CN115052886A - Glp2受体激动剂和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含调节GLP‑2受体的肽的肽缀合物。该肽缀合物可用于治疗响应于GLP‑2受体的调节的病症。本发明还提供了钉合的GLP‑2肽缀合物。

Description

GLP2受体激动剂和使用方法
交叉引用
本申请要求2019年12月4日提交的美国临时申请序列号62/943,667和2020年3月25日提交的美国临时申请序列号62/994,791的权益；其通过引用以其整体并入本文。
背景技术
治疗剂的开发通常受到短半衰期的阻碍。药剂的生物半衰期是药剂失去一半药理学、生理学或放射学活性所需的时间。因此，患者经常更频繁地施用更高剂量的治疗剂，这可能导致顺应性降低、成本升高和副作用风险增加。因此，需要产生具有延长的半衰期的治疗剂。
发明内容
本文公开了一种肽缀合物，其包含：
a)调节GLP-2受体的肽；以及
b)在第一氨基酸和第二氨基酸处与肽连接的钉合体(staple)。
在一些实施方案中，钉合体为式(I)的化合物：
Figure BDA0003781695400000011
其中：
A为任选取代的亚烷基、任选取代的亚芳基、任选取代的杂亚芳基、任选取代的-NR3-亚烷基-NR3-或-N-；
X1和X2独立地为键、-C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)-、-C(＝O)-亚烷基或-亚烷基-C(＝O)NR3-、-亚烷基-C(＝O)NR3-亚烷基-；
其中X1连接至所述肽的第一氨基酸，且X2连接至所述肽的第二氨基酸；
R为氢或-(L)s-Y；
每个L独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-O-亚烷基-、-C(＝O)-亚烷基-、-亚烷基-C(＝O)-、-NR3-亚烷基-、-亚烷基-NR3-、-S-亚烷基-、-亚烷基-S-、-S(＝O)-亚烷基-、-亚烷基-S(＝O)-、-S(＝O)2-亚烷基、-亚烷基-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-NR3C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)NR3-亚烷基-、-NR3C(＝O)-亚烷基-NR3-、-亚烷基-C(＝O)NR3-、-C(＝O)NR3-亚烷基-、-亚烷基-NR3C(＝O)-或-NR3C(＝O)-亚烷基-；
v为2-20；
R1或R2各自独立地为氢、卤素、-CN、-ORa、-SRa、-S(＝O)Rb、-NO2、-NRcRd、-S(＝O)2Rd、-NRaS(＝O)2Rd、-S(＝O)2NRcRd、-C(＝O)Rb、-OC(＝O)Rb、-CO2Ra、-OCO2Ra、-C(＝O)NRcRd、-OC(＝O)NRcRd、-NRaC(＝O)NRcRd、-NRaC(＝O)Rb、-NRaC(＝O)ORa、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-ORa、-NRcRd中的一个、两个或三个取代；
或R1和R2一起形成C1-C6环烷基或C1-C6杂环烷基；
每个R3独立地为氢、-S(＝O)Rb、-S(＝O)2Ra、-S(＝O)2NRcRd、-C(＝O)Rb、-CO2Ra、-C(＝O)NRcRd、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；
Y为氢、C1-C6烷基、-CO2H、-CO2(C1-C6烷基)、-CO2NH2、-CO2N(烷基)2或-CO2NH(烷基)；以及
s为0-20；
Ra为氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
Rb为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
Rc和Rd各自独立地为氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
或者Rc和Rd与它们所连接的氮原子一起形成杂环烷基或杂芳基；其中杂环烷基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代。
本文还公开了包含本文所述的肽缀合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本文还公开了用于治疗有需要的对象的疾病或病症的方法，该方法包括向对象施用包含治疗有效量的本文所述的肽缀合物的组合物。
本文还描述了下式的钉合体：
Figure BDA0003781695400000031
其中：
A为任选取代的亚烷基、任选取代的亚芳基、任选取代的杂亚芳基、任选取代的-NR3-亚烷基-NR3-或-N-；
X1和X2独立地为键、-C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)-、-C(＝O)-亚烷基、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-C(＝O)NR3-亚烷基-；
Y1和Y2独立地为卤素、-COOH、
Figure BDA0003781695400000041
或独立地为含巯基氨基酸的-S-或-CONH-，其中-NH-为调节GLP-2受体的肽中含胺氨基酸的一部分；
R为氢或-(L)s-Y；
每个L独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-O-亚烷基-、-C(＝O)-亚烷基-、-亚烷基-C(＝O)-、-NR3-亚烷基-、-亚烷基-NR3-、-S-亚烷基-、-亚烷基-S-、-S(＝O)-亚烷基-、-亚烷基-S(＝O)-、-S(＝O)2-亚烷基、-亚烷基-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-NR3C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)NR3-亚烷基-、-NR3C(＝O)-亚烷基-NR3-、-亚烷基-C(＝O)NR3-、-C(＝O)NR3-亚烷基-、-亚烷基-NR3C(＝O)-或-NR3C(＝O)-亚烷基-；
v为2-20；
R1或R2各自独立地为氢、卤素、-CN、-ORa、-SRa、-S(＝O)Rb、-NO2、-NRcRd、-S(＝O)2Rd、-NRaS(＝O)2Rd、-S(＝O)2NRcRd、-C(＝O)Rb、-OC(＝O)Rb、-CO2Ra、-OCO2Ra、-C(＝O)NRcRd、-OC(＝O)NRcRd、-NRaC(＝O)NRcRd、-NRaC(＝O)Rb、-NRaC(＝O)ORa、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-ORa、-NRcRd中的一个、两个或三个取代；
或R1和R2一起形成C1-C6环烷基或C1-C6杂环烷基；
每个R3独立地为氢、-S(＝O)Rb、-S(＝O)2Ra、-S(＝O)2NRcRd、-C(＝O)Rb、-CO2Ra、-C(＝O)NRcRd、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；
Y为氢、C1-C6烷基、-CO2H、-CO2(C1-C6烷基)、-CO2NH2、-CO2N(烷基)2或-CO2NH(烷基)；以及
s为0-20；
Ra为氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
Rb为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
Rc和Rd各自独立地为氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
或者Rc和Rd与它们所连接的氮原子一起形成杂环烷基或杂芳基；其中杂环烷基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代。
在一些实施方案中，A为任选取代的亚烷基。在一些实施方案中，A为-(CH2)t-，其中t为1-12。在一些实施方案中，A为任选取代的亚芳基。在一些实施方案中，A为-NR3-亚烷基-NR3-。在一些实施方案中，A为-N-。
在一些实施方案中，X1和X2为-C(＝O)-。在一些实施方案中，X1和X2为-亚烷基-C(＝O)-。在一些实施方案中，X1和X2为-CH2-C(＝O)-。在一些实施方案中，X1和X2独立地为-亚烷基-C(＝O)NR3-。在一些实施方案中，X1和X2独立地为-CH2-C(＝O)NR3-。在一些实施方案中，X1和X2独立地为-亚烷基-C(＝O)NR3-亚烷基-。在一些实施方案中，X1和X2独立地为-CH2-C(＝O)NR3-CH2CH2-。
在一些实施方案中，>A-R具有以下结构：
Figure BDA0003781695400000061
其中r1和r2各自独立地为0-4。
在一些实施方案中，>A-R具有以下结构：
Figure BDA0003781695400000062
在一些实施方案中，>A-R具有以下结构：
Figure BDA0003781695400000063
其中p1为1-5。
在一些实施方案中，>A-R具有以下结构：
Figure BDA0003781695400000064
在一些实施方案中，>A-R具有以下结构：
Figure BDA0003781695400000065
在一些实施方案中，s为1-15。在一些实施方案中，s为1-10。在一些实施方案中，s为5-15。在一些实施方案中，s为5-10。
在一些实施方案中，Y为氢或-CO2H。
在一些实施方案中，每个L独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；且v为2-20。
在一些实施方案中，Y1和Y2为卤素。在一些实施方案中，Y1和Y2为-COOH。在一些实施方案中，Y1和Y2为调节GLP-2受体的肽中两个含巯基氨基酸的-S-。
在一些实施方案中，Y1和Y2为肽中两个含巯基氨基酸的-S-。
在一些实施方案中，Y1和Y2为-CONH-，其中-NH-为调节GLP-2受体的肽中的两个含胺氨基酸的一部分。
在一些实施方案中，Y1和Y2为-CONH-，其中-NH-为调节GLP-2受体的肽中的间隔7个氨基酸的两个含胺氨基酸的一部分。
附图说明
图1A描述了未加入血清的替度鲁肽(teduglutide)和长效GLP2R激动剂对人GLP2R的浓度-反应曲线。
图1B描述了加有血清的替度鲁肽和长效GLP2R激动剂对人GLP2R的浓度-反应曲线。
图2描述了替度鲁肽、长效GLP2R激动剂和阿普鲁肽(apraglutide)对小鼠GLP2R的浓度-反应曲线。
图3描述了替度鲁肽和长效GLP2R激动剂对食蟹猴GLP2R的浓度-反应曲线。
图4A描述了替度鲁肽和长效GLP2R激动剂对GLP1R的浓度-反应曲线。
图4B描述了替度鲁肽和长效GLP2R激动剂对GCGR的浓度-反应曲线。
图4C描述了替度鲁肽和长效GLP2R激动剂对GIPR的浓度-反应曲线。
图5A描述了4℃下GLP2-2G-10Nle-1K-Ex4-K5(GLP2-K5)和GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)在4天内的热稳定性。
图5B描述了25℃下GLP2-2G-10Nle-1K-Ex4-K5(GLP2-K5)和GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)在4天内的热稳定性。
图5C描述了37℃下GLP2-2G-10Nle-1K-Ex4-K5(GLP2-K5)和GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)在4天内的热稳定性。
图5D描述了70℃下GLP2-2G-10Nle-1K-Ex4-K5(GLP2-K5)和GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)在4天内的热稳定性。
图6A描述了pH 3.3和4℃温度下GLP2-2G-10Nle-1K-Ex4-K5(GLP2-K5)和GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)在4天内的稳定性。
图6B描述了pH 3.3和室温下GLP2-2G-10Nle-1K-Ex4-K5(GLP2-K5)和GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)在4天内的稳定性。
图6C描述了pH 37.5和4℃温度下GLP2-2G-10Nle-1K-Ex4-K5(GLP2-K5)和GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)在4天内的稳定性。
图6D描述了pH 37.5和室温下GLP2-2G-10Nle-1K-Ex4-K5(GLP2-K5)和GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)在4天内的稳定性。
图6E描述了pH 8.9和4℃温度下GLP2-2G-10Nle-1K-Ex4-K5(GLP2-K5)和GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)在4天内的稳定性。
图6F描述了pH 8.9和室温下GLP2-2G-10Nle-1K-Ex4-K5(GLP2-K5)和GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)在4天内的稳定性。
图7A描述了长效GLP2-2G-1-EX4-L5A在120分钟内的肝稳定性。
图7B描述了长效GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A在120分钟内的肝稳定性。
图7C描述了长效GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5在120分钟内的肝稳定性。
图8描述了小鼠中GLP2-2G-1-EX4-L5A在96h内的平均血浆浓度。
图9描述了食蟹猴中GLP2-2G-1-EX4-L5A在504h内的平均血浆浓度。
图10描述了小鼠中GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A在96h内的平均血浆浓度。
图11描述了食蟹猴中GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A在504h内的平均血浆浓度。
图12描述了小鼠中GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5在96h内的平均血浆浓度。
图13描述了食蟹猴中GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5在504h内的平均血浆浓度。
图14A描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-1-L5A(GLP2-2G-1-EX4-L5A)和GLP2-2G-5-L5A(GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A)治疗的野生型小鼠中小肠的标准化长度。
图14B描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-1-L5A(GLP2-2G-1-EX4-L5A)和GLP2-2G-5-L5A(GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A)治疗的野生型小鼠中小肠的标准化长度。
图14C描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-1-L5A(GLP2-2G-1-EX4)和GLP2-2G-5-L5A(GLP2-2G-10Nle-1-EX4)治疗的野生型小鼠在11天内的体重。
图15A描述了接受GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的野生型小鼠和未接受治疗的野生型小鼠的小肠长度。
图15B描述了接受GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的野生型小鼠和未接受治疗的野生型小鼠的小肠重量。
图15C描述了接受GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的野生型小鼠和未接受治疗的野生型小鼠的结肠长度。
图15D描述了用GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的野生型小鼠和未治疗的野生型小鼠的结肠重量。
图16A描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-1-L5A(GLP2-2G-1-EX4-L5)和环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠在12天内的体重。
图16B描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-1-L5A(GLP2-2G-1-EX4-L5)和环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠的标准化结肠重量。
图16C描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-1-L5A(GLP2-2G-1-EX4-L5)和环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠的标准化小肠重量。
图16D描述了未接受治疗的和接受GLP2-2G-1-L5A(GLP2-2G-1-EX4-L5)治疗的野生型小鼠和患有诱导的急性结肠炎的小鼠的结肠中的隐窝深度。
图16E描述了未接受治疗的和接受GLP2-2G-1-L5A(GLP2-2G-1-EX4-L5)治疗的野生型小鼠和患有诱导的急性结肠炎的小鼠的空肠绒毛长度。
图17A描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5、替度鲁肽和环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠在10天内的体重。
图17B描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5、替度鲁肽和环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠的结肠长度。
图17C描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5、替度鲁肽和环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠的小肠长度。
图17D描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5、替度鲁肽和环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠的小肠重量。
图17E描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5、替度鲁肽和环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠的空肠绒毛高度。
图17F描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5、替度鲁肽和环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠的空肠中的增殖指数。
图17G描述了GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5和替度鲁肽在小鼠中的药代动力学。
图18A描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-10Nle-L5A和环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠在8天内体重百分比的变化。
图18B描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-1-EX4-L5A和环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠在8天内体重百分比的变化。
图18C描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5和环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠在8天内体重百分比的变化。
图18D描述了未接受治疗的、接受不同的长效GLP2R激动剂和环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠的结肠长度。
图18E描述了未接受治疗的、接受长效GLP2R激动剂和环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠的结肠重量。
图18F描述了未接受治疗的、接受不同的长效GLP2R激动剂环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠的小肠长度。
图18G描述了未接受治疗的、接受不同的长效GLP2R激动剂和环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠的小肠重量。
图18H描述了未接受治疗的、接受不同的长效GLP2R激动剂环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠的胆囊肿大。
图18I描述了未接受治疗的、接受不同的长效GLP2R激动剂环孢菌素A治疗的患有诱导的急性结肠炎的小鼠粪便中的潜血量。
图18J描述了0.03mg/kg剂量的长效GLP2R激动剂的药代动力学。
图18K描述了0.1mg/kg剂量的长效GLP2R激动剂的药代动力学。
图18L描述了急性结肠炎小鼠模型中两种剂量的GLP2-2G-10Nle-L5A的药代动力学。
图18M描述了急性结肠炎小鼠模型中两种剂量的GLP2-2G-1-EX4-L5A的药代动力学。
图18N描述了急性结肠炎小鼠模型中两种剂量的GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5的药代动力学。
图19A描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-1-EX4-L5A治疗的、接受环孢菌素治疗和接受替度鲁肽治疗的患有诱导的慢性结肠炎的小鼠的体重绝对变化。
图19B描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-1-EX4-L5A、环孢菌素和替度鲁肽治疗的患有诱导的慢性结肠炎的小鼠的结肠长度。
图19C描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-1-EX4-L5A、环孢菌素和替度鲁肽治疗的患有诱导的慢性结肠炎的小鼠的结肠重量。
图19D描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-1-EX4-L5A、环孢菌素和替度鲁肽治疗的患有诱导的慢性结肠炎的小鼠的小肠重量。
图20A描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A、环孢菌素和替度鲁肽治疗的患有诱导的慢性结肠炎的小鼠的结肠长度。
图20B描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A、环孢菌素和替度鲁肽治疗的患有诱导的慢性结肠炎的小鼠的结肠重量。
图20C描述了未接受治疗的、接受GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A、环孢菌素和替度鲁肽治疗的患有诱导的慢性结肠炎的小鼠的小肠长度。
图21A描述了未接受治疗的和接受GLP2-2G-5-EX4-L5A治疗的胆碱缺陷型小鼠以及喂食正常饮食的小鼠中的ALT血清水平。
图21B描述了未接受治疗的和接受GLP2-2G-5-EX4-L5A治疗的胆碱缺陷型小鼠以及喂食正常饮食的小鼠中的AST血清水平。
图21C描述了未接受治疗的和接受GLP2-2G-5-EX4-L5A治疗的胆碱缺陷型小鼠以及喂食正常饮食的小鼠的纤维化评分。
图21D描述了未接受治疗的和接受GLP2-2G-5-EX4-L5A治疗的胆碱缺陷小鼠以及喂食正常饮食的小鼠中的脂肪变性。
图21E描述了未接受治疗的和接受GLP2-2G-5-EX4-L5A治疗的胆碱缺陷型小鼠以及喂食正常饮食的小鼠中的小叶炎症(lobular inflammation)。
图22A描述了未接受治疗的、接受替度鲁肽或GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的断奶为常规饮食的雄性小鼠的体重。
图22B描述了未接受治疗的、接受替度鲁肽或GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的断奶为常规饮食的雌性小鼠的体重。
图22C描述了未接受治疗的、接受替度鲁肽或GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的断奶为缺陷型饮食的雄性小鼠的体重。
图22D描述了未接受治疗的、接受替度鲁肽或GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的断奶为缺陷型饮食的雌性小鼠的体重。
图22E描述了未接受治疗的、接受替度鲁肽或GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的断奶为常规饮食的雄性小鼠的标准化小肠重量。
图22F描述了未接受治疗的、接受替度鲁肽或GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的断奶为常规饮食的雌性小鼠的标准化小肠重量。
具体实施方式
胰高血糖素样肽2(GLP-2)是从肠道内分泌细胞分泌的激素。GLP-2刺激肠道生长，增加营养吸收和血液流动，降低肠道通透性和蠕动，并减少上皮细胞凋亡和炎症。由于GLP-2的肠营养作用，GLP-2和相关类似物可用于治疗胃肠道(GI)病症。在人类中，天然GLP-2的短血浆半衰期需要更高的剂量和频繁的注射或输注以实现临床功效，这会对患者的依从性产生负面影响。已利用一些方法来延长GLP-2的半衰期，包括聚乙二醇化和与多肽融合以增加分子量和流体动力学半径，并降低通过肾过滤的清除率。然而，所得类似物的体外效力降低，因此需要更高的剂量才能在体内有效。
肽缀合物
在一个方面，本文公开了包含调节GLP-2受体的肽的肽缀合物。在示例性情况下，调节GLP-2受体的肽包含通过钉合体连接的两个氨基酸。用于缀合的氨基酸的非限制性实例包括半胱氨酸、高半胱氨酸、2-氨基-5-巯基戊酸、2-氨基-6-巯基己酸、赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、高赖氨酸、其他含巯基氨基酸或其他含胺氨基酸。对于包含通过钉合体连接的两个氨基酸的调节GLP-2受体的肽，所述两个氨基酸相隔约或至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多个氨基酸。例如，第一氨基酸的位置为i，且第二氨基酸的位置为i+7、i+11、i+13、i+15或i+16。例如，第一氨基酸在肽中的位置为i，且第二氨基酸在肽中的位置为i+n，其中n为4-16。例如，第一氨基酸在肽中的位置为i，且第二氨基酸在肽中的位置为i+7。例如，第一氨基酸在肽中的位置为i，且第二氨基酸在肽中的位置为i+11。例如，第一氨基酸在肽中的位置为i，且第二氨基酸在肽中的位置为i+15。例如，第一氨基酸在肽中的位置为i，且第二氨基酸在肽中的位置为i+16。
调节GLP-2受体的肽
在一个方面，本文提供了包含调节GLP-2受体的肽的肽缀合物。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽是GLP-2受体激动剂。
本文所述的肽缀合物的结合亲和力可在未修饰形式的GLP-2肽(例如未缀合的GLP-2肽)的结合亲和力的约5％以内。本文所述的肽缀合物的结合亲和力可在未修饰形式的GLP-2肽的结合亲和力的约10％以内。本文所述的肽缀合物的结合亲和力可在未修饰形式的GLP-2肽的结合亲和力的约15％以内。本文所述的肽缀合物的结合亲和力可在未修饰形式的GLP-2肽的结合亲和力的约20％以内。
调节GLP-2受体的肽可包含野生型GLP-2肽的至少一部分，并且可包含一个或多个氨基酸突变。一个或多个氨基酸突变可以包括缺失、取代、添加或其组合。一个或多个氨基酸突变可包括向野生型GLP-2肽添加一个或多个氨基酸残基。一个或多个氨基酸突变可包括野生型GLP-2肽的一个或多个氨基酸残基的缺失。一个或多个氨基酸突变可包括野生型GLP-2肽的一个或多个氨基酸残基的取代。一个或多个氨基酸突变可包括用一个或多个半胱氨酸、赖氨酸或其他含巯基或胺的残基取代野生型GLP-2肽的一个或多个氨基酸残基。一个或多个氨基酸突变可包括用一个或多个D-氨基酸残基取代野生型GLP-2肽的一个或多个氨基酸残基。GLP-2野生型肽的一个或多个氨基酸残基可包含一个或多个丙氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
调节GLP-2受体的肽可用例如乙酰化、磷酸化和甲基化修饰。肽修饰可包括化学修饰。肽修饰可发生在肽的N-末端。肽修饰可包括在肽的N-末端乙酰化氨基。或者或另外，肽修饰可发生在肽的C-末端。肽修饰可发生在肽的一个或多个内部氨基酸处。肽修饰可包括置换肽C-末端的羧基。肽修饰可包括修饰肽C-末端的羧基。可修饰肽C-末端的羧基以产生酰胺基。可修饰肽C-末端的羧基以产生胺基。
