KR101702251B1 - 신규한 소포 수송에 이용하기 위한 담즙산 올리고머 결합체 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 소포 수송에 이용하기 위한 담즙산 올리고머 결합체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2 이상의 담즙산 모노머를 올리고머화하여 제조된 담즙산 올리고머를 거대분자의 말단에 결합시키는 단계를 포함하는, 말단-특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체(end-specific macromolecule-bile acid oligomer conjugate)의 제조 방법; 상기 방법으로 제조된 거대분자-담즙산 올리고머 결합체를 개체에 경구 투여하는 단계를 포함하는, 말단 특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체를 체내로 흡수시키는 방법; 거대분자의 말단에 담즙산 올리고머 결합체가 결합된 것을 특징으로 하는, 말단 특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체; 상기 결합체를 포함하는 조성물; 상기 결합체, 가용화제, 부형제, 붕해제, 결합제, 및 윤활제를 포함하는, 거대분자 경구투여용 제제; 헤파린의 말단에 담즙산 올리고머가 결합된, 헤파린-담즙산 올리고머 결합체를 포함하는 약학적 조성물; 및 상기 조성물을 이용하여 혈전증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 소포 수송에 이용하기 위한 담즙산 올리고머 결합체 및 이의 용도 {Bile acid oligomer conjugate for novel vesicular transport and use thereof}
본 발명은 2 이상의 담즙산 모노머를 올리고머화하여 제조된 담즙산 올리고머를 거대분자의 말단에 결합시키는 단계를 포함하는, 말단-특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체(end-specific macromolecule-bile acid oligomer conjugate)의 제조 방법; 상기 방법으로 제조된 거대분자-담즙산 올리고머 결합체를 개체에 경구 투여하는 단계를 포함하는, 말단 특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체를 체내로 흡수시키는 방법; 거대분자의 말단에 담즙산 올리고머 결합체가 결합된 것을 특징으로 하는, 말단 특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체; 상기 결합체를 포함하는 조성물; 상기 결합체, 가용화제, 부형제, 붕해제, 결합제, 및 윤활제를 포함하는, 거대분자 경구투여용 제제; 헤파린의 말단에 담즙산 올리고머가 결합된, 헤파린-담즙산 올리고머 결합체를 포함하는 약학적 조성물; 및 상기 조성물을 이용하여 혈전증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
거대분자(macromolecule)는 작은 서브유닛이 중합되어 형성된 큰 분자를 의미한다. 거대분자는 폴리사카라이드 유도체와 같은 폴리펩타이드, 및 인슐린과 같은 폴리펩타이드를 포함한다. 인슐린, 엑세나타이드 및 헤파린과 같은 거대분자들 중 일부는 생리 활성을 지녀 치료 용도로 사용되고 있다.
헤파린은 주로 D-글루코사민 및 L-이두론산의 반복 단위로 이루어진 뮤코폴리사카라이드다. 헤파린은 항응고 활성을 가지는 혈액 내 성분이며, 항-염증 및 혈관신생 억제와 같은 생리활성을 가지고 있다. 수많은 이온화 가능한 설페이트기로 인하여, 헤파린은 강한 음전하를 가진다. 또한, 헤파린은 수용성 염, 예컨대 헤파린 소듐을 쉽게 형성할 수 있는 상대적으로 강한 산이다. 헤파린은 비만세포(mast cell)에서 발견되며, 여러 신체 기관, 특히 풍부한 비만세포를 가진 기관들로부터 추출될 수 있다. 그 중에서도 간과 폐가 헤파린이 풍부하다. 반면, 혈액 순환계에서는 비만세포의 극심한 분열 후를 제외하고는 헤파린을 포함하지 않는다. 상기 헤파린은 혈액 항응고, 평활근 세포 증식 억제, 면역 억제 활성 등 다양한 생리적 역할을 한다. 특히, 피브린 응고(fibrin clot) 형성을 막기 위하여 안티트롬빈 와 강하게 결합하는 강력한 항응고제이다. 이러한 특성으로 인하여, 헤파린은 심정맥 혈전증(deep vein thrombosis) 및 폐동맥 색전증(pulmonary embolism)의 치료 또는 예방을 위하여 사용되어 왔다.
이러한 생리학적 유용성에도 불구하고, 헤파린의 그것의 큰 분자량 및 강한 음전하로 인하여 이의 적용에 있어서 많은 제한이 수반되었다. 헤파린의 이러한 물리적 특성은 위장관(GI), 코 또는 입의 점막 등에 의한 흡수를 방해한다. 따라서, 임상용으로 이용할 수 있는 경로는 정맥 주사 및 피하 주사가 유일하였다.
인슐린은 췌장의 랑게르한스 베타 세포에서 생산되는, 뚜렷한 생리적 활성을 지니는 거대분자이다. 인슐린은 체내 혈당치가 높을 때 췌장에서 분비되어, 간, 근육, 지방 조직으로 당을 흡수시켜 글리코겐으로 저장하고, 지방을 분해하여 에너지원으로 사용되는 것을 억제하여 혈당 조절 기능을 가진다. 이러한 특성으로 인슐린은, 혈당 조절이 요구되는 당뇨병 등의 치료에 유용하게 사용되어 왔으나, 그것의 큰 분자량으로 인하여 경구 투여에는 제한이 있었다.
이와 같이, 인슐린, 헤파린과 같은 특별한 생리활성을 가지는 거대분자들은, 이들의 생리학적 유용성에도 불구하고, 경구 투여용으로 사용될 수 없었다. 따라서, 거대분자의 경구 투여를 위한 적절한 제제를 만들기 위하여 많은 연구가 있어 왔다. 헤파린에 대한 이전의 연구에서는, 헤파린의 보다 우수한 흡수를 위하여, 양이온성 세포 침투성 물질과 친수성 또는 소수성의 계면활성제를 함께 투여하였다 (Ross & Toth, 2005). 다른 연구에서는, N-[8-(2-하이드록시벤조일)아미노]카프릴레이트(SNAC)와 함께 헤파린을 투여하는 방법이 강구되었으나, 상기 방법의 경우 전달 물질의 독성으로 인하여 사용될 수 없었다 (Berkowitz et al., 1914-1919). 본 발명자들 역시, 헤파린에 담즙산의 일종인 데옥시콜산 모노머 또는 다이머를 헤파린에 비-위치특이적으로 결합시켜 헤파린의 상기 언급한 특성들을 개선함으로써, 헤파린의 경구 투여 방법을 종전에 개발한 바 있다 (미국등록특허 제6,656,922호 및 Byun et al., Journal of Control Release 120 (2007) 4-10). 그러나, 이 방법은 흡수율을 증가시키기 위하여 데옥시콜산 모이어티의 수를 증가시키는 경우, 헤파린의 항응고 활성이 감소되었기 때문에, 헤파린의 장내 흡수를 높이는데 제한이 있었다.
체내 흡수율 및 생물학적 활성을 모두 증진시킬 수 있는 거대분자-담즙산 올리고머 결합체를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 본 발명자들은 담즙산 올리고머를 거대분자의 말단에 결합시키고, 상기 결합체를 경구 투여용으로 이용하는 경우, 거대분자의 말단에 결합된 담즙산 올리고머가 높은 흡수 효율을 가지는 신규한 소포 수송(vesicular transport) 메카니즘을 통하여 거대분자의 장내 흡수를 유도함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은, (a) 2 이상의 담즙산 모노머를 올리고머화하여 담즙산 올리고머를 제조하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 담즙산 올리고머를 거대분자의 말단에 결합시키는 단계를 포함하는, 말단-특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체(end-specific macromolecule-bile acid oligomer conjugate)의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, (a) 2 이상의 담즙산 모노머를 올리고머화하여 제조된 담즙산 올리고머를 거대분자의 말단에 결합시켜 거대분자-담즙산 올리고머 결합체를 제조하는 단계; (b) 단계 (a)에서 제조된 거대분자-담즙산 올리고머 결합체를 개체에 경구투여하는 단계; (c) 상기 투여된 결합체를 소장 세포막의 ASBT(apical sodium bile acid transporter)와 결합하여 소포 형태로 장세포의 세포질로 수송하는 단계를 포함하는, 말단-특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체의 체내 흡수 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 거대분자의 말단에 담즙산 올리고머가 결합된, 거대분자-담즙산 올리고머 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 결합체 및 가용화제를 포함하는 조성물, 구체적으로는 경구투여용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 헤파린-데옥시콜산 올리고머 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 약학적 조성물을 이용하여 혈전증을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
일 실시양태로서, 본 발명은 (a) 2 이상의 담즙산 모노머를 올리고머화하여 담즙산 올리고머를 제조하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 제조된 담즙산 올리고머를 거대분자의 말단에 결합시키는 단계를 포함하는, 말단-특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체(end-specific macromolecule-bile acid oligomer conjugate)의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 2 이상의 담즙산 모노머를 올리고머화하여 제조된 담즙산 올리고머를 거대분자의 말단에 결합시키는 경우, 장내 흡수가 어려웠던 거대분자를, 장 세포 막의 담즙산 수용체인 ASBT(apical sodium bile acid transporter)와의 결합을 통한 소포 수송이라는 신규한 메커니즘을 통하여 체내로 효과적으로 흡수시킬 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 상기 담즙산 올리고머를 거대분자의 말단에 결합시켜, 폴리펩타이드 또는 폴리사카라이드와 같은 다양한 거대분자의 효과적인 체내 흡수를 가져올 수 있는 말단-특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은, 거대분자에 담즙산을 단계적으로 부착하는 것이 아니라, 담즙산 올리고머를 별도로 제조하고 소포 수송을 유도하는 거대분자의 말단에 담즙산 올리고머를 부착하는 데에 특징이 있다.
본원에서, 용어 "거대분자-담즙산 올리고머 결합체(macromolecule-bile acid oligomer conjugate)"는 거대분자의 말단에 담즙산 올리고머가 결합된 결합체를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 거대분자-담즙산 올리고머 결합체는 거대분자의 말단에 담즙산 올리고머가 연결된 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명의 거대분자-담즙산 올리고머 결합체는, 거대분자의 비-특이적인 위치에 담즙산 올리고머를 결합시키거나 거대분자의 중간-위치에 결합시켜 형성되는 것이 아니다. 그 대신에, 본 발명의 결합체는, 담즙산 올리고머와 거대분자의 말단-특이적 결합으로 제조된다. 본 발명의 거대분자-담즙산 올리고머 결합체가 담즙산 올리고머와 거대분자의 말단-특이적 결합으로 형성되기 때문에, 담즙산 올리고머와 장세포의 ASBT 사이의 상호작용을 통하여 거대분자의 흡수가 증대된다. 또한, 이러한 결합체의 형성은, 거대분자의 생리학적 활성을 나타낼 수 있는 부위에 입체 장애를 가져오지 않는다. 따라서, 본 발명의 결합체는 거대분자의 생리활성을 유지 또는 증진시킬 수 있으면서도 높은 장내 흡수를 촉진시킬 수 있는 이점을 지닌다. 따라서, 거대분자의 말단에 담즙산 올리고머를 결합시켜 제조된 본 발명의 결합체는 경구 투여용 제제 내에 가용화제와 함께 사용되는 경우, 높은 체내 흡수율뿐만 아니라 강력한 생물학적 활성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 많은 결합체 중에서, 헤파린-담즙산 올리고머 결합체는 특히 헤파린 말단에 담즙산 올리고머를 결합시켜 형성될 수 있다. 상기 말단-특이적인 결합은, 헤파린의 말단에서 헤파린의 환원 2,5-안하이드로만노스 단위(reducing 2,5-anhydromannose unit)와 EtnDOCA(n=bis/tri/tetra)와 같은 담즙산 유도체를 반응시킨 다음, NaCNBH4와 같은 환원제를 반응시킴으로써, 수행될 수 있다. 본 발명의 말단-특이적인 결합체와 달리, 비-위치특이적인 헤파린-담즙산 결합체는 헤파린의 여러 카르복실산을 활성화시키고 이들을 담즙산 유도체와 반응시키고, 그렇게 함으로써 헤파린의 중간 위치에 담즙산이 비-특이적으로 결합된다.
