JP2018535195A - タンパク質コンジュゲート - Google Patents
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Abstract
Description
S1、S2及びS3は、個々のスペーサーを表し、
R1、R2及びR3は、個々に反応性末端を表す]
を有する。
タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-S-タンパク質2 (式II)
[式中、チオール反応性リンカーは、構造:
LG1-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2
(式中、LG1は、LG2よりも高い反応性を有する)
を有する]
のタンパク質コンジュゲートを得る、タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
a) タンパク質1-SHをリンカーの-NH-C(=O)-CH2-LG1と反応させる工程と、
b) コンジュゲート中間体:タンパク質1-S-CH2-C-(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2を得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
d) c)の中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
e) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法に関する。
IgG1及びIgG4の標準Fcポリペプチド配列は配列表で提供しているが、情報の参照を容易にするためにここに重複記載する。
EU番号付与による全長重鎖のAA231〜447に対応する。
EU番号付与による全長重鎖のAA217〜230に対応する。
PKSCDKTHTCPPCP
EU番号付与による全長重鎖のAA231〜447に対応する。
EU番号付与による全長重鎖のAA217〜230に対応する。
本発明は、タンパク質コンジュゲート及びそのようなコンジュゲートを調製する方法に関する。本方法は、2つ以上のポリペプチドを共有結合的に連結するのに有用であり得る。
本発明は、タンパク質コンジュゲート、例えば、翻訳後化学反応により共有結合的に連結されている2つ以上のタンパク質又はポリペプチドを含む化合物に関する。このような化合物及び分子は、複数の領域における、特に治療用化合物の開発に関連した使用を見出すことができる。
タンパク質又はポリペプチドは、当業者が一緒に共有結合的に連結させたいと考える任意のタンパク質又はポリペプチドであってよい。当業者は他のタンパク質及びポリペプチドに本方法を容易に適応させることができるので、したがって本発明は例示した化合物にとどまらない。以下において、治療用タンパク質及び治療用タンパク質の特性を改変することを目的としたエフェクタータンパク質を含むコンジュゲートについて重点を置く。また本発明の化合物の代替的使用も予見される。
治療用タンパク質は、疾患又は障害を処置する方法において有用なタンパク質又はポリペプチド、例えばアミノ酸配列である。
本明細書で使用される場合の用語「成長ホルモン化合物」とは、総称的に、配列番号5により同定される成熟ヒト成長ホルモンの機能的特徴を実質的に保持する成長ホルモン分子を意味する。したがって、本化合物は、成長ホルモン、成長ホルモン融合タンパク質、成長ホルモン変異体若しくは類似体、又は成長ホルモンコンジュゲート又は誘導体であり、アシル化又はアルキル化成長ホルモンを含むものであり得る。
エフェクタータンパク質は、(治療用)タンパク質の特性を改変することができるポリペプチドである。エフェクタータンパク質の限定されない例は、PEG、アルブミン、XTEN、及びFcドメインであり、最後の記載は本出願の重要な例である。
抗体の結晶性断片領域(Fc領域又はFcドメイン)は、抗体の尾部である。IgG、IgA及びIgD抗体の場合、Fc領域は、2つの同一ポリペプチドを含有し、これらは両方とも重鎖の第2定常ドメイン及び第3定常ドメイン(CH2及びCH3)を含む。IgM及びIgE抗体のFc領域は、それぞれのポリペプチド鎖中に3つの重鎖定常ドメイン(CHドメイン2〜4)を含む。Fcドメインのタンパク質配列は、本明細書ではFcポリペプチドと呼ばれ、通常、少なくともCH2ドメイン及びCH3ドメインを含む。2つのFcポリペプチドは非共有結合的に、またおそらくは共有結合的にも相互作用してヒンジシステインがジスルフィド結合を形成し得るので、Fcドメインは二量体とも呼ぶことができる。
リンカーは、タンパク質を共有結合的に連結するために使用される化学的成分である。リンカーは別個の成分であり、例えば、ジスルフィド結合のみによって連結されているタンパク質は、本発明によるリンカーを含むとは考えない。以下に示すように、リンカーは、アミノ酸、アミノ酸様エレメント及び非アミノ酸エレメントを含み得るが、リンカーはそれ自体、コンジュゲートの1つ又は複数のタンパク質の一部として異種発現により産生されない。
ハロ1-CH2-C(=O)-NH-スペーサー-NH-C(=O)-CH2-ハロ2、
Cl-CH2-C(=O)-NH-スペーサー-NH-C(=O)-CH2-Br、又は
Br-CH2-C(=O)-NH-スペーサー-NH-C(=O)-CH2-Cl
を有する。
上述のように、本発明は、タンパク質とFcドメインとの連結を網羅する。とりわけ、Fcドメインは、ポリペプチド間のジスルフィド結合を含む、共有結合及び非共有結合により通常一緒になって保持される2つのポリペプチドからなる。従来の二価リンカーを使用する共有結合的連結の場合、連結はタンパク質からFcポリペプチドの一方のみになされる。本発明による三価リンカーを使用すると、2つのFcポリペプチド鎖の両方がタンパク質に連結されているタンパク質コンジュゲートを得ることができる。このような三価リンカーの使用がFcドメインのコンジュゲーションに限定されないのは明らかである。
S1、S2及びS3は、個々のスペーサーを表し、
R1、R2及びR3は、タンパク質分子にコンジュゲーションするための(好適な)個々の反応性末端を表す]
である。
を有するリンカーを提供する。
グリシンスペーサーエレメントは、ポリエチレングリコール単位を含めることにより延長され得る。
を含む二重ラジカルである。このような一実施形態において、n'は2〜20から選択される整数である。このような一実施形態において、n'は2〜10又は2〜5から選択される整数である。一実施形態において、n'は2である。
を有する。特定の一実施形態において、k=1及びn=1の場合はスペーサーエレメント
である。
である。
したがって、本発明のタンパク質コンジュゲートは、リンカー部分を介して互いに共有結合されている2つ以上の個々のポリペプチド(タンパク質1、タンパク質2及び/又はタンパク質3)を含む。一実施形態において、タンパク質1、タンパク質2及びタンパク質3は、個々のポリペプチドである。一実施形態において、個々のポリペプチドは同一であってもよく、又はタンパク質1、タンパク質2及びタンパク質3の2つは同一であってもよい。したがって、個々のポリペプチドは、それぞれN末端及びC末端のアミノ酸残基を有する。その際に、個々のポリペプチドは、例えばジスルフィド結合を介して、互いに、又は更にポリペプチド/タンパク質に追加的に結合され得る。
リンカーは化学的部分であり、
Sは硫黄原子であり、
タンパク質1は、前記リンカー及び硫黄原子を介してタンパク質2及びタンパク質3に共有結合的に連結されている]
を有する。
一実施形態において、タンパク質2及びタンパク質3は同じFcポリペプチドであり、一緒になってFcドメインを形成する。本明細書で説明しているように、Fcポリペプチドへの連結は、ヒンジ領域のジスルフィド架橋を還元し、各々のシステインをリンカーに、例えばリンカーアーム2及び3を介して連結することによって得ることができる。第3のリンカーアーム(ここではリンカーアーム1)は、目的のタンパク質1に前又は後でコンジュゲートされる。タンパク質コンジュゲートの調製に関するセクションで説明されているように、コンジュゲートは、
タンパク質1-RR1-S1-U-[S2-NH-C(=O)-CH2-S-Fc]2
[式中、
RR1は反応性末端基を表し、
Uは中心の単位を表し、
S1及びS2は個々のスペーサーを表し、FcはFcポリペプチドである]
を有する。
タンパク質1-A-(B-Fc)2
により説明することができることになる。
タンパク質1-A-(B-S-Fc)2
であり、チオエーテルを含む場合、構造は、Fcのシステインの-CH2-も示すならば、
タンパク質1-A-(B-CH2-S-Fc)2、又はタンパク質1-A-(B-CH2-S-CH2-Fc)2
である。連結がチオールとハロアセトアミドのカップリングにより得られる場合、その際、Bは、チオールとハロアセトアミドの反応から残っている少なくとも-NH-C(=O)-CH2-エレメントを含み、
タンパク質1-A-(B'-NH-C(=O)-CH2-S-Fc)2
を提供する。
タンパク質1-A-(CH2-CH2-NH-C(=O)-CH2-S-Fc)2
のコンジュゲート構造を提供し、式中、Aはタンパク質1に接続しているリンカー単位であり、これは、本願の他の箇所で説明しているように、中心の単位(少なくとも3つの結合についての選択肢を有する)と、適切なスペーサーと、タンパク質1への連結を提供する反応性末端基とを含む。
一態様において、本発明は成長ホルモンFcコンジュゲートに関し、そのようなGHコンジュゲートは、好ましくは、野生型ヒト成長ホルモンに比べてin vivo半減期(T1/2)が増加している。更に、成長ホルモンFcコンジュゲートは、好ましくは、アッセイ1及びアッセイ2で説明されているように、BAFアッセイで受容体結合及び活性を試験することによってin vitroでアッセイすることができるヒト成長ホルモンの治療能力を維持する。動物モデルを使用して、成長ホルモンFcコンジュゲートの治療可能性を更に評価することができる(アッセイ3〜5)。
本発明によるタンパク質コンジュゲートは、医薬組成物として製剤化することができる。
本明細書で説明されているタンパク質コンジュゲートは、コンジュゲートのタンパク質の併用治療効果に応じて、様々な疾患及び障害の処置に有用であり得る。
本発明の一態様は、本明細書に説明されているタンパク質コンジュゲートを調製する方法に関する。コンジュゲートしようとするタンパク質(タンパク質1、タンパク質2及び任意のタンパク質3)、並びにリンカーは、別々に生成され、適切な反応において一緒にカップリングされる。
目的のタンパク質に応じて、様々な供給源が当業者には利用可能である。タンパク質は、適切な宿主、例えば大腸菌、酵母又は哺乳動物細胞における異種発現によってのみ、組換えにより産生され得る(Molecular Cloning: A Laboratory Manual by Joseph Sambrook, E. F. Fritsch及びJ. Sambrook(著))。
本明細書において上記で説明しているように、リンカーは、硫黄原子を介して1つ又は複数のタンパク質と共有結合している。硫黄原子は、一実施形態において、タンパク質チオール由来である。タンパク質チオールの最も一般的な供給源は、アミノ酸システインである。システインはジスルフィド結合に関与し得るが、チオールを供給するシステインは通常ジスルフィド結合に関与しないことが好ましい場合がある。或いは、ジスルフィド結合を還元して、コンジュゲーションに利用可能な2つの硫黄原子を提供することができる。