调节GLP-2受体的肽的非限制性实例示于表1中。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:1-40中任一项的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:1-40中的任一项具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:1-40中的任一项相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:1-9中任一项的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:1-9中的任一项具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:1-9中的任一项相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:1具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:1相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:2具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:2相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:3具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:3相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:4具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:4相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:5具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:5相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:6具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:6相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:7具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:7相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:8具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:8相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:9具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:9相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:10-20中任一项的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:10-20中的任一项具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:10-20中的任一项相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:10具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:10相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:11具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:11相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:12具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:12相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:13具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:13相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:14具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:14相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:15具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:15相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:16具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:16相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:17具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:17相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:18具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:18相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:19具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:19相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:20具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:20相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:21-29中任一项的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:21-29中的任一项具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:21-29中的任一项相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:21具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:21相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:22具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:22相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:23具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:23相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:24具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:24相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:25具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:25相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:26具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:26相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:27具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:27相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:28具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:28相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:29具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:29相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:30-40中任一项的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:30-40中的任一项具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:30-40中的任一项相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:30具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:30相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:31具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:31相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:32具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:32相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:33具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:33相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:34具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:34相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:35具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:35相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:36具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:36相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:37具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:37相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:38具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:38相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:39具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:39相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些情况下，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:40具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，调节GLP-2受体的肽包含与SEQ ID NO:40相比具有至多约1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、修饰或取代的氨基酸序列。
表1：SEQ ID表
Figure BDA0003781695400000271
Figure BDA0003781695400000281
Figure BDA0003781695400000291
Figure BDA0003781695400000301
Figure BDA0003781695400000311
Figure BDA0003781695400000312
钉合体
本文公开了包含钉合体的肽缀合物。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为式(I)的化合物：
Figure BDA0003781695400000313
其中：
A为任选取代的亚烷基、任选取代的亚芳基、任选取代的杂亚芳基、任选取代的-NR3-亚烷基-NR3-或-N-；
X1和X2独立地为键、-C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)-、-C(＝O)-亚烷基-、-亚烷基-C(＝O)NR3-、-亚烷基-NR3C(＝O)-、-C(＝O)NR3-亚烷基-、-NR3C(＝O)-亚烷基-、-亚烷基-C(＝O)NR3-亚烷基-或-亚烷基-NR3C(＝O)-亚烷基-；
其中X1连接至所述肽的第一氨基酸，且X2连接至所述肽的第二氨基酸；
R为氢或-X3-(L)s-Y；
X3为键、-C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)-、-C(＝O)-亚烷基、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-C(＝O)NR3-亚烷基-；
每个L独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-O-亚烷基-、-C(＝O)-亚烷基-、-亚烷基-C(＝O)-、-NR3-亚烷基-、-亚烷基-NR3-、-S-亚烷基-、-亚烷基-S-、-S(＝O)-亚烷基-、-亚烷基-S(＝O)-、-S(＝O)2-亚烷基、-亚烷基-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-NR3C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)NR3-亚烷基-、-NR3C(＝O)-亚烷基-NR3-、-亚烷基-C(＝O)NR3-、-C(＝O)NR3-亚烷基-、-亚烷基-NR3C(＝O)-或-NR3C(＝O)-亚烷基-；
v为2-20；
R1或R2各自独立地为氢、卤素、-CN、-ORa、-SRa、-S(＝O)Rb、-NO2、-NRcRd、-S(＝O)2Rd、-NRaS(＝O)2Rd、-S(＝O)2NRcRd、-C(＝O)Rb、-OC(＝O)Rb、-CO2Ra、-OCO2Ra、-C(＝O)NRcRd、-OC(＝O)NRcRd、-NRaC(＝O)NRcRd、-NRaC(＝O)Rb、-NRaC(＝O)ORa、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-ORa、-NRcRd中的一个、两个或三个取代；
或R1和R2一起形成C1-C6环烷基或C1-C6杂环烷基；
每个R3独立地为氢、-S(＝O)Rb、-S(＝O)2Ra、-S(＝O)2NRcRd、-C(＝O)Rb、-CO2Ra、-C(＝O)NRcRd、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；
Y为氢、C1-C6烷基、-CO2H、-CO2(C1-C6烷基)、-CO2NH2、-CO2N(烷基)2或-CO2NH(烷基)；以及
s为0-20；
Ra为氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
Rb为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
Rc和Rd各自独立地为氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
或者Rc和Rd与它们所连接的氮原子一起形成杂环烷基或杂芳基；其中杂环烷基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为式(I)的化合物：
Figure BDA0003781695400000331
其中：
A为任选取代的亚烷基、任选取代的亚芳基、任选取代的杂亚芳基、任选取代的-NR3-亚烷基-NR3-或-N-；
X1和X2独立地为键、-C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)-、-C(＝O)-亚烷基、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-C(＝O)NR3-亚烷基-；
其中X1连接至所述肽的第一氨基酸，且X2连接至所述肽的第二氨基酸；
R为氢或-X3-(L)s-Y；
X3为键、-C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)-、-C(＝O)-亚烷基、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-C(＝O)NR3-亚烷基-；
每个L独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-O-亚烷基-、-C(＝O)-亚烷基-、-亚烷基-C(＝O)-、-NR3-亚烷基-、-亚烷基-NR3-、-S-亚烷基-、-亚烷基-S-、-S(＝O)-亚烷基-、-亚烷基-S(＝O)-、-S(＝O)2-亚烷基、-亚烷基-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-NR3C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)NR3-亚烷基-、-NR3C(＝O)-亚烷基-NR3-、-亚烷基-C(＝O)NR3-、-C(＝O)NR3-亚烷基-、-亚烷基-NR3C(＝O)-或-NR3C(＝O)-亚烷基-；
v为2-20；
R1或R2各自独立地为氢、卤素、-CN、-ORa、-SRa、-S(＝O)Rb、-NO2、-NRcRd、-S(＝O)2Rd、-NRaS(＝O)2Rd、-S(＝O)2NRcRd、-C(＝O)Rb、-OC(＝O)Rb、-CO2Ra、-OCO2Ra、-C(＝O)NRcRd、-OC(＝O)NRcRd、-NRaC(＝O)NRcRd、-NRaC(＝O)Rb、-NRaC(＝O)ORa、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-ORa、-NRcRd中的一个、两个或三个取代；
或R1和R2一起形成C1-C6环烷基或C1-C6杂环烷基；
每个R3独立地为氢、-S(＝O)Rb、-S(＝O)2Ra、-S(＝O)2NRcRd、-C(＝O)Rb、-CO2Ra、-C(＝O)NRcRd、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；
Y为氢、C1-C6烷基、-CO2H、-CO2(C1-C6烷基)、-CO2NH2、-CO2N(烷基)2或-CO2NH(烷基)；以及
s为0-20；
Ra为氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
Rb为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
Rc和Rd各自独立地为氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
或者Rc和Rd与它们所连接的氮原子一起形成杂环烷基或杂芳基；其中杂环烷基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代。
在一些实施方案中，A为任选取代的亚烷基。在一些实施方案中，A为-(CH2)t-，其中t为1-12。在一些实施方案中，A为-(CH2)t-，其中t为1-10。在一些实施方案中，A为-(CH2)t-，其中t为1-8。在一些实施方案中，A为-(CH2)t-，其中t为1-6。在一些实施方案中，A为-(CH2)t-，其中t为1-4。
在一些实施方案中，A为任选取代的亚芳基。在一些实施方案中，A为任选地被卤素、烷基或卤代烷基取代的亚芳基。在一些实施方案中，A为亚芳基。
在一些实施方案中，A为-NR3-亚烷基-NR3-。
在一些实施方案中，A为-N-。
在一些实施方案中，X1和X2相同。在一些实施方案中，X1和X2不同。
在一些实施方案中，X1和X2为-C(＝O)-。在一些实施方案中，X1和X2独立地为-亚烷基-C(＝O)-或-C(＝O)亚烷基-。在一些实施方案中，X1和X2独立地为-CH2-C(＝O)-或-C(＝O)-CH2-。在一些实施方案中，X1和X2独立地为-亚烷基-C(＝O)NR3或-C(＝O)NR3-亚烷基-。在一些实施方案中，X1和X2独立地为-CH2-C(＝O)NR3-或-C(＝O)NR3-CH2-。在一些实施方案中，X1和X2独立地为-亚烷基-C(＝O)NR3-亚烷基-或-亚烷基-NR3C(＝O)-亚烷基-。在一些实施方案中，X1和X2独立地为CH2-C(＝O)NR3-CH2CH2-或-CH2-NR3C(＝O)-CH2CH2-。在一些实施方案中，X1和X2独立地为-CH2-C(＝O)NH-CH2CH2-或-CH2-NHC(＝O)-CH2CH2-。
在一些实施方案中，每个R3独立地为氢或C1-C6烷基。在一些实施方案中，每个R3为氢。
在一些实施方案中，>A-R具有以下结构：
Figure BDA0003781695400000361
其中r1和r2各自独立地为0-4。
在一些实施方案中，r1和r2各自独立地为0-2。在一些实施方案中，r1和r2各自为0。在一些实施方案中，r1和r2各自为1。在一些实施方案中，r1和r2各自为3。
在一些实施方案中，>A-R具有以下结构：
Figure BDA0003781695400000371
在一些实施方案中，>A-R具有以下结构：
Figure BDA0003781695400000372
其中p1为1-5。
在一些实施方案中，p1为1-3。在一些实施方案中，p1为1-2。在一些实施方案中，p1为1。在一些实施方案中，p1为2。在一些实施方案中，p1为3。在一些实施方案中，p1为4。在一些实施方案中，p1为5。
在一些实施方案中，>A-R具有以下结构：
Figure BDA0003781695400000373
在一些实施方案中，>A-R具有以下结构：
Figure BDA0003781695400000374
在一些实施方案中，s为1-15。在一些实施方案中，s为1-10。在一些实施方案中，s为5-15。在一些实施方案中，s为5-10。在一些实施方案中，s为5-20。
在一些实施方案中，Y为氢或-CO2H。在一些实施方案中，Y为氢。在一些实施方案中，Y为-CO2H。
在一些实施方案中，每个L独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；且v为2-20。
在一些实施方案中，每个L独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；且v为2-16。
在一些实施方案中，v为2-16。在一些实施方案中，v为2-5。在一些实施方案中，v为5-16。在一些实施方案中，v为5或16。在一些实施方案中，v为2或16。
在一些实施方案中，R1或R2各自独立地为氢、卤素、-CN、-ORa、-NRcRd、-C(＝O)Rb、-CO2Ra、-C(＝O)NRcRd或C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R1或R2各自独立地为氢、卤素、-CO2Ra、-C(＝O)NRcRd或C1-C6烷基。在一些实施方案中，R1或R2各自独立地为氢、-CO2Ra或-C(＝O)NRcRd。在一些实施方案中，R1或R2各自独立地为氢或-CO2Ra。
在一些实施方案中，钉合体为式
Figure BDA0003781695400000381
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000382
其中每个L1独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-O-亚烷基-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；v为2-20；且s1为1-15。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000383
其中每个L2独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-O-亚烷基-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；v为2-20；且s2为1-15。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000391
其中每个L3独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-O-亚烷基-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；v为2-20；且s3为1-15。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000392
其中每个L4独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-O-亚烷基-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；v为2-20；且s4为1-15。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000393
其中每个L5独立地为-(CR1R2)v-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；v为2-20；且s5为1-10。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000394
其中每个L6独立地为-(CR1R2)v-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；v为2-20；且s6为1-5。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000401
其中每个L7独立地为-(CR1R2)v-、-C(＝O)NR3-或-NR3C(＝O)-；v为2-20；且s7为1-5。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000402
其中L8为-(CR1R2)v-且v为10-20。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000403
其中每个L9独立地为-(CR1R2)v-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；v为2-20；且s9为1-5。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000404
其中L10为-(CR1R2)v-且v为10-20。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000405
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000411
其中每个L11独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-O-亚烷基-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；v为2-20；且s11为1-15。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000412
其中每个L12独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-O-亚烷基-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；v为2-20；且s12为1-15。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000413
其中每个L13独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-O-亚烷基-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；v为2-20；且s13为1-15。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000414
其中每个L14独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-O-亚烷基-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；v为2-20；且s14为1-15。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000421
其中每个L15独立地为-(CR1R2)v-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；v为2-20；且s15为1-10。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000422
其中每个L16独立地为-(CR1R2)v-、-C(＝O)NR3-或-NR3C(＝O)-；v为2-20；且s16为1-5。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000423
其中每个L17独立地为-(CR1R2)v-、-C(＝O)NR3-或-NR3C(＝O)-；v为2-20；且s17为1-5。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000424
其中L18为-(CR1R2)v-且v为10-20。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000425
其中每个L19独立地为-(CR1R2)v-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；v为2-20；且s19为1-5。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000431