상기 결합체, 특히 거대분자-담즙산 테트라머 결합체(macromolecule-bile acid tetramer conjugate)는 담즙산 수용체인 ASBT(apical sodium dependent bile acid transporter 또는 human ileal bile acid transporter)와 결합하여 소포의 형태로 장세포 내부로 전달된다. 기존에는, 담즙산이 ASBT를 통과하고 목적 위치로 확산되는, 담즙산의 수송 메커니즘을 찾는 많은 연구들이 있었다. 이러한 경우, ASBT를 통과할 수 있는 분자의 크기가 제한되어 있어서, 거대 분자의 장내 흡수율이 낮은 문제점이 있었다. 그러나, 본 발명자들은 담즙산 올리고머를 거대분자 말단에 부착시킬 경우 ASBT가 장내 막에서 소포를 형성하여 거대분자의 장내 흡수가 가능한 소포 수송이 가능함을 최초로 규명하였다. 이러한 신규한 메커니즘을 확인하여, 본 발명의 결합체가 거대분자의 장내 흡수를 용이하게 가져올 수 있는 경구 투여용 제제에 사용될 수 있음을 최초로 규명하였다. 이와 같은 소포성 제제는 본 발명의 결합체의 구성을 개발하여 만들어질 수 있다. 거대분자-담즙산 올리고머가 ASBT와 결합하여 소포 형태로 수송되는, 본 발명의 소포 수송 메커니즘은 이전에 전혀 알려진 바 없다.
본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 (a)는 2 이상의 담즙산 모노머를 올리고머화하여 담즙산 올리고머를 제조하는 단계이다.
본원에서, 용어 "담즙산(bile acid)"은 스테로이드의 자연 및 합성 유도체를 의미한다. 본 발명의 목적상, 담즙산은 올리고머의 형태로 거대분자에 결합되어 효율적인 장내 흡수를 가져올 수 있다면 그 종류에 특별히 제한되지 않는다. 담즙산의 예로 콜산(cholic acid), 데옥시콜산(deoxycholic acid), 케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 리토콜산(lithocholic acid), 우르소콜산(ursocholic acid), 이소우르소데옥시콜산(isoursodeoxycholic acid), 라고데옥시콜산(lagodeoxycholic acid), 글리코콜산(glycocholic acid), 타우로콜산(taurocholic acid), 글리코데옥시콜산(glycodeoxycholic acid), 글리코케노데옥시콜산(glycochenodeoxycholic acid), 디하이드로콜산(dehydrocholic acid), 히오콜산(hyocholic acid) 또는 히오데옥시콜산(hyodeoxycholic acid)이 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 데옥시콜산을 대표적인 담즙산으로 사용하였다.
본원에서, 용어 "담즙산 올리고머(bile acid oligomer)"는 2개 이상의 담즙산을 연결하여 제조된 담즙산 유도체를 의미하고, 바람직하게는 3개 이상의 담즙산을 연결하여 형성된 유도체를 의미하며, 더욱 바람직하게는 4개 이상의 담즙산을 연결하여 형성된 유도체를 의미한다. 바람직하게는, 상기 담즙산 올리고머는 2 내지 10개의 담즙산 모노머를 포함할 수 있다. 본 발명의 거대분자의 말단에 결합되는, 담즙산 올리고머는 장세포의 ASBT에 결합하여 소포 수송을 가져옴으로써 거대분자의 효율적인 장내 흡수를 가져온다.
상기 담즙산 올리고머는 콜산(cholic acid), 데옥시콜산(deoxycholic acid), 케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 리토콜산(lithocholic acid), 우르소콜산(ursocholic acid), 이소우르소데옥시콜산(isoursodeoxycholic acid), 라고데옥시콜산(lagodeoxycholic acid), 글리코콜산(glycocholic acid), 타우로콜산(taurocholic acid), 글리코데옥시콜산(glycodeoxycholic acid), 글리코케노데옥시콜산(glycochenodeoxycholic acid), 디하이드로콜산(dehydrocholic acid), 히오콜산(hyocholic acid) 및 히오데옥시콜산(hyodeoxycholic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 담즙산으로 이루어질 수 있다. 상기 담즙산 올리고머는 동일한 담즙산 또는 서로 다른 종류의 답즙산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 담즙산 올리고머는 바람직하게는 거대분자의 말단에 연결될 수 있는 작용기를 가진 링커를 포함할 수 있다.
본원에서, 용어 "링커(linker)"는 담즙산 올리고머를 거대분자 말단에 연결할 수 있는 연결기를 의미하고, 거대분자의 말단과 결합할 수 있는 작용기를 포함할 수 있다. 거대분자의 말단에 결합할 수 있는 작용기는 거대분자의 말단에 위치하는 작용기의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 단백질의 시스테인 잔기의 티올기와 반응하여 티오에스터(thioethers) 결합을 형성하는 경우에는, 말레이미드(maleimide)기, 아이오도아세트아마이드(iodoacetamide)기 또는 다이설파이드(disulfide)기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 폴리사카라이드의 알데하이드기 또는 케톤기와 같은 카르보닐기와 환원성 아민화 반응(reductive amination)을 통하여 결합을 형성하는 경우에는, 아민기를 포함할 수 있다(Kalia J et al., Curr Org Chem. 2010 Jan; 14(2):138-147; Riin Velleste et al., Cellulose, 2010, 17:125-138). 상기 링커의 예로는, 분자량 300 내지500 Da의 알킬 사슬, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 펜타에틸렌헥사민, 1,5-다이아미노-2-메틸펜테인 또는 에틸렌다이아민(EDA) 등이 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서, 합성된 데옥시콜산 올리고머에 에틸렌다이아민을 연결하여 아민기를 포함하는 링커를 형성하였다. 그 뒤, 담즙산 올리고머에 연결된 링커의 아민기와 헤파린 말단의 환원(reducing 2,5-anhydromannose unit)의 알데히드기 사이의 반응을 통하여 데옥시콜산 올리고머를 헤파린 말단에 결합시켰다. 또한, 말레이미드(maleimide) 기를 포함하는 링커를 데옥시콜산 올리고머에 연결하여, 이를 트라이머의 N-말단의 시스테인 잔기의 티올기와 반응시켜 말단-특이적인 트라이머-데옥시콜산 올리고머 결합체를 제조하였다.
본 발명의 제조 방법은, (b) 단계 (a)의 담즙산 올리고머를 거대분자의 말단에 결합시키는 단계를 포함한다.
본원에서, 용어 "거대분자(macromolecule)"는 작은 서브유닛이 중합되어 형성된 큰 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 거대분자는 말단에 결합된 담즙산 올리고머를 통하여 장내로 흡수될 수 있는 분자라면 특별히 그 종류에 제한되지 않는다. 이러한 거대분자의 예로 폴리사카라이드, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 거대분자는 분자량 1000 Da 이상의 폴리사카라이드, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다.
본원에서, 용어 "폴리사카라이드(polysaccharide)"는 2개 이상의 모노사카라이드가 글리코시드 결합으로 연결된 고분자 화합물을 의미한다. 폴라사카라이드의 예로 헤파린(heparin), 헤파린 소듐(heparin sodium), 설폰화된 폴리사카라이드(sulfonated polysaccharide), 셀룰로오스(cellulose), 히드록시메틸셀룰로오스(hydroxymethylcellulose) 또는 히드록시프로필셀룰로오스(hydroxypropylcellulose)가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 폴리사카라이드는 항응고성 폴리사카라이드가 바람직하고, 헤파린이 보다 바람직하다.
또한, 상기 폴리사카라이드는 말단에 카보닐기를 포함할 수 있다. 말단에 카보닐기를 포함하는 폴리사카라이드는 담즙산 올리고머에 연결된 링커의 아민기와 환원성 아민화 반응(reductive amination)을 통하여 서로 커플링될 수 있다. 보다 구체적으로, 셀룰로오스 말단의 히드록시기는 케톤과 같은 카보닐기로 산화될 수 있으며, 이는 아민기와 반응하여 커플링될 수 있다(Riin Velleste et al., Cellulose, 2010, 17:125-138). 또한, 헤파린 말단의 환원 2,5-안하이드로만노스 단위(Reducing 2, 5-anhydromannose unit)의 알데하이드기 역시 아민기와의 반응을 통하여 다른 화합물과 커플링될 수 있다.
본원에서, 용어 "헤파린(heparin)"은 설폰산기(sulfonic acid group)를 가진 산성 폴리사카라이드로서, 주로 D-글루코사민 및 L-이두론산의 반복 단위로 이루어져 있다. 상기 헤파린은 항응고 활성을 가진다. 본원에서 사용되는 헤파린은 비분획 헤파린(unfractionated heparin), 고분자량 헤파린(high molecular weight heparin), 저분자량 헤파린(low molecular weight heparin; LMWH), 헤파린 단편(heparin fragments) 및 재조합 헤파린(recombined heparin)을 포함한다. 헤파린의 말단에 담즙산 올리고머가 결합되어 형성된, 본 발명의 대표적인 헤파린-담즙산 올리고머 결합체의 경우, 헤파린의 중간 위치에 담즙산 올리고머가 결합된 비-위치특이적 헤파린-담즙산 올리고머 결합체와 달리, 헤파린에 결합된 담즙산 모이어티의 수가 증가할수록 체내 흡수율 및 항응고 활성이 모두 향상된 결과를 나타낸다.
본원에서, 용어 "폴리펩타이드(polypeptide)"는 10개 이상의 아미노산 잔기가 펩타이드 결합으로 연결되어 이루어진 아미노산 중합체를 의미하고, 바람직하게는 분자량 1000 Da 이상의 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 폴리펩타이드의 예로 인슐린, 인슐린 분비성 펩타이드 또는 칼시토닌을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 인슐린 분비성 펩타이드는 GLP-1, 엑센딘-3, 엑센딘-4 뿐만 아니라, 이들의 작용제(agonist), 전구물질(precursors), 유도체(derivative), 단편(fragment) 또는 변이체(variant)를 모두 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서는 대표적인 GLP-1 작용제인 엑세나타이드를 사용하였다.
또한, 상기 폴리펩타이드는 담즙산 올리고머와 결합되기 위하여 N-말단 또는 C-말단에 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 시스테인 잔기는 자연적으로 발생한 형태이거나 아미노산 서열에서 인위적으로 시스테인 잔기를 포함하도록 개질된 형태(예컨대, 치환 또는 첨가)일 수 있다. 상기 N-말단 또는 C-말단에 위치하여 담즙산 올리고머와 연결되는 시스테인 잔기는 폴리펩타이드에 위치하는 여러 시스테인 잔기 중에서 당 구조 또는 3차 구조에 의한 입체 장애 없이 담즙산 올리고머와 연결될 수 있도록 노출되어 있을 수 있다.
상기 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 위치한 시스테인 잔기의 티올기는 담즙산 올리고머 그 자체 또는 담즙산 올리고머에 연결된 링커의 작용기와 커플링될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 티올기는 담즙산 올리고머에 부착된 링커의 말레이미드기, 아이오도아세트아마이드기, 또는 다이설파이드기에 커플링될 수 있다.
본원에서, 용어 "말단(terminus)"은 담즙산 올리고머가 부착되는 거대분자의 부분을 의미한다. 폴리펩타이드의 경우 상기 말단은 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단을 의미할 수 있고, 폴리사카라이드의 경우 상기 말단은 폴리사카라이드의 말단에 위치한 모노사카라이드를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법으로 제조된 본 발명의 결합체는 ASBT(apical sodium bile acid transporter)와 결합하여 소포 수송을 통하여 장세포 내부로 이동할 수 있다.