本発明のリンカーは標準的な化学技術によって生成することができ、本明細書には多数の例が含まれている。
コンジュゲーションで使用されるタンパク質及び使用される個々のリンカーに応じて、様々な方法を適用することができるが、当業者には、本発明の概念から逸脱することなく、任意の特定のニーズに対して本明細書に記載されている方法を調整することができることが予測されよう。
LG1-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2、
[式中、LG1はLG2よりも高い反応性を有する]
を使用して、タンパク質1-SHとタンパク質2-SHを一緒にカップリングして式IIのタンパク質コンジュゲート
式II タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-S-タンパク質2
を得る、タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
a) タンパク質1-SHをリンカーの-NH-C(=O)-CH2-LG1と反応させる工程と、
b) コンジュゲート中間体:タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2を得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
d) c)の中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
e) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法に関する。
タンパク質1-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG
を有する中間体を提供する代替の経路によってカップリングされ得る。
タンパク質1-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG
を有する中間体を使用して実施される、若干変更された方法で更に使用され得る。
式I: タンパク質1-リンカー-NH-C(=O)-CH2-S-タンパク質2
のタンパク質コンジュゲートを得る、タンパク質コンジュゲートを調製する方法
[式中、LG2は低反応性の脱離基である]であって、
b) コンジュゲート中間体:タンパク質1-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2を得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
d) c)によって得られる中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
e) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法に関する。
を使用して、タンパク質1-SHと2×(タンパク質2-SH)を一緒にカップリングして、
式IV
方法であって、
a) タンパク質1-SHをリンカーの-NH-C(=O)-CH2-LG1 (R1)と反応させる工程と、
b) コンジュゲート中間体:タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー[-NH-C(=O)-CH2-LG2]2を得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
d) c)の中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
e) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法に関する。
b) コンジュゲート中間体:タンパク質1-リンカー[-NH-C(=O)-CH2-LG2]2を得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
d) c)の中間体をタンパク質2-SH及びタンパク質3-SHと反応させる工程と、
e) タンパク質コンジュゲートを得る工程。
式III
a) コンジュゲート中間体又は構造:
を得る工程と、
b) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
c) b)の中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
d) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む。
上記で説明した方法の全体的な設定に基づけば、説明されている一連の生成物及び中間体は本発明の一部である。
1. 以下の構造
リンカーは化学的部分であり、
Sは硫黄原子であり、
タンパク質1は、リンカー及び硫黄原子を介してタンパク質2及びタンパク質3に共有結合的に連結されている]
のタンパク質コンジュゲート。
を有する、実施形態1のタンパク質コンジュゲート。
タンパク質1-RR1-S1-U-[S2-NH-C(=O)-CH2-S-Fc]2
[式中、
RR1は反応性末端基であり、
S1及びS2は個々のスペーサーを表し、
Uは中心の単位を表し、
FcはFcポリペプチドである]
を有する、実施形態1〜8のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
を有する、実施形態1〜10のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
GH-RR1-S1-U-[S2-NH-C(=O)-CH2-S-Fc]2
[式中、
GHは成長ホルモン分子を表し、
RR1は反応性末端基を表し、
S1及びS2は個々のスペーサーを表し、
Uは中心の単位を表し、
FcはFcポリペプチドである]
を有する、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のコンジュゲート。
S1、S2及びS3は個々のスペーサーを表し、
R1、R2及びR3は個々に反応性末端を表す]
の三価リンカー。
のリンカーを提供する、実施形態33〜38のいずれか1つに記載のリンカー。
45. 第1のリンカーアームが、構造LG1-CH2-C(=O)-S1-を有する、実施形態33〜44のいずれか1つに記載のリンカー。
の群から選択される、実施形態33〜53のいずれか1つに記載のリンカー。
及び
からなる群から選択される、実施形態33〜55のいずれか1つに記載のリンカー。
タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-S-タンパク質2 (式II)
[式中、チオール反応性リンカーは構造:
LG1-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2
(式中、LG1はLG2より高い反応性を有する)
を有する]
のタンパク質コンジュゲートを得る、タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
a) タンパク質1-SHをリンカーの-NH-C(=O)-CH2-LG1と反応させる工程と、
b) コンジュゲート中間体:タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2を得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
d) c)の中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
e) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法。
タンパク質1-リンカー-NH-C(=O)-CH2-S-タンパク質2 (式I)
[式中、LGは低反応性の脱離基である]
のタンパク質コンジュゲートを得る、タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
b) コンジュゲート中間体:タンパク質1-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LGを得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLGの反応性を増大させる工程と、
d) b)のコンジュゲート中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
e) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法。
b) コンジュゲート中間体又は構造:
を得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
d) b)の中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
e) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法。
を有する]
のタンパク質コンジュゲートを得る、タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
a) タンパク質1-SHをリンカーの-NH-C(=O)-CH2-LG1と反応させる工程と、
b) コンジュゲート中間体:タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー[-NH-C(=O)-CH2-LG2]2を得る工程と、
c) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
d) c)の中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
e) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法。
amu=原子質量単位
Boc=tert-ブチルオキシカルボニル
O-t-Bu=tert-ブチルエステル
t-Bu=tert-ブチル
CDCl3=ジュウテリオクロロホルム
CD3OD=テトラジュウテリオメタノール
CV=カラム体積
DMSO-d6=ヘキサデューテリオジメチルスルホキシド
DCM=DCM、CH2Cl2、塩化メチレン
DIC=ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA=ジイソプロピルエチルアミン
DMF=N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO=ジメチルスルホキシド
DTT=ジチオスレイトール
EDAC=1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
Et2O=ジエチルエーテル
EtOAc=酢酸エチル
FA=ギ酸
Fmoc=9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル
Fmoc-Glu-O-t-Bu=N-Fmoc-グルタミン酸-1-t-ブチルエステル
Fmoc-Lys(Mtt)-OH=(S)-6-[(ジフェニル-p-トリル-メチル)-アミノ]-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸
Fmoc-OEG-OH=(2[2-(Fmoc-アミノ)エトキシ]エトキシ)酢酸
