技術によって作成することができる、実施例およびたとえばHouben-Weyl, Methods of organic Chemistry, Volume E 22a, E 22b and E 22 c； Green and Wuts, “Protecting Groups in Organic Synthesis”, Jogn Wiley & Sons, 1999を参照されたい。インスリン分泌性薬剤が非天然アミノ酸残基を含むペプチドであるときに、これらの方法が好ましい。
インスリン分泌性薬剤が、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸残基だけを含むポリペプチドであるとき、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするDNA配列を含み、かつペプチドの発現が可能な条件下で適切な栄養培地中でポリペプチドを発現することができる宿主細胞を培養することを含む方法によっても産生することができ、そしてその後に、生じるペプチドを培養から回収し、次いで式（I）の化合物へと誘導体化させる。
細胞を培養するために使用される培地は、適切な補充を含む最小培地または複合培地などの、宿主細胞を栽培するために適したいずれの従来の培地であってもよい。適切な培地は、市販の供給元から入手可能であるか、または公開された製法（たとえば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログのもの）に従って調製してもよい。次いで、細胞によって産生されるペプチドを遠心分離または濾過によって宿主細胞を培地から分離することを含む従来の手順により、培地から回収してもよい。細胞外産物については、上清のタンパク質成分を、問題のポリペプチドのタイプに応じて、濾過、カラムクロマトグラフィーまたは沈着、たとえば精密濾過法、限外濾過、等電沈殿、種々のクロマトグラフィー法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーその他による精製によって単離する。細胞内または周辺質の産物については、培地から単離した細胞を崩壊させ、または透過化させ、抽出して産物ポリペプチドまたはこれらの前駆体を回収する。
治療的ポリペプチドをコードするDNA配列は、最適には、たとえばゲノムまたはcDNAライブラリを調製すること、および標準的技術（たとえば、Sambrook, J, Fritsch, EF and Maniatis, T, Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989を参照されたい）にしたがって合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションによってペプチドの全部または一部をコードするDNA配列をスクリーニングすることによって得られた、ゲノムまたはcDNA起源のものであってもよい。また、ポリペプチドをコードするDNA配列は、確立された標準的方法、たとえばBeaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 （1981）, 1859 - 1869, または the method described by Matthes et al., EMBO Journal 3 （1984）, 801 - 805によって記述されたホスホアミダイト（phosphoamidite）法によって合成的に調製してもよい。また、DNA配列は、たとえば米国第4,683,202号またはSaiki et al., Science 239 （1988）, 487 - 491に記載されているように、特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応法によって調製してもよい。
DNA配列は、都合よく組換えDNA法に供されるであろういずれのベクターに挿入してもよく、ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存することが多い。したがって、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外の実体として存在し、その複製が染色体の複製から独立したベクター、たとえばプラスミドであってもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに、宿主細胞ゲノムに組み込まれて、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
ある態様において、ベクターは、ポリペプチドをコードするDNA配列が、プロモーターなどのDNAの転写のために必要とされるさらなるセグメントに作動可能に連結された発現ベクターである。プロモーターは、選択の宿主細胞において転写活性を示すいずれのDNA配列であってもよく、宿主細胞に相同または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい。種々の宿主細胞における本発明のペプチドをコードするDNAの転写を指揮するために適したプロモーターの例は、当技術分野において周知である（たとえばSambrook et al., 上記を参照）。
また、ポリペプチドをコードするDNA配列は、必要に応じて、適切なターミネーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列および翻訳エンハンサー配列に作動可能に接続していてもよい。本発明の組換えベクターは、問題の宿主細胞においてベクターの複製を可能にするDNA配列をさらに含んでいてもよい。
また、ベクターは、選択可能なマーカー、たとえばその産物が宿主細胞における欠陥を補完する遺伝子または薬物、たとえばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシンもしくはメトトレキセートに対する耐性を与えるものを含んでいてもよい。大規模製造の態様において、選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性でなく、たとえばベクターの抗生物質耐性遺伝子は、ベクターが大規模製造のために使用されるときに、切除される。抗生物質耐性遺伝子をベクターから除去するための方法は、当技術分野において既知であり、たとえば米国6,358,705号（これは、参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
宿主細胞の分泌経路内に本発明の親ペプチドを向けるために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られる）を組換えベクターに提供してもよい。分泌シグナル配列は、ペプチドをコードするDNA配列に対して正確なリーディングフレームで連結される。分泌シグナル配列は、一般にペプチドをコードするDNA配列に対して5'に位置する。分泌シグナル配列は、通常ペプチドと関連していてもよく、または別の分泌されるタンパク質をコードする遺伝子由来であってもよい。
本ペプチドをコードするDNA配列、プロモーターおよび任意にターミネーターおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ結合するために、並びに複製に必要な情報を含む適切なベクターにこれらを挿入するために使用される手順は、当業者に周知である（たとえばSambrook et al., 上記を参照）。
DNA配列または組換えベクターが導入される宿主細胞は、本ペプチドを産生することができるいずれの細胞であってもよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞を含む。当技術分野において周知かつ使用される適切な宿主細胞の例は、限定したものではないが、大腸菌（E. coli）、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）または哺乳類BHKもしくはCHO株化細胞である。
明らかであるが、上の特許請求の範囲を含む本明細書に記述した本発明の態様の1つまたは複数を組み合わせることよって、新たな態様が得られる。
分枝重合体は、一般に、分岐アプローチおよび収束アプローチと呼ばれる2つの基本的に異なるオリゴマー形成ストラテジーのうちの1つを使用して、上記した単量体ビルディングブロックから構築することができる。
分枝重合体の分岐構築：
一つの態様において、分枝重合体は、合成サイクルの反復過程によって構築され、この場合、それぞれのサイクルでは、適切な活性化された、それ自体が官能性末端基を含み−さらに伸長（すなわち重合体「成長」）することができる、反応性の二分枝または三分枝の単量体ビルディングブロックを使用する。官能性末端基は、通常、自己重合を防止するために保護する必要があり、そのような場合、さらなる伸長のための官能性末端基を生成するために脱保護工程が必要である。反復過程において、活性化された（反応性の）単量体ビルディングブロックを添加すること、およびその後の脱保護の一回のこのようなサイクルにより生成が完了する。分岐アプローチは、溶液相化学を使用して反応スキーム4において、および固相化学を使用して反応スキーム3において例証してある。
一つの態様において、分枝重合体は、合成サイクルの反復過程によって構築され、この場合、それぞれのサイクルでは、適切な活性化された、それ自体が官能性末端基を含み−さらに伸長（すなわち重合体「成長」）することができる、反応性の二分枝または三分枝の単量体ビルディングブロックを使用する。官能性末端基は、通常、自己重合を防止するために保護する必要があり、そのような場合、さらなる伸長のための官能性末端基を生成するために脱保護工程が必要である。反復過程において、活性化された（反応性の）単量体ビルディングブロックを添加すること、およびその後の脱保護の一回のこのようなサイクルにより生成が完了する。分岐アプローチは、溶液相化学を使用して反応スキーム4において、および固相化学を使用して反応スキーム3において例証してある。
分枝重合体の収束構築：
しかし、このような反復過程でより高次世代材料に到達するときは、官能性末端基のパッキング密度が高くなることが多く、これがさらなる規則的成長を防げて不完全な世代を生じてしまう。実際に、成長に多数の表面官能基の反応を必要とする全ての系で、それぞれの成長段階において全てを確実に反応させることは、困難である。反応していない官能性末端基は、段階的成長順序の後期の段階にて連鎖失敗（切断）または偽反応を引き起こす可能性があり、これが、規則的な一分岐され、かつ高度に組織化された分枝構造の合成に重大な問題をもたらす。
しかし、このような反復過程でより高次世代材料に到達するときは、官能性末端基のパッキング密度が高くなることが多く、これがさらなる規則的成長を防げて不完全な世代を生じてしまう。実際に、成長に多数の表面官能基の反応を必要とする全ての系で、それぞれの成長段階において全てを確実に反応させることは、困難である。反応していない官能性末端基は、段階的成長順序の後期の段階にて連鎖失敗（切断）または偽反応を引き起こす可能性があり、これが、規則的な一分岐され、かつ高度に組織化された分枝構造の合成に重大な問題をもたらす。
ある態様において、分枝重合体は、したがって、米国特許第5,041,516号に記述した収束アプローチによって構築される。巨大分子を造るための収束アプローチには、分岐アプローチと同様にそのコアではなく、その周辺にて開始することによって、最終分子を構築することを含む。これにより、典型的には、次第に多数の部位にて反応することに付随した、不完全な共有結合の形成などの問題が回避される。
第2世代分枝重合体の構築のための収束アプローチを、単量体ビルディングブロックの1つを含む具体例を使用して、反応スキーム1に、および反応スキーム2に示してある。
分枝重合体の硬性は、特定の単量体をデザインすることにより、たとえば強固なコア構造（X3またはX4）を使用することにより、または強固なリンカー部分（L1およびL2）を使用することにより制御することができる。もう一つの態様において、硬性の調整は、より柔軟な性質の単量体と混在する1つまたは複数の特定の層に強固な単量体を使用することによって得られる。もう一つの態様において、重合体の全体の親水性の性質を制御することができる。これは、樹状層の1つまたは複数に、より疎水性のコア構造（X3またはX4）またはより疎水性のリンカー部分（L1およびL2）をもつ単量体を選択することによって達成される。
もう一つの態様において、最終GLP-1抱合体において、周囲環境に曝露される分枝重合体の外側の末端層（Z）に、異なる単量体が使用される。本明細書に記述したいくつかの単量体は、末端末端基（B’）として保護されたアミン官能性を有し、これは、脱保護後に、かつ生理学的条件下で、すなわち約7.4のpH値に緩衝された中性生理学的条件下で、プロトン化されてポリカチオンで荷電された全体構造を生じさせる。あるいは、中性構造は、種々のアシル化試薬でキャッピングすることによって作製することができる。反応スキーム5に例証したような一例では、樹状構造の最終層（Z）をキャッピングするためにCH3（OCH2CH2）2CH2COOHを使用し、これは、さもなければアミンで終結するであろう。
もう一つの態様において、天然に存在する糖ペプチドを模倣し、これらのN-グリカンのアンテナ構造上の終結基として、一般に複数の陰イオン性に荷電したシアル酸を有する分枝重合体が提供される。最終層（Z）を作製するために使用される単量体を適当に選択することにより、このようなグリカンを、これらのポリ陰イオン性の性質に関して模倣することができる。このような例を反応スキーム6に示してあり、この場合、分枝重合体は、コハク酸モノtert-ブチルエステルでキャップされており、酸での脱保護により、生理学的条件下で負に荷電した重合体表面を与える。
重合体への単量体の構築は、たとえば、N.J. Wells, A. Basso and M. Bradley in Biopolymers 47, 381-396 （1998）によって記述されたような固体支持体上で、またはたとえば米国特許第5,041,516号においてFrechetらによって記述されたような古典的な溶液相化学によって適切な有機溶媒中で、いずれで行ってもよい。
したがって、ある態様において、分枝重合体は、上記および反応スキーム3で例証したような反復分岐過程において適切な結合により誘導体化した固体支持体上で構築される。FmocまたはBoc保護アミノ基（B’）および反応性官能性アシル化部分（A’）と共にデザインされる単量体については、従来のペプチド合成のために有用な固相プロトコルに都合よく適応させることができる。適用可能であれば、文献に記述されたものなどの標準的固相法（Fields, editor, Solid phase peptide synthesis, in Meth Enzymol 289を参照されたい）を適切なプログラム可能な機器（たとえば、ABI 430A）もしくは同様の自己構築した機械または支持体の分離および洗浄のための手動で使用する標準的濾過技術のいずれかを使用することによって行うことができる。
DMT保護されたアルコール基（B’）および、たとえば、反応性ホスホラミダイト（A’）での単量体のためには、たとえばApplied Biosystems Expidite 8909などの標準的オリゴヌクレオチド合成のために使用される固相設備およびM. Dubber and J.M.J. Frechet in Bioconjugate chem. 2003, 14, 239-246によって最近記述されたものなどの条件を都合よく適用することができる。従来のホスホラミダイト法に従ったこのようなリン酸ジエステルの固相合成は、通常中間体亜リン酸エステル三エステルをリン酸三エステルに酸化させることを必要とする。このタイプの固体支持体酸化は、典型的にはヨウ素／水またはtert-ブチル過酸化水素および3-クロロ過安息香酸などの（しかし、これらに限定されるわけではない）過酸化物で達成され、保護の有無にかかわらず、単量体が酸化条件に耐える必要がある。また、ホスホラミダイト法では、ピリジンまたは3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン-1,1-ジオキシドなどの有機チオール化試薬の元素硫黄でのヨウ素の単純な置換により、チオリン酸エステルを便利に合成することができる（たとえば、M. Dubber and J.M.J. Frechet in Bioconjugate chem. 2003, 14, 239-246を参照されたい）。
次いで、樹脂に付着した分枝重合体は、完成時に、適切な条件下で樹脂から切断することができる。成長する重合体と固体支持体との間で切断できるリンカーは、個々の合成サイクルに使用されるいずれの脱保護工程、酸化または還元工程を含む個々の単量体のオリゴマー形成過程の間に無傷のままであるが、必要に応じて、適切な条件下で最終分枝重合体を無処置のまま切断することができるように選択されることが重要である。当業者であれば、問題の単量体に応じてリンカーおよび支持体、並びにオリゴマー形成過程、脱保護過程および任意に酸化過程のための反応条件を適切に選択することができるであろう。
単量体単位を付着することができ、その後に切断可能部分として作用する適切な官能基で誘導体化された樹脂は、市販されている（たとえば、Bachem and NovoBiochemのカタログを参照されたい）。
もう一つの態様において、分枝重合体は、適切なリンカーをもつ樹脂上で合成され、これは、切断により、後述するようにその後の溶液相抱合過程でインスリン分泌性薬剤（ITA）に対して付着基として直接作用することができ、または代わりに、適切な化学的手段により、このような付着基に変換することができる官能基と共に供給される分枝重合体生成物を生成する。
もう一つの態様において、一定のサイズの樹状分枝重合体および組成物は、古典的な溶液相技術を使用して合成される。
本態様において、分枝重合体は、成長している重合体に適切な活性化された単量体を連続添加することによって、適切な溶媒中で構築される。それぞれの添加の後、次世代の構築が開始し得る前に、脱保護工程が必要であるかもしれない。完全な反応に達するためには、過剰な単量体を使用することが望ましいであろう。ある態様において、過剰な単量体の除去には、親水性重合体がジエチルエーテルまたは同様のタイプの溶媒に難溶性であるという事実を利用する。こうして、成長している重合体を沈殿させて、過剰な単量体、カップリング試薬、副産物その他を溶液に残す。次いで、相分離を単純なデカンテーションによって行うことができる。遠心分離による態様において、デカンテーションを伴った。また、P.R. Ashton in et al. in J.Org.Chem. 1998, 63, 3429-3437によって記述されたとおり、重合体は、たとえばシリカゲルでの従来のクロマトグラフィーの技術によって、または正常もしくは逆相条件のいずれかの下でHPLCもしくはMPLC系を使用することにによって副産物から分離することができる。あるいは、かなり大きな重合体では、E.R.Gillies and J.M.J. Frechet in J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 14137-14146によって記述されたとおり、サイズ排除クロマトグラフィーを、任意に透析と組み合わせて使用して、過剰な単量体および副産物などの低分子の成分から分離することができる
もう一つの態様において、収束溶液相合成が使用される。固相法とは対照的に、溶液相では、上記のとおりの、およびS.M.Grayson and J.M.J.Frechet in Chem.Rev. 2001, 101, 3819-3867によってさらに概説されたとり、分枝重合体の構築のために収束性アプローチを使用することもできる。このアプローチでは、合成を単量体で開始することが望ましく、この場合、最初に、保護された官能性末端基（B’）が、最終的には最終分枝重合体の外面に存在すると考えられる部分に変換される。したがって、一般式Iの官能性部分（A’）は、ほとんどの場合、末端基（B’）の段階的化学操作を可能にする適切な保護を必要とする。官能性部分（A’）のための保護基の選択は、実際には官能性基に依存する。たとえば、一般式IVbまたはIVcのA’がカルボキシル基である場合、TFAによって除去することができるtert-ブチルエステル誘導体が適切な選択であろう。適切な保護基は、当業者に既知であり、その他の例をGreen & Wuts “Protection groups in organic synthesis”, 3rd edition, Wiley-interscienceにおいて見いだすことができる。分枝重合体の収束性構築を反応スキーム1および反応スキーム2に例証してある。本反応スキームは、下記に見出すことができる。反応スキーム1の工程（i）において、tert-ブチルエステル官能性（A’）は、tert-ブチルα-ブロモ酢酸と適切な前駆体（precurser）の反応によって調製される。工程（ii）において、末端基（B’）は、これらを工程（iii）のカルボン酸とのアシル化が可能で、工程（iv）においてアシルハロゲン化物に変換することができるような方法で操作される。工程（v）では、tert-ブチルエステル官能性（A’）を除去して末端（B’）がキャップされた単量体を作製する。この末端キャップされた単量体は、反応スキーム2における第二世代生成物を調製するための出発材料として役立ち、ここでは、反応スキーム1の工程（ii）の生成物とのアシル化反応に2当量が使用される。この反応の生成物は、新たなtert-ブチルエステルであり、これは、脱保護後に、より高次世代材料を作製する反復様式において、反応スキーム2の初期工程に再び入れることができる。
もう一つの態様において、収束溶液相合成が使用される。固相法とは対照的に、溶液相では、上記のとおりの、およびS.M.Grayson and J.M.J.Frechet in Chem.Rev. 2001, 101, 3819-3867によってさらに概説されたとり、分枝重合体の構築のために収束性アプローチを使用することもできる。このアプローチでは、合成を単量体で開始することが望ましく、この場合、最初に、保護された官能性末端基（B’）が、最終的には最終分枝重合体の外面に存在すると考えられる部分に変換される。したがって、一般式Iの官能性部分（A’）は、ほとんどの場合、末端基（B’）の段階的化学操作を可能にする適切な保護を必要とする。官能性部分（A’）のための保護基の選択は、実際には官能性基に依存する。たとえば、一般式IVbまたはIVcのA’がカルボキシル基である場合、TFAによって除去することができるtert-ブチルエステル誘導体が適切な選択であろう。適切な保護基は、当業者に既知であり、その他の例をGreen & Wuts “Protection groups in organic synthesis”, 3rd edition, Wiley-interscienceにおいて見いだすことができる。分枝重合体の収束性構築を反応スキーム1および反応スキーム2に例証してある。本反応スキームは、下記に見出すことができる。反応スキーム1の工程（i）において、tert-ブチルエステル官能性（A’）は、tert-ブチルα-ブロモ酢酸と適切な前駆体（precurser）の反応によって調製される。工程（ii）において、末端基（B’）は、これらを工程（iii）のカルボン酸とのアシル化が可能で、工程（iv）においてアシルハロゲン化物に変換することができるような方法で操作される。工程（v）では、tert-ブチルエステル官能性（A’）を除去して末端（B’）がキャップされた単量体を作製する。この末端キャップされた単量体は、反応スキーム2における第二世代生成物を調製するための出発材料として役立ち、ここでは、反応スキーム1の工程（ii）の生成物とのアシル化反応に2当量が使用される。この反応の生成物は、新たなtert-ブチルエステルであり、これは、脱保護後に、より高次世代材料を作製する反復様式において、反応スキーム2の初期工程に再び入れることができる。
インスリン分泌性薬剤（ITA）に対する分枝重合体分子の共有結合を行うためには、溶液中、または固体支持体上のいずれかにおいて、分枝重合体を反応性ハンドルと共に提供しなければならず、すなわち反応性官能基と共に供給されなければならず、その例には、カルボン酸、第一アミノ基、ヒドラジド、O-アルキル化されたヒドロキシルアミン、チオール、スクシナート、スクシンイミジルスクシナート、スクシンイミジルプロプリオナート（succimidyl proprionates）、スクシンイミジル（succimidyl）カルボキシメチラート、ヒドラジドアリールカルボナートおよびニトロフェニルカルバマートなどのアリールカルバマート、並びにニトロフェニルカルボナート、クロロカルボナート、イソチオシアナート、イソシアナート、マレイミド（malemides）および
などの活性化されたエステルを含む。
ITAに対する分枝重合体の抱合は、従来法によって行われ、当業者に既知である。当業者であれば、ITAに対して選択された付着基（たとえば、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基など）および分枝重合体（たとえば、スクシンイミジルプロプリオナート（succimidyl proprionates）、ニトロフェニルカルボナート、マレイミド（malimides）、ビニルスルホン、ハロアセテートなど）に応じて、使用すべき賦活法および／または抱合化学（たとえば、反応基の選択など）を知っているであろう。もう一つの態様において、上述したような分枝重合体上の適切な付着部分は、分枝重合体を従来の溶液相化学を使用して構築した後に作製する。カルボン酸基を含む分枝重合体上の求核性付着部分を作製するための種々の方法を例証する本発明の態様を、反応スキーム7の一覧表に記載してある。
分枝重合体誘導体でのリジン上のεアミノ基の直接のアシル化に代わるものとして、たとえばN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、1-ヒドロキシベンゾトリアゾルエステルその他などの活性化を使用して、最初にインスリン分泌性薬剤（ITA）をホルミル誘導体化したカルボキシル酸でアシル化してもよい。次いで、アルデヒド官能性を有する生じるITAは、任意に有機共存溶媒を含む水性媒体中で、中性、酸性またはアルカリ性pHにて2つの成分を混合することにより、次にたとえばO置換されたヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはヒドラジドとして適切に誘導体化された本発明のモノ、オリゴまたは重合体ビルディングブロックと縮合させてもよい。この場合、L4は、原子価結合であり、一般式Iの二価のラジカルL3には、オキシム基を含む。部分L4さらに隣接したL3の代表的な非限定の例には、（synおよびanti形態として）：
を含む。
ある態様において、L3は、定義に従った二価のラジカルであり、L4は、原子価結合および式-CO-L5-CH=N-O-の部分の中から選択され、式中L5は、原子価結合、アルキレンまたはアリーレンであり、かつ前記L4部分の末端カルボニル部分は、ITA部分に結合されている。L4の代表的な非限定の例には、（synおよびanti形態として）：
を含む。
あるいは、インスリン分泌性薬剤（ITA）は、たとえば過ヨウ素酸酸化などの化学反応後に、アルデヒド官能性を含むITA分子を生成しうる部分で誘導体化してもよい。次いで、アルデヒド官能性を有するITAを上のように、任意に有機共存溶媒を含む水性媒体中で、中性、酸性またはアルカリ性pHにて2つの成分を混合することにより、たとえばO置換されたヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはヒドラジドとして適切に誘導体化された本発明のモノ、オリゴまたは重合体ビルディングブロックと縮合させてもよい。
特定の例には、リジン上のεアミノ基のセリンとの最初のアシル化、続いてグリオキシル誘導体化されたITAを生成する過ヨウ素酸の切断がある。この場合、二価のL4部分さらに隣接したL3部分の代表的な非限定の例には、（synおよびanti形態として）：
を含む。
また、L3は、定義に従った二価のラジカルであってもよく、L4は、オキシイミノアルキルカルボニル基であってもよい。
代表的な非限定の例には、（synおよびanti形態として）：
を含む
生物学的に活性なITAを、ITAのpH要求に応じて任意に緩衝されている水性反応媒体中において活性化された分枝重合体と反応させる。反応のための最適pH値は、一般に約6.5〜約8の間にある。ある態様において、大部分のITA類似体については約7.4である。
生物学的に活性なITAを、ITAのpH要求に応じて任意に緩衝されている水性反応媒体中において活性化された分枝重合体と反応させる。反応のための最適pH値は、一般に約6.5〜約8の間にある。ある態様において、大部分のITA類似体については約7.4である。
インスリン分泌性薬剤（ITA）安定性、反応効率、その他のための最適反応条件は、当技術分野において当業者のレベル内にある。ある態様において、温度領域は、約4℃〜約37℃である。反応媒体の温度は、インスリン分泌性薬剤（ITA）が変性し、または分解し得る温度を上回ることはできない。ある態様において、インスリン分泌性薬剤（ITA）を過剰な活性化された分枝重合体と反応させる。反応に続いて、ダイアフィルトレーションや、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを含むカラムクロマトグラフィーや、電気泳動法またはこれらの組み合わせその他などによって抱合体を回収し、精製する。
ある態様において、抱合の方法は、標準的化学に基づいており、これは以下の様式で行われる。分枝重合体は、反応スキーム7にて例証したように、たとえばジアミノアルキル連結されたアミノオキシ酢酸のアシル化によって合成の間に付着されたアミノオキシアセチル基を有する。ITAは、末端セリンまたはスレオニン残基を有し、これがRose in J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 30-33および欧州特許第0243929号に従って過ヨウ素酸塩で穏やかな条件下でグリオキシリル基に酸化される。あるいは、アルデヒド官能基は、リジン残基のεアミノ基などの曝露されたアミノ基を、アルデヒドまたは一時的に保護されたアルデヒド基を含むアシル化部分でアシル化することによって導入してもよい。分枝重合体のアミノオキシ成分およびITAのアルデヒド成分は、ほぼ等しい比率で、約1〜約10mMの範囲の濃度にて水溶液中で穏やかな酸性条件にて、たとえば約2〜約5の範囲のpH値にて、特に室温周辺にて混合し、抱合反応（この場合、オキシム化）後に逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）およびエレクトロスプレーイオン化質量分析（ES-MS）を行う。反応速度は、濃度、pH値および立体因子に依存するが、通常数時間以内に平衡可視、平衡は、抱合体にとって非常に好む（Rose, et al., Bioconjugate Chemistry 1996, 7, 552-556）。1成分がわずかに過剰であると（約5倍まで）抱合反応を完了の方に進められる。生成物を単離して、オキシムについて前述したように特徴づける。ITA類似体は、たとえば逆相HPLCによって精製する（Rose, J Am. Chem.Soc.上記およびRose, et al., Bioconjugate Chemistry上記）。
もう一つの態様において、抱合の方法は、以下の様式で行われる：分枝重合体を反応スキーム3にて例証したように、SasrinまたはWang樹脂（Bachem）上で合成する。樹脂製造業者（Bachem）によって推奨される手順を使用して、分枝重合体をTFAのジクロロメタン溶液で繰り返し処置することによって樹脂から切断し、切断された重合体の溶液をピリジンのメタノール溶液で中和する。室温における（熱を適用しない）溶剤蒸発およびこれがGLP-1であるかのように切断された重合体を精製後、樹脂に結合されていたカルボキシル基を活性化し（たとえば、HBTU、TSTUまたはHATUで）、ペプチド化学の標準的技術によって、インスリン分泌性薬剤（ITA）上の求核基（アミノ基など、すなわち溶解素の側鎖上のεアミノ基）に結合させる。必要に応じて、修飾された標的分子または材料を、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、調製用等電点電気泳動、その他などの当業者に周知の多数の精製法のうちの1つによって、反応混合物から精製することができる。巨大分子精製、特にペプチド精製のための一般的方法および原理は、たとえば"Protein Purification: Principles and Practice" by Seeres, 2nd edition, Springer-Verlag, New York, NY, （1987）において見出すことができ、これは、参照により本明細書に援用される。
本発明の化合物を調製するために使用される親GLP-1類似体またはGLP-1誘導体の多くは、既知であり（一連の非限定の例について、L.B. Knudsen et al., J. Med. Chem. 2000, 43, 1664-1669を参照されたい）、その他には、既知の化合物の調製と類似して、または当業者に明らかなその他の方法によって調製することができる。
前述のものでは、分枝重合体との抱合のために適したGLP-1類似体を含むインスリン分泌性薬剤（ITA）を例証している。また、具体的に述べられていないが、適切な特性を有するインスリン分泌性薬剤および類似体も意図されており、本発明の範囲内であることが理解されるはずである。
もう一つの態様において、水溶性重合体が提供される。これらは、GLP-1類似体の特性を増強するための薬剤として重要である。たとえば、溶解度を増大するためには、水溶性重合体をGLP-1類似体に対して抱合することによる。固有の免疫原性特性を有するGLP-1類似体に対する分枝重合体の付着により、抱合されていないGLP-1類似体によって生じる免疫応答と比較して免疫応答が減少された抱合体、または薬物動態学的プロフィールが増大し、保存寿命が増大し、および生物学的半減期が増大した抱合体を提供する。本発明は、修飾されていないGLP-1類似体の生物学的活性を実質的に減少させ、または妨害することのなく、親水性水溶性分枝重合体を付着することによって修飾されたGLP-1類似体を提供する。
本発明のGLP-1類似体は、構造的に明確に定義された重合体によって修飾され、本質的に均質な化合物であり、分枝重合体の世代の数が明確に定義されている。
本発明は、抱合されていないGLP-1の生物活性を維持した抱合体を提供する。本発明のもう一つの態様において、抱合されたGLP-1は、抱合されていないGLP-1と比較して、改善された特徴を有する。
本発明のもう一つの態様において、GLP-1の一定部分に抱合された分枝重合体は、GLP-1の生物学的利用能、能力、および有効性または活性を減少させる。このような減少は、持放性原理に基づいた薬物送達システムに好ましいものであることができる。もう一つの態様において、分枝重合体が生理学的条件下で切断されて、これにより生物活性なGLP-1を分枝重合体からゆっくりと放出することができるリンカーと結合して使用される持放性原理が想定される。この場合、GLP-1は、分枝重合体が除去される前は、生物学的に活性ではない。具体的態様において、切断可能なリンカーは、たとえば血清中に存在するプロテアーゼの基質として機能することができる小ペプチドである。
重合体抱合体は、付着される重合体分子の数、サイズおよび組成（たとえば、世代の数およびそれぞれの世代に使用される特定の単量体）、並びにGLP-1に対する付着点に関して、最適な分子を生成するようにデザインされることが理解されるであろう。使用される分枝重合体の詳細な分子量は、たとえば達成されるべき所望の効果に基づいて選択してもよい。たとえば、抱合体の主要目的が、（たとえば、腎クリアランスを減少させるために）高分子量を有する抱合体を達成することである場合、通常望ましい分子量を得るためにできる限り高分子分枝重合体分子を抱合しないことが望ましい。その他の場合には、GLP-1上の免疫原性エピトープの特異的または非特異的タンパク質分解性の切断または遮蔽から保護することが望ましいであろうし、特定の低分子量をもつ分枝重合体が、最適の選択であろう。
