JP6165168B2 - 抗糖尿病化合物 - Google Patents

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Description

本発明は、インスリン分泌を促進し、血中グルコースレベルを低下させる新規化合物、ならびにこれらの化合物を作製および使用する方法に関する。
ＩＩ型糖尿病は、糖尿病の最も蔓延している形態である。この疾患は、インスリン抵抗性および膵β細胞不全によって引き起こされ、グルコース刺激性インスリン分泌の減少をもたらす。線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）２１は、ＦＧＦファミリーのメンバーであり、代謝調節因子として同定されており、肝臓組織および脂肪組織において選択的に発現され、肝臓組織および脂肪組織などの標的細胞上で、ＦＧＦＲ１ｃおよびβ−Ｋｌｏｔｈｏから構成される細胞表面受容体複合体を通じてその生物活性を発揮する（ＷＯ０１３６６４０、およびＷＯ０１１８１７２）。受容体複合体は、細胞質シグナル伝達を始動させ、Ｒａｓ／ＭＡＰキナーゼ経路を通じてＧＬＵＴ１発現を上方制御すると考えられている。前臨床設定において明らかな有害作用を引き起こすことなく、持続的グルコース制御および持続的脂質制御をもたらし、インスリン感受性およびβ細胞機能を改善するその能力のため、ＦＧＦ２１は、２型糖尿病および関連代謝異常にとって魅力的な治療剤である。
ＦＧＦ２１に基づく療法の開発に向けたいくつかの取り組みがなされている。ＷＯ２００６０６５５８２、ＷＯ２００６０２８７１４、ＷＯ２００６０２８５９５、およびＷＯ２００５０６１７１２は、個々のアミノ酸置換を含むＦＧＦ２１の突然変異タンパク質に関する。ＷＯ２００６０７８４６３は、ＦＧＦ２１を使用して心血管疾患を治療する方法を対象とする。ＷＯ２００５０７２７６９は、ＦＧＦ２１およびチアゾリジンジオンの組合せを使用して糖尿病を治療する方法に関する。ＷＯ０３０５９２７０は、ＦＧＦ２１を投与するステップを含む、重病患者の死亡率を低減する方法に関する。ＷＯ０３０１１２１３は、ＦＧＦ２１を投与するステップを含む、糖尿病および肥満症を治療する方法に関する。
しかし、これらの提案された療法の多くは、ＦＧＦ２１のヒトにおけるインビボ半減期が１．５〜２時間の間であるという問題に悩まされている。この欠点を克服するためのいくつかの試みが行われている。ＷＯ２００５０９１９４４、ＷＯ２００６０５０２４７、およびＷＯ２００８１２１５６３は、それぞれ、リシンまたはシステイン残基、グリコシル基、および非天然アミノ酸残基を介してＰＥＧに連結されたＦＧＦ２１分子を開示している。ＷＯ２００５１１３６０６は、ポリグリシンリンカーを使用して、ＦＧＦ２１分子のＣ末端を介してアルブミン分子および免疫グロブリン分子に組換えで融合されたＦＧＦ２１分子を記載している。
しかし、タンパク質コンジュゲートを有用な、費用効果的な医薬品に発展させることは、重要で多くの場合競合するいくつかの課題を提起する。インビボ効力、インビボ半減期、インビトロ貯蔵の安定性、ならびにコンジュゲーションの効率および特異性を含めた製造の容易さおよび効率の間でバランスを取らなければならない。一般に、コンジュゲーションプロセスは、対象とするタンパク質の所望の生物学的作用を排除しない、または著しく低減しないことが不可避である。機能に要求されるタンパク質間相互作用は、タンパク質の複数の領域が協調して作用することを必要とする場合があり、コンジュゲートが近傍に存在する状態でこれらのいずれかが混乱すると、活性部位（複数可）に支障をきたし、活性部位の機能を低減するように三次元構造を十分に変化させる場合がある。コンジュゲーションがＮ’末端またはＣ’末端を通じたものでない限り、連結を促進するための内部突然変異が必要となり得る。これらの突然変異は、タンパク質の構造および機能に対して予測不可能な効果を有する可能性がある。したがって、代替のＦＧＦ２１に基づく治療剤の必要性が依然としてある。
インクレチンは、グルコース依存性インスリン分泌を刺激し、グルカゴン分泌を阻害する化合物であり、ＩＩ型糖尿病を治療するための魅力的な候補として登場した。グルカゴン様ペプチド（７〜３６）アミド（ＧＬＰ１）は、インクレチンファミリーメンバーの１つであり、インスリン分泌を増大させ、グルカゴン分泌を減少させ、プロインスリン遺伝子転写を刺激し、胃内容排出時間を遅延させ、食物摂取量を低減することが示されている（ＷＯ９８０１９６９８）。ＧＬＰ１は、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）、推定７回膜貫通ドメイン受容体に結合することによってその生理的効果を発揮する。
ＧＬＰ１の治療的使用に対する欠点は、その短いインビボ半減期（１〜２分）である。この短い半減期は、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ−ＩＶ）によるペプチドの急速な分解の結果である。それにより、ＧＬＰ１Ｒ活性をアゴナイズする能力を維持しながら、半減期の増大を呈するＧＬＰ１相同体が同定された。これらの相同体の例には、エキセンジン４およびＧＬＰ１−Ｇｌｙ８が含まれる。
ＷＯ２００９０２０８０２は、ＧＬＰ１化合物と組み合わせてＦＧＦ２１化合物を投与するステップを含む、体重を低下させるための方法を開示している。
本明細書におけるいずれの技術への参照も、参照された技術が共通の一般的な知見の一部を形成するいずれの形態または示唆も承認するものではなく、こうした承認として解釈されるべきでない。
いくつかの態様では、本発明は、式：
［ＦＧＦ２１−第１リンカー］−［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］の組成物であって、式中、
ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１相同体であり、
Ｅｘ４は、エキセンジン４相同体であり、
Ａｂは、アルドラーゼ触媒抗体またはその抗原結合部分であり、
第１リンカーは、ＦＧＦ２１中のタンパク質連結残基の側鎖および抗体の結合部位に共有結合しており、
第２リンカーは、Ｅｘ４中のペプチド連結残基の側鎖および抗体の結合部位に共有結合しており、第１および第２リンカーは、同じまたは異なっている、組成物、またはその立体異性体、互変異性体、溶媒和物、プロドラッグ、および薬学的に許容できる塩を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、第１リンカーを介して抗体またはその抗原結合部分の第１結合部位に共有結合しているＦＧＦ２１分子を含み、第２リンカーを介して抗体の第２結合部位に共有結合しているエキセンジン４相同体をさらに含む組成物であって、第１リンカーは、ＦＧＦ２１内のタンパク質連結残基の側鎖に共有結合しており、第２リンカーは、エキセンジン４相同体内のペプチド連結残基の側鎖に共有結合している、組成物、またはその立体異性体、互変異性体、溶媒和物、プロドラッグ、および薬学的に許容できる塩に関する。
いくつかの態様では、本発明は、式：［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］を含み、式中、ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１相同体であり、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択することができ、Ｅｘ４は、エキセンジン４相同体であり、配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、および７２からなる群から選択することができ、抗体は、アルドラーゼ触媒抗体またはその抗原結合部分であり、第１リンカーは、ＦＧＦ２１中のタンパク質連結残基の側鎖および抗体の結合部位に共有結合しており、第２リンカーは、Ｅｘ４中のペプチド連結残基の側鎖および抗体の結合部位に共有結合しており、第１および第２リンカーは、同じまたは異なっている。第１および第２リンカーは、それぞれ独立して、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、およびＬ１０からなる群から選択することができる。
タンパク質連結残基は、システインまたはリシンとすることができる。タンパク質連結残基は、配列番号１の番号付けによるアミノ酸残基番号５６、５９、６９、７９、８６、１２２、１２５、および１２９からなる群から選択される位置に位置し得る。タンパク質連結残基は、配列番号１の番号付けによるアミノ酸残基番号５６、５９、８６、および１２２からなる群から選択される位置に位置し得る。タンパク質連結残基は、配列番号１の番号付けによる残基７９、１２５、および１２９からなる群から選択される位置に位置し得る。タンパク質連結残基は、配列番号１の番号付けによる残基１２５、および１２９からなる群から選択される位置に位置し得る。
タンパク質連結残基の側鎖は、チオール基を含むことができる。タンパク質連結残基は、システインとすることができる。
ＦＧＦ２１分子は、配列番号３を含み得る。ＦＧＦ２１分子は、配列番号４を含み得る。ＦＧＦ２１分子は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３からなる群から選択される配列を含み得る。
タンパク質連結残基は、配列番号１の番号付けによる１２５位に位置し得る。ＦＧＦ２１分子は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群から選択される配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１配列は、配列番号７である。
タンパク質連結残基は、配列番号１の番号付けによる１２９位に位置し得る。ＦＧＦ２１分子は、配列番号３、配列番号４、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択される配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１配列は、配列番号１０である。ＦＧＦ２１分子は、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０を含み得る。
タンパク質連結残基は、配列番号１の番号付けによる７９位に位置し得る。ＦＧＦ２１分子は、配列番号３、配列番号４、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３からなる群から選択される配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１配列は、配列番号１３である。
いくつかの実施形態では、タンパク質連結残基は、配列番号１の番号付けによる１、２、５６、５９、６９、および１２２からなる群から選択される位置に位置し得る。いくつかの実施形態では、タンパク質連結残基は、配列番号１の番号付けによる１、２、５６、５９、および１２２からなる群から選択される位置に位置し得る。タンパク質連結残基は、リシンとすることができる。ＦＧＦ２１分子は、配列番号１７を含み得る。ＦＧＦ２１分子は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２３からなる群から選択される配列を含み得る。
いくつかの態様では、エキセンジン４相同体は、式：
Ｈｘ２ＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳｘ４０（配列番号３８）を含むことができ、式中、ｘ２は、Ａｉｂであり、ｘ４０は、任意のアミノ酸を含むペプチド連結残基であり、または存在せず、Ｌ１０、Ｓ１１、Ｋ１２、Ｑ１３、Ｍ１４、Ｅ１６、Ｅ１７、Ｖ１９、Ｒ２０、Ｌ２１、Ｅ２４、Ｌ２６、Ｋ２７、Ｎ２８、Ｓ３２、Ｓ３３、Ｇ３４、Ａ３５、Ｐ３６、Ｐ３７、Ｐ３８、Ｓ３９、またはＸ４０の１つは、ペプチド連結残基［ＬＲ］を含み、またはこれで置換されており、その結果、ペプチド連結残基は、第２リンカーを介して抗体の第２結合部位に共有結合的に連結した求核性側鎖またはＣ末端カルボキシル基を含み、求核性側鎖によって連結可能な場所で、ペプチド連結残基は、Ｋ、Ｋ（ＳＨ）、Ｋ（Ｓ−ＭＡＬ）、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｔ、Ｓ、ホモシステイン、ホモセリン、Ｄａｐ、およびＤａｂからなる群から選択される。
ペプチド連結残基は、配列番号３８の番号付けによるアミノ酸残基番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２４、２７、２８、３９、および４０からなる群から選択される位置に位置し得る。いくつかの実施形態では、ペプチド連結残基は、配列番号３８の番号付けによる１２、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２４の位置の１つに位置する。いくつかの実施形態では、エキセンジン４相同体は、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、および配列番号５５からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチド連結残基は、配列番号３８の番号付けによる１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２４の位置の１つに位置する。いくつかの実施形態では、エキセンジン４相同体は、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、および配列番号５４からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチド連結残基は、配列番号３８の番号付けによる１２、１４、１７、１９、２０、または２１の位置の１つに位置する。いくつかの実施形態では、エキセンジン４相同体は、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、および配列番号５５からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチド連結残基は、配列番号３８の番号付けによる１２、１４、１９、２０、２１、または４０の位置の１つに位置する。
エキセンジン４相同体は、配列番号６０を含み得る。いくつかの実施形態では、エキセンジン４相同体は、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５３、配列番号５５、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、および配列番号７２からなる群から選択される配列を含む。
エキセンジン４相同体は、ｘ４０が存在しないとき、配列番号６０を含み得る。いくつかの実施形態では、エキセンジン４相同体は、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５３、配列番号５５、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、および配列番号７０からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチド連結残基は、配列番号６０の番号付けによる１４、１９、２０、または２１の位置の１つに位置する。いくつかの実施形態では、エキセンジン４相同体は、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５３、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、および配列番号７０からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチド連結残基は、配列番号６０の番号付けによる１４位に位置する。いくつかの実施形態では、エキセンジン４相同体は、配列番号５３、配列番号６３、配列番号６４、および配列番号７７からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、エキセンジン４相同体は、配列番号５３を含む。いくつかの実施形態では、エキセンジン４相同体は、配列番号６３を含む。いくつかの実施形態では、エキセンジン４相同体は、配列番号６４を含む。いくつかの実施形態では、エキセンジン４相同体は、配列番号７７を含む。
ペプチド連結残基は、第２リンカーに共有結合的に連結した求核性側鎖を含み得る。ペプチド連結残基は、Ｋ、Ｙ、Ｃ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｋ（ＳＨ）、およびＫ（Ｓ−ＭＡＬ）からなる群から選択することができる。ペプチド連結残基の側鎖は、チオール基を含むことができる。
ペプチド連結残基［ＬＲ］は、構造：Ｋ（Ｓ−ＭＡＬ）
Figure 0006165168
 を含むことができ、式中、ｕは、１、２、または３であり、Ｌは、第２リンカーである。いくつかの実施形態では、ｕは１である。いくつかの実施形態では、ｕは２である。いくつかの実施形態では、ｕは３である。別段の記載のない限り、Ｋ（ＳＭＡＬ）が実施例において使用される場合、ｕ＝２である。
いくつかの実施形態では、ペプチド連結残基は、構造Ｋ（ＳＨ）、
Figure 0006165168
 を含み、式中、ｕは、１、２、または３である。ｕ＝２である場合、Ｋ（ＳＨ）＝
Figure 0006165168
 である。