Fmoc-Thx-OH=N-Fmoc-trans-4-アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸
H20=水
hr(s)=時間
Hz=ヘルツ
HOBt=1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC=高圧液体クロマトグラフィー
HPLC-MS=高圧液体クロマトグラフィー-質量分析
i.v.=静脈内
L=リットル
M=モル
mbar=ミリバール
mg=ミリグラム
min.=分
mL=ミリリットル
mM=ミリモル
mol=モル(s)
mmol=ミリモル
m/z=質量対電荷比
MS=質量分析
MeCN=アセトニトリル
MeOH=メタノール
μL=マイクロリットル
N=正常
nm=ナノメートル
nmol=ナノモル
NaCl=塩化ナトリウム
NaOH=水酸化ナトリウム
NMR=核磁気共鳴分光法
OEG=(2[2-(アミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル
ppm=百万分の一
PyBrOP=ブロモ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
p.o.=経口当たり
RP=逆相
rt又はRT=室温
tr又はRt=保持時間
sec=秒
s.c.=皮下
TCTU=O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル}-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
TEA=トリエチルアミン
TFA=トリフルオロ酢酸
THF=テトラヒドロフラン
TIS=トリイソプロピルシラン
TSTU=0-(N-スクシンイミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウラニウムテトラフルオロボレート
HATU=1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート
TCEP=トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン
TPPDS=ビス(p-スルホナトフェニル)フェニルホスフィン
TPPTS=トリス((m-スルホナトフェニル)フェニルホスフィン
方法1-成長ホルモンタンパク質を調製及び分析するための方法
成長ホルモン又は成長ホルモン変異体をコードする遺伝子をプラスミドベクターに組換え的に挿入した。続いて、適切な大腸菌株をプラスミドベクターの使用により形質転換した。hGH又はGH変異体は、N末端メチオニンにより発現させることができるか、又はMEAE融合体として発現させることができ、これからMEAE配列は続いて切断される。
完全精製タンパク質は、MALDI-MSを使用して分析した。観察された質量は、アミノ酸配列から推定される理論的質量に合致した。
重炭酸アンモニウムバッファー中1mg/mLの試験化合物溶液100μLを、37℃で24時間まで酵素によって分解する。部分試料を様々な時点で採取し、1%TFAへの10倍希釈により試料を酸性化させることによってタンパク質分解反応を停止させる。これらの希釈試料を逆相HPLCにより分析し、タンパク質分解による消化の程度を評価する。
水中0.1%TFA〜0.1%TFA含有100%MeCNの直線勾配で溶出させる逆相Vydac C4 2×150mmカラムに、30分間にわたり流速0.2mL/分で10μlの上記溶液を注入する。ピークの検出は、214nmにおけるUV吸収で実施する。時点t=Tにおける完全化合物のパーセンテージ(%)は、時点t=T(AT)におけるピーク面積とt=0(A0)におけるピーク面積から(AT/A0)×100%として計算する。GraphPad Prismソフトウェアver 5.01を使用して、完全化合物のパーセンテージ(%)を時間に対してプロットする。また半減期(T1/2)は、GraphPad Prismソフトウェアによって、1相減衰として計算する。使用することができる酵素の例は、エラスターゼ(Sigma社製、ブタ膵臓由来)及びキモトリプシン(Roche社製、配列決定グレード)である。バッファーの例は、50mMの重炭酸アンモニウム、pH=8.5である。
キャピラリー電気泳動は、Agilent Technologies 3DCEシステム(Agilent Technologies社製)を使用して実施した。データ取得及びシグナル処理は、Agilent Technologies 3DCE ChemStationを使用して実施した。キャピラリーは、64.5cm(有効な長さ56.0cm)で、50μm内径のAgilent社製の「Extended Light Path Capillary」であった。UV検出は、200nmで実施した(16nm Bw、基準380nm及び50nm Bw)。電気泳動電解質は、50mMのpH7 リン酸緩衝液であった(方法A)。キャピラリーは、0.1MのNaOHで3分間、次いで、Milli-Q水で2分間、電解質で3分間、調整した。各泳動後、キャピラリーをmilli-Q水で2分間、リン酸で2分間、milli-Q水で2分間洗い流した。流体力学的注入は、50mbarで4.0秒間行った。電圧は+25kVであった。キャピラリー温度は30℃であり、電気泳動時間は10.5分であった。
分子量は、Autoflex Maldi-Tof装置(Bruker社製)を使用して決定した。試料は、マトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシ-桂皮酸を使用して調製した。
RP-HPLC分析は、Vydac 218TP54 4.6mm×250mm 5μm C-18シリカカラム(The Separations Group社製、Hesperia)を使用してAgilent 1100システムで実施した。検出は、214nm、254nm、280nm及び301nmでのUVによるものであった。カラムは0.1%TFA/H2Oで平衡化し、試料は0.1%TFA/H2Oに対して0〜90%MeCNの適切な勾配により溶出した。
LC-MS分析は、2台のPerkin Elmer Series 200マイクロポンプ、Perkin Elmer Series 200オートサンプラー、Applied Biosystems 785A UV検出器、及びSedex 75蒸発光散乱検出器を備えたPE-Sciex API 100又は150質量分析計で実施した。Waters Xterra 3.0mm×50mm 5μC-18シリカカラムを室温にて1.5mL/分で溶出した。これを5%MeCN/0.1%TFA/H2Oで平衡化し、5%MeCN/0.1%TFA/H2Oで1.0分間溶出し、次いで7分間かけて90%MeCN/0.1%TFA/H2Oまでの直線勾配で溶出した。検出は、214nmでのUV検出及び蒸発光散乱により行った。カラム溶出液のフラクションをPE-Sciex API 100質量分析計のイオンスプレー界面に導入した。質量範囲300〜2000amuを、実行中2秒ごとに走査した。
タンパク質濃度は、NanoDrop ND-1000 UV-分光光度計を使用し、280nmでの吸光度を測定することにより判定した。
ペプチドマッピングは、還元及びアルキル化タンパク質のAsp-N消化を使用して実施した。最初に、標準的な手順に従い、タンパク質をDTT及びヨードアセトアミドで処理した。アルキル化生成物は、HPLCを使用して精製した。続いて、アルキル化した精製生成物をエンドプロテアーゼAsp-N(Boehringer社製)により1:100の酵素:基質比で一晩消化した。消化物を、C-18カラム及び標準的なTFA/MeCNバッファー系を使用してHPLC分離した。得られたペプチドマップを、非誘導体化hGHのペプチドマップと比較し、保持時間の異なるフラクションを収集し、更にMaldi-tof質量分析法を使用して分析した。
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動は、NuPAGE4%〜12%Bis-トリスゲル(Invitrogen社製 NP0321BOX)を使用して実施した。ゲルを銀染色(Invitrogen社製 LC6100)又はクマシー染色(Invitrogen社製 LC6065)し、適切な場合にはM. M. Kurfurst in Anal. Biochem. 200(2)、244-248、(1992)に記載されているようにヨウ化バリウムでPEGに対して染色した。
タンパク質クロマトグラフィーは、Akta Explorerクロマトグラフィーシステム及びGE Health Care社製のカラムで実施した。アニオン交換は、Q-Sepharose HP 26/10カラムを使用して行った。開始バッファーは20mMトリエタノールアミン緩衝液pH8.5であり、溶出緩衝液は開始バッファー+0.2M NaClであった。化合物は、典型的には、15カラム量にわたって0〜75%溶出緩衝液の勾配で溶出した。脱塩及びバッファー交換は、HiPrep 26/10カラムを使用して実施した。
Fcドメインは、当分野で公知の技術により、例えば、大腸菌(国際公開第05047334号、国際公開第05047335号、国際公開第05047336号、国際公開第05047337号及び国際公開第05001025号)又はHEC等の哺乳動物細胞(Farge, F.ら、Journal of Chromatography (1976)、第123巻、247〜250ページ)における発現により発現され得る。以下の全方法が本出願に適用されている。
化学
コンジュゲーション方法は、適切な結合点を含む種々の適切なタンパク質を用いて実施することができるが、ここでは、GH変異体、及びリンカーに対するコネクターとして機能する1つ又は複数の硫黄原子を含む全てのFcドメインを使用して例示する。
2) 遊離Cys GH(II)を三価リンカー(III)でアルキル化し、Cysコンジュゲート型GHタンパク質リンカー中間体(IV)を得る
3) 水性フィンケルシュタインヨウ素交換反応(V)を介して、中間体(IV)中の脱離基LG2を活性化し、活性化Cys GHコンジュゲート中間体(VI)を得る
4) 適切な選択的還元剤でジスルフィド架橋を選択的に還元することにより、Fcドメイン(VII)の遊離システインを遊離させ、(VIII)を得る
5) Fcドメイン(VIII)と活性化Cys GHコンジュゲート中間体(VI)とのカップリングにより、Cysコンジュゲート型GH-Fcコンジュゲート(IX)を得る
代替法において、コンジュゲートGH-A-B-タンパク質(IX)は、下記に示したように調製される:
2) Fcドメイン(VIII)を三価リンカー(III)でアルキル化し、LG1-A-B-Fcコンジュゲート中間体(X)を得る
3) 混合ジスルフィド(I)を適切な選択還元剤で還元することにより、遊離Cys GH(II)を任意選択的に遊離させる
4) 水性フィンケルシュタインヨウ素交換反応(V)を介して、中間体(X)の脱離基LG1を活性化し、活性化コンジュゲート中間体(XI)を得る
5) 遊離Cys GH(II)と活性化コンジュゲート中間体(XI)とのカップリングにより、Cysコンジュゲート型GH-Fc-化合物(IX)を得る
アッセイ1 - GH受容体結合アッセイ
GH化合物の受容体相互作用は、表面プラズモン共鳴(SPR)分析を使用して分析される。この方法は、GH化合物にとって一般的である。