したがって、本発明により、微調整された所定の質量をもつ、重合体で誘導体化されたGLP-1類似体（抱合体）が得られる。本発明のさらにもう一つ態様において、本明細書に記述したように調製された分枝重合体は、GLP-1に抱合されている。本発明のもう一つの態様において、これにより、経肺生物学的利用能が増大した抱合体を生産する。本発明のもう一つの態様において、これにより、肺作用期間が増大した抱合体を生産する。
関連した態様において、本明細書に記述したような分枝重合体は、非ヒト供与源から得られた生物薬剤GLP-1上の免疫原性エピトープを保護するために使用される。
さらにもう一つの態様において、分枝水溶性重合体は、その修飾されていない状態で、かつ生理学的条件下で難溶解性を有するGLP-1に抱合されている。
もう一つの態様において、本発明の一定のGLP-1抱合体のインビボ半減期は、10%以上改善される。ある態様において、本発明の一定のGLP-1抱合体のインビボ半減期は、25%以上改善される。ある態様において、本発明の一定のGLP-1抱合体のインビボ半減期は、50%以上改善される。ある態様において、本発明の一定のGLP-1抱合体のインビボ半減期は、75%以上改善される。ある態様において、本発明の一定のGLP-1抱合体のインビボ半減期は、100%以上改善される。もう一つの態様において、一定のGLP-1のインビボ半減期は、分枝重合体の抱合により、250%増大した。
もう一つの態様において、本発明の一定のGLP-1抱合体の機能的インビボの半減期は、10%以上改善される。もう一つの態様において、本発明の一定のGLP-1抱合体の機能的インビボの半減期は、25%以上改善される。もう一つの態様において、本発明の一定のGLP-1抱合体の機能的インビボの半減期は、50%以上改善される。もう一つの態様において、本発明の一定のGLP-1抱合体の機能的インビボの半減期は、75%以上改善される。もう一つの態様において、本発明の一定のGLP-1抱合体の機能的インビボの半減期は、100%以上改善される。もう一つの態様において、一定のGLP-1の機能的半減期は、分枝重合体の抱合により250%増加する。
一般に、溶液中でのGLP-1類似体の安定性は、非常に乏しい。従って、本発明の一実施例において、本明細書に記述したような明確に定義された水溶性分枝重合体をGLP-1類似体を抱合して、再折りたたみなどの構造変化を最小化することによってGLP-1を安定化し、GLP-1活性を維持することができる。
関連した態様において、本明細書に記述したとおり、GLP-1の貯蔵半減期は、分枝重合体に抱合することによって改善される。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、DPPIV保護されたペプチドである。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、本明細書に開示した機能的受容体アッセイ法によって1nM未満のEC50を有すると決定される。
本発明のもう一つの態様において、インスリン分泌性薬剤は、本明細書に開示した機能的受容体アッセイ法によって300pM未満、200pM未満または100pM未満のEC50を有すると決定される。
反応スキーム1-溶液中での収束合成-キャップされた−第一世代
反応スキーム2：局所部位が保護された第二世代
反応スキーム3：第二世代の分枝重合体の固相合成
反応スキーム4：溶液中での第二世代の材料の分岐合成
反応スキーム5：Me（PEG）2CH2COOH酸を使用する第二世代重合体の末端キャッピングの例証。
反応スキーム6：ポリ陰イオン性の糖擬態重合体を作製するためのコハク酸モノtertブチルエステルを使用する、固体支持体またはインスリン分泌性薬剤（R）に付着された第二世代重合体の末端キャッピングの例証。
反応スキーム7：ITA分子に対する重合体抱合のため適した反応性ハンドルの形成。第二世代の高分子物質について例証してある。
薬学的投与
式Iの本発明の抱合GLP-1類似体は、たとえば皮下に、経口的に、または肺に投与することができる。
式Iの本発明の抱合GLP-1類似体は、たとえば皮下に、経口的に、または肺に投与することができる。
皮下投与のためには、式Iの化合物は、既知のGLP-1類似体の製剤と同様に処方される。さらに、皮下投与のためには、式Iの化合物は、既知のGLP-1類似体の投与と同様に投与され、一般に、医師はこの手順をよく知っている。
経口投与のためには、式Iの化合物は、経口的に投与されるその他の医薬の製剤と同様に処方される。さらに、経口投与のためには、式Iの化合物は、既知の経口医薬の投与と同様に投与され、主に、医師は、このような手順をよく知っている。肺製品のためには、以下の詳細が示される：
本発明の抱合されたGLP-1類似体は、循環GLP-1レベを増大させるため、および／または循環グルコースレベルを低下させるために有効な用量様式で、吸入法によって投与してもよい。このような投与は、糖尿病または高血糖などの障害を治療するために有効であり得る。GLP-1の有効な用量を達成するには、本発明の抱合されたGLP-1の約0.5μg/kg〜約50μg/kg以上の吸入される用量の投与が必要である。治療上有効量は、GLP-1レベル、血糖値、患者の身体条件、患者の肺状態等を含む要因を考慮する知識のある開業医によって決定することができる。
本発明の抱合されたGLP-1類似体は、循環GLP-1レベを増大させるため、および／または循環グルコースレベルを低下させるために有効な用量様式で、吸入法によって投与してもよい。このような投与は、糖尿病または高血糖などの障害を治療するために有効であり得る。GLP-1の有効な用量を達成するには、本発明の抱合されたGLP-1の約0.5μg/kg〜約50μg/kg以上の吸入される用量の投与が必要である。治療上有効量は、GLP-1レベル、血糖値、患者の身体条件、患者の肺状態等を含む要因を考慮する知識のある開業医によって決定することができる。
本発明によれば、本発明の抱合されたGLP-1は、これらの迅速な吸収を達成するために吸入法によってを送達してもよい。吸入法による投与は、GLP-1類似体の皮下投与と同等の薬物動態を生じ得る。本発明の抱合されたGLP-1吸入法は、循環GLP-1レベルの迅速な上昇、続く血糖値の迅速な落下を引き起こす。異なる吸入装置でも、同様の粒径および同様の肺沈着レベルを比較すると、典型的には同様の薬物動態を提供する。
本発明によれば、本発明の抱合されたGLP-1は、吸入法による治療薬の投与のための、当該技術分野において既知の種々の吸入装置のいずれによって送達してもよいこれらの装置には、定用量吸入器、噴霧器、乾燥粉末発生装置、噴霧器、その他を含む。ある態様において、本発明の抱合されたGLP-1は、乾燥粉末吸入器または噴霧器によって送達される。本発明の抱合されたGLP-1を投与するための吸入装置には、いくつかの望ましい特色がある。たとえば、吸入装置による送達は、信頼でき、再現性があり、かつ正確であることが都合よい。吸入装置は、小粒子、たとえば約10マイクロメートル未満、たとえば快適に呼吸できるためには、約1〜5マイクロメートルを送達すべきである。本発明の実施のために適した市販の吸入装置のいくつかの具体例には、Turbohaler（商標）（Astra）、Rotahaler（登録商標）（Glaxo）、Diskus（登録商標）（Glaxo）、Spiros（商標）吸入器（Dura）、Inhale Therapeuticsによって市場に出されている装置、AERx（商標）（Aradigm）、Ultravent噴霧器（Mallinckrodt）、Acorn II（登録商標）噴霧器（Marquest Medical Products）、Ventolin（登録商標）定用量吸入器（Glaxo）、Spinhaler（登録商標）粉末吸入器（Fisons）等がある。
当業者であれば認識するであろうとおり、本発明の抱合されたGLP-1の製剤、送達される製剤の量および単一用量の投与の期間は、使用される吸入装置のタイプに依存する。噴霧器などのいくつかのエアロゾル送達系については、投与の頻度および系が活性化される延べ時間は主に、エアロゾル内のGLP-1抱合体の濃度に依存する。たとえば、投与の期間が短いほど、噴霧器溶液において高濃度のGLP-1抱合体を使用することができる。定用量吸入器などの装置では、より高いエアロゾル濃度を生じさせることができ、所望の量のGLP-1抱合体を送達するために、操作をより短い期間にすることができる。粉末吸入器などの装置は、所与の装入量の薬剤が装置から放出されるまで、活性薬剤を送達する。この種の吸入器では、所与の量の粉末の本発明の抱合されたGLP-1の量により、単独投与で送達される用量を決定する。
吸入装置によって送達される製剤中の本発明の抱合されたGLP-1の粒径は、GLP-1が肺内でこれを作る能力に関して重要である。下気道または肺胞への態様において。ある態様において、本発明の抱合されたGLP-1は、また、送達されたGLP-1抱合体の少なくとも約10%が肺に沈着するように処方される。ある態様では、約10〜約20以上である。約2マイクロメートル〜約3マイクロメートルの粒径で、口呼吸しているヒトのための肺沈着の最高効率が得られることが知られている。粒径が上記の約5μMを上回るとき、肺沈着は激減する。約1μを下回る粒径では、肺沈着の減少を引き起こし、治療的に有効な十分量の粒子を送達することが困難になる。したがって、本発明の態様において、吸入によって送達されるGLP-1抱合体の粒子は、約10μM未満の粒径を有する。ある態様では、約1μM〜約5μMの範囲である。GLP-1抱合体の製剤は、選ばれた吸入装置において所望の粒径を生じるように選択される。
乾燥粉末としての投与するための態様では、本発明の抱合されたGLP-1は、約10μM未満の粒径をもつ粒状形態で調製される。ある態様では、約1〜約5μMである。ある態様において、粒径は、患者の肺の肺胞に送達するために有効である。ある態様において、乾燥粉末は、大多数の粒子が所望の範囲のサイズを有するように製造された粒子で主に構成される。ある態様において、乾燥粉末の少なくとも約50%は、約10μM未満の直径を有する粒子でできている。このような製剤は、GLP-1抱合体とその他の所望の成分とを含む溶液の噴霧乾燥、製粉または臨界点凝縮によって達成することができる。また、本発明に有用な粒子を作製するために適したその他の方法は、当該技術分野において既知である。
粒子は、通常、乾燥粉末製剤から容器内に分離し、次いで担体気流を経て患者の肺に輸送される。典型的には、現在の乾燥粉末吸入器では、固体を分解する力は、単に患者の吸入のみによって提供される。1つの適切な乾燥粉末吸入器は、Astra（Sodertalje, Sweden）によって製造されるTurbohaler（商標）である。吸入器のもう一つのタイプでは、患者の吸入によって発生する気流が、単量体GLP-1類似体粒子の塊をほぐす羽根車モーターを活性化する。Dura Spiros（商標）吸入器は、このような装置である。
乾燥粉末吸入器からの投与のための本発明の抱合されたGLP-1の製剤は、典型的にはGLP-1抱合体を含む微細に分割された乾燥粉末を含むが、粉末には、増量剤、担体、賦形剤、別の添加物等も含むことができる。添加物には、たとえば特定の粉末吸入器からの送達のために必要とされる粉末を希釈するために、製剤のプロセシングを容易にするために、製剤に有利な粉体物性を提供するために、吸入装置からの粉末の分散を促進するために、製剤（たとえば、抗酸化剤または緩衝液）を安定化するために、製剤に味を提供するために、その他のためにGLP-1抱合体の乾燥粉末製剤で含めることができる。添加物は、患者の気道に悪影響を与えないことが都合よい。GLP-1抱合体は、分子レベルで添加物と混合することができ、または固体製剤には、添加物の粒子と混合し、またはコーティングしたGLP-1抱合体の粒子を含めることができる。典型的な添加物には、一糖、二糖および多糖；たとえば乳糖、グルコース、ラフィノース、メレチトース、ラクチトール、マルチトール、トレハロース、ショ糖、マンニトール、デンプンまたはこれらの組み合わせなどの糖アルコールおよびその他のポリオール；ソルビトール、ジホスファチジルコリンまたはレシチンなどの界面活性物質；その他を含む。典型的には、増量剤などの添加物は、上記した目的のために有効な量で、たいてい製剤の約50%〜約90重量％で存在する。また、GLP-1類似体タンパク質などのタンパク質製剤のための、当該技術分野において既知のさらなる薬剤も、製剤に含めることができる。
本発明の抱合されたGLP-1を含むスプレーは、圧力下でノズルを介してGLP-1抱合体の懸濁液または溶液を圧力をかけることによって産生することができる。ノズルサイズおよび配置（加圧力）および液体の流加速度は、所望出力および粒径を達成するように選ぶことができる。エレクトロスプレーは、たとえばキャピラリーまたはノズルフィードと組み合わせた電場によって産生することができる。ある態様において、噴霧器によって送達されるGLP-1抱合体の粒子は、約10μM未満の粒径を有する。ある態様において、約1μM〜約5μMの範囲である。
噴霧器の用途に適した本発明の抱合されたGLP-1の製剤は、典型的には溶液1mlあたり約1mg〜約20mgのGLP-1抱合体の濃度で水溶液中にGLP-1抱合体を含む。製剤には、賦形剤、緩衝液、等張薬、保存剤、界面活性物質などの薬剤を含むことができる。ある態様において、製剤は、亜鉛を含む。また、製剤は、緩衝液、還元剤、バルクタンパク質または炭水化物などのGLP-1抱合体の安定化のための賦形剤または薬剤を含むことができる。GLP-1抱合体を製剤化するのに有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミン等が含まれる。GLP-1抱合体を製剤化するのに有用な典型的な炭水化物には、ショ糖、マンニトール、乳糖、トレハロース、グルコース等が含まれる。また、GLP-1抱合体製剤は、エアロゾルを形成する際に溶液の微粒化によって生じる表面で誘導されるGLP-1抱合体の凝集を減少させ、または防止することができる界面活性物質を含むことができる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、並びにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなどの種々の従来の界面活性物質を使用することができる。量は、一般に約0.001〜約4重量％の間の製剤の範囲である。
ある態様において、本発明の目的のための界面活性物質は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、ポリソルベート80、ポリソルベート20等である。GLP-1類似体タンパク質などのタンパク質製剤のための当該技術分野において既知のさらなる薬剤も、製剤に含めることができる。GLP-1類似体タンパク質などのタンパク質の製剤のために当該技術分野において既知のさらなる薬剤は、製剤においてまた含まれることができる。
本発明の抱合されたGLP-1は、ジェットネブライザまたは超音波ネブライザなどの噴霧器によって投与することができる。典型的には、ジェットネブライザにおいて、圧縮空気源を使用して開口部を通る高速噴流を作製する。ガスがノズルを越えて膨張すると、低圧領域が生じ、これが液体貯蔵所に接続された毛細管を通ってGLP-1抱合体の溶液を吸引する。毛細管からの液体流は、不安定なフィラメントおよび小滴にせん断され、これがチューブに存在するとエアロゾルを生じる。配置の範囲、出水率およびバッフル型を使用して、所与のジェットネブライザから所望の動作特性を達成することができる。超音波ネブライザでは、高頻度電気エネルギー源を振動性の機械エネルギーを生じさせるために使用され、典型的にはピエゾ電気変換器を使用する。このエネルギーは直接、またはカップリング液を介してGLP-1抱合体製剤に伝達され、GLP-1抱合体を含むエアロゾルを生じる。噴霧器によって送達され、GLP-1抱合体の粒子は、約10μM未満の粒径を有すると好都合である。ある態様では、約1μM〜約5μMの範囲である。
ジェットまたは超音波のいずれかの噴霧器の用途に適したGLP-1抱合体の製剤は、典型的には溶液1mlあたり約1mg〜約20mgのGLP-1抱合体の濃度で水溶液中にGLP-1抱合体を含む。製剤には、賦形剤、緩衝液、等張薬、保存剤、界面活性物質などの薬剤を含むことができる。GLP-1抱合体を製剤化するのに有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミン等が含まれる。GLP-1抱合体を製剤化するのに有用な典型的な炭水化物には、ショ糖、マンニトール、乳糖、トレハロース、グルコース等が含まれる。また、GLP-1抱合体製剤は、エアロゾルを形成するこ際に溶液の微粒化によって生じる表面で誘導されるGLP-1抱合体の凝集を減少させ、または防止することができる界面活性物質を含むことができる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、並びにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなどの種々の従来の界面活性物質を使用することができる。量は、一般に約0.001〜約4重量％の間の製剤の範囲である。ある態様において、本発明の目的のための界面活性物質は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、ポリソルベート80、ポリソルベート20等である。GLP-1類似体タンパク質などのタンパク質製剤のための当該技術分野において既知のさらなる薬剤も、製剤に含めることができる。
定用量吸入器（MDI）には、噴霧剤、本発明のGLP-1抱合体および任意の賦形剤またはその他の添加物が、液化圧縮ガスを含む混合物としてキャニスタ内に含まれる。調節弁の操作により、エアロゾルとして混合物が放出する。ある態様において約10μM未満のサイズ範囲の粒子を含む。ある態様では、約1μM〜約5μMである。所望のアロゾル粒径は、ジェット製粉、噴霧乾燥、臨界点凝縮等を含む当業者に既知の種々の方法によって作製された本発明のGLP-1抱合体製剤を使用することによって得ることができる。ある態様において、定用量吸入器は、3Mまたはグラクソによって製造されたもの、およびヒドロフルオロカーボン噴霧剤を使用するものを含む。定容量吸入器装置用としての本発明のGLP-1抱合体製剤には、一般に、たとえば界面活性物質を用いて噴霧剤中に懸濁した、非水性媒体中の懸濁液として、本発明のGLP-1抱合体を含む微細に粉砕した粉末含むであろう。噴霧剤は、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび1,1,1,2-テトラフルオロエタン、HFA-134a（ヒドロフルオロアルカン-134a（hydrofluroalkane-134a））、HFA-227（ヒドロフルオロアルカン-227（hydrofluroalkane-227））等を含むクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボンまたは炭化水素など、この目的のために使用される任意の従来の材料であってもよい。ある態様において、噴霧剤は、ヒドロフルオロカーボンである。界面活性物質は、活性薬剤を化学分解その他から保護するために、噴霧剤中の懸濁液として本発明のGLP-1抱合体を安定化するように選ぶことができる。適切な界面活性物質は、ソルビタントリオレアート、大豆レシチン、オレイン酸またはその他を含む。いくつかの態様において、溶液エアロゾルには、エタノールなどの溶媒を使用する。GLP-1類似体タンパク質などのタンパク質製剤のために当該技術分野において既知のさらなる薬剤も、製剤に含めることができる。
当業者であれば、本発明の方法は、本明細書に記述されない装置を経た本発明の抱合されたGLP-1の肺投与によって達成してもよいことを認識するであろう。
また、本発明は、本発明のGLP-1抱合体を含み、かつ吸入による投与のために適した医薬組成物または製剤に関する。本発明によれば、本発明のGLP-1抱合体は、吸入法による投与のために適した製剤または医薬を製造するために使用することができる。本発明は、吸入法による投与のために適した形態で本発明のGLP-1抱合体を含む製剤を製造するための方法にも関する。たとえば、乾燥粉末製剤は、従来技術を使用して、いくつかの方法で製造することができる。下気道における最大沈着に適したサイズ範囲の粒子は、超微粉砕すること、製粉すること、噴霧乾燥することその他によって作製することができる。また液状製剤は、緩衝液またはその他の賦形剤を含む、水などの適切な溶媒に本発明のGLP-1抱合体を適切なpHにて溶解することによって製造することができる。
それ故、ある態様において、本発明は、式IIの抱合されたインスリンの有効量を、これらの必要な患者に肺手段によって投与することを含む、式IIの抱合されたインスリンを投与する方法に関連し；ある態様において、前記式IIの抱合されたインスリンは、前記患者の口を介して吸入される。
より正確には、本発明は、以下の態様にも関する：
a）式IIの抱合されたインスリンが患者の低気道に送達される、本明細書に記述した方法。
a）式IIの抱合されたインスリンが患者の低気道に送達される、本明細書に記述した方法。
b）式IIの抱合されたインスリンが肺胞に沈着される、本明細書に記述した方法。
c）式IIの抱合されたインスリンが薬学的に許容される担体中に式IIの抱合されたインスリンを含む医薬品製剤として投与される、本明細書に記述した方法。
d）製剤が水溶媒質中の溶液および非水性媒質中の懸濁液からなる群より選択される、本明細書に記述した方法。
e）製剤がエアロゾルとして投与される、本明細書に記述した方法。
f）製剤が乾燥粉末の形態である、本明細書に記述した方法。
g）式IIの抱合されたインスリンが約10ミクロン未満の粒径を有する、本明細書に記述した方法。
h）式IIの抱合されたインスリンが約1〜約5ミクロンの粒径を有する、本明細書に記述した方法。
i）式IIの抱合されたインスリンが約2〜約3ミクロンの粒径を有する、本明細書に記述した方法。
j）送達された式IIの抱合されたインスリンの少なくとも約10%が肺に沈着される、本明細書に記述した方法。
k）式IIの抱合されたインスリンが肺投与のために適した吸入装置から送達され、かつ患者の肺にインスリン類似体を沈着させることができる、本明細書に記述した方法。
l）装置が噴霧器、定用量吸入器、乾燥粉末吸入器および散布器からなる群より選択される、本明細書に記述した方法。
m）装置が乾燥粉末吸入器である、本明細書に記述した方法。
n）装置が噴霧器である、本明細書に記述した方法。
o）装置が定容量吸入器である、本明細書に記述した方法。
p）装置が散布器である、本明細書に記述した方法。
q）装置の作動により、約3μg/kg〜約20g/kgの前記式IIの抱合されたインスリンを投与する、本明細書に記述した方法。ある態様において、約7μg/kg〜約14μg/kgの前記式IIの抱合されたインスリン。
r）前記式IIの抱合されたインスリンが、上記実施例のいずれかにおいて具体的に言及された化合物のいずれかである、本明細書に記述した方法。
s）前記式IIの抱合されたインスリンの有効な用量をこれらの必要な患者に肺手段によって投与することを含む、糖尿病を治療するための本明細書に記述した方法。
t）式IIの抱合されたインスリンが薬学的に許容される担体中に式IIの抱合されたインスリンを含む医薬品製剤として投与される、本明細書に記述した方法。
本明細書に記述した方法であって、GLP-1抱合体が本明細書において、特に本明細書の具体的実施例において、具体的に言及した式IIの具体的化合物のいずれかである方法。上記の態様は、方法に関して本明細書に具体的に記述してあるが、これらは、使用される製品または製剤と類似して適用される。
一つの本発明の目的は、約0.1mg/ml〜約25mg/mlの濃度で存在する本発明に従った化合物を含む医薬品製剤であって、前記製剤が2.0〜10.0のpHを有する医薬品製剤を提供することである。本製剤は、緩衝系、防腐剤、等張性薬剤、キレート薬、安定剤および界面活性物質をさらに含んでいてもよい。本発明の一つの態様において、医薬品製剤は、水性製剤、すなわち水を含む製剤である。このような製剤は、典型的には溶液または懸濁液である。本発明のさらなる態様において、医薬品製剤は、水溶液である。「水性製剤」という用語は、少なくとも50% w/w水を含む製剤として定義される。同様に、「水溶液」という用語は、少なくとも50% w/w水を含む溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも50% w/w水を含む懸濁液として定義される。
もう一つの態様において、医薬品製剤は、冷凍乾燥製剤であって、医師または患者が使用前に溶媒および／または希釈剤を添加する冷凍乾燥製剤である。
もう一つの態様において、医薬品製剤は、事前に溶解することなく使用準備済の乾燥製剤（たとえば、冷凍乾燥またはスプレー乾燥）である。
さらなる側面において、本発明は、本発明に従った化合物の水溶液と緩衝液とを含む医薬品製剤であって、前記化合物が0.1mg/ml以上の濃度で存在し、前記製剤が約2.0〜約10.0、pHを有する医薬品製剤に関連する。
本発明のもう一つの態様において、製剤のpHは、約7.0〜約9.5ある。本発明のもう一つの態様において、製剤のpHは、約3.0〜約7.0ある。本発明のもう一つの態様において、製剤のpHは、約5.0〜約7.5ある。本発明のもう一つの態様において、製剤のpHは、約7.5〜約9.0ある。本発明のもう一つの態様において、製剤のpHは、約7.5〜約8.5ある。本発明のもう一つの態様において、製剤のpHは、約6.0〜約7.5ある。本発明のもう一つの態様において、製剤のpHは、約6.0〜約7.0ある。
本発明のもう一つの態様において、製剤のpHは、約3.0〜約9.0であり、前記pHは、本発明の化合物の等電pHから少なくとも2.0pH単位にある。
本発明のさらなる態様において、緩衝液は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトラート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびトリス（ヒドロキシメチル）-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸またはこれらの混合物からなる群より選択される。これらの具体的緩衝液のそれぞれは、本発明の代わりの態様を構成する。
本発明のさらなる態様において、製剤は、薬学的に許容される保存剤をさらに含む。本発明のさらなる態様において、保存剤は、フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、p−オキシ安息香酸メチル、プロピルp-ヒドロキシベンゾアート、2-フェノキシエタノール、ブチルp-ヒドロキシベンゾアート、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノールおよびチオメルサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、p−ヒドロオキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロロフェネシン（3p-クロルフェノキシプロパン-1,2-ジオール）およびこれらの混合物からなる群より選択される。本発明のさらなる態様において、保存剤は、0.1mg/ml〜20mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる態様において、保存剤は、0.1mg/ml〜5mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる態様において、保存剤は、5mg/ml〜10mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる態様において、保存剤は、10mg/ml〜20mg/mlの濃度で存在する。これらの具体的防腐剤のそれぞれは、本発明の代わりの態様を構成する。医薬組成物における保存剤の使用は、当業者に周知である。便宜のために、The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照されたい。
本発明のさらなる態様において、製剤は、等張薬をさらに含む。本発明のさらなる態様において、等張薬は、塩（たとえば、塩化ナトリウム）、糖または糖アルコール、アミノ酸（たとえば、L-グリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン）、アルジトール（たとえば、グリセロール（グリセリン）、1,2-プロパンジオール（プロピレングリコール）、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール）ポリエチレングリコール（たとえば、PEG400）またはこれらの混合物からなる群より選択される。たとえば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、乳糖、ショ糖、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、水溶性グルカン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロース-Naを含む単糖、二糖または多糖などの任意の糖を使用してもよい。一つの態様において、糖添加物は、ショ糖である。
糖アルコールは、少なくとも1つの-OH基を有するC4-C8炭化水素として定義され、たとえば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール（galacititol）、ズルシトール、キシリトールおよびアラビトールを含む。一つの態様において、糖アルコール添加物は、マンニトールである。前述の糖または糖アルコールは、個々に、または組み合わせて使用してもよい。糖または糖アルコールは、液状製剤に可溶性であり、かつ本発明の方法を使用して達成される安定化効果を逆に作用させない限り、使用する量に決まった制限はない。一つの態様において、糖または糖アルコール濃度は、約1mg/ml〜約150mg/mlの間である。本発明のさらなる態様において、等張薬は、1mg/ml〜50mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる態様において、等張薬は、1mg/ml〜7mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる態様において、等張薬は、8mg/ml〜24mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる態様において、等張薬は、25mg/ml〜50mg/mlの濃度で存在する。これらの特異的な等張薬のそれぞれは、本発明の代わりの態様を構成する。医薬組成物における等張薬の使用は、当業者に周知である。便宜のために、The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照されたい。
本発明のさらなる態様において、製剤は、キレート薬をさらに含む。本発明のさらなる態様において、キレート薬は、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、クエン酸およびアスパラギン酸の塩、並びにこれらの混合物から選択される。本発明のさらなる態様において、キレート薬は、0.1mg/ml〜5mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる態様において、キレート薬は、0.1mg/ml〜2mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる態様において、キレート薬は、2mg/ml〜5mg/mlの濃度で存在する。これらの特異的キレート薬のそれぞれは、本発明の代わりの態様を構成する。医薬組成物におけるキレート薬の使用は、当業者に周知である。便宜のために、The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照されたい。
本発明のさらなる態様において、製剤は、安定剤をさらに含む。医薬組成物における安定剤の使用は、当業者に周知である。便宜のために、The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照されたい。
より詳しくは、本発明の組成物は、安定化された液体医薬組成物であって、その治療的に活性な成分には、液体医薬品製剤の貯蔵の間におそらく凝集体形成を示すポリペプチドを含む液体医薬組成物である。「凝集体形成」とは、オリゴマー（これは、可溶性ままであってもよい）の形成を生じるポリペプチド分子または溶液から沈殿する大きな可視凝集体の間の物理的相互作用を意図する。「貯蔵の間」とは、一旦製造された液体医薬組成物または製剤が被験体に即時に投与されないことを意図する。それどころか、製造後に、これは、液体形態で、凍結状態で、または液体形態もしくは被験体に投与するために適したその他の形態に後で再構成するための乾燥形態で、いずれかで貯蔵するためにパックされる。「乾燥形態」とは、液体医薬組成物または製剤が、凍結乾燥（すなわち、凍結乾燥；たとえば、 Williams and Polli （1984） J. Parenteral Sci. Technol. 38：48-59を参照されたい）、噴霧乾燥（Masters （1991） in Spray-Drying Handbook （5th ed； Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.）, pp. 491-676； Broadhead et al. （1992） Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206；およびMumenthaler et al. （1994） Pharm. Res. 11:12-20を参照されたい）または空気乾燥（Carpenter and Crowe （1988） Cryobiology 25:459-470；および Roser （1991） Biopharm. 4:47-53）のいずれかによって乾燥させることを意図する。液体医薬組成物の貯蔵の間のポリペプチドによる凝集体形成は、そのポリペプチドの生物活性に悪影響を与えて、医薬組成物の治療有効性の減少を生じうる。さらにまた、凝集体形成は、ポリペプチド含有医薬組成物を注入系を使用して投与するときに、管系、膜またはポンプの遮断などのその他の問題を引き起こすかもしれない。
本発明の医薬組成物は、組成物の貯蔵の間のポリペプチドによる凝集体形成を減少させるために十分なアミノ酸塩基の量をさらに含んでいてもよい。「アミノ酸塩基」とは、任意の所与のアミノ酸がその遊離塩基形態で、またはその塩形態で存在するアミノ酸またはアミノ酸の組み合わせを意図する。アミノ酸の組み合わせが使用される場合、アミノ酸の全てがこれらの遊離塩基形態で存在してもよく、全てがこれらの塩形態で存在してもよく、またはいくつかがこれらの遊離塩基形態で存在し、一方でその他がこれらの塩形態で存在してもよい。一つの態様において、本発明の組成物を製造する際に使用するためのアミノ酸は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの荷電した側鎖を有するものである。特定のアミノ酸（例えばこれらのグリシン、メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニンおよび混合物）のいずれの立体異性体（すなわちL、DまたはDL異性体）またはこれらの立体異性体の組み合わせも、特定のアミノ酸の遊離塩基形態またはその塩形態で存在する限り、本発明の医薬組成物に存在してもよい。一つの態様において、L-立体異性体が使用される。また、本発明の組成物は、これらのアミノ酸の類似体と共に製剤化してもよい。「アミノ酸類似体」とは、本発明の液体医薬組成物の貯蔵の間にポリペプチドによる凝集体形成を減少する望ましい効果をもたらす、天然に存在するアミノ酸の誘導体を意図する。適切なアルギニン類似体には、たとえばアミノグアニジン、オルニチンおよびN-モノエチルL-アルギニンを含み、適切なメチオニン類似体には、S-エチルホモシステインおよびS-ブチルホモシステインを含み、並びに適切なシステイン類似体には、S-メチル-Lシステインを含む。その他のアミノ酸と同様に、アミノ酸類似体は、これらの遊離塩基形態またはこれらの塩形態で組成物に組み込まれる。本発明のさらなる態様において、アミノ酸またはアミノ酸類似体は、タンパク質の凝集を防止し、または遅延させるために十分な濃度で使用される。