別段の記載のない限り、Ｋ（ＳＨ）が実施例および配列表において使用される場合、ｕ＝２である。
いくつかの態様では、エキセンジン４相同体は、ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、またはＣ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３からなる群から選択されるアミノ末端キャッピング基Ｒ１をさらに含む。いくつかの態様では、エキセンジン４相同体は、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨ（ＣＨ３）、ＮＨＣＨ２ＣＨ３、ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、ＮＨＣ６Ｈ５、ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＮＨＯＣＨ３、ＮＨＯＣＨ２ＣＨ３、カルボキシ保護基、脂質脂肪酸基、または炭水化物からなる群から選択されるカルボキシ末端キャッピング基Ｒ２をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｒ１はＣ（Ｏ）ＣＨ３である。いくつかの実施形態では、Ｒ２はＮＨ２である。Ｅｘ４ペプチドが配列番号６４を含み、Ｒ１がＣ（Ｏ）ＣＨ３であり、Ｒ２がＮＨ２である実施形態では、Ｅｘ４ペプチドは、配列番号７７と表すことができる。
いくつかの態様では、エキセンジン４相同体は、式：
Figure 0006165168
 を含む。
第１および第２リンカーはともにそれぞれ、それぞれタンパク質およびペプチドの提示において極めて重要な役割を果たす。リンカーの組成および長さは、タンパク質およびペプチドの両方について、これらのそれぞれの同族と相互作用するそれぞれの能力を最大にするために最適化されることが必須である。非対称二官能性分子（すなわち、２本のアームのそれぞれの上に異なるタンパク質／ペプチドを提示するもの）とのさらなる複合化は、一方のアームのリンカー−ペプチドの配置または機能性が他方のアームのリンカー−タンパク質の配置または機能性を妨害せず、逆の場合も同様であることが重要である。いくつかの実施形態では、リンカー長がより長いと、異なるアーム間の妨害を低減する傾向を有する。しかし、これとのバランスは、より長いリンカーがプロテアーゼに対してあまり保護をもたらさない傾向である。さらに、いくつかの状況では、短いリンカーは、ペプチドまたはタンパク質が同族の相互作用に対して最適に提示されることを可能にすることができ、リンカー長を長くすると、柔軟性が増大し、したがってこの利点を失い得る。反対に、それぞれの標的とのいくつかのタンパク質またはペプチド相互作用は、リンカー中のある特定の量の柔軟性によって改善される。したがって、各活性タンパク質／ペプチドの最適なリンカーの長さおよび組成を見つけ、アセンブルされる分子全体にわたって全体的にそれぞれバランスをとることは、タンパク質およびペプチドの両方の半減期と活性との適切なバランスを得るために極めて重要である。そのとき、これのすべては、各タンパク質／ペプチドに対して異なるリンカーを有することに付随する追加の製造コストおよび複雑性と相殺されなければならない。各活性分子に同じリンカーを使用すると、明らかな費用効率および製造効率がある。
ある特定の適当なリンカーは、ＵＳ２００９０９８１３０に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれている。特に、そこで具体的かつ一般的に記載される、リンカーを記述する一般式、特定のリンカー構造、リンカーの合成、ならびにＸ基、Ｙ（ｙｙとも表記し得る）基、およびＺ基の様々な要素の組合せに関係するＵＳ２００９０９８１３０の態様は、本明細書に含まれている。第１および／または第２リンカーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、１つまたは複数の炭素環基または複素環基を含んでもよい。リンカー長は、直鎖状原子の数に関してとらえることができ、芳香環などの環状部分は、環の周囲の最短経路を採用して数えられる。いくつかの実施形態では、第１および／または第２リンカーは、５〜１５原子、他の実施形態では、１５〜３０原子、さらに他の実施形態では、３０〜５０原子、さらに他の実施形態では、５０〜１００原子、およびさらに他の実施形態では、１００〜２００原子の間の直鎖状ストレッチを有する。他のリンカーの考慮事項には、得られる化合物の物理的または薬物動態学的性質、例えば、溶解度、親油性、親水性、疎水性、安定性（より安定またはより不安定、および計画された分解）、剛性、柔軟性、免疫原性、および抗体結合の調節、ミセルまたはリポソーム中に組み込まれる能力などに対する効果が含まれる。
第１および／または第２リンカーは、式：Ｘ−Ｙ−Ｚを含むことができ、式中、Ｘは、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択される任意の原子を含む生物学的に適合性の接続鎖であり、ポリマーまたはブロックコポリマーを含んでいてもよく、リンカーが直鎖状である場合は、タンパク質連結残基および／またはペプチド連結残基に共有結合により連結しており、Ｙは、少なくとも１つの環状構造を含む、存在してもよい認識基であり、Ｚは、抗体の結合部位におけるアミノ酸側鎖への共有結合性連結を含む結合部分である。
存在する場合、Ｙは、置換されていてもよい構造：
Figure 0006165168
 を有することができ、式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅは、独立して、炭素または窒素であり、ｆは、炭素、窒素、酸素、または硫黄であり、Ｙは、十分な価数の任意の２つの環位置で、独立してＸおよびＺに結合しており、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、またはｆのうちの４つ以下が同時に窒素であり、好ましくは、環状構造中のａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅは、それぞれ炭素である。いくつかの態様では、Ｙは、フェニルとすることができる。いずれの理論によっても束縛されることを望まないが、Ｙ基は、Ｚ基が反応性アミノ酸側鎖と反応することができるように、反応基を抗体結合部位中に配置するのを補助することができると考えられる。
第１および／または第２リンカーは、抗体、タンパク質、またはこれらの断片などの巨大分子との結合を共有結合または非共有結合により形成することができる反応基を含有するように設計することができる。反応基は、特定の結合部位中の反応性残基とともに使用するために選ばれる。例えば、アルドラーゼ抗体によって修飾するための化学部分は、ケトン、ジケトン、βラクタム、活性エステルハロケトン、ラクトン、アンヒドリド、マレイミド、α−ハロアセトアミド、シクロヘキシルジケトン、エポキシド、アルデヒド、アミジン、グアニジン、イミン、エナミン、ホスフェート、ホスホネート、エポキシド、アジリジン、チオエポキシド、マスクまたは保護されたジケトン（例えば、ケタール）、ラクタム、ハロケトン、アルデヒドなどであってもよい。本発明のペプチドをリンカーと連結する本発明の実施形態では、Ｚは反応基である。
いくつかの実施形態では、Ｚは、抗体の結合部位中の残基の側鎖とコンジュゲートする前に、アゼチジノン、ジケトン、アシルβ−ラクタム、活性エステル、ハロケトン、シクロヘキシルジケトン基、アルデヒド、マレイミド、活性化アルケン、活性化アルキン、または一般に、求核置換もしくは求電子置換に感受性の脱離基を含む分子を形成するように配列された１つまたは複数のＣ＝Ｏ基を含む。他の基として、ラクトン、アンヒドリド、α−ハロアセトアミド、イミン、ヒドラジド、またはエポキシドを挙げることができる。抗体の結合部位中の反応性求核基（例えば、リシン側鎖またはシステイン側鎖）に共有結合により結合することができる例示的なリンカーの求電子性反応基として、アシルβ−ラクタム、単純ジケトン、スクシンイミド活性エステル、マレイミド、リンカーを含むハロアセトアミド、ハロケトン、シクロヘキシルジケトン、アルデヒド、アミジン、グアニジン、イミン、エナミン、ホスフェート、ホスホネート、エポキシド、アジリジン、チオエポキシド、マスクまたは保護されたジケトン（例えば、ケタール）、ラクタム、スルホネートなど、マスクされたＣ＝Ｏ基、例えば、イミン、ケタール、アセタールなど、および任意の他の公知の求電子性基が挙げられる。ある特定の実施形態では、反応基は、アシルβ−ラクタム、単純ジケトン、スクシンイミド活性エステル、マレイミド、リンカーを含むハロアセトアミド、ハロケトン、シクロヘキシルジケトン、またはアルデヒドを形成するように配置された１つまたは複数のＣ＝Ｏ基を含む。Ｚは、置換アルキル、置換シクロアルキル、置換アリール、置換アリールアルキル、置換複素環、または置換ヘテロシクロアルキルとすることができ、ここで、少なくとも１つの置換基は、１，３−ジケトン部分、アシルβ−ラクタム、活性エステル、α−ハロケトン、アルデヒド、マレイミド、ラクトン、アンヒドリド、α−ハロアセトアミド、アミン、ヒドラジド、またはエポキシドである。いくつかの態様では、Ｚ基は、本発明のペプチドに半減期の延長をもたらし得る巨大分子骨格に共有結合により連結する。いくつかの態様では、Ｚ基は、存在する場合、抗体の結合部位に共有結合により連結する。
いくつかの態様では、コンジュゲートする前に（例えば、抗体の結合部位と）、Ｚは、構造：
Figure 0006165168
 を有し、式中、ｑ＝０〜５である。ｑは１または２であってもよい。ｑは１であってもよい。他の態様では、ｑは２であってもよい。
いくつかの態様では、抗体の結合部位とコンジュゲートした後に、Ｚは、構造：
Figure 0006165168
 を有し、式中、ｑ＝０〜５であり、抗体−Ｎ−は、抗体の結合部位中の側鎖への共有結合である（ＮＨは、抗体結合部位中の側鎖のリシンのε−アミノ基である）。ｑは１または２であってもよい。ｑは１であってもよい。他の態様では、ｑは２であってもよい。
Ｘは、３つの成分、すなわち、Ｘｐ−Ｘｓ−Ｘｙを含む基とすることができ、式中、Ｘｐは、ＦＧＦ２１タンパク質のタンパク質連結残基および／またはエキセンジン４相同体のペプチド連結残基の側鎖と結合できるように特に適合された基であり、Ｘｓは、Ｘ基のスペーサー領域であり、Ｘｙは、Ｙ基に結合するように適合された基である。いくつかの態様では、Ｘｙは、アミド結合、エナミン結合、またはグアニジン結合から選択される。Ｘｙは、Ｙ基に隣接する（２原子以内で）水素分子をもたらすように選択することができる。理論によって束縛されることを望まないが、Ｈ原子は、特に、ｈ３８Ｃ２などの触媒抗体の結合溝の疎水性ポケットに関して、Ｈ結合相互作用を通じた疎水性ポケットのＹ基の認識を補助することができると考えられる。したがって、アミド結合は、例えば、ＮＨ基がＹ基に直接結合され、水素結合のためにＮＨ基のＨを提供するように配向することができる。あるいは、アミドのＣ＝Ｏ基は、Ｙ基に結合し、ＮＨ基のＨが、Ｙ基に最大２原子で隣接するが、Ｈ結合に依然として利用可能である場合がある。いくつかの実施形態では、Ｘｙは存在しない。いくつかの実施形態では、Ｘｙ基は、式：
Figure 0006165168
 を有する。
いくつかの態様では、Ｘｓは、Ｘｓが過度に反応性の基を提供しないように選択される。Ｘｓは、２〜１５原子の間のＸ基の全長をもたらすように選択することができる。Ｘｓは、Ｘ基の全長が、２〜１０原子の間であるように選択することができる。Ｘｓは、Ｘ基の全長が、４〜８原子であるように選択することができる。Ｘｓは、Ｘ基の全長が、５原子であるように選択することができる。Ｘｓは、Ｘ基の全長が、６原子であるように選択することができる。いくつかの態様では、Ｘｓは、以下の式のうちの１つを含むことができ：
Figure 0006165168
 式中、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｍは、存在するか、または存在せず、ｎは、１、２、３、４、５、または６であってもよく、ｎは、１、２、３、または４であってもよく、ｎは、１であってもよく、ｎは、２であってもよく、ｎは、３であってもよく、ｎは、４であってもよい。
いくつかの態様では、Ｘｓは、以下の式のうちの１つを含む：
Figure 0006165168
Ｘｐは、理想的には、ＦＧＦ２１タンパク質のタンパク質連結残基および／またはエキセンジン４相同体のペプチド連結残基への特定方向共有結合性連結ストラテジーを可能にするように選択される。例えば、連結残基が求核基を含む場合、Ｘｐは、求電子基とすることができ、逆の場合も同様である。例えば、連結残基の側鎖がアミン基、例えば、Ｋ、Ｈ、Ｙ、オルニチン、Ｄａｐ、またはＤａｂなどを含む場合、Ｘｐは、ＣＯＯＨ、または他の同様に反応性の求電子体とすることができる。連結残基がＤまたはＥである場合、Ｘｐは、アミン基などの求核基を含むことができる。これらのストラテジーのいずれも、アミド結合形成ストラテジーによって、Ｘｐ基と連結残基との間に共有結合を形成することを可能にする。連結残基がアミン基を含む場合、Ｘｐは、式：
Figure 0006165168
を含むことができる。
連結残基が、Ｃ、Ｃの同族体、またはＫ（ＳＨ）などの他のチオール基含有残基である場合、Ｘｐは、マレイミド基（または同様のもの）を含むことができ、チオール−マレイミド付加反応ストラテジーを可能にすることによって、Ｘｐ基を連結残基に共有結合により連結する。いくつかの態様では、Ｘｐは、チオール基を含むこともでき、連結残基とＸｐ基の間にジスルフィド架橋が形成されるのを可能にする。いくつかの態様では、Ｘｐは、マレイミド：
Figure 0006165168
 とすることができ、ここで、矢印は、連結残基への結合箇所を示し、波線は、リンカーのＹ基への結合を表す。連結残基がシステイン残基、または他のチオールを持つ側鎖である場合、コンジュゲーションの機構は、以下の通りとなり得る：
Figure 0006165168
 式中、ＰＬＲは、タンパク質連結残基またはペプチド連結残基であり、Ｓは、Ｋ（ＳＨ）などのシステインまたは他のチオールを持つアミノ酸のチオール基の硫黄原子である。
いくつかの態様では、Ｘｐ基は、置換マレイミド：
Figure 0006165168
 を含む。
いくつかの態様では、コンジュゲーションの前後のＸＹ成分は、以下から選択することができる：
Figure 0006165168
成分ＸＹ−１、ＸＹ−２、ＸＹ−３、およびＸＹ−４は、連結残基上のチオール基を持つ側鎖にコンジュゲートする実施形態において特に有用である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー−１（Ｌ１）とすることができる：
Figure 0006165168
 Ｌ１がＰＬＲにコンジュゲートされる場合、Ｌ１−ＰＬＲ複合体は、式：
Figure 0006165168
 を含むことができる。Ｌ１が抗体およびＰＬＲにコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ１−ＰＬＲ複合体は、式：
Figure 0006165168
 を含むことができる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー−２（Ｌ２）とすることができる：
Figure 0006165168
 Ｌ２がＰＬＲにコンジュゲートされる場合、Ｌ２−ＰＬＲ複合体は、以下の式のうちの１つ：
Figure 0006165168
 を含むことができる。Ｌ２が抗体およびＰＬＲにコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ２−ＰＬＲ複合体は、以下の式のうちの１つ：
Figure 0006165168
 を含むことができる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー−３（Ｌ３）とすることができる：
Figure 0006165168
 Ｌ３がＰＬＲにコンジュゲートされる場合、Ｌ３−ＰＬＲ複合体は、以下の式のうちの１つ：
Figure 0006165168
 を含むことができる。Ｌ３が抗体およびＰＬＲにコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ３−ＰＬＲ複合体は、式：
Figure 0006165168
 を含むことができる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー−４（Ｌ４）とすることができる：
Figure 0006165168
 ＰＬＲにコンジュゲートされる場合、Ｌ４−ＰＬＲ複合体は、式：
Figure 0006165168
 を含むことができる。Ｌ４が抗体およびＰＬＲにコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ４−ＰＬＲ複合体は、式：
Figure 0006165168
 を含むことができる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー−５（Ｌ５）とすることができる：
Figure 0006165168
 Ｌ５がＰＬＲにコンジュゲートされる場合、Ｌ５−ＰＬＲ複合体は、式：
Figure 0006165168
 を含むことができる。Ｌ５が抗体およびＰＬＲにコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ５−ＰＬＲ複合体は、式：
Figure 0006165168
 を含むことができ、式中、ＮＨは、リシンなどのＬＲの側鎖の末端のアミノ基である。