hGH化合物の生物活性は、細胞に基づいた受容体効力増殖アッセイ、すなわちBAFアッセイで測定する。BAF-3細胞(骨髄に由来するマウスプロBリンパ球細胞株)は、増殖及び生存について本来IL-3依存性である。IL-3は、刺激の際にGHが活性化される同じ媒介物質であるJAK-2及びSTATを活性化する。ヒト成長ホルモン受容体のトランスフェクション後、細胞株を成長ホルモン依存性細胞株に転換した。このクローンを使用して、BAF-3GHRの生存に対する様々な成長ホルモン試料の効果を評価することができる。
実施例の化合物の薬物動態は、静脈内(iv.)単回用量投与後に、オスSprague Dawleyラットにおいて調査する。
in vivo応答は、下垂体摘出オスSprague Dawleyラットにおいて試験する。下垂体摘出ラットは、下垂体を外科的に切除した後に成長ホルモンの産生が起こらない、周知で認識されている成長ホルモン欠乏症の動物モデルである。またこれにより、ヒトにおける成長ホルモン欠乏症の別の重要な臨床的特徴である、インスリン様成長因子-1(IGF-1)の低循環レベルをもたらす。
麻酔及び術前鎮痛
ラットに、フェンタニル-フルアニゾン(Hypnorm 1ml当たり0.315mgのフェンタニル及び10mgのフルアニゾン)、並びにミダゾラム(Midazolam Accord 1ml当たり5mgのミダゾラム)で麻酔する。ラットに、滅菌水で希釈したフェンタニル-フルアニゾンとミダゾラムの混合物を2mL/kgで腹腔内投与する。得られた混合物は、0.079mgのフェンタニル、2.5mgのフルアニゾン及び1.25mgのミダゾラムを1mL当たり含有する。
ラットを無菌手術のために準備する。ラットを、下垂体摘出手順のために設計したHoffman-Reiter定位固定装置に載せる。
回復前に、ラットを、滅菌水で希釈したカルプロフェン5mg/mLを含有する溶液を用いて、1mL/kgのカルプロフェン(Rimadyl 50mg/mLのカルプロフェン)により皮下処置する。術後鎮痛は、飲料水の代わりにラットに提供される5%デキストロース溶液に1ml当たり0.05mgのカルプロフェンを添加することにより、手術後2日間にわたり維持する。術後の最初の2日間の後、飲料水として5%デキストロース溶液を術後10〜14日までラットに与える。
血漿IGF-1濃度は、市販のELISAアッセイ(Immunodiagnostic Systems Ltd.社製による市販アッセイ、Octeia Rat/Mouse IGF-1、カタログ番号AC-18F1 IDS Ltd., England)により決定する。アッセイは、捕獲剤として高IGF-1特異的ポリクローナル抗体を使用し、検出剤として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識高親和性モノクローナル抗体を使用するサンドイッチELISAである。アッセイの検出の下限は63ng/mLである。IGF-1血漿濃度-時間プロファイルは、ベースライン補正したIGF-1血漿濃度-時間プロファイルと一緒に、各化合物について作成する。ベースライン補正したプロファイルがゼロを超える時間及び程度を化合物効力の尺度として使用する。
実施例の化合物の薬物動態は、皮下(sc.)単回用量投与後に、メスGottingenミニブタにおいて調査する。試験化合物を、グリシン20mg/mL、マンニトール2mg/mL、NaHCO3 2.5mg/mL、pHを8.2に調整した希釈バッファー中で15mg/mLの最終濃度に希釈する。試験化合物を体重約10〜12kgのメスGottingenミニブタにおいて試験する。
三価リンカー1
反応スキーム:
2-(1-ヒドロキシ-3-メチルブチリデン)-5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン(2)(37.7g、168mmol)のDCM(200mL)中の溶液を、ジエチレントリアミン(1)(8.64mL、80.0mmol)のDCM(130mL)中の溶液に滴下して加えた。反応混合物を一晩撹拌し、次いで、溶媒を蒸発させて、2,2'-(((アザンジイルビス(エタン-2,1-ジイル))ビス(アザンジイル))ビス(3-メチルブタン-1-イル-1-イリデン))ビス(5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン)(3)を淡黄色油状物として得た。
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 3.57 (q, 4 H); 3.06-2.89 (m, 8 H); 2.36 (bs, 8 H); 2.05-1.89 (m, 2 H); 1.09-0.94 (m, 26 H).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 7.77 (d, J=7.5 Hz, 2 H); 7.59 (m, 2 H); 7.40 (t, J=7.5 Hz, 2 Hz); 7.36-7.26 (m, 2 H); 5.65 (d, J=9.2 Hz, 1 H); 4.72-4.59 (m, 1 H); 4.46-4.27 (m, 2 H); 4.24-4.16 (m, 1 H); 4.12-3.99 (m, 1 H); 3.94-3.53 (m, 6 H); 3.48-3.33 (m, 1 H); 2.97 (bs, 4 H); 2.46-2.26 (m, 10 H); 2.08-1.83 (m, 4 H); 1.79-1.64 (m, 1 H); 1.43 (s, 9 H); 1.07-0.90 (m, 24 H).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, 80℃, δH): 7.79 (d, J=7.3 Hz, 2 H); 7.64 (d, J=7.5 Hz, 2 H); 7.39 (t, J=7.4 Hz, 2 H); 7.36-7.26 (m, 2 H); 4.83 (bs, 1 H); 4.48-4.30 (m, 2 H); 4.27-4.19 (m, 1 H); 4.19-3.62 (m, 7 H); 3.61-3.46 (m, 1 H); 3.28-2.90 (m, 4 H); 2.55 (t, J=6.7 Hz, 2 H); 2.43 (s, 8 H); 2.01-1.81 (m, 4 H); 1.07-0.88 (m, 24 H)
収量:36.0g。
ローディング:51%(0.321mmol/g)。
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, 80℃, δH): 5.13 (dd, J=9.3 Hz, J=4.2 Hz, 1 H); 4.68 (dd, J=8.3 Hz, J=5.3 Hz, 1 H); 4.20-4.06 (m, 8 H); 3.95 (s, 2 H); 3.91-3.41 (m, 24 H); 2.61-2.08 (m, 7 H); 2.08-1.88 (m, 1 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 5:95〜100:0 + 0.1% FA): Rt = 4.74分.
LC-MS m/z: 926.6 (M+H)+.
UPLC純度: 97.5% (214 nm).
UPLC Rt (Acquity UPLC BEHC 18, 1.7 μm, 2.1 x 150 mm; MeCN/水 5:95〜95:5 + 0.05% TFA): Rt = 1.64分.
反応スキーム:
2-(1-ヒドロキシ-3-メチルブチリデン)-5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン(44.9g、200mmol)のMeOH(400mL)中溶液を、ジエチレントリアミン(1)(DETA、10.3g、100mmol)のDCM(1.50L)中溶液に40分以内に加えた。反応混合物を一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Silicagel 60、0.040〜0.063mm;溶離液:DCM/MeOH 25/1)で精製し、純化合物(2)を黄色ががった蝋状固体として得た。
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 13.83 (bs, 2 H); 3.57 (q, J=5.7 Hz, 4 H); 3.10-2.91 (m, 8 H); 2.36 (bs, 8 H); 1.97 (sep, J=6.8 Hz, 2 H); 1.05-0.96 (m, 24 H).
RF (SiO2, EtOAc): 0.50.
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 14.03 (bs, 1 H); 13.87 (bs, 1 H); 5.43 (bs, 1 H); 4.01 (d, J=4.7 Hz, 2 H); 3.79-3.56 (m, 8 H); 3.06-2.89 (m, 4 H); 2.48-2.27 (m, 8 H); 1.95 (sep, J=6.8 Hz, 2 H); 1.45 (s, 9 H); 1.05-0.95 (m, 24 H).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 14.01 (s, 1 H); 13.88 (s, 1 H); 3.80-3.70 (m, 2 H); 3.68-3.58 (m, 6 H); 3.52 (s, 2 H); 3.06-2.93 (m, 4 H); 2.45-2.29 (m, 8 H), 1.95 (sep, J=6.8 Hz, 2 H); 1.06-0.95 (m, 24 H).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 4.23 (s, 2 H); 4.19 (s, 2 H); 4.16 (s, 2 H); 3.71-3.51 (m, 8 H).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 4.27 (s, 2 H); 4.19 (s, 2 H); 4.13 (s, 2 H); 4.02 (s, 2 H); 3.70-3.50 (m, 8 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 2.90分.
LC-MS m/z: 433.0 (M+H)+.
反応スキーム:
TFA(30mL)を、tert-ブチル(2-(ビス-((1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル)アミノ)エチル)アミノ)-2-オキソエチル)カルバメート(1)(3.98g、5.91mmol、実施例2、化合物(3)に記載されたようにして調製したもの)のDCM(5mL)中溶液に加えた。2時間後、揮発性物質を減圧下で除去し、炭酸カリウムの飽和水溶液を加えた(60mL)。生成物をEtOAc(3×40mL)で抽出した。有機相を無水Na2SO4で脱水し、溶媒を減圧下で除去し、純化合物(2)をオフホワイト色固体泡状物として得た。
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 14.01 (s, 1 H); 13.88 (s, 1 H); 3.80-3.70 (m, 2 H); 3.68-3.58 (m, 6 H); 3.52 (s, 2 H); 3.06-2.93 (m, 4 H); 2.45-2.29 (m, 8 H); 1.95 (sep, J=6.8 Hz, 2 H); 1.06-0.95 (m, 24 H).
RF (SiO2 DCM/MeOH 20:1): 0.15.