本発明のさらなる態様において、メチオニン残基のメチオニンスルホキシドへの酸化を阻害するために、治療薬として作用するポリペプチドがこのような酸化に対して感受性が高い少なくとも1つのメチオニン残基を含むポリペプチドであるときに、メチオニン（またはその他の含硫アミノ酸または類似アミノ酸）を添加してもよい。「阻害する」とは、時間とともにメチオニンの酸化型種が蓄積するのを最小にすることを意図する。メチオニン酸化を阻害することにより、その適当な分子形態のポリペプチドをより多く保持させる。メチオニン（L、DまたはDL異性体）のいずれの立体異性体またはこれらの組み合わせも使用することができる。添加される量は、メチオニンスルホキシドの量が調節媒体に許容されるように、メチオニン残基の酸化を阻害するために十分な量であるべきである。典型的には、これは、組成物が約10%〜約30%のメチオニンスルホキシドのみを含むことを意味する。一般に、これは、メチオニン残基に添加されるメチオニンの比が、約1：1〜約1000：1、10：1〜約100：1などの範囲であるようにメチオニンを付加することによって達成することができる。
本発明のさらなる態様において、製剤は、高分子重合体または低分子化合物の群から選択される安定剤をさらに含む。本発明のさらなる態様において、安定剤は、ポリエチレングリコール（たとえば、PEG 3350）、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン、カルボキシ-/ヒドロキシセルロースまたはこれらの誘導体（たとえば、HPC、HPC-SL、HPC-LおよびHPMC）、シクロデキストリンや、モノチオグリセロール、チオグリコール酸および2-メチルチオエタノールとしての硫黄含有物質、並びに種々の塩（たとえば、塩化ナトリウム）から選択される。これらの具体的安定剤のそれぞれは、本発明の代わりの態様を構成する。
また、医薬組成物は、その中の治療的に活性なポリペプチドの安定性をさらに増強するさらなる安定剤を含んでいてもよい。本発明にとって特に興味がもたれる安定剤には、ポリペプチドをメチオニン酸化から保護するメチオニンおよびEDTA、並びにポリペプチドを凍結融解または機械的分断に関連した凝集から保護する非イオン性界面活性剤が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
本発明のさらなる態様において、製剤は、界面活性物質をさらに含む。本発明のさらなる態様において、界面活性物質は、以下から選択される：洗浄剤、エトキシル化されたヒマシ油、ポリグルコール化されたグリセリド、アセチル化されたモノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロック重合体（たとえば、Pluronic（登録商標）F68、ポロキサマー188および407、Triton X-100などのポロキサマー）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アルキル化された誘導体およびアルコキシ化された誘導体（Tween類、たとえば、Tween-20、Tween-40、Tween-80、およびBrij-35）などのポリオキシエチレンおよびポリエチレン誘導体、モノグリセリドまたはこれらのエトキシル化誘導体、ジグリセリドまたはこれらのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レシチンおよびリン脂質（たとえば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルイノシトール、カルジオリピンおよびスフィンゴミエリン）、リン脂質（たとえば、ジパルミトイルホスファチジン酸）およびリゾリン脂質（たとえば、エタノールアミン、コリン、セリンまたはスレオニンのパルミトイルリゾホスファチジル-L-セリンおよび1-アシル-sn-グリセロ-3-リン酸エステル）の誘導体、並びにリゾホスファチジルおよびホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル（アルキルエステル）、アルコキシ（アルキルエーテル）誘導体、例えばリゾホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンのラウロイルおよびミリストイル誘導体、並びに極性頭部基の修飾、すなわちコリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、スレオニン、グリセロール、イノシトール、並びに正に荷電したDODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、リゾホスファチジルセリンおよびリゾホスファチジルスレオニン、並びにグリセロリン脂質（たとえば、ケファリン）グリセロ糖脂質（たとえば、ガラクロピラノシド（galactopyransoide））、スフィンゴ糖脂質（例えばセラミド、ガングリオシド）、ドデシルホスホコリン、雌鶏卵子リゾレシチン、フシジン酸誘導体-（たとえば、ナトリウムタウロ-ジヒドロフジダートその他）、長鎖脂肪酸およびこれらの塩C6-C12（たとえば、オレイン酸およびカプリル酸）、アシルカルニチンおよび誘導体、リジン、アルギニンまたはヒスチジンのNα-アシル化された誘導体またはリジンもしくはアルギニンの側鎖アシル化された誘導体、リジン、アルギニンまたはヒスチジンと中性もしくは酸性アミノ酸との任意の組み合わせを含むジペプチドおよびのNα-アシル化された誘導体、中性アミノ酸と2つの荷電アミノ酸との任意の組み合わせを含むトリペプチドのNα-アシル化された誘導体、DSS（ドキュセートナトリウム（CAS登録番号[577-11-7]）、ドキュセートカルシウム（CAS登録番号[128-49-4]）、ドキュセートカリウム（CAS登録番号[7491-09-0]）、SDS（ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウム）、カプリル酸ナトリウム、コール酸またはこれらの誘導体、胆汁酸およびこれらの塩、並びにグリシンまたはタウリン抱合体、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、N-ヘキサデシル-N,N-ジメチル3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸、陰イオン性（アルキル-アリール-スルホナート）一価界面活性物質、双性イオン性界面活性物質（N-アルキル-N,N-ジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホナート、3-コラミド-1-プロピルジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホナート、陽イオン性界面活性物質（四級アンモニウム塩基）（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム）、非イオン性界面活性物質（たとえば、ドデシルβ-グルコピラノシド）、ポロキサミン（たとえば、Tetronicのもの）（これらは、プロピレンオキサイドおよびエチレンオキシドをエチレンジアミンに逐次付加することに由来する四官能基性ブロック共重合体である）、または界面活性物質は、イミダゾリン誘導体またはこれらの混合物の群から選択してもよい。これらの具体的界面活性物質のそれぞれは、本発明の代わりの態様を構成する。
医薬組成物における界面活性物質の使用は、当業者に周知である。便宜のために、The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照されたい。
その他の成分が、本発明のペプチド医薬品製剤に存在してもよいかもしれない。このようなさらなる成分には、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、増量剤、張度調整剤、キレート薬、金属イオン、油性媒体、タンパク質（たとえば、ヒト血清アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質）および双性イオン（たとえば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジンおよびヒスチジンなどのアミノ酸）を含んでいてもよい。このようなさらなる成分は、もちろん、本発明の医薬品製剤の全体の安定性に悪影響を与えるべきではない。
本発明に従った化合物を含む医薬組成物は、このような治療を必要とする患者に対して、数か所の部位に、局所的な部位に、たとえば、皮膚に、たとえば皮膚および粘膜の部位に、吸収を迂回する部位に、たとえば動脈に、静脈に、心臓に投与、および吸収に関与する部位に、たとえば皮膚に、皮下に、筋肉に、または腹部に投与してもよい。
本発明に従った医薬組成物の投与は、このような治療を必要とする患者に対して、いくつかの経路、例えば舌音、舌下腺、頬側を介して、口に、経口で胃および小腸に、経鼻で、経肺で、たとえば細気管支および肺胞またはこれらの組み合わせを介して、表皮に、真皮に、経皮で、膣に、直腸に、眼に、たとえば結膜を介して、経尿管、並びに非経口的にで投与してもよい。
一つの側面において、本発明は、式（I）に従った化合物と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関連する。
一つの態様において、医薬組成物は、経肺投与のために適している。
もう一つの側面において、本発明は、経肺医薬の製造のための式（I）の化合物の使用に関連する。たとえば、本発明の組成物は、いくつかの剤形で、たとえば溶液、懸濁液、エマルジョン、ミクロエマルジョン、多層乳剤、泡、膏薬、ペースト、硬膏剤、軟膏、錠剤、コートされたタブレット、リンス、カプセル、たとえば硬ゼラチンカプセルおよび軟ゼラチンカプセル、坐薬、直腸投与カプセル、滴、ゲル、スプレー、粉末、エアロゾル、吸入薬、点眼、眼軟膏、眼リンス、膣ペッサール、膣リング、膣軟膏、注射溶液、インサイチュー(in situ) 形質転換溶液、たとえばインサイチューゲル化、インサイチュー凝固、インサイチュー沈着、インサイチュー結晶化、輸液およびインプラントとして投与してもよい。
本発明の組成物は、化合物の安定性を増強し、生物学的利用能を増大し、溶解度を増大し、有害作用を減少し、当業者に周知の時間治療を達成し、および患者のコンプライアンスを増大し、またはこれらの任意の組み合わせのために、たとえば共有結合、疎水結合および静電気的相互作用を介して、薬物キャリア、薬物送達システムおよび高度薬物送達システムにさらに配合しても、付着してもよい。担体、薬物送達システムおよび進歩された薬物送達システムの例には、重合体、たとえばセルロースおよび誘導体、多糖体、たとえばデキストランおよび誘導体、デンプンおよび誘導体、ポリ（ビニルアルコール）、アクリラートおよびメタクリル酸エステル重合体、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、並びにこれらのブロック共重合体、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、たとえばアルブミン、ゲル、たとえば熱ゲル化系、たとえば当業者に周知のブロック共重合体系、ミセル、リポソーム、微粒子、ナノ粒子、液晶およびこれらの分散、L2相およびこれらの分散、たとえば脂質-水系の相行動の当業者に周知の重合体ミセル、多層乳剤、自己乳化、自己微小乳化、シクロデキストリンおよびこれらの誘導体、並びにデンドリマーが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
本発明の組成物は、例えば定用量吸入器、乾燥粉末吸入器および噴霧器（これらは、全て当業者に周知の装置である）を使用する、化合物の経肺投与のための固体、半固体、粉末および溶液の製剤に有用である。
本発明の組成物は、徐放性、持効性、遅延性、遅延型および遅放性薬物送達システムの製剤に特に有用である。より具体的には、しかし、限定されるわけではないが、組成物は、当業者に周知である非経口的徐放性および持効性系の製剤に有用である（両系とも、投与回数の数倍の減少に至る）。ある態様において、徐放性および持効性系は、皮下投与される。本発明の範囲を限定しないが、有用な徐放系および徐放組成物の例は、液晶、重合体ミセル、微粒子、ナノ粒子である。
本発明の組成物のために有用な徐放系を作製する方法には、結晶化、凝縮、共結晶化、沈殿、共沈、乳化、分散、高圧ホモジナイゼーション、カプセル化、噴霧乾燥、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、微粒子を生じる溶媒蒸発、押出しおよび超臨界流動床法が含まれるが、これらに限定されるわけではない。 Handbook of Pharmaceutical Controlled Release （Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000）およびDrug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery （MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000）を一般的に参照されたい。
非経口的投与は、注射器、任意にペン様注射器によって、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によって行ってもよい。あるいは、非経口的投与は、注入ポンプによって行うことができる。さらなる選択肢は、経鼻または経肺スプレーの形態で本発明に従った化合物を投与するための溶液または懸濁液であってもよい組成物である。なおさらなる選択肢として、本発明の化合物を含む医薬組成物は、また、経皮の投与に、たとえば針のない注射により、もしくはパッチ、任意にイオン注入パッチから、または経粘膜で、たとえば頬側投与に適応させることができる。
「安定化された製剤」という用語は、物理安定度が増大し、化学的安定性が増大し、または増物理的および化学的安定性が増大した製剤をいう。
本明細書に使用されるタンパク質製剤の「物理安定度」という用語は、熱-機械的ストレスおよび／または疎水表面および界面などの不安定にする界面および表面との相互作用への曝露の結果として、タンパク質がタンパク質の生物学的に不活性および／または不溶性凝集体を形成する傾向をいう水性タンパク質製剤の物理安定度は、適切な容器（たとえば、カートリッジまたはバイアル）に満たした製剤を機械的／物理的ストレス（たとえば、撹拌）に対して種々の時間、異なる温度にて曝露した後、目視検査および／または濁度測定によって評価される。製剤の目視検査は、鮮明に焦点をあわせた光の中で暗い背景で行う。製剤の濁度は、濁り程度をランク付けする視覚スコアによって、たとえば0〜3のスケールで特徴づけられる（濁度を示さない製剤は、視覚スコア0に対応し、昼光において視覚濁度を示す製剤は、視覚スコア3に対応する）製剤は、昼光において視覚濁度を示す場合、タンパク質凝集に関して物理的不安定度により分類する。あるいは、製剤の濁度は、当業者に周知の単純な濁度測定によって評価することができる。また、水性タンパク質製剤の物理安定度は、分光薬またはタンパク質の高次構造状態のプローブを使用することにより評価することができる。ある態様において、プローブは、小分子である。ある態様において、これは、タンパク質の非天然配座異性体と結合する。タンパク質構造の小分子分光学プローブの1つの例は、チオフラビンTである。チオフラビンTは、アミロイド繊維の検出のために広く使用されてきた蛍光色素である。原繊維の存在下において、およびおそらくその他のタンパク質配置も同様に、チオフラビンTは、原繊維タンパク質型に結合したときに、約450nmにて新たな励起最大を生じさせ、約482nmにおける発光を増強した。結合していないチオフラビンTは、該波長にて本質的に非蛍光性である。
その他の小分子を、天然から非天然の状態のタンパク質構造の変化のプローブとして使用することができる。例えば、「疎水性パッチ」は、曝露されたタンパク質の疎水性パッチに対するその結合をプローブする。疎水性パッチは、一般にその天然の状態のタンパク質の三次構造内に埋もれているが、タンパク質が折り畳まれないか、または変性さされ始めると曝露される。これらの小分子、分光プローブの例は、アントラセン（antrhacene）、アクリジン、フェナントロリンなどの芳香族、疎水性色素その他である。その他の分光プローブは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンその他の疎水性アミノ酸などのコバルト金属錯体などの、金属-アミノ酸錯体である。
本明細書に使用されるタンパク質製剤の「化学的安定性」という用語は、天然のタンパク質構造と比較して、潜在的により生物学的能力が少なく、および／または潜在的に免疫原性特性が増大した化学分解産物の形成を引き起こすタンパク質構造の化学的共有結合変化をいう。未変性タンパク質のタイプおよびの性質、並びにタンパク質が曝露されるおよび環境に応じて、種々の化学分解産物を形成することができる。化学分解の排除は、おそらく完全に回避することができず、当業者に周知のように、タンパク質製剤の貯蔵および使用の間には、たいてい化学分解産物の量の増大が見られる。大部分のタンパク質は、グルタミニルまたはアスパラギニル残基の側鎖アミド基が加水分解ししカルボン酸を形成するプロセスにおいて、脱アミド化する傾向がある。その他の分解経路には、2つ以上タンパク質分子がアミド基転移および／またはジスルフィド相互作用を介して互いに共有結合して共有結合で結合した二量体、オリゴマーおよび重合体分解産物の形成を引き起こす高分子量変換産物の形成を含む（Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992）。酸化（例えば、メチオニン残基の）は、化学分解のもう一つのバリエーションとして述べることができる。タンパク質製剤の化学的安定性は、種々の環境条件に対する曝露後の種々の時点にて化学物質の量を測定することによって分解生成物を評価することができる（分解生成物の形成は、例えば温度を増大することによって促進することができることがおおい）。個々の分解生成物の量は、たいてい種々のクロマトグラフィー技術（たとえば、SEC-HPLCおよび／またはRP-HPLC）を使用して分子サイズおよび／または電荷に応じて分解生成物を分離によって決定される。
それ故、上で概説したように、「安定化された製剤」とは、物理安定度が増大され、化学的安定性が増大され、または物理的および化学的安定性が増大された製剤をいう。一般に、製剤は（推奨された使用および貯蔵条件に従って）耐用年数に到達するまで使用および貯蔵の間に安定でなければならない。
本発明の一つの態様において、本発明に従った化合物を含む医薬品製剤は、6週以上の使用の間、および3年以上の貯蔵の間安定である。
本発明のもう一つの態様において、本発明に従った化合物を含む医薬品製剤は、4週以上の使用の間、および3年以上の貯蔵の間安定である。
本発明のさらなる態様において、本発明に従った化合物を含む医薬品製剤は、4週以上の使用の間、および2年以上の貯蔵の間安定である。
本発明のさらなる態様において、本発明に従った化合物を含む医薬品製剤は、2週以上の使用の間、および2年以上の貯蔵の間安定である。
もう一つの側面において、本発明は、医薬の製造のための、本発明に従った化合物の使用に関連する。
一つの態様において、本発明に従った化合物は、高血糖、2型糖尿病、グルコース寛容減損、1型糖尿病、肥満症、高血圧症、エックス症候群、異脂肪血症、認知障害、アテローム性動脈硬化症（atheroschlerosis）、心筋梗塞、冠状動脈性心疾患およびその他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸症候群、消化不良、並びに胃潰瘍の治療または予防のための医薬の製造のために使用される。
もう一つの態様において、本発明に従った化合物は、2型糖尿病の疾患進行を遅延し、または防止するための医薬の製造のために使用される。
もう一つの態様において、本発明に従った化合物は、摂食を減少させ、β細胞アポトーシスを減少させ、β-細胞機能を増大させ、およびβ細胞質量を増大させ、および／またはβ細胞に対するグルコース感受性を回復させるための医薬の製造のために使用される。
また、本発明に従った化合物での治療は、たとえば抗糖尿病薬、抗肥満症薬、食欲調節薬、降圧薬、糖尿病によって生じるか、もしくは関連した合併症の治療よび／または予防のための薬剤または肥満症によって生じるか、もしくは関連した合併症の治療よび／または予防のための薬剤から選択される第2またはそれ以上の薬理学的に活性な物質と組み合わせてもよい。これらの薬理学的に活性な物質の例は、以下のとおりである：インスリン、スルホニルウレア、ビグアナイド、メグリチニド（meglitinide）、グルコシダーゼ阻害剤、グルカゴンアンタゴニスト、DPP-IV（ジペプチジルペプチダーゼ-IV）阻害剤、糖新生および／またはグリコーゲン分解刺激に関与する肝酵素の阻害剤、グルコース摂取モジュレーター、HMG CoA阻害剤としての抗高脂血症薬などの脂質代謝を修飾する化合物（スタチン）、摂食を低下させる化合物、RXRアゴニストおよびβ細胞のATP感受性カリウムチャネルに作用する薬剤；コレスチラミン、コレスチポール、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、プロブコール、デキストロチロキシン、ネタグリニド（neteglinide）、レパグリニド；アルプレノロール、アテノロール、チモロール、ピンドロール、プロプラノロールおよびメトプロロールなどのβブロッカー、ベナゼプリル（benazepril）、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル（fosinopril）、リシノプリル、アラトリオプリル、アラトリオプリル、キナプリルおよびラミプリル（ramipril）などのACE（アンジオテンシン変換酵素）阻害剤、ニフェジピン、フェロジピン、ニカルジピン、イスラジピン、ニモジピン、ジルチアゼムおよびベラパミルなどのカルシウム拮抗薬、およびドキサゾシン、ウラピジル、プラゾシンおよびテラゾシンなどのαブロッカー；CART（コカインアンフェタミン調節転写物）アゴニスト、NPY（ニューロペプチドY）アンタゴニスト、MC4（メラノコルチン4）アゴニスト、オレキシンアンタゴニスト、TNF（腫瘍壊死因子）アゴニスト、CRF（コルチコトロピン放出因子）アゴニスト、CRF BP（コルチコトロピン放出因子結合タンパク質）アンタゴニスト、尿コルチンアゴニスト、β3アゴニスト、MSH（メラニン細胞刺激ホルモン）アゴニスト、MCH（メラニン形成細胞濃縮ホルモン）アンタゴニスト、CCK（コレシストキニン）アゴニスト、セロトニン再取り込み阻害剤、セロトニンおよびノルアドレナリン再取り込み阻害剤、混合されたセロトニンおよびノルアドレナリン作動性化合物、5HT（セロトニン）アゴニスト、ボンベシンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、成長ホルモン、成長ホルモン放出化合物、TRH（チレオトロピン（thyreotropin）放出ホルモン）アゴニスト、UCP 2または3（脱共役タンパク質2または3）モジュレーター、レプチンアゴニスト、DAアゴニスト（ブロモクリプチン、ドプレキシン）、リパーゼ／アミラーゼ阻害剤、RXR（レチノイドX受容体）モジュレーター、TRアゴニスト；ヒスタミンH3アンタゴニスト。
1つまたは複数の上述の化合物と本発明に従った化合物のいずれの適切な組み合わせ、および任意に1つまたは複数のさらなる薬理学的に活性な物質は、本発明の範囲内であるとみなされることが理解されるはずである。
本明細書に引用された、刊行物、特許出願および特許を含む全ての参照文献は、これらの全体が、あたかもそれぞれの参照文献が参照により個々に、および具体的に援用され、かつ本明細書にその全体が記載されたのと同じ範囲に（法によって許容される最大範囲に）参照として本明細書に援用される。
全ての見出しおよび小見出しは、便宜のためにのみ本明細書において使用されており、いかなる形であれ本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
本明細書に提供されるいずれのおよび全ての実施例または例示的な言語（たとえば「などの」）の使用は、単に本発明をよりよく解明することのみを意図し、他に主張されない限り、本発明の範囲の限定を主張するわけではない。明細書の用語は、本発明の実施に必須な請求していない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
特許文献の引用および援用は、本明細書において便宜のためにのみなされ、およびこのような特許文献の妥当性、特許性および／または実施性のいずれの観点も反映しない。本明細書における参照文献の言及は、これらが従来技術を構成することを認めるものではない。
本明細書おいて、「含む」という語は、広く解釈され、意味は「含む」、「含有する」または「包含する」を意味する。
本発明は、適用法によって許容されるとおり、本願明細書に添付した特許請求の範囲に詳述した内容の全ての修飾および均等物を含む。
本発明は、以下の実施例によってさらに例証されるが、保護の範囲を限定するものとして解釈されない。前述の記述において、および以下の実施例において開示さた特色は、別々に、およびこれらのいずれかの組み合わせの両方において、これらの多様な形態の本発明を理解するための材料である。
以下の実施例および一般的手順では、構造の詳細において、および合成スキームにおいて同定される中間化合物および最終生成物に言及する。本発明の化合物の調製は、以下の実施例を使用して詳述してあるが、記述した化学反応は、選択された本発明の分枝重合体の調製のためにこれらを一般的に適用できるかの点から開示してある。時折、反応は、記述したとおりに、本発明の開示された範囲に含まれるそれぞれの化合物に適用できないかもしれない。これが生じる化合物は、当業者に容易に認識されるであろう。これらの場合、反応は、当業者に既知の従来の修飾によって、すなわち妨害基の適切な保護によって、その他の従来の試薬に変更することによって、または反応条件のルーチンの修飾によって首尾よく行うことができる。あるいは、本明細書に開示したその他の反応またはさもなければ他の従来の本発明の対応する化合物の調製に適用できるであろう。全ての調製方法において、全ての出発原料は、既知であるか、または既知の出発原料から容易に調製されるであろう。全ての温度は、摂氏度で記載してあり、特に明記しない限り、全ての部および割合は、収率について言及するときは重量により、全ての部は、溶媒および溶出剤をいうときは体積による。全ての試薬は、Aldrich、Sigma、その他から供給されるような標準的等級のものである。プロトン、炭素およびリン光体核磁気共鳴（1H-、13C-および31P-NMR）は、Bruker NMR装置で、テトラメチルシランまたはリン酸からの場の下で報告される化学シフト（δ）で記録した。LCM質量スペクトルは、以下のとおりの装置および準備条件を使用して得た：
GLP-1抱合体は、一般に以下のHPLC系を使用して解析した：
HPLC（方法A）：RP解析は、Waters 996ダイオードアレイ検出器に装着したWaters2690系を使用して行った。UV検出は、214、254、276および301nmにて、218TP54 4.6mm×250mm 5μ C-18シリカカラム（The Seperations Group, Hesperia）で収集し、これは42℃にて1ml／分にて溶出した。カラムは、0,5 M硫酸アンモニウムの10%で平衡化して、これを4Mの硫酸でpH 2.5に合わせた。注射後、試料を50分の間に同じ水性緩衝液中の0%〜60%のアセトニトリルの勾配によって溶出した。
GLP-1抱合体は、一般に以下のHPLC系を使用して解析した：
HPLC（方法A）：RP解析は、Waters 996ダイオードアレイ検出器に装着したWaters2690系を使用して行った。UV検出は、214、254、276および301nmにて、218TP54 4.6mm×250mm 5μ C-18シリカカラム（The Seperations Group, Hesperia）で収集し、これは42℃にて1ml／分にて溶出した。カラムは、0,5 M硫酸アンモニウムの10%で平衡化して、これを4Mの硫酸でpH 2.5に合わせた。注射後、試料を50分の間に同じ水性緩衝液中の0%〜60%のアセトニトリルの勾配によって溶出した。
LC-MS（方法A）解析（エレクトロスプレー）は、二連ポンプ、カラムコンパートメント、ダイオードアレイ検出器および単一の四極質量分析検出器を備えたHP1100 MSDで行った。解析は、40℃にてWaters Xterra MS C-18×3mmのカラムで、0,01 %TFAを含む10%のアセトニトリル水溶液から−100%アセトニトリル直線勾配で、7.5分にわたって流して行った。210nmのUV検出およびMS走査は、100〜1000amuの範囲である。
LC-MS（方法B）：は、Hewlett Packard series 1100 G1312A Bin Pump、Hewlett Packard series 1100カラムコンパートメント、Hewlett Packard series 1100 G1315A DAD ダイオードアレイ検出器、Hewlett Packard series 1100 MSDおよびHP Chemstationソフトウェアによって検出器を制御するSedere 75 Evaporative Light Scatteringで行った。HPLCポンプは、以下を含む2つの溶出剤貯蔵所に接続した：（A）10mM NH4OHの水溶液および（B）10mM NH4OHの90%アセトニトリル溶液。解析は、23℃にて適切な体積の試料（好ましくは20μl）をカラムに注射し、これをAおよびBの勾配で溶出することによって行った。HPLC条件、検出器設定および使用する質量分析計設定は、以下のとおりであった：
カラム Waters Xterra MS C-18X 3 mm id 5μm
勾配 1.5ml／分にて6.5分の間、5%−100%のアセトニトリル直線
検出 210nm（DADからの類似体出力）
ELS（ELSからのアナログ出力）
MSイオン化モードAPI-ES。スキャン100-1000amu、ステップ0.1amu。
カラム Waters Xterra MS C-18X 3 mm id 5μm
勾配 1.5ml／分にて6.5分の間、5%−100%のアセトニトリル直線
検出 210nm（DADからの類似体出力）
ELS（ELSからのアナログ出力）
MSイオン化モードAPI-ES。スキャン100-1000amu、ステップ0.1amu。
以下の実施例に示したいくつかのNMRデータは、選択したデータのみである。
実施例において、以下の用語は、以下の一般的な意味を有することが意図される：
略語
AEEAc アミノエトキシエトキシアセチル
AcOEt：酢酸エチル
Ala：アラニン
tBu：tertブチル
Boc：tert-ブトキシカルボニル
CDI：カルボニルジイミダゾール
CH3CN：アセトニトリル
DBU：1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデス-7-エン
DCM：ジクロロメタン, メチレンクロライド
Dde：1-（4,4-ジメチル2,6-ジオキソシクロヘキシリデン）エチル
DIC：ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA：N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DhbtOH：3-ヒドロキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4（3H）-オン
DMAP：4-ジメチルアミノピリジン
DMF：N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO：ジメチルスルホキシド
DTT：ジチオスレイトール
Et：エチル
Et2O：ジエチルエーテル
EtOH：エタノール
Fmoc：9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
H2O：水
HBTU：2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-）-1,1,3,3 テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸
HCl：塩酸
HOBt：1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
ivDde：1-（4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン）-3-メチルブチル
MeCN：アセトニトリル
MeOH：メタノール
Mtt：4-メチルトリチル
Mmt：4-メトキシトリチル
NMP：N-メチル-2-ピロリドン
NEt3：トリエチルアミン
OtBu：tertブチルエステル
Pmc：2,2,5,7,8-ペンタメチル-クロマン-6-スルホニル
PhMe：トルエン
Rf：保持因子
Rt：保持時間
r.t.：室温
SiO2：シリカゲル
THF：テトラヒドロフラン
TFA：トリフルオロ酢酸
TIS：トリイソプロピルシラン
TLC：薄層クロマトグラフィー
Trt：トリフェニルメチル
TSTU：2-スクシンイミド-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート
以下の非限定の実施例は、固相合成または溶液相合成を使用する単量体の合成および重合技術を例証する。
略語
AEEAc アミノエトキシエトキシアセチル
AcOEt：酢酸エチル
Ala：アラニン
tBu：tertブチル
Boc：tert-ブトキシカルボニル
CDI：カルボニルジイミダゾール
CH3CN：アセトニトリル
DBU：1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデス-7-エン
DCM：ジクロロメタン, メチレンクロライド
Dde：1-（4,4-ジメチル2,6-ジオキソシクロヘキシリデン）エチル
DIC：ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA：N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DhbtOH：3-ヒドロキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4（3H）-オン
DMAP：4-ジメチルアミノピリジン
DMF：N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO：ジメチルスルホキシド
DTT：ジチオスレイトール
Et：エチル
Et2O：ジエチルエーテル
EtOH：エタノール
Fmoc：9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
H2O：水