본 발명의 결합체는 거대분자의 말단에 부착된 담즙산 올리고머를 포함하며, 기존에 알려진 다른 결합체와 달리, 상기 결합체는 ASBT에 결합하여 소포 수송의 형태로 세포 내로 전달될 수 있다. ASBT에 결합하여 소포 수송으로 세포 내로 전달된 담즙산 올리고머를 포함하는 상기 결합체는, 세포질에서 IBABP와 결합하여, 기저(basolateral) 부위를 통하여 세포외배출(exocytosis)되고, 궁극적으로 혈액 순환계로 전달된다. 본 발명의 소포 수송 메카니즘은 거대분자의 장내 흡수를 가능하게 하며, 이에 따라 경구투여용 제제의 개발에 적용될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 대표적인 거대분자로서 헤파린을 사용하고, 담즙산으로서 데옥시콜산, 콜산, 리토콜산 및 우르소데옥시콜산을 사용하였으며, 데옥시콜산 유도체를 올리고머 형태로 합성하였다(도 1 내지 8). 이러한 데옥시콜산 유도체를 이용하여, 헤파린의 말단에 데옥시콜산 올리고머가 결합된 본 발명의 헤파린-데옥시콜산 올리고머가 제조되었다(도 9). 이와 유사하게, 대표적인 폴리펩타이드-담즙산 올리고머 결합체, 즉 트라이머-데옥시콜산 올리고머 결합체를 제조하였고, 이는 트라이머의 N-말단에 데옥시콜산 올리고머가 결합된 것이다(실시예 2 및 3). 헤파린의 말단에 데옥시콜산 올리고머가 결합된 본 발명의 결합체 및 가용화제를 포함하는 조성물을 랫트에 투여하고 상기 조성물의 항응고 활성을 관찰하였다. 그 결과, 비-위치특이적으로 데옥시콜산이 결합된 비교군과 달리, 데옥시콜산 모이어티의 수가 증가할수록 항응고 활성 또한 현저히 증가되는 결과를 나타내었다. 또한, 상기 비교군에 비하여 항응고 활성이 대부분 우수한 결과를 보였다. 특히, 데옥시콜산 트라이머 이상이 상기 결합체에 결합된 경우, 항응고 활성이 월등히 우수하였다(도 11 및 12). 헤파린-테트라DOCA(LHe-tetraDOCA)가 본 발명의 대표적인 말단-특이적인 결합체로 사용되었다. LHe-tetraDOCA 를 랫트에 농도별로 투여했을 때, 혈액의 항응고 활성이 증가하였다(도 13). 마찬가지로, LHe-tetraDOCA를 원숭이에 투여하였을 때도 현저히 우수한 항응고 활성을 나타내었다(도 14). 우수한 체내 흡수율을 나타내는 본 발명의 대표적인 결합체인 LHe-tetraDOCA의 장세포 표면에 위치한 담즙산 수용체인 ASBT와의 결합력을 표면 플라스몬 공명(SPR)으로 분석하였다. SPR 결과는 0.072 μM의 KD 값을 나타내었다(도 15). 또한, 체내 흡수율을 확인하기 위하여, 대표적인 약물 전달 시스템으로 Caco-2 세포를 사용하였다. 그 결과, 본 발명의 말단-특이적인 결합체들은 결합된 데옥시콜산 모이어티의 수가 증가할수록, 정단(A) 부위에서 기저(B) 부위로의 상기 결합체의 전달율이 증가하였다. 특히, 데옥시콜산 테트라머가 상기 결합체에 연결된 경우, 기저 부위에서 정단 부위로의 역수송이 현저히 감소하였다(도 16). 또한, 상기 세포를 타우로콜산(TCA)을 처리하여 정단 부위에서 기저 부위로의 수송을 억제하였을 경우, 본 발명의 데옥시콜산 모노머를 가진 결합체와 비교하여, 데옥시콜산 올리고머를 포함한 결합체가 ASBT 억제를 통한 전달 억제가 보다 현저하였다. 특히, 데옥시콜산 테트라머가 연결된 경우, 상기 결합체의 수송이 현저히 억제되었으며, 이는 데옥시콜산 올리고머, 특히 데옥시콜산 테트라머가 결합된 결합체의 전달에서 ASBT에 의한 전달이 중요하게 관여함을 시사하였다(도 17). 이러한 결과는, 본 발명의 대표적인 헤파린-올리고DOCA 결합체가 우수한 체내 흡수율 및 항-응고 활성을 가짐을 나타내는 것이다. 또한, 본 발명에서는 담즙산 올리고머가 말단에 포함된 거대분자 결합체의 수송 메커니즘을 규명하였다. 또한, 본 발명의 대표적인 결합체인 LHe-tetraDOCA가 ASBT-과발현 세포에서 ASBT 근처에 위치하는 것을 나타내었다(도 19 및 20). 그리고, 세포 내 LHe-tetraDOCA의 존재에 따라, ASBT가 세포막에서 세포질로 이동하며, 다시 세포막으로 회복하였다(도 21 및 22). 또한, ASBT 및 LHe-tetraDOCA 사이의 상호작용이 관찰되었다(도 23 및 24). 이러한 상호작용을 통하여 LHe-tetraDOCA가 소포 수송으로 세포 내부로 전달되는 것을 확인하였다(도 25). 그 후, 상기 전달된 LHe-tetraDOCA는 IBABP와 상호작용하고 기저 부위를 통하여 세포외배출되었다(도 26).
또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 2 이상의 담즙산 모노머를 올리고머화하여 제조된 담즙산 올리고머를 거대분자의 말단에 결합시켜 거대분자-담즙산 올리고머 결합체를 제조하는 단계; (b) 단계 (a)에서 제조된 거대분자-담즙산 올리고머 결합체를 개체에 경구투여하는 단계; (c) 상기 결합체를 소장 세포막의 ASBT(apical sodium bile acid transporter)와 결합하여 소포 형태로 장세포의 세포질로 수송하는 단계를 포함하는, 말단-특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체를 체내로 흡수시키는 방법을 제공한다.
상기 단계 (a)는 위에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 단계 (a)에서 제조된 거대분자-담즙산 올리고머 결합체를 개체에 경구투여하는 단계이다. 본 발명에 있어서, 거대분자의 말단에 담즙산 올리고머 결합체를 결합시킴으로써, 거대분자를 포함하는 상기 결합체를 경구 투여하여도 용이하게 장내 흡수시킬 수 있다.
또한, 상기 단계 (c)는 투여된 거대분자-담즙산 올리고머 결합체를 소장 세포막의 ASBT(apical sodium bile acid transporter)에 결합시켜 소포 수송하는 단계이다. 본 발명에서는 ASBT 운반체를 통한 확산에 의한 것이 아니라 ASBT에 결합하여 소포를 형성함으로써 세포 내로 수송될 수 있다는 새로운 메카니즘을 규명하였다. 이러한 메커니즘을 통하여, 거대분자 및 이의 결합체의 큰 크기로 인하여 세포 내로 수송되기 어려웠던 결합체가 장세포 내부로 용이하게 수송시킬 수 있다.
또한, 상기 방법은 (d) 상기 소포-수송된 결합체가 세포질에서 IBABP(ileal bile acid binding protein)과 결합하고, 기저(basolateral) 부위에서 세포외배출되어 혈액 순환계로 배출되는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 소포에서 상기 결합체가 소포로부터 방출되기 전에 IBABP와 결합한 다음, 세포질에서 혈액 순환계로 엑소시토시스됨을 규명하였다.
이러한 신규한 메카니즘을 통하여, 경구 투여된 본 발명의 거대분자-담즙산 올리고머 결합체는 장내로 용이하게 흡수되어 생체 내에서 강력한 생물학적 활성을 나타낼 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 거대분자의 말단에 담즙산 올리고머가 결합된 것을 특징으로 하는, 말단-특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체를 제공한다.
상기 거대분자, 담즙산, 담즙산 올리고머 및 거대분자-담즙산 올리고머 결합체에 대해서는 위에서 설명한 바와 같다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 결합체 및 가용화제를 포함하는 조성물, 보다 구체적으로 경구 투여용 조성물 또는 제제를 제공한다.
상기 결합체에 대해서는 위에서 설명한 바와 같다.
본원에서, 용어 "가용화제"는 본 발명의 결합체가 자가-집합(self-aggregate)하는 것을 방지하기 위한 첨가제를 의미한다. 상기 가용화제는 친수성 및 소수성 분자를 모두 포함하며, 이에 따라 본 발명의 결합체가 자가-집합하는 것을 방지한다. 구체적으로, 상기 가용화제의 친수성 부분은 헤파린과 같은 거대분자와 상호작용하고, 소수성 부분은 담즙산 모이어티와 상호작용하며, 이에 따라 표면장력을 감소시킬 수 있다. 이러한 가용화제의 작용에 의하여, 본 발명의 결합체의 담즙산 올리고머가 노출되어 상호작용을 하게 되고, 이를 통하여 결합체의 흡수가 증가될 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 가용화제는 본 발명의 결합체의 효율적인 장 흡수를 촉진하는 물질이라면 제한없이 포함된다. 상기 가용화제의 예로 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 히드록시알킬 셀룰로오스(hydroxyalkyl cellulose), 히드록시프로필알킬 셀룰로오스(hydroxypropylalkyl cellulose), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 코포비돈(copovidone), 소듐 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose), 카보폴(carbopol), 소듐 알기네이트(sodium alginate), 크산툼검(xanthum gum), 로커스트빈검(locust bean gum), 글리코푸롤(glycofurol), 폴록사머(poloxamer), 사이클로덱스트린(cyclodextrin) 또는 계면활성제가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 계면활성제는 음이온성 계면활성제, 비-이온성 계면활성제 또는 양쪽이온성 계면활성제, 및 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 계면활성제의 예로는 알킬알릴-폴리(옥시에틸렌)에터(alkylallyl-poly (oxyethylene) ethers), 알킬알릴 포름알데하이드 축합 폴리(옥시에틸렌)에터(alkylallyl formaldehyde condensed poly (oxyethylene) ethers), 소수성 부분으로 폴리(옥시에틸렌)(poly (oxyethylene))을 포함하는 블록 코폴리머, 글리세린 에스터의 폴리(옥시에틸렌)에터(poly (oxyethylene) ethers), 소르비탄 에스터의 폴리(옥시에틸렌)에터(poly (oxyethylene) ethers), 폴리(옥시에틸렌)에터 소르비탄 지방산 에스터(poly (oxyethylene) sorbitan fatty acid esters), 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스터(polyethylene glycol fatty acid esters), 글리세린 에스터(glycerin esters), 소르비탄 에스터(sorbitan esters), 프로필렌글리콜 에스터(propylene glycol esters), 당 에스터(sugar esters), 지방산 알칸올 아마이드(fatty acid alkanol amides), 폴리(옥시에틸렌)지방산 아마이드(poly (oxyethylene) fatty acid amides), 폴리(옥시에틸렌)알킬 아민(poly (oxyethylene) alkyl amines), 폴리글리콜화 글리세라이드(polyglycolated glycerides), 폴리(옥시에틸렌) 캐스터 오일(poly (oxyethylene) castor oils), 폴리(옥시에틸렌) 수소화 캐스터 오일(poly (oxyethylene) hydrogenated castor oils), 소르비탄 지방산 에스터(sorbitan fatty acid esters), 지방산 모노글리세라이드, 지방산 다이글리세라이드, 지방산 트리글리세라이드, 당 지방산 에스터(sugar fatty acid esters), 담즙산 염(bile salts), 담즙산염 및 레시틴의 혼합된 미쉘(mixed micelles of bile salts and lecithin), 글루코오스 에스터(glucose esters) 및 비타민 E TPGS(D-α-토코페릴 폴리에틸렌글리콜 1000 숙시네이트)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 계면활성제는 솔루트롤 HS 15(마크로골-15-하이드록시스테아레이트); 크레모포어 RH 40(폴리옥실 40 수소화 캐스터 오일); 크레모포어 A6(마크로골 (6) 세토스테아릴 에터); 크레모포어 A25(마크로골 (25) 세토스테아릴 에터); 라브라솔(카프릴로카프로일 마크로골글리세라이드(폴리옥시글리세라이드)); 트랜숙톨(다이에틸렌글리콜 모노에틸 에터); 트윈(폴리소르베이트 20, 21, 40, 61, 65, 80, 81, 85, 120); 폴록사머 124, 188, 237, 338, 407(폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머); 니콜 HCO-40(폴리에틸렌 글리콜화 천연 또는 수소화 캐스터 오일); 미르지 45(폴리옥시에틸렌 (8) 스테아레이트); 타가트 L(폴리옥시에틸렌 (30) 모노-라우레이트); 마를로솔 1820(폴리옥시에틸렌 (20) 스테라레이트); 마를로솔 OL 15(폴리옥시에틸렌 (15) 올레이트); 브리지 52(폴리옥시에틸렌 (2) 세틸 알코올); 브리지 96(폴리옥시에틸렌 (10) 올레일 에터); 브리지 700(폴리옥시에틸렌 (100) 스테아릴 알코올); 볼포 015(폴리옥시에틸렌 (15) 올레일 에터); 마를로웨트 OA30(폴리옥시에틸렌 (30) 올레일 에터); 마를로웨트 LMA 20(폴리옥시에틸렌 (20) 올레일 에터); 시퍼노익 PE L44(폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머); 시퍼노익 F127(폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머); 라브라필 M1994CS(올레일 마크로글리세라이드(폴리옥시글리세라이드)); 라브라필 M2125CS(리놀레일 마크로글리세라이드(폴리옥시글리세라이드)); 라브라팩 PG(프로필렌글리콜 다이카프릴로카프레이트); 임비터(카프릴산/카프릭산 모노- 및 다이- 글리세라이드); 소르비탄 모노 스테라레이트; 소르비탄 트라이-스테아레이트; 소르비탄 모노-올레이트; 폴리에틸렌글리콜 모노-올레이트; 미글리올 840(프로필렌글리콜 다이카프릴레이트); 겔루시레 44/14(라우로일 마크로골글리세라이드(폴리옥시글리세라이드)); 겔루시레 50/13(스테아로일 마크로골글리세라이드(폴리옥시글리세라이드)); 플루롤 올레이퀴 CC 497(폴리글리세릴 올레이트); 라우로글리콜 FCC(프로필렌글리콜 라우레이트); 카프리올 PGMC(프로필렌글리콜 카프릴레이트); 라우로글리콜 90(프로필렌글리콜 모노라우레이트); 카프리올 90(프로필렌글리콜 모노카프릴레이트); 지방산 염; α-설포닐 지방산 에스터; 직쇄 알킬 벤젠 설폰산 염; 알킬 설폰산 에스터 염; 알킬 에터 설폰산 에스터 염; 알파 올레핀 설폰산 염; 알킬 설폰산 염; 소듐 라우릴 설페이트; 알킬 아미노 지방산 염; 알킬 베테인; 레시틴; 라우릴 다이-메틸 베테인; 및 이의 혼합물을 포함한다.