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 14.06 (bs, 1 H); 13.91 (bs, 1 H); 7.66 (bs, 1 H); 5.45 (bs, 1 H); 4.19 (d, J=4.7 Hz, 2 H); 4.05 (s, 2 H); 3.79-3.62 (m, 12 H); 3.57 (t, J=5.1 Hz, 2 H); 3.38-3.29 (m, 2 H); 3.04-2.92 (m, 4 H); 2.45-2.27 (m, 8 H); 1.93 (sep, J=6.8 Hz, 2 H); 1.43 (s, 9 H); 1.05-0.94 (m, 24 H).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 13.95 (bs, 1 H); 13.79 (bs, 1 H); 7.69 (bs, 1 H); 4.17-4.10 (m, 2 H); 4.03 (s, 2 H); 3.74-3.56 (m, 12 H); 3.52 (t, J=5.1 Hz, 2 H); 3.03-2.83 (m, 6 H); 2.32 (s, 8 H); 2.13 (bs, 2 H); 1.93 (sep, J=6.8 Hz, 2 H); 1.43 (s, 9 H); 1.03-0.90 (m, 24 H).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 4.32 (s, 2 H); 4.20 (s, 2 H); 4.18 (s, 2 H); 4.16 (s, 2 H); 3.84 (t, J=4.8 Hz, 2 H); 3.81-3.72 (m, 4 H); 3.68-3.51 (m, 8 H); 3.38 (t, J=4.8 Hz, 2 H).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 4.29 (s, 2 H); 4.19 (s, 2 H); 4.16 (s, 2 H); 4.14 (s, 2 H); 3.98 (s, 2 H); 3.75-3.49 (m, 16 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 3.02分.
LC-MS m/z: 480.2 (M+H)+.
反応スキーム:
2-クロロトリチル樹脂100〜200メッシュ1.8mmol/g(1、41.7g、75.1mmol)を無水DCM(350mL)中で20分間膨潤させた。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、19.3g、50.1mmol)及びDIPEA(33.1mL、190mmol)の無水DCM(250mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を一晩振盪した。樹脂を濾過し、DIPEA(17.4mL、100mmol)のMeOH/DCM混合物(4:1、5分、200mL)中の溶液で処理した。次いで、樹脂をDCM(2×250mL)及びDMF(2×250mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中の20%ピペリジン(1×5分、1×15分、2×250mL)で処理することにより除去した。樹脂をDMF(2×250mL)、2-プロパノール(2×250mL)、DCM(2×250mL)及びDMF(2×250mL)で洗浄した。2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-Glu-OtBu、42.6g、100mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、35.6g、100mmol)及びDIPEA(31.4mL、180mmol)のDMF(200mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を4時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(2×250mL)及びDCM(10×250mL)で洗浄した。生成物を2,2,2-トリフルオロエタノール(350mL)で一晩処理することにより樹脂から切断した。樹脂を濾別し、DCM(2×200mL)で洗浄し、溶媒を蒸発させ、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(Silicagel 60、0.040〜063mm;溶離液:DCM/MeOH 95:5〜85:15)により精製し、(R)-4-[2-(2-カルボキシメトキシ-エトキシ)-エチルカルバモイル]-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-酪酸tert-ブチルエステル(2)を黄褐色蝋状固体として得た。
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 7.77 (d, J=7.5 Hz, 2 H); 7.65-7.50 (m, 2 H); 7.47-7.37 (m, 2 H); 7.37-6.72 (m, 2 H); 6.84-6.72 (m, 1 H); 5.92-5.81 (m, 1 H); 4.58-4.30 (m, 2 H); 4.30-3.95 (m, 4 H); 3.79-3.51 (m, 6 H); 3.43 (q, J=4.6 Hz, 2 H); 2.39-1.90 (m, 4 H); 1.54-1.39 (m, 9 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 20:80〜100:0 + 0.1% FA): 3.65分.
LC-MS m/z: 570.6 (M+H)+.
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 13.81 (bs, 2 H); 3.64-3.44 (m, 4 H); 3.12-2.83 (m, 8 H); 2.34 (s, 8 H); 2.06-1.86 (m, 2 H); 1.05-0.87 (m, 24 H).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 14.02-13.78 (m, 2 H); 7.77 (d, J=7.2 Hz, 2 H); 7.60 (d, J=6.8 Hz, 2 H); 7.40 (t, J=7.1 Hz, 2 H); 7.35-7.24 (m, 2 H); 6.76 (bs, 1 H); 5.85 (d, J=8.5 Hz, 1 H); 4.50-4.13 (m, 6 H); 3.79-3.35 (m, 16 H); 3.06-2.85 (m, 4 H); 2.45-2.12 (m, 11 H); 2.09-1.82 (m, 3 H); 1.47 (s, 9 H); 1.07-0.85 (m, 24 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 70:30〜100:0 + 0.1% FA): 2.12分.
LC-MS m/z: 1068.3 (M+H)+.
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 13.90-13.65 (m, 2 H); 7.77 (d, J=7.5 Hz, 2 H); 7.67-7.53 (m, 2 H); 7.40 (t, J=7.2 Hz, 2 H); 7.35-7.23 (m, 3 H); 6.01 (d, J=7.5 Hz, 1 H); 4.49-4.34 (m, 3 H); 4.31-4.15 (m, 3 H); 3.86-3.30 (m, 16 H); 3.14-2.84 (m, 4 H); 2.55-2.31 (m, 10 H); 2.30-2.05 (m, 2 H); 2.03-1.78 (m, 2 H); 1.11-0.88 (m, 24 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 35:65〜100:0 + 0.1% FA): 3.68分.
LC-MS m/z: 1012.2 (M+H)+.
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 4.76 (dd, J=7.8及び5.9 Hz, 1 H); 4.57 (dd, J=8.9及び4.9 Hz, 1 H); 4.36 (s, 2 H); 4.20 (s, 2 H); 4.14 (s, 4 H); 3.98 (s, 2 H); 3.81-3.41 (m, 24 H); 2.56 (t, J=8.0 Hz, 2 H); 2.47 (t, J=7.2 Hz, 2 H); 2.37-2.20 (m, 2 H); 2.20-2.05 (m, 2 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 3.58分.
LC-MS m/z: 925.6 (M+H)+.
反応スキーム:
Wang樹脂-結合物1の調製は、プロトコルREaD-24247(バッチNo.218-004-1)に記載した。
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, 80℃, δH): 5.08 (dd, J=9.5 Hz, J=4.2 Hz, 1 H); 4.71 (dd, J=8.1 Hz, J=5.1 Hz, 1 H); 4.19-4.09 (m, 6 H); 3.96 (s, 2 H); 3.90-3.44 (m, 16 H); 2.59-2.07 (m, 7 H); 2.01-1.86 (m, 1 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 4.56分.
LC-MS m/z: 781.5 (M+H)+.
UPLC純度: 99% (220 nm).
UPLC Rt (Acquity UPLC BEHC 18, 1.7 μm, 2.1 x 150 mm; MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.1% TFA): 1.57分.
反応スキーム:
反応スキーム:
化合物(1)の調製。
2-(1-ヒドロキシ-3-メチルブチリデン)-5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン(37.7g、168mmol)のDCM(200mL)中溶液を、ジエチレントリアミン(8.64mL、80.0mmol)のDCM(130mL)中溶液に滴下して加えた。反応混合物を一晩撹拌し、次いで溶媒を蒸発させ、2,2'-(((アザンジイルビス(エタン-2,1-ジイル))ビス(アザンジイル))ビス(3-メチルブタン-1-イル-1-イリデン))ビス(5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン)を淡黄色油状物として得た。
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 3.57 (q, 4 H); 3.06-2.89 (m, 8 H); 2.36 (bs, 8 H); 2.05-1.89 (m, 2 H); 1.09-0.94 (m, 26 H).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 7.77 (d, J=7.5 Hz, 2 H); 7.59 (m, 2 H); 7.40 (t, J=7.5 Hz, 2 Hz); 7.36-7.26 (m, 2 H); 5.65 (d, J=9.2 Hz, 1 H); 4.72-4.59 (m, 1 H); 4.46-4.27 (m, 2 H); 4.24-4.16 (m, 1 H); 4.12-3.99 (m, 1 H); 3.94-3.53 (m, 6 H); 3.48-3.33 (m, 1 H); 2.97 (bs, 4 H); 2.46-2.26 (m, 10 H); 2.08-1.83 (m, 4 H); 1.79-1.64 (m, 1 H); 1.43 (s, 9 H); 1.07-0.90 (m, 24 H).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, 80℃, δH): 7.79 (d, J=7.3 Hz, 2 H); 7.64 (d, J=7.5 Hz, 2 H); 7.39 (t, J=7.4 Hz, 2 H); 7.36-7.26 (m, 2 H); 4.83 (bs, 1 H); 4.48-4.30 (m, 2 H); 4.27-4.19 (m, 1 H); 4.19-3.62 (m, 7 H); 3.61-3.46 (m, 1 H); 3.28-2.90 (m, 4 H); 2.55 (t, J=6.7 Hz, 2 H); 2.43 (s, 8 H); 2.01-1.81 (m, 4 H); 1.07-0.88 (m, 24 H).
収量:36.0g。
ローディング:51%(0.321mmol/g)。
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 5.07 (dd, J=9.9及び2.9 Hz, 1 H); 4.72 (dd, J=8.7及び4.7 Hz, 1 H); 4.22-4.12 (m, 6 H); 3.96 (s, 2 H); 3.93-3.37 (m, 16 H); 3.33 (t, J=6.8 Hz, 3 H); 2.59-2.29 (m, 7 H); 2.10 (d, J=4.9 Hz, 2 H); 1.97-1.80 (m, 3 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 2.86分.