HBTU：2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-）-1,1,3,3 テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸
HCl：塩酸
HOBt：1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
ivDde：1-（4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン）-3-メチルブチル
MeCN：アセトニトリル
MeOH：メタノール
Mtt：4-メチルトリチル
Mmt：4-メトキシトリチル
NMP：N-メチル-2-ピロリドン
NEt3：トリエチルアミン
OtBu：tertブチルエステル
Pmc：2,2,5,7,8-ペンタメチル-クロマン-6-スルホニル
PhMe：トルエン
Rf：保持因子
Rt：保持時間
r.t.：室温
SiO2：シリカゲル
THF：テトラヒドロフラン
TFA：トリフルオロ酢酸
TIS：トリイソプロピルシラン
TLC：薄層クロマトグラフィー
Trt：トリフェニルメチル
TSTU：2-スクシンイミド-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート
以下の非限定の実施例は、固相合成または溶液相合成を使用する単量体の合成および重合技術を例証する。
一般的合成方法および手順
樹脂結合されたペプチドの合成
保護されたペプチジル樹脂は、HBTU（2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-）-1,1,3,3 テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸）またはHATU（O-（7-アザベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラ-メチルウロニウムヘキサフルオロリン酸）を媒介したNMP（N-メチルピロリドン）のカップリングおよびFmoc保護基の脱保護のUVモニタリングを使用する製造業者から供給されたFastMoc UVプロトコルを使用して、0.25mmolスケールまたは1.0mmolスケールでApplied Biosystems 431Aペピチド合成機でFmocストラテジーに従って合成した。GLP-1ペプチドアミドの合成のために使用した開始樹脂は、Rink-アミド樹脂であり、Wangまたはクロロトリチル樹脂を、カルボキシC末端をもつGLP-1ペプチドのために使用した。使用した保護アミノ酸誘導体は、Fmoc-Aib-OH（Fmoc-アミノイソ酪酸）などの非天然アミノ酸を除く、ABI433Aシンセサイザーのために適した事前に計量されたカートリッジで供給される標準的Fmoc-アミノ酸（たとえば、Anaspec、またはNovabiochemから供給）であった。N末端アミノ酸は、αアミノ基にてBoc保護されていた（たとえば、Boc-His（Boc）OHは、N末端にてHisをもつペプチドのために使用した）。さらに誘導体化されなければならないリジンのεアミノ基は、アルブミン結合部分およびスペーサーの付着のための経路に応じて、Mtt、Mmt、Dde、ivDdeまたはBocで保護した。
樹脂結合されたペプチドの合成
保護されたペプチジル樹脂は、HBTU（2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-）-1,1,3,3 テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸）またはHATU（O-（7-アザベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラ-メチルウロニウムヘキサフルオロリン酸）を媒介したNMP（N-メチルピロリドン）のカップリングおよびFmoc保護基の脱保護のUVモニタリングを使用する製造業者から供給されたFastMoc UVプロトコルを使用して、0.25mmolスケールまたは1.0mmolスケールでApplied Biosystems 431Aペピチド合成機でFmocストラテジーに従って合成した。GLP-1ペプチドアミドの合成のために使用した開始樹脂は、Rink-アミド樹脂であり、Wangまたはクロロトリチル樹脂を、カルボキシC末端をもつGLP-1ペプチドのために使用した。使用した保護アミノ酸誘導体は、Fmoc-Aib-OH（Fmoc-アミノイソ酪酸）などの非天然アミノ酸を除く、ABI433Aシンセサイザーのために適した事前に計量されたカートリッジで供給される標準的Fmoc-アミノ酸（たとえば、Anaspec、またはNovabiochemから供給）であった。N末端アミノ酸は、αアミノ基にてBoc保護されていた（たとえば、Boc-His（Boc）OHは、N末端にてHisをもつペプチドのために使用した）。さらに誘導体化されなければならないリジンのεアミノ基は、アルブミン結合部分およびスペーサーの付着のための経路に応じて、Mtt、Mmt、Dde、ivDdeまたはBocで保護した。
粗製樹脂結合した保護されたペプチド上の特異的リジン残基に対する分枝重合体およびリンカーの付着は、自動合成の間にFmoc-Lys（Dde）-OH、Lys（ivDde）-OH、Lys（Mtt）-OHまたはLys（Mmt）-OHを組みこんで、続いてヒドラジンまたはTFAで選択的な脱保護することによって特定部位において行った。
ivDdeまたはDde-保護の除去のための手順
樹脂（0.25mmol）を手動シェーカー／濾過装置に置いて、2%ヒドラジンのN-メチルピロリドン（20ml、2×12分）溶液で処置し、DDE基を除去して、N-メチルピロリドン（4×20ml）で洗浄した。
樹脂（0.25mmol）を手動シェーカー／濾過装置に置いて、2%ヒドラジンのN-メチルピロリドン（20ml、2×12分）溶液で処置し、DDE基を除去して、N-メチルピロリドン（4×20ml）で洗浄した。
MttまたはMmt-保護の除去のための手順
樹脂（0.25mmol）を手動シェーカー／濾過装置に置いて、MttまたはMmt基を除去するために、2%のTFAのDCM（20ml、5-10分を、6-12回繰り返した）溶液で処置し、DCM（2×20ml）、10% MeOHおよび5%のDIPEAのDCM（2×20ml）溶液、並びにN-メチルピロリドン（4×20ml）で洗浄した。
樹脂（0.25mmol）を手動シェーカー／濾過装置に置いて、MttまたはMmt基を除去するために、2%のTFAのDCM（20ml、5-10分を、6-12回繰り返した）溶液で処置し、DCM（2×20ml）、10% MeOHおよび5%のDIPEAのDCM（2×20ml）溶液、並びにN-メチルピロリドン（4×20ml）で洗浄した。
リジン残基に対する分枝重合体の樹脂上付着のための一般的手順
分枝重合体（樹脂結合したペプチドに関して4モル相当）をNMP／DCM（1：1）に溶解した。ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）（樹脂結合したペプチドに関して4モル相当）およびジイソプロピルカルボジイミド（樹脂結合したペプチドに関して4モル相当）を添加して、溶液を15分間撹拌した。溶液を樹脂に添加して、ジイソプロピルエチルアミン（樹脂結合したペプチドに関して4モル相当）を添加した。樹脂を室温で24時間振盪した。樹脂をNMPで2回、NMP／DCM（1：1）で2回、およびDCMで2回洗浄した。
分枝重合体（樹脂結合したペプチドに関して4モル相当）をNMP／DCM（1：1）に溶解した。ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）（樹脂結合したペプチドに関して4モル相当）およびジイソプロピルカルボジイミド（樹脂結合したペプチドに関して4モル相当）を添加して、溶液を15分間撹拌した。溶液を樹脂に添加して、ジイソプロピルエチルアミン（樹脂結合したペプチドに関して4モル相当）を添加した。樹脂を室温で24時間振盪した。樹脂をNMPで2回、NMP／DCM（1：1）で2回、およびDCMで2回洗浄した。
ペプチドを樹脂から切断するための手順：
トリフルオロ酢酸、水およびトリイソプロピルシラン（95：2.5：2.5）の混合物と共に室温で180分間攪拌することによってペプチドを樹脂から切断した。切断混合物を濾過して、濾液を窒素流によって油まで濃縮した。粗製ペプチドを45mlのジエチルエーテルでこの油から沈殿して、45mlのジエチルエーテルで3回洗浄した。
トリフルオロ酢酸、水およびトリイソプロピルシラン（95：2.5：2.5）の混合物と共に室温で180分間攪拌することによってペプチドを樹脂から切断した。切断混合物を濾過して、濾液を窒素流によって油まで濃縮した。粗製ペプチドを45mlのジエチルエーテルでこの油から沈殿して、45mlのジエチルエーテルで3回洗浄した。
ペプチド産物を下記に記述したプロトコルのうちの1つを使用して精製する（実施例に他に記述されない限り）：
TFA（酸）に基づいた溶媒系における調製用HPLCプロトコル：粗製ペプチドを、7μC-18シリカをパックした20mm×250mmカラムでの準調製用HPLCによって精製した。乾燥後、粗製ペプチドを5ml 50% 酢酸H2Oに溶解して、H2Oで20mlまで希釈し、カラムに注射後、次いでこれを40-60% CH3CNの0.1% TFA溶液の勾配で、10ml／分で40℃にて50分の間溶出した。ペプチド含有画分を収集した。精製したペプチドを、水で溶出液を希釈後に凍結乾燥した。
TFA（酸）に基づいた溶媒系における調製用HPLCプロトコル：粗製ペプチドを、7μC-18シリカをパックした20mm×250mmカラムでの準調製用HPLCによって精製した。乾燥後、粗製ペプチドを5ml 50% 酢酸H2Oに溶解して、H2Oで20mlまで希釈し、カラムに注射後、次いでこれを40-60% CH3CNの0.1% TFA溶液の勾配で、10ml／分で40℃にて50分の間溶出した。ペプチド含有画分を収集した。精製したペプチドを、水で溶出液を希釈後に凍結乾燥した。
硫酸アンモニウム（塩基性）に基づいた溶媒系における調製用HPLCプロトコル：粗製ペプチドを、7μC-18シリカをパックした20mm×250mmカラムでの準調製用HPLCによって精製した。カラムを40%のCH3CNの0.05Mの（NH4）2SO4溶液で平衡化して、これを濃H2SO4でpH 2.5に合わせた。乾燥後、粗製ペプチドを5ml 50% 酢酸H2Oに溶解して、H2Oで20mlまで希釈し、カラムに注射後、次いでこれを40-60% CH3CNの0.05M （NH4）2SO4、pH2.5溶液の勾配で、10ml／分で40℃にて50分の間溶出した。ペプチド含有画分を収集し、3倍量のH2Oで希釈して、0.1%のTFAで平衡化したSep-Pak（登録商標）C18カートリッジ（Waters part.#：51910）を通した。次いで、これを0.1%のTFAを含む70%のCH3CNで溶出して、精製したペプチドを水で溶出液を希釈後に凍結乾燥によって単離さした。
得られた最終生成物を解析RP-HPLC（保持時間）によって、およびLCMSによって特徴づけた。214nmでのUV検出および42℃にて1ml／分で溶出したVydac 218TP54 4.6mm×250mm、5μ C-18シリカカラム（The Separations Group, Hesperia, USA）を使用してRP-HPLC解析を行った。2つの異なる溶出条件を使用した：
A1：濃H2SO4でpH 2.5に合わせた0.1Mの（NH4）2SO4からなる緩衝液でのカラムの平衡化および50分の間に同じ緩衝液中の0%〜60%のCH3CNの勾配による溶出。
A1：濃H2SO4でpH 2.5に合わせた0.1Mの（NH4）2SO4からなる緩衝液でのカラムの平衡化および50分の間に同じ緩衝液中の0%〜60%のCH3CNの勾配による溶出。
B1： 0.1%のTFA／H2Oでのカラムの平衡化および50分の間に0%のCH3CN／0.1%のTFA／H2O〜60%のCH3CN／0.1%のTFA／H2Oの勾配による溶出。
B6： 0.1%のTFA／H2Oでのカラムの平衡化および50分の間に0%のCH3CN／0.1%のTFA／H2O〜90%のCH3CN／0.1%のTFA／H2Oに対するの勾配による溶出。
単量体ビルディングブロックおよびリンカーの合成：
実施例1
2-[2-（2-クロロエトキシ）エトキシメチル]オキシラン
実施例1
2-[2-（2-クロロエトキシ）エトキシメチル]オキシラン
2（2-クロロエトキシ）エタノール（100.00g；0.802 mol）をジクロロメタン（100ml）に溶解し、三フッ化ホウ素エーテラートの触媒量（2.28g；16mmol）を添加した。透明な溶液を0℃に冷却し、エピブロモヒドリン（104.46g；0.762 mol）を滴状に添加し、温度を0℃に維持した。透明溶液を0℃にてさらに3時間撹拌し、次いで、溶媒を回転蒸発によって除去した。残油をアセトニトリルから一度蒸発させて、粗製1-ブロモ-3-[2-（2-クロロエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オールを得て、これをTHF（500ml）に再融解した。次いで、粉末状のカリウムtert-ブトキシド（85.0g；0.765mmol）を添加して、混合物を30分間還流まで加熱した。不溶性塩を濾過によって除去し、真空中で濾液は濃縮して、透明な黄色の油を得た。油を減圧蒸留によってさらに精製し、純粋な56.13g（41%）の表題物質を得た。
bp = 65-75℃ （0.65mbar）. 1H-NMR （CDCl3）: δ = 2.61 ppm （m, 1H）; 2.70 （m, 1H）; 3.17 （m, 1H）; 3.43 （dd, 1H）; 3.60-3.85 （m, 9H）. 13C-NMR （CDCl3）: δ = 42.73 ppm; 44.18; 50.80; 70.64 & 70,69 （may collapse）; 71.37; 72.65。
実施例2
1,3-ビス[2-（2-クロロエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オール
1,3-ビス[2-（2-クロロエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オール
2-[2-（2-クロロエトキシ）エトキシメチル]オキシラン（2.20g；12.2mmol）をDCM（20ml）に溶解し、2-（2-クロロエトキシ）エタノール（1.52g；12.2mol）を添加した。混合物を0℃に冷却し、三フッ化ホウ素（boron trifluride）エーテラートの触媒量（0.2ml；1.5mmol）を添加した。混合物を0℃にて2時間撹拌し、次いで溶媒を回転蒸発によって除去した。残留する三フッ化ホウ素（boron trifluride）エーテラートをアセトニトリルから2回共に蒸発させることによって除去した。こうして得られた油を、クグレラー蒸留（kuglerohr destilation）によって精製した。表題物質は、2.10g（45%）収率で透明な粘稠性の油として得られた。bp. = 270℃, 0.25 mbar. 1H-NMR （CDCl3）: δ = 3.31 （bs, 1H）; 3.55 ppm （ddd, 4H）; 3.65-3.72 （m, 12H）; 3.75 （t, 4H）; 3.90 （m, 1H）. 13C-NMR （CDCl3）: δ = 43.12 ppm; 69.92; 70.95; 71.11; 71.69; 72.69。
実施例3
1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オール
1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オール
1,3-ビス[2-（2-クロロエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オール（250mg；0.81mmol）をDMF（2.5ml）に溶解し、アジ化ナトリウム（200mg；3.10mmol）およびヨウ化ナトリウム（100mg；0.66mmol）を添加した。懸濁液を100℃（内部温度）まで一晩加熱した。次いで、混合物を冷却して、濾過した。濾液を乾燥させて、半結晶性の油をDCM（5ml）に再懸濁した。非可溶性塩を濾過によって除去した。濾液を乾燥まで蒸発させ、無色の油として純粋な表題物質を得た。収率：210 mg （84%）. 1H-NMR （CDCl3）: δ = 3.48 ppm （t, 4H）; 3.60-3.75 （m, 16H）; 4.08 （m, 1H）. 13C-NMR （CDCl3）: δ = 51.05 ppm; 69.10; 70.24; 70.53; 70.78; 71.37. LC-MS: m/e = 319 （M+1） +; 341 （M+Na） +; 291 （M-N2） +. Rt = 2.78 分
実施例4
1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イル-p-ニトロフェニルカルボナート
実施例4
1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イル-p-ニトロフェニルカルボナート
1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オール（2.00g；6.6mmol）をTHF（50ml）に溶解して、ジイソプロピルエチルアミン（10ml）を添加した。次いで、透明な黄色溶液を4-ジメチルアミノピリジン（1.60g；13.1mmol）およびp-ニトロフェニルクロロホルミアート（2.64g；13.1mmol）に添加して、外界温度にて撹拌した。沈殿物を迅速に形成した。懸濁液を室温で5時間撹拌し、次いで濾過して、真空中で濃縮した。残渣を溶出剤として酢酸エチル-ヘプタン-トリエチルアミン（40/60/2）を使用するクロマトグラフィーによってさらに精製した。生成物は、透明な黄色の油として500mg（16%）の収率で得られた。1H-NMR （CDCl3）: δ = 3.38 ppm （t, 4H）; 3.60-3.72 （m, 12H）; 3.76 （m, 4H）; 5.12 （q, 1H）; 7.41 （d, 2H）; 8.28 （d, 2H）. LC-MS: m/e = 506 （M+Na）+; 456 （M-N2）, Rt = 4.41分。
実施例5
1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イル クロロホルミアート
1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イル クロロホルミアート
トリクロロアセチルクロライド（1,42 g、7.85mmol）をTHF（10ml）に溶解して、溶液を0℃に冷却した。1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オール（1.00g；3.3mmol）およびトリエチルアミン（0,32g、3.3mmol）のTHF（5ml）溶液を10分にわたってゆっくりと滴状に添加した。冷却を除去して、生じる懸濁液を外界温度にて6時間撹拌した。混合物を濾過して、濾液を蒸発させて、薄茶色の油を得た。油を蒸発後にアセトニトリルで2回処置して、生成物をさらに精製することなく使用した。
1H-NMR （CDCl3）: δ = 3.40 （t, 4H）; 3,55-3,71 （m, 12H）; 3,75 （d, 4H）; 5.28 （m, 1H）。
実施例6
2-（1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）酢酸
2-（1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）酢酸
水素化ナトリウム（7.50g；80%の油懸濁液）をヘプタンで瞬間洗浄し、次いで、乾燥THF（100ml）に再懸濁した。次いで、1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オール（10.00g；33.0mmol）の乾燥THF（100ml）溶液を室温で30分の期間にわたってゆっくり添加した。次いで、ブロモ酢酸（6.50mg；47mmol）のTHF（100ml）溶液（6.50mg；47mmol）を20分にわたってゆっくりと滴状に添加した→わずかな発熱。クリーム色の懸濁液が形成された。混合物を外界温度にて一晩撹拌した。混合物を冷却すると共に、過剰な水素化ナトリウムを、水の添加（20ml）によって慎重に破壊した。懸濁液は、回転蒸発によって乾燥し始め、残渣をDCMと水との間で分けた。水相をDCMで2回抽出し、次いで酢酸（25ml）の添加によって酸性化させた。次いで、水相をDCMで2回抽出して、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥して、乾燥まで蒸発させた。残油は、現時点で表題物質並びにブロモ酢酸を含んだ。後者を、ピペリジン（5ml）を含むDCM（50ml）溶液に油を再融解すること；30分間撹拌し、次いで、1N HCl水溶液（3×）で有機溶液を瞬間の洗浄によって除去した。次いで、溶媒の乾燥（Na2SO4）および蒸発後に純粋な表題物質が得られた。収率：7.54 g（63%）。
1H-NMR （CDCl3）: δ = 3.48 ppm （t, 4H）; 3.55-3.80 （m, 16H）; 4.28 （s, 2H）; 4.30 （m, 1H）; 8.50 （bs, 1H）. 13C-NMR （CDCl3）: δ = 51.04 ppm; 69.24; 70.50; 70.72; 71.39; 71.57; 80.76; 172.68. LC-MS: m/e = 399 （M+Na） +; 349 （M-N2）. Rt = 2.34分。
実施例7
イミダゾール-1-カルボン酸1,3-ビス（2-（2-アジドエトキシ）エトキシ）プロパン-2-イル エステル
イミダゾール-1-カルボン酸1,3-ビス（2-（2-アジドエトキシ）エトキシ）プロパン-2-イル エステル
1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オール（1.00g；3.3mmol）をDCM（5ml）に溶解し、カルボニルジイミダゾール（1.18g、6.3mmol）を添加した。混合物を室温で2時間撹拌した。溶媒を除去して、残渣をメタノール（20ml）に溶解して、20分間撹拌した。溶媒を除去し、こうして得られた透明な油を、溶出剤として2%のMeOHのDCM溶液を使用するシリカでのカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。収率：372.4 mg（35%）。1H-NMR （CDCl3）: δ =3.33 （t, 4H）; 3,60-3,75 （m, 12H）; 3,80 （d, 4H）; 5.35 （m, 1H）; 7.06 （s, 1H）; 7.43 （s, 1H）; 8.16 （s, 1H）. LC-MS: m/e = 413 （M+1）. Rt = 2.35分
実施例8
tert-ブチル 2-（1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセテート
実施例8
tert-ブチル 2-（1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセテート
2-（1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）酢酸（5.0g；13.28mmol）をトルエン（20ml）に溶解して、反応混合物を不活性雰囲気下で還流まで加熱した。次いで、N,N-ジメチルホルムアミド-ジ-tert-ブチルアセタール（13ml；54.21mmol）を30分にわたって滴状に添加した。還流を24時間続けた。次いで、濃褐色の溶液をセライトを通して濾過した。溶媒を減圧下で除去し、油状残渣を、溶出剤として3%のメタノールジクロロメタンを使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋画分をプールして、乾燥まで蒸発させた。表題物質は、黄色の透明な油として得られた。収率：5.07 g（88%）。1H-NMR （CDCl3）: δ = 1.42 ppm （s, 9H）; 3.35 （t, 4H）; 3.54-3.69 （m, 16H）; 3.75-3.85 （m, 1H）; 4.16 （s, 2H）. 13C-NMR （CDCl3, selected peaks）: δ = 30.35 ppm.; 52.93; 70.65; 72.25; 73.12; 73.90; 80.44; 83.55; 172.28. TLC: Rf = 0.33 酢酸エチル-ヘプタン中。
実施例9
tert-ブチル 2-（1,3-ビス[2-（2-アミノエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセテート
tert-ブチル 2-（1,3-ビス[2-（2-アミノエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセテート
tert-ブチル 2-（1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセテート（5.97g、11.7mmol）をエタノール-水（25ml；2：1）に溶解し、酢酸（5ml）を、続いてラネー-ニッケル（5ml）の水性懸濁液を添加した。次いで、混合物を、Parr装置を使用して3気圧にて16時間水素付加した。次いで、触媒を濾過によって除去し、反応混合物を回転蒸発によって乾燥させた。油状残渣を水に溶解して、凍結乾燥させ、定量的収率の表題物質を得た。1H-NMR （CDCl3）: δ = 1.45 ppm （s, 9H）; 3.15 （bs, 4H）; 3.48-3.89 （broad m, 17H）; 4.15 （s, 2H）. 13C-NMR （CDCl3, selected peaks）: δ = 28.44 ppm.; 39.81; 68.17; 70.58; 70.79; 70.99; 78.81; 82.31; 170.59。
実施例10
2-（1,3-ビス[2-（2-アミノエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）酢酸
2-（1,3-ビス[2-（2-アミノエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）酢酸
2-（1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）酢酸（1.00g；2.65mmol）を1N塩酸水溶液（10ml）に溶解し、炭素（1ml）上の5%パラジウムの50%水性懸濁液を添加した。混合物を、Parr装置を使用して3.5気圧にて水素付加した。1時間後に反応を止めて、触媒を濾過によって除去した。溶媒を回転蒸発によって除去して、残渣をアセトニトリルから2回蒸発させた。収率：930mg（88%）。1H-NMR （D2O）: δ = 3.11 ppm （t, 4H）; 3.53-3.68 （m, 16H）; 3.80 （m, 1H）; 4.25 （s, 2H）. 13C-NMR （D2O）: δ = 38.18 ppm.; 65.43; 66.09; 68.55: 69.13; 69.23; 77.18; 173.42。
実施例11
2-（1,3-ビス[2-（2-{9-フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）酢酸
2-（1,3-ビス[2-（2-{9-フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）酢酸
2-（1,3-ビス[2-（2-アミノエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）酢酸（9.35g；28.8mmol）には、DIPEA（10ml；57mmol）を添加した。反応混合物を氷浴上で冷却して、DCM（50ml）に溶解したクロロトリメチルシラン（15ml；118mmol）を滴状に添加し、続いてDIPEA（11ml；62.7mmol）を添加した。ほぼ透明な溶液に、Fmoc-Cl（15.0g；57mmol）のDCM（50ml）溶液を滴状に添加した。反応混合物を一晩撹拌し、次いでDCM（500ml）で希釈して、0.01NHCl水溶液（500ml）に添加した。有機層を分離し；水（3×200ml）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を回転蒸発によって除去した。粗生成物を、溶出剤として酢酸エチル-ヘプタン（1：1）を使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋画分は、収集して、乾燥させ、9.20g（42%）の表題物質を得た。
1H-NMR （D2O）: δ = 3.34 ppm （t, 4H）; 3.45-3.65 （m, 16H）; 3.69 （bs, 1H）; 4.20 （t, 2H）; 4.26 （s, 2H）; 4.38 （d, 4H）; 5.60 （t, 2H）; 7.30 （t, 4H）; 3.35 （t, 4H）; 7.58 （d, 4H）; 7.72 （d, 4H）. 13C-NMR （D2O; selected peaks）: δ = 21.20 ppm.; 30.75; 34.64; 67.66; 68.90; 70.38; 70.51; 80.02; 120.37; 125.54; 127.48; 128.09; 128.67; 136.27; 141.69; 173.63; 176.80。
実施例12
2-[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]エタノール
2-[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]エタノール
2-（2-（-2-クロロエトキシ）エトキシ）エタノール（25.0g、148mmol）およびナトリウムアジド（14.5g、222mmol）のジメチルホルムアミド（250ml）中のスラリーを100℃にて一晩置いた。反応混合物を氷浴で冷却して、濾過し、有機溶媒を真空中で蒸発させた。残渣をジクロロメタン（200ml）に溶解し、水（75ml）で洗浄して、水相をさらなるジクロロメタン（75ml）で抽出して、合わせた有機層を硫酸マグネシウム（MgSO4）で乾燥させ、濾過して、真空中で蒸発させて油を得て、これをさらに精製することなく使用した。収率：30.0g（100%）。13C-NMR （CDCl3）: δ= 72.53; 70.66-70.05; 61.74; 50.65。
実施例13
（2-[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]エトキシ）酢酸
（2-[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]エトキシ）酢酸
上記2-[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]エタノール（26g,148mmol）をテトラヒドロフラン（100ml）に溶解して、窒素雰囲気下で氷冷した水素化ナトリウム（24g、593mmol、油中60%）（これは、ヘプタン（2×100ml）で前もって洗浄した）のテトラヒドロフラン（250ml）中のスラリーにゆっくりと添加した。反応混合物を40分間静置し、次いで氷浴上で冷却し、続いてテトラヒドロフラン（150ml）に溶解したブロモ酢酸（31g、223mmol）をゆっくりと添加し、次いで室温にて約3時間置いた。有機溶媒を真空中で蒸発させた。残渣をジクロロメタン（400ml）に懸濁した。水（100ml）をゆっくりと添加し、その後、混合物を機械的攪拌下で30分間置いた。水相を分離して、塩酸（4N）で酸性化して、ジクロロメタン（2×75ml）で抽出した。全ての合わせた有機層を真空中で蒸発させ、黄色の油を得た。ピペリジン（37ml、371mmol）のジクロロメタン（250ml）溶液を油にゆっくりと添加し、混合物を機械的攪拌下で1時間置いた。透明溶液をジクロロメタン（100ml）で希釈して、塩酸（4N、2x100ml）で洗浄した。水相をさらなるジクロロメタン（2×75ml）で抽出して、合わせた有機層を真空中で蒸発し、黄色の油を得て、さらに精製することなく使用した。収率：27.0 g（66%）。13C-NMR （CDCl3）: δ= 173.30; 71.36; 70.66-70.05; 68.65; 50.65。
実施例14
（S）-2,6-ビス-（2-{2-[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ）ヘキサン酸 メチル エステル
（S）-2,6-ビス-（2-{2-[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ）ヘキサン酸 メチル エステル
上記（2-[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]エトキシ）酢酸（13g、46.9mol）をジクロロメタン（100ml）に溶解した。N-ヒドロキシスクシンイミド（6.5g、56.3mmol）および1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドハイドロクロライド（10.8g、56.3mmol）を添加して、反応混合物を1時間置いた。ジイソプロピルエチルアミン（39ml、234mmol）およびL-リジンメチルエステルジハイドロクロライド（6.0g、25.8mmol）を添加して、反応混合物を16時間置いた。反応混合物をジクロロメタン（300ml）で希釈し、水（100ml）、塩酸（2N、2×100ml）、水（100ml）、50%飽和炭酸水素ナトリウム（100ml）および水（2×100ml）で抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させて、濾過して、真空中で蒸発させ、油を得て、これをさらに精製することなく使用した。収率：11g（73%）。LCMS: m/z = 591. 13C-NMR （CDCl3）: （selected） δ= 172.48; 169.87; 169.84; 71.093-70.02; 53.51; 52.34; 51.35; 50.64; 38.48; 36.48; 31.99; 31.40; 29.13; 22.82。
実施例15
（S）-2,6-ビス-（2-{2-[2-（2-t-ブチルオキシカルボニルアミノエトキシ）エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ）ヘキサン酸 メチル エステル
（S）-2,6-ビス-（2-{2-[2-（2-t-ブチルオキシカルボニルアミノエトキシ）エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ）ヘキサン酸 メチル エステル
上記（S）-2,6-ビス-（2-{2-[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ）ヘキサン酸メチルエステル（1.0g、1.7mmol）のエチルアセテート（15ml）溶液にジ-tert-ブチルジカルボナート（0.9g、4.24mmol）および10%のPd／C（0.35g）を添加した。次いで、水素を常に溶液を通して3時間泡立てた。反応混合物を濾過して、有機溶媒を真空中で除去した。残渣を、溶出剤として9：1に酢酸エチル／メタノールを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を含む画分をプールして、有機溶媒を真空中で除去し、油を得た。収率：0.60g（50%）。LC-MS: m/z = 739 （M+1）。
実施例16
（S）-2,6-ビス-（2-{2-[2-（2-アミノエトキシ）エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ）ヘキサン酸 メチル エステル