其中L20为-(CR1R2)v-且v为10-20。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000432
Figure BDA0003781695400000441
Figure BDA0003781695400000451
Figure BDA0003781695400000452
Figure BDA0003781695400000453
为半胱氨酸、高半胱氨酸、2-氨基-5-巯基戊酸或2-氨基-6-巯基己酸残基的一部分，且
Figure BDA0003781695400000454
为赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸或高赖氨酸残基的一部分。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000461
Figure BDA0003781695400000462
其中n为1-4且m为6-20；
Figure BDA0003781695400000463
为半胱氨酸、高半胱氨酸、2-氨基-5-巯基戊酸或2-氨基-6-巯基己酸残基的一部分，且
Figure BDA0003781695400000464
为赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸或高赖氨酸残基的一部分。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000465
Figure BDA0003781695400000471
Figure BDA0003781695400000472
为半胱氨酸、高半胱氨酸、2-氨基-5-巯基戊酸或2-氨基-6-巯基己酸残基的一部分，且
Figure BDA0003781695400000473
为赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸或高赖氨酸残基的一部分。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000474
Figure BDA0003781695400000475
Figure BDA0003781695400000476
为半胱氨酸、高半胱氨酸、2-氨基-5-巯基戊酸或2-氨基-6-巯基己酸残基的一部分。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA0003781695400000477
Figure BDA0003781695400000478
Figure BDA0003781695400000479
为赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸或高赖氨酸残基的一部分。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为
Figure BDA00037816954000004710
Figure BDA00037816954000004711
为赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸或高赖氨酸残基的一部分。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为：
Figure BDA0003781695400000481
Figure BDA0003781695400000482
为半胱氨酸、高半胱氨酸、2-氨基-5-巯基戊酸或2-氨基-6-巯基己酸残基的一部分。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为：
Figure BDA0003781695400000483
Figure BDA0003781695400000484
为半胱氨酸、高半胱氨酸、2-氨基-5-巯基戊酸或2-氨基-6-巯基己酸残基的一部分。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为：
Figure BDA0003781695400000485
Figure BDA0003781695400000486
为赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸或高赖氨酸残基的一部分。
在一些实施方案中，与肽连接的钉合体为：
Figure BDA0003781695400000487
Figure BDA0003781695400000488
为赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸或高赖氨酸残基的一部分。
在一些实施方案中，肽缀合物包含：
a)调节GLP-2受体的肽，其包含SEQ ID NO:1-9中任一项的序列；以及
b)在第一半胱氨酸和第二半胱氨酸处与肽连接的具有以下结构的钉合体(“S”为半胱氨酸残基的一部分)：
Figure BDA0003781695400000491
在一些实施方案中，肽缀合物包含：
a)调节GLP-2受体的肽，其包含SEQ ID NO:1的序列；以及
b)在第一半胱氨酸和第二半胱氨酸处与肽连接的具有以下结构的钉合体(“S”为半胱氨酸残基的一部分)：
Figure BDA0003781695400000492
在一些实施方案中，肽缀合物包含：
a)调节GLP-2受体的肽，其包含SEQ ID NO:2的序列；以及
b)在第一半胱氨酸和第二半胱氨酸处与肽连接的具有以下结构的钉合体(“S”为半胱氨酸残基的一部分)：
Figure BDA0003781695400000493
在一些实施方案中，肽缀合物包含：
a)调节GLP-2受体的肽，其包含SEQ ID NO:10-20中任一项的序列；以及
b)在第一赖氨酸和第二赖氨酸处与肽连接的具有以下结构的钉合体(“NH”为赖氨酸残基的一部分)：
Figure BDA0003781695400000501
在一些实施方案中，肽缀合物包含：
a)调节GLP-2受体的肽，其包含SEQ ID NO:10的序列；以及
b)在第一赖氨酸和第二赖氨酸处与肽连接的具有以下结构的钉合体(“NH”为赖氨酸残基的一部分)：
Figure BDA0003781695400000502
在一些实施方案中，肽缀合物包含：
a)调节GLP-2受体的肽，其包含SEQ ID NO:21-29中任一项的序列；以及
b)在第一半胱氨酸和第二半胱氨酸处与肽连接的具有以下结构的钉合体(“S”为半胱氨酸残基的一部分)：
Figure BDA0003781695400000503
Figure BDA0003781695400000511
在一些实施方案中，肽缀合物包含：
a)调节GLP-2受体的肽，其包含SEQ ID NO:21的序列；以及
b)在第一半胱氨酸和第二半胱氨酸处与肽连接的具有以下结构的钉合体(“S”为半胱氨酸残基的一部分)：
Figure BDA0003781695400000512
在一些实施方案中，肽缀合物包含：
a)调节GLP-2受体的肽，其包含SEQ ID NO:22的序列；以及
b)在第一半胱氨酸和第二半胱氨酸处与肽连接的具有以下结构的钉合体(“S”为半胱氨酸残基的一部分)：
Figure BDA0003781695400000513
在一些实施方案中，肽缀合物包含：
a)调节GLP-2受体的肽，其包含SEQ ID NO:30-40中任一项的序列；以及
b)在第一赖氨酸和第二赖氨酸处与肽连接的具有以下结构的钉合体(“NH”为赖氨酸残基的一部分)：
Figure BDA0003781695400000514
Figure BDA0003781695400000521
在一些实施方案中，肽缀合物包含：
a)调节GLP-2受体的肽，其包含SEQ ID NO:30的序列；以及
b)在第一赖氨酸和第二赖氨酸处与肽连接的具有以下结构的钉合体(“NH”为赖氨酸残基的一部分)：
Figure BDA0003781695400000522
药代动力学
肽缀合物积极影响药代动力学或药效学行为的机制包括但不限于(i)预防或减轻调节GLP-2受体的肽的体内蛋白水解降解或其他活性降低化学修饰；(ii)通过减少肾过滤、减少受体介导的清除或增加生物利用度来改善半衰期或其他药代动力学性质；(iii)降低毒性；(iv)增加溶解度；和/或(v)增加肽或未修饰的肽的生物活性和/或靶标选择性。
肽缀合物可以在与调节GLP-2受体的肽连接时增强该肽的一种或多种药代动力学性质。在与单独的肽或未修饰的肽相比时，如通过药效学测量的，本文公开的肽缀合物可使调节GLP-2受体的肽的一种或多种药代动力学性质增强至少约200％。在与单独的肽或未修饰的肽相比时，如通过药效学测量的，本文公开的肽缀合物可使治疗剂的一种或多种药代动力学性质增强至少约300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％。
药代动力学性质可包括半衰期。肽缀合物的半衰期可以是单独的未修饰的肽的半衰期的至少约2倍。本文公开的肽缀合物的半衰期可以是单独的治疗剂或未修饰的治疗性肽的半衰期的至少约3、4、5或10倍。本文公开的肽缀合物的半衰期可以是单独的未修饰的肽的半衰期的至少约6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50倍。
在一些实施方案中，肽缀合物的半衰期是未修饰形式的肽的半衰期的至少约2倍。在一些实施方案中，肽缀合物的半衰期是未修饰形式的肽的半衰期的至少约5倍。在一些实施方案中，肽缀合物的半衰期是未修饰形式的肽的半衰期的至少约10倍。
此外，与未缀合形式的未修饰的治疗性肽相比，本文所述的肽缀合物可在增加肽的可制造性和/或降低肽的免疫原性方面具有积极影响。
治疗用途
在一方面，本文公开的肽缀合物可用于治疗、缓解、抑制和/或预防一种或多种疾病和/或病症。该疾病和/或病症可以是慢性疾病或病症。或者，该疾病和/或病症是急性疾病或病症。该疾病或病症可以是复发性的、难治性的、加速的或缓解的。该疾病或病症可影响一种或多种细胞类型。该一种或多种疾病和/或病症可以是自身免疫疾病、炎性疾病或代谢疾病。
本文公开了用于治疗有需要的对象中的疾病或病症的方法，该方法包括向对象施用本文所述的肽缀合物。上述疾病或病症可以是糖尿病或肥胖症、或与糖尿病或肥胖症相关的医学病症。上述疾病或病症可以是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或心血管疾病。上述疾病或病症可以是自身免疫性病症。上述疾病或病症可以是克罗恩病(Crohn’s disease)或溃疡性结肠炎。上述疾病或病症可以是短肠综合征(SBS)。上述疾病或病症可以是炎性肠病(IBD)、炎性肠综合征(IBS)或银屑病。上述疾病或病症可以是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、帕金森病(Parkinson’s disease)或亨廷顿病(Huntington’s disease)。PLC可以与一种或多种另外的治疗剂一起施用。本文公开了治疗有需要的对象的疾病或病症的方法，该方法包括向对象施用本文公开的包含一种或多种肽缀合物的组合物。
本文提供了在有需要的对象中预防或治疗代谢疾病或病症的方法，该方法包括向对象施用本文所述的肽缀合物。代谢疾病或病症可以是糖尿病。代谢疾病或病症可以是肥胖症。代谢疾病或病症可以是糖原贮积病(glycogen storage disease)、苯丙酮酸尿症(phenylketonuria)、枫糖尿症(maple syrup urine disease)、戊二酸血症1型(glutaricacidemia type 1)、氨基甲酰基磷酸合成酶I缺乏症(Carbamoyl phosphate synthetase Ideficiency)、尿黑酸尿症(alcaptonuria)、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(Medium-chainacyl-coenzyme A dehydrogenase deficiency，MCADD)、急性间歇性卟啉症(acuteintermittent porphyria)、莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan syndrome)、类脂先天性肾上腺增生症(lipoid congenital adrenal hyperplasia)、先天性肾上腺增生症(congenitaladrenal hyperplasia)、POMPC缺乏症(POMPC deficiency)、LEPR缺乏症(LEPRdeficiency)、巴尔得–别德尔综合征(Bardet Biedl syndrome)、Alstrome综合征(Alstrome syndrome)、普拉德-威利综合征(Prader-Willi Syndrome)、卡恩斯-塞尔综合征(Kearns-Sayre syndrome)、Zellweger综合征(Zellweger syndrome)、高雪氏病(Gaucher's disease)或尼曼皮克症(Niemann Pick disease)。
本文提供了在有需要的对象中预防或治疗NAFLD、NASH或心血管疾病的方法，该方法包括向对象施用本文所述的肽缀合物。
本文提供了在有需要的对象中预防或治疗短肠综合征(SBS)的方法，该方法包括向对象施用本文所述的肽缀合物。
本文提供了在有需要的对象中预防或治疗炎性肠病(IBD)、炎性肠综合征(IBS)或银屑病的方法，该方法包括向对象施用本文所述的肽缀合物。
本文提供了在有需要的对象中预防或治疗克罗恩病或溃疡性结肠炎的方法，该方法包括向对象施用本文所述的肽缀合物。
本文提供了一种预防或治疗睡眠障碍的方法。
本文提供了一种预防或治疗失神发作的方法。本文提供了一种预防或治疗慢性肾病(例如糖尿病并发症)的方法。本文提供了一种预防或治疗糖尿病性心脏病的方法。本文提供了一种预防或治疗心血管事件的方法。
本文提供了一种在有需要的对象中预防或治疗阿尔茨海默病、帕金森病或亨廷顿病的方法，该方法包括向对象施用本文所述的肽缀合物。
本文提供了一种预防或治疗胃和肠相关病症的方法，诸如治疗具有受损肠功能的新生儿、骨质疏松症和DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介导的病状。作为实例，胃和肠相关病症包括溃疡(ulcer)、胃炎(gastritis)、消化功能紊乱(digestion disorder)、吸收不良综合征(malabsorption syndrome)、短肠综合征(short-gut syndrome)、盲肠综合征(cul-de-sacsyndrome)、炎性肠病(inflammatory bowel disease)、乳糜泻(celiac sprue)(例如由谷蛋白诱导的肠病或麸质过敏症引起)、热带口炎性腹泻(tropical sprue)、低丙球蛋白血症(hypogammaglobulinemia sprue)、肠炎(enteritis)、局限性肠炎(regional enteritis)(克罗恩病Crohn's disease)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、与腹泻相关的肠易激综合征(irritable bowel syndrome associated with diarrhea)、小肠损伤(Smallintestine damage)和短肠综合征(short bowel syndrome)。
本文提供了一种预防或治疗放射性肠炎、感染性或感染后肠炎、以及由于毒性或其他化学治疗剂引起的小肠损伤的方法。这可能需要在化疗或放疗过程之前、同时或之后施用肽缀合物，以减少化疗的副作用如腹泻、腹部绞痛和呕吐，并减少由化疗或放疗导致的肠上皮的结构和功能损伤。
本文提供了一种预防或治疗营养不良，例如诸如消耗综合征恶病质(wastingsyndrome cachexia)和厌食症的病症的方法。
本文提供了一种在有需要的对象中预防或治疗受益于GLP-2受体调节剂的疾病或病症的方法，其包括向对象施用本文所述的肽缀合物。
组合
本文公开了一种包含本文所述的肽缀合物和一种或多种另外的治疗剂的药物组合物。
另外的治疗剂可包含一种或多种其他糖尿病药物(diabetes drugs)、DPP4抑制剂(DPP4 inhibitor)、SGLT2抑制剂(SGLT2 inhibitor)、降血糖药物(hypoglycemic drug)和双胍药物(biguanidine drug)、胰岛素促分泌剂(insulin secretogogue)和磺酰脲药物(sulfonyl urea drug)、TZD药物(TZD drug)、胰岛素(insulin)和胰岛素类似物(insulinanalog)、FGF21和类似物(analog)、瘦素(leptin)或瘦素类似物(leptin analog)、胰淀素(amylin)和胰淀素类似物(amylin analog)、抗炎药(anti-inflammatory drug)、环孢菌素A(cyclosporine A)或FK506、5-ASA或他汀(statin)或其任何组合。另外的治疗剂可以是阿司匹林。
另外的治疗剂可包含治疗性肠促胰岛素(incretin)或其衍生物。肠促胰岛素或其衍生物的非限制性实例包括GLP-1、胰高血糖素、胃泌酸调节素、毒蜥外泌肽-4、GLP-2、GIP及其组合。
组合物
本文公开了包含本文所述的肽缀合物和药学上可接受的赋形剂或媒介物的药物组合物。药学上可接受的赋形剂或媒介物可包括载体(carrier)、赋形剂(excipient)、稀释剂(diluent)、抗氧化剂(antioxidant)、防腐剂(preservative)、着色剂(coloringagent)、调味剂(flavoring agent)和稀释剂(diluting agent)、乳化剂(emulsifyingagent)、悬浮剂(suspending agent)、溶剂(solvent)、填充剂(filler)、膨胀剂(bulkingagent)、缓冲液(buffer)、递送媒介物(delivery vehicle)、张度剂(tonicity agent)、共溶剂(cosolvent)、润湿剂(wetting agent)、络合剂(complexing agent)、缓冲剂(buffering agent)、抗微生物剂(antimicrobial)和表面活性剂(surfactant)。
中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是示例性的合适载体。药物组合物可包括抗氧化剂如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子(salt-forming counterions)如钠；和/或非离子表面活性剂如Tween、普朗尼克类(pluronics)或聚乙二醇(PEG)。还例如，合适的张度增强剂包括碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露醇、山梨醇等。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸等。过氧化氢也可用作防腐剂。合适的助溶剂包括甘油、丙二醇和PEG。合适的络合剂包括咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精。合适的表面活性剂或润湿剂包括脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯80、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal)等。缓冲剂可以是常规缓冲剂，例如乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或Tris-HCl。乙酸盐缓冲液可为约pH 4-5.5，Tris缓冲液可为约pH 7-8.5。其他药剂在麦克出版公司(Mack Publishing Company,1990)出版的A.R.Gennaro编辑的《雷氏药学大全》第18版(Remington's PharmaceuticalSciences，18th Edition，A.R.Gennaro,ed.)中阐述。
组合物可以是液体形式或冻干或冷冻干燥形式，并且可以包括一种或多种冻干保护剂、赋形剂、表面活性剂、高分子量结构添加剂和/或膨胀剂。在一个实施方案中，包括冻干保护剂，它是非还原糖如蔗糖、乳糖或海藻糖。通常包括的冻干保护剂的量使得在重构时，所得制剂将是等渗的，尽管高渗或略微低渗制剂也可能是合适的。此外，冻干保护剂的量应足以防止冻干时蛋白质的不可接受量的降解和/或聚集。预冻干制剂中糖(例如蔗糖、乳糖、海藻糖)的示例性冻干保护剂浓度为约10mM至约400mM。在另一个实施方案中，包括表面活性剂，例如非离子表面活性剂和离子表面活性剂如聚山梨醇酯(polysorbate)(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)；泊洛沙姆(poloxamer)(例如，泊洛沙姆188)；聚(乙二醇)苯基醚(poly(ethylene glycol)phenyl ether)(例如Triton)；十二烷基硫酸钠(sodiumdodecyl sulfate，SDS)；月桂硫酸钠(sodium laurel sulfate)；辛基糖苷钠(sodiumoctyl glycoside)；月桂基磺基甜菜碱(lauryl-sulfobetaine)、肉豆蔻基磺基甜菜碱(myristyl-sulfobetaine)、亚油烯基磺基甜菜碱(linoleyl-sulfobetaine)或硬脂基磺基甜菜碱(stearyl-sulfobetaine)；月桂基肌氨酸(lauryl-sarcosine)、肉豆蔻基肌氨酸(myristyl-sarcosine)、亚油烯基肌氨酸(linoleyl-sarcosine或硬脂基肌氨酸(stearyl-sarcosine)；亚油烯基甜菜碱(linoleyl-betaine)、肉豆蔻基甜菜碱(myristyl-betaine)或鲸蜡基甜菜碱(cetyl-betaine)；月桂酰氨基丙基甜菜碱(lauroamidopropyl-betaine)、椰油酰氨基丙基甜菜碱(cocamidopropyl-betaine)、亚油酰氨基丙基甜菜碱(linoleamidopropyl-betaine)、肉豆蔻酰氨基丙基甜菜碱(myristamidopropyl-betaine)、棕榈酰氨基丙基甜菜碱(palmidopropyl-betaine)或异硬脂酰氨基丙基甜菜碱(isostearamidopropyl-betaine)(例如，月桂酰氨基丙基)；肉豆蔻酰氨基丙基二甲胺(myristamidopropyl-dimethylamine)、棕榈酰氨基丙基二甲胺(palmidopropyl-dimethylamine)或异硬脂酰氨基丙基二甲胺(isostearamidopropyl-dimethylamine)；甲基椰油酰基牛磺酸钠(sodium methyl cocoyl-taurate)或甲基椰油酰基牛磺酸二钠(sodium methyl cocoyl-taurate)；以及MONAQUATTM系列(Mona Industries，Inc.，Paterson,N.J.)、聚乙二醇(polyethyl glycol)、聚丙二醇(polypropyl glycol)以及乙二醇和丙二醇的共聚物(copolymers of ethylene and propylene glycol)(例如普朗尼克类(Pluronics)，PF68等)。可存在于预冻干制剂中的表面活性剂的示例性量为约0.001-0.5％。高分子量结构添加剂(例如，填充剂、粘合剂)可以包括例如阿拉伯树胶(acacia)、白蛋白(albumin)、海藻酸(alginic acid)、磷酸钙(二元)(calcium phosphate(dibasic))、纤维素(cellulose)、羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose)、羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium)、羟乙基纤维素(hydroxyethylcellulose)、羟丙基纤维素(hydroxypropylcellulose)、羟丙基甲基纤维素(hydroxypropylmethylcellulose)、微晶纤维素(microcrystalline cellulose)、葡聚糖(dextran)、糊精(dextrin)、葡聚糖结合剂(dextrate)、蔗糖(sucrose)、纤基乙酸钠(tylose)、预胶化淀粉(pregelatinizedstarch)、硫酸钙(calcium sulfate)、直链淀粉(amylose)、甘氨酸(glycine)、膨润土(bentonite)、麦芽糖(maltose)、山梨醇(sorbitol)、乙基纤维素(ethylcellulose)、磷酸氢二钠(disodium hydrogen phosphate)、磷酸二钠(disodium phosphate)、焦亚硫酸二钠(disodium pyrosulfite)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、明胶(gelatin)、葡萄糖(glucose)、瓜尔胶(guar gum)、液体葡萄糖(liquid glucose)、可压缩糖(compressiblesugar)、硅酸镁铝(magnesium aluminum silicate)、麦芽糖糊精(maltodextrin)、聚环氧乙烷(polyethylene oxide)、聚甲基丙烯酸酯(polymethacrylate)、聚维酮(povidone)、海藻酸钠(sodium alginate)、黄蓍胶(tragacanth)、微晶纤维素(microcrystallinecellulose)、淀粉(starch)和玉米醇溶蛋白(zein)。高分子量结构添加剂的示例性浓度为按重量计0.1-10％。在其他实施方案中，可以包括膨胀剂(例如甘露醇、甘氨酸)。
组合物可适于肠胃外施用。示例性的组合物适于通过技术人员可用的任何途径注射或输注到动物中，例如关节内、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内或病灶内途径。肠胃外制剂通常可以是无菌、无热原、等渗水溶液，任选地含有药学上可接受的防腐剂。
非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液，乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏液或不挥发性油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。一般参见麦克出版社(Mack Eds.,1980)出版的《雷氏药学大全》第16版(Remington's PharmaceuticalScience,16th Ed.)。
本文所述的药物组合物可以以在特定局部环境中提供产品的局部浓度(例如推注、贮库效应)和/或增加的稳定性或半衰期的方式配制用于受控或持续递送。所述组合物可以包括本文公开的肽缀合物的制剂，其具有聚合化合物如聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制剂以及试剂如生物可降解的基质、可注射的微球、微囊颗粒、微胶囊、生物可蚀性颗粒珠、脂质体，以及提供活性剂的受控或持续释放的可植入的递送装置，该活性剂随后可以作为贮库注射剂递送。配制这种持续或受控递送方式的技术是已知的，并且已经开发了多种聚合物并用于药物的受控释放和递送。这样的聚合物通常是生物可降解的和生物相容的。聚合物水凝胶，包括通过对映体聚合物或多肽片段的络合形成的那些，以及具有温度或pH敏感性质的水凝胶，由于涉及捕获生物活性蛋白质试剂(例如，包含超长CDR3的抗体)的温和和水性条件，对于提供药物贮库效应可能是期望的。
根据预期的施用途径、递送形式和所需剂量，可以鉴于本公开内容和制剂技术的一般知识来确定合适的和/或优选的药物制剂。不管施用方式如何，可根据患者体重、体表面积或器官大小计算有效剂量。进一步细化用于确定涉及本文所述的每种制剂的治疗的适当剂量的计算在本领域中是常规进行的，并且在本领域中常规进行的任务的范围内。可以通过使用适当的剂量-反应数据来确定适当的剂量。
定义
如本文和所附权利要求中使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种试剂”包括多种这样的试剂，提及“该细胞”包括提及一种或多种细胞(或提及多个细胞)及其本领域技术人员已知的等价物，等等。当范围在本文中用于物理性质(例如分子量)或化学性质(例如化学式)时，意图包括范围和其中的具体实施方案的所有组合和子组合。当提及数字或数值范围时，术语“约”意指所提及的数字或数值范围是在实验可变性内(或在统计实验误差内)的近似值，并且因此在某些情况下，数字或数值范围将在该数字或数值范围的1％与15％之间变化。术语“包含(comprising)”(和相关术语如“包含(comprise/comprises)”或“具有(having)”或“包括(including)”)不旨在排除在其他某些实施方案中，例如，本文所述的任何物质组合物、组合物、方法或过程等的实施方案“由所述特征组成”或“基本上由所述特征组成”。
如在说明书和所附权利要求中所使用的，除非有相反的说明，否则以下术语具有以下指示的含义。
“烷基”是指直链或支链烃单价基团，其可以是完全饱和的或不饱和的，具有1至约10个碳原子或1至6个碳原子，其中烷基残基的sp3杂化的碳通过单键连接至分子的其余部分。饱和烃单价基团的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基和己基、以及更长的烷基、例如庚基、辛基等。每当其在本文中出现时，数值范围如“C1-C6烷基”意指烷基由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子组成，尽管本定义还涵盖其中未指定数值范围的术语“烷基”的出现。在一些实施方案中，烷基为C1-C10烷基、C1-C9烷基、C1-C8烷基、C1-C7烷基、C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C1-C2烷基或C1烷基。当烷基是指不饱和直链或支链烃单价基时，它被称为“烯基”或“炔基”。烯基可以是关于双键的顺式或反式构象，并且应理解为包括两种异构体。烯基的实例包括但不限于乙烯基(-CH＝CH2)、1-丙烯基(-CH2CH＝CH2)、异丙烯基[-C(CH3)＝CH2]、丁烯基、1,3-丁二烯基等。每当其在本文中出现时，数值范围如“C2-C6烯基”意指烯基可由2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子组成，尽管本定义还涵盖其中未指定数值范围的术语“烯基”的出现。在一些实施方案中，烯基为C2-C10烯基、C2-C9烯基、C2-C8烯基、C2-C7烯基、C2-C6烯基、C2-C5烯基、C2-C4烯基、C2-C3烯基或C2烯基。烯基的实例包括但不限于乙炔基、2-丙炔基、2-等。每当其在本文中出现时，数值范围如“C2-C6炔基”意指炔基可由2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子组成，尽管本定义还涵盖其中未指定数值范围的术语“炔基”的出现。在一些实施方案中，烯基为C2-C10炔基、C2-C9炔基、C2-C8炔基、C2-C7炔基、C2-C6炔基、C2-C5炔基、C2-C4炔基、C2-C3炔基或C2炔基。除非在说明书中另有具体说明，否则烷基任选地如下所述被例如氧代、卤素、氨基、腈、硝基、羟基、卤代烷基、烷氧基、芳基、环烷基、杂环烷基、杂芳基等取代。在一些实施方案中，烷基任选地被氧代、卤素、-CN、-CF3、-OH、-OMe、-NH2或-NO2取代。在一些实施方案中，烷基任选地被氧代、卤素、-CN、-CF3、-OH或-OMe取代。在一些实施方案中，烷基任选地被卤素取代。