いくつかの態様では、リンカーは、リンカー−６（Ｌ６）とすることができる。
Figure 0006165168
 Ｌ６がＰＬＲにコンジュゲートされる場合、Ｌ６−ＰＬＲ複合体は、Ｌ５−ＰＬＲ１についての式と同じ式を含み得る。同様に、Ｌ６が抗体およびＰＬＲにコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ６−ＰＬＲ複合体は、Ａｂ−Ｌ５−ＰＬＲについての式と同じ式を含み得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー−７（Ｌ７）とすることができる：
Figure 0006165168
 ＰＬＲにコンジュゲートされる場合、Ｌ７−ＰＬＲ複合体は、式：
Figure 0006165168
 を含むことができる。抗体およびＰＬＲ分子にコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ７−ＰＬＲ複合体は、式：
Figure 0006165168
 を含むことができる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー−８（Ｌ８）とすることができる：
Figure 0006165168
 Ｌ８がＰＬＲにコンジュゲートされる場合、Ｌ８−ＰＬＲ複合体は、式：
Figure 0006165168
 を含むことができる。Ｌ８が抗体およびＰＬＲにコンジュゲートされる場合、抗体−Ｌ８−ＰＬＲ複合体は、式：
Figure 0006165168
 を含むことができる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、式：
Figure 0006165168
 のものとすることができ、式中、抗体は、抗体の結合部位への共有結合性連結であり、Ｓ−ＰＬＲは、タンパク質連結残基および／またはペプチド連結残基上のチオールを持つ側鎖への共有結合性連結であり、ｎ＝１、または２、または３、または４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｎは、１、２、３、４、５、または６であってもよく、ｎは、１であってもよく、ｎは、２であってもよく、ｎは、３であってもよく、ｎは、４であってもよい。ｍは、存在しなくてもよい。ｍは、存在してもよい。
いくつかの実施形態では、第１および／または第２リンカーは、抗体およびＰＬＲにコンジュゲートしているとき、式：
Figure 0006165168
 のものとすることができ、式中、抗体は、抗体の結合部位への共有結合性連結であり、Ｓ−ＰＬＲは、タンパク質連結残基および／またはペプチド連結残基上のチオールを持つ側鎖への共有結合性連結であり、ｎ＝１、または２、または３、または４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｎは、１、２、３、４、５、または６であってもよく、ｎは、１であってもよく、ｎは、２であってもよく、ｎは、３であってもよく、ｎは、４であってもよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、式：
Figure 0006165168
 を含み、式中、抗体は、抗体の結合部位への共有結合性連結であり、Ｓ−ＰＬＲは、タンパク質連結残基および／またはペプチド連結残基上のチオールを持つ側鎖への共有結合性連結である。
いくつかの実施形態では、タンパク質連結残基は、アミノまたはチオールを持つ側鎖を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質連結残基は、リシンまたはシステインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質連結残基は、システインを含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質連結残基は、配列番号１の番号付けによる残基番号５６、５９、６９、７９、８６、１２２、１２５、および１２９の１つに位置する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１分子は、配列番号１０を含む。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１分子は、配列番号７を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチド連結残基は、配列番号６０の番号付けによる１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２１、２４、２６、２７、２８、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０の位置の１つに位置する。
いくつかの実施形態では、第１および第２リンカーは、同じである。いくつかの実施形態では、第１および第２リンカーはともに、Ｌ１を含む。
いくつかの態様では、抗体に結合しているときのタンパク質連結残基［Ｓ−ＰＬＲ］および／またはペプチド連結残基［Ｓ−ＰＬＲ］の構造は、式：
Figure 0006165168
 のものであり、式中、ｖは、１または２であり、ｔは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｙは、０、１、または２であり、ｓは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｑは、１、２、３、４、または５である。いくつかの態様では、ｖはであり、ｔは２であり、ｙは１であり、ｓは０であり、ｑは２である。
いくつかの態様では、本発明は、式：
Figure 0006165168
 の化合物を提供し、式中、ｖ１およびｖ２のそれぞれは独立して、１または２であり、ｔ１およびｔ２のそれぞれは独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｙ１およびｙ２のそれぞれは独立して、０、１、または２であり、ｓ１およびｓ２のそれぞれは独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｑ１およびｑ２のそれぞれは独立して、１、２、３、４、または５である。いくつかの態様では、ｖ１およびｖ２はともに２である。いくつかの態様では、ｔ１およびｔ２はともに２である。いくつかの態様では、ｙ１およびｙ２はともに１である。いくつかの態様では、ｓ１およびｓ２はともに０である。いくつかの態様では、ｑ１およびｑ２はともに２である。
いくつかの態様では、本発明は、式：
Figure 0006165168
 の組成物を提供し、式中、第１および第２リンカーはそれぞれ、２つの抗体結合部位のうちの１つに共有結合的に接続されており、抗体は、配列番号２５および配列番号２６を含み、Ｓ−Ｅｘ４は、配列番号６４のＫ（ＳＨ）へのチオール基を通じた共有結合性連結を表し、Ｓ−ＦＧＦ２１は、配列番号１０のＣ１２９へのチオール基を通じた共有結合性連結を表す。
いくつかの態様では、抗体の第２リンカーおよび第２結合部位に結合しているときのペプチド−連結残基［ＬＲ］の構造は、式：
Figure 0006165168
 のものであり、式中、ｕは、１、２、または３であり、ｖは、１または２であり、ｔは、１、２、または３であり、ｙは、１または２であり、ｓは、０、１、または２であり、ｑは、１または２である。いくつかの態様では、ｕは２であり、ｖは２であり、ｔは２であり、ｙは１であり、ｓは０であり、ｑは２である。
本発明のいくつかの態様では、エキセンジン４相同体および第２リンカーは、式：
Figure 0006165168
 を含み、式中、ｕは、１、２、または３であり、ｖは、１または２であり、ｔは、１、２、または３であり、ｙは、１または２であり、ｓは、０、１、または２であり、ｑは、１または２であり、［ＬＲ］は、ペプチド連結残基である。いくつかの態様では、ｕは２であり、ｖは２であり、ｔは２であり、ｙは１であり、Ｓは０であり、ｑは２である。いくつかの態様では、［ＬＲ］は、Ｋ、Ｋ（Ｓ−ＭＡＬ）、またはＫ（ＳＨ）である。
いくつかの実施形態では、本発明は、式：［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１−［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の組成物に関し、式中、ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１相同体であり、Ｅｘ４は、エキセンジン４相同体であり、Ａｂは、アルドラーゼ触媒抗体であり、第１リンカーは、ＦＧＦ２１中のタンパク質連結残基の側鎖および抗体の結合部位に共有結合しており、第２リンカーは、Ｅｘ４中のペプチド連結残基の側鎖および抗体の結合部位に共有結合しており、第１および第２リンカーは、同じであり、または異なっており、その結果、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体の皮下半減期は、マウスモデルにおいて少なくとも約２０時間である。いくつかの実施形態では、ＳＣ半減期は、少なくとも約２５時間である。いくつかの実施形態では、ＳＣ半減期は、少なくとも約３０時間である。いくつかの実施形態では、ＳＣ半減期は、少なくとも約３３時間である。いくつかの実施形態では、ＳＣ半減期は、霊長類モデルにおいて少なくとも約４０時間である。いくつかの実施形態では、ＳＣ半減期は、霊長類モデルにおいて少なくとも約４５時間である。いくつかの実施形態では、ＳＣ半減期は、霊長類モデルにおいて少なくとも４８時間である。いくつかの実施形態では、本発明は、マウスモデルにおいて少なくとも約２８時間のＩＶ半減期を有するコンジュゲートされた抗体−タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、マウスモデルにおいて少なくとも約３０時間のＩＶ半減期を有するコンジュゲートされた抗体−タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、マウスモデルにおいて少なくとも約３４時間のＩＶ半減期を有するコンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、マウスモデルにおいて少なくとも約４０時間のＩＶ半減期を有するコンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、霊長類モデルにおいて少なくとも約５０時間のＩＶ半減期を有するコンジュゲートされた抗体−タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、霊長類モデルにおいて少なくとも約５５時間のＩＶ半減期を有するコンジュゲートされた抗体−タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、霊長類モデルにおいて少なくとも約６０時間のＩＶ半減期を有するコンジュゲートされた抗体−タンパク質複合体を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、式：［ＦＧＦ２１−第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー−Ｅｘ４］の組成物に関し、式中、ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１相同体であり、Ｅｘ４は、エキセンジン４相同体であり、抗体は、アルドラーゼ触媒抗体であり、第１リンカーは、ＦＧＦ２１中のタンパク質連結残基の側鎖および抗体の結合部位に共有結合しており、第２リンカーは、Ｅｘ４中のペプチド連結残基の側鎖および抗体の結合部位に共有結合しており、第１および第２リンカーは、同じであり、または異なっており、その結果、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体の皮下バイオアベイラビリティーは、マウスモデルにおいて少なくとも約８０％である。いくつかの実施形態では、ＳＣバイオアベイラビリティーは、少なくとも約８５％である。いくつかの実施形態では、ＳＣバイオアベイラビリティーは、少なくとも約９０％である。いくつかの実施形態では、ＳＣバイオアベイラビリティーは、霊長類モデルにおいて少なくとも約５０％である。いくつかの実施形態では、ＳＣバイオアベイラビリティーは、霊長類モデルにおいて少なくとも約５５％である。いくつかの実施形態では、ＳＣバイオアベイラビリティーは、霊長類モデルにおいて少なくとも約６０％である。
いくつかの実施形態では、本発明は、式：［ＦＧＦ２１−第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー−Ｅｘ４］の組成物に関し、式中、ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１相同体であり、Ｅｘ４は、エキセンジン４相同体であり、抗体は、アルドラーゼ触媒抗体であり、第１リンカーは、ＦＧＦ２１中のタンパク質連結残基の側鎖および抗体の結合部位に共有結合しており、第２リンカーは、Ｅｘ４中のペプチド連結残基の側鎖および抗体の結合部位に共有結合しており、第１および第２リンカーは、同じであり、または異なっており、その結果、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体の皮下バイオアベイラビリティーは、約１ｎＭ未満のｈＧＬＰ−１Ｒ（ｉＡＭＰ）アッセイにおけるＥＣ５０効力を有する。いくつかの態様では、ｈＧＬＰ−１Ｒ（ｉＡＭＰ）アッセイにおけるＥＣ５０効力は、約５００ｐｍ未満である。いくつかの態様では、ｈＧＬＰ−１Ｒ（ｉＡＭＰ）アッセイにおけるＥＣ５０効力は、約１００ｐｍ未満である。いくつかの態様では、ｈＧＬＰ−１Ｒ（ｉＡＭＰ）アッセイにおけるＥＣ５０効力は、約５０ｐｍ未満である。いくつかの態様では、ｈＧＬＰ−１Ｒ（ｉＡＭＰ）アッセイにおけるＥＣ５０効力は、約１０〜５０ｐｍの間である。
いくつかの実施形態では、本発明は、式：［ＦＧＦ２１−第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー−Ｅｘ４］の組成物に関し、式中、ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１相同体であり、Ｅｘ４は、エキセンジン４相同体であり、抗体は、アルドラーゼ触媒抗体であり、第１リンカーは、ＦＧＦ２１中のタンパク質連結残基の側鎖および抗体の結合部位に共有結合しており、第２リンカーは、Ｅｘ４中のペプチド連結残基の側鎖および抗体の結合部位に共有結合しており、第１および第２リンカーは、同じであり、または異なっており、その結果、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体は、約５ｎＭ未満のＧｌｕｔ１ ＴａｑｍａｎアッセイにおけるＥＣ５０効力を有する。いくつかの実施形態では、Ｇｌｕｔ１ ＴａｑｍａｎアッセイにおけるＥＣ５０効力は、約４ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、Ｇｌｕｔ１ ＴａｑｍａｎアッセイにおけるＥＣ５０効力は、約３ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、Ｇｌｕｔ１ ＴａｑｍａｎアッセイにおけるＥＣ５０効力は、約２ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、Ｇｌｕｔ１ ＴａｑｍａｎアッセイにおけるＥＣ５０効力は、約１ｎＭ未満である。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートされたタンパク質−抗体複合体は、２つ以上の好都合な利点、例えば、ＳＣ半減期、ＩＶ半減期、グルコース取込み、効力、バイオアベイラビリティー、製造の容易さ、コンジュゲーション効率、インビボ安定性、インビトロ安定性、加水分解に対する耐性、ならびに抗体、リンカー、およびタンパク質の間の適合性などを兼ね備える。
いくつかの態様では、本発明は、配列番号１の番号付けによる残基番号１７１に位置する連結残基において、少なくとも１つの半減期延長部分（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ−ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）に共有結合により接続されたＦＧＦ２１分子を含む組成物を提供する。いくつかの態様では、ＦＧＦ２１分子は、１つの半減期延長部分に共有結合により接続されている。いくつかの態様では、ＦＧＦ２１分子は、１つを超える半減期延長部分に共有結合的に接続されている。いくつかの態様では、連結残基は、残基番号７９、１２９、および１７１からなる群から選択される。いくつかの態様では、連結残基は、１７１位である。ＦＧＦ２１分子は、配列番号７３を含み得る。ＦＧＦ２１分子は、配列番号７４を含み得る。ＦＧＦ２１分子は、配列番号７５を含み得る。用語「半減期延長部分」は、ＦＧＦ２１分子に接続される場合、ＦＧＦ２１分子の循環半減期を延長し、かつ／またはＦＧＦ２１分子の腎クリアランスを阻害もしくは低減する任意の分子を指す。半減期延長部分の例として、ＰＥＧ、ｍＰＥＧ、ホスホリルコリン含有ポリマー、Ｆｃドメイン、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、抗体、触媒抗体（以下で論じられる）、タンパク質（アルブミンなど）、および当技術分野で公知である他の巨大分子が挙げられる。