（S）-2,6-ビス-（2-{2-[2-（2-アミノエトキシ）エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ）ヘキサン酸 メチル エステル
上記の（S）-2,6-ビス-（2-{2-[2-（2-t-ブチルオキシカルボニルアミノエトキシ）エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ）ヘキサン酸 メチル エステル（0.6g、0.81mmol）をジクロロメタン（5ml）に溶解した。トリフルオロ酢酸（5ml）を添加して、反応混合物を約1時間置いた。真空中で反応混合物を蒸発させ、油を得て、これをさらに精製することなく使用した。収率：0.437 g（100%）。LC-MS m/z = 539 （M+1）。
実施例17
（S）-2,6-ビス-（2-{2-[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ）ヘキサン酸
（S）-2,6-ビス-（2-{2-[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ）ヘキサン酸
（S）-2,6-ビス-（2-{2-[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ）ヘキサン酸 メチル エステル（2.0g、3.47mmol）のメタノール（10ml）溶液に水酸化ナトリウム（4N、1.8ml、6.94mmol）を添加し、反応混合物を2時間置いた。有機溶媒を真空中で蒸発させて、残渣を水（45ml）に溶解し、塩酸（4N）で酸性化した。混合物をジクロロメタン（150ml）で抽出し、これを飽和塩化ナトリウム水溶液（2×25ml）で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させて、濾過して、真空中で蒸発させ、油を得た。LC-MS m/z = 577（M+1）。
実施例 18
N-（tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシブチル）フタルイミド
N-（tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシブチル）フタルイミド
N-（4-ブロモブチル）フタルイミド（18.9g、67.0mmol）、MeCN（14ml）およびN-Boc-ヒドロキシルアミン（12.7g、95.4mmol）の撹拌混合物にDBU（15.0ml、101mmol）を一部に添加した。生じる混合物を50℃にて24時間撹拌した。水（300ml）および12MのHCl（10ml）を添加して、生成物をAcOEtで3回抽出した。合わせられた抽出物を鹹水で洗浄し、乾燥させて（MgSO4）、減圧下で濃縮した。生じる油（28g）をクロマトグラフィー（140g SiO2、ヘプタン／AcOEtでの勾配溶出）によって精製した。17.9g（80%）の表題化合物が油として得られた。1H NMR （DMSO-d6） δ= 1.36 （s, 9H）, 1.50 （m, 2H）, 1.67 （m, 2H）, 3.58 （t, J = 7 Hz, 2H）, 3.68 （t, J = 7 Hz, 2H）, 7.85 （m, 4H）, 9.90 （s, 1H）。
実施例19
4-（tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシ）ブチルアミン
4-（tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシ）ブチルアミン
N-（tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシブチル）フタルイミド（8.35g、25.0mmol）のEtOH（10ml）溶液にヒドラジン水和物）（20ml）を添加して、混合物を80℃にて38時間撹拌した。混合物を濃縮して、残渣をEtOHおよびPhMeで共に蒸発させた。残渣にEtOH（50ml）を添加して、沈殿するフタルヒドラジドを濾過して、EtOH（50ml）で洗浄した。合わせた濾液の濃縮により、5.08gの油を得た。この油をK2CO3（10g）の水（20ml）溶液と混合して、生成物をDCMで抽出した。乾燥（MgSO4）および濃縮により、油として2.28g（45%）の表題化合物を得て、これをさらに精製することなく使用した。1H NMR （DMSO-d6）: δ= 1.38 （m, 2H）, 1.39 （s, 9H）, 1.51 （m, 2H）, 2.51 （t, J = 7 Hz, 2H）, 3.66 （t, J = 7 Hz, 2H）。
実施例20
2-（1,3-ビス[2-（2-ヒドロキシエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）酢酸tert-ブチル エステル
2-（1,3-ビス[2-（2-ヒドロキシエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）酢酸tert-ブチル エステル
1,3-ビス[2-（2-トリチルオキシエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オール（0.3g、0.40mmol）を乾燥ピリジンから一度および乾燥アセトニトリルから一度蒸発させた。残留物を窒素、60%のNaH下で乾燥DMF（2mL）に溶解し−油懸濁液（24mg、0.6mmol）を添加した。混合物を15分間室温で撹拌した。tert-ブチルブロモ酢酸（0.07mL、0.48mmol）を添加して、混合物をさらに60分間撹拌した。反応を氷でクエンチし、次いでジエチルエーテル（100mL）と水（100mL）との間で分けた。有機相を収集し、乾燥させて（Na2SO4）、溶媒を真空中で除去し、油を得て、これをEtOAc／ヘプタン／Et3N（49：50：1）と共にシリカゲルカラムで溶出した。主生成物を含む画分を収集した。溶媒を真空中で除去して、残渣を80%の水性酢酸（5mL）に溶解し、室温で一晩撹拌した。溶媒を真空中で除去し、粗製物質をジエチルエーテル（25mL）に溶解し、水（2×5mL）で洗浄した。水相を収集して、水を回転蒸発で除去し、63mgの表題化合物を得た。1H NMR （CDCl3）: δ= 4.19 （s, 2H）, 3.78-3.55 （m, 21H）, 1.49 （s, 9H）。
実施例21
N,N-ビス（2-（2-フタルイミドエトキシ）エチル）-O-tert-ブチルカルバメート
N,N-ビス（2-（2-フタルイミドエトキシ）エチル）-O-tert-ブチルカルバメート
N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）-O-tert-ブチルカルバメートをTHFまたはDMFなどの極性の非プロトン性溶媒に溶解する。水素化ナトリウム（60%の鉱油中懸濁液）をゆっくりと溶液に添加する。混合物を3時間撹拌する。N-（2-ブロモエチル）フタルイミドを添加する。反応が完了するまで混合物を撹拌する。メタノールをゆっくりと添加することによって反応をクエンチする。酢酸エチルを添加する。溶液を水性炭酸水素ナトリウムで洗浄する。有機相を乾燥させ、濾過して、その後可能な限り減圧下で濃縮する。粗製化合物を標準的カラムクロマトグラフィーによって精製する。
実施例22
N,N-ビス（2-（2-アミノエトキシ）エチル）-O-tert-ブチルカルバメート
N,N-ビス（2-（2-アミノエトキシ）エチル）-O-tert-ブチルカルバメート
N,N-ビス（2-（2-フタルイミドエトキシ）エチル）-O-tert-ブチルカルバメートをエタノールなどの極性溶媒に溶解する。ヒドラジン（またはフタロイル保護基を除去することが知られている別の薬剤）を添加する。反応が完了するまで混合物を室温（または必要に応じて高温）にて撹拌する。混合物を可能な限り減圧下で濃縮する。粗製化合物を標準的カラムクロマトグラフィーによって、または可能ならば真空蒸留（destillation）によって精製する。
実施例23
N,N-ビス（2-（2-ベンジルオキシカルボニルアミノエトキシ）エチル）-O-tert-ブチルカルバメート
N,N-ビス（2-（2-ベンジルオキシカルボニルアミノエトキシ）エチル）-O-tert-ブチルカルバメート
N,N-ビス（2-（2-アミノエトキシ）エチル）-O-tert-ブチルカルバメートを水酸化ナトリウム水溶液およびTHFの混合物に、または水酸化ナトリウム水溶液およびアセトニトリルの混合物に溶解する。ベンジルオキシクロロホルマートを添加する。反応が完了するまで混合物を室温で撹拌する。必要に応じて、体積を真空中で減少させる。酢酸エチルを添加する。有機相を鹹水で洗浄する。有機相を乾燥させ、濾過し、その後可能な限り真空中で濃縮する。粗製化合物を標準的カラムクロマトグラフィーによって精製する。
実施例24
ビス（2-（2-フタルイミドエトキシ）エチル）アミン
ビス（2-（2-フタルイミドエトキシ）エチル）アミン
ビス（2-（2-フタルイミドエトキシ）エチル）-tert-ブチルカルバメートをトリフルオロ酢酸に溶解する。反応が完了するまで混合物を室温で撹拌する。混合物を可能な限り真空中で濃縮する。粗製化合物を標準的カラムクロマトグラフィーによって精製する。
実施例25
11-オキソ-17-フタルイミド-12-（2-（2-フタルイミドエトキシ）エチル）-3,6,9,15-テトラオキサ-12-アザヘプタ-デカン酸
11-オキソ-17-フタルイミド-12-（2-（2-フタルイミドエトキシ）エチル）-3,6,9,15-テトラオキサ-12-アザヘプタ-デカン酸
3,6,9-3オキサウンデカン酸をジクロロメタンに溶解する。カルボジイミド（たとえば、N,N-ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはN,N-ジイソプロピルカルボジイミド）を添加する。溶液を室温で一晩撹拌する。混合物を濾過する。濾液を必要に応じて真空濃縮させる。形成された分子内無水物でのアミンのアシル化は、文献から既知である（たとえば、Cook, R. M.； Adams, J. H.； Hudson, D. Tetrahedron Lett., 1994, 35, 6777-6780 または Stora, T.； Dienes, Z.； Vogel, H.； Duschl, C. Langmuir 2000, 16, 5471-5478）。無水物をビス（2-（2-フタルイミドエトキシ）エチル）アミンの非プロトン溶媒（たとえば、ジクロロメタンまたはN,N-ジメチルホルムアミド）溶液と混合する。反応が完了するまで混合物を撹拌する。粗製化合物を抽出し、その後標準的カラムクロマトグラフィーによって精製する。
実施例26
5-オキソ-11-フタルイミド-6-（2-（2-フタルイミドエトキシ）エチル）-3,9-ジオキサ-6-アザウンデカン酸
5-オキソ-11-フタルイミド-6-（2-（2-フタルイミドエトキシ）エチル）-3,9-ジオキサ-6-アザウンデカン酸
ジグリコール酸無水物のジクロロメタンまたはN,N-ジメチルホルムアミドなどの非プロトン溶媒中の溶液をビス（2-（2-フタルイミドエトキシ）エチル）アミンのジクロロメタンまたはN,N-ジメチルホルムアミドなどの非プロトン溶媒中の溶液に滴状に添加する。反応が完了するまで混合物を撹拌する。粗製化合物を抽出し、その後に標準的カラムクロマトグラフィーによって精製する。
実施例27
ビス-[2-（1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロイソインドール-2-イル）エチル]アンモニウム アセテート
ビス-[2-（1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロイソインドール-2-イル）エチル]アンモニウム アセテート
ジエチレントリアミン（15.8ml、145.4mmol）をゆっくりと氷酢酸（175ml）に添加し、一方でこれを氷欲で冷却した。無水フタル酸（43.1g、290.8mmol）を添加した。生じる混合物を20時間還流した。溶液を冷却した。混合物を真空中で濃縮した。生じる粘稠性の油を、アセトニトリルから3回共に蒸発させた。油をアセトニトリル（250ml）と混合して、混合物を簡単に還流まで加熱した。溶液を一晩冷蔵庫に保持した。形成された結晶を濾過によって単離した。単離された明るい黄色の結晶を真空オーブン中で乾燥させた。収率：33.5 g（63%）。
濃縮（真空中で）後に、濾液の結晶化により、さらなる材料を得ることができる。
1H-NMR （d6-DMSO） δ: 7.81-7.74 （m, 8H）, 3.60 （t, J = 6.32 Hz, 4H）, 3.70-3.20 （b, 15H）, 2.76 （t, J = 6.32 Hz, 4H）, 1.91 （s, 5H、おそらく、残留酢酸が存在する）。
13C-NMR （d6-DMSO） δ: 168.3, 146.0, 134.5, 132.0, 123.2, 46.5, 37.5-アセトニトリルおよび酢酸からの微量ピークも観察される。LC-MS（ES-positive mode）、m/z：364。
実施例28
2-[2-（{ビス-[2-（1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロイソインドール-2-イル）エチル]カルバモイル}メトキシ）エトキシ]-エトキシ}酢酸
2-[2-（{ビス-[2-（1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロイソインドール-2-イル）エチル]カルバモイル}メトキシ）エトキシ]-エトキシ}酢酸
3,6,9-トリオキサウンウンカンジオン酸（3,6,9-trioxaununcandioic acid）（2.67g、12mmol）およびN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（2.48g、12mmol）をジクロロメタン（90ml）中で混合した。生じる混合物を30分間撹拌した。混合物を濾過して、その後真空中で濃縮した。形成された化合物をジクロロメタン（250ml）に溶解した。ビス-[2-（1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル）-エチル]-アンモニウム アセテート（4.0g、9.45mmol）およびN,N,N’,N’-テトラメチルグアニジン（1.15g、10.0mmol）を溶液に添加した。生じる混合物を少なくとも20時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮した。酢酸エチル（150ml）および水性炭酸水素ナトリウム（5% w/w、150ml）を添加した。相を分離した。pHが1〜2になるまで濃塩酸を水相に添加した。溶液をジクロロメタン（4×100ml）で抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させて、濾過して、真空中で濃縮し、明るい黄色のシロップを得た。収率：2.55 g（48%）
1H-NMR （CDCl3） δ: 7.86-7.69 （m, 8H）, 4.17 （s, 2H）, 4.09 （s, 2H）, 3.94-3.51（いくつかの多重項、16H）。
1H-NMR （CDCl3） δ: 7.86-7.69 （m, 8H）, 4.17 （s, 2H）, 4.09 （s, 2H）, 3.94-3.51（いくつかの多重項、16H）。
13C- NMR （CDCl3） δ: 172.2, 170.4, 168.3, 168.0, 134.4, 134.0, 132.0, 131.7, 123.6, 123.4, 71.3, 70.5, 70.4, 70.3, 69.2, 69.0, 44.6, 44.0, 35.7, 35.4
LC-MS （ES-positive mode）, m/z: 568 [M+H]+ and 591 [M+Na]+。
LC-MS （ES-positive mode）, m/z: 568 [M+H]+ and 591 [M+Na]+。
実施例29
（{ビス-[2-（1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロイソインドール-2-イル）エチル]カルバモイル}メトキシ）酢酸
（{ビス-[2-（1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロイソインドール-2-イル）エチル]カルバモイル}メトキシ）酢酸
ビス-[2-（1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロイソインドール-2-イル）エチル]アンモニウム アセテート（25.8g、60.9mmol）をDCM（100ml）に懸濁した。N,N,N’,N’-テトラメチルグアニジン（7.00g、60.9mmol）を添加し、これにより大量の沈着が生じた。さらなるジクロロメタン（50ml）を添加した。ジグリコール酸無水物（8.48g、73.0mmol）を一部に添加した。混合物を少なくとも20時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮した。生じるシロップを酢酸エチル（750ml）と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（750ml）との混合物に溶解した。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（2x200 ml）で抽出した。合わせた水相を濃塩酸で酸性化した（pH 1〜2）、大量の白色固体の沈着。合わせた水相をジクロロメタン（400および2×200ml）で抽出した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させて、濾過した。有機相を約200mlまで真空濃縮し、その後にこれを再び濾過した。濾過および濃度の間にさらなる沈着が生じた。濾液を蒸発させて白色固体を得た。収率：6.04 g
1H-NMR （d6-DMSO） δ: 12.65 （b, 1H）, 7.89-7.80 （m, 8H）, 4.08 （s, 2H）, 3.81-3.75 （m, 6H）, 3.59-3.50 （m, 4H）
13C- NMR （CDCl3） δ: 171.4, 169.4, 168.3, 168.1, 134.9, 134.7, 131.9, 131.8, 123.5, 123.3, 68.4, 67.4, 44.3, 43.5, 35.9, 35.5
LC-MS （ES-positive mode）, m/z: 480 [M+H]+ 。
1H-NMR （d6-DMSO） δ: 12.65 （b, 1H）, 7.89-7.80 （m, 8H）, 4.08 （s, 2H）, 3.81-3.75 （m, 6H）, 3.59-3.50 （m, 4H）
13C- NMR （CDCl3） δ: 171.4, 169.4, 168.3, 168.1, 134.9, 134.7, 131.9, 131.8, 123.5, 123.3, 68.4, 67.4, 44.3, 43.5, 35.9, 35.5
LC-MS （ES-positive mode）, m/z: 480 [M+H]+ 。
実施例30
ベンジルフェニルカルボナート
ベンジルフェニルカルボナート
Pittelkow, M.； Lewinsky, R.；および Christensen, J. B. Synthesis 2002, 15, 2195-2202に従う。
フェニルクロロホルマート（54.1g、500mmol）を凝縮器および滴下漏斗をもつ1l-フラスコ内のベンジルアルコール（78.3g、500mmol）、ジクロロメタン（90ml）およびピリジン（50ml）の混合物に滴状に添加した。混合物を1時間撹拌した。水（125ml）を添加した。相を分離した。有機相を希硫酸（2M、2×125 ml）で洗浄した。優れた分離を得るためには、鹹水を最終洗浄液に添加しなければならなかった。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させて、濾過して、真空中で濃縮した。粗製化合物を真空蒸留して（destilled）、無色の液体を得た。収率：104.3 g（91%）
1H-NMR （CDCl3） δ: 7.46-7.17 （2重項、10H）, 5.27 （s, 2H）
13C- NMR （CDCl3） δ: 152.5, 149.9, 133.5, 128.3, 127.6, 127.5, 127.3, 124.8, 119.8, 69.1。
1H-NMR （CDCl3） δ: 7.46-7.17 （2重項、10H）, 5.27 （s, 2H）
13C- NMR （CDCl3） δ: 152.5, 149.9, 133.5, 128.3, 127.6, 127.5, 127.3, 124.8, 119.8, 69.1。
実施例31
ビス-（2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル）アンモニウムクロライド
ビス-（2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル）アンモニウムクロライド
Pittelkow, M.； Lewinsky, R.；および Christensen, J. B. Synthesis 2002, 15, 2195-2202に従う。
ベンジルフェニルカルボナート（25,1 g、110mmol）をジエチレントリアミン（5,16 g、50mmol）のジクロロメタン（100ml）溶液に滴状に添加した。混合物を少なくとも20時間撹拌した。有機相をリン酸緩衝液（0.025M K2HPO4、0.025M NaH2PO4、2000ml、2M 硫酸でpH3に合わせた）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させて、濾過して、真空中で濃縮した。収率：25.2g。
粗製油の一部（5g）を塩酸（2M、15ml）と混合した。混合物を15分間撹拌した。混合物を濾過した。単離された固体をエタノール無水物（600ml）と混合した。混合物を還流させた。不溶性不純物を除去するために沸騰混合物をデカントした。化合物を5℃にて一晩結晶化させた。収率：2.84g（白い結晶）
1H-NMR （d6-DMSO） δ: 8.96 （b, 2H）, 7.51 （t, J = 5.56 Hz, 2H）, 7.40-7.30 （b, 10H）, 5,04 （s, 4H）, 3.33 （q, J = 6.06 Hz, 4H）, 3.00 （b, 4H）
13C- NMR （d6-DMSO） δ: 156.6, 137.2, 128.7, 128.3, 128.2, 66.0, 46.8, 37.1
LC-MS （ES-positive mode）, m/z: 372.5 [M+H]+。
1H-NMR （d6-DMSO） δ: 8.96 （b, 2H）, 7.51 （t, J = 5.56 Hz, 2H）, 7.40-7.30 （b, 10H）, 5,04 （s, 4H）, 3.33 （q, J = 6.06 Hz, 4H）, 3.00 （b, 4H）
13C- NMR （d6-DMSO） δ: 156.6, 137.2, 128.7, 128.3, 128.2, 66.0, 46.8, 37.1
LC-MS （ES-positive mode）, m/z: 372.5 [M+H]+。
実施例32
[2-（2-{[ビス-（2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル）カルバモイル]メトキシ}エトキシ）エトキシ]酢酸
[2-（2-{[ビス-（2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル）カルバモイル]メトキシ}エトキシ）エトキシ]酢酸
3,6,9-トリオキサウンデカン二酸（1.83g、8.3mmol）およびN,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（1.70g、8.3mmol）をジクロロメタン（10ml）中で混合した。生じる混合物を30分間撹拌した。混合物を濾過して、その後真空中で濃縮した。形成された化合物をビス-（2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル）アンモニウムクロライド（2.8g、6.87mmol）およびN,N,N’,N’-テトラメチルグアニジン（791mg、6.87mmol）（250ml）のN,N-ジメチル-ホルムアミド（27ml）溶液と混合した。生じる混合物を20時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮した。酢酸エチル（150ml）および水性炭酸水素ナトリウム（5% w/w、150ml）を添加した。相を分離した。有機相を水性炭酸水素ナトリウム（5% w/w、2×100ml）で抽出した。合わせた水抽出液を酢酸エチル（200ml）と混合した。pHが2-3になるまで濃塩酸を混合物に添加した。相を直ちに分離した。水相を酢酸エチル（2×200ml）で抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させて、濾過して、真空中で濃縮し、無色のシロップを得た。収率：2.17g（55%）。
1H-NMR （CDCl3） δ: 10.2 （b, 1H）, 7.31 （b, 10H）, 6.10 （b, 1H）, 5.84 （b, 1H）, 5.06 （s, 2H）, 5.04 （s, 2H）, 4.17-4.09 （m, 4H）, 3.72-3.22 （いくつかの多重項、16H）
13C- NMR （CDCl3） δ: 172.9, 171.2, 157.3, 137.0, 128.9-128.4 （いくつかのシグナル）, 71.3, 70.8, 70.7, 70.3, 68.9, 67.1, 67.0, 47.5, 46.0, 39.6
LC-MS （ES-positive mode）, m/z: 576 [M+H]+。
13C- NMR （CDCl3） δ: 172.9, 171.2, 157.3, 137.0, 128.9-128.4 （いくつかのシグナル）, 71.3, 70.8, 70.7, 70.3, 68.9, 67.1, 67.0, 47.5, 46.0, 39.6
LC-MS （ES-positive mode）, m/z: 576 [M+H]+。
実施例33
[2-（2-{[ビス-（2-アミノエチル）カルバモイル]メトキシ}エトキシ）エトキシ]酢酸
[2-（2-{[ビス-（2-アミノエチル）カルバモイル]メトキシ}エトキシ）エトキシ]酢酸
[2-（2-{[ビス-（2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル）カルバモイル]メトキシ}エトキシ）エトキシ]酢酸（725mg、1.26mmol）をメタノール（50ml）に溶解する。活性炭（150mg、5% Pd、湿気、デグッサ触媒系E101 NO/W）上のパラジウムを添加した。混合物を水素ガス雰囲気において20時間撹拌した。混合物を濾過した。濾液を真空中で濃縮した。
LC-MS（ES-positive mode）、m/z: 309[M+H]+、291[M-H2O]+。
実施例34
[2-（2-{[ビス-（2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル）カルバモイル]メトキシ}エトキシ）エトキシ]酢酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イル エステル
[2-（2-{[ビス-（2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル）カルバモイル]メトキシ}エトキシ）エトキシ]酢酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イル エステル
[2-（2-{[ビス-（2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル）カルバモイル]メトキシ}エトキシ）エトキシ]酢酸（1.45g、2.52mmol）をN-ヒドロキシスクシニックイミド（291mg、2.53mmol）、1-エチル-3-（3'-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（485mg、2.53mmol）およびN,N,N',N'-テトラメチルグアニジン（291mg、2.53mmol）と混合した。混合物を20時間撹拌した。亜硫酸水素ナトリウム水溶液（5% w/w、150ml）およびジクロロメタン（100ml）を添加した。相を分離した。水相をジクロロメタン（2×100および2×50ml）で抽出した。合わせた有機層を固体の硫酸ナトリウム上で乾燥させて、濾過して、真空中で濃縮した。
LC-MS（ES-positive mode）、m/z: 674 [M+H]+、577（反応していない出発材料）。
実施例35
1,2,3-ベンゾトリアジン-4（3H）-オン-3-イル 2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセテート
1,2,3-ベンゾトリアジン-4（3H）-オン-3-イル 2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセテート
3-ヒドロキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4（3H）-オン（10.0g；61.3mmol）および2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]酢酸（10.9g；61.3mmol）DCM（125ml）中に懸濁し、DIC（7,7g；61.3mmol）を添加した。混合物を外界温度にて乾燥雰囲気下で一晩撹拌した。ジイソプロピル尿素沈着物が形成され、これを濾過した。有機溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で十分に洗浄し、次いで乾燥させて（Na2SO4）、真空中で蒸発させ、透明な黄色の油として表題生成物を得た。収量は、16.15g（81%）であった。1H-NMR （CDCl3）: δ = 3.39 ppm （s, 3H）; 3.58 （t, 2H）; 3.68 （t, 2H）; 3.76 （t, 2H）; 3.89 （t, 2H）; 4.70 （s, 2H）; 7.87 （t, 1H）; 8.03 （t, 1H）; 8.23 （d, 1H）; 8.37 （d, 1H）. 13C-NMR （CDCl3, selected peaks）: δ = 57.16 ppm; 64.96; 68.71; 68.79; 69.59; 69.99; 120.32; 123.87; 127.17; 130.96; 133.63; 142.40; 148.22; 164.97。
オリゴマー生成物：
固相オリゴマー形成：
後述する反応の全ては、Wangリンカーで官能性をもたせたポリスチレン上で行われる。また、反応は、一般にその他のタイプの固体支持体上で、並びにその他のタイプの官能性をもたせたリンカーででも作用する。
固相オリゴマー形成：
後述する反応の全ては、Wangリンカーで官能性をもたせたポリスチレン上で行われる。また、反応は、一般にその他のタイプの固体支持体上で、並びにその他のタイプの官能性をもたせたリンカーででも作用する。
固相アジド還元：
本反応は、既知であり（Schneider, S.E. et al. Tetrahedron, 1998, 54（50） 15063-15086）、支持体に結合したアジドを過剰のトリフェニルホスフィンのTHFと水との混合物溶液で室温にて12〜24時間処置することによって行うことができる。あるいは、Chan, T.Y. et al Tetrahedron Lett. 1997, 38（16）, 2821-2824によって記述されているように、トリメチルホスフィンのTHF水溶液を使用することもできる。また、アジドの還元は、ジチオスレイトールなどのスルフィド（Meldal, M. et al. Tetrahedron Lett. 1997, 38（14）, 2531-2534）、1,2-ジメルカプトエタンおよび1,3-ジメルカプトプロパン（Meinjohanns, E. et al. J. Chem. Soc, Perkin Trans 1, 1997, 6, 871-884）または塩化スズ（II）などのスズ（II）塩（Kim, J.M. et al. Tetrahedron Lett, 1996, 37（30）, 5305-5308）を使用して固相上で行うこともできる、。
本反応は、既知であり（Schneider, S.E. et al. Tetrahedron, 1998, 54（50） 15063-15086）、支持体に結合したアジドを過剰のトリフェニルホスフィンのTHFと水との混合物溶液で室温にて12〜24時間処置することによって行うことができる。あるいは、Chan, T.Y. et al Tetrahedron Lett. 1997, 38（16）, 2821-2824によって記述されているように、トリメチルホスフィンのTHF水溶液を使用することもできる。また、アジドの還元は、ジチオスレイトールなどのスルフィド（Meldal, M. et al. Tetrahedron Lett. 1997, 38（14）, 2531-2534）、1,2-ジメルカプトエタンおよび1,3-ジメルカプトプロパン（Meinjohanns, E. et al. J. Chem. Soc, Perkin Trans 1, 1997, 6, 871-884）または塩化スズ（II）などのスズ（II）塩（Kim, J.M. et al. Tetrahedron Lett, 1996, 37（30）, 5305-5308）を使用して固相上で行うこともできる、。
固相カルバメート形成：
本反応は、既知であり、通常活性化されたカルボナートを、またはアミンと共にハロホルミアート誘導体を反応することによって、好ましくは塩基の存在下において行われる。
本反応は、既知であり、通常活性化されたカルボナートを、またはアミンと共にハロホルミアート誘導体を反応することによって、好ましくは塩基の存在下において行われる。
実施例36
3-（1,3-ビス{2-[2-（[ベンゾイルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシカルボニル）-アミノ）-プロパン酸
3-（1,3-ビス{2-[2-（[ベンゾイルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシカルボニル）-アミノ）-プロパン酸
本実施例では、2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]酢酸でキャップされた分枝重合体に基づいた第二世代カルバメートの合成の際に実施例4で調製した1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イル-p-ニトロフェニルカルボナート単量体ビルディングブロックを使用する。カップリング化学は、標準的な固相カルバメート化学に基づき、保護法は、上記のとおりの固相アジド還元工程に基づく。
工程1：Fmoc-β-Ala-Wang樹脂（100mg；0.31mmol/gを充填BACHEM）をジクロロメタンに30分間懸濁し、次いで、DMFで2回洗浄した。20%のピペリジンのDMF溶液を添加して、混合物を外界温度にて15分間浸透した。この工程を繰り返して、樹脂をDMF（3×）およびDCM（3×）で洗浄した。
工程2：単量体ビルディングブロックのカップリング：1,3-ビス[アジドエトキシエチル]プロパン-2-イル-p-ニトロフェニルカルバメート（527mg；1,4mmol、4×）の溶液をDIPEA（240μl；1,4mmol、4×）と共に樹脂に添加した。樹脂を90分間浸透し、次いで排液して、DMF（3×）およびDCM（3×）で洗浄した。