LC-MS m/z: 866.5 (M+H)+.
UPLC純度: 98.7% (214 nm).
UPLC Rt (Acquity UPLC BEHC 18, 1.7 μm, 2.1 x 150 mm; MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.05% TFA): 2.74分.
反応スキーム:
化合物(1)の調製。
2-(1-ヒドロキシ-3-メチルブチリデン)-5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン(37.7g、168mmol)のDCM(200mL)中溶液を、ジエチレントリアミン(8.64mL、80.0mmol)のDCM(130mL)中溶液に滴下して加えた。反応混合物を一晩撹拌し、次いで溶媒を蒸発させ、2,2'-(((アザンジイルビス(エタン-2,1-ジイル))ビス(アザンジイル))ビス(3-メチルブタン-1-イル-1-イリデン))ビス(5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン)を淡黄色油状物として得た。
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 3.57 (q, 4 H); 3.06-2.89 (m, 8 H); 2.36 (bs, 8 H); 2.05-1.89 (m, 2 H); 1.09-0.94 (m, 26 H).
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 7.77 (d, J=7.5 Hz, 2 H); 7.59 (m, 2 H); 7.40 (t, J=7.5 Hz, 2 Hz); 7.36-7.26 (m, 2 H); 5.65 (d, J=9.2 Hz, 1 H); 4.72-4.59 (m, 1 H); 4.46-4.27 (m, 2 H); 4.24-4.16 (m, 1 H); 4.12-3.99 (m, 1 H); 3.94-3.53 (m, 6 H); 3.48-3.33 (m, 1 H); 2.97 (bs, 4 H); 2.46-2.26 (m, 10 H); 2.08-1.83 (m, 4 H); 1.79-1.64 (m, 1 H); 1.43 (s, 9 H); 1.07-0.90 (m, 24 H).
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, 80℃, δH): 7.79 (d, J=7.3 Hz, 2 H); 7.64 (d, J=7.5 Hz, 2 H); 7.39 (t, J=7.4 Hz, 2 H); 7.36-7.26 (m, 2 H); 4.83 (bs, 1 H); 4.48-4.30 (m, 2 H); 4.27-4.19 (m, 1 H); 4.19-3.62 (m, 7 H); 3.61-3.46 (m, 1 H); 3.28-2.90 (m, 4 H); 2.55 (t, J=6.7 Hz, 2 H); 2.43 (s, 8 H); 2.01-1.81 (m, 4 H); 1.07-0.88 (m, 24 H).
収量:36.0g。
ローディング:51%(0.321mmol/g)。
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 5.07 (dd, J=9.9及び2.9 Hz, 1 H); 4.72 (dd, J=8.7及び4.7 Hz, 1 H); 4.22-4.12 (m, 6 H); 3.96 (s, 2 H); 3.93-3.37 (m, 16 H); 3.33 (t, J=6.8 Hz, 3 H); 2.59-2.29 (m, 7 H); 2.10 (d, J=4.9 Hz, 2 H); 1.97-1.80 (m, 3 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 2.86分.
LC-MS m/z: 866.5 (M+H)+.
UPLC純度: 98.7% (214 nm).
UPLC Rt (Acquity UPLC BEHC 18, 1.7 μm, 2.1 x 150 mm; MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.05% TFA): 2.74分.
反応スキーム:
Wang樹脂0.63mmol/g(1、5.08g、3.20mmol)をTHF(60mL)中で45分間膨潤させた。(S)-4-(ビス-{2-[1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソ-シクロヘキシリデン)-エチルアミノ]-エチル}-カルバモイル)-4-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-酪酸(7.52g、9.61mmol)、DIC(1.49mL、9.61mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、0.04g、0.32mmol)のTHF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を一晩振盪した。樹脂を濾過し、DMF(2×50mL)、DCM(2×50mL)及びDMF(2×50mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(2×50mL、1×5分、1×20分)。樹脂をDMF(2×50mL)、2-プロパノール(2×50mL)、DCM(2×50mL)及びDMF(2×50mL)で洗浄した。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、2.47g、6.41mmol)、TCTU(2.28,6.41mmol)及びDIPEA(2.01mL、11.5mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(2×50mL)、DCM(2×50mL)及びDMF(2×50mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(2×50mL、1×5分、1×20分)。樹脂をDMF(2×50mL)、2-プロパノール(2×50mL)、DCM(2×50mL)及びDMF(2×50mL)で洗浄した。(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-Glu-OtBu、2.04g、4.80mmol)、TCTU(1.71、4.80mmol)及びDIPEA(1.67mL、9.61mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を1.5時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(2×50mL)、DCM(2×50mL)及びDMF(2×50mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(2×50mL、1×5分、1×20分)。樹脂をDMF(2×50mL)、2-プロパノール(2×50mL)、DCM(2×50mL)及びDMF(2×50mL)で洗浄した。1-(クロロ-ジフェニル-メチル)-4-メチル-ベンゼン(MttCl、1.13g、3.84mmol)及びDIPEA(1.67mL、9.61mmol)の無水DCM(50mL)中溶液を樹脂に添加し、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、DCM(4×50mL)及びDMF(4×50mL)で洗浄した。Dde基は、DMF中2%ヒドラジンで処理することにより除去した(3×50mL、3×3分)。樹脂をDMF(8×50mL)で洗浄した。クロロ酢酸(0.91g、9.61mmol)、PyBrOP(4.48g、9.61mmol)及びDMF(3.35mL、19.2mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を一晩振盪した。ニンヒドリン試験は依然として陽性であったため、再カップリングを行った。クロロ酢酸(0.91g、9.61mmol)、PyBrOP(4.48g、9.61mmol)及びDIPEA(3.35mL、19.2mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を3時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(4×50mL)及びDCM(4×50mL)で洗浄した。Mtt基は、DCM中80%1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールで処理することにより除去した(7×50mL、2×10分、5×30分)。樹脂をDCM(5×50mL)及びDMF(4×50mL)で洗浄した。ブロモ酢酸(8.90g、64.1mmol)及びDIC(8.43mL、54.5mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を20分間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(4×30mL)及びDCM(10×30mL)で洗浄した。生成物をTFA(50mL)で1.5時間処理することにより樹脂から切断した。樹脂を濾別し、TFA(1×50mL)及びDCM(2×50mL)で洗浄した。溶液を合わせ、溶媒を蒸発させた。残渣をトルエンで2回同時蒸発させ、調製用LC/MS(SunFire Prep C18 OBD 5m、19×100mm、勾配0.1%FA中5〜100%MeCN/H2O)により精製した。純生成物を含有するフラクションを合わせ、凍結乾燥し、表題化合物をベージュ色固体として得た。
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 5.19-5.05 (m, 1 H); 4.72-4.56 (m, 1 H); 4.27-4.07 (m, 6 H); 4.06-3.37 (m, 18 H); 2.60-2.37 (m, 4 H); 2.36-2.22 (m, 1 H); 2.21-1.87 (m, 3 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 05:95〜100:0 + 0.1% FA): 2.94分.
LC-MS m/z: 780.4 (M+H)+.
反応スキーム:
樹脂(1)(8.25g、2.71mmol、実施例5に記載の調製物)の一部からのIvDde基は、DMF中2%ヒドラジン一水和物で処理することにより除去した(3×3分、3×50mL)。樹脂をDMF(6×50mL)で洗浄した。ブロモ酢酸(2.26g、16.3mmol)、DIC(2.52mL、16.3mmol)及び2,4,6-コリジン(4.30mL、32.5mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2.5時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×50mL)、DCM(3×50mL)、DMF(3×50mL)及びDCM(4×50mL)で洗浄した。Mtt基は、DCM中の80%1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールで処理することにより除去した(2×10分、2×30分、4×50mL)。樹脂をDCM(5×50mL)及びDMF(4×50mL)で洗浄した。クロロ酢酸(5.12g、54.2mmol)及びDIC(7.13mL、46.1mmol)のDMF(50mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を30分間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(4×50mL)及びDCM(10×50mL)で洗浄した。生成物をTFA/TIS/H2O(95:2.5:2.5、50mL)の切断カクテルで2時間処理することにより樹脂から切断した。樹脂を濾過し、TFA/DCM混合物(1:1、50mL)及びDCM(10×30mL)で洗浄した。溶液を合わせ、溶媒を蒸発乾固させた。残渣をHPLC(column X-Bridge3 C18、OBD、5μm、50×250mm MeCN/H2O 3:35〜35:40+0.05%TFA)により精製し、(4S,18S)-4-(ビス(2-(2-ブロモアセトアミド)エチル)カルバモイル)-18-(2-(2-(2-(2-クロロアセトアミド)エトキシ)エトキシ)アセトアミド)-6,15-ジオキソ-8,11-ジオキサ-5,14-ジアザノナデカン二酸(2)を白色固体として得た。
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, 80℃, δH): 5.12 (dd, J=9.5及び3.9 Hz, 1 H); 4.69 (dd, J=8.0及び5.4 Hz, 1 H); 4.19-4.10 (m, 6 H); 3.94 (s, 2 H); 3.90-3.43 (m, 24 H); 2.55 (t, J=7.0 Hz, 2 H); 2.48 (m, 2 H); 2.41-1.99 (m, 4 H).