抗体
「約」または「およそ」は、測定可能な数値変数に関連して使用されるとき、その変数の示された値、および示された値の実験誤差内（例えば、平均の９５％信頼区間内）、または示された値の１０パーセント以内のいずれか大きい方である変数のすべての値を指す。
「抗体」は、免疫グロブリン分子であって、その免疫グロブリン分子の可変領域中に位置した少なくとも１つの抗原認識部位を通じて、標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに特異的に結合することができる、免疫グロブリン分子である。本明細書において、用語「抗体」は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、これらの任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）または単鎖、抗体を含む融合タンパク質、ならびに例えば、限定することなく、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、サメおよびラクダ科の動物の抗体）、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、ミニボディ、細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ダイアボディ、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ｖ−ＮＡＲ、およびビス−ｓｃＦｖを含めた、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された立体配置も包含する（例えば、ＨｏｌｌｉｎｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２３（９）：１１２６〜１１３６を参照）。抗体には、任意のクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＭ（またはこれらのサブクラス）などが含まれ、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分類することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および３次元立体配置は、周知である。
ヒト軽鎖定常領域の２つのタイプ、ラムダ（ＣＬ−λ）およびカッパ（ＣＬ−κ）が公知である。４６位の多型Ｖ／Ａおよび８４位の多型Ａ／Ｌ（配列番号７８による番号付け）に基づいて３つの公知のＣＬ−κ変異体がある。３つの同定されたＣＬ−κ多型は、Ｋｍ（１）：Ｖ４６／Ｌ８４、Ｋｍ（１，２）：Ａ４６／Ｌ８４、およびＫｍ（３）：Ａ４６／Ｖ８４である。したがって、本発明の抗体は、配列番号７８、７９、８０、もしくは８１のいずれか１つによる定常カッパドメイン、または５、４、３、２、もしくは１つ以下のアミノ酸挿入、置換、もしくは欠失を含むこれらの変異体を含むことができる。いくつかのカウント法による配列番号７８、７９、８０、および８１の残基Ｒ１を、可変ドメイン内に含めることができ、したがって定常ドメインは、前記配列の残基Ｔ２から始まるとみなすこともできることを、当業者は理解する。
用語の抗体の「抗原結合部分」は、本明細書において、所与の抗原（例えば、標的Ｘ）に特異的に結合する能力を保持するインタクト抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、インタクト抗体の断片によって実行され得る。用語の抗体の「抗原結合部分」の中に包含される結合断片の例として、Ｆａｂ；Ｆａｂ’；Ｆ（ａｂ’）２；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６）、ならびに単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を、単独で、または組合せで指す。当技術分野で公知であるように、重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても公知である３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなり、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。特に、ＣＤＲ領域の外側（すなわち、フレームワーク領域内）のアミノ酸残基中に置換を有する、対象可変領域の変異体が望まれる場合、適切なアミノ酸置換、好ましくは、保存的アミノ酸置換は、対象可変領域を、対象可変領域と同じカノニカルクラス中のＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を含有する他の抗体の可変領域と比較することによって同定することができる（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９６（４）：９０１〜９１７、１９８７）。対象ＣＤＲに隣接するようにＦＲを選ぶとき、例えば、抗体をヒト化または最適化するとき、同じカノニカルクラス内のＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を含有する抗体に由来するＦＲが好適である。
可変ドメインの「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの両方の累積の定義、ＡｂＭ、接触、および／もしくはコンフォメーションの定義、または当技術分野で周知のＣＤＲの決定の任意の方法によって同定される可変領域内のアミノ酸残基である。抗体ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらによって最初に定義された超可変領域として同定することができる。例えば、Ｋａｂａｔら、１９９２、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、公衆衛生局、ＮＩＨ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．を参照。ＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａらによって最初に記載された構造的ループ構造として同定することもできる。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７〜８８３を参照。ＣＤＲ同定のための他の手法には、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの間の妥協案であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（現在、Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を使用して得られる「ＡｂＭ定義」、またはＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２〜７４５に示された、観察される抗原接触に基づくＣＤＲの「接触定義」が含まれる。ＣＤＲの「コンフォメーション定義」と本明細書で呼ばれる別の手法では、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー的寄与をする残基として同定することができる。例えば、Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６を参照。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記手法の１つに厳密に従わない場合があり、しかしそれにもかかわらず、Ｋａｂａｔ ＣＤＲの少なくとも一部と重なることになるが、これらは、特定の残基もしくは残基の群、またはさらにはＣＤＲ全体が抗原結合に有意にインパクトを与えないという予測または実験的知見を踏まえて、短くし、または長くすることができる。本明細書において、ＣＤＲは、手法の組合せを含めて、当技術分野で公知の任意の手法によって定義されるＣＤＲを指すことができる。本明細書で使用される方法は、これらの手法のいずれかによって定義されたＣＤＲを利用することができる。１つを超えるＣＤＲを含む任意の所与の実施形態について、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＡｂＭ、接触、および／またはコンフォメーションの定義のいずれかによって定義することができる。
ＵＳ２００６２０５６７０の内容は、参照により本明細書に組み込まれている。ＵＳ２００６２０５６７０は、本願に直接適用可能ないくつかの組成物および技法を記載しており、特に、段落［０１５３］〜［０２３３］において、抗体技術の他の要素の中で、抗体、これらの有用な断片および変異体および修飾、結合部位、ならびにＣＤＲ、抗体調製、発現、ヒト化、アミノ酸修飾、グリコシル化、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、抗体の血清半減期を増大させること、発現ベクター、哺乳動物宿主システム、ならびに折り畳みを記載している。
本明細書において、「結合部位」（抗体結合部位としても知られる）は、適切な抗原（または構造的に同様のタンパク質）の決定基と化合する（または化合することができる）免疫グロブリンまたはＩｇドメインの領域を指す。この用語は一般に、抗原結合に関与するＣＤＲおよび隣接フレームワーク残基を含む。
「アルドラーゼ抗体」は、本明細書において、阻害されていない場合（例えば、コンジュゲーションによって）、脂肪族ケトンドナーとアルデヒドアクセプターとの間のアルドール付加反応を触媒する結合部位部を含有する抗体を指す。アルドラーゼ抗体は、免疫性−反応性の動物を、キャリアタンパク質にカップリングした式：
Figure 0006165168
 の１，３ジケトンハプテンを含む免疫原で免疫することによって生成され得、抗体の結合部位において反応性ε−アミノ基を伴ったリシンを有することによってさらに特徴づけられる。アルドラーゼ抗体は、１，３−ジケトンハプテンと触媒抗体のリシンのε−アミノ基との間で複合体を形成することによって、１，３−ジケトンハプテンで阻害を受けやすいその触媒活性によってさらに特徴づけられる。
論じたように、ある特定の実施形態では、本発明の化合物とともに使用することができるある特定の抗体は、抗体結合部位中に反応性側鎖を必要とする場合がある。反応性側鎖は、天然に存在していてもよく、または突然変異によって抗体中に置かれてもよい。抗体結合部位の反応性残基は、この残基が、抗体を作製するのに最初に同定されるリンパ系細胞内に存在する核酸によってコードされる場合などに、抗体に付随し得る。あるいは、アミノ酸残基は、特定の残基をコードするようにＤＮＡを意図的に突然変異させることによって生じ得る（例えば、ＷＯ０１／２２９２２）。反応性残基は、例えば、本明細書で論じられるユニークコドン、ｔＲＮＡ、およびアミノアシル−ｔＲＮＡを使用する生合成的組込みによって生じる非天然残基とすることができる。別の手法では、アミノ酸残基またはその反応性官能基（例えば、求核性のアミノ基またはスルフヒドリル基）は、抗体結合部位中のアミノ酸残基に結合することができる。したがって、本明細書において、「抗体の結合部位中のアミノ酸残基を通じて」起こる抗体との共有結合性連結は、抗体結合部位のアミノ酸残基に直接のもの、または抗体結合部位のアミノ酸残基の側鎖に連結された化学部分を通じたものとすることができることを意味する。いくつかの実施形態では、アミノ酸はシステインであり、側鎖の反応基はスルフヒドリル基である。他の実施形態では、アミノ酸残基はリシンであり、側鎖の反応基はε−アミノ基である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｋａｂａｔ番号付けによる重鎖上のＬｙｓ９３である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、ＨＣ ｈ３８Ｃ２（配列番号２６）上のＬｙｓ−９９である。
触媒抗体は、１つまたは複数の反応性アミノ酸側鎖を含む適当な結合部位を有する抗体の１つの源である。このような抗体には、アルドラーゼ抗体、βラクタマーゼ抗体、エステラーゼ抗体、およびアミダーゼ抗体が含まれる。
一実施形態は、アルドラーゼ抗体、例えば、マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ ３３Ｆ１２およびｍＡｂ ３８Ｃ２、ならびにこのような抗体の適切なキメラバージョンおよびヒト化バージョンなど（例えば、ｈ３８Ｃ２、配列番号２５および２６）を含む。マウスｍＡｂ ３８Ｃ２（およびｈ３８Ｃ２）は、ＨＣＤＲ３の付近であるが外側に反応性リシンを有し、反応性免疫化によって生成された触媒抗体の新規クラスのプロトタイプであり、天然アルドラーゼ酵素を機構的に模倣する。Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ３世ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：２０８５〜２０９２（１９９７）を参照。使用することができる他のアルドラーゼ触媒抗体には、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１５を有するハイブリドーマ８５Ａ２；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１４を有するハイブリドーマ８５Ｃ７；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１７を有するハイブリドーマ９２Ｆ９；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２３を有するハイブリドーマ９３Ｆ３；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２４を有するハイブリドーマ８４Ｇ３；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１８を有するハイブリドーマ８４Ｇ１１；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１９を有するハイブリドーマ８４Ｈ９；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２５を有するハイブリドーマ８５Ｈ６；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１６を有するハイブリドーマ９０Ｇ８によって生成される抗体が含まれる。反応性リシンを通じて、これらの抗体は、天然アルドラーゼのエナミン機構を使用してアルドール反応およびレトロ−アルドール反応を触媒する。アルドラーゼ抗体およびアルドラーゼ抗体を生成する方法は、米国特許第６，２１０，９３８号、同第６，３６８，８３９号、同第６，３２６，１７６号、同第６，５８９，７６６号、同第５，９８５，６２６号、および同第５，７３３，７５号に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれている。
本発明の化合物は、チオエステラーゼ触媒抗体およびエステラーゼ触媒抗体の結合部位中に見出されるものなどの反応性システインに本発明の化合物を連結することによっても形成することができる。適当なチオエステラーゼ触媒抗体は、Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：２５３２〜２５３６（１９９４）によって記載されている。適当なエステラーゼ抗体は、Ｐ．Ｗｉｒｓｃｈｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１７７５〜１７８２（１９９５）によって記載されている。反応性アミノ酸含有抗体は、反応性アミノ酸をコードするように抗体結合部位の残基を突然変異させること、または反応基を含有するリンカーを用いて抗体結合部位中のアミノ酸側鎖を化学的に誘導体化することを含めて、当技術分野で周知である手段によって調製することができる。