또한, 상기 조성물이 약학적 조성물로 사용하는 경우, 상기 조성물은 약학적 제조용 담체, 부형제(충전제) 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 경구투여용 고형제제의 종류에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제가 있다. 또한, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제를 혼합하여 제조된다. 상기 부형제의 예로 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨과 같은 당류; 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분과 같은 전분류; 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 및 하이드록시프로필메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스류; 젤라틴 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 충전제를 포함할 수 있다. 일부 경우에는, 가교된 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 소듐 알기네이트를 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응고제, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제, 습윤제, 방향제, 유화제 및 방부제를 더 포함할 수 있다. 경구투여용 액상 제제로 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 액상 제제는 물 및 액상 파라핀과 같은 단순한 희석제뿐만 아니라, 습윤제, 감미제, 방향제, 및 보존제와 같은 다양한 부형제를 포함할 수 있다.
추가적으로, 본 발명의 조성물이 약학적 조성물인 경우, 이는 약학적 유효량으로 투여될 수 있다.
본원에서, 용어 "약학적 유효량(pharmaceutically effective amount)"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율에 상응하는, 질환의 예방 또는 치료용으로 적합한 양을 의미한다. 본 조성물의 유효 투여량은, 개체, 질환의 중증도, 연령, 성별, 질환의 종류, 약물 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시에 사용되는 약물, 및 기타 의학 분야에 알려진 다른 요소들에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 순차적 또는 동시에 병용투여될 수 있다. 그리고, 단일 투여 또는 다중 투여될 수 있다. 위 요소들을 모두 고려할 때, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 헤파린-oligoDOCA 결합체 및 가용화제를 포함하는 조성물은, 비-위치특이적으로 헤파린- oligoDOCA 결합체 및 가용화제를 포함하는 조성물에 비하여, 보다 우수한 항응고 활성을 나타냄을 확인하였다(표 2 및 3). 상기 결합체들의 항응고 활성에 대한 차이는, 결합체 내의 데옥시콜산의 모이어티의 수가 증가할수록 보다 명백해졌고 특히 데옥시콜산 테트라머를 가진 헤파린-tetraDOCA 결합체의 경우 보다 우수한 경구 흡수율 및 항응고 활성을 나타내었다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 결합체; 가용화제; 부형제; 붕해제; 결합제; 및 윤활제를 포함하는, 거대분자 경구 투여용 제제를 제공한다.
본 발명의 거대분자의 경구투여용 제제는 본 발명의 결합체를 포함하고, 이에 따라 경구 투여시 보다 쉬운 장흡수를 가능하게 한다. 또한, 상기 제제는 거대분자의 말단에 담즙산 올리고머를 포함하기 때문에, 거대분자의 생리학적 활성을 유지하거나 증가시킬 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 헤파린-담즙산 올리고머 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 헤파린-담즙산 올리고머 결합체는 위에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 약학적 조성물은 가용화제를 추가로 포함하여, 결합체의 경구 흡수를 증진시킬 수 있다.
본 약학적 조성물은 헤파린-담즙산 올리고머 결합체를 포함하며, 이에 따라 헤파린에 의하여 치료될 수 있는 인간 질환, 예를 들어 암, 관절염(arthritis)과 같은 염증성 질환, 또는 혈전증을 치료할 수 있다.
본원에서, 용어 "암(cancer)"은 상기 조성물에 의하여 치료될 수 있는 암을 의미한다. 상기 암의 예로, 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 담낭암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 또는 다발성 골수종 혈액암이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 헤파린은 암세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있으므로(Robert J Linhardt et al., Chem Biol. 2004 Apr; 11(4): 420-2.), 본 발명의 헤파린-담즙산 올리고머 결합체는 헤파린의 체내 흡수율 및 생물학적 활성을 증진시키면서 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본원에서, 용어 "염증성 질환(inflammatory disease)"은 염증에 의하여 발생하는 질환을 의미한다. 본 발명의 목적상, 헤파린에 의하여 치료될 수 있는 모든 염증성 질환을 의미할 수 있다. 상기 염증성 질환의 예로, 관절염, 류마티스 관절염, 알레르기, 형질구증가증(plasmacitosis), 과면역글로불린혈증(hyperimmunoglobulinemia), 빈혈, 신염(nephritis), 악액질(cachexia), 축산업자에 두드러진 질환, 맥관 증식 신염, 다발성 경화증, 포도막염(uveitis), 만성 갑상선염, 만성 지연 과민증, 접촉피부염, 전신성 홍반(systemic erythematous), 크론병, 건선(psoriasis), 연소성 특발성 위축증, 당뇨병 또는 알츠하이머병이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서, 용어 "혈전증(thrombosis)"은 혈관 내 혈액의 응고에 의하여 유발된 질환을 의미한다. 상기 혈전증은, 급성 심근경색증(acute cardiac infarction), 뇌졸중, 폐색전증(pulmonary embolism), 급성 말초 동맥폐쇄증(acute peripheral arterial occlusion), 심부정맥혈전증(deep venous thrombosis), 문정맥혈전증(portal vein thrombosis), 급성 신정맥 폐쇄증(acute renal vein occlusion), 대뇌 정맥동 혈전증(cerebral venous sinus thrombosis) 또는 중심 망막 정맥 폐쇄증(cetral retinal vein occlusion)이 유발될 수 있다.
본원에서, 용어 "예방(prevention)"은 상기 조성물의 투여에 의하여 상기 질병을 억제하거나 혈전증의 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 용어 "치료(treatment)"는 상기 조성물의 투여에 의해 혈전증의 증세가 완화되는 모든 행위를 의미한다.
또한, 상기 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있으며, 이는 위에서 설명한 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 헤파린-담즙산 올리고머 결합체를 포함하는 조성물을 혈전증 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 혈전증의 치료 방법을 제공한다.
상기 헤파린-담즙산 올리고머 결합체, 조성물 및 혈전증에 대해서는 위에서 설명한 바와 같다.
보다 구체적으로, 본 발명의 치료 방법은 상기 조성물을 약학적 유효량으로 혈전증 의심 개체 내에 투여하는 것을 포함한다. 상기 개체는 개, 소, 말, 토끼, 마우스, 랫트, 닭, 및 인간을 비롯한 포유류 전체를 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적상 상기 조성물은 바람직하게는 경구 투여될 수 있으며, 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 중증도, 약물 형태, 투여 경로 및 투여 기간에 따라 달라질 수 있다. 적절한 투여량은, 당업자에 의하여 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 거대분자-담즙산 올리고머 결합체는 담즙산 올리고머를 통하여, 높은 체내 흡수율을 나타내는 이점을 지니므로, 거대분자의 경구 투여용 제제의 개발에 있어 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 데옥시콜산과 라이신 에틸 에스터 다이하이드로클로라이드(2HCl)의 반응으로 제조된 비스데옥시콜산(bisDOCA)의 합성 공정을 보여주는 모식도이다.
도 2는 비스데옥시콜산의 에톡시(-OC2H5) 기를 통해 비스데옥시콜산과 에틸렌 다이아민(EDA)을 반응시켜 제조된 N-비스데옥시콜릴에틸렌아민 유도체 (EtbisDOCA)의 합성 공정을 보여주는 모식도이다.
도 3은 Ne-BOC-L-라이신 메틸 에스터 하이드로클로라이드 및 BOC-라이신(BOC)-OSu의 반응으로, 라이신 모노머가 3개의 아민기와 연결된 화합물(C28H52N4O9 )의 합성 공정을 보여주는 모식도이다.
도 4는 N-하이드록시숙신이미드 활성화된 데옥시콜산(aDOCA)와 탈보호화된 라이신 모노머의 반응으로 제조된 트라이데옥시콜산(triDOCA)의 합성 공정을 보여주는 모식도이다.
도 5는 트라이데옥시콜산(triDOCA)와 EDA의 반응에 의한 N-트라이데옥시콜릴에틸렌아민(EttriDOCA)를 합성 공정을 보여주는 모식도이다.
도 6은 테트라데옥시콜산(tetraDOCA)의 합성을 위해, 라이신 모노머가 4개의 아민기와 연결된 화합물의 합성 공정을 보여주는 모식도이다.
도 7은 활성화된DOCA와 탈보호화된 라이신 모노머 사이의 반응을 통하여 테트라데옥시콜산(tetraDOCA)를 제조하는 공정을 나타낸 것이다.
도 8은 테트라데옥시콜산(tetraDOCA)와 EDA의 반응에 의한 N-테트라데옥시콜릴에틸렌아민(EttetraDOCA)의 합성 공정을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 대표적인 거대분자 유도체인, 말단-특이적으로 올리고 담즙산이 결합된 헤파린 유도체의 합성 공정을 보여주는 모식도이다. 보다 구체적으로, 헤파린의 환원 2,5-안하이드로만노스 단위(reducing 2,5-anhydromannose unit)에 DOCA 유도체를 반응시키고, 환원제로서 소듐 시아노보로하이드라이드(NaCNBH4)를 사용하여 말단-특이적인 헤파린 결합된 N-올리고데옥시콜릴에틸아민을 합성하였다.
도 10은 비-위치특이적인 헤파린 결합된 N-올리고데옥시콜릴에틸아민 유도체의 일반적인 합성법을 나타낸 것이다. EtbisDOCA, EttriDOCA 및 EttetraDOCA와 같은 담즙산 올리고머는, 헤파린의 카르복실기와 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보다이이미드(EDC)의 활성화를 통하여 헤파린과 반응시켰다.
도 11은 본 발명의 대표적인 말단-특이적인 거대분자 결합체인, 말단-특이적인 헤파린-올리고머 데옥시콜산(LHe-oligoDOCA) 결합체를 경구 투여했을 때, 나타나는 혈장내 항-FXa 활성의 측정결과를 시간에 따라 나타낸 것이다. 상기 조성물은 라브라솔(lbs) 및 폴록사머188(P188)(400 mg/kg 및 2.16 mg/kg)으로 제제화되었고, 수컷 SD 랫트에 투여되었다. 그 결과는 아래의 말단-특이적인 결합체들의 흡수 프로파일의 차이를 나타낸다; 각각 10 mg/kg 의 투여량으로 투여된 (●) LHe-bisDOCA, (□) LHe-triDOCA, (■) LHe-tetraDOCA, (○) LMWH, 및 (▲) LHe-tetraDOCA. (▲) LHe-tetraDOCA 그룹은 다른 처리 없이(예컨대, 가용화) 투여되었다(그룹 당 n=4 랫트). 결과는 mean±s.e.m. 로 나타내었다.