“亚烷基”是指直链或支链二价烃链。每当其在本文中出现时，数值范围如“C1-C6亚烷基”意指亚烷基由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子组成，尽管本定义还涵盖其中未指定数值范围的术语“亚烷基”的出现。在一些实施方案中，亚烷基为C1-C10亚烷基、C1-C9亚烷基、C1-C8亚烷基、C1-C7亚烷基、C1-C6亚烷基、C1-C5亚烷基、C1-C4亚烷基、C1-C3亚烷基、C1-C2亚烷基或C1亚烷基。除非说明书中另有具体说明，否则亚烷基可任选地被例如氧代、卤素、氨基、腈、硝基、羟基、卤代烷基、烷氧基、芳基、环烷基、杂环烷基、杂芳基等取代。在一些实施方案中，亚烷基任选地被氧代、卤素、-CN、-CF3、-OH、-OMe、-NH2或-NO2取代。在一些实施方案中，亚烷基任选地被氧代、卤素、-CN、-CF3、-OH或-OMe取代。在一些实施方案中，亚烷基任选地被卤素取代。
“烷氧基”是指式-ORa的基团，其中Ra为如所定义的烷基。除非说明书中另有具体说明，否则烷氧基可任选地被例如氧代、卤素、氨基、腈、硝基、羟基、卤代烷基、烷氧基、芳基、环烷基、杂环烷基、杂芳基等取代。在一些实施方案中，烷氧基任选地被氧代、卤素、-CN、-CF3、-OH、-OMe、-NH2或-NO2取代。在一些实施方案中，烷氧基任选地被氧代、卤素、-CN、-CF3、-OH或-OMe取代。在一些实施方案中，烷氧基任选地被卤素取代。
“芳基”是指衍生自包含氢、6至30个碳原子和至少一个芳环的烃环体系的基团。芳基可以是单环、双环、三环或四环体系，其可以包括稠环(当与环烷基或杂环烷基环稠合时，芳基通过芳环原子键合)或桥环体系。在一些实施方案中，芳基是6-10元芳基。在一些实施方案中，芳基是6元芳基。芳基包括但不限于衍生自亚蒽基、亚萘基、亚菲基、蒽、薁、苯、屈、荧蒽、芴、不对称引达省(as-indacene)、对称引达省(s-indacene)、茚满、茚、萘、非那烯、菲、七曜烯(pleiadene)、芘和苯并菲的烃环体系的芳基。在一些实施方案中，芳基是苯基。除非说明书中另有具体说明，否则芳基可任选地被例如卤素、氨基、腈、硝基、羟基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、烷氧基、芳基、环烷基、杂环烷基、杂芳基等取代。在一些实施方案中，芳基任选地被卤素、甲基、乙基、-CN、-CF3、-OH、-OMe、-NH2或-NO2取代。在一些实施方案中，芳基任选地被卤素、甲基、乙基、-CN、-CF3、-OH或-OMe取代。在一些实施方案中，芳基任选地被卤素取代。
“环烷基”是指稳定的、部分或完全饱和的单环或多环碳环，其可包括稠环(当与芳基或杂芳基环稠合时，环烷基通过非芳族环原子键合)或桥环体系。代表性的环烷基包括但不限于具有3-15个碳原子(C3-C15环烷基)、3-10个碳原子(C3-C10环烷基)、3-8个碳原子(C3-C8环烷基)、3-6个碳原子(C3-C6环烷基)、3-5个碳原子(C3-C5环烷基)或3-4个碳原子(C3-C4环烷基)的环烷基。在一些实施方案中，环烷基是3-6元环烷基。在一些实施方案中，环烷基是5-6元环烷基。单环环烷基包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环环烷基或碳环包括例如金刚烷基、降冰片基、十氢萘基、双环[3.3.0]辛烷、双环[4.3.0]壬烷、顺式-十氢化萘、反式-十氢化萘、双环[2.1.1]己烷、双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷、双环[3.2.2]壬烷和双环[3.3.2]癸烷以及7,7-二甲基-双环[2.2.1]庚烷基。部分饱和的环烷基包括例如环戊烯基、环己烯基、环庚烯基和环辛烯基。除非说明书中另有特别说明，否则环烷基任选地被例如氧代、卤素、氨基、腈、硝基、羟基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、烷氧基、芳基、环烷基、杂环烷基、杂芳基等取代。在一些实施方案中，环烷基任选地被氧代、卤素、甲基、乙基、-CN、-CF3、-OH、-OMe、-NH2或-NO2取代。在一些实施方案中，环烷基任选地被氧代、卤素、甲基、乙基、-CN、-CF3、-OH或-OMe取代。在一些实施方案中，环烷基任选地被卤素取代。
“卤代”或“卤素”是指溴、氯、氟或碘。在一些实施方案中，卤素为氟或氯。在一些实施方案中，卤素为氟。
“卤代烷基”是指被一个或多个如上定义的卤代基团取代的如上定义的烷基，例如三氟甲基、二氟甲基、氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、1,2-二氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1,2-二溴乙基等。
“杂环烷基”是指包含2-23个碳原子和1-8个选自氮、氧、磷和硫的杂原子的稳定的3-24元部分或完全饱和的环基团。代表性的杂环烷基包括但不限于具有2-15个碳原子的杂环烷基(C2-C15杂环烷基)、2-10个碳原子的杂环烷基(C2-C10杂环烷基)、2-8个碳原子的杂环烷基(C2-C8杂环烷基)、2-6个碳原子的杂环烷基(C2-C6杂环烷基)、2-5个碳原子的杂环烷基(C2-C5杂环烷基)或2-4个碳原子的杂环烷基(C2-C4杂环烷基)。在一些实施方案中，杂环烷基是3-6元杂环烷基。在一些实施方案中，杂环烷基是5-6元杂环烷基。除非在说明书中另有具体说明，杂环烷基可以是单环、双环、三环或四环体系，其可以包括稠环(当与芳基或杂芳基环稠合时，杂环烷基通过非芳族环原子键合)或桥环体系；并且杂环烷基中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化；氮原子可以任选地被季铵化。此类杂环烷基的实例包括但不限于吖丙啶基(aziridinyl)、氮杂环丁烷基(azetidinyl)、二氧戊环基(dioxolanyl)、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基(4-piperidonyl)、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫代吗啉基、1-氧代-硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉基、1,3-二氢异苯并呋喃-1-基(1,3-dihydroisobenzofuran-1-yl)、3-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-1-基、甲基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基和2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基。术语杂环烷基还包括碳水化合物的所有环形式，包括但不限于单糖、二糖和寡糖。除非另有说明，杂环烷基在环中具有2-10个碳。应当理解，当提及杂环烷基中的碳原子数时，杂环烷基中的碳原子数与构成杂环烷基(即杂环烷基环的骨架原子)的原子(包括杂原子)的总数不同。部分饱和的杂环烷基包括例如二氢吡咯基或四氢吡啶。除非说明书中另有特别说明，否则杂环烷基任选地被例如氧代、卤素、氨基、腈、硝基、羟基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、烷氧基、芳基、环烷基、杂环烷基、杂芳基等取代。在一些实施方案中，杂环烷基任选地被氧代、卤素、甲基、乙基、-CN、-CF3、-OH、-OMe、-NH2或-NO2取代。在一些实施方案中，杂环烷基任选地被氧代、卤素、甲基、乙基、-CN、-CF3、-OH或-OMe取代。在一些实施方案中，杂环烷基任选地被卤素取代。
“杂烷基”是指烷基基团，其中烷基的一个或多个骨架原子选自除碳以外的原子，例如氧、氮(例如-NH-、-N(烷基)-)、硫或其组合。杂烷基在杂烷基的碳原子处连接至分子的其余部分。在一个方面，杂烷基是C1-C6杂烷基，其中杂烷基包含1-6个碳原子和一个或多个除碳以外的原子，例如氧、氮(例如-NH-、-N(烷基)-)、硫或其组合，其中杂烷基在杂烷基的碳原子处连接至分子的其余部分。除非说明书中另有特别说明，否则杂烷基任选地被例如氧代、卤素、氨基、腈、硝基、羟基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、烷氧基、芳基、环烷基、杂环烷基、杂芳基等取代。在一些实施方案中，杂烷基任选地被氧代、卤素、甲基、乙基、-CN、-CF3、-OH、-OMe、-NH2或-NO2取代。在一些实施方案中，杂烷基任选地被氧代、卤素、甲基、乙基、-CN、-CF3、-OH或-OMe取代。在一些实施方案中，杂烷基任选地被卤素取代。
“杂芳基”是指包含氢原子、1-13个碳原子、1-6个选自氮、氧、磷和硫的杂原子以及至少一个芳环的5-14元环体系基团。杂芳基可以是单环、双环、三环或四环体系，其可以包括稠环(当与环烷基或杂环烷基环稠合时，杂芳基通过芳环原子键合)或桥环体系；并且杂芳基中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化；氮原子可以任选地被季铵化。在一些实施方案中，杂芳基是5-10元杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基是5-6元杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基是5元杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基是6元杂芳基。实例包括但不限于氮杂基(azepinyl)、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二氧杂环庚基、1,4-苯并二噁烷基(benzodioxanyl)、苯并萘并呋喃(benzonaphthofuranyl)、苯并噁唑基、苯并二噁唑基、苯并二噁英基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(苯并苯硫基)、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、肉桂基(cinnolinyl)、二苯并呋喃基、二苯并苯硫基、呋喃基、呋喃酮基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、吲哚啉基、异吲哚啉基、异喹啉基、中氮茚基(indolizinyl)、异噁唑基、萘啶基(naphthyridinyl)、噁二唑基、2-氧氮杂基(2-oxoazepinyl)、噁唑基、环氧乙烷基(oxiranyl)、1-氧化吡啶基、1-氧化嘧啶基、1-氧化吡嗪基、1-氧化哒嗪基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基、蝶啶基(pteridinyl)、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基(quinolinyl)、奎宁环基(quinuclidinyl)、异喹啉基、四唑喹啉基、噻唑基、噻二唑基(thiadiazolyl)、三唑基、四唑基、三嗪基和苯硫基(即噻吩基)。除非说明书中另有特别说明，否则杂芳基任选地被例如卤素、氨基、腈、硝基、羟基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、烷氧基、芳基、环烷基、杂环烷基、杂芳基等取代。在一些实施方案中，杂芳基任选地被卤素、甲基、乙基、-CN、-CF3、-OH、-OMe、-NH2或-NO2取代。在一些实施方案中，杂芳基任选地被卤素、甲基、乙基、-CN、-CF3、-OH或-OMe取代。在一些实施方案中，杂芳基任选地被卤素取代。
术语“同一性百分比”是指两个核酸或氨基酸序列之间的比较。使用本领域已知的任何数量的比对方法测量这种比较，包括但不限于全局(例如，Needleman–Wunsch算法)或局部比对(例如，Smith–Waterman、Sellers或其他算法)。同一性百分比通常是指对于位置的连续部分，两个序列的匹配位置的百分比，其中两个序列以使匹配位置最大化和使非匹配位置的空位(gap)最小化的方式排列。在一些情况下，进行比对，其中在两个序列之间没有空位。在一些情况下，比对导致小于5％的空位、小于3％的空位或小于1％的空位。序列比较或比对的其他方法也与本公开一致。
如本文所用，术语“同源性(homology)”可用于计算两个或更多个氨基酸序列之间的“同源性”或“同源性百分比”，其可以通过出于最佳比较目的比对序列来确定(例如，可在第一序列的序列中引入空位)。然后可以比较相应位置处的氨基酸，并且两个序列之间的百分比同一性可以是序列共有的相同位置的数目的函数(即，同源性％＝相同位置的数量#/位置的总数量#×100)。例如，第一序列中的位置可以被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸占据，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的同源性百分比可以是序列共享的相同位置的数量的函数，考虑到空位的数量和每个空位的长度，其需要被引入以用于两个序列的最佳比对。在一些实施方案中，出于比较目的而比对的序列的长度可以是参考序列长度的至少约30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或95％。
Figure BDA0003781695400000671
搜索可以确定两个序列之间的同源性。同源性可以在两个序列的全长之间或在两个序列的全长的部分之间。这两个序列可以是肽序列、氨基酸序列或其片段。两个序列的实际比较可以通过公知的方法，例如使用数学算法来完成。这种数学算法的非限制性示例可以描述于Karlin,S.和Altschul,S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90-5873-5877(1993)。这种算法可以结合到NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中，描述于Altschul,S.等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)，25:3389-3402(1997)。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如NBLAST)的任何相关参数。例如，用于序列比较的参数可以设置为评分＝100，字长＝12，或者可以改变(例如，W＝5或W＝20)。其他示例包括Myers和Miller、CABIOS(1989)、ADVANCE、ADAM、BLAT和FASTA算法。在另一个实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用例如GCG软件包(英国剑桥Accelrys)中的GAP程序来实现。
“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准或认可的，或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物包括人的。
“药学上可接受的盐”是指药学上可接受的并且具有母体化合物的所需药理学活性的化合物的盐。
“药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂”是指可以与本公开的至少一种抗体一起施用于对象的赋形剂、载体或佐剂，并且当以足以递送治疗量的化合物的剂量施用时，其不破坏其药理学活性并且是无毒的。
“药学上可接受的媒介物”是指与本公开的至少一种抗体一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。
术语如“治疗(treating/treatment/to treat)”或“缓解(alleviating/toalleviate)”等可指：1)治愈、减缓、减轻所诊断的病理病状或病症的症状和/或阻断所诊断的病理病状或病症的进展的治疗措施；和/或2)预防和/或减缓目标病理状况或病症发展的预防或预防性措施。“治疗(treatment)”是指试图改变所治疗的个体或细胞的自然过程的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学过程期间进行。治疗的理想效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状和减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或缓和疾病状态、以及缓解或改善预后。因此，需要治疗的人可包括已经患有这种病症的人；易患这种病症的人；以及要预防这种病症的人。
“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸功能相似的氨基酸类似物(amino acid analogs)和氨基酸模拟物(amino acid mimetics)。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及稍后被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，例如与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物可具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但功能类似于天然存在的氨基酸的化学化合物。
“病症(disorder)”或“疾病(disease)”是指将受益于用本文公开的物质/分子(例如，本文公开的肽缀合物)或方法治疗的病况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所述病症的那些病理状况。
用于治疗目的的“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、啮齿动物(例如小鼠和大鼠)和猴；家畜和农场动物；和动物园动物、运动动物、实验室动物或宠物，例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。在一些实施方案中，哺乳动物选自人、啮齿动物或猴。
“未修饰的肽”是指未修饰的序列(野生型肽)或没有钉合体的修饰序列。
实施例
通过标准固相肽合成(SPPS)技术合成肽并通过HPLC(如所述)纯化。
除非另有说明，否则所有试剂均购自商业供应商(西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)、费希尔公司(Fisher)、奥克伍德公司(Oakwood))并且未经进一步纯化即使用。肽购自合肥赛曼诺生物科技有限公司(Cellmano Biotech Limited(Hefei))、InnoPep(圣地亚哥)，上海楚肽生物科技有限公司(Shanghai Apeptide Co.(Shanghai))或上海德驰生物科学有限公司(Shanghai Dechi Biosciences Co.(Shanghai))。所有涉及空气或水分敏感性试剂或中间体的反应在氮气或氩气的惰性气氛下进行。所用的所有溶剂均为HPLC级。通过LC-MS或通过薄层色谱(TLC)在使用KMnO4的水溶液染色的Merck 50×100mm硅胶60铝片上监测反应。
快速色谱纯化在预填充硅胶柱(40μm，来自Teledyne Isco的
Figure BDA0003781695400000691
Rf)上在
Figure BDA0003781695400000692
Rf(Teledyne Isco)上进行。纯化的最终化合物作为单一和对称峰洗脱(从而证实纯度为≥95％)。
在Shimadzu HPLC上用Phenomenex Luna柱(C18，孔径
Figure BDA0003781695400000701
粒径10μm，250×10.0mm，流速：4mL/min)或在Agilent 1200HPLC上用Phenomenex Luna柱(C18，孔径
Figure BDA0003781695400000702
粒径5μm，150×21.2mm，流速：20mL/min)进行半制备性色谱。
在Bruker400系统上在d6-DMSO、CDCl3或CD3OD中记录1H和13C NMR光谱。化学位移以百万分率(ppm)给出，其中四甲基硅烷作为内标。缩写使用如下：s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，p＝五重峰，m＝多重峰，dd＝双二重峰，br＝宽峰。偶合常数(J值)以赫兹(Hz)给出。在具有Phemomenex Luna Omega C18柱(C18，孔径
Figure BDA0003781695400000703
粒径1.6μm，50×2.1mm，流速：0.4mL/min)的Waters Acquity UPLC上记录低分辨率质谱。溶剂：A-H2O+0.1％甲酸，B-MeCN+0.1％甲酸，梯度：0-1min 10-90％B，1-1.6min 90％B，1.6-1.7min 90-10％B，1.7-2min 10％B。
在配备Aeris Widepore色谱柱(XB-C8，粒径3.6μm，150×2.1mm，流速：0.5mL/min)的Agilent 1200系列精密飞行时间质谱仪(TOF)上记录高分辨率质谱(HRMS)。溶剂：A-H2O+0.1％甲酸，B-MeCN+0.1％甲酸，梯度：0-2min 5％B，2-12min 5-60％B，12-13min 60-80％B，13-14min 80-20％B，14-15min 20-80％B，15-16min 80-20％B，16-17min 20-95％B，17-20min 95％B，20-21min 95-5％B。
用于装载氯三苯甲基氯树脂(chlorotrityl chloride resin)的通用方案A
通过在5mL DMF中混合氨基酸、树脂和DIEA(70μL，400μmol)并搅拌30min，使Fmoc-Lys(ivDde)-OH(60mg，100μmol)与2-氯三苯甲基氯树脂(Novabiochem)(100mg，80μmol)偶联。然后将树脂用DMF(3×)、DCM(3×)洗涤并用CH3OH/DCM/DIEA(8:1:1)处理10min以封闭未反应的三苯甲基氯位点，在真空下干燥并储存在干燥器中。
Fmoc保护基脱保护的通用方案B
向树脂中加入哌啶的DMF溶液(20％)。将混合物振摇5分钟并排出。加入新鲜的20％哌啶，此时将混合物振摇15分钟。观察到茚三酮和/或TNBS试验呈阳性。然后用DMF(3×)、DCM(3×)洗涤树脂。
ivDde保护基脱保护的通用方案C
用DMF和DCM洗涤后，用2％肼的DMF溶液(5mL，2×15min)处理树脂。观察到茚三酮和/或TNBS试验呈阳性。然后用DMF(3×)、DCM(3×)洗涤树脂。
肽偶联的通用方案D
利用偶联剂HATU(3.3当量)和DIEA(3.3当量)的DMF(5mL)溶液，将树脂用指定的羧酸衍生物(3当量)处理2h或重复直到观察到茚三酮和/或TNBS测试为阴性。然后用DMF(3×)、DCM(3×)洗涤树脂。
用于树脂上溴乙酰化的通用方案E
然后将树脂用溴代乙酸酐(2.4当量)和DIEA(2.6当量)的200mL的DCM溶液处理30分钟。
用于从氯三苯甲基氯树脂裂解肽的通用方案F
用DCM(3×)洗涤树脂，使用5mL含有10％H2O和10％三异丙基硅烷的10％TFA的DCM溶液将产物从树脂上裂解1h。
实施例1：L1的合成
Figure BDA0003781695400000711
在0℃下向1,4-二氨基丁烷(80μL，0.795mmol，1当量)的DCM(10mL)溶液中加入DIEA(276μL，1.59mmol，2当量)，随后加入溶解于1mL DCM中的溴代乙酸酐(413g，1.59mmol，2当量)。然后将反应混合物在0℃搅拌30分钟，在室温搅拌1.5h，并除去溶剂。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到白色固体L1(162mg，0.49mmol，61％)。MS(ES+)m/z 331.0([M+H]+)。1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ3.94(s,4H),3.40-3.30(m,4H),1.68(p,J＝3.5Hz,4H)。
实施例2：L1B的合成
Figure BDA0003781695400000721
在0℃下向1,2-乙二胺(30μL，0.448mmol，1当量)的DCM(5mL)溶液中加入DIEA(172μL，0.985mmol，2.2当量)，随后加入溶解于1mL DCM中的溴代乙酸酐(233mg，0.897mmol，2当量)。然后将反应混合物在0℃搅拌30分钟，在室温搅拌1.5h，并除去溶剂。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到白色固体L1B(43.9mg，0.145mmol，32％)。MS(ES+)m/z 302.55([M+H]+),304.54([M+H]+)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ2.49(s,4H),2.06(s,4H)。
实施例3：L1C的合成
Figure BDA0003781695400000722
在0℃下向1,3-二氨基丙烷(30μL，0.359mmol，1当量)的DCM(5mL)溶液中加入DIEA(138μL，0.789mmol，2.2当量)，随后加入溶解于1mL DCM中的溴代乙酸酐(186mg，0.718mmol，2当量)。然后将反应混合物在0℃搅拌30分钟，在室温搅拌1.5h，并除去溶剂。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到白色固体L1C(60.8mg，0.19mmol，53％)。MS(ES+)m/z316.32([M+H]+),318.6([M+H]+)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ3.86(s,4H),3.27(t,J＝6.8Hz,4H),1.74(p,J＝6.8Hz,2H)。
实施例4：L1D的合成
Figure BDA0003781695400000723
在0℃下向1,7-二氨基己烷(65mg，0.499mmol，1当量)的DCM(15mL)溶液中加入DIEA(208μL，1.197mmol，2.4当量)，随后加入溶解于1mL DCM中的溴代乙酸酐(259mg，0.998mmol，2当量)。然后将反应混合物在0℃搅拌30分钟，在室温搅拌1.5h，并除去溶剂。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到白色固体L1D(120mg，0.322mmol，64％)。MS(ES+)m/z372.71([M+H]+),374.70([M+3H]+)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.55(s,2H),3.91(s,4H),3.30(q,J＝7.1Hz,4H),1.56(p,J＝7.1Hz,4H),1.45-1.29(m,6H)。
实施例5：L1E的合成
Figure BDA0003781695400000731
在0℃下向1,11-二氨基十一烷(48mg，0.257mmol，1当量)的DCM(10mL)溶液中加入DIEA(108μL，0.616mmol，2.4当量)，随后加入溶解于1mL DCM中的溴代乙酸酐(134mg，0.515mmol，2当量)。然后将反应混合物在0℃搅拌30分钟，在室温搅拌1.5h，并除去溶剂。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到白色固体L1E(62.3mg，0.145mmol，56％)。MS(ES+)m/z428.33([M+H]+)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.53(s,2H),3.91(s,4H),3.30(q,J＝6.8Hz,4H),1.57(q,J＝7.2Hz,4H),1.42-1.20(m,14H)。
实施例6：L1F的合成
Figure BDA0003781695400000732
在0℃下向尸胺(48mg，0.257mmol，1当量)的DCM(20mL)溶液中加入DIEA(284μL，1.63mmol，2.4当量)，随后加入溶解于1mL DCM中的溴代乙酸酐(353mg，1.36mmol，2当量)。然后将反应混合物在0℃搅拌30分钟，在室温搅拌1.5h，并除去溶剂。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到白色固体L1F(156mg，0.453mmol，66％)。MS(ES+)m/z 344.65([M+H]+),346.64([M+H]+)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ3.83(s,4H),3.23(q,J＝6.8Hz,4H),1.57(p,J＝7.2Hz,4H),1.44-1.33(m,2H)。
实施例7：L1G的合成
Figure BDA0003781695400000741
中间体L1Ga
在0℃下向双(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(167mg，0.82mmol，1当量)的DCM(20mL)溶液中加入DIEA(342μL，11.96mmol，2.4当量)，随后加入溶解于1mL DCM中的溴代乙酸酐(426mg，1.64mmol，2当量)。然后将反应混合物在0℃搅拌30分钟，在室温搅拌1.5h，并除去溶剂。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到白色固体L1Ga(289mg，0.65mmol，79％)。MS(ES+)m/z 445.71([M+H]+),447.7([M+H]+)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ3.85(s,4H),3.39(s,9H),1.50(s,10H)。