抗体は、ヒト化抗体とすることができる。本発明の化合物が抗体の結合部位に共有結合により連結され、このような抗体がヒト化される場合、このような抗体は、Ｚ基に対する高い連結親和性を保持してヒト化されることが重要である。様々な形態のヒト化マウスアルドラーゼ抗体が企図されている。一実施形態では、ヒト定常ドメインＣκおよびＣγ１１を有するヒト化アルドラーゼ触媒抗体ｈ３８ｃ２ ＩｇＧ１またはｈ３８ｃ２ Ｆａｂを使用する。Ｃ．Ｒａｄｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．３３２：８８９〜８９９（２００３）は、ｈ３８ｃ２ Ｆａｂおよびｈ３８ｃ２ ＩｇＧ１を生成するのに使用することができる遺伝子配列およびベクターを開示している。ヒト生殖系列Ｖｋ遺伝子ＤＰＫ−９およびヒトＪｋ遺伝子ＪＫ４は、ｍ３８ｃ２のκ軽鎖可変ドメインをヒト化するためのフレームワークとして使用され、ヒト生殖系列遺伝子ＤＰ−４７およびヒトＪＨ遺伝子ＪＨ４は、ｍ３８ｃ２の重鎖可変ドメインをヒト化するためのフレームワークとして使用された。図１は、ｍ３８ｃ２、ｈ３８ｃ２、およびヒト生殖系列における可変軽鎖と可変重鎖の間の配列アライメントを例示する。ｈ３８ｃ２は、そのアロタイプのいずれかを含む、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４定常ドメインを利用することができる。抗体がＧ１ｍ（ｆ）アロタイプを含むｈ３８ｃ２ ＩｇＧ１である、本発明の化合物のある特定の実施形態では、Ｚは、重鎖の９９位でリシン残基の側鎖に結合する。別の実施形態では、ｈ３８ｃ２の可変ドメイン（ＶＬおよびＶＨ）（配列番号２７および２８）、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来する定常ドメインを含むキメラ抗体を使用する。抗体は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、ダイアボディ、またはミニボディとすることができる。抗体は、全長抗体とすることができ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Δａ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４Δｂ、ＩｇＧ４Δｃ、ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４Δｂ Ｓ２２８Ｐ、およびＩｇＧ４ΔｃＳ２２８Ｐからなる群から選択することができる。抗体またはその抗原結合部分は、ｈ３８ｃ２に由来するＶＨおよびＶＬドメインを含み得る。抗体は、ｈ３８ｃ２に由来するＶＬドメインおよびＶＨドメイン、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Δａ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４Δｂ、ＩｇＧ４Δｃ、ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４ΔｂＳ２２８Ｐ、およびＩｇＧ４ΔｃＳ２２８Ｐからなる群から選択される定常ドメインを含む抗体であってもよい。抗体は、ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１（配列番号２５および２６）であってもよい。抗体は、ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ２（配列番号２５および７６）であってもよい。抗体は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体に由来する定常領域を含むマウスアルドラーゼ抗体のヒト化バージョンであってもよい。別の実施形態では、抗体は、マウスアルドラーゼ抗体に由来するＶＬ領域およびＶＨ領域、ならびにヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体に由来する定常領域を含むキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ｍ３８Ｃ２に由来するＶＬ領域およびＶＨ領域（配列番号２９および３０）を含む。さらなる実施形態では、抗体は、天然または固有のヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体に由来するポリペプチド配列を含むマウスアルドラーゼ抗体の完全ヒトバージョンである。いくつかの態様では、抗体は、配列番号２７に示した軽鎖可変領域（ＶＬ）配列のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬ、ならびに配列番号２８に示した重鎖可変領域（ＶＨ）配列のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨを含み得る。上記に概説したように、ＣＤＲは、当技術分野のいくつかの公知の方法によって求めることができる。
いくつかの態様では、抗体は、配列番号２５と少なくとも９５％同一である軽鎖、および配列番号２６と少なくとも９５％同一である重鎖を含む。軽鎖は、配列番号２５と少なくとも９６％同一であり得る。軽鎖は、配列番号２５と少なくとも９７％同一であり得る。軽鎖は、配列番号２５と少なくとも９８％同一であり得る。軽鎖は、配列番号２５と少なくとも９９％同一であり得る。重鎖は、配列番号２６と少なくとも９６％同一であり得る。重鎖は、配列番号２６と少なくとも９７％同一であり得る。重鎖は、配列番号２６と少なくとも９８％同一であり得る。重鎖は、配列番号２６と少なくとも９９％同一であり得る。いくつかの態様では、軽鎖は、１つのアミノ酸によって配列番号２５と異なる場合がある。いくつかの態様では、重鎖は、１つのアミノ酸によって配列番号２６と異なる場合がある。いくつかの態様では、軽鎖と配列番号２５との差異は、定常領域内のみに位置し得る。いくつかの態様では、重鎖と配列番号２６との差異は、定常領域内のみに位置し得る。
様々な形態のヒト化アルドラーゼ抗体断片も企図されている。一実施形態では、ｈ３８ｃ２ Ｆ（ａｂ’）２を使用する。ｈ３８ｃ２ Ｆ（ａｂ’）２は、ｈ３８ｃ２ ＩｇＧ１のタンパク質消化によって生成することができる。別の実施形態では、介在リンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３１）によって接続されていてもよい、ｈ３８ｃ２に由来するＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むｈ３８ｃ２ ｓｃＦｖを使用する。ヒト化の代替として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、免疫化（または触媒抗体の場合では反応性免疫化）の後に、内在性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを生成することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが現在では可能である。
あるいは、ファージディスプレイ技術を使用することによって、免疫されていないドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーを使用して、インビトロでヒト抗体および抗体断片を生成することができる。上記に示したように、ヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞、例えば、米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号によって生成することもできる。
本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）は、企図されている。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的性質を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体核酸中に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。このような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、この残基への挿入、および／またはこの残基の置換が含まれる。最終的な構築物に到達するように、欠失、挿入、および置換の任意の組合せが行われ、ただし、最終的な構築物は、所望の特性を有する。グリコシル化部位の数または位置の変化などのアミノ酸変化はまた、抗体の翻訳後プロセスを変更し得る。
本発明の抗体または抗体部は、別の分子（例えば、別のペプチドもしくはタンパク質）に誘導体化または連結することができる。一般に、抗体またはその一部分は、リンカーの、抗体結合部位に共有結合によりコンジュゲートする能力が誘導体化または標識化によって悪影響されないように誘導体化される。したがって、本発明の抗体および抗体部は、本明細書に記載される抗体のインタクトな形態および修飾形態の両方を含むことが意図されている。例えば、本発明の抗体または抗体部は、１つまたは複数の他の分子実体、例えば、別の抗体（例えば、二重特異性抗体もしくはダイアボディ）、検出剤、細胞毒性薬、医薬品、および／または別の分子（ストレプトアビジンコア領域もしくはポリヒスチジンタグなど）との抗体もしくは抗体部の付随を媒介することができるタンパク質もしくはペプチドなどに機能的に連結することができる（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合、または他の方法によって）。
他の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合部は、融合抗体、または別のポリペプチドに連結された抗体とすることができる。いくつかの態様では、抗体の可変領域のみがポリペプチドに連結される。いくつかの態様では、抗体は、結合部位の結合能力を妨害しないようにペプチドに共有結合によりコンジュゲートされる。
ポリペプチドは、治療剤、例えば、ターゲティング剤、ペプチド、タンパク質アゴニスト、タンパク質アンタゴニスト、代謝調節因子、ホルモン、毒素、成長因子、または他の調節タンパク質などであっても、西洋わさびペルオキシダーゼなどの、容易に可視化され得る酵素などの診断剤であってもよい。さらに、２つ（またはそれ以上）の単鎖抗体が互いに連結されている融合抗体を作り出すことができる。これは、１本のポリペプチド鎖上に二価もしくは多価抗体を作り出したい場合、または二重特異性抗体を作り出したい場合に有用である。
一タイプの誘導体化抗体は、２つ以上の抗体（例えば、二重特異性抗体を作り出すために、同じタイプまたは異なるタイプの）を架橋することによって生成される。適当な架橋剤には、適切なスペーサーによって分離された２つの別個に反応性の基を有するヘテロ二官能性（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、またはホモ二官能性（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）であるものが含まれる。
別のタイプの誘導体化抗体は、標識抗体である。本発明の抗体または抗体部が誘導体化され得る有用な検出剤は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニド蛍光体などを含めた蛍光化合物が含まれる。抗体は、検出に有用である酵素、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどで標識することもできる。抗体が検出可能な酵素で標識される場合、これは、酵素が使用する追加の試薬を添加して、見分けることができる反応生成物を生成することによって検出される。例えば、作用物質の西洋わさびペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンを添加すると、検出可能である着色した反応生成物がもたらされる。抗体はまた、ビオチンで標識し、アビジンまたはストレプトアビジン結合という間接的測定を通じて検出することができる。抗体は、ガドリニウムなどの磁性剤で標識してもよい。抗体は、二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される所定のポリペプチドエピトープで標識することもできる。いくつかの実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を低減するために、様々な長さのスペーサーアームによって結合される。
抗体は、化学基、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基もしくはエチル基、または炭水化物基などで誘導体化することもできる。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善する、例えば、血清半減期を延長し、または組織結合を増大させるのに有用となり得る。
コンジュゲーションプロセス
本発明は、式：
［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１−［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の化合物であって、
式中、ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１相同体であり、
Ｅｘ４は、エキセンジン４相同体であり、
Ａｂは、アルドラーゼ触媒抗体またはその抗原結合部分であり、
第１リンカーは、ＦＧＦ２１中のタンパク質連結残基の側鎖および抗体の結合部位に共有結合しており、
第２リンカーは、Ｅｘ４中のペプチド連結残基の側鎖および抗体の結合部位に共有結合しており、
第１および第２リンカーは、同じまたは異なっている、化合物を生成するためのプロセスを提供する。一実施形態によれば、本発明は、
（ｉ）ＦＧＦ２１および第１リンカーを約１：４〜約１：１の間の比で一緒に混合することによって、複合体［ＦＧＦ２１−第１リンカー］を形成するステップと、
（ｉｉ）［Ａｂ］、［Ａｂ］−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１および［Ａｂ］−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］２を含有する混合物を形成するように、［ＦＧＦ２１−第１リンカー］およびＡｂを約１．１：１〜約１：５の間の比で一緒に混合するステップと、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で形成された混合物から［Ａｂ］−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１分子を抽出するステップと、
（ｉｖ）Ｅｘ４および第２リンカーを約２：１〜約１：２の間の比で一緒に混合することによって、複合体［第２リンカー−Ｅｘ４］を形成するステップと、
（ｖ）［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１−［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１を含有する混合物を形成するように、約２：１〜約１：２の間の比で［Ａｂ］−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１を［第２リンカー−Ｅｘ４］と混合するステップと
を含むプロセスを提供する。
ＦＧＦ２１を第１リンカーとコンジュゲートすること
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１相同体は、約２０ｍＭのトリス、約５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝約７中で提供される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１相同体は、約２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ＝約６．５中で提供される。いくつかの実施形態では、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）は、ＦＧＦ２１と比較して０．１×から１０×倍の最終濃度まで添加することができる（０．５×および０．７５×が、特によく機能することが示されている）。これは、タンパク質のおよそ７５％以上が単量体形態であるように、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃが二量体化する傾向を最小にするという利点を有する。タンパク質が二量体化される場合、ＴＣＥＰがこれを壊して単量体に戻す。ＴＣＥＰは別として、０．１×〜１０×の濃度のメルカプトエタノール（β−ＭＥ）またはジチオトレイトール（ＤＴＴ）を、二量体を壊して単量体に戻すのに使用することができる。β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）またはジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの試薬もＦＧＦ２１と反応し、チオール硫黄と共有結合を形成するが、ＴＣＥＰは、ＦＧＦ２１と共有結合を形成しない。テトラキス−ヒドロキシメチルホスホニウムクロリドおよびトリス−ジエチルアミノメチルホスフィンなどの他の試薬は、ジスルフィドを容易に還元することができ、二量体を還元して単量体にするのに有用である。いくつかの実施形態では、第１リンカーは、約１０ｍＭの濃度で、約１００％のＤＭＳＯ中で提供される。
いくつかの態様では、ＦＧＦ２１および第１リンカーは、穏やかに回旋しながら約室温で約３０分間インキュベートすることによって、一緒にコンジュゲートすることができる。［ＦＧＦ２１−第１リンカー］複合体は、過剰のリンカーがＺｅｂａカラム樹脂中に残るように、混合物をプレ平衡化したＺｅｂａカラムに通して溶出することによって得ることができる。
ＦＧＦ２１の第１リンカーとのコンジュゲーションは、約１：１〜約１：４の間の比で実施することができる。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１と第１リンカーとのコンジュゲーションは、下限が約１：１、約１：１．２５、約１：１．５、約１：１．７５、約１：２からなる群から選択され、上限が約１：２、約１：２．２５、約１：２．５、約１：２．７５、約１：３、約１：３．５、および約１：４からなる群から選択される比の範囲で実施することができる。いくつかの態様では、リンカーの量は、ＦＧＦ２１と比較して当量基準で約２〜約４倍過剰に増やすことができる。第１リンカーの量が増えると、コンジュゲーション時間を速めるのに役立ち得る。しかし、約４倍超過剰のリンカーを添加しても、生成物形成または反応時間のそれ以上の増大を生じない。約２倍過剰の第１リンカーが好ましく、これは、ＦＧＦ２１−リンカー材料をもたらす。１当量未満まで第１リンカーの量を減らすと、生成物形成の量が低減する。リンカーの量が、約０．９当量、および約０．８当量、０．７当量などに降下するにつれて、形成される生成物の量が減少する。形成される生成物の量が最高になるのは、ＦＧＦ２１と第１リンカーの比が約１：１〜約１：２の間であるときである。