LC-MS純度: 100%.
LC-MS Rt (Kinetex 4.6 mm x 50 mm, MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 3.06分.
LC-MS m/z: 970.5 (M+H)+.
UPLC純度: 98.3% (214 nm).
UPLC Rt (Acquity UPLC BEHC 18, 1.7 μm, 2.1 x 150 mm; MeCN/H2O 5:95〜95:5 + 0.05% TFA): 1.66分.
三価リンカー9は、三価リンカー1について実施例1で説明した方法と同様の方法で、2,2'-(((アザンジイルビス(エタン-2,1-ジイル))ビス(アザンジイル))ビス(3-メチルブタン-1-イル-1-イリデン))ビス(5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン)を2,2'-(((アザンジイルビス(プロパン-3,1-ジイル))ビス(アザンジイル))ビス(3-メチルブタン-1-イル-1-イリデン))ビス(5,5-ジメチルシクロヘキサン-1,3-ジオン)と置き換えて調製した。粗(4S)-5-[ビス[3-[(2-クロロアセチル)アミノ]プロピル]アミノ]-4-[[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-5-オキソ-ペンタン酸を分取LC-MS(Column Labio C18、50×500mm、MeCN/水+0.05%TFA、勾配10:40で120分間)により精製し、純(4S)-5-[ビス[3-[(2-クロロアセチル)アミノ]プロピル]アミノ]-4-[[2-[2-[2-[(2-ブロモアセチル)アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-5-オキソ-ペンタン酸を無色油状物として得た。
LC-MS純度: 100% (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 3.01分.
LC-MS m/z: 680.2 (M+H)+.
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 7.71-7.60 (m, 2 H); 7.49-7.41 (m, 1 H); 7.35-7.29 (m, 1 H); 5.17-5.07 (m, 1 H); 4.43 (bs, 1 H); 4.12-3.98 (m, 6 H); 3.90 (s, 2 H); 3.76-3.57 (m, 8 H); 3.50-3.14 (m, 8 H); 2.50-2.42 (m, 2 H); 2.10-1.70 (m, 6 H).
反応スキーム:
Wang-OH樹脂0.53mmol/g(1、3.85g、2.04mmol)を無水DCM(40mL)中で30分間膨潤させた。4-ニトロフェニルカルボノクロリデート(2、0.27g、1.36mmol)及びピリジン(0.12mL、1.50mmol)の無水DCM(40mL)中溶液を樹脂(1)に加え、混合物を一晩振盪した。樹脂(3)を氷水(1×30mL)、氷水/1,4-ジオキサン混合物(1:1、1×30mL)、DMF(3×30mL)及びDCM(3×30mL)で洗浄した。
収量:240mg(42%)。
LC-MS純度:93%(ELSD)。
LC-MS Rt(Kinetex C18、4.6mm×50mm、MeCN/H2O 5:95〜100:0+0.1%FA):2.42分。
LC-MS m/z:430.29(M+H)+。
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, δH): 7.45 (bs, 2 H); 7.27 (bs, 1 H); 6.06-5.93 (m, 1 H); 4.06 (s, 4 H); 3.90 (s, 2 H); 3.64 (s, 4 H); 3.62-3.55 (m, 4 H); 3.53-3.38 (m, 12 H).
LC-MS純度: 100% (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, MeCN/H2O 5:95〜100:0 + 0.1% FA): 2.91分.
LC-MS m/z: 552.3 (M+H)+.
反応スキーム:
Wang樹脂結合化合物(1)(1.42g、0.70mmol)をDCM(20mL)中で20分間膨潤させた。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(2×5分、1×20分、3×10mL)。樹脂をDMF(3×15mL)、2-プロパノール(3×15mL)及びDCM(3×15mL)で洗浄した。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、0.77g、2.00mmol)、5-クロロ-1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール3-オキシドテトラフルオロボレート(TCTU、0.71g、2.00mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.63mL、3.60mmol)のDMF(10mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×15mL)、DCM(3×15mL)及びDMF(3×15mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(2×5分、1×20分、3×10mL)。樹脂をDMF(3×15mL)、2-プロパノール(3×15mL)及びDCM(3×15mL)で洗浄した。(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-L-Glu-OtBu、0.85g、2.00mmol)、5-クロロ-1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール3-オキシドテトラフルオロボレート(TCTU、0.71g、2.00mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.63mL、3.60mmol)のDMF(10mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×15mL)、DCM(3×15mL)及びDMF(3×15mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(2×5分、1×20分、3×10mL)。樹脂をDMF(3×15mL)、2-プロパノール(3×15mL)及びDCM(3×15mL)で洗浄した。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、0.77g、2.00mmol)、5-クロロ-1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール3-オキシドテトラフルオロボレート(TCTU、0.71g、2.00mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.63mL、3.60mmol)のDMF(10mL)中溶液を樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、DMF(3×15mL)、DCM(3×15mL)及びDMF(3×15mL)で洗浄した。Fmoc基は、DMF中20%ピペリジンで処理することにより除去した(2×5分、1×20分、3×10mL)。樹脂をDMF(3×15mL)、2-プロパノール(3×15mL)及びDCM(3×15mL)で洗浄した。
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, δH): 4.74-4.55 (m, 2 H); 4.33 (s, 1 H); 4.31 (s, 1 H); 4.23-4.10 (m, 6 H); 3.98 (s, 2 H); 3.83-3.42 (m, 24 H); 2.59-2.41 (m, 4 H); 2.38-2.08 (m, 4 H).
LC-MS純度: 100% (ELSD).
LC-MS Rt (Kinetex C18, 4.6 mm x 50 mm, MeCN/水 5:95〜100:0 + 0.1% TFA): 3.04分.
LC-MS m/z: 927.0 (M+H)+.
GH-Fcコンジュゲート1
GH-三価リンカー1中間体
[(ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチルアミン)))-Glu-OEG-γGlu-OEG]-カルボニルメチレン-S101-hGH[L101C]
工程1
上記で得られたhGH[L101C]は、グルタチオン及びシスタミンでブロックされているその遊離システインの部分を有していた。脱ブロックは、GSH及びGSSGを含有する平衡バッファー中でグルタレドキシンII(Grx2)を使用して酵素的に実施した。脱ブロックされたhGH[L101C]は、Sephadex G25カラムでのバッファー交換により低分子量GSH/GSSGから分離された。
使用したFc:200mg(50mM重炭酸アンモニウム pH7.8中100mL)。
濃度2.03mg/mL
LC-MS(エレクトロスプレー):実測値m/z=22959,43;計算値m/z=22959,48
HPLCでの純度:214nmで93%。
システム:Agilent 1200シリーズHPLC
カラム:Zorbax 300SB-C3、4.6×50mm、3.5μ
検出器:Agilent Technologies LC/MSD TOF(G1969A)
検出器設定:DAD:280nm、(G1315A)
走査範囲:m/z分 100、m/z max 3000
リニアリフレクタモード
ポジティブモード
条件:工程勾配:5%〜90%B
実行時間:12分:0〜1分 5%B、1〜8分 5〜90%B、8〜9分 90%B、9〜9.1分 90〜5%B 9.1〜12分 5%B
流速:1.00mL/分固定
カラム温度:40℃
溶離液:溶媒A:99.9% H2O、0.1% ギ酸
溶媒B:99.9% MeCN、0.1% ギ酸
工程2の手順:
1. クロロからヨードへの交換(フィンケルシュタイン反応):工程1から得た上記化合物[(ビス(2-(2-クロロアセトアミド)エチルアミン)))-Glu-OEG-γGlu-OEG]-カルボニルメチレン-S101-hGH[L101C](2.2mL、22mg/mL、956μM)を、2.2mLの5M KI水溶液、50mMアスコルビン酸溶液で希釈し、室温で18時間、暗所でインキュベートした。最後に、反応混合物を20mM HEPES、10mM EDTA、pH7.5バッファー(2.3mL、21.7mg/mL、945μM)中でバッファー交換し、以下の工程3で直接使用した。