工程3：無水酢酸でのキャッピング：次いで、樹脂を無水酢酸、DIPEA、DMF（12：4：48）の溶液で外界温度にて10分間処置した。溶媒を除去して、樹脂をDMF（3×）およびDCM（3×）で洗浄した。
工程4：脱保護（アジド基の還元）：樹脂をDTT（2M）およびDIPEA（1M）のDMF溶液で50℃にて1時間処置した。次いで、樹脂をDMF（3×）およびDCM（3×）で洗浄した。少量の樹脂を抜き取り、塩化ベンゾイル（0.5M）およびDIPEA（1M）のDMF溶液で1時間処置した。樹脂を50% TFA／DCMで切断し、ジベンゾイル化された生成物をNMRおよびLC-MSで解析した。1H-NMR （CDCl3）: δ = 3.50-3.75 （m, 20H）; 3.85 （s, 1H）; 4.25 （d, 2H）; 6.95 （t, 1H）; 7.40-7.50 （m, 6H）; 7.75 （m, 4H）. LC-MS: m/z = 576 （M+1）; Rt = 2.63分。
実施例37
3-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イル-オキシ）-アセチルアミノ]プロパン酸
3-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イル-オキシ）-アセチルアミノ]プロパン酸
工程1：Fmoc-β-Ala連結Wang樹脂（A22608、Nova Biochem、3.00g；0.83 mmol/gを充填）をDCM中で20分間膨潤させ、次いでDCM（2×20ml）およびNMP（2×20ml）で洗浄した。次いで、樹脂を20%のピペリジンのNMP溶液で2回処置した（2×15分）。樹脂をNMP（3×20ml）およびDCM（3×20ml）で洗浄した。
工程2：2-（1,3-ビス[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）酢酸（3.70g；10mmol）をNMP（30ml）およびDhbtOH（1.60g；10mmol）に溶解し、DIC（1.55ml；10mmol）を添加した。混合物を外界温度にて30分間撹拌した、次いで、DIPEA（1.71ml；10mmol）と共に工程1で得た樹脂に添加した。反応混合物を1.5時間振盪し、次いで排液して、NMP（5×20ml）およびDCM（3×20ml）で洗浄した。
工程3：次いで、SnCL2.2H2O（11.2g；49.8mmol）のNMP（15ml）およびDCM（15ml）溶液を添加した。反応混合物を1時間振盪した。NMP：MeOH（5×20 ml；1：1）を有する樹脂を排出して、洗浄した。次いで、樹脂を真空中で乾燥させた。
工程4：2-[2-（2-メトキシエチル）エトキシ]酢酸（1.20g；6.64mmol）、DhbtOH（1.06g；6.60mmol）およびDIC（1.05ml；6.60mmol）のNMP（10ml）溶液を室温で10分間混合し、次いで、工程3で得たwang樹脂に繋ぎ止められた3-[2-（1,3-ビス[2-（2-アミノエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]プロパン酸（1.0g；0.83mmol/g）を添加した。DIPEA（1.15ml、6.60mmol）を添加して、反応混合物を2.5時間振盪した。溶媒を除去して、樹脂をNMP（5x20 ml）およびDCM（10x20 ml）で洗浄した。
工程5：工程4の樹脂生成物を、TFA：DCM（10ml、1：1）で1時間処置した。樹脂を濾過して、TFA：DCM（10ml、1：1）で一度洗浄した。次いで、合わせた濾液および洗浄液を乾燥させ、黄色の油（711mg）を得た。油を10% アセトニトリル-水（20ml）に溶解して、C18カラムおよび15-40% アセトニトリル-水の勾配を使用する調製用HPLC装置で2回の操作にわたって精製した。その後、画分をLC-MSによって解析した。生成物を含む画分をプールして、乾燥させた。収率：222mg（37%）。LC-MS: m/z = 716 （M+1）, Rt = 1.97 min. 1H-NMR （CDCl3）: δ = 2.56 ppm （t, 2H）; 3.36 （s, 6H）; 3.46-3.66 （m, 39H）; 4.03 （s, 4H）; 4.16 （s, 2H）; 7.55 （t, 2H）; 8.05 （t, 1H）. 13C-NMR （CDCl3, selected peaks）: δ = 33.71 ppm; 34.90; 58.89; 68.94; 69.40; 69.98; 70.09; 70.33; 70.74; 70.91; 71.07; 71.74; 79.07; 171.62; 171.97; 173.63。
実施例38
3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）-エトキシ]-アセトアミノ}-エトキシ）-エトキシ]-プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）-プロパン酸
3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）-エトキシ]-アセトアミノ}-エトキシ）-エトキシ]-プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）-プロパン酸
この材料は、実施例工程3において使用する試薬の量を2倍にして工程2〜5を繰り返すことによって得られたwang樹脂に繋ぎ止めた3-[2-（1,3-ビス[2-（2-アミノエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）-アセチル-アミノ]-プロパン酸（1.0g；0.83mmol/g）から調製した。収率：460mg（33%）。MALDI-MS（α-シアノ4-ヒドロキシケイ皮酸）：m/z = 1670 （M+Na）. 1H-NMR （CDCl3）: δ = 2.57 ppm （t, 2H）; 3.38 （s, 12H）; 3.50-3.73 （m, 85 H）; 4.05 （s, 8H）; 4.17 （s, 2H）; 4.19 （s, 4H）; 7.48 （m, 4H）; 7.97 （m, 3H）. 13C-NMR （CDCl3, selected peaks）: δ = 38.81 ppm; 58.92; 69.46; 69.92; 70.05; 70.05; 70.13; 70.40; 70.73; 70.97; 71.11; 71.88; 76.74; 77.06; 77.38; 171.33; 172.02。
代わりの調製の様式：
本実施例では、2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]酢酸でキャップされた分枝重合体に基づいた第二世代カルバメートの合成の際に実施例6で調製した2-（1,3-ビス[アジドエトキシエチル]プロパン-2-イルオキシ）酢酸単量体ビルディングブロックを使用する。カップリング化学は、標準的な固相ペプチド化学に基づき、保護法は、上記のとおりの固相アジド還元工程に基づく。
本実施例では、2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]酢酸でキャップされた分枝重合体に基づいた第二世代カルバメートの合成の際に実施例6で調製した2-（1,3-ビス[アジドエトキシエチル]プロパン-2-イルオキシ）酢酸単量体ビルディングブロックを使用する。カップリング化学は、標準的な固相ペプチド化学に基づき、保護法は、上記のとおりの固相アジド還元工程に基づく。
工程1：Fmoc-β-Ala-Wang樹脂（100mg；0.31mmol/gを充填BACHEM）をジクロロメタンに30分間懸濁し、次いで、DMFで2回洗浄した。20%のピペリジンのDMF溶液を添加して、混合物を外界温度にて15分間浸透した。この工程を繰り返して、樹脂をDMF（3×）およびDCM（3×）で洗浄した。
工程2：単量体ビルディングブロックのカップリング：2-（1,3-ビス[アジドエトキシエチル]-プロパン-2-イルオキシ）酢酸（527mg；1,4mmol、4×）およびDhbtOH（225mg；1,4mmol、4×）をDMF（5ml）に溶解し、DIC（216μl、1,4mmol、4×）を添加した。混合物を10分間放置し（プレ活性化）、次いでDIPEA（240μl；1,4mmol、4×）と共に樹脂に添加した。樹脂を90分間振盪し、次いで排液して、DMF（3×）およびDCM（3×）で洗浄した。
工程3：無水酢酸でのキャッピング：次いで、樹脂を無水酢酸、DIPEA、DMF（12：4：48）の溶液で外界温度にて10分間処置した。溶媒を除去して、樹脂をDMF（3×）およびDCM（3×）で洗浄した。
工程4：脱保護（アジド基の還元）：樹脂をDTT（2M）およびDIPEA（1M）のDMF溶液で50℃にて1時間処置した。次いで、樹脂をDMF（3×）およびDCM（3×）で洗浄した。少量の樹脂を抜き取り、塩化ベンゾイル（0.5M）およびDIPEA（1M）のDMF溶液で1時間処置した。樹脂を50% TFA／DCMで切断し、ジベンゾイル化された生成物をNMRおよびLC-MSで解析した。1H-NMR （CDCl3）: δ = 3.50-3.75 （m, 20H）; 3.85 （s, 1H）; 4.25 （d, 2H）; 6.95 （t, 1H）; 7.40-7.50 （m, 6H）; 7.75 （m, 4H）. LC-MS: m/e = 576 （M+1）; Rt = 2.63分。
工程5〜7は、二倍モル量の試薬を使用して、しかし同一溶媒量で、工程2〜4として行った。
工程8：2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]酢酸：2-[2-（2-メトキシエトキシ）-エトキシ]酢酸（997mg；5.6mmol、樹脂充填に関して16×）およびDhbtOH（900mg；5.6mmol、16×）をDMF（5ml）に溶解し、DIC（864μl、5.6mmol、16×）を添加した。混合物を10分間放置し（プレ活性化）、次いでDIPEA（960μl；5.6mmol、16×）と共に樹脂に添加した。樹脂を90分間振盪し、次いで排液して、DMF（3×）およびDCM（3×）で洗浄した。
工程9：樹脂からの切断：樹脂を50%のTFA-DCM溶液で外界温度にて30分間処置した。溶媒を収集して、樹脂を50%のTFA-DCMでさらに回数洗浄した。合わせた濾液を乾燥まで蒸発させて、残渣をクロマトグラフィーによって精製した。
実施例39
3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）-エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）プロパン酸
3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）-エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）プロパン酸
この材料は、実施例の工程3において使用する試薬の量を2×にして工程2〜3を繰り返し、次いで使用する試薬の量を4×にして工程2〜5を繰り返すことによって得られたwang樹脂に繋ぎ止めた3-[2-（1,3-ビス[2-（2-アミノエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]プロパン酸（1.0g；0.83mmol/g）から調製した。収率：84mg（4%）。LC-MS: （m/2）+1 = 1758; （m/3）+1 = 1172; （m/4）+1 = 879; （m/5）+1 = 704. Rt = 2.72 min. 1H-NMR （CDCl3）: δ = 2.51 ppm （t, 2H）; 3.33 （s, 24H）; 3.44-3.70 （m, 213H）; 3.93 （s, 16H）; 4.08 （s, 14H）; 7.25 （m, 8H）; 7.69 （m, 7H）. 13C-NMR （CDCl3, selected peaks）: δ = 38.94 ppm; 59.33; 69.78; 70.08; 70.37; 70.44; 70.56; 70.82; 71.10; 71.26; 71.51; 72.17; 79.24; 170.60; 171.22。
実施例40
N-ヒドロキシスクシンイミジル3-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]プロパノアート
N-ヒドロキシスクシンイミジル3-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]プロパノアート
3-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]プロパン酸（67mg；82μmol）をTHF（5ml）に溶解した。反応混合物を、氷浴上で冷却した。DIPEA（20μl；120μmol）およびTSTU（34mg；120μmol）を添加した。混合物を外界温度にて一晩撹拌し、その時に、反応をLC-MSに従って完了した。LC-MS: m/z = 813 （M+H）; Rt = 2.22分。
実施例41
N-ヒドロキシスクシンイミジル3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチル-アミノ）プロパノアート
N-ヒドロキシスクシンイミジル3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチル-アミノ）プロパノアート
3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）プロパン酸およびTSTUから実施例40に記載されているのと同様に調製する。LC-MS: （m/2）+1 = 873, Rt = 2.55分。
実施例42
N-ヒドロキシスクシンイミジル3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）-エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）プロパノアート
N-ヒドロキシスクシンイミジル3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）-エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）プロパノアート
N-ヒドロキシスクシンイミジル3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）プロパン酸およびTSTUから実施例40に記載されているのと同様に調製する。LC-MS: （m/4）+1 = 903, Rt = 2.69分。
実施例43
N-（4-tert-ブトキシカルボニルアミノキシブチル）3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシ-エトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）プロパンアミド
N-（4-tert-ブトキシカルボニルアミノキシブチル）3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシ-エトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）プロパンアミド
N-ヒドロキシスクシンイミジル 3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）プロパノアート（105mg；0.06mmol）をDCM（2ml）に溶解した。次いで、4-（tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシ）ブチルアミン（49mg；0.24mmol）を、続いてDIPEA（13μl；0.07mmol）を添加した。混合物を外界温度にて1時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。残渣を20%のアセトニトリル-水（4ml）に溶解して、C18カラムおよびアセトニトリル-水の0、10、20、30および40%（それぞれ10mlの溶出）の段階勾配を使用する調製用HPLC装置で精製した。純粋な生成物を含む画分を濃縮して、真空オーブンで16時間乾燥させ、黄色の油を得た。収率：57mg（51%）。LC-MS: （m/2）+1 = 918, Rt = 2.75 min. 1H-NMR （CDCl3）: δ = 1.42 ppm （s, 9H）; 2.40 （t, 2H）; 3.21 （dd, 2H）; 3.33 （s, 12H）; 3.38-3.72 （m, 99H）; 3.80 （m, 2H）; 3.95 （s, 8H）; 4.08 （s, 6H）; 6.99 （m, 1H）; 7.23 （m, 4H）; 7.69 （m, 2H）; 7.85 （m, 1H）; 8.00 （m, 1H）. 13C-NMR （CDCl3, selected peaks）: δ = 28.27 ppm; 38.58; 58.97; 69.42; 69.72; 70.01; 70.08; 70.20; 70.41; 70.46; 70.73; 70.91; 71.16; 71.22; 71.81; 78.89; 81.33; 170.27; 170.89。
実施例44
N-（4-アミノキシブチル）3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）プロパンアミド
N-（4-アミノキシブチル）3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）プロパンアミド
N-（4-tert-ブトキシカルボニルアミノキシブチル）3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）プロパンアミド（19mg；10μmol）を50%のTFA／DCM（10ml）に溶解して、透明な溶液を外界温度にて30分間撹拌した。溶媒を回転蒸発によって除去して、残渣を2回DCMから放散させ、定量的収率（19mg）の表題生成物を得た。LC-MS: （m/2）+1 = 868, （m/3）+1 = 579, Rt = 2,35分。
実施例45
tert-ブチル2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセテート
tert-ブチル2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセテート
tert-ブチル2-（1,3-ビス[2-（2-アミノエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセテート（1.74g；4.5mmol、実施例9）および1,2,3-ベンゾトリアジン-4（3H）-オン-3-イル2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセテート（2.94g；9mmol、実施例35）をDCM（100ml）に溶解した。DIPEA（3.85ml；22.3mmol）を添加して、透明な混合物を、室温で90分間撹拌した。溶媒を真空中で除去して、残渣を溶出剤としてMeOH-DCM（1：16）を使用するシリカでのクロマトグラフィーによって精製した。純粋画分をプールして、乾燥させ、透明な油として表題材料を得た。収量は、1.13g（36%）であった。 1H-NMR （CDCl3）: δ = 1.46 ppm （s, 9H）; 3.38 （s, 6H）; 3.49-3.69 （m, 37H）; 4.01 （s, 4H）; 4.18 （s, 2H）; 7.20 （bs, 2H）。
実施例46
2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）酢酸：
2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）酢酸：
tert-ブチル2-（1,3-ビス[2-（2-アミノエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセテート（470mg；0.73mmol）をDCM-TFA（25ml、1：1）に溶解して、混合物を外界温度にて30分間撹拌した。溶媒を真空中で除去して、残渣を2回DCMから放散させた。LC-MS: （M+1） = 645, Rt = 2,26 min. 1H-NMR （CDCl3）: δ = 3.45 ppm （s, 6H）; 3.54-3.72 （m, 37H）; 4.15 （s, 4H）; 4.36 （s, 2H）。
実施例47
N-ヒドロキシスクシンイミジル2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセテート
N-ヒドロキシスクシンイミジル2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセテート
2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）酢酸（115mg；0.18mmol）をTHF（5ml）に溶解した。反応混合物を氷浴上に置いた。TSTU（65mg、0.21mmol）およびDIPEA（37μl；0.21mmol）を添加し、反応混合物を0℃にて30分間、次いで室温で一晩撹拌した。次いで反応を乾燥させ、透明な油として130mgの表題物質を得た。LC-MS: （m+1） = 743, （m/2）+1 = 372, Rt = 2,27分。
実施例48
t-ブチル3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセテート
t-ブチル3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセテート
本材料は、実施例45に記述されたプロトコルおよび精製法を使用して、N-ヒドロキシスクシンイミジル2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセテートおよび1等量のtert-ブチル2-（1,3-ビス[2-（2-アミノエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセテートから調製した。
さらなる樹状成長は、実施例46に記載されているようにtert-ブチル基を除去し、その後に実施例47に記載されているようなN-ヒドロキシスクシミジルエステル形成、続くこの実施例に記載されているようなtert-ブチル2-（1,3-ビス[2-（2-アミノエトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセテートに対するカップリングによって達成してもよい。
実施例49
（S）-2,6-ビス（2-[2-（2-[2-（2,6-ビス-[2-（2-[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]エトキシ）アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ）エトキシ]エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ）ヘキサン酸メチルエステル
（S）-2,6-ビス（2-[2-（2-[2-（2,6-ビス-[2-（2-[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]エトキシ）アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ）エトキシ]エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ）ヘキサン酸メチルエステル
（S）-2,6-ビス（2-{2-[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ）ヘキサン酸（1.8g、3.10mmol）をジメチルホルムアミド/ジクロロメタン1：3（10ml）の混合物に溶解し、ジイソプロピルエチルアミンを使用してpHを塩基性に合わせて、N-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびN-エチル-N’-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライドを添加して、反応混合物を30分間置いた。次いで、この反応混合物を（S）-2,6-ビス-（2-{2-[2-（2-アミノエトキシ）エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ）ヘキサン酸メチルエステル（0.37g、0.70mmol、ジクロロメタン溶液）の溶液に添加して、反応混合物を一晩おいた。反応混合物をジクロロメタン（150ml）で希釈し、水（2×40ml）、50% 飽和炭酸水素ナトリウム（2×30ml）および水（3×40ml）で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させて、濾過して、真空中で蒸発させ、油を得た。収率：1.6g（89%）。LC-MS: m/z = 1656 （M+1）, 828.8 （M/2）+1および553 （M/3）+1。
実施例50
（S）-2,6-ビス（2-[2-（2-[2-（（S）-2,6-ビス[2-（2-[2-（2-tert-ブトキシカルボニルアミノエトキシ）エトキシ]エトキシ）アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ）エトキシ]エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ）ヘキサン酸メチルエステル
（S）-2,6-ビス（2-[2-（2-[2-（（S）-2,6-ビス[2-（2-[2-（2-tert-ブトキシカルボニルアミノエトキシ）エトキシ]エトキシ）アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ）エトキシ]エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ）ヘキサン酸メチルエステル
上記の（S）-2,6-ビス（2-[2-（2-[2-（（S）-2,6-ビス[2-（2-[2-（2-アジドエトキシ）エトキシ]エトキシ）アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ）エトキシ]エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ）ヘキサン酸メチルエステル（1.6g、0.97mmol）の酢酸エチル（60ml）溶液にジ-tert-ブチルジカルボナート（1.0g、4.8mmol）およびPd/C（10%、1.1g）を添加した。水素を反応混合物を通して2時間常に泡立てた。反応混合物を濾過して、有機溶媒を真空中で除去し、油を得て、これをさらに精製することなく使用した。収率：1.8 g（98%）。 LC-MS: m/z = 1953 （M+1）, 977 （M/2）+1。
実施例51
（S）-2,6-ビス（2-[2-（2-[2-（（S）-2,6-ビス[2-（2-[2（2アミノエトキシ）エトキシ]エトキシ）アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ）エトキシ]エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ）ヘキサン酸メチルエステル
（S）-2,6-ビス（2-[2-（2-[2-（（S）-2,6-ビス[2-（2-[2（2アミノエトキシ）エトキシ]エトキシ）アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ）エトキシ]エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ）ヘキサン酸メチルエステル
上記の（S）-2,6-ビス（2-[2-（2-[2-（（S）-2,6-ビス[2-（2-[2-（2-tert-ブトキシカルボニルアミノエトキシ）エトキシ]エトキシ）アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ）エトキシ]エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ）ヘキサン酸メチルエステルをジクロロメタン（20ml）に溶解して、トリフルオロ酢酸（20ml）を添加した。反応混合物を2時間置いた。有機溶媒を真空中で蒸発させ、油を得た。収率：1.4g（100%）。 LC-MS: m/z = 1552 （M+1）; 777.3 （M/2）+1; 518.5 （M/3）+1 and 389.1 （M/4）+1。
実施例52
（S）-2,6-ビス-（2-[2-（2-[2-（（S）-2,6-ビス-[2-（2-[2-（2-（2-（2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ）アセチルアミノ）エトキシ）エトキシ]エトキシ）アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ）エトキシ]エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ）ヘキサン酸メチルエステル
（S）-2,6-ビス-（2-[2-（2-[2-（（S）-2,6-ビス-[2-（2-[2-（2-（2-（2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ）アセチルアミノ）エトキシ）エトキシ]エトキシ）アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ）エトキシ]エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ）ヘキサン酸メチルエステル
2-（2-（メトキシエトキシ）エトキシ）酢酸（1.3g、7.32mmol）のジクロロメタンおよびジメチルホルムアミド3：1（20ml）の混合溶液にN-ヒドロキシスクシンイミド（0.8g、7.32mmol）およびN-エチル-N’-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（1.4g、7.32mmol）を添加した。反応混合物を1時間置き、その後、混合物を（S）-2,6-ビス（2-[2-（2-[2-（（S）-2,6-ビス[2-（2-[2（2アミノエトキシ）エトキシ]エトキシ）アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ）エトキシ]エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ）ヘキサン酸メチルエステル（1.42g、0.92mmol）およびジイソプロピルエチルアミン（2.4ml、14.64mmol）のジクロロメタン（10ml）溶液に添加した。反応混合物を一晩置いた。反応混合物をジクロロメタン（100ml）で希釈して、水（3×25ml）で抽出した。合わせた水相をさらなるジクロロメタン（2×75ml）で抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させて、濾過して、真空中で蒸発させた。残渣を、溶出剤として500mlの酢酸エチル、続いて500mlの 酢酸エチル／メタノール9：1および最後にメタノールを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を含む画分を真空中で蒸発させ、油を得た。収率：0.75g（38%）。LC-MS: m/z = 1097 （M/2）+1; 732 （M/3）+1 and 549 （M/4）+1。
（S）-2,6-ビス-（2-[2-（2-[2-（（S）-2,6-ビス-[2-（2-[2-（2-（2-（2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ）アセチルアミノ）エトキシ）エトキシ]エトキシ）アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ）エトキシ]エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ）ヘキサン酸メチルエステルを遊離酸に対してけん化して、たとえば活性化されたエステルを使用してεアミノリジン残基に、または末端αアミノ基で、ITAの遊離アミノ基に付着することができる。活性化されたエステルは、ジイソプロピルエチルアミンおよびN-ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはその他の活性化条件などの当技術分野において既知の標準的カップリング法により、作製し、およびITAペプチドのアミノ基に結合してもよい。
あるいは、上記のtertブチル保護されたカルボン酸中間体を脱保護して、その後に（subsequemtly）ITAペプチドの付着のためのOSuエステル（たとえば、実施例40に記載されているとおり）として活性化してもよい。
実施例53
[2-（2-{[ビス-（2-{2-[2-（2-{[ビス-（2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル）カルバモイル]メトキシ}エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ}エチル）カルバモイル]メトキシ}エトキシ）エトキシ]酢酸
[2-（2-{[ビス-（2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル）カルバモイル]メトキシ}エトキシ）エトキシ]酢酸2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル（2.53mmol−以前の実験からの、質量は決定されない）のテトラヒドロフラン（50ml）溶液および[2-（2-{[ビス-（2-アミノエチル）カルバモイル]メトキシ}エトキシ）エトキシ]酢酸（1.26mmol−以前の実験からの、質量は決定されない）の炭酸水素ナトリウム水溶液（5% w/w、50ml）を混合した。混合物を少なくとも20時間撹拌した。pHが2〜3になるまで固体の亜硫酸水素ナトリウムを添加した。相を分離した。水相をジクロロメタン（3×50ml）で抽出した。合わせた有機相を亜硫酸水素ナトリウム水溶液（5% w/w、50ml）で洗浄した。水相をジクロロメタン（2×50ml）で抽出した。合わせた有機相を、硫酸マグネシウム上で乾燥させて、濾過して、真空中で濃縮した。収率：989mg
LC-MS （ES-positive mode）, m/z: 1423 [M+H]+。
[2-（2-{[ビス-（2-{2-[2-（2-{[ビス-（2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル）カルバモイル]メトキシ}エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ}エチル）カルバモイル]メトキシ}エトキシ）エトキシ]酢酸
[2-（2-{[ビス-（2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル）カルバモイル]メトキシ}エトキシ）エトキシ]酢酸2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル（2.53mmol−以前の実験からの、質量は決定されない）のテトラヒドロフラン（50ml）溶液および[2-（2-{[ビス-（2-アミノエチル）カルバモイル]メトキシ}エトキシ）エトキシ]酢酸（1.26mmol−以前の実験からの、質量は決定されない）の炭酸水素ナトリウム水溶液（5% w/w、50ml）を混合した。混合物を少なくとも20時間撹拌した。pHが2〜3になるまで固体の亜硫酸水素ナトリウムを添加した。相を分離した。水相をジクロロメタン（3×50ml）で抽出した。合わせた有機相を亜硫酸水素ナトリウム水溶液（5% w/w、50ml）で洗浄した。水相をジクロロメタン（2×50ml）で抽出した。合わせた有機相を、硫酸マグネシウム上で乾燥させて、濾過して、真空中で濃縮した。収率：989mg