L1G
将化合物L1Ga(20mg)溶于TFA/DCM(1:1，v/v，2mL)中，在室温下搅拌30分钟并蒸发(与己烷共蒸发)，得到油状化合物L1G。将产物直接用于其他步骤。MS(ES+)m/z 345.2([M+H]+)。
实施例8：L3的合成
Figure BDA0003781695400000742
中间体L3a
将肉豆蔻酸(184mg,0.805mmol,1当量)溶于4mL DMF中。加入HATU(321mg，0.845mmol，1.1当量)和DIEA(154μL，0.885mmol，1.1当量)，然后加入Boc-NH-PEG2-COOH(200mg，0.805mmol，1当量)。然后将反应混合物搅拌1.5h，并除去溶剂。将产物溶于EtOAc中。将有机层依次用1M HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到所需的白色固体化合物L3a(254mg，0.55mmol，69％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ3.66-3.54(m,8H),3.49(q,J＝5.2Hz,2H),3.35(d,J＝6.1Hz,2H),2.20(t,J＝7.7Hz,2H),1.63-1.58(m,2H),1.47(s,8H),1.33-1.24(m,21H),0.90(t,J＝6.9Hz,3H)。tR＝2.21min(Agilent)。MS(ES+)m/z 459.6([M+H]+)
中间体L3b
将化合物L3a(242mg，0.527mmol，1当量)的DCM(2mL)溶液用TFA(2mL)处理30分钟。将混合物浓缩，与己烷共蒸发。向溶于DMF(5mL)中的BocNH-PEG2-CO2H(146mg，0.527mol，1当量)的溶液中加入HATU(224mg，0.59mmol，1.1当量)。将脱保护的化合物L3a和DIEA(183μL，1.05mmol，2当量)的DMF溶液加入到反应混合物中。将反应混合物在室温下搅拌2h。用EtOAc稀释产物。将有机层依次用1M HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到所需的油状化合物L3b(129mg，0.209mmol，40％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.76(s,1H),6.19(s,1H),5.29(s,1H),3.76(t,J＝5.8Hz,2H),3.69-3.62(m,8H),3.57(dt,J＝12.3,5.0Hz,6H),3.48(dt,J＝10.4,5.5Hz,4H),3.33(s,2H),2.51(t,J＝5.8Hz,2H),2.20(t,J＝7.0Hz,2H),1.90-1.75(m,4H),1.64(p,J＝7.3Hz,2H),1.46(s,9H),1.33-1.22(m,17H)。
中间体L3c
将化合物L3b(129mg，0.209mmol，1当量)的DCM(2mL)溶液用TFA(2mL)处理30分钟。将混合物浓缩，与己烷共蒸发。向溶于DMF(5mL)中的Boc-Orn(Boc)-OH(69mg，0.209mmol，1当量)的溶液中加入HATU(88mg，0.23mmol，1.1当量)。将脱保护的化合物L3b和DIEA(73μL，0.419mmol，2当量)的DMF溶液加入到反应混合物中。将反应混合物在室温下搅拌2h。用EtOAc稀释产物。将有机层依次用1M HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到所需的油状化合物L3c(137mg，0.164mmol，78％)。tR＝4.07min(Agilent)。MS(ES+)m/z832.9([M+H]+)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.12(s,1H),6.80(s,1H),6.30(s,1H),4.87(s,1H),3.85-3.73(m,2H),3.68-3.61(m,7H),3.58(p,J＝6.1,5.5Hz,7H),3.53-3.36(m,6H),3.29-3.00(m,2H),2.51(t,J＝5.8Hz,2H),2.20(t,J＝7.7Hz,2H),2.00-1.74(m,6H),1.71-1.51(m,5H),1.45(s,18H),1.35-1.22(m,21H)。
L3
将化合物L3c(137mg，0.165mmol，1当量)的DCM(2mL)溶液用TFA(2mL)处理30分钟。将混合物浓缩，与己烷共蒸发并溶解于10mL DCM中并在0℃下冷却。加入DIEA(115μL，0.66mmol，4当量)，然后加入溶解于1mL DCM中的溴代乙酸酐(85.8g，0.33mmol，2当量)。然后将反应混合物在0℃搅拌30分钟，在室温搅拌1.5h，并除去溶剂。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到白色固体L3(56mg，0.064mmol，39％)。tR＝3.4min(Agilent)。MS(ES+)m/z 872.4([M+H]+),874.3([M+H]+)。
实施例9：L4的合成
Figure BDA0003781695400000771
中间体L4a
向溶解于DMF(5mL)的Boc-Orn(Boc)-OH(595mg，1.79mmol，1当量)的溶液中加入溶解于1mL DMF中的HATU(750mg，1.79mmol，1.1当量)、DIEA(343μL，1.97mmol，1.1当量)和胺-PEG3-N3(391mg，1.79mmol，1当量)。将反应混合物在室温下搅拌16h。用EtOAc稀释产物。将有机层依次用1M HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到所需的油状化合物L4a(558mg，1.05mmol，58％)。MS(ES+)m/z 533.13([M+H]+)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.82(s,1H),5.25(d,J＝8.3Hz,1H),4.75(s,1H),4.19(s,1H),3.76-3.60(m,10H),3.57(t,J＝5.1Hz,2H),3.43(t,J＝4.6Hz,2H),3.30-3.19(m,1H),3.18-3.03(m,1H),1.85(s,4H),1.68-1.49(m,2H),1.45(s,18H)。
中间体L4b
在氩气下向化合物L4a(548mg，1.02mmol，1当量)的无水MeOH(10mL)溶液中加入Pd/C(10.9mg，0.102mmol，0.1当量)且用H2置换氩气。将反应混合物在室温下搅拌6h，在硅藻土上过滤并蒸发，得到油状化合物L4b(516mg，1.02mmol，定量)。产物无需进一步纯化即可使用。
中间体L4c
向溶解于DMF(5mL)的十八烷二酸单叔丁酯(370mg，1.02mmol，1当量)的溶液中加入溶解于1mL DMF中的HATU(387mg，1.02mmol，1.1当量)、DIEA(186μL，1.07mmol，2当量)和化合物L4b(516mg，1.02mmol，1当量)。将反应混合物在室温下搅拌3h。用EtOAc稀释产物。将有机层依次用1M HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到所需的油状化合物L4c(697mg，0.81mmol，79％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.94(s,1H),6.42(s,1H),4.81(s,1H),4.20(s,1H),3.65(d,J＝6.7Hz,8H),3.59(dt,J＝9.7,5.1Hz,4H),3.51-3.35(m,4H),3.31-3.18(m,1H),3.17-3.06(m,1H),2.20(q,J＝8.0Hz,4H),1.87(s,4H),1.71-1.53(m,6H),1.45(s,26H),1.26(s,24H)。
L4
将L4c(422mg，0.49mmol，1当量)的DCM(2mL)溶液用TFA(2mL)处理30分钟。将混合物浓缩，与己烷共蒸发并溶解于20mL DCM中并在0℃下冷却。加入DIEA(327μL，1.96mmol，4当量)，然后加入溶解于1mL DCM中的溴代乙酸酐(254mg，0.98mmol，2当量)。然后将反应混合物在0℃搅拌30分钟，在室温搅拌1.5h，并除去溶剂。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到白色固体L4(53mg，0.063mmol，12％)。MS(ES+)m/z 845.08([M+H]+),847.07([M+H]+)1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ3.68-3.60(m,8H),3.54(td,J＝5.4,3.4Hz,4H),3.43-3.35(m,4H),3.30-3.16(m,2H),2.27(t,J＝7.5Hz,2H),2.17(t,J＝7.6Hz,2H),1.86-1.73(m,1H),1.72-1.45(m,8H),1.37-1.19(m,28H)。
实施例10：L4A的合成
Figure BDA0003781695400000791
中间体L4Aa
在0℃向双(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(500mg，2.45mmol，1当量)和DIEA(1.02mL，5.88mmol，2当量)的DCM(20mL)溶液中逐滴加入溴代乙酸酐(1.31g，5.04mmol，2.05当量，1mL DCM溶液)。将反应混合物在0℃搅拌30分钟，在RT搅拌2h并在真空中蒸发。通过快速色谱法纯化得到油状产物(883mg，81％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ1.50(s,9H),3.39(s,8H),3.85(s,4H)。tR＝1.04min.MS(ES+)m/z 445.71/447.70([M+H]+)。
中间体L4Ab
将化合物L4Aa(1当量)的DCM/TFA(1:1，v/v)溶液在室温下搅拌30分钟并且在真空中浓缩(与庚烷共蒸发)。化合物L4Ab无需纯化直接用于其他步骤。tR＝0.58min.MS(ES+)m/z345.65/347.67([M+H]+)。
中间体L4Ac
向琥珀酸单叔丁酯(1.05当量)的DMF溶液中加入HATU(1.05当量)。将反应混合物在室温下搅拌5分钟。将化合物L4Ab和DIEA(4当量)溶解于DMF(1mL)中并添加至反应混合物中。将反应物在室温下搅拌过夜并用AcOEt稀释。将有机相用HCl 1N、饱和NaHCO3溶液洗涤，用MgSO4干燥并蒸发。通过快速色谱法纯化得到油状产物。tR＝1.07min.MS(ES+)m/z501.52/503.80([M+H]+)。
中间体L4Ad
将化合物L4Ac(1当量)的DCM/TFA(1:1，v/v)溶液在室温下搅拌30分钟并且在真空中浓缩(与庚烷共蒸发)。化合物L4Ad无需纯化直接用于其他步骤。tR＝0.57min.MS(ES+)m/z445.71/447.73([M+H]+)。
中间体L4Ae
将十八烷二酸单叔丁酯酸(200mg，0.54mmol，1当量)溶于5mL DMF中。加入HATU(225mg，0.59mmol，1.1当量)和DIEA(103μL，0.59mmol，1.1当量)，然后加入Boc-NH-PEG3-NH2(157.8g，0.54mmol，1当量)。然后将反应混合物搅拌3h，并除去溶剂。将产物溶于EtOAc中。将有机层依次用饱和NaHCO3、1M HCl和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到所需的白色固体产物L4Ae(281mg，0.43mmol，81％)。MS(ES+)m/z645.5([M+H]+)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ3.76-3.61(m,8H),3.63-3.54(m,4H),3.48(q,J＝5.1Hz,2H),3.34(s,2H),2.20(dt,J＝9.8,7.6Hz,4H),1.67-1.55(m,4H),1.49-1.44(m,17H),1.30(s,6H),1.30-1.24(m,19H)。
L4A
将化合物L4Ae的DCM溶液用TFA处理30分钟。将混合物浓缩，与庚烷共蒸发，溶解于DMF中并添加至化合物L4Ad、HATU和DIEA的DMF溶液中。将反应混合物搅拌3h并通过半制备型HPLC纯化，得到所需产物L4A。
实施例11：L5的合成
Figure BDA0003781695400000811
通用方案A、B、D(十八烷二酸单叔丁酯)；C、D(Fmoc-PEG2-丙酸)；B、D(Fmoc-PEG2-丙酸)；B、D(Fmoc-Orn(Fmoc)-OH)；B、E、F。
通过具有质量检测的半制备型HPLC纯化粗产物，得到白色固体产物L5(73mg，0.065mmol，11％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.36(td,J＝8.9,5.1Hz,2H),3.89(q,J＝11.4Hz,2H),3.82(s,2H),3.74(t,J＝6.2Hz,2H),3.60(s,4H),3.54(t,J＝5.5Hz,2H),3.37(q,J＝5.2Hz,2H),3.29-3.11(m,5H),2.44(t,J＝6.2Hz,2H),2.26(dt,J＝12.3,7.5Hz,4H),1.89-1.77(m,2H),1.76-1.49(m,10H),1.48-1.38(m,2H),1.37-1.25(m,25H)。
实施例12：L5A的合成
Figure BDA0003781695400000812
中间体L5Aa
在-40℃下在N2下将Fmoc-OSu(131g，388mmol)的DCM(200mL)溶液滴加到二亚乙基三胺(20g，194mmol)的DCM(200mL)溶液中，搅拌2h。LCMS显示反应完成。溶液中的粗产物不经纯化直接用于下一步骤。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.88(d,J＝7.6Hz,4H),7.68(d,J＝7.6Hz,4H),7.43-7.24(m,10H),4.30(d,J＝6.4Hz,4H),4.21(d,J＝6.4Hz,2H),3.06(d,J＝5.6Hz,4H),2.57(d,J＝7.6Hz,4H)。MS(ES+)m/z 548.2([M+H]+)。
中间体L5Ab
向化合物L5Aa(106g，194mmol)的DCM(400mL)溶液中加入DMAP(4.74g，38.8mmol)和四氢呋喃-2,5-二酮(67.9g，678mmol)，在25℃搅拌14h。LCMS显示反应完成。向反应混合物中加入1N HCl直至pH＝5-6，搅拌15分钟，分离有机相，然后将有机相用水和饱和NaCl(500mL)洗涤，并将水相用DCM(500mL)萃取两次。合并的DCM经无水Na2SO4干燥，真空浓缩。粗产物通过硅胶柱色谱法纯化，使用DCM/MeOH(80:0-5:1)作为洗脱剂，得到白色固体粉末状化合物L5Ab(57.6g，45％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.09(s,1H),7.87(d,J＝7.5Hz,4H),7.66(d,J＝7.0Hz,4H),7.23-7.48(m,10H),4.24-4.33(m,4H),4.14-4.22(m,2H),3.27(s,4H),2.95-3.19(m,4H),2.37-2.44(m,4H)。MS(ES+)m/z 648.2([M+H]+)。
L5A
通用方案A、B、D(十八烷二酸单叔丁酯)；C、D(Fmoc-PEG2-丙酸)；B、D(Fmoc-PEG2-丙酸)；B、D(化合物L5Ab)；B、E、F。
粗产物通过HPLC纯化，得到白色固体产物L5A(5.2g，11％收率)。MS(ES+)m/z1188.5([M+H]+)。
实施例13：L6的合成
Figure BDA0003781695400000831
中间体L6a
将棕榈酸(235mg,0.919mmol,1.05当量)溶于4mL DMF中。加入HATU(349mg，0.919mmol，1.1当量)和DIEA(167μL，0.963mmol，1.1当量)，然后加入Boc-NH-PEG2-NH2(200mg，0.875mmol，1当量)。然后将反应混合物搅拌2h，并除去溶剂。将产物溶于EtOAc中。将有机层依次用1M HCl、饱和NaHCO3、HCl和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩得到所需的白色固体化合物L6a(412mg，0.84mmol，97％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.17(s,1H),5.07(s,1H),3.58(s,4H),3.53(t,J＝5.0Hz,3H),3.43(q,J＝5.3Hz,2H),3.36-3.21(m,2H),2.15(t,J＝7.5Hz,2H),1.66-1.54(m,2H),1.32-1.15(m,26H),0.84(t,J＝6.6Hz,3H)。
中间体L6b
将化合物L6a(412mg，0.84mmol，1当量)的DCM(2mL)溶液用TFA(2mL)处理30分钟。将混合物浓缩，与己烷共蒸发。向溶解于DMF(5mL)的BocNH-PEG2-CO2H(258mg，0.931mmol，1.1当量)的溶液中加入HATU(353mg，0.931mmol，1.1当量)。将脱保护的化合物L6a和DIEA(294μL，1.69mmol，2当量)的DMF溶液加入到反应混合物中。将反应混合物在室温下搅拌2h。用EtOAc稀释产物。将有机层依次用1M HCl、饱和NaHCO3、HCl和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到所需的油状化合物L6b(329mg，0.51mmol，60％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.79(s,1H),6.28(s,1H),5.28(s,1H),3.68(t,J＝5.8Hz,2H),3.61-3.44(m,14H),3.38(p,J＝5.6Hz,4H),3.24(q,J＝5.5Hz,2H),2.42(t,J＝5.8Hz,2H),2.11(t,J＝7.9Hz,2H),1.55(p,J＝7.2Hz,2H),1.38(s,9H),1.32-1.10(m,24H),0.81(t,J＝6.7Hz,3H)。
中间体L6c
将化合物L6b(329mg，0.51mmol，1当量)的DCM(2mL)溶液用TFA(2mL)处理30分钟。将混合物浓缩，与己烷共蒸发。向溶解于DMF(5mL)的Boc-Orn(Boc)-OH(186mg，0.56mmol，1.1当量)的溶液中加入HATU(213mg，0.56mmol，1.1当量)。将脱保护的化合物L6b和DIEA(177μL，1.02mmol，2当量)的DMF溶液加入到反应混合物中。将反应混合物在室温下搅拌2h。用EtOAc稀释产物。将有机层依次用饱和NaHCO3、1M HCl和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到所需的油状化合物L6c(326mg，0.37mmol，94％)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.18(s,1H),6.92(s,1H),6.48(s,1H),5.61(d,J＝8.4Hz,1H),5.08(t,J＝5.9Hz,1H),4.13(s,1H),3.73-3.65(m,2H),3.59-3.44(m,14H),3.42-3.29(m,8H),3.19-2.86(m,2H),2.42(t,J＝5.9Hz,2H),2.10(d,J＝7.3Hz,2H),1.78-1.63(m,1H),1.60-1.40(m,5H),1.35(s,18H),1.26-1.09(m,22H),0.80(t,J＝6.7Hz,3H)。
L6
将化合物L6c(100mg，0.116mmol，1当量)的DCM(2mL)溶液用TFA(2mL)处理30分钟。将混合物浓缩，与己烷共蒸发并溶解于10mL DCM中并在0℃下冷却。加入DIEA(80.8μL，0.46mmol，4当量)，然后加入溶解于1mL DCM中的溴代乙酸酐(61.9mg，0.238mmol，2.05当量)。然后将反应混合物在0℃搅拌30分钟，在室温搅拌1.5h，并除去溶剂。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到白色固体L6(50.1mg，0.055mmol，40％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.39(dd,J＝8.4,5.5Hz,1H),3.91(q,J＝11.4Hz,2H),3.84(s,2H),3.76(t,J＝6.2Hz,2H),3.63(d,J＝7.1Hz,8H),3.57(q,J＝5.5Hz,6H),3.43-3.36(m,6H),3.25(t,J＝13.9,6.8Hz,2H),2.49(t,J＝6.2Hz,2H),2.21(t,J＝7.5Hz,2H),1.91-1.79(m,1H),1.75-1.53(m,5H),1.42-1.25(m,24H),0.92(t,J＝6.7Hz,3H)。
实施例14：L7的合成
Figure BDA0003781695400000851
中间体L7a
将硬脂酸(261mg,0.919mmol,1.05当量)溶于4mL DMF中。加入HATU(349mg，0.919mmol，1.1当量)和DIEA(167μL，0.963mmol，1.1当量)，然后加入Boc-NH-PEG2-NH2(200mg，0.875mmol，1当量)。然后将反应混合物搅拌2h，并除去溶剂。将产物溶于EtOAc中。将有机层依次用1M HCl、饱和NaHCO3、和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩得到所需的白色固体化合物L7a(430mg,0.83mmol,95％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ3.69-3.59(m,4H),3.56(t,J＝5.1Hz,4H),3.46(q,J＝5.2Hz,2H),3.40-3.23(m,2H),2.18(t,J＝7.6Hz,2H),1.62(t,J＝7.3Hz,2H),1.45(s,9H),1.35-1.19(m,30H),0.88(t,J＝6.7Hz,4H)。
中间体L7b
将化合物L7a(426mg，0.87mmol，1当量)的DCM(2mL)溶液用TFA(2mL)处理30分钟。将混合物浓缩，与己烷共蒸发。向溶解于DMF(5mL)的BocNH-PEG2-CO2H(266mg，0.96mmol，1.1当量)的溶液中加入HATU(366mg，0.96mmol，1.1当量)。将脱保护的化合物L7a和DIEA(304μL，1.75mmol，2当量)的DMF溶液加入到反应混合物中。将反应混合物在室温下搅拌2h。用EtOAc稀释产物。将有机层依次用1M HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到所需的油状化合物L7b(360mg，0.53mmol，61％)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ6.75(s,1H),6.18(s,1H),5.26(s,1H),3.75(t,J＝5.8Hz,2H),3.69-3.52(m,14H),3.47(p,J＝5.4Hz,4H),3.33(q,J＝5.5Hz,2H),2.50(t,J＝5.8Hz,2H),2.19(t,J＝7.5Hz,2H),2.07(s,1H),1.63(p,J＝7.3Hz,2H),1.46(s,9H),1.37-1.19(m,29H),0.89(t,J＝6.7Hz,3H)。
中间体L7c
将化合物L7b(360mg，0.53mmol，1当量)的DCM(2mL)溶液用TFA(2mL)处理30分钟。将混合物浓缩，与己烷共蒸发。向溶解于DMF(5mL)的Boc-Orn(Boc)-OH(195mg，0.58mmol，1.1当量)的溶液中加入HATU(223mg，0.58mmol，1.1当量)。将脱保护的化合物L7b和DIEA(186μL，1.07mmol，2当量)的DMF溶液加入到反应混合物中。将反应混合物在室温下搅拌2h。用EtOAc稀释产物。将有机层依次用1M HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到所需的油状化合物L7c(373mg，0.42mmol，78％)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ7.14(s,1H),6.84(s,1H),6.35(s,1H),5.53(d,J＝8.2Hz,1H),5.05-4.88(m,1H),4.20(s,1H),3.82-3.69(m,2H),3.65-3.31(m,22H),3.23-3.00(m,2H),2.48(t,J＝5.8Hz,2H),2.17(t,J＝7.8Hz,2H),1.87-1.72(m,1H),1.67-1.48(m,5H),1.42(s,18H),1.34-1.14(m,29H),0.87(t,J＝6.9Hz,3H)。
L7
将化合物L7c(100mg，0.112mmol，1当量)的DCM(2mL)溶液用TFA(2mL)处理30分钟。将混合物浓缩，与己烷共蒸发并溶解于10mL DCM中并在0℃下冷却。加入DIEA(78μL，0.44mmol，4当量)，然后加入溶解于1mL DCM中的溴代乙酸酐(62mg，0.24mmol，2.05当量)。然后将反应混合物在0℃搅拌30分钟，在室温搅拌1.5h，并除去溶剂。将产物溶于EtOAc中。将有机层依次用1M HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到白色固体L7(95mg，0.10mmol，91％)。MS(ES+)m/z 931.31([M+H]+),933.25([M+H]+)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.39(dd,J＝8.5,5.4Hz,1H),3.91(q,J＝11.3Hz,2H),3.84(s,2H),3.76(t,J＝6.2Hz,2H),3.63(d,J＝7.0Hz,8H),3.57(t,J＝5.5Hz,6H),3.42-3.35(m,6H),3.31-3.13(m,4H),2.49(t,J＝6.2Hz,2H),2.20(t,J＝7.4Hz,2H),1.91-1.79(m,1H),1.75-1.56(m,6H),1.39-1.26(m,26H),0.92(t,J＝6.3Hz,3H)。
实施例15：L8的合成
Figure BDA0003781695400000871
通用方案A、B、D(十六烷二酸单叔丁酯)；C、D(Fmoc-PEG2-丙酸)；B、D(Fmoc-PEG2-丙酸)；B、D(Fmoc-Orn(Fmoc)-OH)；B、E、F。
通过具有质量检测的半制备型HPLC纯化粗产物，得到白色固体产物L8(42.6mg，0.038mmol，22％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.38(td,J＝8.6,5.1Hz,2H),3.91(q,J＝11.3Hz,2H),3.84(s,2H),3.76(q,J＝6.1Hz,4H),3.65-3.59(m,8H),3.56(td,J＝5.5,1.7Hz,4H),3.43-3.37(m,4H),3.31-3.16(m,4H),2.48(dt,J＝15.7,6.2Hz,4H),2.28(dt,J＝12.6,7.5Hz,4H),1.95-1.79(m,1H),1.77-1.51(m,10H),1.49-1.41(m,2H),1.40-1.26(m,31H)。
实施例16：L9的合成
Figure BDA0003781695400000881
通用方案A、B、D(十七烷二酸单叔丁酯)；C、D(Fmoc-PEG2-丙酸)；B、D(Fmoc-PEG2-丙酸)；B、D(Fmoc-Orn(Fmoc)-OH)；B、E、F。
通过具有质量检测的半制备型HPLC纯化粗产物，得到白色固体状产物L9(49mg，0.089mmol，9％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.45-4.33(m,2H),3.92(t,J＝10.9Hz,2H),3.85(d,J＝1.1Hz,2H),3.77(q,J＝6.0Hz,4H),3.63(s,8H),3.57(t,J＝5.6Hz,4H),3.40(t,J＝5.5Hz,4H),3.25(dq,J＝22.7,6.7Hz,4H),2.48(dt,J＝15.6,6.2Hz,4H),2.29(dt,J＝13.2,7.4Hz,4H),1.95-1.79(m,2H),1.80-1.50(m,10H),1.51-1.41(m,2H),1.40-1.27(m,20H)。
实施例17：L12的合成
Figure BDA0003781695400000882
通用方案A、B、D(十八烷二酸)；C、D(Fmoc-PEG2-丙酸)；B、D(Fmoc-Orn(Fmoc)-OH)；B、E、F。
通过具有质量检测的半制备型HPLC纯化粗产物，得到白色固体产物L12(51.7mg，0.054mmol，3％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.39(td,J＝9.2,5.1Hz,2H),3.92(qd,J＝11.4,1.2Hz,2H),3.85(s,2H),3.76(t,J＝6.2Hz,2H),3.63(s,4H),3.57(t,J＝5.5Hz,2H),3.40(q,J＝5.1Hz,2H),3.30-3.12(m,6H),2.47(t,J＝6.1Hz,2H),2.29(dt,J＝12.1,7.4Hz,4H),1.95-1.77(m,2H),1.78-1.50(m,10H),1.48-1.40(m,2H),1.39-1.26(m,22H)。
实施例18：L14的合成
Figure BDA0003781695400000891
中间体L14a