도 12는 (■) LHm-bisDOCA, (●) LHm-triDOCA, 및 (□) LHm-tetraDOCA (그룹 당 n=4 랫트) 경구 투여 후 혈장내 결합체의 항-FXa 활성의 분석에 근거하여, 비-위치특이적인 결합체들의 경구 흡수 프로파일의 차이를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 대표적인 말단-특이적인 거대분자 결합체인, LHe-tetraDOCA를 서로 다른 투여량 (■) 10 mg/kg, (□) 5 mg/kg, 또는 (●) 1 mg/kg로 투여하였을 때 혈장내 항-FXa 측정 결과를 나타낸 것이다. 상기 결합체는 라브라솔(lbs) 및 폴록사머188(P188)(400 mg/kg 및 2.16 mg/kg)으로 제제화하여 랫트(그룹 당 n=4 랫트)에 경구 투여하였다. 결과는 mean±s.e.m. 로 나타내었다.
도 14는 본 발명의 대표적인 말단-특이적인 거대분자 결합체인 LHe-tetraDOCA를 액상 캡슐로 경구 투여한 후, 항-FXa 활성 측정 결과를 나타낸 것이다. 기호 (■)는 5 mg/kg의 투여량으로 LHe-tetraDOCA 를 투여하였을 경우를 나타낸 것이며, 기호 (□)는 10 mg/kg의 투여량으로 LMWH을 캡슐로 경구 투여하였을 경우를 나타낸 것이다(그룹 당 n=4 원숭이). 결과는 mean±s.e.m. 로 나타내었다.
도 15는 본 발명의 대표적인 말단-특이적인 거대분자 결합체인 LHe-tetraDOCA의 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석 결과를 나타낸 것이다. ASBT 단백질을 BIAcore 센서 칩에 결합시킨 뒤, LHe-tetraDOCA를 투입하여 본 도면에 보여진 해리상수(Kd)를 구하였다.
도 16은 LMWH 50 ug/ml 및 oilgoDOCA가 LMWH 말단에 연결된 LMWH 결합체 50 ug/ml의 직접 수송 분석결과 나타낸 것이다. Caco-2 세포를 37 ℃에서 1 시간 동안 LMWH 또는 LMWH 결합체로 처리하고, 상기 세포 내로 물질의 수송을 분석하였다(n=3). A는 정단(apical) 부위를 나타내고, B는 기저(basolateral) 부위을 나타낸 것이다.
도 17은 ASBT의 억제제인 소듐 타우로콜레이트(TCA) 200 uM을 가하여 LMWH 50 ug/ml 및 oligoDOCA가 LMWH 말단에 연결된 LMWH 결합체 50 ug/ml의 정단에서 기저 방향으로의 억제 결과를 나타낸 것이다(n= 3).
도18은 MDCK-ASBT 세포에서 oilgoDOCA의 종류에 따라, oligoDOCA가 LMWH 말단에 연결된 LMWH 결합체의 흡수율의 차이를 나타낸 것이다.
도 19는 ASBT-과발현 MDCK 세포 및 야생형 MDCK 세포에서, 본 발명의 대표적인 위치-특이적 거대분자 결합체인 LHe-tetraDOCA를 처리한 결과를 나타낸 것이다. 그 결과는, LHe-tetraDOCA가 ASBT-과발현(MDCK-ASBT) 세포 내부에 존재하고, LHe-tetraDOCA의 경구 흡수가 화합물의 소수성 증가에 의해 유도되는 것이 아니라, 담즙산 수용체, 즉 ASBT에 대한 증가된 친화력과 관련이 있음을 나타낸다. 핵은 DAPI(파란색)로 염색하였다. 스케일바, 10μm; 고배율, 5μm.
도 20은 본 발명의 대표적인 말단-특이적 거대분자 결합체인 LHe-tetraDOCA의 흡수를 확인하기 위하여, 세포의 공초점 이미지(confocal image)를 나타낸 것이다. RITC-표지 LHe-tetraDOCA로 Caco-2 세포를 처리한 다음, 30분 후 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 분석하였다. Merge는 LHe-tetraDOCA가 세포질에서 발견됨을 나타낸다. 세포에서 밀착연접(tight junction)은 팔로이딘-FITC(Phalloidin-FITC)로 염색하여 제거하였다. 핵은 DAPI(파란색)로 염색하였다. 스케일바, 10μm; 고배율, 5μm.
도 21은 ASBT-과발현 MDCK 세포에 LHe-tetraDOCA를 처리한 후 막으로부터 세포질까지의 ASBT의 공간적 분포를 파악하기 위해 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 상기 물질을 제거한 후, ASBT 발현이 세포질에서 다시 관찰되었다. 웨스턴 블롯 분석은, ASBT에 특이적인 염소 항-인간 ASBT 항체(goat anti-human ASBT antibody)뿐만 아니라, 막(cadherin) 세포질(calnexin), 핵(YY1)에 특이적인 다른 항체들을 사용하여 수행되었다. 또한, 본 결과에서 타우로콜레이트(TCA)를 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹 또한 비교 분석하였다.
도 22는 본 발명의 대표적인 말단-특이적 거대분자 결합체인 LHe-tetraDOCA로 처리한 MDCK-ASBT 세포에서, ASBT 발현 변화를 공초점 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. ASBT 단백질의 클러스터(녹색)는 LHe-tetraDOCA의 처리한 후, 정단(apical) 막에서 사라졌으며, 상기 물질이 제거된 후에는 다시 막에 나타나는 결과를 보였다. ASBT 발현에 있어서 위와 같은 변화는 상기 물질이 처리되지 않은 대조군 및 TCA 처리 그룹에서는 관찰되지 않은 것이다. 스케일바, 20μm.
도 23은 각 분획에서 본 발명의 대표적인 말단-특이적 거대분자 결합체인 LHe-tetraDOCA 및 ASBT 간의 상호작용을 확인하기 위한 공-면역침강(co-immunoprecipitation; Co-IP) 분석 결과를 나타낸 것이다. 비오틴 표지된 LHe-tetraDOCA로 MDCK-ASBT 세포를 처리한 다음, 세포막과 세포질로 분획하였다. LHe-tetraDOCA-비오틴을 스트렙트아비딘 비드(streptavidin bead)로 풀다운한 다음, 면역블롯하여 상호작용을 확인하였다. 그 결과는, 세포막 및 세포질 모두에서 ASBT가 존재함을 보여주었다. <ASBT(상단), LHe-tetraDOCA-비오틴, ASBT 로딩(하단)>.
도 24는 MDCK-ASBT세포에서 ASBT와 LHe-tetraDOCA의 상호작용을 탐지하기 위하여 인-시츄 PLA(Proximity Ligation Assay) 탐지 분석법으로 측정한 결과를 나타낸 것이다. 단백질 상호작용은 붉은색으로 관찰되었다. 고배율의 우측 그림에서, 단백질 상호작용이 세포막과 세포질에서 모두 일어나고 있음을 나타내었다. 스케일바, 20μm.
도 25는 다중-소포체(multi-vesicular bodies; MVB)를 형성하는 ASBT의 세포간 이동을 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다. ASBT는 화살표로 표시한 바와 같이 MDCK-ASBT 세포의 세포막에서 처음 발견되었다. 그러나, 본 발명의 대표적인 말단-특이적 거대분자 결합체인 LHe-tetraDOCA로 세포를 처리하여, 세포막 구조 및 세포막의 곡률의 변화를 일으켰다. ASBT는 세포막의 에워싸여진(engulfed) 부위에서 발견되었다. 그 후, 세포막에서 ASBT는 한 곳에 모였고, 다중-소포체(MVB)에 근처로 이동하였다. ASBT를 포함한 작은 단백질 운반체들은 MVB와 융합하였다. 스케일바, 200 nm.
도 26은 SK-BR-3 세포에서 IBABP(ileal bile acid binding protein)과 본 발명의 대표적인 말단-특이적 거대분자 결합체인 LHe-tetraDOCA 사이의 상호작용을 보여주는 인-시츄 PLA 결과를 나타낸 것이다. IBABP와 LHe-tetraDOCA의 상호작용에 대한 마크(붉은색)가 ASBT 마크(녹색)에 매우 아주 근접해있음이 관찰되었다. 또한, 고배율에서 이러한 마크들이 소포성 구조를 가짐이 관찰되었다. 스케일바, 10μm.
이하에서는 하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1: 담즙산 올리고머의 합성
실시예 1-1: DOCA 다이머의 합성
데옥시콜산 다이머(bisDOCA)를 L-라이신 에틸 에스터(L-lysine ethyl ester)를 이용하여 합성하였다.
보다 구체적으로, 6.6 g(16.85 mmol)의 데옥시콜산을 300 mL THF 용액에 용해시킨 후, 질소충전을 하고 얼음 중탕으로(ice bath) 에서 30분간 놔둔 뒤, 4시간 동안 실온에서 4-메틸몰폴린 및 에틸클로로포르메이트로 반응시켰다. 박층크로마토그래피(TLC)를 통해 반응의 완료를 확인하였다. 그리고 2.08 g(8.43 mmol)의 L-라이신 에틸 에스터 다이하이드로클로라이드를 가한 후, 70 내지 80 ℃의 온도에서 밤새 환류시켰다. 밤새 환류시킨 후, 침전물을 여과로 걸러낸 뒤 용매를 증발시켰다. 조(crude) 침전물을 클로로포름에 다시 용해시키고, 5% HCl, 10% NaOH 및 증류수를 이용하여 연속적으로 세척하였다. 유기층에 소듐 설페이트를 가하여 수용액을 제거하고, 소듐 설페이트를 여과한 뒤, 용매를 증발시켜 농축시켰다. 상기 농축액은, 0.04-0.06 mm 실리카겔을 이용한 크로마토그래피 및 용리제로 디클로로메탄 내 10% 메탄올을 통하여, 농축액을 이동시켜 분리하였다. 최종 생성물의 수집된 분획을 모으고, 정제하고 차가운 에터 용액에서 재결정화하였다. 전체 반응 공정은 도 1의 모식도에 나타내었다.
그 다음 단계로, 상기 수득한 DOCA 다이머(14.4 mmol)를 108.54 mL의 무수 에탄올에 녹이고, 냉각시킨 비커에서 96.06 mL(1.44 mol)의 에틸렌다이아민(EDA)을 적가하였다. 그 후, 비커 내의 반응 혼합물을 질소충전시킨 뒤, 차광 상태에서 3일간 반응시켰다. 잔류 용매 및 과량의 에틸렌다이아민은 진공 증발시키고, 차가운 물에서 물질을 침전시켰다. 최종 생성물은 0.04-0.063 mm 실리카겔 및 용리제로 7.75:3:0.25 내지 5:5.75:0.25의 비율로 혼합된 클로로포름, 메탄올 및 암모늄하이드록사이드를 사용한 흡착 크로마토그래피를 통하여 정제하였다. 최종 생성물의 특성은 1H NMR, 성분 분석(Elemental analysis), IR, MALDI-TOF, 및 LC/MS(Agilent 1100 series)를 통하여 분석하였다. LC/MS 분석은, Xterra phenyl(150×2.1, 3.5μm) 컬럼을 이용한ESI mass spectra가 사용되었다. 전체 반응 공정은 도 2의 모식도에 나타내었다.
실시예 1-2: DOCA 트라이머의 합성
3개의 아미노기를 포함하는 라이신 모노머 BOC-CH3O-lys(lys(boc)2)를 펩타이드 합성법으로 합성하였다. 제1반응물인 H-lysBOC-CH3O.HCl[GL Biochem, China](1.9 g, 6.4 mmol)은 11.67 mL의 DMF에 초음파 하에서 용해시켰다. 그 후, 상기 용액에 4-메틸 몰폴린(2.82 ml, 25.6 mmol)을 적가한 뒤, 2.5 mL의 메탄올 (HPLC grade)을 가하였다. HCl 염을 제거하기 위해 상기 혼합 용액을 60분간 교반시켰다. 한편, 제2반응물인 BOC-lysBOC-OSu[Sigma](2.897 g, 6.4 mmol)는 10.99 mL의 DMF에 용해시키고 냉각하였다. 상기 용액을 질소 기체로 충전하고, 차광 상태에서 밤새 방치하였다. 밤새 반응 후, 용매를 진공상태에서 완전히 증발시켰다. 조 생성물을 60 mL의 클로로포름에 다시 용해시킨 뒤, 5% HCl 20 mL 및 증류수 20 mL로 연속적으로 세척하였다. 용매 증발 후, 상기 조 생성물을 메탄올에 용해시키고, 차가운 증류수에서 침전시켰다. 원심분리로 침전물을 분리하고, 동결건조하여 수분을 제거하였다. 전체 반응 공정을 도 3의 모식도에 나타내었다.