LC-MS （ES-positive mode）, m/z: 1423 [M+H]+。
荷電したリン酸バックボーンをもつデンドリマーの合成のための一般的手順。
あるいは、上記のtertブチル保護されたカルボン酸中間体を脱保護して、その後に（subsequemtly）インスリンに対する付着のためのOSuエステル（たとえば、実施例47に記載されているとおり）として活性化してもよい。
実施例54
2-（2-トリチルオキシエトキシ）エタノール：
トリフェニルクロロメタン（10g、35.8mmol）を乾燥ピリジンに溶解し、ジエチレングリコール（3.43mL、35.8mmol）を添加して、混合物を窒素下で一晩撹拌した。溶媒を真空中で除去した。ジクロロメタン（100mL）に溶解し、水で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥して、溶媒を真空中でを除去した。粗生成物をヘプタン／トルエン（3：2）からの再結晶によって精製し、表題化合物を得た。
1H NMR （CDCl3）: δ = 7.46 （m, 6H）, 7.28, （m, 9H）, 3.75 （t, 2H）, 3.68 （t, 2H）, 3.62 （t, 2H）, 3.28 （t, 2H）. LC-MS: m/z = 371 （M+Na）; Rt = 2.13分。
2-[2-（2-トリチルオキシエトキシ）エトキシメチル]オキシラン：
2-（2-トリチルオキシエトキシ）エタノール（6.65g、19mmol）を乾燥THF（100mL）に溶解した。60%のNaH（0.764mg、19mmol）をゆっくり添加した。懸濁液を15分間撹拌した。エピブロモヒドリン（1.58mL、19mmol）を添加して、混合物を室温にて窒素下で一晩撹拌した。反応を氷でクエンチし、ジエチルエーテル（300mL）と水（300mL）との間で分離した。水面をジクロロメタンで抽出した。有機相を収集して、乾燥させ（Na2SO4）、溶媒を真空中で除去して油を得て、これをDCM／MeOH／Et3N（98：1：1）で溶出するシリカゲルカラムで精製し、表題化合物を得た。
1H NMR （CDCl3）: δ = 7.45 （m, 6H）, 7.25, （m, 9H）, 3.82 （dd, 1H）, 3.68 （m, 6H）, 3.45 （dd, 1H）, 3.25 （t, 2H）, 3.15 （m, 1H）, 2.78 （t, 1H）, 2.59 （m, 1H）. LC-MS: m/z = 427 （M+Na）; Rt = 2.44分
1,3-ビス[2-（2-トリチルオキシエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オール：
1,3-ビス[2-（2-トリチルオキシエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オール：
2-（2-トリチルオキシエトキシ）エタノール（1.14g、3.28mmol）を乾燥DMF（5mL）に溶解した。60%のNaH（144mg、3.61mmol）をゆっくり添加して、混合物を室温にて窒素下で30分間撹拌した。混合物を40℃まで加熱する。2-[2-（2-トリチルオキシエトキシ）エトキシメチル]オキシラン（1.4g、3.28mmol）を乾燥DMF（5mL）に溶解して、溶液に窒素下で滴状に添加し、一方で攪拌を続けた。添加終了後、混合物を、40℃にて一晩窒素下で撹拌する。加熱を除き、室温に冷却後、反応を氷でクエンチし、飽和NaHCO3水溶液（100ml）に注ぎ、ジエチルエーテル（3×75 mL）で抽出する。有機相を収集し、乾燥させ（Na2SO4）、溶媒を真空中でを除去して油を得て、これをEtOAc／ヘプタン／Et3N（49：50：1）で溶出するシリカゲルカラムで精製し、表題化合物を得た。1H NMR （CDCl3）: δ = 7.45 （m, 12H）, 7.25, （m, 18H）, 3.95 （m, 1H）, 3.78-3.45 （m, 16H）, 3.22 （t, 4H）, LC-MS: m/z = 775 （M+Na）; Rt = 2.94分。
1,3-ビス[2-（2-トリチルオキシエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オール（2-シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイト）：
1,3-ビス[2-（2-トリチルオキシエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オール（0.95g、1.26mmol）を乾燥ピリジンから2回および乾燥アセトニトリルから1回蒸発させた（aveporated）。窒素下で攪拌すると共に乾燥THF（15mL）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（1.2mL、6.95mmol）を添加した。混合物を氷浴で0℃に冷却して（coold）2-シアノエチルジイソプロピルクロロホスホラミダイト（0.39mL、1.77mmol）を窒素下で添加した。混合物を0℃にて10分間、続いて室温で30分間撹拌した。NaHCO3水溶液（50ml）を添加して、混合物をDCM／Et3N（98：2）（3×30mL）で抽出した。有機相を収集して、乾燥させ（Na2SO4）、溶媒を真空中で除去して油を得て、これをEtOAc／ヘプタン／Et3N（35：60：5）で溶出するシリカゲルカラムで精製し、703mgの表題化合物を得た。31P-NMR （CDCl3）: δ149.6 ppm。
{2-[2-（2-ヒドロキシエトキシ）エトキシ]-1-[2-（2-ヒドロキシエトキシ）エトキシメチル]エトキシ}酢酸tert-ブチルエステル：
1,3-ビス[2-（2-トリチルオキシエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オール（0.3g、0.40mmol）を乾燥ピリジンから1回および乾燥アセトニトリルから1回蒸発させた。窒素下で乾燥DMF（2ml）に溶解し、60%のNaH（24mg、0.6mmol）を添加した。混合物を室温で15分間撹拌した。tert-ブチルブロモアセタート（0.07mL、0.48mmol）を添加して、混合物をさらに60分間撹拌した。反応を氷でクエンチした。ジエチルエーテル（2×50 mL）と水（2×50mL）との間で分離して、有機相を収集して、乾燥させ（Na2SO4）、溶媒を真空中で除去して油を得て、これをEtOAc／ヘプタン／Et3N（49：50：1）と共にシリカゲルカラムで溶出する。主生成物を含む画分を収集し、溶媒を真空中で除去し、80%の水性酢酸（5mL）に溶解して、室温で一晩撹拌する。溶媒を真空中で溶媒除去した。粗製物質をジエチルエーテル（25mL）に溶解し、水（2×5mL）で洗浄した。水相を収集して、水を回転蒸発で除去し、63mgの表題化合物を得た。1H NMR （CDCl3）: δ = 4.19 （s, 2H）, 3.78-3.55 （m, 21H）, 1.49 （s, 9H）。
2-（1,3-ビス[2-（2-ヒドロキシエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オキシ）酢酸tert-ブチルエステル（63mg、0.16mmol）を乾燥アセトニトリルから2回蒸発させた。1,3-ビス[2-（2-トリチルオキシエトキシ）エトキシ]プロパン-2-オキシβ-シアノエチルN,N-ジイソプロピルホスホラミダイト（353mg、0.37mmol）を乾燥アセトニトリルから2回蒸発させ、乾燥アセトニトリル（2mL）で溶解して、添加した。テトラゾールの乾燥アセトニトリル（0.25M、2.64ml）溶液を窒素下で添加して、混合物を室温で1時間撹拌した。5.5mLのI2-溶液（0.1M のTHF/ルチジン/H2O 7：2：1）を添加して、混合物をさらに1時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（20mL）で希釈して、ヨウ素色が消えるまで2%の亜硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を乾燥させて（Na2SO4）、溶媒を真空中でを除去した。残渣を80%の水性酢酸（5mL）に溶解して、室温で一晩撹拌した。溶媒を真空中で除去して、粗製物質にはジエチルエーテル（25mL）および水（10mL）を添加した。水相を収集して、水を真空中で除去した。生成物を逆相調製用HPLC C-18カラム、0.1%のTFAを含む勾配0〜40%のアセトニトリルで精製し、表題のtert-ブチル保護された第2世代分枝重合体生成物を得た。LC-MS: m/z = 1171 （M+Na）; 1149 （M+）, 1093 （MSにおいてtert-ブチルの減少）; Rt = 2.76分。
その後、β-シアノエチル基の脱保護およびtert-ブチルエステル基の除去を、当業者に既知の従来の塩基および酸処理を使用して行った。
ITAに対するデンドリマーの付着：
実施例55
N-イプシロン26,3-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]プロパノイル[Arg34]GLP-1-（7-37）-OH
実施例55
N-イプシロン26,3-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]プロパノイル[Arg34]GLP-1-（7-37）-OH
R34-GLP-1（7-37）（L.B.Knudsen et al., J. Med. Chem.2000, 43, 1664-1669.）（110mg；33μmol）を水（30ml）に懸濁した。不透明懸濁液にDIPEA（156μl；1.6mmol）を添加し、混合物を10分間撹拌した。その間に、溶液が透明になった。pHを10まで測定した。次いで、N-ヒドロキシスクシンイミジル3-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）-エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]プロパノアート（80.4mg；99μmol、実施例32）の水（6.0ml）溶液を添加した。反応混合物が黄色になり、わずかに不透明になった。混合物を室温で45分間撹拌した。次いで、グリシンの溶液（5.3ml濃度=10mg/ml）を添加した。混合物を室温で5分間撹拌した。次いで、反応混合物を2操作にわたって直接注射（それぞれ20mlおよび16ml）して、25〜55%の水−アセトニトリルの直線勾配および10ml／分の流速と共にC18カラム（20×2cm）を使用して調製用HPLCによって精製し、10mlの画分を収集した。生成物を含む個々の画分をLC-MS（エレクトロスプレー（electorspray））およびHPLC（metodeA）を使用して解析した。純粋化合物を含む試料をプールして、80mlの総容積の試料を得て、λ=276nmでの相対吸収測定から1.05mg/mlの終濃度と決定された。試料を凍結して使用するまで-18℃にて貯蔵した。収率：84.6 mg（67%）。MALDI-TOF-MS（α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸）： m/z = 4080. LC-MS （エレクトロスプレー）： （m/3）+1 = 1261； （m/4）+1 = 1021； Rt = 3.54 min. HPLC （方法A）： Rt = 36.46分。
実施例56
N-イプシロン26-3-（1,3-ビス{2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}-エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ]）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）-プロパノイル[Arg34]GLP-1-（7-37）-OH
N-イプシロン26-3-（1,3-ビス{2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}-エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ]）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）-プロパノイル[Arg34]GLP-1-（7-37）-OH
R34-GLP-1（7-37）（15.6mg；4.5μmol）を水（10ml）に懸濁した。不透明な懸濁液にDIPEAを添加し（86μl；0.88mmol）、混合物を10分間撹拌した。その間に溶液は透明になった。pHを10まで測定した。次いで、N-ヒドロキシスクシンイミジル3-（1,3-ビス{2-（2-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセトアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]エトキシ）エトキシ}プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ）プロパノアート（93.0mg；53umol、実施例33）の水（2.0ml）溶液を添加した。反応混合物は透明なままであった。混合物を室温で40分間撹拌した。次いで、グリシンの溶液（3.0ml、濃度=10mg/ml）を添加した。混合物を室温で5分間撹拌した。混合物を、以下のとおりに調製用RP-HPLCによって精製した：総試料容量（15ml）をC18カラム（20×2cm）に注射して、25%〜55%の水-アセトニトリルの直線勾配を使用して10ml／分の流速で溶出し、10mlの画分を収集した。生成物を含む個々の画分をLC-MS（エレクトロスプレー（electorspray））およびHPLC（metodeA）を使用して解析した。純粋化合物を含む試料をプールして、24mlの総容積の試料を得て、λ=276nmでの相対吸収測定から0.25mg/mlの終濃度と決定された。試料を凍結して使用するまで-18℃にて貯蔵した。収率：5.8 mg（24%）。LC-MS （エレクトロスプレー）： （m/3）+1 = 1672； （m/4）+1 = 1254； （m/5）+1 = 1004； Rt = 3.25 min. HPLC （方法A）： Rt = 35.64分。
実施例57
Nε37-（（S）-2,6-ビス-（2-[2-（2-[2-（（S）-2,6-ビス-[2-（2-[2-（2-（2-（2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ）アセチルアミノ）エトキシ）エトキシ]エトキシ）アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ）エトキシ]エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ）ヘキサノイル）[Aib8,22,35,Lys37]GLP-1（7-37）アミドの調製
Nε37-（（S）-2,6-ビス-（2-[2-（2-[2-（（S）-2,6-ビス-[2-（2-[2-（2-（2-（2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ）アセチルアミノ）エトキシ）エトキシ]エトキシ）アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ）エトキシ]エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ）ヘキサノイル）[Aib8,22,35,Lys37]GLP-1（7-37）アミドの調製
1.a 保護されたペプチジル樹脂の合成。
Boc-His（Boc）-Aib-Glu（OtBu）-Gly-Thr（tBu）-Phe-Thr（tBu）-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Val-Ser（tBu）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Aib-Gln（Trt）-Ala-Ala-Lys（Boc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-Ala-Trp（Boc）-Leu-Val-Lys（Boc）-Aib-Arg（Pmc）-Lys（Dde）-Rink アミド樹脂は、HBTUを媒介したNMPカップリングおよびFmoc保護基の脱保護のUVモニタリングを使用する製造業者から供給されたFastMoc UVプロトコルを使用して、0.25mmolスケールでApplied Biosystems 433Aペピチド合成機でFmocストラテジーに従って調製した。カップリング効率を改善するために、Aib残基およびAibに続く残基を、カップリング試薬としてHBTUの代わりにHATUを使用してこれらの残基をカップリングさせた。合成のために使用した開始樹脂（438mg）は、0.57mmol/gの置換能力をもつ4-（2’,4’-ジメトキシフェニル-Fmoc-アミノメチル）-フェノキシ樹脂（Rinkアミド樹脂）（Merck Biosciences GmbH, Germany. cat. #: 01-12-0013）であった。使用した保護アミノ酸誘導体は、（2S）-6-[1-（4,4-ジメチル-2,6-ジオキソ-シクロヘキシリデン）-エチルアミノ]-2-（9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸（Fmoc-Lys（Dde）-OH）、Fmoc-Arg（Pmc）-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp（Boc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Gly-OHおよびBoc-His（Boc）-OHであった。収率は、1.37gの乾燥ペプチジル樹脂であった。
1.b ペプチジル樹脂の特徴づけ
樹脂は、14μl TIS、14μl H2Oおよび0.5ml TFAの混合物でこれを2時間処置することにより、粗製ペプチドを50mgのこの樹脂から切断することによって特徴づけた。濾過によって樹脂を除去し、粗製ペプチドを沈着によって単離して、Et2Oで洗浄した。HPLCおよびLC-MS解析を乾燥沈殿物に対して行った。
樹脂は、14μl TIS、14μl H2Oおよび0.5ml TFAの混合物でこれを2時間処置することにより、粗製ペプチドを50mgのこの樹脂から切断することによって特徴づけた。濾過によって樹脂を除去し、粗製ペプチドを沈着によって単離して、Et2Oで洗浄した。HPLCおよびLC-MS解析を乾燥沈殿物に対して行った。
解析結果：
1.c Ddeの脱保護
（1.a）から生じる保護されたペプチジル樹脂（1.35g、250μmol）をNMP：DCM 1：1（15ml）中で2回洗浄した。新たに調製した水和ヒドラジン2%のNMP（20ml）溶液を添加した。反応混合物を室温で12分間振盪し、次いで濾過した。ヒドラジン処置は、2回繰り返した。この後に、樹脂をNMP、DCMおよびNMPで十分に洗浄した。
（1.a）から生じる保護されたペプチジル樹脂（1.35g、250μmol）をNMP：DCM 1：1（15ml）中で2回洗浄した。新たに調製した水和ヒドラジン2%のNMP（20ml）溶液を添加した。反応混合物を室温で12分間振盪し、次いで濾過した。ヒドラジン処置は、2回繰り返した。この後に、樹脂をNMP、DCMおよびNMPで十分に洗浄した。
1.d 分枝重合体の付着
Dde脱保護した樹脂をNMP（20ml）に懸濁する。実施例39に記載したようにTSTUでプレ活性化した（S）-2,6-ビス-（2-[2-（2-[2-（（S）-2,6-ビス-[2-（2-[2-（2-（2-（2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ）アセチルアミノ）エトキシ）エトキシ]エトキシ）アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ）エトキシ]エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ）ヘキサン酸をDIPEAと共に添加し、懸濁液を一晩振盪した。次いで、樹脂を濾過によって単離し、NMP、DCM、2-プロパノール、メタノールおよびEt2Oで十分に洗浄し、真空中で乾燥させた。
Dde脱保護した樹脂をNMP（20ml）に懸濁する。実施例39に記載したようにTSTUでプレ活性化した（S）-2,6-ビス-（2-[2-（2-[2-（（S）-2,6-ビス-[2-（2-[2-（2-（2-（2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ）アセチルアミノ）エトキシ）エトキシ]エトキシ）アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ）エトキシ]エトキシ）エトキシ]アセチルアミノ）ヘキサン酸をDIPEAと共に添加し、懸濁液を一晩振盪した。次いで、樹脂を濾過によって単離し、NMP、DCM、2-プロパノール、メタノールおよびEt2Oで十分に洗浄し、真空中で乾燥させた。
1.e 生成物の切断
1.dからの樹脂を350μlのTIS、350μlのH2Oおよび14mlのTFAの混合物と共に室温にて3時間撹拌する。樹脂を濾過によって除去し、3mlのTFAで洗浄する。収集した濾液を真空中で5mlに濃縮し、粗生成物を40mlのEt2Oの添加によって沈殿させ、続いて遠心分離する。ペレットを40mlのEt2Oで2回洗浄し、次いで空気乾燥させる。
1.dからの樹脂を350μlのTIS、350μlのH2Oおよび14mlのTFAの混合物と共に室温にて3時間撹拌する。樹脂を濾過によって除去し、3mlのTFAで洗浄する。収集した濾液を真空中で5mlに濃縮し、粗生成物を40mlのEt2Oの添加によって沈殿させ、続いて遠心分離する。ペレットを40mlのEt2Oで2回洗浄し、次いで空気乾燥させる。
1.f 生成物の精製
粗製ペプチドをH2O／AcOH（40：4）（40ml）に溶解し、7μ C-18のシリカをパックした25mm×250mmカラムで2操作での準調整用HPLCによって精製する。カラムを、40〜62% CH3CNの0.1%のTFA／H2Oに対する勾配で10ml／分にて40℃の温度にて47分間溶出する。ペプチドを含む画分を収集し、3倍量のH2Oで希釈し、凍結乾燥する。得られた最終生成物をHPLCによって特徴づける。
粗製ペプチドをH2O／AcOH（40：4）（40ml）に溶解し、7μ C-18のシリカをパックした25mm×250mmカラムで2操作での準調整用HPLCによって精製する。カラムを、40〜62% CH3CNの0.1%のTFA／H2Oに対する勾配で10ml／分にて40℃の温度にて47分間溶出する。ペプチドを含む画分を収集し、3倍量のH2Oで希釈し、凍結乾燥する。得られた最終生成物をHPLCによって特徴づける。
本発明の化合物に以下を含む：
実施例58
N-イプシロン26,3-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]プロパノイル[Aib8,22,35]GLP-1（7-37）アミド
N-イプシロン26,3-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]プロパノイル[Aib8,22,35]GLP-1（7-37）アミド
Dde-Lys（Fmoc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-Ala-Trp（Boc）-Leu-Val-Arg（Pmc）-Aib-Arg（Pmc）-Gly-Rinkアミド樹脂は、HBTUを媒介したNMPカップリングおよびFmoc保護基の脱保護のUVモニタリングを使用する製造業者から供給されたFastMoc UVプロトコルを使用して、0.25mmolスケールでApplied Biosystems 433Aペプチド合成機でFmocストラテジーに従って調製した。末端Fmoc基を2% DBUのDMF（3×3分）溶液で処置することによって除去して、最初にFmoc-AEEAc-OHで、Fmoc脱保護後に3-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）酢酸でリジン側鎖でアシル化した。次いで、末端Dde-基を10% ヒドラジンのNMP溶液で除去した。ペプチドのN末端を、HBTUを媒介したNMPカップリングおよびFmoc保護基の脱保護のUVモニタリングを使用する配列製造業者が供給したFastMoc UVプロトコルを使用して、Boc-His（Boc）-Aib-Glu（OtBu）-Gly-Thr（tBu）-Phe-Thr（tBu）-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Val-Ser（tBu）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Aib-Gln（Trt）-Ala-Ala-配列で伸長した。ペプチドは、5% トリイソプロピルシランおよび5%水のTFA溶液を使用して、樹脂から（form）切断した。樹脂を濾過して、TFAで洗浄した。合わせた濾液を最小限の体積に減少させ、ペプチドを冷却ジエチルエーテルの添加によって沈殿させて、遠心分離によって単離した。沈殿物を、冷却ジエチルエーテルで2回（twice）洗浄した。粗製ペプチドをRP18-HPLCによって精製した。カラムを0.1%のTFA／H2Oに対して36〜60%のCH3CNの勾配で10ml／分で溶出した。ペプチドを含む画分を収集し、H2Oで希釈して、凍結乾燥させた。LC-MS（エレクトロスプレー）：（m/3）+1 = 1409.8； （m/4）+1 = 1057.0； （m/5）+1 = 846.2； Rt = 3.28 min. HPLC （Method A）： Rt = 29.08分。
実施例59
N-アルファ7-ホルミル,N-イプシロン26,3-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]プロパノイル[Arg34]GLP-1-（7-37）-OH
N-アルファ7-ホルミル,N-イプシロン26,3-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]プロパノイル[Arg34]GLP-1-（7-37）-OH
N-イプシロン26,3-[2-（1,3-ビス[2-（2-{2-[2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ）エトキシ]プロパン-2-イルオキシ）アセチルアミノ]プロパノイル[Arg34]GLP-1-（7-37）-OH（実施例55）を水（20ml）に溶解して、pHをトリエチルアミンで9に合わせた。無水酢酸およびギ酸の1：1混合物を調製して、トリエチルアミン添加でpHを9にて保持すると共に、5μlのこの溶液（3当量）を添加した。反応混合物を1時間撹拌し、次いで無水酢酸／ギ酸の1：1混合物をさらに5μl添加した。最終工程をもう1回繰り返し、次いで、混合物を室温で3時間撹拌した。次いで、生成物を実施例58に記載されているように精製し、9mgの表題物質を得た。LC-MS（エレクトロスプレー）：（m/3）+1 = 1370.7； （m/4）+1 = 1028.7； Rt = 3.25 min. HPLC （Method A）： Rt = 37.75分。
肺の生物学的利用能を測定するための方法
本プロトコルは、エアロゾルの経肺送達のための麻酔下ラットモデルの開発に使用した方法および材料を記述する。エアロゾルは、明確に定義された小滴／粒径（平均質量空気力学的直径、MMAD）をもつ噴霧器カテーテルを使用することによって発生する。噴霧器カテーテルは、微粉の調節がいらないエアロゾルを提供する押し出し成型多管腔カテーテルである。これは、1つの液体の内腔周辺で複数の（典型的には4〜6）気体内腔を取り込む。それぞれの内腔はカテーテルの長さに延び、遠位先端の小さな開口部をもつ微細な（〜0.5 mm直径）ノズルへと先が細くなる。先端の気体と液体との間の密接な接触により、調節することなく微細なエアロゾルを生じる。噴霧器カテーテルは、気管内チューブを通して導いてあり、主な気管支分枝のちょうど上に置かれる。エアロゾルは、制御装置により管理されたパルスで沈着される。
本プロトコルは、エアロゾルの経肺送達のための麻酔下ラットモデルの開発に使用した方法および材料を記述する。エアロゾルは、明確に定義された小滴／粒径（平均質量空気力学的直径、MMAD）をもつ噴霧器カテーテルを使用することによって発生する。噴霧器カテーテルは、微粉の調節がいらないエアロゾルを提供する押し出し成型多管腔カテーテルである。これは、1つの液体の内腔周辺で複数の（典型的には4〜6）気体内腔を取り込む。それぞれの内腔はカテーテルの長さに延び、遠位先端の小さな開口部をもつ微細な（〜0.5 mm直径）ノズルへと先が細くなる。先端の気体と液体との間の密接な接触により、調節することなく微細なエアロゾルを生じる。噴霧器カテーテルは、気管内チューブを通して導いてあり、主な気管支分枝のちょうど上に置かれる。エアロゾルは、制御装置により管理されたパルスで沈着される。
設備
肺送達のための設備は、Trudell Medical International （London, Ontario, Canada）から得られる。
肺送達のための設備は、Trudell Medical International （London, Ontario, Canada）から得られる。
噴霧器カテーテル
噴霧器カテーテル（Aeroprobe（登録商標））は、製造業者から多くの異なる配置および長さで供給されている。これらの種々のデザインにより、種々の異なる液体および流速に適応し、並びに5μm MMAD（平均質量空気力学的直径）程度であろう低いエアロゾル粒径を提供する。本実験では、以下の寸法をもつカテーテルが使用される：1.4L／分の外部内腔気体流量、0.7ml／分の内部内腔液体流量および50cmの長さで約7〜8μm（PN 104504-050）のMMAD（1）。
噴霧器カテーテル（Aeroprobe（登録商標））は、製造業者から多くの異なる配置および長さで供給されている。これらの種々のデザインにより、種々の異なる液体および流速に適応し、並びに5μm MMAD（平均質量空気力学的直径）程度であろう低いエアロゾル粒径を提供する。本実験では、以下の寸法をもつカテーテルが使用される：1.4L／分の外部内腔気体流量、0.7ml／分の内部内腔液体流量および50cmの長さで約7〜8μm（PN 104504-050）のMMAD（1）。
制御装置
LABNeb（登録商標）カテーテル制御システム（CCS）。エアロプローブカテーテルは、（2）に従って制御システムに結合されている。
LABNeb（登録商標）カテーテル制御システム（CCS）。エアロプローブカテーテルは、（2）に従って制御システムに結合されている。
100psiの圧力の空気を支持ガスおよび最大の液圧、通常98psiとして使用する。100μl注射器を貯蔵所として使用する。LABNeb CCSは、80ミリ秒のパルス時間および20ミリ秒のガス遅延を使用した。したがって、2.3mlの空気および0.93μl試液がそれぞれのパルスに送達される。
動物
250〜350gの間の重量のスプラーグドーリー雄ラット。動物は標準化した条件下で収容し、食物（Altromine 1324）および飲料水を自由に摂取させる。実験日に、動物にはこれらを供給した状態で使用する。
250〜350gの間の重量のスプラーグドーリー雄ラット。動物は標準化した条件下で収容し、食物（Altromine 1324）および飲料水を自由に摂取させる。実験日に、動物にはこれらを供給した状態で使用する。
麻酔のための溶液
Hypnorm（登録商標）（0.2mg/mlフェンタニル、フルアンソール（fluansol）10mg/ml）を滅菌水1+1で希釈する。
Hypnorm（登録商標）（0.2mg/mlフェンタニル、フルアンソール（fluansol）10mg/ml）を滅菌水1+1で希釈する。
Dormicum（登録商標）（ミダゾラム5mg/ml）を滅菌水1+1で希釈する。2つの溶液を混合した1+1。
外科的手技および気管内投与
調製したHyponorm／Dormicum溶液0.25ml/100g BWを皮下注射することによって麻酔を誘導する。気管内チューブ（PE 240、Becton Dickinson）を挿入して、2つの主気管支の枝分れより約1/2cm上の位置に導く。熱損失をラットの周りをプラスチックシールドで包むことによって最小にした。
調製したHyponorm／Dormicum溶液0.25ml/100g BWを皮下注射することによって麻酔を誘導する。気管内チューブ（PE 240、Becton Dickinson）を挿入して、2つの主気管支の枝分れより約1/2cm上の位置に導く。熱損失をラットの周りをプラスチックシールドで包むことによって最小にした。
肺に試液を適用する前に、注射器およびカテーテル系に気泡がないことを確認する。気管内に試液を適用する前に、バイアルに吹き付けて、その後にカテーテルによって投与される物質量を試験する。次いで、カテーテルを、気管内チューブを通して導いて、チューブ端部に1〜2mmカテーテル先端部がないままにし、試液を麻酔したラットの肺内でエアロゾル化する。
静注または皮下投与後のGLP-1誘導体の遷延
本発明の多くのGLP-1誘導体の遷延は、下に記述した方法を使用して健康なブタに対するsc投与後の血漿中のこれらの濃度をモニターすることによって決定した。また、比較のために、sc投与後のGLP-1（7-37）の血漿中濃度でも行った。本発明のその他のGLP-1誘導体の遷延も同様に決定することができる。
本発明の多くのGLP-1誘導体の遷延は、下に記述した方法を使用して健康なブタに対するsc投与後の血漿中のこれらの濃度をモニターすることによって決定した。また、比較のために、sc投与後のGLP-1（7-37）の血漿中濃度でも行った。本発明のその他のGLP-1誘導体の遷延も同様に決定することができる。
ミニブタにおけるGLP-1類似体の薬物動態学的試験
試験物質を皮下または静脈内投与のため適した媒体に溶解した。投薬体積は、およそ1mlであるように濃度を調整した。
試験物質を皮下または静脈内投与のため適した媒体に溶解した。投薬体積は、およそ1mlであるように濃度を調整した。
研究は、Ellegaard Gottingen Minipigs ApSからの雄12匹のGottingenミニブタで行った。動物が研究に入る前に、およそ10日の順化期間とした。順化期間の開始時に、ミニブタは、約5月齢および8〜10kgの重量範囲であった。
研究は、21〜23℃にセットした室温で、かつ50%≧相対湿度にて、適切な動物部屋で行った。部屋を照射し、12時間の明かり、および12時間の暗闇のサイクルを与えた。明かりは、06.00〜18.00時間であった。
動物を、寝具としてわらと共に檻に、それぞれの檻に6匹一緒に収容した。
動物は、研究の間、国内品質飲料水を自由に摂取させたが、投薬の前日およそ午後4時から投薬後およそ12時間まで絶食させた。
動物は、到着時に、および投薬日に計量した。
動物には、経静脈または皮下注射を一回受けさせた。皮下注射は、頚部の右面（耳からおよそ5〜7cmおよび頚部の中央から7〜9cm）に与えらた。注射は、0.5cmの針を導入することができる針のストッパーと共に施した。
それぞれの試験物質を3匹の動物に与えた。それぞれの動物には、2nmol/kgの体重の用量を受けさせた。
6匹の動物には、1週当たり投薬し、残りの6匹は、休ませた。
全血漿濃度-時間プロフィールをそれぞれの動物から得た。血液試料は、以下のスケジュールに従って収集した：
静脈内投与後：