向溶解于DMF(5mL)的十六烷二酸单叔丁酯(102mg，0.30mmol，1当量)的溶液中加入溶解于1mL DMF中的HATU(125mg，0.33mmol，1.1当量)、DIEA(51μL，0.33mmol，1.1当量)和化合物L4b(151.9mg，0.3mmol，1当量)。将反应混合物在室温下搅拌3h。用EtOAc稀释产物。将有机层依次用1M HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到所需的油状化合物L14a(147mg，0.176mmol，59％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.87(s,1H),6.40(s,1H),5.32(s,2H),4.79(s,1H),4.20(s,1H),3.66(d,J＝7.0Hz,8H),3.60(dt,J＝10.0,5.1Hz,4H),3.49-3.45(m,3H),3.31-3.18(m,1H),3.13-3.06(m,1H),2.21(td,J＝7.8,6.0Hz,4H),1.88-1.78(m,1H),1.66-1.53(m,7H),1.51-1.42(m,27H),1.36-1.19(m,20H)。
L14
将化合物L14a(40mg，0.048mmol，1当量)的DCM(2mL)溶液用TFA(2mL)处理30分钟。将混合物浓缩，与己烷共蒸发并溶解于20mL DCM中并在0℃下冷却。加入DIEA(34μL，0.1924mmol，4当量)，然后加入溶解于1mL DCM中的溴代乙酸酐(23.63mg，0.098mmol，2.05当量)。然后将反应混合物在0℃搅拌30分钟，在室温搅拌1.5h，并除去溶剂。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到白色固体L14(18.3mg，0.022mmol，46％)。MS(ES+)m/z 817.1([M+H]+),819.09([M+H]+)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.38(dd,J＝8.4,5.5Hz,1H),3.92(q,J＝11.2,10.6Hz,2H),3.84(s,2H),3.69-3.61(m,8H),3.56(td,J＝5.5,2.6Hz,4H),3.44-3.36(m,4H),3.30-3.14(m,2H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),2.21(t,J＝7.5Hz,2H),1.91-1.78(m,1H),1.76-1.67(m,1H),1.67-1.54(m,6H),1.40-1.29(m,20H)。
实施例19：L15的合成
Figure BDA0003781695400000901
中间体L15a
向溶解于DMF(5mL)的20-(叔丁氧基)-20-氧代二十烷酸(360mg，0.90mmol，1.05当量)的溶液中加入溶解于1mL DMF中的HATU(343mg，0.90mmol，1.05当量)、DIEA(300μL，1.71mmol，2当量)和化合物L4b(435mg，0.858mmol，1当量)。将反应混合物在室温下搅拌3h。用EtOAc稀释产物。将有机层依次用1M HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到所需的油状化合物L15a(555mg，0.625mmol，72％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.87(s,1H),6.40(s,1H),4.79(s,1H),4.21(s,1H),3.76-3.53(m,15H),3.47(s,5H),3.32-3.05(m,3H),2.29-2.17(m,4H),1.90-1.76(m,4H),1.69-1.53(m,2H),1.52-1.41(m,33H),1.36-1.20(m,29H)。
L15
将化合物L15a(100mg，0.112mmol，1当量)的DCM(2mL)溶液用TFA(2mL)处理30分钟。将混合物浓缩，与己烷共蒸发并溶解于20mL DCM中并在0℃下冷却。加入DIEA(79μL，0.45mmol，4当量)，然后加入溶解于1mL DCM中的溴代乙酸酐(60mg，0.231mmol，2.05当量)。然后将反应混合物在0℃搅拌30分钟，在室温搅拌1.5h，并除去溶剂。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到白色固体L15(17.5mg，0.02mmol，18％)。MS(ES+)m/z 873.21([M+H]+),875.20([M+H]+)1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.38(dd,J＝8.4,5.5Hz,1H),3.91(q,J＝11.4Hz,2H),3.84(s,2H),3.72-3.61(m,8H),3.56(td,J＝5.5,2.7Hz,4H),3.44-3.35(m,5H),3.30-3.17(m,2H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),2.21(t,J＝7.5Hz,2H),1.92-1.77(m,1H),1.75-1.53(m,7H),1.40-1.27(m,27H)。
实施例20：L16的合成
Figure BDA0003781695400000911
中间体L16a
向溶解于DMF(10mL)的Boc-Orn(Boc)-OH(400mg，1.2mmol，1当量)的溶液中加入溶解于1mL DMF中的HATU(504mg，1.32mmol，1.1当量)、DIEA(230μL，1.32mmol，1.1当量)和胺-PEG2-N3(210mg，1.20mmol，1当量)。将反应混合物在室温下搅拌4h。用EtOAc稀释产物。将有机层依次用1M HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到所需的油状化合物L16a(471mg，0.96mmol，80％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.01(t,J＝6.6Hz,1H),3.71-3.60(m,6H),3.55(t,J＝5.5Hz,2H),3.41-3.37(m,3H),3.04(t,J＝6.2Hz,2H),1.78-1.66(m,1H),1.62-1.48(m,3H),1.48-1.39(m,18H)。
中间体L16b
在氩气下向化合物L16a(471mg，0.9mmol，1当量)的无水MeOH(10mL)溶液中加入Pd/C(10.2mg，0.09mmol，0.1当量)且用H2置换氩气。将反应混合物在室温下搅拌6h，在硅藻土上过滤并蒸发，得到油状化合物L16b(295.5mg，0.64mmol，71％)。产物无需进一步纯化即可使用。MS(ES+)m/z 462.51([M+H]+)。
中间体L16c
向溶解于DMF(5mL)的十八烷二酸单叔丁酯(281mg，0.76mmol，1当量)的溶液中加入溶解于1mL DMF中的HATU(288mg，0.76mmol，1当量)、DIEA(132μL，0.76mmol，1当量)和化合物L16b(351mg，0.76mmol，1当量)。将反应混合物在室温下搅拌3h。用EtOAc稀释产物。将有机层依次用1M HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到所需的油状化合物L16c(351mg，0.43mmol，57％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ3.61(s,4H),3.54(td,J＝5.6,2.3Hz,4H),3.40-3.34(m,4H),3.04(t,J＝6.6Hz,2H),2.20(td,J＝7.6,5.9Hz,4H),1.77-1.68(m,2H),1.64-1.48(m,2H),1.48-1.42(m,28H),1.35-1.26(m,26H)。
L16
将化合物L16c(31mg，0.038mmol，1当量)的DCM(2mL)溶液用TFA(2mL)处理30分钟。将混合物浓缩，与己烷共蒸发并溶解于20mL DCM中并在0℃下冷却。加入DIEA(27μL，0.152mmol，4当量)，然后加入溶解于1mL DCM中的溴代乙酸酐(21mg，0.078mmol，2.05当量)。然后将反应混合物在0℃搅拌30分钟，在室温搅拌1.5h，并除去溶剂。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到白色固体L16(12.6mg，0.015mmol，41％)。MS(ES+)m/z 801.13([M+H]+),803.12([M+H]+)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.37(dd,J＝8.5,5.4Hz,1H),3.91(q,J＝11.3Hz,2H),3.84(s,2H),3.63(s,4H),3.57(td,J＝5.6,2.6Hz,4H),3.43-3.36(m,4H),3.31-3.17(m,1H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),2.21(t,J＝7.5Hz,2H),1.90-1.79(m,1H),1.76-1.54(m,7H),1.41-1.30(m,26H)。
实施例21：L17的合成
Figure BDA0003781695400000931
中间体L17a
向溶解于DMF(10mL)的Boc-Orn(Boc)-OH(400mg，1.2mmol，1当量)的溶液中加入溶解于1mL DMF中的HATU(504mg，1.32mmol，1.1当量)、DIEA(230μL，1.32mmol，1.1当量)和胺-PEG2-N3(316mg，1.20mmol，1当量)。将反应混合物在室温下搅拌4h。用EtOAc稀释产物。将有机层依次用1M HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到所需的油状化合物L17a(454mg，0.78mmol，66％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.04-3.97(m,1H),3.71-3.58(m,14H),3.54(t,J＝5.4Hz,2H),3.37(t,J＝5.0Hz,4H),3.04(t,J＝6.6Hz,2H),1.75-1.67(m,1H),1.62-1.48(m,3H),1.48-1.41(m,18H)。
中间体L17b
在氩气下向化合物L17a(454mg，0.9mmol，1当量)的无水MeOH(10mL)溶液中加入Pd/C(8.3mg，0.078mmol，0.1当量)且用H2置换氩气。将反应混合物在室温下搅拌6h，在硅藻土上过滤并蒸发，得到油状化合物L17b(192mg，0.35mmol，45％)。产物无需进一步纯化即可使用。
中间体L17c
向溶解于DMF(5mL)的十八烷二酸单叔丁酯(225mg，0.61mmol，1当量)的溶液中加入溶解于1mL DMF中的HATU(231mg，0.61mmol，1当量)、DIEA(106μL，0.61mmol，1当量)和化合物L17b(335mg，0.61mmol，1当量)。将反应混合物在室温下搅拌2h。用EtOAc稀释产物。将有机层依次用1M HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到所需的油状化合物L17c(178mg，0.20mmol，32％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.32(s,2H),3.74-3.63(m,11H),3.59(dt,J＝10.9,5.0Hz,4H),3.52-3.43(m,4H),3.27-3.08(m,2H),2.22(d,J＝7.6Hz,4H),1.69-1.52(m,6H),1.51-1.42(m,27H),1.27(s,26H)。
L17
将化合物L17c(45.6mg，0.05mmol，1当量)的DCM(2mL)溶液用TFA(2mL)处理30分钟。将混合物浓缩，与己烷共蒸发并溶解于20mL DCM中并在0℃下冷却。加入DIEA(36μL，0.202mmol，4当量)，然后加入溶解于1mL DCM中的溴代乙酸酐(27mg，0.103mmol，2.05当量)。然后将反应混合物在0℃搅拌30分钟，在室温搅拌1.5h，并除去溶剂。通过硅胶快速柱色谱法纯化，得到白色固体L17(14.9mg，0.017mmol，33％)。MS(ES+)m/z 889.18([M+H]+),891.17([M+H]+)1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ4.38(dd,J＝8.3,5.5Hz,1H),3.92(q,J＝11.3Hz,2H),3.84(s,2H),3.67-3.60(m,7H),3.56(td,J＝5.5,3.5Hz,4H),3.45-3.35(m,5H),3.32-3.15(m,3H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),2.21(t,J＝7.5Hz,2H),1.90-1.76(m,1H),1.74-1.57(m,7H),1.41-1.26(m,25H)。
实施例22：L18的合成
Figure BDA0003781695400000941
通用方案A、B、D(十八烷二酸)；C、D(Fmoc-PEG2-丙酸)；B(Fmoc-PEG2-丙酸)、B(Fmoc-PEG2-丙酸)；B、D(Fmoc-Orn(Fmoc)-OH)；B、E、F。
通过具有质量检测的半制备型HPLC纯化粗产物，得到白色固体产物L18(47mg，0.036mmol，10％)。MS(ES+)m/z 1276.39([M+H]+),1278.37([M+H]+)。
用于溴乙酰基肽钉合/缀合的通用方案
将肽以2mM浓度用1.5当量溴乙酰基钉合体溶解在1:3(v/v)MeCN/30mM NH4HCO3缓冲液(pH 8.5)中。用氢氧化铵重新调节反应混合物的pH以校正由肽TFA抗衡离子引起的pH降低。对于特别不溶的肽，加入更多的MeCN。将反应物在室温下搅拌2-4h，然后通过滴加乙酸酸化至pH 5。将所得溶液冻干并通过反相HPLC纯化。
用于内酰胺钉合的通用固相方案
将在每个钉合位置带有胺侧链正交保护(Dde/Mmt)的肽-树脂在DMF中溶胀1h。通过用DMF中的2％肼溶液处理(2×15min)从第一侧链除去Dde保护基。观察到TNBS检测呈阳性。如下所述偶联下文指定的接头构建单元，并观察到TNBS检测呈阴性。将溶剂交换为DCM，并通过用含有5％TIPS的1％TFA的DCM溶液处理5×2min从第二侧链除去Mmt基团。用DCM、10％DIEA的DMF溶液、DMF洗涤树脂，观察到TNBS检测呈阳性。如下所述，将接头环化，并将钉合体的PEG-脂肪酸部分(如果适用)延长。使用95％TFA、2.5％TIPS、2.5％H2O，将完整的钉合的肽从树脂上裂解3h。将肽裂解混合物蒸发成油状物，研磨并用乙醚洗涤并通过反相HPLC纯化。Dde/Alloc保护方案也可用于该方法，其需要向Dde脱保护混合物中加入烯丙醇作为清除剂以防止Alloc烯丙基部分同时还原。
K(Fmoc)接头的合成
Figure BDA0003781695400000961
中间体Ka
将Fmoc-β-Ala-OH(1.00g，3.21mmol)和亚氨基二乙酸二叔丁酯(0.461g，2.68mmol)悬浮于100mL DCM中。加入HATU(1.02g，2.68mmol)和DIEA(3.32mL，12.8mmol)，并将反应物在室温下搅拌3.5h。蒸发溶剂，将残余物溶于甲醇中，通过快速硅胶柱色谱(己烷/EtOAc)纯化，得到白色固体产物(0.802g，56％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.78(d,J＝7.4Hz,2H),7.62(d,J＝7.4Hz,2H),7.42(t,J＝7.4Hz,2H),7.33(t,J＝7.4Hz,2H),5.66(t,J＝5.7Hz,1H),4.35(d,J＝7.3Hz,2H),4.23(t,J＝7.3Hz,1H),4.10(s,2H),4.02(s,2H),3.56(q,J＝5.7Hz,2H),2.55(t,J＝5.7Hz,2H),1.49(s,18H)。
K(Fmoc)接头
将化合物Ka用20mL 1:1TFA/DCM处理2h。蒸发溶剂，研磨残余物，并用乙醚洗涤，得到白色固体K(Fmoc)接头(0.371g，58％)。MS(ES+)m/z 427.15([M+H]+)。
A(Fmoc)接头的合成
Figure BDA0003781695400000962
将5-氨基间苯二甲酸(1.00g，5.5mmol)的10mL二噁烷溶液加入Na2CO3(1.46g，5.5mmol)在15mL水中的脱气溶液中。将溶液在冰上冷却，然后在搅拌下在15分钟内滴加Fmoc氯化物(1.42g，5.5mmol)的10mL二噁烷溶液。然后将反应物搅拌1h，然后在室温搅拌24h。真空除去二噁烷，且剩余的水溶液用1M HCl酸化。然后将所得固体沉淀物用乙醚(4×10mL)洗涤，再溶解于EtOAc中，过滤，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩得到白色固体A(Fmoc)接头(119mg，5％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.24(s,2H),10.12(s,1H),8.33(d,J＝1.5Hz,2H),8.12(t,J＝1.5Hz,1H),7.91(d,J＝7.6Hz,2H),7.76(dd,J＝7.6,1.2Hz,2H),7.43(t,J＝7.6Hz,2H),7.36(td,J＝7.6,1.2Hz,2H),4.50(d,J＝6.8Hz,2H),4.33(t,J＝6.8Hz,1H)。
“A1”和“K1”系列简单内酰胺钉合体的通用方案G
对于接头偶联，使用HATU(4当量)和DIEA(4当量)的DMF溶液连接合适的二酸构建单元(2当量)1×2h。使用HATU(1当量)和DIEA(2当量)的DMF溶液实现环化步骤1×2h。
用于‘K’PEG-脂肪酸三官能内酰胺钉合体的通用方案H
对于接头偶联，使用DIC(2当量)和催化性DMAP在干燥DCM中于室温下预形成构建单元K(Fmoc)接头(2当量)的分子内对称酸酐10分钟。将肽-树脂溶剂换成DCM，然后加入酸酐并搅拌过夜。排出树脂，用DCM和DMF洗涤。通过DIC(1当量)和HOBt或HOAt(1当量)的DMF溶液处理将接头环化过夜，并观察到TNBS呈阴性。通过用10％乙酸酐的DMF溶液处理(30min)将剩余的未环化接头封端。通过用20％哌啶的DMF溶液处理(2×10min)，将接头Fmoc基团脱保护。观察到TNBS呈阳性。随后的钉合体PEG和脂肪酸构建单元通过标准偶联化学依次连接至接头游离胺：构建单元(3当量)、HATU(3当量)和DIEA(6当量)的DMF溶液，室温，1h，使用20％哌啶的DMF溶液进行脱保护循环(5+10min，RT)。
用于‘A’PEG-脂肪酸三官能内酰胺钉合体的通用方案I
对于接头偶联，使用HATU(4当量)和DIEA(4当量)的DMF溶液连接构建单元A(Fmoc)接头(2当量)1×2h。使用HATU(1当量)和DIEA(2当量)的DMF溶液实现环化步骤1×2h。通过用10％乙酸酐的DMF溶液处理将剩余的未环化接头封端(30min)。通过用20％哌啶的DMF溶液处理(2×10min)，将接头Fmoc基团脱保护。不可能观察到苯胺氮的TNBS检测呈阳性。使用HATU(3当量)和DIEA(6当量)的DMF溶液在室温下偶联Fmoc-β-Ala-OH(3当量)4×1h或使用DIC/DMAP的DCM溶液(2h，RT)偶联作为对称酸酐。随后的钉合体PEG和脂肪酸构建单元通过标准偶联化学依次连接至接头游离胺：构建单元(3当量)、HATU(3当量)和DIEA(6当量)的DMF溶液，室温，1h，使用20％哌啶的DMF溶液进行脱保护循环(5+10min，RT)。
在一些实施方案中，本文所述的肽缀合物包含表2的钉合体。
表2
Figure BDA0003781695400000981
Figure BDA0003781695400000991
Figure BDA0003781695400001001
Figure BDA0003781695400001011
Figure BDA0003781695400001012
为半胱氨酸、高半胱氨酸、2-氨基-5-巯基戊酸或2-氨基-6-巯基己酸残基的一部分，且
Figure BDA0003781695400001013
为赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸或高赖氨酸残基的一部分。
在一些实施方案中，本文所述的肽缀合物如表3所示。
表3：肽缀合物
Figure BDA0003781695400001014
Figure BDA0003781695400001021
Figure BDA0003781695400001031
Figure BDA0003781695400001041
Figure BDA0003781695400001051
Figure BDA0003781695400001061
Figure BDA0003781695400001071
实施例A：体外GLP-2受体活化报告基因测定(受体介导的cAMP合成)
在10％FBS的存在下，使用过表达cAMP响应元件(CRE)驱动的荧光素酶报告基因和人GLP-2R的稳定HEK293细胞系确定针对GLP-2R活化的肽活性和效力。GLP2-2G(替度鲁肽)用作阳性对照。
将HEK293-GLP-2R-CRE细胞以每孔5000个细胞的密度接种在384孔板中，并在37℃和5％CO2下在具有10％FBS的DMEM中培养18h。以剂量依赖性方式用肽处理细胞16h，并使用One-Glo(Promega，WI)荧光素酶试剂按照制造商的说明通过发光强度报告受体活化。使用GraphPad Prism 6软件(GraphPad，San Diego，CA)确定每种肽的EC50。一式三份进行测定，并且在三个独立实验中获得结果。结果如表4所示。
表4
Figure BDA0003781695400001081
实施例B：小鼠体内肽的药代动力学(半衰期)
为了测定GLP-2激动剂的体内半衰期，通过在CD1雌性小鼠(每组n＝4)中以10nmol/kg静脉内或皮下注射肽进行药代动力学(PK)研究。使用体外GLP-2R介导的基于细胞的报告基因测定来确定不同时间点(5min、30min、1h、3h、7h和24h)的肽的血浆水平。静脉或皮下施用后估计的终末半衰期示于下表5中。
简言之，将来自查尔斯河实验室的雌性CD-1小鼠(每组n＝4)禁食过夜并通过静脉内(iv)或皮下(sc)途径施用100μL每种肽的磷酸盐缓冲盐水。在出血30分钟后立即给小鼠提供食物。将血液提取到肝素管中并以3000g离心15分钟。然后将所得上清液血浆储存在-80℃下用于肽浓度测定。通过体外基于细胞的活性测定来确定每个时间点血浆中肽的浓度。在不同时间点用血浆样品处理HEK293-GLP-2R-CRE细胞(5点剂量反应，从各血浆样品的1:10至1:100稀释度开始)，并在37℃和5％CO2下在含有10％FBS的DMEM中孵育16h，然后测量萤火虫荧光素酶活性。同时，使用相同的肽获得Bottom(输入数据)、Top(输出数据)、EC50和Hill斜率的标准曲线和参数。利用得自标准曲线的参数，使用每个血浆样品的相对光单位(RLU)计算血浆中的肽浓度(nmol/L)(RLU＝Bottom+(Top–Bottom)/(1+10((logEC50–浓度)Hill斜率))。获得血浆中的肽浓度，并利用WinNonLin Phoenix软件(Pharsight Corp，St.Louis，MO)相对于时间点作图以获得每种肽的体内半衰期。
表5
Figure BDA0003781695400001091
Figure BDA0003781695400001101
实施例C：长效GLP2R激动剂对人GLP2R的体外效力
本实施例评估了长效GLP2对GLP2R的效力。665/615比率的降低表明由于GLP2R活性增加，游离cAMP增加。
GLP2-2G(替度鲁肽)用作阳性对照。如图1A所示，随着替度鲁肽浓度增加，665/615的比率降低，表明GLP2R活性增加。与替度鲁肽相比，改变GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5、GLP2-2G-1-EX4-L5A和GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A的浓度产生了相似的活性水平。根据该数据，计算出IC50值，如表6所示。如图1B所示，当将10％胎牛血清加入测定中时，替度鲁肽曲线变得比长效GP2R激动剂的曲线更陡。如表6中所列，所有三种长效GLP2R激动剂的所得IC50值均较高。
表6：长效GLP2R激动剂的IC50值
Figure BDA0003781695400001102
实施例D：长效GLP2R激动剂对小鼠GLP2R的体外效力
确定长效GLP2R激动剂对小鼠GLP2R的效力。665/615比率的降低表明由于GLP2R活性增加，游离cAMP增加。
如图2所示，将665荧光与615荧光比率相对于分子浓度作图，且该数据用于计算IC50值，列于表7。使用替度鲁肽(GLP2-2G)和阿普鲁肽(合成的GLP-2类似物)作为阳性对照。发现长效GLP2R激动剂的IC50值在与替度鲁肽和阿普鲁肽相似的范围内，表明长效GLP2R激动剂是小鼠GLP2R的相对有效的激动剂。
表7：长效GLP2R激动剂对小鼠GLP2R的IC50值
Figure BDA0003781695400001111
实施例E：长效GLP2R激动剂对食蟹猴GLP2R的体外效力
确定长效GLP2R激动剂对食蟹猴GLP2R的效力。如图3所示，将665比615的比率相对于浓度(nM)作图，以测定长效GLP2R激动剂对食蟹猴GLP2R的效力。使用图3中的数据计算EC50，且值列于表8中。长效GLP2R激动剂的EC50值的范围为0.119-0.156nM，表明长效GLP2R激动剂是食蟹猴GLP2R的相对有效的激动剂。
表8：食蟹猴中的EC50值
Figure BDA0003781695400001112
实施例F：长效GLP2R激动剂对GLP2R的选择性高于对其他G蛋白偶联受体的选择性
本实施例评估了稳定的GLP2R激动剂对其他G蛋白偶联受体(GPCR)的影响。
665/615比率的降低表明由于GLP2R活性增加，游离cAMP增加。
如图4A所示，当与由不同浓度的索马鲁肽(semaglutide)(一种GLP-1R激动剂)产生的变化相比时，GLP2或测试的稳定分子(GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5或GLP2-2G-10Nle-1-L5A)均未对GLP-1R活性水平产生任何显著变化。在计算IC50值时，如表9所列，与索马鲁肽(阳性对照)相比，这些值非常高。这表明在GLP-1R被激活之前需要极高浓度的GLP2和长效GLP2R激动剂。
表9：稳定的GLP2R激动剂相对其他GPCR的IC50
Figure BDA0003781695400001121
如图4B所示，长效GLP2R激动剂在10-2和102nm的浓度范围内未导致GCGR活性水平的变化。然而，胰高血糖素浓度的增加影响GCGR的活性水平。如表9中所列，尽管胰高血糖素的IC50为0.04，表明其在较低浓度下影响GCGR的活性水平，但GLP2和长效GLP2R激动剂的IC50值大于500。
如图4C所示，长效GLP2R激动剂在10-2和102nm的浓度范围内未导致GIPR活性水平的变化。然而，增加GIP的浓度影响GIPR的活性水平。计算IC50值，如表9所列。GIP的IC50为0.04，表明其在影响GIPR的活性水平方面相对有效；然而，GLP2和长效GLP2R激动剂的IC50值大于500。
此外，GLP2-2G-1-EX4-L5A和GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5通过DiscoverRx相对于gpcrMAX Panel进行描绘。利用激动剂和拮抗剂初级筛选测试168个GPCR靶标。使用PathHunterβ-抑制蛋白酶片段互补(EFC)技术进行测定。在激动剂模式中，除了GLP2之外，未鉴定出活性>30％的靶标。在拮抗剂模式中：未鉴定出抑制活性>35％的靶标。实施例G：不同温度下的长效GLP2R激动剂的稳定性
本实施例评估了稳定的GLP2R激动剂在不同温度下长时间的稳定性。
如图5A所示，GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)和GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-L5A(GLP2-K5)在4℃下稳定4天。如图5B所示，在25℃下观察到GLP2-2G-1-EX4-L5A氧化了3％，而GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5相当完整地保持了4天。在37℃下，观察到GLP2-2G-1-EX4-L5A氧化了11％，且在第2天+12Da杂质增加了4％。如图5C所示，GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5在第4天比GLP2-2G-1-EX4-L5A具有更高的完整肽百分比。在70℃(强制降解)，存在两种肽的许多外消旋产物。如图5D所示，70℃下4天，GLP2-2G-1-EX4-L5A和GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5的完整肽百分比均小于50％。
实施例H：不同溶液中的长效GLP2R激动剂的稳定性
如表10中所列，测量不同溶液中化合物0h的稳定性。对于GLP2-2G-1-EX4-L5A和GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A，在24h没有检测到目标化合物。对于GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5，谷胱甘肽组在24h具有良好的保护。总之，这表明最稳定的肽是GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A，而最不稳定的肽是GLP2-2G-1-EX4-L5A。
表10：化合物在不同溶液中0h的稳定性
Figure BDA0003781695400001131
Figure BDA0003781695400001141
实施例E：呈液体和呈固体形式的硫醚肽的长期稳定性
在本实施例中测试硫醚肽的长期稳定性。
测定硫醚肽对湿空气氧化的稳定性。10天后观察到GLP2-2G-1-EX4-L5A的Met氧化，观察到16％的降解。GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A对湿空气氧化更稳定。这表明硫醚桥至少在10天内对氧化稳定。