다음 단계로, BOC 그룹을 일반적으로 사용되는 BOC 제거 방법으로 제거하였다.
먼저, 8.16 mL(115.52 mmol)의 아세틸 클로라이드와 114.48 mL의 메탄올을 60 분 동안 교반하고, 혼합 용액을 냉각하였다. 그 다음, 3.4 g(5.775 mmol)의 BOC-CH3O-lys(lys(boc)2) 을 상기 용액에 가하고, 얼음 중탕으로 12 시간 동안 반응시켰다. 용매를 완전히 증발시킨 후, 물질을 증류수에 다시 용해시켰다. 물에 용해된 상기 물질을 클로로포름으로 세척하였다. 액체 추출후, 클로로포름은 플라스크 내에서 수층을 만들면서 제거되고, 상기 수층을 동결 건조시켜 최종 생성물을 수득하였다. 상기 반응 공정을 도 4의 모식도에 나타내었다.
위 합성된 라이신 모노머(500 mg, 1.257 mmol)를 15 mL의 DMF에 초음파로 용해시켰다. HCl 염을 제거하기 위하여, 4-메틸 몰폴린(1.243 mL, 11.3 mmol)를 천천히 가하였다. 40 내지 50분 동안 반응시킨 후, 상기 용액을 얼음 중탕으로 냉각시켰다. 이렇게 냉각된 용액에, N-하이드록시숙신이미드 활성 데옥시콜산(2.68 g, 5.658 mmol)를 12.55 mL의 DMF에 녹인 용액을 적가하였다. 상기 혼합 용액을 24시간 동안 질소충전시키고, 차광 상태에서 교반하였다. 다음날 용매를 증발시키고, 차가운 증류수에서 생성물을 침전시켰다. 상기 침전물을 여과하고 진공 건조시켜 최종 생성물을 수득하였다. 상기 최종 생성물은 추가적으로 정제하고 실시예 1-1에서 언급한 방법으로 분석하였다.
실시예 1-3: DOCA 테트라머의 합성
라이신 모노머 BOC-CH3O-lys(lys(boc)2)를 실시예 1-2에 개시된 방법으로 합성한 후, 수산화나트륨을 이용하여 6 시간 동안 70 ℃에서 비누화 반응을 통해 BOC-lys(lys(boc)2)-COONa로 전환시켰다. 그 다음, 1N HCl을 가하여 산성화시켜 BOC-COOH-lys(lys(boc)2)를 제조하였다. 상기 산성화된 라이신 모노머는 얼음 중탕으로 DCC와 N-하이드록시숙신이미드와 함께 DMF에 용해시키고, 4 ℃에서 30 분 동안 교반시켰다. 침전된 DCU를 여과시켜 제거하여 최종적으로 화합물 A를 얻었다.
다음 단계로, H-lysBOC-CH3O.HCl을 4-메틸 몰폴린과 혼합하고, 1시간 동안 교반시켜 화합물 B를 얻었다. 화합물 A를 혼합물 B에 천천히 가한 후, 24 시간 동안 반응시켜 라이신 다이머 BOC-CH3O-lys(lys(boc)2)2를 합성하였다. 침전된 DCU는 여과로 제거하였다. 용매는 진공에서 증발시키고, 차가운 증류액에서 물질을 침전시켰다. 조 생성물은 메탄올에 다시 용해시키고 침전시켰다. 그 다음, 상기 정제 물질 BOC-CH3Olys(lys(boc)2)2를 동결 건조시켜 잔류 수분을 제거하였다. 실시예 1-2에 개시한 BOC 탈보호화 방법으로 BOC-CH3O-lys(lys(boc)2)2에서 BOC 그룹을 제거하였다. 그 다음, 4개의 아민기를 가진 라이신 다이머를 합성하였다.
반응물의 몰비를 제외한 실시예 1-2의 방법에 따라, 상기 합성된 라이신 다이머를 N-하이드록시 활성화 데옥시콜산(aDOCA)과 반응시켜 DOCA 테트라머를 합성하였다. 상기 합성된 DOCA 테트라머는 상기 실시예 1-2에 나온 방법으로 추가 정제되고 분석되었다.
실시예 1-4: 콜산 올리고머의 합성
실시예 1-1 내지 1-3의 방법으로, 콜산 모이어티를 이용하여 콜산 다이머, 트라이머 및 테트라머를 제조하였다.
실시예 1-5: 우르소데옥시콜산 올리고머의 합성
실시예 1-1 내지 1-3의 방법으로, 우르소데옥시콜산 모이어티를 이용하여 우르소데옥시콜산 다이머, 트라이머 및 테트라머를 합성하였다.
실시예 1-6: 리소콜산 올리고머의 합성
실시예 1-1 내지 1-3의 방법으로, 리소콜산 모이어티를 이용하여 리소콜산 다이머, 트라이머 및 테트라머를 합성하였다.
실시예 2: 말단-특이적인 헤파린- oligo DOCA 결합체의 합성
도 9는 헤파린의 말단에 데옥시콜산 올리고머를 결합시켜 형성된 본 발명의 결합체의 개략적인 합성 공정을 나타낸 것이다. 구체적인 과정은 하기와 같다.
실시예 2-1: 말단-특이적인 헤파린- bis DOCA 말단 결합체(LHe- bis DOCA) 의 합성
35 mg(7 μM)의 헤파린을 포름아마이드 및 DMF(1.5:1.0 v/v) 혼합물에 약간 가열하면서 용해시킨 뒤, 소듐 시아노보로하이드라이드(77.65 μM)를 가하였다. 그 다음, bisDOCA를 헤파린 FA/DMF 용액에 1:12의 비율로 가하고, 50 ℃에서 21 시간 동안 교반시켰다. 상기 반응 후 형성된 이민 결합은 소듐 시아노보로하이드라이드를 가하여 환원시켰다. 합성된 물질을 침전시키고, 상기 반응 혼합물에 차가운 에탄올을 3회 가하여 정제하였다. 마지막 정제 공정 후, 용매를 완전히 증발시킨 뒤, 남은 물질을 동결건조시켜 LHe-bisDOCA를 분말상태로 수득하였다. 상기 합성된 결합체를 실시예 1에서 개시한 분석 방법으로 확인하였다.
실시예 2-2: 말단-특이적인 헤파린- tri DOCA 결합체( LHe - tri DOCA )의 합성
말단-특이적인 헤파린-triDOCA를 합성하고, 실시예 1-2의 데옥시콜산 트라이머(EttriDOCA)를 이용하여 실시예 2-1의 방법으로 분석하였다.
실시예 2-3: 말단-특이적인 헤파린- tetra DOCA 결합체( LHe - tetra DOCA )의 합성
말단-특이적인 헤파린-tetraDOCA를 합성하고, 실시예 1-3의 데옥시콜산 테트라머(EttetraDOCA)를 이용하여 실시예 2-1의 방법으로 분석하였다.
실시예 3: 엑세나타이드 - tetra DOCA 결합체( tetra DOCA -6M- 엑세나타이드 )의 합성
GLP-1 작용제의 대표적인 예인 엑세나타이드는 그 말단에 담즙산 올리고머를 결합시켜, 아래와 같이 tetraDOCA-6M-엑세나타이드 합성하였다.
먼저, 30 mg 의 tetraDOCA를 0.75 mL의 DMF에 용해시킨 후, 0.75 mL의 DMF에 용해된 9.5 mg의 링커 6-말레이미도헥사노익 NHS와 반응시켰다. 반응 촉매로서, 4 μL의 트리에틸아민이 상기 반응 혼합물에 첨가되었으며, 실온에서 1 시간 동안 교반시켰다. 상기 반응 생성물은 메탄올을 이동상으로 한 HPLC 과정을 통하여 정제하였다. 말레이미드기를 포함하는, 합성 및 정제가 끝난 링커-tetraDOCA는, 프랙션 콜렉터(fraction collector)로 분리한 후, 동결건조하였다.
링커-tetraDOCA 와의 반응을 위하여, 엑세나타이드의 N-말단에서 세린(serine)을 시스테인(cysteine)으로 치환시켜, 엑세나타이드를 개질하였다. 먼저, 개질된 엑세나타이드 2 mg 및 말레이미드기를 포함한 링커-tetraDOCA 물질 5.1 mg을 최소량의 DMF에 녹인 후, 실온에서 24 시간 동안 반응시켰다. HPLC 공정으로 반응 생성물을 정제하였으며, 5분-20분-40분에서 5%-60%-95%의 구배로 메탄올을 이동상으로 사용하였다. HPLC에서 이동상의 속도는 1 mL/분이며, 물질 피크는 UV/vis를 통해 227 nm의 파장에서 관찰되었다. 상기 합성 및 정제가 끝난 링커-tetraDOCA 는 프랙션 콜렉터로 분리한 후, 동결건조하였다.
실시예 4: GLP-1- 담즙산 올리고머 결합체의 제조
실시예 3과 같은 방법으로, 엑세나타이드 대신 GLP-1을 사용하여 GLP-1-담즙산 올리고머 결합체를 제조하였다.
실시예 5: 엑센딘 -3- 담즙산 올리고머 결합체의 제조
실시예 3과 같은 방법으로, 엑세나타이드 대신 엑센딘-3을 사용하여 엑센딘-3-담즙산 올리고머 결합체를 제조하였다.
실시예 6: 엑센딘 -4- 담즙산 올리고머 결합체의 제조
실시예 3과 같은 방법으로, 엑세나타이드 대신 엑센딘-3을 사용하여 엑센딘-4-담즙산 올리고머 결합체를 제조하였다.
비교예 : 비-위치특이적인 헤파린- oligo DOCA 결합체의 합성
도 10은 비-위치특이적으로 헤파린에 데옥시콜산 올리고머가 결합된, 결합체의 제조에 대하여 간략히 나타낸 것이다. 구체적인 과정은 하기와 같다.
비교예 1: 비-위치특이적인 헤파린- bis DOCA 결합체( LHm - bis DOCA )의 합성
비-위치특이적인 헤파린-bisDOCA는, 헤파린과 N-비스데옥시콜릴에틸 아민(EtbisDOCA)) 간의 비등가의 몰비로 결합시켜 제조되었다.
보다 구체적으로, 100 mg의 저분자량 헤파린(LMWH)을 3.125 mL의 포름아마이드 용액에 약간의 가열로 용해시켰다. 헤파린의 카르복시산기를 EDAC를 가하여 활성화시켰다. 그 다음, 1:1.2 내지 1:12의 몰비로 4 ℃에서 12 시간 동안 EtbisDOCA와 반응시켰다. 그 생성물을 차가운 에탄올에서 침전시키고, 필터에서 여과한 다음, 진공-건조시켰다. 상기 헤파린 결합체는 증류수에 다시 용해시킨 후, 동결건조시켜 파우더 형태가 되었다.
표 1은 LMWH-bisDOCA의 결합 형태, 즉 LHm-bisDOCA를, bisDOCA의 커플링 비율에 따라 나열한 것이다. LMWH에 대한 DOCA 다이머(bisDOCA)의 커플링 비율은, 황산으로 적정되는 가스정량법에 의해 결정되었다[A. Fini et al., Journal of Pharmaceutical sciences 81 (1992) 726-730]. 비-위치특이적인 LH-bisDOCA의 항응고 활성은 헤파린의 항-FXa 활성에 기초한 항-FXa Chromogenic assay kit로 확인하였다.
비교예 2: 비-위치특이적인 헤파린- tri DOCA 결합체( LHm - tri DOCA )의 합성
비-위치특이적인 헤파린-triDOCA 결합체(LHm-triDOCA)는, 비교예 1에 개시된 방법에 의하여 비등가의 몰비로 헤파린과 N-트라이데옥시콜릴에틸렌아민을 결합시켜 제조하였다. 커플링 비율 및 항-응고 활성은 비교예 1에 개시된 방법으로 확인하였다.
비교예 3: 비-위치특이적인 헤파린- tetra DOCA 결합체( LHm - tetra DOCA )의 합성
비-위치특이적인 헤파린-tetraDOCA 결합체(LHm-tetraDOCA)는, 비교예 1에 개시된 방법에 의하여 비등가의 몰비로 헤파린과 N-테트라데옥시콜릴에틸렌아민을 결합시켜 제조하였다.