［ＦＧＦ２１−第１リンカー］の抗体へのコンジュゲーション
いくつかの態様では、［ＦＧＦ２１−第１リンカー］は、ＭＥＳまたはリン酸塩緩衝液中で、約２５ｍＭ〜約１５０ｍＭの間の濃度で、約５．５〜約７．５または約６．０〜約７．０のｐＨ範囲で、約０℃〜３７℃の間で、好ましくは約４℃〜約ＲＴの間で、抗体にコンジュゲートされる。いくつかの態様では、［ＦＧＦ２１−第１リンカー］は、１００ｍＭのリン酸塩緩衝液中で、約６．０〜約６．５のｐＨ範囲で、ＲＴで抗体にコンジュゲートされる。［ＦＧＦ２１−第１リンカー］は、少なくとも３０分、少なくとも約６０分、少なくとも約９０分、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、および少なくとも約２４時間からなる群から選択される時間にわたって実施される反応中で抗体にコンジュゲートすることができる。
Ａｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］を抽出すること
いくつかの態様では、逆相クロマトグラフィーによって（ｉｉ）で形成された混合物からＡｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１分子を抽出することが有利である。一部分において、本発明は、高純度でＡｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１を単離するための逆相クロマトグラフィーの意外な適用に基づく。
いくつかの態様では、逆相クロマトグラフィーは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ブチルカラム上で行われる。ＨＩＣ樹脂は一般に、ブチルリガンド（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）に共有結合したビーズ（例えば、ヒドロキシル化メチルアクリレート化ポリマーの）を含む。いくつかの態様では、本発明は、ブチルカラム上の逆相クロマトグラフィーによって、非コンジュゲート抗体、非コンジュゲート［ＦＧＦ２１−第１リンカー］、Ａｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１、およびＡｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］２の混合物からＡｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１を抽出するためのプロセスを提供する。
カラムビーズの粒径は、約５０μｍ未満とすることができる。カラムビーズの粒径は、約４０μｍ未満とすることができる。カラムビーズの粒径は、約５０μｍ〜約２０μｍの間とすることができる。カラムビーズの粒径は、約４０μｍ〜約３０μｍの間とすることができる。カラムビーズの粒径は、約３５μｍとすることができる。いくつかの態様では、「Ｓ」グレードのブチルカラムを使用することができる。
いくつかの態様では、ビーズは、少なくとも約５００Åの孔を含み得る。いくつかの態様では、ビーズは、少なくとも約７５０Åの孔を含み得る。いくつかの態様では、ビーズは、少なくとも約１０００Åの孔を含み得る。いくつかの態様では、ビーズは、約４５０Å〜１０５０Åの間の孔を含み得る。いくつかの態様では、ビーズは、約９５０Å〜１０５０Åの間の孔を含み得る。
いくつかの態様では、ＨＩＣカラムは、約１０００Åの孔を含む約３５μｍのブチルコンジュゲート樹脂ビーズを含むことができる。いくつかの態様では、カラムは、ブチル６５０Ｓカラムとすることができる。
これは、約０℃と３７℃の間の温度でのものとすることができる。これは、ＲＴ（約１５℃〜約２５℃）でのものとすることができる。これは、約１５℃〜約２０℃の間の温度でのものとすることができる。これは、約１６℃〜約１８℃の間でのものとすることができる。本発明のいくつかの態様では、温度が高すぎると、過剰のＡｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］２種をもたらし得、一方、低すぎる温度では、カラムによって捕捉される所望のＡｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１種が十分でない。
いくつかの態様では、ブチルカラムを、約２％〜約３％、好ましくは約２．２％〜約２．６％の間、最も好ましくは約２．４％の濃度の１，６ヘキサンジオールを含むアイソクラチック洗浄ステップにかけることができる。洗浄緩衝液は、ｐＨ約６．５〜ｐＨ約７．５の間とすることができ、ｐＨ約７．０とすることができる。洗浄緩衝液は、５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含み得る。いくつかの態様では、１，６ヘキサンジオールを、代替の有機ジオール、例えば、プロピレングリコールまたはウノキソール（ｕｎｏｘｏｌ）などと置換することができる。イソプロパノールなどのアルコールは、十分な結果をもたらさなかった。
ＨＩＣカラムは一般に、一定の割合減少する塩濃度にわたって実行され、本発明は、一部分において、コンジュゲーション反応からのＡＢ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１種の単離において、漸増ジオール濃度で相対的に低い塩濃度の溶出緩衝液を流すことに関連した特定の利点という意外な発見に基づく。
いくつかの態様では、ブチルカラム上の溶出は、１，６ヘキサンジオールを含む緩衝液を用いた直線勾配を使用して行うことができる。溶出直線勾配は、約２％〜約３％の間、好ましくは、約２．２％〜約２．６％の間、最も好ましくは、約２．４％の初期濃度から進めることができる。
ジオール溶出は、大きいカラム体積（少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５カラム体積（ＣＶ））にわたって実行することができる。このような実施形態では、最初のジオール濃度は、上述した通りとすることができるが、直線勾配の最終濃度は、２０％超とすることができ、約２５％とすることができる。いくつかの実施形態では、溶出ステップは、５〜１５ＣＶの間、好ましくは、８〜１３ＣＶの間、より好ましくは、１０〜１２ＣＶの間、最も好ましくは、１１ＣＶにわたって実行される。このような実施形態では、直線勾配の最終濃度を、約６％〜約１０％の間、好ましくは、約７％〜約９％の間、より好ましくは、約７．５％〜約８．５％の間、最も好ましくは、約８％に制限することが有利となり得る。溶出緩衝液は、ｐＨ約６．５〜ｐＨ約７．５の間とすることができ、ｐＨ約７．０とすることができる。溶出緩衝液は、約１０〜約１００ｍＭの間のリン酸ナトリウムを含み得る。溶出緩衝液は、約２０ｍＭ〜約８０ｍＭの間のリン酸ナトリウムを含み得る。溶出緩衝液は、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭの間のリン酸ナトリウムを含み得る。溶出緩衝液は、５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含み得る。
次いでこの材料を、適当な緩衝液（例えば、３０ｍＭの乳酸ナトリウム、ｐＨ４．８、または２０ｍＭのグルタミン酸ナトリウム、ｐＨ４．５）中に透析濾過することができる。
［第２リンカー−Ｅｘ４］の生成
いくつかの態様では、エキセンジン４相同体および第２リンカーを、約２：１〜約１：２の間の比で一緒に混合して、複合体［第２リンカー−Ｅｘ４］を形成することができる。いくつかの態様では、複合体［第２リンカー−Ｅｘ４］を形成するために、エキセンジン４相同体および第２リンカーを一緒に混合することを、約１．５：１の比で行うことができる。いくつかの態様では、複合体［第２リンカー−Ｅｘ４］を形成するために、エキセンジン４相同体および第２リンカーを一緒に混合することを、約１：１の比で行うことができる。いくつかの態様では、複合体［第２リンカー−Ｅｘ４］を形成するために、エキセンジン４相同体および第２リンカーを一緒に混合することを、約１：１．５の比で行うことができる。いくつかの態様では、複合体［第２リンカー−Ｅｘ４］を形成するために、エキセンジン４相同体および第２リンカーを一緒に混合することを、約１：２の比で行うことができる。
本発明のいくつかの態様では、本発明のエキセンジン４相同体は、側鎖がチオール基を含むペプチド連結残基を含む。いくつかの実施形態では、次いでこのチオール基は、本明細書に開示されるある特定のリンカーのマレイミド環へのマイケル反応またはコンジュゲーション付加を起こすことができる。
適当なエキセンジン４相同体と第２リンカーとの間のコンジュゲーション付加は、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、水、エタノール、アセトニトリル、アセトン、プロピレングリコール、および上記溶媒の任意の組合せを含めた広い範囲の溶媒中で実施することができる。いくつかの態様では、エキセンジン４／第２リンカー反応のための溶媒は、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、および水からなる群から選択される。コンジュゲーション反応は、アセトニトリル−水、ジメチルスルホキシド−水、およびジメチルホルムアミド−水などの混合溶媒系中で行うこともできる。ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、水−アセトニトリル溶媒の使用は、エキセンジン４ペプチドおよび第２リンカーの溶解のしやすさ、コンジュゲーション反応の効率、および後続の生成物精製の容易さに起因して好適な選択である。重要な判定基準は、副生成物が最低であるコンジュゲーションおよびコンジュゲーションの効率に適しているはずである濃度でのエキセンジン４相同体の溶解度である。エキセンジン４ペプチドおよび第２リンカーが難溶性（例えば、約０．１Ｍ未満）である場合、コンジュゲーション効率は低減されることになる。
有機塩基または無機塩基が存在すると、エキセンジン４ペプチド中のチオレート陰イオンの形成、および後続の第２リンカーへのコンジュゲーションが大いに促進される。１級アミンおよび２級アミンは一般に、リンカーとのこれらの反応性に起因して好適でない。しかし、１級アミンまたは２級アミンは、これらがリンカーと反応しにくいという条件で、ある特定の実施形態では使用することができ、３級アミン、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルメチルアミン、ジイソプロピルメチルアミン、ジエチルイソプロピルアミン、トリイソプロピルアミン、トリブチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、およびＮ−メチルピペリジンなどを、コンジュゲーション反応で使用することができる。上記に列挙したアミン塩基のほとんどは、コンジュゲーション反応に適している。しかし、反応の効率は、異なる塩基の中で異なる。いくつかの塩基は、他の塩基よりリンカーと反応するのに耐性がある。一般に、より嵩高い塩基は、リンカーと容易に反応しないので好適である。ジイソプロピルエチルアミン、トリイソプロピルアミン、およびジエチルイソプロピルアミンなどの塩基は、リンカーとの反応性がほとんどないことと、生成物の効率的な形成との良好なバランスをもたらすので好適である。
反応は、無機塩基、例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素リチウム、炭酸リチウムなどを使用して、水溶液系中で実施することもでき、ただしこれらの塩基は、リンカーまたはペプチドと反応しない。反応は、有機共溶媒の有無にかかわらず水性緩衝液系中で実施することもできる。チオールの二重結合への付加は、ｐＨが約７以上であるとき、より容易に実現される。コンジュゲーション反応は、ｐＨ約７未満でより遅い。Ｅｘ４とリンカーとのコンジュゲーション反応は、一般に、ｐＨ約５〜約８の間で行うことができる。しかし、より塩基性の条件下で、リンカーは、より不安定である。中性レベルに近いｐＨは、効率および安定性の両方をもたらす。反応を促進するのに、広い範囲の緩衝液を使用することができる。それだけに限らないが、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、グリシン／ヒスチジン緩衝液、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール緩衝液、４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸、および３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸を含めた、多くの緩衝液がコンジュゲーション反応に適している。
［第２リンカー−Ｅｘ４］のＡｂ−［ＦＧＦ２１−リンカー］１へのコンジュゲーション
いくつかの態様では、Ａｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１および［第２リンカー−Ｅｘ４］を、約０．７：１〜約２：１の間のＡｂ−［ＦＧＦ２１−リンカー］１：［第２リンカー−Ｅｘ４］の比で組み合わせることができる。いくつかの態様では、この比は、約１．１：１〜約１．７：１である。いくつかの態様では、この比は、約１：３：１〜約１．５：１である。この比は、約１．４：１とすることができる。
いくつかの態様では、Ａｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１および［第２リンカー−Ｅｘ４］は、約５．５〜約６．５の間のｐＨで組み合わせることができる。いくつかの態様では、Ａｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１および［第２リンカー−Ｅｘ４］は、は、約６〜約６．５の間のｐＨで組み合わせることができる。いくつかの態様では、Ａｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１および［第２リンカー−Ｅｘ４］は、約６．３のｐＨで組み合わせることができる。
いくつかの態様では、Ａｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１および［第２リンカー−Ｅｘ４］は、ＲＴで組み合わせることができる。いくつかの態様では、Ａｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１および［第２リンカー−Ｅｘ４］は、約１７℃〜約２２℃の間で組み合わせることができる。いくつかの態様では、Ａｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１および［第２リンカー−Ｅｘ４］は、約１９℃で組み合わせることができる。
いくつかの態様では、Ａｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１および［第２リンカー−Ｅｘ４］は、少なくとも６時間の反応後に組み合わせることができる。いくつかの態様では、Ａｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１および［第２リンカー−Ｅｘ４］は、少なくとも８時間の反応後に組み合わせることができる。いくつかの態様では、Ａｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１および［第２リンカー−Ｅｘ４］は、少なくとも１２時間の反応後に組み合わせることができる。本発明の化合物を生成するためのプロセスの別の実施形態によれば、本プロセスは、
（ｉ）Ｅｘ４および第２リンカーを約２：１〜約１：２の間の比で一緒に混合することによって、複合体［第２リンカー−Ｅｘ４］を形成するステップと、
（ｉｉ）［Ａｂ］、［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１、および［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］２を含有する混合物を形成するように、［第２リンカー−Ｅｘ４］およびＡｂを約１：１〜約１：３の間の比で一緒に混合するステップと、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で形成された混合物から［Ａｂ］−［第２リンカー］［Ｅｘ４］１分子を抽出するステップと、
（ｉｖ）ＦＧＦ２１および第１リンカーを約１：４〜約１：１の間の比で一緒に混合することによって、複合体［ＦＧＦ２１−第１リンカー］を形成するステップと、
（ｖ）［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１−［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１を含有する混合物を形成するように、約２：１〜約１：２の間の比で［ＦＧＦ２１−第１リンカー］を［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１と混合するステップと