将该粉末作为HCl盐储存在4℃。4个月后GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)没有Met氧化的迹象。同样，7个月后GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)没有Met氧化的迹象。
实施例F：不同pH值下的长效GLP2R激动剂的稳定性
在一定的pH值和温度范围内测定肽的稳定性。
在pH 3.3，室温下，GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)在4天内100％稳定。如图6A所示，GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5也是稳定的，95％的肽在5天内保持完整。如图6B所示，GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5和GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)在pH 3.3和37℃下比它们在室温下更不稳定。在37℃下，GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5和GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)在pH3.4(-18Da和-775Da)下进行主要水解。此外，GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)在pH 4.6时不溶。
如图6C所示，GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5和GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)在pH7.5和室温下均100％稳定4天。如图6D中所示，在37℃，GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5降解1％且L5A降解1％。如图6E所示，GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5和GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)在pH 8.9和室温下均100％稳定4天。如图6F中所示，在37℃和pH 8.9下，GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5降解1％并且GLP2-2G-1-EX4-L5A(GLP2-L5A)降解1％。
实施例G：肝细胞中长效GLP2R激动剂的稳定性
随时间测量长效GLP2R激动剂的肝细胞稳定性。如图7A所示，对于GLP2-2G-1-EX4-L5A，120分钟后小鼠和MC值均略高于100％。然而，如图7B-7C所示，对于GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A和GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5两者，尽管小鼠值增加至稍高于100％，但120分钟后MC值降低至约60％。
如表11所列，从数据中计算出每种肽的生物半衰期(T1/2)和固有清除率(CLint)值。在肝细胞和肝脏中，GLP2-2G-1-EX4-L5A具有最高的半衰期和最低的CLint。在肝细胞和肝脏中，GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A具有最低的半衰期，而GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A具有最高的CLint值。
表11：肝细胞中的半衰期和CLint值
Figure BDA0003781695400001151
实施例H：GLP2-2G-1-EX4-L5A在小鼠中显示出延长的体内半衰期
雄性C57BL/6小鼠用1.5mg/kg的GLP2-2G-1-EX4-L5A的PBS(pH 7.5，澄清溶液)溶液给药，并跟踪激动剂的血浆浓度96h，如图8所示。使用定量下限为20ng/mL的LC-MS测定来分析血浆浓度。这些值也用于计算该化合物在小鼠中通过静脉内注射和皮下注射给药的其他药代动力学性质，如表12所示。观察到长约8.4h的体内半衰期，类似于索马鲁肽在啮齿动物中的8h半衰期。
表12：GLP2-Met-L5A在小鼠中的药代动力学
Figure BDA0003781695400001161
实施例I：GLP2-2G-1-EX4-L5A在食蟹猴中显示出延长的体内半衰期
雄性食蟹猴施用1.0mg/kg的GLP2-2G-1-EX4-L5A的PBS(pH 7.5，澄清溶液)溶液给药，并追踪激动剂的血浆浓度达504h，如图9所示。分析GLP2-2G-1-EX4-L5A的药代动力学，用于通过静脉内和通过皮下注射递送药物，如表13所列。使用定量下限为10ng/mL的LC-MS测定来分析血浆浓度。观察到长约70h的体内半衰期，长于索马鲁肽在啮齿动物中的大约50h半衰期。这种长的体内半衰期表明可能转化成每周一次的人给药。
表13：GLP2-2G-1-EX4-L5A在食蟹猴中的药代动力学特性
Figure BDA0003781695400001171
实施例J：GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A在小鼠中显示出长的体内半衰期
雄性C57BL/6小鼠用1.5mg/kg的GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A的PBS(pH 7.5)溶液经皮下(SC)或静脉内(IV)给药。如图10所示，在给药后96h跟踪激动剂的血浆浓度。使用定量下限为5ng/mL的LC-MS测定来分析血浆浓度。由该数据计算药物在小鼠中的药代动力学性质，包括半衰期，并且数值列于表14中。在小鼠中观察到该药物的长约8h的体内半衰期。
表14：GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A在小鼠中的药代动力学特性
Figure BDA0003781695400001181
实施例K：GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A在食蟹猴中显示出延长的半衰期
雄性食蟹猴用1.0mg/kg的GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A的PBS(pH 7.5)溶液经皮下(SC)或静脉内(IV)给药。如图11所示，在给药后504h跟踪激动剂的血浆浓度。使用定量下限为5ng/mL的LC-MS测定来分析血浆浓度。由该数据计算药物在食蟹猴中的药代动力学性质，包括半衰期，并且数值列于表15中。在食蟹猴中观察到该药物的长约57h的体内半衰期。
表15：GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A在食蟹猴中的药代动力学特性
Figure BDA0003781695400001191
实施例L：GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5在小鼠中显示出长的体内半衰期
雄性C57BL/6小鼠用1.5mg/kg的GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5的PBS(pH 7.5)溶液经皮下(SC)或静脉内(IV)给药。如图12所示，在给药后72h跟踪激动剂的血浆浓度。使用定量下限为5ng/mL的LC-MS测定来分析血浆浓度。由该数据计算药物在小鼠中的药代动力学性质，包括半衰期，并且数值列于表16中。在小鼠中观察到该药物的长约7h的体内半衰期。
表16：GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5在小鼠中的药代动力学特性
Figure BDA0003781695400001201
实施例M：GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5在食蟹猴中显示出延长的半衰期
雄性食蟹猴用1.0mg/kg的GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5的PBS(pH 7.5)溶液经皮下(SC)或静脉内(IV)给药。如图13所示，在给药后504h跟踪激动剂的血浆浓度。使用定量下限为5ng/mL的LC-MS测定来分析血浆浓度。由该数据计算药物在食蟹猴中的药代动力学性质，包括半衰期，如表17所列。在食蟹猴中观察到该药物的长约36h的体内半衰期。
表17：GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5在食蟹猴中的药代动力学特性
Figure BDA0003781695400001211
实施例N：GLP2-L5A在小鼠中产生肠营养作用
将13周龄雌性CD1小鼠分成如下列出的5个处理组：A(媒介物PBS，SC，QD)；B(GLP-C14，0.05mg/kg，BID)；C(GLP2-2G-1-EX4-L5A，0.1mg/kg，QD)；D(GLP2-2G-1-EX4-L5A，1mg/kg，QD)；E(GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A，0.1mg/kg，QD)和F(GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A，1mg/kg，QD)。各组均为5只小鼠。使用DPBS作为媒介物以5mL/kg的体积每天(QD)或每天两次(BID)对小鼠皮下施用相关剂量，然后每天监测体重。
在施用剂量后10天，收集胃肠道(GI)测量值。这些测量包括收集末梢血；解剖小肠；以及测量小肠的长度和重量；记录空大肠的长度和重量。
如图14A所示，与未治疗的小鼠(A组)相比，接受至少0.1mg/kg剂量的任一种长效GLP2R激动剂治疗的小鼠(C-F组)的小肠重量显著增加。如图14B所示，与未治疗的小鼠(A组)相比，接受长效GLP2R激动剂治疗的所有小鼠的小肠长度均增加，以及接受0.1mg/kg的GLP2-2G-5-L5A治疗的小鼠(E组)的小肠长度显著增加。如图14C所示，在10天内没有处理组产生显著的体重变化。
实施例O：GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A有效治疗急性结肠炎的小鼠模型
本实施例评估了GLP2-2G-10Nle-1-Ex4-L5A在小鼠中的肠营养作用。
将7-8周龄的雄性C57B6小鼠分成6个实验组：A(媒介物PBS，QD)；B(替度鲁肽，0.5mg/kg，BID)；C(GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5，0.03mg/kg，QD)；D(GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5，0.1mg/kg，QD)；E(GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5，0.3mg/kg，QD)；和F(GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5，1mg/kg，QD)。除了含有4只小鼠的A组外，每个处理组含有6只小鼠。使用FPBS作为媒介物，以5mL/kg的给药体积对小鼠皮下施用治疗剂，每天一次(QD)或每天两次(BID)。每天监测体重，并在给药10天后收集胃肠道(GI)测量值。这些测量包括收集末梢血；解剖小肠；测量小肠的长度和重量；以及记录空大肠的长度和重量。
如图15C-15D所示，与对照组相比，所有处理组(B-F)导致小肠长度和重量的显著增加。即使是最低剂量(0.03mg/kg)的GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5(C组)，也对小强度的两种测量产生显著影响。此外，0.1mg/kg剂量的GLP2-2G-10Nle-1-EX4-K5(D组)显示出与用0.5mg/kg的替度鲁肽治疗(B组)相当的效果。
与未处理对照组(A组)相比，接受高剂量GLP2-2G-10Nle-1-EX4-K5的小鼠(E-F组)显示结肠长度的显著增加。与未处理对照组相比，所有处理组均显示了结肠重量的显著增加。然而，用最高剂量的GLP2-2G-10Nle-1-EX4-K5治疗的E组和F组中的小鼠表现出最大的增加。
实施例P：GLP2-2G-1-EX4-L5A有效治疗急性结肠炎的小鼠模型
通过用3％葡聚糖硫酸钠(DSS)进行单次5天疗程，在小鼠中诱导急性结肠炎。将小鼠分成所列的4个处理组：A(未接受DSS的对照小鼠)；B(接受DSS和皮下注射PBS的小鼠)；C(接受DSS和1mg/kg GLP2-2G-1-EX4-L5皮下治疗的小鼠)和D(接受DSS和20mg.kg环孢菌素腹膜内治疗的小鼠)。
如图16A所示，在12天内测量体重。与患有诱导的结肠炎的未治疗小鼠(B组)相比，接受急性结肠炎治疗的小鼠(C组和D组)体重没有大的减轻。另外，如图16B-16C所示，与患有诱导的急性结肠炎的未治疗小鼠(B组)相比，接受GLP2-2G-1-EX4-L5A治疗的C组小鼠显示结肠和小肠重量的显著增加。当与患有诱导的急性结肠炎的未处理对照组相比时，接受GLP2-2G-1-EX4-L5A治疗的小鼠也显示结肠和小肠长度的显著增加(图未显示)。GLP2-2G-1-EX4-L5A治疗还改善了DSS诱导的结肠炎模型中的结肠和小肠组织病理学。如图16D所示，接受DSS和L5A的小鼠的组织病理学显示结肠中的隐窝深度与未接受DSS处理的小鼠相似，而仅接受DSS的小鼠的隐窝长度显著减少。如图16E所示，在空肠小肠中，C组小鼠的空肠绒毛长度大于A组或B组小鼠的空肠绒毛长度。当比较接受GLP2-2G-1-EX4-L5A治疗的小鼠与未治疗的小鼠时，空肠绒毛的长度显著增加。此外，C组小鼠没有表现出B组小鼠表现出的绒毛扭曲和脓肿。
实施例Q：GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5有效治疗急性结肠炎的小鼠模型
将8周龄雄性C57BL/6小鼠分成如下列出的7个处理组：A(未接受DSS的对照小鼠)；B(接受DSS和皮下注射PBS的小鼠)；C(接受DSS和0.1mg/kg GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5皮下治疗的小鼠)；D(接受DSS和0.3mg/kg GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5皮下治疗的小鼠)；E(接受DSS和1mg/kg GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5皮下治疗的小鼠)；F(接受DSS和0.5mg/kg替度鲁肽皮下治疗的小鼠)和G(接受DSS和20mg.kg环孢菌素腹膜内治疗的小鼠)。除了含有4只小鼠的A组外，每组含有6只小鼠。
如图17A所示，通过用3％葡聚糖硫酸钠(DSS)进行单次5天疗程，在小鼠中诱导急性结肠炎。每天以每个处理组的适当剂量处理动物，持续11天。每天监测体重。如果动物体重减轻超过20％，则对其实施安乐死。在第10-11天，在给药后0、1、3、7和24h收集样品用于药代动力学分析。在第11天，将动物安乐死，并进行尸检。将末端血液收集到肝素化收集管中并处理成血浆。收集小肠和结肠以测量重量和长度。收集胃肠道组织进行组织学检查。
当随时间检查体重时，如图17A所示，与任何其他处理组的小鼠相比，接受环孢菌素治疗的G组小鼠在DSS处理期间表现出更大百分比的体重下降，但在DSS处理结束后体重增加。与所有其他处理组相比，接受DSS而未接受治疗的小鼠(B组)在DSS处理结束后显示出最大的体重下降百分比。接受GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5(C-E组)或替度鲁肽(F组)治疗的小鼠与未接受DSS的小鼠(A组)在这段时间内没有表现出体重的显著变化。
GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗保护小鼠免于体重减轻并恢复结肠缩短。如图17B所示，与未处理组(B组)相比，接受高剂量GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5或替度鲁肽的小鼠(D-F组)的结肠长度显著增加。结肠重量没有变化。如图17C-17D所示，在小肠中，与未处理的小鼠相比，接受替度鲁肽或GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5的组(C-F组)的长度和重量都显著增加。最低剂量(0.1mg/ml)的GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5(C组)显示出与0.5mg/kg BID的替度鲁肽相当的效果。
用GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗也影响肠的组织学特征。如图17E所示，替度鲁肽和GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5处理组(C-F组)与未治疗的小鼠(A-B组)相比显示出绒毛高度的显著增加。最低剂量(0.1mg/kg)的GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5显示出与每日施用两次的0.5mg/kg的替度鲁肽相当的肠营养作用。
此外，如图17F所示，Ki67染色显示在任何处理组中没有增加增殖。这表明没有与GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗相关的异常增殖的证据。
处理组C-F的药代动力学性质绘制在图17G中。治疗后3h后检测不到替度鲁肽。然而，所有剂量的GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5在治疗后长达24h内均可检测到。
实施例R：长效GLP2R激动剂有效治疗急性结肠炎
将小鼠分成如下所列的9个处理组：A(无DSS：媒介物)、B(DSS：媒介物(PBS))、C(DSS：GLP2-2G-1-EX4-L5A，0.03mg/kg)、D(DSS：GLP2-2G-1-EX4-L5A，0.1mg/kg)、E(DSS：GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A，0.03mg/kg)、F(DSS：GLP2-2G-10Nle-1-EX4-L5A，0.1mg/kg)、G(DSS：GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5，0.03mg/kg)、H(DSS：GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5，0.1mg/kg)，以及I(DSS：环孢菌素A，20mg/kg，IP)。每组包含6只8周龄的C57BL/6雄性小鼠。小鼠用3％的DSS给药7天，同时用适当的处理剂给药8天以诱导急性结肠炎。除组I之外的所有动物均皮下给药5ml/kg的量和DPBS的媒介物，其中媒介物是橄榄油。在第6-7天，在给药后0、1、3、7和24h，从C-H组收集药代动力学样品。在第9天进行测量。这些测量包括收集末梢血；解剖小肠；测量小肠的长度和重量；以及记录空大肠的长度和重量。
与未经治疗的动物相比，所有长效GLP-2激动剂都显示出剂量相关的防止体重减少的保护作用，并且该保护作用在0.1mg/kg的剂量下是显著的。如图18A所示，用任一剂量的GLP2-2G-10Nle-1-Ex4-L5A治疗的动物(C、D组)比未接受治疗的动物(B组)具有更高的总体重。如图18B所示，用任一剂量的GLP2-2G-1-EX4-L5A治疗的动物(E、F组)比未接受治疗的动物(B组)具有更高的总体重。如图18C所示，用任一剂量的GLP2-2G-10Nle-1K-Ex4-K5A治疗的动物(G、H组)比未接受治疗的动物(B组)具有更高的总体重。此外，在0.03mg/kg的剂量下，GLP2-2G-10Nle-1-Ex4-L5A和GLP2-2G-10Nle-1K-Ex4-K5在防止体重减少的保护方面比GLP2-2G-1-EX4-L5A更有效。
如图18D所示，所有3种长效-GLP-2激动剂在0.1mg/kg下在急性DSS诱导的结肠炎模型中显著增加结肠长度。此外，如图18E所示，当将用长效GLP2激动剂治疗的动物与未经治疗的DSS动物进行比较时，结肠重量有非显著增加的趋势。此外，如图18F-18G所示，所有3种长效GLP2激动剂对小肠的重量和长度均显示出剂量相关的营养作用。
如图18H所示，用GLP2R激动剂治疗也增加了胆囊的大小。另外，如图18I所示，使用Hemoccult II测试来测量粪便潜血量。与未经治疗的DSS模型小鼠相比，几种治疗参数(例如两种剂量的1L5A)降低了潜血水平。
随时间测量长效GLP2激动剂的水平。如图18J所示，在0.03mg/kg的剂量下，浓度增加直至给药后7h，但在给药后24h仍可检测到。如图18K所示，在0.1mg/kg的剂量下，浓度增加直至给药后7h，并且在给药后24h仍可检测到。对于两种剂量，GLP2-2G-1-EX4-L5A具有最高的含量，接着是GLP2-2G-10Nle-1-Ex4-L5A，然后是GLP2-2G-10Nle-1K-Ex4-K5。如图18L-18N所示，对于所有三种测试的药物，较高剂量导致在所有测试时间点药物浓度较高。
在结肠组织中观察到炎性细胞因子的mRNA水平的显著降低。
实施例S：GLP2-2G-1-EX4-L5A有效治疗慢性结肠炎
在C57BL/6小鼠(雄性，10-12周龄)中，通过3个周期的连续5天在饮用水中施用2.5％DSS、接着7天恢复来诱导慢性DSS诱导的结肠炎。在最后的DSS诱导周期中，每天对动物进行治疗，持续7天。每天一次(QD)或每天两次(BID)通过皮下(S)或腹膜内(IP)施用治疗。根据如下所列的处理组对小鼠进行处理：A(无DSS：媒介物，SC，QD(n＝6))、B(DSS：媒介物(PBS)，SC，QD(n＝8))、C(DSS：GLP2-2G-1-EX4-L5A，0.1mg/kg，SC，QD(n＝8))、D(DSS：GLP2-2G-1-EX4-L5A，0.3mg/kg，SC，QD(n＝8))、E(DSS：环孢菌素，20mg/kg，IP(n＝6))，以及F(DSS：替度鲁肽，0.3mg/kg，SC，QD(n＝6))。
每周监测体重3次。在尸检前3天和4天进行药代动力学收集。在第33天，进行尸检，并进行测量。这些测量包括收集末梢血；解剖小肠；测量小肠的长度和重量；记录空大肠的长度和重量。
GLP2-2G-1-EX4-L5A在慢性结肠炎小鼠模型中有效治疗体重减轻。如图19A所示，用GLP2-2G-1-EX4-L5A或替度鲁肽治疗的小鼠(C、D和F组)未显示与未经治疗小鼠(B组)相同的体重百分比或总体重的减轻。防止体重减轻的保护作用是剂量依赖性的，较高的剂量导致保护增强。此外，这些作用等同于每天一次(QD)0.3mg/kg替度鲁肽的治疗。
如图19B所示，当与未接受治疗的小鼠相比时，GLP2-2G-1-EX4-L5A显示出剂量相关的结肠长度恢复。此外，当将0.3mg/kg GLP2-2G-1-EX4-L5A治疗与等效剂量的替度鲁肽进行比较时，GLP2-2G-1-EX4-L5A的作用比替度鲁肽治疗的作用变化更小。如图19C所示，GLP2-2G-1-EX4-L5A和替度鲁肽治疗也影响结肠重量。用低剂量的GLP2-2G-1-EX4-L5A治疗的小鼠具有与用替度鲁肽治疗的小鼠相似的结肠重量。
如图19D所示，与未接受治疗的小鼠相比，较高剂量的GLP2-2G-1-EX4-L5A显示出小肠重量的显著增加。该作用等同于替度鲁肽产生的作用。
实施例T：GLP2-2G-10Nle-1-Ex4-L5A有效治疗慢性结肠炎的小鼠模型
在C57BL/6小鼠(雄性，10-12周龄)中，通过3个周期的连续5天在饮用水中施用2.5％DSS、接着7天恢复来诱导慢性DSS诱导的结肠炎。在最后的DSS诱导周期中，每天对动物进行治疗，持续7天。每天一次(QD)或每天两次(BID)通过皮下(S)或腹膜内(IP)施用治疗。根据如下所列的处理组对小鼠进行处理：A(无DSS：媒介物，SC，QD(n＝4))、B(DSS：媒介物(PBS)，SC，QD(n＝6))、C(DSS：GLP2-2G-10Nle-1-L5A，0.03mg/kg，SC，QD(n＝6))、D(DSS：GLP2-2G-10Nle-1-L5A，0.1mg/kg，SC，QD(n＝6))、E(DSS：GLP2-2G-10Nle-1-L5A，0.3mg/kg，SC，QD(n＝6))、F(DSS：GLP2-2G-10Nle-1-L5A，1mg/kg，SC，QD(n＝6))，以及G(DSS：替度鲁肽，0.5mg/kg，SC，BID(n＝6))。
每周监测体重3次。在尸检前3天和4天进行药代动力学收集。在第33天，进行尸检，并进行测量。这些测量包括收集末梢血；解剖小肠；测量小肠的长度和重量；以及记录空大肠的长度和重量。
低剂量的GLP2-2G-10Nle-1-Ex4-L5A对体重减少显示出适度的作用。当与未接受治疗的小鼠相比时，用0.03mg/kg和0.3mg/kg的剂量治疗对体重减少具有保护作用。(图中未示出)。
如图20A-20B所示，GLP2-2G-10Nle-1-Ex4-L5A在慢性DSS诱导的结肠炎模型中可增加结肠长度和重量。当与未经治疗的动物(B组)相比时，用0.1mg/kg和更高剂量的GLP2-2G-10Nle-1-Ex4-L5A治疗的动物以及用替度鲁肽治疗的动物(D-G组)的结肠长度显著增加。与未经治疗的动物相比，用0.3mg/kg或更高剂量的GLP2-2G-10Nle-1-Ex4-L5A治疗的动物以及用替度鲁肽治疗的动物的结肠重量增加。
GLP2-2G-10Nle-1-Ex4-L5A也显著影响了小肠重量和长度。如图20C所示，与未经治疗的小鼠模型相比，用0.1mg/kg和更高剂量的GLP2-2G-10Nle-1-Ex4-L5A治疗以及用替度鲁肽治疗导致小肠长度显著增加。与未经治疗的小鼠相比，用0.3mg/kg或更高剂量的GLP2-2G-10Nle-1-Ex4-L5A治疗导致小肠重量显著增加(未示出)。
实施例U：NASH模型中的GLP-2-2G-5-L5A治疗
将5周龄C57BL/6小鼠置于缺乏胆碱的饮食(CDAA，Dyets#518753)或补充AA的对照饮食(CSAA，Dyets#518754)共19周。将小鼠分成如下所列3个处理组，每组8只小鼠：CSAA对照饮食，仅用媒介物处理；用媒介物处理的CDAA饮食(MCT，PO；盐水，SC)；以及用1mg/kgGLP2-2G-5-EX4-L5A皮下处理的CDAA饮食。15周后，用媒介物或化合物处理小鼠4周。在饮食诱导阶段每周监测体重，在治疗阶段每周监测3次体重。19周后，将动物安乐死，并且采集末梢血和肝脏样本用于血清分析、组织学和基因表达。
GLP2-2G-5-EX4-L5A的慢性治疗改善了肝功能的标志物。如图21A-21B所示，在喂食缺乏胆碱的饮食的小鼠中，与相同饮食的未经治疗小鼠相比，血清ALT和血清AST显著降低。与相同饮食的未经治疗小鼠相比，接受GLP2-2G-5-EX4-L5A治疗的小鼠的总血清胆红素也降低了。在7/8的GLP-2治疗的小鼠中胆囊增大。
如图21C所示，用GLP2-2G-5-EX4-L5A治疗导致肝纤维化评分降低了20％。用天狼猩红观察到胶原沉积/纤维化，并且使用以下量表对严重程度进行分级：0＝不存在；1＝最轻；2＝轻度；3＝中度；4＝显著；5＝重度。该治疗对体重没有显著影响，表明该治疗是耐受的。
还分析了这种治疗对肝脂肪变性和炎症的作用。脂肪变性通过由脆的、圆的、未染色的脂质空泡确定的肝细胞空泡化的百分比来分析，并且基于如下所列的量表来分配等级：0表示小于5％；1表示5-33％；2表示33-66％；以及3表示大于66％。如图21D所示，用GLP2-2G-5-EX4-L5A治疗未显著影响肝脏中的脂肪变性等级。通过评估炎性病灶的中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的浸润来分析小叶炎症。使用以下量表对小叶炎症进行评分：0表示无病灶；1表示2个病灶/200x视野；2表示2-4个病灶/200x场；以及3表示多于4个病灶/200x视野。如图21E所示，与未经治疗的CDAA饮食的动物相比，用GLP-2-2G-5-L5A治疗降低了小叶炎症的水平。
该实施例显示出在CDAA-NASH模型中，用GLP2-2G-5-EX4-L5A治疗改善了肝损伤的标志物并且防止了肝纤维化的恶化。
实施例V：长效GLP2激动剂治疗环境肠道功能障碍(EED)的小鼠模型
使用断奶营养不足模型来评估GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗环境肠道功能障碍(EED)的能力。将所有母畜置于等热量的巴西东北部(区域基本饮食-RBD)，当其幼仔10日龄时，蛋白质、脂肪和矿物质中度缺乏。在断奶时(3周龄)，将幼仔置于标准对照饮食(CD)或继续RBD。在4周龄时，每天一次皮下给予断奶幼畜药物或安慰剂(0.1mg/kg，配制在PBS(媒介物)中)，持续2-3周。每周测量体重和食物消耗两次。在断奶、6周龄和8周龄时收集粪便用于量热法和微生物组学。口服FITC-葡聚糖用作屏障功能的量度。在6周龄时，将小鼠安乐死，并且收集空肠组织用于形态学、免疫组织化学以及跨粘膜阻力和渗透性的腔室分析。
如图22A-22B所示，断奶为CD并用替度鲁肽或GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的雄性和雌性RBD小鼠的体重都有增加的趋势。然而，如图22C-22D所示，当施用替度鲁肽或长效GLP2激动剂时，断奶为RBD的雄性和雌性小鼠显示出体重恶化的趋势。
用替度鲁肽和长效GLP2激动剂治疗对肠的湿重和长度具有深远影响。如图22E所示，用替度鲁肽或GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的CD雄性显示出小肠湿体重/体重的显著增加。如图22F所示，与未经治疗的雌性相比，用替度鲁肽或GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的CD雌性显示出小肠湿重/体重的显著增加。此外，当与用替度鲁肽治疗相比时，用GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗也导致显著增加。与未经治疗的雄性相比，用替度鲁肽或GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的RBD雄性显示出小肠湿重/体重的显著增加。在RBD雌性中，与未经治疗的动物相比，仅用GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的动物显示出小肠湿重/体重的显著增加。
对于断奶为CD饮食的动物和断奶为RBD饮食的动物，当与未经治疗的动物相比时，用GLP2或替度鲁肽治疗导致小肠长度的显著增加。
用GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗对动物也具有肠营养作用。用替度鲁肽或GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的CD雄性具有比未经治疗的雄性显著更长的绒毛高度。用GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的CD雌性也具有比未经治疗的雌性显著更长的绒毛长度。经治疗和未经治疗的CD动物的隐窝深度。用替度鲁肽或GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的雄性比未经治疗的雄性具有更长的隐窝深度。
还在这些小鼠中测量了肠渗透性，其中FITC-葡聚糖相对荧光越大，肠渗透性越大。与未经治疗的小鼠相比，用替度鲁肽或GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的CD雄性在经治疗的小鼠中显示出渗透性降低的趋势。当与未经治疗的CD雌性小鼠相比时，用替度鲁肽或GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗的CD雌性小鼠显示出渗透性的显著降低。当与未经治疗的小鼠相比时，用替度鲁肽或GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗未显著影响RBD雌性或RBD雄性的渗透性。
未经治疗的CD小鼠显示出比未经治疗的RBD小鼠更高的肠渗透性水平。当用替度鲁肽治疗时，CD和RBD小鼠具有相似的总体渗透性水平。当与相同饮食的雄性小鼠相比时，用GLP2-2G-10Nle-1K-EX4-K5治疗时，雌性小鼠可能具有略高的渗透性水平。

Claims (150)

1.一种肽缀合物，其包含：
a)调节GLP-2受体的肽；以及
b)在第一氨基酸和第二氨基酸处与所述肽连接的钉合体。
2.根据权利要求1所述的肽缀合物，其中所述第一氨基酸和所述第二氨基酸独立地为含胺氨基酸或含巯基氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的肽缀合物，其中所述第一氨基酸和第二氨基酸独立地为半胱氨酸、高半胱氨酸、2-氨基-5-巯基戊酸或2-氨基-6-巯基己酸。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的肽缀合物，其中所述第一氨基酸和第二氨基酸为半胱氨酸。
5.根据权利要求1或2所述的肽缀合物，其中所述第一氨基酸和第二氨基酸独立地为赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸或高赖氨酸。
6.根据权利要求1或2或5中任一项所述的肽缀合物，其中所述第一氨基酸和第二氨基酸为赖氨酸。
7.根据权利要求1或2或5中任一项所述的肽缀合物，其中所述第一氨基酸和第二氨基酸为鸟氨酸。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的肽缀合物，其中所述第一氨基酸在所述肽中的位置为i，且所述第二氨基酸在所述肽中的位置为i+n，其中n为4-16。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的肽缀合物，其中所述第一氨基酸在所述肽中的位置为i，且所述第二氨基酸在所述肽中的位置为i+n，其中n为4-10。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的肽缀合物，其中所述第一氨基酸在所述肽中的位置为i，且所述第二氨基酸在所述肽中的位置为i+n，其中n为6-8。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的肽缀合物，其中所述第一氨基酸在所述肽中的位置为i，且所述第二氨基酸在所述肽中的位置为i+7。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1-9、21-29中任一项具有至少约80％同一性的序列。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1-9、21-29中任一项具有至少约90％同一性的序列。
14.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1-9、21-29中任一项具有至少约95％同一性的序列。
15.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1-9、21-29中任一项具有至少约99％同一性的序列。
16.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:1-9、21-29中任一项的序列。
17.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1或21具有至少约80％同一性的序列。
18.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1或21具有至少约90％同一性的序列。
19.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1或21具有至少约95％同一性的序列。
20.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:1或21具有至少约99％同一性的序列。
21.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:1或21的序列。
22.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:2或22具有至少约80％同一性的序列。
23.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:2或22具有至少约90％同一性的序列。
24.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:2或22具有至少约95％同一性的序列。
25.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:2或22具有至少约99％同一性的序列。
26.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:2或22的序列。
27.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:10-20、30-40中任一项具有至少约80％同一性的序列。
28.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:10-20、30-40中任一项具有至少约90％同一性的序列。
29.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:10-20、30-40中任一项具有至少约95％同一性的序列。
30.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:10-20、30-40中任一项具有至少约99％同一性的序列。
31.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:10-20、30-40中任一项的序列。
32.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:10或30具有至少约80％同一性的序列。
33.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:10或30具有至少约90％同一性的序列。
34.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:10或30具有至少约95％同一性的序列。
35.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含与SEQ ID NO:10或30具有至少约99％同一性的序列。
36.根据权利要求1-11中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:10或30的序列。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物的半衰期是未修饰形式的所述肽的半衰期的至少约2倍。
38.根据权利要求1-36中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物的半衰期是未修饰形式的所述肽的半衰期的至少约5倍。
39.根据权利要求1-36中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物的半衰期是未修饰形式的所述肽的半衰期的至少约10倍。
40.根据权利要求1-36中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物的结合亲和力在未修饰形式的所述肽的结合亲和力的约5％以内。
41.根据权利要求1-36中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物的结合亲和力在未修饰形式的所述肽的结合亲和力的约10％以内。
42.根据权利要求1-36中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物的结合亲和力在未修饰形式的所述肽的结合亲和力的约15％以内。
43.根据权利要求1-36中任一项所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物的结合亲和力在未修饰形式的所述肽的结合亲和力的约20％以内。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的肽缀合物，其中所述钉合体为式(I)的化合物：
Figure FDA0003781695390000041
其中：
A为任选取代的亚烷基、任选取代的亚芳基、任选取代的杂亚芳基、任选取代的-NR3-亚烷基-NR3-或-N-；
X1和X2独立地为键、-C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)-、-C(＝O)-亚烷基-、-亚烷基-C(＝O)NR3-、-亚烷基-NR3C(＝O)-、-C(＝O)NR3-亚烷基-、-NR3C(＝O)-亚烷基-、-亚烷基-C(＝O)NR3-亚烷基-或-亚烷基-NR3C(＝O)-亚烷基-；
其中X1连接至所述肽的第一氨基酸，且X2连接至所述肽的第二氨基酸；
R为氢或-(L)s-Y；
每个L独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-O-亚烷基-、-C(＝O)-亚烷基-、-亚烷基-C(＝O)-、-NR3-亚烷基-、-亚烷基-NR3-、-S-亚烷基-、-亚烷基-S-、-S(＝O)-亚烷基-、-亚烷基-S(＝O)-、-S(＝O)2-亚烷基、-亚烷基-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-NR3C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)NR3-亚烷基-、-NR3C(＝O)-亚烷基-NR3-、-亚烷基-C(＝O)NR3-、-C(＝O)NR3-亚烷基-、-亚烷基-NR3C(＝O)-或-NR3C(＝O)-亚烷基-；
v为2-20；
R1或R2各自独立地为氢、卤素、-CN、-ORa、-SRa、-S(＝O)Rb、-NO2、-NRcRd、-S(＝O)2Rd、-NRaS(＝O)2Rd、-S(＝O)2NRcRd、-C(＝O)Rb、-OC(＝O)Rb、-CO2Ra、-OCO2Ra、-C(＝O)NRcRd、-OC(＝O)NRcRd、-NRaC(＝O)NRcRd、-NRaC(＝O)Rb、-NRaC(＝O)ORa、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-ORa、-NRcRd中的一个、两个或三个取代；
或R1和R2一起形成C1-C6环烷基或C1-C6杂环烷基；
每个R3独立地为氢、-S(＝O)Rb、-S(＝O)2Ra、-S(＝O)2NRcRd、-C(＝O)Rb、-CO2Ra、-C(＝O)NRcRd、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；
Y为氢、C1-C6烷基、-CO2H、-CO2(C1-C6烷基)、-CO2NH2、-CO2N(烷基)2或-CO2NH(烷基)；以及
s为0-20；
Ra为氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
Rb为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
Rc和Rd各自独立地为氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
或者Rc和Rd与它们所连接的氮原子一起形成杂环烷基或杂芳基；其中杂环烷基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代。
45.根据权利要求44所述的肽缀合物，其中A为任选取代的亚烷基。
46.根据权利要求44或45所述的肽缀合物，其中A为-(CH2)t-，其中t为1-12。
47.根据权利要求44所述的肽缀合物，其中A为任选取代的亚芳基。
48.根据权利要求44所述的肽缀合物，其中A为-NR3-亚烷基-NR3-。
49.根据权利要求44所述的肽缀合物，其中A为-N-。
50.根据权利要求44-49中任一项所述的肽缀合物，其中X1和X2为-C(＝O)-。
51.根据权利要求44-49中任一项所述的肽缀合物，其中X1和X2为-亚烷基-C(＝O)-。
52.根据权利要求44-49中任一项所述的肽缀合物，其中X1和X2为-CH2-C(＝O)-。
53.根据权利要求44-49中任一项所述的肽缀合物，其中X1和X2独立地为-亚烷基-C(＝O)NR3-。
54.根据权利要求44-49中任一项所述的肽缀合物，其中X1和X2独立地为-CH2-C(＝O)NR3-。
55.根据权利要求44-49中任一项所述的肽缀合物，其中X1和X2独立地为-亚烷基-C(＝O)NR3-亚烷基-。
56.根据权利要求44-49中任一项所述的肽缀合物，其中X1和X2独立地为-CH2-C(＝O)NR3-CH2CH2-。
57.根据权利要求44-56中任一项所述的肽缀合物，其中>A-R具有以下结构：
Figure FDA0003781695390000071
其中r1和r2各自独立地为0-4。
58.根据权利要求44-56中任一项所述的肽缀合物，其中>A-R具有以下结构：
Figure FDA0003781695390000072
59.根据权利要求44-56中任一项所述的肽缀合物，其中>A-R具有以下结构：
Figure FDA0003781695390000073
其中p1为1-5。
60.根据权利要求44-56中任一项所述的肽缀合物，其中>A-R具有以下结构：
Figure FDA0003781695390000081
61.根据权利要求44-56中任一项所述的肽缀合物，其中>A-R具有以下结构：
Figure FDA0003781695390000082
62.根据权利要求44-61中任一项所述的肽缀合物，其中s为1-15。
63.根据权利要求44-62中任一项所述的肽缀合物，其中s为1-10。
64.根据权利要求44-62中任一项所述的肽缀合物，其中s为5-15。
65.根据权利要求44-62中任一项所述的肽缀合物，其中s为5-10。
66.根据权利要求44-65中任一项所述的肽缀合物，其中Y为氢或-CO2H。
67.根据权利要求44-66中任一项所述的肽缀合物，其中每个L独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；且v为2-20。
68.根据权利要求1所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物包含以下结构：
Figure FDA0003781695390000083
Figure FDA0003781695390000091
Figure FDA0003781695390000101
Figure FDA0003781695390000111
69.根据权利要求1所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物包含以下结构：
Figure FDA0003781695390000112
Figure FDA0003781695390000121
Figure FDA0003781695390000122
其中n为1-4且m为6-20。
70.根据权利要求1所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物包含以下结构：
Figure FDA0003781695390000123
71.根据权利要求1所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物包含以下结构：
Figure FDA0003781695390000131
72.根据权利要求1所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物包含以下结构：
Figure FDA0003781695390000132
73.根据权利要求1所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物包含以下结构：
Figure FDA0003781695390000133
74.根据权利要求1所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物包含以下结构：
Figure FDA0003781695390000141
75.根据权利要求1所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物包含以下结构：
Figure FDA0003781695390000142
76.根据权利要求1所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物包含：
a)调节所述GLP-2受体的肽，所述肽包含SEQ ID NO:1-9、21-29中任一项的序列；以及
b)在第一半胱氨酸和第二半胱氨酸处与所述肽连接的具有以下结构的钉合体(“S”为半胱氨酸残基的一部分)：
Figure FDA0003781695390000143
77.根据权利要求1所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物包含：
a)调节所述GLP-2受体的肽，所述肽包含SEQ ID NO:1或21的序列；以及
b)在第一半胱氨酸和第二半胱氨酸处与所述肽连接的具有以下结构的钉合体(“S”为半胱氨酸残基的一部分)：
Figure FDA0003781695390000151
78.根据权利要求1所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物包含：
a)调节所述GLP-2受体的肽，所述肽包含SEQ ID NO:2或22的序列；以及
b)在第一半胱氨酸和第二半胱氨酸处与所述肽连接的具有以下结构的钉合体(“S”为半胱氨酸残基的一部分)：
Figure FDA0003781695390000152
79.根据权利要求1所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物包含：
a)调节所述GLP-2受体的肽，所述肽包含SEQ ID NO:10-20、30-40中任一项的序列；以及
b)在第一赖氨酸和第二赖氨酸处与所述肽连接的具有以下结构的钉合体(“NH”为赖氨酸残基的一部分)：
Figure FDA0003781695390000153
80.根据权利要求1所述的肽缀合物，其中所述肽缀合物包含：
a)调节所述GLP-2受体的肽，所述肽包含SEQ ID NO:10或30的序列；以及
b)在第一赖氨酸和第二赖氨酸处与所述肽连接的具有以下结构的钉合体(“NH”为赖氨酸残基的一部分)：
Figure FDA0003781695390000161
81.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-80中任一项所述的肽缀合物和药学上可接受的赋形剂。
82.一种用于治疗有需要的对象的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述对象施用包含治疗有效量的根据权利要求1-80中任一项所述的肽缀合物的组合物。
83.根据权利要求81所述的方法，其中所述疾病或病症是糖尿病或肥胖症、或与糖尿病或肥胖症相关的医学病症。
84.根据权利要求82所述的方法，其中所述疾病或病症是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或心血管疾病。
85.根据权利要求82所述的方法，其中所述疾病或病症是胃肠道(GI)病症。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述胃肠道(GI)病症是短肠综合征(SBS)、炎性肠综合征(IBS)或炎性肠病(IBD)。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述炎性肠病(IBD)是克罗恩病。
88.根据权利要求86所述的方法，其中所述炎性肠病(IBD)是溃疡性结肠炎。
89.根据权利要求82所述的方法，其中所述疾病或病症是银屑病。
90.根据权利要求82所述的方法，其中所述疾病或病症是阿尔茨海默病、帕金森病或亨廷顿病。
91.根据权利要求82所述的方法，其中所述有需要的对象正在经受化疗。
92.根据权利要求82所述的方法，其中所述有需要的对象患有辐射诱导的胃肠道粘膜炎。
93.根据权利要求82所述的方法，其中所述有需要的对象患有化疗诱导的腹泻(CID)。
94.根据权利要求82所述的方法，其中所述有需要的对象患有全胃肠外营养(TPN)诱导的肠萎缩。
95.一种下式的钉合体：
Figure FDA0003781695390000171
其中：
A为任选取代的亚烷基、任选取代的亚芳基、任选取代的杂亚芳基、任选取代的-NR3-亚烷基-NR3-或-N-；
X1和X2独立地为键、-C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)-、-C(＝O)-亚烷基、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-C(＝O)NR3-亚烷基-；
Y1和Y2独立地为卤素、-COOH、
Figure FDA0003781695390000172
或独立地为含巯基氨基酸的-S-或-CONH-，其中-NH-为调节GLP-2受体的肽中含胺氨基酸的一部分；
R为氢或-(L)s-Y；
每个L独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-O-亚烷基-、-C(＝O)-亚烷基-、-亚烷基-C(＝O)-、-NR3-亚烷基-、-亚烷基-NR3-、-S-亚烷基-、-亚烷基-S-、-S(＝O)-亚烷基-、-亚烷基-S(＝O)-、-S(＝O)2-亚烷基、-亚烷基-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-NR3C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)NR3-亚烷基-、-NR3C(＝O)-亚烷基-NR3-、-亚烷基-C(＝O)NR3-、-C(＝O)NR3-亚烷基-、-亚烷基-NR3C(＝O)-或-NR3C(＝O)-亚烷基-；
v为2-20；
R1或R2各自独立地为氢、卤素、-CN、-ORa、-SRa、-S(＝O)Rb、-NO2、-NRcRd、-S(＝O)2Rd、-NRaS(＝O)2Rd、-S(＝O)2NRcRd、-C(＝O)Rb、-OC(＝O)Rb、-CO2Ra、-OCO2Ra、-C(＝O)NRcRd、-OC(＝O)NRcRd、-NRaC(＝O)NRcRd、-NRaC(＝O)Rb、-NRaC(＝O)ORa、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-ORa、-NRcRd中的一个、两个或三个取代；
或R1和R2一起形成C1-C6环烷基或C1-C6杂环烷基；
每个R3独立地为氢、-S(＝O)Rb、-S(＝O)2Ra、-S(＝O)2NRcRd、-C(＝O)Rb、-CO2Ra、-C(＝O)NRcRd、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-ORa或-NRcRd中的一个、两个或三个取代；
Y为氢、C1-C6烷基、-CO2H、-CO2(C1-C6烷基)、-CO2NH2、-CO2N(烷基)2或-CO2NH(烷基)；以及
s为0-20；
Ra为氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
Rb为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
Rc和Rd各自独立地为氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C8环烷基、C2-C8杂环烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基和杂烷基任选地被卤素、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；并且环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代；
或者Rc和Rd与它们所连接的氮原子一起形成杂环烷基或杂芳基；其中杂环烷基和杂芳基任选地被卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OH、-OMe或-NH2中的一个、两个或三个取代。
96.根据权利要求95所述的钉合体，其中A为任选取代的亚烷基。
97.根据权利要求95或96所述的钉合体，其中A为-(CH2)t-，其中t为1-12。
98.根据权利要求95所述的钉合体，其中A为任选取代的亚芳基。
99.根据权利要求95所述的钉合体，其中A为-NR3-亚烷基-NR3-。
100.根据权利要求95所述的钉合体，其中A为-N-。
101.根据权利要求95-100中任一项所述的钉合体，其中X1和X2为-C(＝O)-。
102.根据权利要求95-100中任一项所述的钉合体，其中X1和X2为-亚烷基-C(＝O)-。
103.根据权利要求95-100中任一项所述的钉合体，其中X1和X2为-CH2-C(＝O)-。
104.根据权利要求95-100中任一项所述的钉合体，其中X1和X2独立地为-亚烷基-C(＝O)NR3-。
105.根据权利要求95-100中任一项所述的钉合体，其中X1和X2独立地为-CH2-C(＝O)NR3-。
106.根据权利要求95-100中任一项所述的钉合体，其中X1和X2独立地为-亚烷基-C(＝O)NR3-亚烷基-。
107.根据权利要求95-100中任一项所述的钉合体，其中X1和X2独立地为-CH2-C(＝O)NR3-CH2CH2-。
108.根据权利要求95-107中任一项所述的钉合体，其中>A-R具有以下结构：
Figure FDA0003781695390000201
其中r1和r2各自独立地为0-4。
109.根据权利要求95-107中任一项所述的钉合体，其中>A-R具有以下结构：
Figure FDA0003781695390000202
110.根据权利要求95-107中任一项所述的钉合体，其中>A-R具有以下结构：
Figure FDA0003781695390000203
其中p1为1-5。
111.根据权利要求95-107中任一项所述的钉合体，其中>A-R具有以下结构：
Figure FDA0003781695390000204
112.根据权利要求95-107中任一项所述的钉合体，其中>A-R具有以下结构：
Figure FDA0003781695390000205
113.根据权利要求95-112中任一项所述的钉合体，其中s为1-15。
114.根据权利要求95-113中任一项所述的钉合体，其中s为1-10。
115.根据权利要求95-113中任一项所述的钉合体，其中s为5-15。
116.根据权利要求95-113中任一项所述的钉合体，其中s为5-10。
117.根据权利要求95-116中任一项所述的钉合体，其中Y为氢或-CO2H。
118.根据权利要求95-117中任一项所述的钉合体，其中每个L独立地为-(CR1R2)v-、-亚烷基-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-、-亚烷基-C(＝O)NR3-或-亚烷基-NR3C(＝O)-；且v为2-20。
119.根据权利要求94-118所述的钉合体，其中Y1和Y2为卤素。
120.根据权利要求94-118所述的钉合体，其中Y1和Y2为-COOH。
121.根据权利要求95-118所述的钉合体，其中Y1和Y2为
Figure FDA0003781695390000211
122.根据权利要求95-118所述的钉合体，其中Y1和Y2为调节所述GLP-2受体的肽中两个含巯基氨基酸的-S-。
123.根据权利要求95-118所述的钉合体，其中Y1和Y2为调节所述GLP-2受体的肽中的间隔7个氨基酸的两个含巯基氨基酸的-S-。
124.根据权利要求95-118所述的钉合体，其中Y1和Y2为-CONH-，其中-NH-为调节所述GLP-2受体的肽中的两个含胺氨基酸的一部分。
125.根据权利要求95-118所述的钉合体，其中Y1和Y2为-CONH-，其中-NH-为调节所述GLP-2受体的肽中的间隔7个氨基酸的两个含胺氨基酸的一部分。
126.根据权利要求95所述的钉合体，其具有以下结构：
Figure FDA0003781695390000221
127.根据权利要求95所述的钉合体，其具有以下结构：
Figure FDA0003781695390000222
128.根据权利要求95所述的钉合体，其具有以下结构：
Figure FDA0003781695390000223
129.根据权利要求95所述的钉合体，其具有以下结构：
Figure FDA0003781695390000231
130.根据权利要求95所述的钉合体，其具有以下结构：
Figure FDA0003781695390000232
131.一种肽序列，其为SEQ ID NO:1。
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