プレ用量（0）、注射の0.17（10分）、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96および120時間後。
静脈内投与後：
プレ用量（0）、注射の0.17（10分）、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96および120時間後。
皮下投与後：
プレ用量（0）、注射の0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96および120時間後。
プレ用量（0）、注射の0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96および120時間後。
それぞれのサンプリング時にて、2mlの血液をそれぞれの動物から抜いた。血液試料は、頚静脈から採取した。
血液試料は、GLP-1類似体の酵素的分解を防止するための安定化のための緩衝液を含む試験管に収集した。
血漿は、直ちにMicronic-チューブに移した。およそ200μlの血漿は、それぞれのMicronicチューブに移した。血漿は、アッセイするまで-20℃にて貯蔵した。血漿試料は、免疫アッセイ法を使用してGLP-1類似体の含量をアッセイした。
血漿濃度-時間プロフィールは、比較できない薬物動態学的解析によって解析した。以下の薬物動態学的パラメーターをそれぞれの場合に算出した：AUC、AUC／用量、AUC%Extrap、Cmax、tmax、λz、t1/2、CL、CL／f、Vz、Vz／fおよびMRT。
本発明の選択化合物、デンマーク在来種ブタにおいて試験した。
ブタにおけるGLP-1類似体の薬物動態学的試験
ブタ（50% デュロック、25% ヨークシャー、25% デンマーク在来種、およそ40kg）は、実験の最初から絶食させた。それぞれのブタに対して、1kg体重あたり0.5nmolの試験化合物を50μM等張液（5mMリン酸塩、pH 7.4、0.02% Tween（登録商標）-20（Merck）、45mg/ml マンニトール（発熱物質なし、Novo Nordisk）中に投与した。血液試料は、頚静脈内のカテーテルから抜いた。5mlの血液試料を175μlの以下の溶液を含む冷却ガラスに注いだ：0.18 M EDTA、15000 KIE／ml アプロチニン（Novo Nordis）および0.30mMバリン-ピロリジド（Novo Nordis）、pH 7.4。30分以内に、試料を5〜6000×gにて10分間遠心した。温度は、4℃に保持した。上清を異なるガラス内にピペットで移して、使用するまでマイナス20℃にて保持した。
ブタ（50% デュロック、25% ヨークシャー、25% デンマーク在来種、およそ40kg）は、実験の最初から絶食させた。それぞれのブタに対して、1kg体重あたり0.5nmolの試験化合物を50μM等張液（5mMリン酸塩、pH 7.4、0.02% Tween（登録商標）-20（Merck）、45mg/ml マンニトール（発熱物質なし、Novo Nordisk）中に投与した。血液試料は、頚静脈内のカテーテルから抜いた。5mlの血液試料を175μlの以下の溶液を含む冷却ガラスに注いだ：0.18 M EDTA、15000 KIE／ml アプロチニン（Novo Nordis）および0.30mMバリン-ピロリジド（Novo Nordis）、pH 7.4。30分以内に、試料を5〜6000×gにて10分間遠心した。温度は、4℃に保持した。上清を異なるガラス内にピペットで移して、使用するまでマイナス20℃にて保持した。
ペプチドの血漿濃度は、サンドイッチELISAで、または異なるモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用するRIAによって決定した。抗体の選択は、GLP-1誘導体に依存する。血漿中のピーク濃度が達成される時間は、選択される特定のGLP-1誘導体に応じて、広範な限度内で変化する。
96ウェルマイクロタイタープレートにおけるサンドイッチELISAのための一般的アッセイプロトコル
コーティング緩衝液（PBS）：リン酸緩衝食塩水、pH7.2
洗浄液-緩衝液（PBS-洗浄液）：リン酸緩衝食塩水、0.05% v/v Tween 20、pH 7.2
アッセイ緩衝液（BSA-緩衝液）：リン酸緩衝食塩水、10g/l ボービン血清アルブミン（Fluka 05477）、0.05% v/v Tween 20、pH 7.2
ストレプトアビジン-緩衝液：リン酸緩衝食塩水、0.5M NaCl、0.05% v/v Tween 20、pH 7.2
標準：血漿-マトリックス中の個々の化合物
A-TNP：ナンセンス抗体
AMDEX：ストレプトアビジン-西洋わさび-ペルオキシダーゼ（Amersham RPN4401V）
TMB基質：3,3',5,5'テトラメチルベンジリジン（＜0.02%）過酸化水素
アッセイ法は、以下のとおりに（容積/ウェル）行った：
1.）100μlのキャッチング抗体5μg/mlのPBS緩衝液溶液でコートする
→o/n、4℃でインキュベート
→5×PBS-洗浄→最後の洗浄で、最小で30分遮断した
→次いでプレートを空にする
2.）20μl試料 + 100μlビオチン化された検出抗体1μg/mlの10μg/ml A-TNPを含むBSA緩衝液溶液
→2時間、室温、シェーカー上でインキュベート→5×PBS洗浄、次いでプレートを空にする
3.）100μl AMDEXストレプトアビジン緩衝液中に1：8000
→シェーカ上で45〜60分、室温にてインキュベート
→5×PBS洗浄、次いでプレートを空にする
4.）100μl TMB-基質
→シェーカー上で室温にてx分インキュベート
→100μl 4M H3PO4で反応を止める
参照として620nmで、450nmにて吸光度を読み込む
試料の濃度は標準曲線から算出した。
コーティング緩衝液（PBS）：リン酸緩衝食塩水、pH7.2
洗浄液-緩衝液（PBS-洗浄液）：リン酸緩衝食塩水、0.05% v/v Tween 20、pH 7.2
アッセイ緩衝液（BSA-緩衝液）：リン酸緩衝食塩水、10g/l ボービン血清アルブミン（Fluka 05477）、0.05% v/v Tween 20、pH 7.2
ストレプトアビジン-緩衝液：リン酸緩衝食塩水、0.5M NaCl、0.05% v/v Tween 20、pH 7.2
標準：血漿-マトリックス中の個々の化合物
A-TNP：ナンセンス抗体
AMDEX：ストレプトアビジン-西洋わさび-ペルオキシダーゼ（Amersham RPN4401V）
TMB基質：3,3',5,5'テトラメチルベンジリジン（＜0.02%）過酸化水素
アッセイ法は、以下のとおりに（容積/ウェル）行った：
1.）100μlのキャッチング抗体5μg/mlのPBS緩衝液溶液でコートする
→o/n、4℃でインキュベート
→5×PBS-洗浄→最後の洗浄で、最小で30分遮断した
→次いでプレートを空にする
2.）20μl試料 + 100μlビオチン化された検出抗体1μg/mlの10μg/ml A-TNPを含むBSA緩衝液溶液
→2時間、室温、シェーカー上でインキュベート→5×PBS洗浄、次いでプレートを空にする
3.）100μl AMDEXストレプトアビジン緩衝液中に1：8000
→シェーカ上で45〜60分、室温にてインキュベート
→5×PBS洗浄、次いでプレートを空にする
4.）100μl TMB-基質
→シェーカー上で室温にてx分インキュベート
→100μl 4M H3PO4で反応を止める
参照として620nmで、450nmにて吸光度を読み込む
試料の濃度は標準曲線から算出した。
RIAのための一般的アッセイプロトコル
DB-緩衝液：80mM リン酸緩衝液、0.1% ヒト血清アルブミン、10mM EDTA、0.6mM チオメルサール、pH 7.5
FAM-緩衝液：40mM リン酸緩衝液、0.1% ヒト血清アルブミン、0.6 mMチオメルサール、pH 7.5
木炭：40mM リン酸緩衝液、0.6mM チオメルサール、16.7% ウシ血漿、15g/l 活性炭、pH 7.5（4℃にて使用前に最小1時間懸濁液を混合する）
標準：血漿-マトリックス中の個々の化合物
アッセイ法は、以下のとおりにミニソープ（minisorp）チューブ12×75mm（容積/チューブ）内で行った：
DB-緩衝液：80mM リン酸緩衝液、0.1% ヒト血清アルブミン、10mM EDTA、0.6mM チオメルサール、pH 7.5
FAM-緩衝液：40mM リン酸緩衝液、0.1% ヒト血清アルブミン、0.6 mMチオメルサール、pH 7.5
木炭：40mM リン酸緩衝液、0.6mM チオメルサール、16.7% ウシ血漿、15g/l 活性炭、pH 7.5（4℃にて使用前に最小1時間懸濁液を混合する）
標準：血漿-マトリックス中の個々の化合物
アッセイ法は、以下のとおりにミニソープ（minisorp）チューブ12×75mm（容積/チューブ）内で行った：
混合−4℃にて30分インキュベート−3000rpmにて30分遠心−直後に上清を新たなチューブに移動、ストッパーを閉じ、1分間γ-カウンターでカウント。試料の濃度は、個々の標準曲線から算出した。
GLP-1放射性受容体アッセイ法（RRA）：
本方法は、LEADseekerイメージング粒子を使用する放射測定リガンド結合アッセイ法である。本アッセイ法は、GLP-1受容体、非標識GLP-1類似体、125Iで標識したヒトGLP-1およびコムギ胚芽凝集素（WGA）でコーティングされたPS LEADseeker粒子を含む膜断片で構成される。冷却し、125Iの標識したGLP-1を受容体に対する結合について競合させる。LEADseeker粒子を添加すると、これらはWGA残基を経て膜断片上の炭水化物残基と結合する。125I-分子とLEADseeker粒子との間の近接により粒子から発光を生じる。LEADseekerにより、放射した光をイージして、これが可逆的に試料に存在するGLP-1類似体の量に相関する。
本方法は、LEADseekerイメージング粒子を使用する放射測定リガンド結合アッセイ法である。本アッセイ法は、GLP-1受容体、非標識GLP-1類似体、125Iで標識したヒトGLP-1およびコムギ胚芽凝集素（WGA）でコーティングされたPS LEADseeker粒子を含む膜断片で構成される。冷却し、125Iの標識したGLP-1を受容体に対する結合について競合させる。LEADseeker粒子を添加すると、これらはWGA残基を経て膜断片上の炭水化物残基と結合する。125I-分子とLEADseeker粒子との間の近接により粒子から発光を生じる。LEADseekerにより、放射した光をイージして、これが可逆的に試料に存在するGLP-1類似体の量に相関する。
試薬および材料：
動物血漿の事前処置：動物血漿は、56℃にて4時間熱処置し、10分間10.000rpmにて遠心した。その後、Val-Pyr（10μM）およびアプロテニン（500 KIE/ml）を添加して、使用まで＜-18℃にて貯蔵した。
動物血漿の事前処置：動物血漿は、56℃にて4時間熱処置し、10分間10.000rpmにて遠心した。その後、Val-Pyr（10μM）およびアプロテニン（500 KIE/ml）を添加して、使用まで＜-18℃にて貯蔵した。
GLP-1類似体キャリブレーター：GLP-1類似体は、熱処理血漿内でスパイクし、およそ1μM〜1pMの範囲で段階希釈を行った。
GLP-1 RRAアッセイ緩衝液：25mM Na-HEPES（pH=7.5）、2.5mM CaCl2、1mM MgCL2、50mM NaCl、0.1% 卵白アルブミン、0.003% Tween20、0.005% バシトラシン、0.05% NaN3。
GLP-1受容体懸濁液：GLP-1受容体膜断片は、ヒト膵臓のGLP-1受容体を発現するベビーハムスター腎臓（BHK）細胞から精製した。使用まで＜-80℃で貯蔵した。
WGA結合したポリスチレンLEADseekerイメージングビーズ（RPNQ0260、Amersham）：ビーズは、GLP-1 RRAアッセイ緩衝液で13.3mg/mLの濃度に再構成した。次いで、GLP-1受容体膜懸濁液を添加して、使用前に少なくとも1時間全体を冷却（2〜8℃）してインキュベートした。
[125I]-GLP-1（7-36）アミド（Novo Nordisk A/S）。使用まで＜-80℃で貯蔵した。
99.9% volエタノール（De Dansk Spritfabrikker A/S）：使用まで＜-80℃で貯蔵した。
MultiScreen（登録商標）Solvinert 0.45μM疎水性PTFEプレート（MSRPN0450、Millipore Corp.）
ポリプロピレンプレート（cat. no. 650201、Greiner Bio-One）
白いポリスチレン384-ウェルプレート（cat. no. 781075、Greiner Bio-One）
装置：
水平プレートミキサー
標準的スイング-バケットマイクロタイタプレートロータアセンブリーを備えた遠心器
UltraVap−Drydown試料濃縮器（Porvair）
LEADseeker（商標）多様式イメージングシステム（Amersham）
アッセイ手順：
試料調製：
濾液を収集するために、化学物質比較可能なレシーバープレート（すなわちポリプロピレンプレート）上にMultiScreen（登録商標）Solvinertフィルタープレートを載置する。
ポリプロピレンプレート（cat. no. 650201、Greiner Bio-One）
白いポリスチレン384-ウェルプレート（cat. no. 781075、Greiner Bio-One）
装置：
水平プレートミキサー
標準的スイング-バケットマイクロタイタプレートロータアセンブリーを備えた遠心器
UltraVap−Drydown試料濃縮器（Porvair）
LEADseeker（商標）多様式イメージングシステム（Amersham）
アッセイ手順：
試料調製：
濾液を収集するために、化学物質比較可能なレシーバープレート（すなわちポリプロピレンプレート）上にMultiScreen（登録商標）Solvinertフィルタープレートを載置する。
150μLの氷冷エタノール99.9%をMultiScreen（登録商標）Solvientフィルタープレートの空のウェルに添加し、続いて50μLのキャリブレーターまたは血漿試料を添加する。フィルタープレート上に貯蔵蓋を配置する。水平プレートミキサー上で18〜22℃にて15分インキュベートする。
標準的スイング-バケットマイクロタイタプレートロータアセンブリー内に、構築したフィルターおよびレシーバープレートを蓋と共に置く。次いで、レシーバープレートの空のウェルに、濾液を2分間1500rpmにて収集する。
加熱した（40℃）N2でUltraVapを使用することにより15分間濾液を乾燥させる。
それぞれのウェルに100μL GLP-1 RRAアッセイ緩衝液を添加することによって、乾燥材料を再構成する。
水平ミキサー上で5分間インキュベートする。
GLP-1放射性受容体アッセイ法：
以下のピペッティングスキームおよび白いポリスチレン384-ウェルプレートを使用する：
・35μL GLP-1 RRAアッセイ緩衝液
・5μL 再構成した濾液
・10μL [125I]-GLP-1（7-36）アミド。保存液は、使用前にGLP-1 RRAアッセイ緩衝液で20.000cpm／ウェルに希釈した。
以下のピペッティングスキームおよび白いポリスチレン384-ウェルプレートを使用する：
・35μL GLP-1 RRAアッセイ緩衝液
・5μL 再構成した濾液
・10μL [125I]-GLP-1（7-36）アミド。保存液は、使用前にGLP-1 RRAアッセイ緩衝液で20.000cpm／ウェルに希釈した。
・WGA-ポリスチレンLEADseekerイメージングビーズ（0.2mg／ウェル）にプレコーティングした15μL GLP-1受容体膜断片（0.5μg／ウェル）。
プレートを塞ぎ、18〜22℃にて一晩インキュベートする。
それぞれのウェルからの発光を、LEADseeker（商標）多様式イメージングシステムを使用することによって10分間検出する。
クローン化したヒトGLP-1受容体を発現する株化細胞におけるcAMP形成の刺激
ヒトGLP-1受容体を発現する安定にトランスフェクトした株化細胞、BHK467-12A（tk-ts13）から精製した原形質膜をGLP-1およびペプチド類似体で刺激して、cAMP産生能力を、Perkin Elmer Life SciencesからのAlphaScreen（商標） cAMPアッセイキットを使用して測定した。
ヒトGLP-1受容体を発現する安定にトランスフェクトした株化細胞、BHK467-12A（tk-ts13）から精製した原形質膜をGLP-1およびペプチド類似体で刺激して、cAMP産生能力を、Perkin Elmer Life SciencesからのAlphaScreen（商標） cAMPアッセイキットを使用して測定した。
安定にトランスフェクトした株化細胞は、NNにて調製して、高発現するクローンをスクリーニングのために選択した。細胞は、5% CO2にてDMEM、5% FCS、1% Pen／Strepおよび0.5mg/ml G418中で培養した。
ほぼ80%集密の細胞をPBSで2×洗浄して、ベルセンで収集し、1000rpmにて5分遠心し、上清を除去した。さらなる工程の全ては、氷上で行った。細胞ペレットを10ml 緩衝液1（20mM Na-HEPES、10mM EDTA、pH=7.4）中で20〜30秒間Ultrathuraxによってホモジナイズし、20.000rpmにて15分遠心、ペレットを10ml 緩衝液2（20mM Na-HEPES、0.1mM EDTA、pH=7.4）に再懸濁した。懸濁液を20〜30秒間ホモジナイズして、20.000rpmにて15分遠心した。緩衝液2に懸濁し、ホモジナイゼーションおよび遠心分離を一度繰り返して、膜を緩衝液2に再懸濁し、さらなる解析のために用意するか、または-80℃にて貯蔵した。機能的受容体アッセイ法は、AlphaScreen技術によってペプチドで誘導されるcAMP産生を測定することによって行った。AlphaScreen技術の基本原理は、内因性cAMPと外因性の添加したビオチン-cAMPとの間の競合である。cAMPの捕獲は、アクセプタービーズに抱合された特異的抗体を使用することにより達成する。形成したcAMPを計数して、AlphaFusionマイクロプレートアナライザーにて測定した。EC50値は、Graph-Pad Prismeソフトウェアを使用して算出した。
Claims (33)
- インスリン分泌性薬剤に共有結合した構造的に明確に定義された分枝重合体を含む抱合体。
- 一般式Iによって表される請求項1に記載の抱合体：
ITA-L4-（L3）m-Y1（Y2（Y3（Y4（Y5（Y6）r）q）p）s）n （I）
式中、ITAは、水素がインスリン分泌性（insolinotropic））薬剤に存在するα-アミノ基から、またはインスリン分泌性（insolinotropic）薬剤のいずれかの位置のリジンに存在するεアミノ基から除去されたインスリン分泌性薬剤を表し、
二分枝の化合物の第一世代について、
Y1は、Ybであり；Y2は、Zであり；r、q、pおよびsは、全てゼロであり；並びにnは、2であり；
二分枝の化合物の第二世代について、
Y1およびY2は、Ybであり；Y3は、Zであり；r、qおよびpは、全てゼロであり；sは、4であり；並びにnは、2であり；
二分枝の化合物の第三世代について、
Y1、Y2およびY3は、全てYbであり；Y4は、Zであり；rおよびqは、ゼロであり；pは、8であり；sは、4であり；並びにnは、2であり；
二分枝の化合物の第四世代について、
Y1、Y2、Y3およびY4は、全てYbであり；Y5は、Zであり；rは、ゼロであり；qは、16であり；pは、8であり；sは、4であり；並びにnは、2であり；
並びに二分枝の化合物の第五世代について、
Y1、Y2、Y3、Y4およびY5は、全てYbであり；Y6は、Zであり；rは、32であり；qは、16であり、pは、8であり；sは、4であり；並びにnは、2であり；
式中、
Y1は、Ytであり；Y2は、Zであり；r、q、pおよびsは、全てゼロであり；並びにnは、3であり；
三分枝の化合物の第二世代について、
Y1およびY2は、Ytであり；Y3は、Zであり；r、qおよびpは、全てゼロであり；sは、9であり；並びにnは、3であり；
三分枝の化合物の第三世代について、
Y1、Y2およびY3は、全てYtであり；Y4は、Zであり；rおよびqは、ゼロであり；pは、27であり；sは、9であり；並びにnは、3であり；
並びに三分枝の化合物の第四世代について、
Y1、Y2、Y3およびY4は、全てYtであり；Y5は、Zであり；rは、ゼロであり；qは、81であり；pは、27であり；sは、9であり；並びにnは、3であり；
式中、
およびBは、-NH-または-O-であり；
ただし、Bが-NH-であるときは、Aは、-CO-または-C（O）O-であり、かつBが-O-であるときは、Aは、-P（=O）（OR）-または、-P（=S）（OR）-であることを条件とし；
並びに式中前記1つの単量体層（世代）の基B（Y1、Y2およびY3によって例証される）は、式中Yが接尾辞として後ろに数を有する（それぞれ、Y2、Y3およびY4によって例証される）隣接した次の層の前記基Aに結合されているか、またはZに結合されており；
X3は、窒素原子、アルカントリイル、アレーントリイル、アルカントリオキシ、式-CO-N＜のアミノカルボニル部分、式-CH2CO-N＜のアセトアミド部分または式
（式中、Qは、アルカントリイルである）；
X4は、アルカンテトライルまたはアレーンテトライルであり；
L1は、原子価結合、オキシ、アルキレン、アルキレンオキシアルキル、ポリアルコキシジイル、（ポリアルコキシ）アルキルカルボニル、オキシアルキルまたは（ポリアルコキシ）アルキルであり；
L2は、原子価結合、オキシ、アルキレン、アルキレンオキシアルキル、ポリアルコキシジイル、（ポリアルコキシ）アルキルカルボニル、オキシアルキル、または（ポリアルコキシ）であり；
L3は、原子価結合、アルキレン、オキシ、ポリアルコキシジイル、オキシアルキル、アルキルアミノ、カルボニルアルキルアミノ、アルキルアミノカルボニルアルキルアミノ、カルボニルアルキルカルボニルアミノ（ポリアルコキシ）アルキルアミノ、カルボニルアルコキシアルキルカルボニルアミノ（ポリアルコキシ）アルキルアミノ、アルキルカルボニルアミノ（ポリアルコキシ）アルキルアミノ、カルボニル（ポリアルコキシ）アルキルアミノまたはカルボニルアルコキシアルキルアミノを表し；
mは、0、1、2または3であり；
L4は、原子価結合および式-CO-L5-CH=N-O-の部分の中で選択され、式中、L5は、原子価結合、アルキレンまたはアリーレンであり、
Zは、水素、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、ポリアルコキシ、オキシアルキル、アシル、ポリアルコキシアルキルまたはポリアルコキシアルキルカルボニルである。 - Y1がYb（すなわち二分枝の化合物）である、請求項2に記載の抱合体。
- X3が以下の6つの式のうちの1つの分枝の三価の有機ラジカルである、請求項2または3に記載の抱合体：
- Y1がYt（すなわち三分枝の化合物）である、請求項2〜4のいずれか1項に記載の抱合体。
- X4がベンゼン-1,3,4,5-テトライルである、請求項2〜5のいずれか1項に記載の抱合体。
- 請求項2〜6のいずれか1項に記載の抱合体であって、L1は、原子価結合、オキシ（-O-）、オキシメチル（-OCH2-）または一般式-CH2（OCH2CH2）n’’-OCH2C（O）-の部分であり、式中、n’’は、0〜10の整数である抱合体。
- 請求項2〜7のいずれか1項に記載の抱合体であって、L2は、式（-CH2CH2O-）2の部分であり、また式：
- 請求項2〜8のいずれか1項に記載の抱合体であって、L3は、原子価結合または例えば以下の6つの式によって例証された二価の連結基である抱合体：
- 請求項2〜9のいずれか1項に記載の抱合体であって、L4および隣接したL3は、例えば以下の8つの式によって例証された二価の連結基である抱合体：
- 請求項2〜10のいずれか1項に記載の抱合体であって、L4は、両方の異性体形態（synおよびanti）のオキシイミノアルキルカルボニル部分、両方の異性体形態（synおよびanti）のオキシイミノアルキルアリールカルボニル部分または原子価結合である抱合体。
- 請求項2〜11のいずれか1項に記載の抱合体であって、Zは、末端アミノ基またはヒドロキシ基と反応することができるキャッピング剤、好ましくは以下の3つの式のうちの1つを有する基である抱合体：
- Aが3つの部分：-CO-、-P（O）O-および-P（S）O-のうちの1つである、請求項2〜12のいずれか1項に記載の抱合体。
- Bがオキシまたは部分-NH-である、請求項2〜13のいずれか1項に記載の抱合体。
- インスリン分泌性薬剤がGLP-1ペプチドまたはエキセンジン-4ペプチドである、請求項1〜14のいずれか1項に記載の抱合体。
- 前記インスリン分泌性薬剤（ITA）がDPPIV保護されたペプチドである、請求項1〜15のいずれか1項に記載の抱合体。
- 前記インスリン分泌性薬剤（ITA）が、本明細書に開示した機能的受容体アッセイ法によって決定すると1nM未満のEC50を有する、請求項1〜16のいずれか1項に記載の抱合体。
- 前記インスリン分泌性薬剤（ITA）が、本明細書に開示した機能的受容体アッセイ法によって決定すると300pM未満、200pM未満または100pM未満のEC50を有する、請求項1〜17のいずれか1項に記載の抱合体。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載の抱合体であって、前記インスリン分泌性薬剤（ITA）が、式（II）のアミノ酸配列を含むペプチドから選択され：
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46
式（II）（配列番号3）
式中、Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニンまたは4-ピリジルアラニンであり；
Xaa8は、Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、（1-アミノシクロプロピル）カルボン酸、（1-アミノシクロブチル）カルボン酸、（1-アミノシクロペンチル）カルボン酸、（1-アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（1-アミノシクロヘプチル）カルボン酸または（1-アミノシクロオクチル）カルボン酸であり；
Xaa16は、ValまたはLeuであり；
Xaa18は、Ser、LysまたはArgであり；
Xaa19は、TyrまたはGlnであり；
Xaa20は、LeuまたはMetであり；
Xaa22は、Gly、GluまたはAibであり；
Xaa23は、Gln、Glu、LysまたはArgであり；
Xaa25は、AlaまたはValであり；
Xaa26は、Lys、GluまたはArgであり；
Xaa27は、GluまたはLeuであり；
Xaa30は、Ala、GluまたはArgであり；
Xaa33は、ValまたはLysであり；
Xaa34は、Lys、Glu、AsnまたはArgであり；
Xaa35は、GlyまたはAibであり；
Xaa36は、Arg、GlyまたはLysであり；
Xaa37は、Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、アミドであるか、または存在せず；
Xaa38は、Lys、Ser、アミドであるか、または不在である。
Xaa39は、Ser、Lys、アミドであるか、または存在せず；
Xaa40は、Gly、アミドであるか、または存在せず；
Xaa41は、Ala、アミドであるか、または存在せず；
Xaa42は、Pro、アミドであるか、または存在せず；
Xaa43は、Pro、アミドであるか、または存在せず；
Xaa44は、Pro、アミドであるか、または存在せず；
Xaa45は、Ser、アミドであるか、または存在せず；
Xaa46は、アミドであるか、または存在せず；
ただし、Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45またはXaa46が存在しない場合は、下流のそれぞれのアミノ酸残基も存在しないことを条件とする抱合体。 - 請求項19に記載の抱合体であって、前記インスリン分泌性薬剤（ITA）が、式（III）のアミノ酸配列を含むペプチドであり：
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38
式（III）（配列番号4）
式中、Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニンまたは4-ピリジルアラニンであり；
Xaa8は、Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、（1-アミノシクロプロピル）カルボン酸、（1-アミノシクロブチル）カルボン酸、（1-アミノシクロペンチル）カルボン酸、（1-アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（1-アミノシクロヘプチル）カルボン酸または（1-アミノシクロオクチル）カルボン酸であり；
Xaa18は、Ser、LysまたはArgであり；
Xaa22は、Gly、GluまたはAibであり；
Xaa23は、Gln、Glu、LysまたはArgであり；
Xaa26は、Lys、GluまたはArgであり；
Xaa30は、Ala、GluまたはArgであり；
Xaa34は、Lys、GluまたはArgであり；
Xaa35は、GlyまたはAibであり；
Xaa36は、ArgまたはLysであり；
Xaa37は、Gly、Ala、GluまたはLysであり；
Xaa38は、Lys、アミドであるか、または存在しない、
抱合体。 - 前記インスリン分泌性薬剤（ITA）が、GLP-1（7-35）、GLP-1（7-36）、GLP-1（7-36）-アミド、GLP-1（7-37）、GLP-1（7-38）、GLP-1（7-39）、GLP-1（7-40）、GLP-1（7-41）またはこれらの類似体から選択される、請求項1〜20のいずれか1項に記載の抱合体。
- 前記インスリン分泌性薬剤（ITA）が、GLP-1（7-37）（配列番号1）と比較して交換され、付加され、もしくは欠失された15アミノ酸以下の残基、またはGLP-1（7-37）（配列番号1）と比較して交換され、付加され、もしくは欠失された10アミノ酸以下の残基を含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の抱合体。
- 前記インスリン分泌性薬剤（ITA）が、GLP-1（7-37）（配列番号1）と比較して交換され、付加され、または欠失された6アミノ酸以下の残基を含む、請求項1〜22のいずれか1項に記載の抱合体。
- 前記インスリン分泌性（ITA）薬剤が、遺伝暗号によってコードされない4アミノ酸以下の残基だけを含む、請求項1〜23のいずれか1項に記載の抱合体。
- 前記インスリン分泌性薬剤（ITA）が、N末端からの2番目のアミノ酸残基としてAib残基を含む、請求項1〜24のいずれか1項に記載の抱合体。
- 前記インスリン分泌性薬剤（ITA）のN末端アミノ酸残基（式IIおよびIIIの位置7）が、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニンおよび4-ピリジルアラニンからなる群より選択される、請求項1〜25のいずれか1項に記載の抱合体。
- 前記インスリン分泌性薬剤（ITA）が、[Arg34]GLP-1（7-37）、[Arg26,34]GLP-1（7-37）Lys、[Lys36Arg26,34]GLP-1（7-36）、[Aib8,22,35]GLP-1（7-37）、[Aib8,35]GLP-1（7-37）、[Aib8,22]GLP-1（7-37）、[Aib8,22,35 Arg26,34]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,35 Arg26,34]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22 Arg26,34]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22,35 Arg26,34]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,35 Arg26,34]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22,35 Arg26]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,35 Arg26]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22 Arg26]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22,35 Arg34]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,35Arg34]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22Arg34]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22,35Ala37]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,35Ala37]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22Ala37]GLP-1（7-37）Lys、[Aib8,22,35 Lys37]GLP-1（7-37）、[Aib8,35Lys37]GLP-1（7-37）、[Aib8,22Lys37]GLP-1（7-37）またはC末端がアミド化されたこれらの誘導体、エキセンジン-4（1-39）、ZP-10、すなわち[Ser38Lys39]エキセンジン-4（1-39）LysLysLysLysLys-アミド（配列番号5）からなる群より選択される、請求項1〜26のいずれか1項に記載の抱合体。
- 前記インスリン分泌性薬剤（ITA）が、カルボキシル基、アミノ基、ケト基、ヒドロキシル基、チオール基またはヒドラジド基を経て請求項1〜27のいずれか1項に記載の分枝重合体に付着されている、請求項1〜27のいずれか1項に記載の抱合体。
- 前記化合物が、本明細書に開示した機能的受容体アッセイ法によって決定すると1000pM未満、500pM未満、300pM未満、200pM未満、100pM未満、50pM未満または10pM未満のEC50を有する、請求項1〜28のいずれか1項に記載の抱合体。
- 請求項1〜29のいずれか1項に記載の化合物と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
- 高血糖、2型糖尿病、グルコース寛容減損、1型糖尿病、肥満症、高血圧症、エックス症候群、異脂肪血症、認知障害、アテローム性動脈硬化症（atheroschlerosis）、心筋梗塞、冠状動脈性心疾患およびその他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸症候群、消化不良、並びに胃潰瘍の治療または予防のための医薬の製造のための、請求項1〜29のいずれか1項に記載の化合物の使用。
- 2型糖尿病の疾患進行を遅延し、または予防するための医薬の製造のための、請求項31に記載の化合物の使用。
- 請求項1〜29のいずれか1項に記載の化合物の有効量を投与することによる、高血糖、2型糖尿病、グルコース寛容減損、1型糖尿病、肥満症、高血圧症、エックス症候群、異脂肪血症、認知障害、アテローム性動脈硬化症（atheroschlerosis）、心筋梗塞、冠状動脈性心疾患およびその他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸症候群、消化不良、並びに胃潰瘍の治療または予防のための方法。
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