を含む。［ＦＧＦ２１−第１リンカー］および［Ｅｘ４−第２リンカー］は、上述したように調製することができる。
［Ｅｘ４−第２リンカー］１−Ａｂの生成
いくつかの実施形態では、［第２リンカー−Ｅｘ４］およびＡｂは、約０．５：１〜約１：３の比で一緒にコンジュゲートすることによって、［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１を形成することができる。いくつかの実施形態では、この比は、約０．６：１とすることができる。いくつかの実施形態では、この比は、約０．７：１とすることができる。いくつかの実施形態では、この比は、約０．７５：１とすることができる。いくつかの実施形態では、この比は、約０．８：１とすることができる。いくつかの実施形態では、この比は、約０．９：１とすることができる。いくつかの実施形態では、この比は、約１：１とすることができる。いくつかの実施形態では、この比は、約１．１：１とすることができる。いくつかの実施形態では、この比は、約１．２：１とすることができる。いくつかの実施形態では、この比は、約１：１〜約０．５：１の間とすることができる。いくつかの実施形態では、この比は、約０．７：１とすることができる。
いくつかの実施形態では、［第２リンカー−Ｅｘ４］とＡｂの比が約１：１である場合、これは、非コンジュゲートＡｂおよび［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］２と比べて、最大量の［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１種をもたらす。比が約１：１である場合、約４０〜５０％の［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１という好都合な分布が、約２５％の非コンジュゲートＡｂ、および約２５％のＡｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］２と一緒に観察される。
しかし、混合物から［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１を精製するために、［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］２の量を最小にするように試みることが有利であり、その理由は、この種がＡｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］１抽出を妨害し得るためである。さらに、［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］２は、再利用することができない材料を代表する。したがって、Ａｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］２の形成を最小にすることも有利である。これを行うために、［第２リンカー−Ｅｘ４］の量を、約１当量から約０．７当量まで、またはさらには０．５当量という低さまで（抗体と比較して）下げてもよい。Ａｂと比較して［第２リンカー−Ｅｘ４］の量を低減することによって、［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］２種の形成を最小にすることができる。
［第２リンカー−Ｅｘ４］とＡｂの比を低減すると、［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］２と比べてＡｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］１に有利であるように、形成される生成物のバランスを改善するのに役立ち得るが、これは、反応が、許容収率をもたらし、反応の最後でコンジュゲートしていない、したがって厳密に不要である抗体の量を最小にする必要性と相殺する必要がある。したがって、［第２リンカー−Ｅｘ４］：［Ａｂ］の比を約０．５：１未満に下げると、Ａｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の全収率が低減される場合がある。［第２リンカー−Ｅｘ４］：［Ａｂ］の最適比は、約０．５：１〜約１：１の間であることが意外にも判明した。いくつかの実施形態では、反応比は、約０．５：１、約０．６：１、約０．７：１、約０．８：１、約０．９：１からなる群から選択される下限、ならびに約０．６：１、約０．７：１、約０．８：１、約０．９：１、および約１：１からなる群から選択される上限によって定義される２つの比の範囲内とすることができる。いくつかの態様では、この比は、約０．６：１〜約０．８：１の間である。いくつかの態様では、この比は、約０．７：１である。
本発明の［第２リンカー−Ｅｘ４］：［Ａｂ］の有利な比は、［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の形成量を維持しながら、［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］２の形成を最小にするのに役立つ。［第２リンカー−Ｅｘ４］の量を下げることによって、収率を依然として維持しながらペプチドを保存することができる。［第２リンカー−Ｅｘ４］の量を１当量超（例えば、［第２リンカー−Ｅｘ４］：［Ａｂ］＝約１．２５：１〜約２：１）に増やすことによって、Ａｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］２種の形成が劇的に増大し、所望の生成物であるＡｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の量が低減する。Ａｂと比較して［第２リンカー−Ｅｘ４］の量がより多いと（当量基準で）、Ａｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の形成量が劇的に降下する。
Ｅｘ４ペプチドと抗体の間の［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の形成は、約４〜約８の間のｐＨで行うことができる。いくつかの実施形態では、特に、第２リンカーがＬ１である場合、Ｅｘ４に接続されたリンカーは、塩基性条件下より酸性条件下で相対的により安定である。しかし、酸性条件下で、コンジュゲーション反応は、より遅い。塩基性条件（ｐＨ＞約７）下で、コンジュゲーション反応は、より速いが、Ｅｘ４に結合したリンカーは、加水分解を起こし得る。したがって、妥当な安定性および効率的なコンジュゲーションを示す条件を特定することが極めて重要である。
中性ｐＨ（約６．５〜約７．５）により近い条件は、反応効率を同時に伴って、リンカーに対して最も安定性を示す。コンジュゲーションは、ｐＨ約７で機能するが、リンカーの安定性およびコンジュゲーションの効率は、ｐＨ約６．５でより良好であると思われる。
反応は、淡水中で実現可能であるが、コンジュゲーション効率を改善するためにｐＨを維持することができる緩衝系を有することがはるかにより望ましい。製剤緩衝液（グリシン、ヒスチジン、スクロースから構成された）、（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝液、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸緩衝液を含めたいくつかの緩衝系。
場合によっては、リン酸塩緩衝液を使用することができるが、抗体凝集を促進する場合がある。ｐＨを約６〜約８の間に維持するために、他の緩衝液を使用することができる。適切なｐＨは、適切な緩衝液とともに、最大量のＥｘ４と抗体の付加体の形成に極めて重要な役割を果たす。抗体融合緩衝液（ヒスチジン、スクロース、グリシン、ｐＨ６．５〜７．５、好ましくはｐＨ約７を含む）は、コンジュゲーション反応用緩衝液に期待されるすべての品質を有するように思われる。緩衝液に応じて、Ｅｘ４を抗体にコンジュゲートするための反応時間は、約２時間〜約２４時間の間のどこかで変動し得る。最も適当な緩衝液では、反応時間は、約６〜約１４時間の間である。抗体融合緩衝液では、反応は、約１２〜約１５時間で完了する。［第２リンカー−Ｅｘ４］をＡｂにコンジュゲートするための反応時間は、２つの時点の間であり得、その最低は、約１、約２、約４、約６、約８、約１２時間、または約一晩とすることができ、その上限は、約２、約４、約６、約８、約１２、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約３６、および約４８時間とすることができる。
いくつかの実施形態では、［第２リンカー−Ｅｘ４］とＡｂの間のコンジュゲーション反応は、約５℃〜約４０℃の間で行うことができる。より高い温度で、コンジュゲーション反応はより速い。しかし、ペプチドおよびリンカーの安定性は、より高い温度でより長い時間にわたってこれらを保持することによって損なわれる場合がある。温度が下がるにつれて、抗体、ペプチド、およびリンカーの安定性は改善されるが、コンジュゲーション効率は、温度変化の影響を受ける。約１５℃〜約２５℃の間の温度が最も好ましい。約２０℃〜約２５℃の間の温度は、効率的なコンジュゲーション、ならびに試薬および生成物の安定性をもたらす。［第２リンカー−Ｅｘ４］をＡｂにコンジュゲートするための温度は、下限および上限によって定義される範囲内とすることができ、その下限は、セ氏約１０、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１度とすることができ、その上限は、セ氏約１１、約１５、約１６、約１８、約２０、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、および約３４度とすることができる。
［第２リンカー−Ｅｘ４］１−Ａｂの抽出
コンジュゲーション混合物は、遊離［第２リンカー−Ｅｘ４］コンジュゲートに加えて、遊離抗体（「Ａｂ」）、１つのコンジュゲートしたＥｘ４ペプチドを有する抗体（［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１）、および２つのコンジュゲートしたＥｘ４ペプチドを有する抗体（［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］２）を含有する。次のステップでは、材料の残りから［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１を精製する。いくつかの態様では、材料は、クロマトグラフィーカラム、例えば、ブチルカラム、カルボキシメチルカラム、および強陽イオン交換カラムなどのイオン交換カラムなどを使用して精製することができる。抗体コンジュゲートを溶出するための適当な溶媒は、緩衝溶液を含む。緩衝溶液のｐＨは、約６〜約８の間とすることができる。水性緩衝液は、有機共溶媒、例えば、イソプロパノール、プロパノール、ブタノール、またはエチルアルコールなどとともに、または伴わずに、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、または２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸のうちの１種または組合せで構成することができる。
Ａｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の［ＦＧＦ２１−第１リンカー］とのコンジュゲーション
約３：１〜約１：１の間の比で［第１リンカー−ＦＧＦ２１］を［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１と混合すると、［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１−［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１分子が形成される。約１：１の比では、妥当な量の生成物がもたらされるが、［ＦＧＦ２１−第１リンカー］の量を約２倍に増やすと、［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１−［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１分子の形成が改善され、約３倍によって、［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１−［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の形成は、さらに改善された。しかし、［ＦＧＦ２１−第１リンカー］の量を約３倍超に増やしても、［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１−［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１分子の形成の効率は改善されない。
いくつかの実施形態では、記載した本発明のプロセスを使用して、０．７：１の比で［第２リンカー−Ｅｘ４］を［Ａｂ］とコンジュゲートすると、上記ステップ（ｉｉ）で、約３５％の非コンジュゲート抗体、約４８％の［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１、および約１７％の［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］２を生じる。いくつかの実施形態では、非コンジュゲート抗体、［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１、および［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］２を、装填緩衝液（０．６Ｍ〜０．９Ｍの間の硫酸アンモニウム、２５ｍＭ〜７５ｍＭの間のリン酸ナトリウム、６．５〜７．５の間のｐＨ）を使用して、ＣＭセファロースカラムを備えたＨＰＬＣを使用して分離し、溶出緩衝液（２５ｍＭ〜７５ｍＭのリン酸ナトリウム、６．５〜７．５の間のｐＨ中の１５〜２５％のイソプロピルアルコール）で溶出した。ＮａＣｌも、装填緩衝液中の成分として、硫酸アンモニウムの代わりに検討した。硫酸アンモニウムを使用する非コンジュゲート抗体、［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１、および［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］２の分離は、ＮａＣｌと同等であった。ＨＰＬＣカラムに固定相としてＣＭセファロース樹脂を充填した。カラムを上述した装填緩衝液で平衡化した。［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１を単離するのに機能するはずである緩衝液濃度およびｐＨの範囲は、上記に述べた。装填緩衝液（硫酸アンモニウム０．７５Ｍ、リン酸ナトリウム５０ｍＭ、ｐＨ＝７）を使用して分離し、溶出緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム中の２０％のイソプロピルアルコール、ｐＨ＝７）で溶出すると、一貫してより良好な収率が得られることが判明した。［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１を含有する画分を合わせ、ヒスチジン（５ｍＭ〜２５ｍＭ）、グリシン（５ｍＭ〜２５ｍＭ）、およびスクロース（０．５〜５％）を含み、６〜８の間のｐＨの抗体融合緩衝液中にＵＦ／ＤＦによって抽出した。１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのグリシン、２％のスクロース、ｐＨ＝約６．５を含有する緩衝液は、一貫してより良好な収率を与えた。上記緩衝液条件を使用して［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１から分離される非コンジュゲート抗体は、約７０％の抽出率を実現するように、３回循環させてもよい。
医薬組成物
本発明の別の態様では、本発明の組成物および／または化合物を含む医薬組成物を提供する。本発明の組成物を含む作用物質を製剤化し、全身的に投与することができる。製剤化および投与のための方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版、１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに見出すことができる。
注射用に、本発明の組成物は、液剤、乳剤、もしくは懸濁剤、もしくは非水性液剤、懸濁剤、乳剤、分散剤、または再構成して滅菌した注射用液剤もしくは分散剤にするのに適した滅菌粉末もしくは凍結乾燥物で製剤化することができる。適当な水性および非水性の希釈剤、溶媒、および担体の例として、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど）、これらの適当な混合物、および油が挙げられる。流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散剤の場合の要求される粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持または改善することができる。