2. Fc-フラグメントジスルフィド架橋の還元:上記のようにして得られたFcフラグメント(50mL、2.03mg/mL、50mM重炭酸アンモニウム中41μM、pH7.8)に、5当量のジチオスレイトール(DTT、20mM HEPES、10mM EDTA中の195mM溶液52μL、pH7.5)を加え、室温で2時間インキュベートした。その後、反応混合物をバッファー交換し、限外濾過により4.3mL(23.6mg/mL、二量体として475μM)まで高濃縮し、以下の工程3で直接使用した。
3. hGH[L101C]-Fcコンジュゲートの形成:工程1から得たhGH[L101C]化合物(50mg、21.7mg/mL、945μM)を、工程2から得た還元Fcフラグメント(100mg、23.6mg/mL、475μM)と混合し、hGH[L101C]とFcとのモル比を1.1対1とした。反応混合物(6.6mL)を暗所で18時間インキュベートし、その後、HICモードで操作するCapto Adhere 16/10カラム(CV=20mL;A:20mM TEA、pH7.5; B:40mM MES、40mMギ酸、pH3.5; 適用バッファー:20mM TEA、200mM NaCl、pH7.5; セグメント勾配:セグメント1:0〜30% B、1CV;セグメント2:30〜70% B、15CV;セグメントC:70〜100% B、1CV;流速3mL/分)で反応混合物から所望のコンジュゲートを精製した。生成物を含有するフラクションをPBSでバッファー交換し、50mgの所望のコンジュゲートを得た(25mL、2.0mg/mL、27.5μM)。
収量=50mg(34%)。
LC-MS(エレクトロスプレー):実測値m/z=72682.09;計算値m/z=72682.13
HPLCによる純度:214nmで96%。
[(ビス(2-(2-Fc-S3-アセトアミド)エチルアミン)))-Gly]-カルボニルメチレン-S101-hGH[L101C]
上記反応混合物をローディングバッファー(トリス+塩)にバッファー交換し、G25カラムにローディングした:
カラム:50/30 Sephadex G25 fine
バッファーA:10mM 重炭酸アンモニウム
流量:10mL/分
温度:室温
フラクション:フラクションあたり40mL
カラム:Capto Adhere 16 /10
バッファーA:20mM TEA pH7.5
バッファーA2:40mM TEA+0.2M NaCl pH7.5
バッファーB:40mM MES+40mMギ酸 pH3.5
勾配1:1CVに0〜30% バッファーB
勾配2:15CVに30〜70% バッファーB
勾配3:1CVに70〜100% バッファーB
流量:3mL/分
温度:室温
フラクション:ピーク分画においてフラクション当たり1mL
収量:101mg(31%)
LC-MS(エレクトロスプレー):実測値m/z=72193.48;計算値m/z=72190.6444
HPLCでの純度:214nmで約100%。
[(ビス(2-(2-Fc-S3-アセトアミド)エチルアミン)))-Gly-OEG]-カルボニルメチレン-S101-hGH[L101C]
使用したFc:200mg(50mM重炭酸アンモニウム中100mL pH7.8)。
濃度2.03mg/mL
上記反応混合物をローディングバッファー(トリス+塩)にバッファー交換し、G25カラムにローディングした:
バッファーA:10mM 重炭酸アンモニウム
流量:10mL/分
温度:室温
フラクション:フラクション当たり40mL
フラクションA4+A5をプールし、Capto Adhereカラムにアプライした:
バッファーA:20mM TEA pH7.5
バッファーA2:40mM TEA+0.2M NaCl pH7.5
バッファーB:40mM MES+40mM ギ酸 pH3.5
勾配1:1CVに0〜30%のバッファーB
勾配2:15CVに30〜65%のバッファーB
勾配3:1CVに65〜100%のバッファーB
流量:3mL/分
温度:室温
フラクション:ピークフラクションにおいてフラクション当たり3mL
収量:91mg(28%)
LC-MS(エレクトロスプレー):実測値m/z=72338.69;計算値m/z=72335.8008
HPLCでの純度:214nmで81%。
Fc-リンカー中間体
工程1
上記で説明したようにして得られたFcフラグメント(12mL、2.03mg/mL、50mLの重炭酸アンモニウム中41μM、pH7.8)をvivaspin UF装置(CU 30kDa、PES膜)により1.9mLまで高濃縮した(22mg、11.6mg/mL、232μM)したものに、10mM TCEPのPBS(4.3当量)中溶液の220μLを加え、室温で1時間インキュベートした。反応混合物を50mMリン酸緩衝液、400mM NaCl、10mM EDTAにバッファー交換し、19.25mgの還元Fc(7.7mg/mL、二量体として154μM)を得た。これに、(4S,18S)-4-(ビス(2-(2-ブロモアセトアミド)エチル)カルバモイル)-18-(2-(2-(2-(2-クロロアセトアミド)エトキシ)エトキシ)アセトアミド)-6,15-ジオキソ-8,11-ジオキサ-5,14-ジアザノナデカン二酸の同一バッファー中の新たに調製した5mM溶液の375μLを添加し(2.5当量)、室温で18時間、暗所でインキュベートし、その後、反応混合物をゲル濾過によりPBSにバッファー交換し、標的Fc-リンカーコンジュゲートを定量的に得た。
収量=50mg(95%)。
LC-MS(エレクトロスプレー):実測値m/z=50605.58;計算値m/z=50605.68
HPLCでの純度:214nmで92%。
システム:Agilent 1200シリーズHPLC
カラム:Zorbax 300SB-C3、4.6×50mm、3.5μ
検出器:Agilent Technologies LC/MSD TOF(G1969A)
検出器設定:DAD:280nm、(G1315A)
走査範囲:m/z分 100、m/z max. 3000
リニアリフレクタモード
ポジティブモード
条件:工程勾配:5%〜90%B
実行時間:12分:0〜1分 5%B、1〜8分 5〜90%B、8〜9分 90%B、9〜9.1分 90-5%B 9.1〜12分 5%B
流速:1.00mL/分固定
カラム温度:40℃
溶離液:溶媒A:99.9% H2O、0.1% ギ酸
溶媒B:99.9% MeCN、0.1% ギ酸
1. クロロからヨードへの交換(フィンケルシュタイン反応):工程1から得た上記化合物Fc-リンカーコンジュゲート(2.5mL、7.7mg/mL、152μM)を、Zebaスピンカラム(10mLサイズ、Pierce)でのゲル濾過により50mMリン酸緩衝液、5M KI、50mMアスコルビン酸、100mM NaCl、pH6にバッファー交換し、室温で暗所にて18時間インキュベートした。最後に、反応混合物をvivaspin UF装置(CU 30kDa、PES膜)で1.3mLまで高濃縮し、Zeba spinカラム(10mLサイズ、Pierce)でのゲル濾過により50mM PB、1M NaCl、10mM EDTA、pH7.6にバッファー交換し、工程3で直ちに使用した。
収量=8.6mg(30%)。
LC-MS(エレクトロスプレー):実測値m/z=72682.09;計算値m/z=72682.13
HPLCによる純度:214nmで94%。
GH化合物の評価
上記実施例2に従って生成したGH化合物を、アッセイ2、3及び5に説明したように評価した。全ての化合物を静脈内投与し、平均滞留時間(MRT)を算出した。IGF-1血漿濃度-時間のプロファイルを各化合物について作成した。
Claims (15)
- 以下の構造
リンカーは化学的部分であり、
Sは硫黄原子であり、
タンパク質1は、リンカー及び硫黄原子を介してタンパク質2及びタンパク質3に共有結合的に連結されている]
のタンパク質コンジュゲート。 - コンジュゲートが以下の構造:
- コンジュゲートが以下の構造
を有する、請求項1に記載のタンパク質コンジュゲート。 - 硫黄原子(-S-)がチオエーテル(-CH2-S-CH2-)の一部である、請求項1から3のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- Uが窒素原子を含むか又は窒素原子のみからなる、請求項3に記載のコンジュゲート。
- タンパク質2及びタンパク質3がFcポリペプチドであり、コンジュゲートが以下の構造
- コンジュゲートが構造:
タンパク質1-RR-S1-U-[S2-NH-C(=O)-CH2-S-Fc]2
[式中、
RRは反応性末端基であり、
Uは中心の単位を表し、
S1及びS2は個々のスペーサーを表し、
FcはFcポリペプチドである]
を有する、請求項1から6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。 - タンパク質1が成長ホルモンである、請求項1から7のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- コンジュゲートが構造:
GH-RR-S1-U-[S2-NH-C(=O)-CH2-S-Fc]2
[式中、
GHは成長ホルモン分子を表し、
RR1は反応性末端基を表し、
Uは中心の単位を表し、
S1及びS2は個々のスペーサーを表し、
FcはFcポリペプチドである]
を有する、請求項1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲート。 - 各Fcポリペプチドのヒンジ領域がCys残基を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 硫黄原子(-S-)がタンパク質システイン、例えば野生型Cys残基又は変異体Cys残基に由来する、請求項1から10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- タンパク質1及びS1が-S-CH2-C(=O)-NH-を介して連結されている、請求項3から11のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 構造:
の三価リンカー。 - R2及びR3が-NH-C(=O)-CH2-LGを含み、構造:
のリンカーを提供する、請求項13に記載のリンカー。 - タンパク質1-SH、タンパク質2-SH及びチオール反応性リンカーを一緒にカップリングして、式II
タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-S-タンパク質2 (式II)
[式中、チオール反応性リンカーは構造:
LG1-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2
(式中、LG1はLG2より高い反応性を有する)
を有する]
のタンパク質コンジュゲートを得る、タンパク質コンジュゲートを調製する方法であって、
b) タンパク質1-SHをリンカーの-NH-C(=O)-CH2-LG1と反応させる工程と、
c) コンジュゲート中間体:タンパク質1-S-CH2-C(=O)-NH-リンカー-NH-C(=O)-CH2-LG2を得る工程と、
d) 脱離基交換反応を実施してLG2の反応性を増大させる工程と、
e) d)のコンジュゲート中間体をタンパク質2-SHと反応させる工程と、
f) タンパク質コンジュゲートを得る工程と
を含む、方法。
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