실험예 1: 헤파린- oligo DOCA 결합체( LH - oligo DOCA )의 특성 분석
헤파린-oligoDOCA 결합체들은 적외선분광(IR) 및 양성자 핵자기공명(1H NMR)으로 분석하여 특정 아마이드 결합과 담즙산의 피크의 존재를 확인하였다. 또한, 1H-1H COSY 및 13C NMR을 이용하여 말단-특이적인 헤파린-oligoDOCA 결합체들을 분석하였다. 상기 헤파린 결합체들의 항-응고 활성은, FXa에 대한 물질의 반응성에 기초하여 항-FXa Chromogenic assay kit로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 결합체의 응집은 Electrophoretic Light Scattering(ELS-800)으로 633 nm, 25±1 ℃조건에서 모니터링하였다. 상기 결합체를 용해시키기 위하여, 라브라솔(labrasol) 및 P188을 사용하였다. 자가-응집(self-aggregate)은 보통 1 mg/mL의 농도에서 보통 일어나는 것으로 확인되었다. 각각의 결합체의 용해도는, 샘플의 계속적으로 희석한 후 응집이 더 이상 일어나지 않는 농도에서 확인하였다.
[표 1]
Figure 112015061470817-pct00001
실험예 2: 헤파린- 데옥시콜산 올리고머 결합체의 경구 흡수 동물 실험
담즙산 수송체가 위치한 소장을 통한 말단-특이적인 헤파린-oligoDOCA 결합체를 포함하는 제제의 흡수율을 확인하기 위하여, 헤파린의 항-FXa 활성에 기초하여 헤파린 결합체의 항-응고 활성을 측정하였다.
말단-특이적인 헤파린-oligoDOCA 결합체는, 가용화제인 라브라솔(1bs)(400 mg/kg) 및 폴록사머188(P188)(2.16 mg/kg)와 함께 제제화하여 10 mg/kg의 투여량으로 수컷 SD 랫트에 투여하였다.
그 결과, 대조군에 비하여, 결합된 데옥시콜산 모이어티의 수가 증가할 수록, 상기 결합체의 항-응고 활성이 증가하였다. 특히 데옥시콜산 테트라머를 포함하는 헤파린 결합체의 경우, 데옥시콜산 다이머 또는 트라이머를 포함하는 결합체에 비하여 현저히 우수한 항-응고 활성을 나타내었다(도 11). 반면, 비-위치특이적인 결합체의 경우, 데옥시콜산 다이머를 포함하는 결합체가 가장 높은 항-응고 활성을 나타내었다(도 12).
이러한 결과는, 말단-특이적인 헤파린-oligoDOCA 결합체가 비-위치비특이적인 결합체에 비하여 우수한 흡수율 및 항-응고 활성을 나타냄을 보여준다.
또한, LHe-tetraDOCA를 다양항 투여량으로 SD 랫트에 경구 투여하였다(도 13). 서로 다른 투여량의 LHe-tetraDOCA는 폴록사머 188(poloxamer 188) 및 라브라솔(Labrasol)과 함께 제제화하였다. 도 13에 도시한 바와 같이, LHe-tetraDOCA는 농도-의존적인 항-응고 활성을 나타내었다.
또한, 상기 결합체 및 다른 가용화제를 조합하여, 여러 제제들을 제조하고, SD 랫트에 경구 투여하였다. 그 다음, 상기 투여된 샘플의 혈중 농도를 약물 역학적으로 측정하였다.
각각의 제제의 조성은 하기 표 2와 나타내었다. 그리고, 각각의 제제에 대하여 400 μL의 총 부피로 제조되었고 경구 투여하였다.
[표 2]
Figure 112015061470817-pct00002
또한, 표 2의 제제를 경구 투여한 후, 혈중 농도를 약물역학적으로 분석하였고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
[표 3]
Figure 112015061470817-pct00003
표 3에서, EAUC는 0 내지 8시간까지 농도-시간곡선하면적을 의미한다. Emax는 최대 효과(maximum effect)를 일으키는 농도를 나타내고, Tmax는 최대 효과를 보이는 농도에 도달하는데 필요한 시간을 의미한다.
표 3에 나타난 바와 같이, 가용화제 없이 헤파린-bisDOCA 결합체(LH-bisDOCA)를 포함하는 비교 제제 2의 경우, LMWH-bisDOCA를 포함하는 제제 비교 제제 1에 비하여, 경구 투여시 높은 흡수율을 나타내었다. LMWH-bisDOCA에 가용화제인 라브라솔, 폴록사머 188 또는 폴록사머를 추가한 경우(각각 제제 4, 7 또는 8), 흡수율이 훨씬 더 증가하였다.
또한, 가용화제(P188 및 라브라솔) 및 헤파린-oligoDOCA 결합체를 모두 포함하는 제제 중에서, 비-위치특이적인 헤파린-oligoDOCA 결합체를 포함하는 제제(제제 10 내지 12)에 비하여, 말단-특이적인 헤파린-oligoDOCA 결합체, 특히 데옥시콜산 트라이머 또는 테트라머 결합체(EHtriDOCA 또는 EHtetraDOCA)를 포함하는 제제가 우수한 경구 흡수율 및 항-응고 활성을 나타내었다. 비-위치특이적인 결합체와 달리, 위치-특이적인 결합체는 데옥시콜산 모이어티의 수가 증가할수록 경구 흡수율이 증가하는 결과를 나타내었다. 특히, 데옥시콜산 테트라머가 헤파린에 결합된 경우, 항-응고 활성이 매우 우수하였다.
전반적으로, 이러한 결과는 위치특이적인 헤파린 결합체, 특히 트라이머 이상의 담즙산이 결합된 결합체; 및 가용화제를 포함하는 경구 투여용 제제가, 비-위치특이적으로 담즙산 올리고머가 결합된 헤파린 결합체에 비하여, 우수한 흡수율 및 항-응고 활성을 보임을 나타낸 것이다.
실험예 3: 캡슐 내에 액상으로 제제화한 말단-특이적인 헤파린- tetra DOCA 결합체(LHe- tetra DOCA)의 게잡이 원숭이( cynomolgus ) 원숭이에 대한 경구 투여 in vivo 연구
말단-특이적인 헤파린-oligoDOCA 결합체의 치료 효과를 확인하기 위하여, 데옥시콜산 테트라머를 포함한 헤파린 결합체를 선택하여 투여하였다. 캡슐 내에 액상으로 제제화한 상기 결합체를 게잡이 원숭이에게 5 mg/kg의 투여량으로 경구 투여하였다. 투여된 LHe-tetraDOCA 결합체의 항-FXa 활성을 측정하였다. 대조군으로, LMWH를 포함하는 캡슐을 10 mg/kg의 투여량으로 투여하였다(그룹당 n=4 랫트). 그 결과를 도 14에 나타내었다.
상기 말단-특이적인 헤파린-tetraDOCA 결합체는 대조군에 비하여 현저히 우수한 항-응고 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 본 발명의 결합체를 포함하는 경구 제제가 헤파린과 같은 거대분자의 경구 투여용으로 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
실험예 4: Caco -2 세포주에서 헤파린- oligo DOCA 결합체( LH - oligo DOCA )의 수송 확인
실험예 4-1: Caco -2 세포에서 헤파린- oligo DOCA 결합체의 수송 확인
헤파린-oligoDOCA 결합체의 장 흡수율을 확인하기 위하여, Caco-2 세포를 이용하였다. 이 실험을 위하여, Caco-2 세포를 12-웰 트랜스웰 플레이트(Corning, life sciences, NY)에 두고, 세포집단(cell population)이 411±10Ω㎠의 표준 TEER 수치에 이를 때까지 배지(DMEM high glucose supplemented with 10% FBS, antibiotics, NEAA)에서 37 ℃의 온도에서 4 주간 배양하였다.
Caco-2 세포에 TCA(Na 타우로콜레이트) 처리된 그룹 및 비처리 그룹 모두에 약물의 50 μg/mL를 가한 후, 샘플을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 그 다음, 정단 부위(A) 에서 기저 부위(B)로 또는 역방향(B에서 A)으로 이동한 약물의 양을 항-FXa chromogenic assay를 통해 정량하였다.
상기 분석의 결과는, 결합체에 데옥시콜산 모이어티의 수가 증가할수록, 말단-특이적인 헤파린-oligoDOCA 결합체가 A에서 B로의 수송이 증가하는 결과를 나타내었다. 특히, 데옥시콜산 테트라머가 결합된 헤파린 결합체의 경우, 다른 결합체에 비하여 기저에서 역방향(B에서 A)으로의 수송이 현저히 감소하였다. 이는 데옥시콜산 테트라머가 결합된 헤파린 결합체가 다른 결합체들에 비하여 우수한 전달 효율을 지님을 시사하는 것이다.
또한, ASBT(Apical Sodium-dependent Bile Salt Transporter)의 억제제인 TCA를 200 μM 처리하였다. 그 다음, 50 μg/mL의 LMWH 및 LMWH-oligoDOCA 결합체를 세포에 가하였다. 상기 결합체의 A에서 B로의 수송의 억제를 모니터링하였고, 그 결과는 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이, ASBT 억제제 TCA를 처리한 경우, 정단에서의 기저로의 헤파린-oligoDOCA 결합체의 수송이 억제되었다. 특히, 상기 수송 억제는 데옥시콜산 테트라머가 결합된 헤파린 결합체에서 보다 명확해지며, 이는 결합체, 특히 데옥시콜산 테트라머 결합체의 수송에 있어 ASBT가 중요하게 관여함을 시사하는 것이다.
상기 수송 메커니즘을 규명하기 위하여, RITC-표지된 LHe-tetraDOCA(0.05 및 0.5 mg/mL)를 배양 세포에 가한 다음, 30 분 동안 배양하였다. 배양 후, 세포들을 PBS로 3회 세척하고, 세포 내 밀착연접(tight junction)을 특이적으로 검출하는 팔로이딘-FITC(Sigma, MO)으로 염색하였다. 상기 염색된 세포를 DAPI가 포함된 Vectashield(Vector Laboratories, CA)로 더 처리하고, 공초점 레이저 현미경(Confocal laser microscopy, CLSM; Leica DM IRB/E, Leica Co, Germany)으로 촬영하였다. 세포의 공초점 이미지는 도 20에 나타내었다.
도 20에 나타난 바와 같이, LHe-tetraDOCA는 세포의 세포질에 분포하였다.
실험예 4-2: ASBT -과발현 MDCK 세포에서 말단-특이적인 헤파린- oligo DOCA 결합체의 흡수 확인
ASBT-과발현 MDCK 세포에서 DOCA 모이어티이 수를 달리하여, 말단-특이적인 헤파린-oligoDOCA 결합체들의 상대적인 흡수율의 차이를 확인하였다. 세포는 TEER 값이 37 ℃의 온도에서 411±10 Ωcm2에 이를 때까지 12-웰 트랜스웰 플레이트(Corning, life sciences, NY)에서 배지(DMEM high glucose supplemented with 10% FBS, antibiotics, NEAA)와 함께 1 주간 배양하였다. 상기 결합체를 처리한 후, 항-FXa chromogenic assay를 통해 37 ℃에서 시간에 따라 투과한 약물의 양을 정량하였다. 이러한 측정결과에 기초하여, 상기 결합체의 흡수율을 확인하였다.
상기 결과에 따라, ASBT-과발현 MDCK 세포에서, 말단-특이적인 헤파린-oilgoDOCA 결합체는 데옥시콜산 모노머가 결합된 결합체에 비하여 현저히 우수한 흡수율을 나타내었다. 또한, 데옥시콜산 테트라머가 결합된 헤파린 결합체의 경우, 그 흡수율이 보다 우수하였다(도 18).
위와 같은 결과는, 본 발명의 말단-특이적인 헤파린-oligoDOCA 결합체가 우수한 흡수 효율을 가짐을 시사하는 것이다.
실험예 5: 말단-특이적인 헤파린- oligo DOCA 결합체와 ASBT 사이의 상호작용, 및 ASBT를 통한 흡수
인간 ASBT 및 LHe-tetraDOCA 결합체 사이의 상호작용을 모니터링하기 위하여, 본 발명의 대표적인 결합체인 LHe-tetraDOCA를 ASBT-과발현 MDCK 세포에 가하고, 5분 동안 배양하였다. 세포처리 후, 각 세포 분획물에서 ASBT(slc10a2)의 발현 수준을 면역블로팅법(immunoblotting)으로 확인하였다.
그 다음, 본 발명의 말단-특이적인 헤파린-tetraDOCA 결합체(LHe-tetraDOCA)의 흡수는 하기의 방법으로 확인하였다.
먼저, 137 mM NaCl(Sigma, cell culture tested)이 공급된 Hanks balanced salt solution(HBSS, Sigma, cell culture tested)에 RITC-표지된 LHe-tetraDOCA를 용해시킨 다음, 상기 용해된 LHe-tetraDOCA를 세포에 가하고, 30분 동안 배양하였다. 그 다음, DAPI가 포함된 Vectashield로 세포를 처리하고, 공초점 스캐닝 레이저 현미경(CSLM)으로 시각화하여 상기 결합체의 흡수를 확인하였다. 한편, 비-감염된 MDCK 세포를 대조군으로 사용하였다. 그 결과는 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타난 바와 같이, 담즙산 수송체인 ASBT에 상기 결합체가 분포하였다. 본 발명의 결합체와 수송체 사이의 상호작용을 시각화하여, 단순히 소수성이 증가하여 상기 결합체의 흡수율이 증가하는 것이 아니라, 담즙산 수송체에 대한 상기 헤파린 결합체의 증가한 친화력과 연관성을 가짐을 나타낸다.
위 결과를 바탕으로, 세포 내 ASBT 수송체의 분포를 확인하였다. 이를 위하여, ASBT-과발현 MDCK 세포에 LHe-tetraDOCA 결합체를 가하였다. 그 다음, 세포막, 세포질 및 핵 분획으로 분획화하였다. 각각의 세포 분획은 웨스턴블로팅으로 분석하였다. 카드헤린(Cadherin), 칼넥신(calnexin) 및 YY1은 각각 세포막, 세포질 및 핵을 검출하는데 사용하였다. 그 결과는 도 21에 나타내었다.
위 결과는, LHe-tetraDOCA를 처리 후에 제거하였을 때, ASBT 단백질이 세포질에서 세포막으로 이동하는 것을 나타낸다(도 21).
또한, 본 발명의 LHe-tetraDOCA 결합체로 처리한 MDCK-ASBT 세포주에서, 형광현미경(fluorescence microscopy)으로 ASBT의 발현을 관찰하였다. LHe-tetraDOCA로 세포를 처리한 경우, ASBT 단백질의 클러스터(녹색)는 정단 부위의 세포막에서 사라졌다. 그러나 상기 결합체를 제거하면, ASBT 단백질은 세포막 부위에서 다시 관찰되었다. 그 결과는 도 22에 나타내었다. 이러한 결과는 TCA가 처리된 그룹이나 상기 결합체가 처리되지 않은 그룹에서는 나타나지 않았다(도 22).
LHe-tetraDOCA 및 ASBT 사이의 상호작용을 공-면역침강(Co-IP) 방법으로 확인하였다. 분석을 위하여, LHe-tetraDOCA를 비오틴(biotin)으로 표지하고, 면역침전물(immunipricipitates)은 스트렙트아비딘 비드(streptavidin beads)로 수득하였다. SDS-PAGE에서 샘플을 시험하기 전, 비드 혼합물을 70 ℃에서 3분 동안 가열하여 스트렙트아비딘 비드에서 비오틴을 분리하였다.
SDS-PAGE에서 샘플을 시험한 후, 염소 항-인간 ASBT 항체(goat anti-human ASBT antibody)를 이용하여, 막에서 ASBT를 탐색하였다. 그리고, 마우스 항-비오틴 항체(mouse anti-biotin antibody)(Abcam)는 LHe-tetraDOCA-비오틴의 공-면역침강을 탐지하기 위하여 사용하였다. 각각의 세포 분획(막, 세포질, 핵)의 순도는 특이적인 마커로 확인하였다. 카드헤린(Cadherin), 칼넥신(calnexin), YY1은 각각 세포막, 세포질 및 분획을 검출하는데 사용하였다. 그 결과는 도 23에 나타내었다.
도 23에 나타난 바와 같이, ASBT 및 본 발명의 LHe-tetraDOCA 결합체 사이의 상호작용이 세포막 및 세포질 모두에서 관찰되었다. 이러한 결과는, ASBT 및 LHe-tetraDOCA 사이의 상호작용이 LHe-tetraDOCA의 수송에 관여함을 나타내는 것이다.
Proximity Ligation Assay(PLA)를 위하여, MDCK-ASBT 세포를 배양하고, 얼음 중탕으로 20분 동안 4% PFA에 고정시켰다. 그 다음, 인 시츄 PLA를 위하여 Duolink Detection kit(Olink Bioscience, Uppsala, Sweden)를 이용하여 고정된 세포를 더 처리하였다. 보다 구체적으로, 세포를 슬라이드에 고정시킨 후, ASBT(항체명 확인) 및 비오틴에 대하여 세포를 탐색하였다. 그 다음, 특정 올리고뉴클레오타이드 및 2차항체(ASBT에 대하여 anti-rabbit, 비오틴에 대하여 anti-mouse)를 결합시켜 형성된, PLA 프로브로 세포를 배양하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드의 Ligation은 유전자 증폭으로 수행되었다. 그 결과는 PLA 프로브의 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 형광 프로브로 샘플을 처리하여 시각화하였다. 슬라이드는 Vectashield를 사용하여 고정시키고(mount), 공초점 현미경으로 샘플을 관찰하였다. 그 결과는 도 24에 나타내었다.
도 24에 나타난 바와 같이, ASBT 및 LHe-tetraDOCA 사이의 상호작용이 붉은 점으로 검출되었다. 그리고, 이러한 상호작용은 세포막 및 세포질 모두에서 관찰되었다.
실험예 6: 투과전자현미경( TEM )을 이용하여 ASBT의 다중 소포체( MVB )의 형성 확인
ASBT-과발현 MDCK 세포(MDCK-ASBT 세포)에 LHe-tetraDOCA를 가한 다음, 37 ℃에서 5분간 배양하였다. 세포를 4% PFA로 슬라이드에 고정시키고, ASBT의 N-말단에 연결된 토끼 항-인간 ASBT 항체(Rabbit anti-human ASBT antibody)(N-terminal)로 배양하였다. 그 다음, 세포를 20 nm 콜로이드성 금-결합 항-토끼 2차 항체(colloidal gold-conjugated anti-rabbit secondary antibody)로 배양하였다. 금(gold)-표지 ASBT를 투과전자현미경(TEM)으로 관찰하였다. 그 결과는 도 25에 나타내었다.
도 25에 나타난 바와 같이, 본 발명의 대표적인 결합체인 LHe-tetraDOCA를 처리한 MDCK-ASBT 세포에서, 세포막에 통상적으로 위치하는 ASBT가, 세포막의 구부러진(engulfed) 위치에서 발견되었고, MVB를 형성하였다.
이러한 결과는, 본 발명의 LHe-tetraDOCA 결합체가 막 수송체인 ASBT와 결합하고 소포를 형성하여 수송됨을 나타내는 것이다. 이는 확산으로 수송된다고 믿어져 왔던 헤파린-DOCA 결합체의 수송 메커니즘과는 다른 것이다.
실험예 7: IBABP와의 결합을 통한 장 세포의 기저 부위에서 LHe - oligo DOCA 결합체의 세포외배출
소포 수송 후 본 발명의 결합체가 혈액 순환계로 이동하는 메카니즘을 확인하기 위하여, LHe-tetraDOCA 와 IBABP 사이의 상호작용을 PLA를 이용하여 시험하였다.
보다 구체적으로, ASBT 및 IBABP를 발현하는 것으로 알려진 SK-BR3 세포에 비오틴 표지 LHe-tetraDOCA를 가하고, 30분 동안 배양하였다. 그 다음, IBABP 및 비오틴-특이적인 항체로 처리하였다. 그 후, 2차 PLA 프로브(anti-rabbit 및 anti-mouse)를 가하여 각각 IBABP및 비오틴을 검출하였다. 그 다음, 형광 프로브를 추가하여 신호를 증폭시켰다. PLA 및 ASBT는 실험예 6에서 언급한 방법으로 염색하였다.
도 26은, 본 발명의 LHe-oligoDOCA결합체가 SK-BR3 세포에서 IBABP와 상호작용함을 나타낸다. 도 26에서, IBABP 및 LHe-tetraDOCA 사이의 상호작용은 붉은색으로 표시되었으며, 이러한 표시는 ASBT를 나타내는 녹색 표시 근처에서 발견되었다. 고배율에서, 소포 구조를 관찰하였다.
이러한 결과는, ASBT를 통하여 세포 내부로 수송된 본 발명의 LHe-tetraDOCA가, IBABP와의 상호작용을 통하여 혈액 순환계로 이동할 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 실시양태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (25)

  1. (a) 2 이상의 담즙산 모노머를 올리고머화하여 담즙산 올리고머를 제조하는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 제조된 담즙산 올리고머를 거대분자의 말단에 결합시키는 단계를 포함하고,
    상기 거대분자는 N-말단 또는 C-말단에 시스테인(cysteine) 잔기를 포함하는 폴리펩타이드이고,
    상기 단계 (b)는 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단의 시스테인 잔기의 티올(thiol)기와 담즙산 올리고머에 연결된 링커의 말레이미드기 사이의 커플링을 포함하는,
    말단-특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체(end-specific macromolecule-bile acid oligomer conjugate)의 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 담즙산 올리고머는 말레이미드(maleimide)기, 아이오도아세트아마이드(iodoacetamide)기, 다이설파이드(disulfide)기 및 아민(amine)기로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용기를 포함하는 링커에 연결된 것인 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 인슐린 또는 인슐린 분비성 펩타이드인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 인슐린 분비성 펩타이드는 GLP-1, 엑센딘-3, 엑센딘-4 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  8. (a) 2 이상의 담즙산 모노머를 올리고머화하여 담즙산 올리고머를 제조하는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 제조된 담즙산 올리고머를 거대분자의 말단에 결합시키는 단계를 포함하고,
    상기 거대분자는 헤파린이고,
    상기 단계 (b)는 헤파린 말단의 환원 2,5-안하이드로만노스 단위(Reducing 2,5-anhydromannose unit)의 알데하이드기와 담즙산 올리고머에 연결된 링커의 아민기 사이의 커플링을 포함하는,
    말단-특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체(end-specific macromolecule-bile acid oligomer conjugate)의 제조 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 담즙산 올리고머는 콜산(cholic acid), 데옥시콜산(deoxycholic acid), 케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid), 리토콜산(lithocholic acid), 우르소콜산(ursocholic acid), 이소우르소데옥시콜산(isoursodeoxycholic acid), 라고데옥시콜산(lagodeoxycholic acid), 글리코콜산(glycocholic acid), 타우로콜산(taurocholic acid), 글리코데옥시콜산(glycodeoxycholic acid), 글리코케노데옥시콜산(glycochenodeoxycholic acid), 디하이드로콜산(dehydrocholic acid), 히오콜산(hyocholic acid) 및 히오데옥시콜산(hyodeoxycholic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 담즙산으로 이루어진 것인 방법.
  12. 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 담즙산 올리고머는 2 내지 10개의 담즙산 모노머를 포함하는 것인 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 거대분자의 말단에 담즙산 올리고머 결합체가 결합되는 것을 특징으로 하고, 장세포의 ASBT(apical sodium bile acid transporter)와 결합하여 소포 수송(vesicular transport)을 통하여 장세포의 세포질로 수송되는, 말단-특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 거대분자는 폴리펩타이드 또는 폴리사카라이드인 결합체.
  17. 삭제
  18. 제15항의 말단-특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체; 및 가용화제를 포함하는, 경구투여용 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 가용화제는 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 히드록시알킬 셀룰로오스(hydroxyalkyl cellulose), 히드록시프로필알킬 셀룰로오스(hydroxypropylalkyl cellulose), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 코포비돈(copovidone), 소듐 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose), 카보폴(carbopol), 소듐 알기네이트(sodium alginate), 크산툼검(xanthum gum), 로커스트빈검(locust bean gum), 글리코푸롤(glycofurol), 폴록사머(poloxamer), 사이클로덱스트린(cyclodextrin) 및 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  20. 제15항의 말단-특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체; 가용화제; 부형제; 붕해제; 결합제; 및 윤활제를 포함하는, 거대분자 경구 투여용 제제.
  21. 제20항에 있어서, 상기 결합체는 헤파린-담즙산 올리고머 결합체인 제제.
  22. 제15항의 말단-특이적인 거대분자-담즙산 올리고머 결합체를 포함하고, 상기 거대분자는 헤파린인, 암, 염증성 질환 및 혈전증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
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