本発明の組成物は、生理学的に適合性の緩衝液、例えば、クエン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、またはリン酸塩などを含有する水溶液で製剤化することができる。必要な場合、このような製剤は、様々な張性調整剤、可溶化剤および／または安定化剤（例えば、塩化ナトリウムなどの塩、スクロース、マンニトール、およびトレハロースなどの糖、アルブミンなどのタンパク質、グリシンおよびヒスチジンなどのアミノ酸、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）などの界面活性剤、またはエタノール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなどの共溶媒）も含有することができる。本発明の組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、分散剤、ならびに保存剤なども含むことができる。本発明の組成物は、懸濁化剤、例えば、寒天、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、エトキシ化イソステアリルアルコール、微結晶性セルロース、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステル、ならびにトラガカント、またはこれらの混合物なども含むことができる。
本発明の組成物は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸なども含むことができる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましい場合もある。本発明の注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させることができる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによって影響され得る。
本発明の組成物は、例えば、ｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、滅菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着、または組成物の浸透を改変、維持、または保存するための製剤材料を含有することができる。適当な製剤材料として、それだけに限らないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシン）、抗菌剤、抗酸化剤（Ｌ−メチオニン、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、もしくは亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝剤（酢酸ナトリウム、乳酸塩、ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、もしくは他の有機酸など）、増量剤（マンニトールもしくはグリシンなど）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＤＰＴＡなど）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、もしくはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）、充填剤、単糖、二糖、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど）、着色剤、香味剤、および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、もしくは過酸化水素など）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトールもしくはソルビトールなど）、懸濁化剤、界面活性剤、もしくは湿潤剤（プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０などのポリソルベート；トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）；トロメタミン；レシチン；コレステロールもしくはチロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）など）、安定性増強剤（スクロースもしくはソルビトールなど）、張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物−好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム−もしくはマンニトール、ソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤、ならびに／または医薬アジュバントが挙げられる。
製剤成分は、投与の部位に許容される濃度で存在し得る。緩衝剤を使用することによって、組成物を生理的ｐＨ、またはわずかにより低いｐＨ、一般的に、約５〜約８のｐＨ範囲内に維持することができる。
いくつかの態様では、本発明の化合物が、化合物を制御放出または徐放するために製剤化されている本発明の医薬組成物を調製することができる。例として、ヒアルロン酸など、ポリマーゲル、ビーズ、粒子、注射用ミクロスフェア、リポソーム、フィルム、マイクロカプセル、徐放マトリックス、および移植可能な薬物送達デバイスが挙げられる。
いくつかの態様では、本発明の医薬組成物は、単室または多室充填済みシリンジで提供される。
いくつかの態様では、本発明は、医薬組成物中に使用するのに適した少なくとも１つの追加の成分と一緒に、本発明の少なくとも１つの化合物または組成物を含むキットを提供する。いくつかの態様では、本発明は、患者に前記組成物を送達するための少なくとも１つの手段と一緒に、本発明の少なくとも１つの化合物または組成物を含むキットを提供する。
本発明は、本明細書に記載される１つまたは複数の療法で使用するための、［ＦＧＦ２１−第１リンカー］−［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］を含む組成物であって、ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１相同体であり、Ｅｘ４は、エキセンジン４相同体であり、Ａｂは、アルドラーゼ触媒抗体またはその抗原結合部分であり、第１リンカーは、ＦＧＦ２１中のタンパク質連結残基の側鎖および抗体の結合部位に共有結合しており、第２リンカーは、Ｅｘ４中のペプチド連結残基の側鎖および抗体の結合部位に共有結合しており、第１および第２リンカーは、同じまたは異なっている、組成物も提供する。本明細書に記載される１つまたは複数の状態の治療における本発明の組成物の使用も提供されている。本明細書に記載される１つまたは複数の疾患または障害を治療するための薬剤を製造するための本発明の組成物の使用も提供されている。
使用方法
ヒトにおける治療用途について、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはヒトキメラ抗体、またはこれらの抗原結合部が、本発明の化合物または組成物の抗体部の好適な抗体形態である。
本発明の一態様は、糖尿病または糖尿病関連状態を治療するための方法であって、糖尿病または糖尿病関連状態を罹患している対象に、治療有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象におけるインスリン分泌を増大させるための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象における血中グルコースレベルを減少させるための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象における肥満症を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象における体重レベルを管理または低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象における異脂肪血症を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象における高血圧症を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象における脂肪肝を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象における心血管疾患を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象におけるグルカゴンレベルを低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象におけるトリグリセリドレベルを低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象における非エステル化遊離脂肪酸レベルを増大させるための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象における低密度コレステロールレベルを低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象におけるＣ反応性タンパク質レベルを低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象におけるフルクトサミンレベルを低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象における血糖コントロールを管理するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象におけるアディプシンのレベルを増大させるための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、対象におけるＨＤＬレベルを増大させるための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。
いくつかの態様では、本発明は、糖尿病関連状態、肥満症、異脂肪血症、高血圧症、脂肪肝、または心血管疾患を治療し、または体重レベルを管理もしくは低減し、または血糖コントロールを管理し、またはインスリン分泌、または非エステル化遊離脂肪酸、ＨＤＬもしくはアディプシンのレベルを増大させ、または血中グルコース、グルカゴン、トリグリセリド、フルクトサミン、低密度コレステロール、またはＣ反応性タンパク質のレベルを低減する方法であって、治療有効量の本発明の化合物または医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、糖尿病関連状態、肥満症、異脂肪血症、高血圧症、脂肪肝、または心血管疾患を治療し、または体重レベルを管理もしくは低減し、または血糖コントロールを管理し、またはインスリン分泌、ＨＤＬもしくは非エステル化遊離脂肪酸レベルを増大させ、または血中グルコース、グルカゴン、トリグリセリド、フルクトサミン、低密度コレステロール、またはＣ反応性タンパク質のレベルを低減するための薬剤の調製における、本発明の組成物または医薬組成物の使用を提供する。
用語「治療有効用量」は、本明細書において、治療されている疾患または障害の症状の軽減を含む、研究者、医師、または他の臨床家によって得ようとされている、組織系、動物、またはヒトにおける生物学的応答または医薬の応答を誘発する、本発明の化合物、組成物、または医薬組成物の量を意味する。
投与の方法および投与量
本発明の組成物の投与経路として、筋肉内、ＳＣ、または髄内注射、ならびにクモ膜下、直接心室内、ＩＶ、および腹腔内の送達を含めた非経口送達を挙げることができる。いくつかの実施形態では、投与は静脈内である。本発明の組成物は、製剤の直接注射、または注入基質、例えば、生理食塩水、Ｄ５Ｗ、乳酸化リンガー液、もしくは他の一般に使用される注入媒質などとの本発明の組成物の製剤の混合物の注入による非経口経路のいずれかを通じて投与することができる。
糖尿病または糖尿病関連状態（あるいはいくつかの態様では、以下の状態の１つまたは複数：糖尿病、肥満症、異脂肪血症、高血圧症、脂肪肝、心血管疾患、高血中グルコース、低インスリンレベル、または本明細書に論じられる状態もしくは本明細書に論じられる症状と関連した状態）を有するヒトを含めた哺乳動物の治療において、治療有効量の本発明の組成物または薬学的に許容できる誘導体が投与される。例えば、本発明の組成物は、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約１５ｍｇの１日のＩＶ注入として投与することができる。したがって、いくつかの実施形態では、体重１ｋｇ当たり約０．５ｍｇの用量を提供する。他の実施形態では、体重１ｋｇ当たり約０．７５ｍｇの用量を提供する。他の実施形態では、体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇの用量を提供する。他の実施形態では、体重１ｋｇ当たり約２．５ｍｇの用量を提供する。他の実施形態では、体重１ｋｇ当たり約５ｍｇの用量を提供する。他の実施形態では、体重１ｋｇ当たり約１０．０ｍｇの用量を提供する。他の実施形態では、体重１ｋｇ当たり約１５．０ｍｇの用量を提供する。本発明の組成物または薬学的に許容できる誘導体の用量は、１日に約１回〜１週間に２回、または代わりに、１週間に約１回〜１カ月に１回の間隔で投与されるべきである。いくつかの実施形態では、用量は、約．００２ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌの、本発明による本発明の組成物またはその薬学的に許容できる誘導体のピーク血漿濃度を実現するように投与される。これは、適切な製剤中の投与される成分の溶液（化学の当業者に公知の任意の適当な製剤溶液を使用することができる）の滅菌注射によって実現することができる。望ましい血中レベルは、有効な分析的方法によって測定される血漿レベルによって確認される場合、本発明による本発明の組成物の持続注入によって維持することができる。
個体に本発明の組成物を投与するための一方法は、個体にＦＧＦ２１−リンカーコンジュゲートを投与するステップと、これにインビボで適切な抗体の結合部位との共有結合性化合物を形成させるステップとを含む。インビボで形成する本発明の組成物の抗体部は、ＦＧＦ２１−リンカーコンジュゲートの投与の前、同時、または後に個体に投与することができる。代わりに、またはさらに、抗体は、適切な免疫原で免疫した後の個体の血液循環中に存在し得る。例えば、触媒抗体は、キャリアタンパク質にコンジュゲートした基質の反応性中間体で免疫することによって生成することができる。特に、アルドラーゼ触媒抗体は、ジケトン部分に連結したキーホールリンペットヘモシニアンを投与することによって生成することができる。
したがって、組成物は、経時的に、または移植デバイスもしくはカテーテルを介した持続注入として、単回用量として、２回以上の用量として（これは、同じ量の所望の分子を含有していても、含有していなくてもよい）投与することができる。適切な投与量のさらなる微調整は、当業者によって日常的に行われ、彼らによって日常的に実施される職務の範囲内である。適切な投与量は、適切な用量−応答データを使用することによって確認することができる。
医薬組成物の投与経路は、公知方法によるもの、例えば、経口によるもの、ＳＣ、ＩＶ、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、もしくは病巣内の経路による注射を通じたもの；徐放システムによるもの；または移植デバイスによるものである。望まれる場合、組成物は、ボーラス注射によって、または注入により連続的に、または移植デバイスによって投与することができる。
代わりに、またはさらに、組成物は、所望の分子が吸収または被包された膜、スポンジ、または他の適切な材料の移植を介して局所的に投与することができる。移植デバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適当な組織または臓器中に移植することができ、所望の分子の送達は、拡散、持続放出ボーラス、または連続投与を介したものとすることができる。
併用療法
本発明の別の態様では、本発明の組成物は、糖尿病または糖尿病関連状態を治療し、またはインスリン分泌を増大させ、または血中グルコースレベルを減少させ、または本明細書に論じられる状態のいずれかを治療するために使用される他の治療剤と併用して使用することができる。一実施形態では、本発明の組成物は、インスリン、例えば、即効型、短時間作用型、中間時間作用型、または持続型のインスリンを含めた合成ヒトインスリンなどと併用して投与することができる。他の実施形態では、本発明の組成物は、α−グルコシダーゼ阻害剤、スルホニル尿素、メグリチニド、ビグアナイド、またはチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）ファミリーに属する化合物と併用して投与することができる。本発明の組成物は、グルコキナーゼ（ＧＫ）などの代謝調節タンパク質（ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）もしくはペプチド、グルコキナーゼ調節タンパク質（ＧＫＲＰ）、脱共役タンパク質２および３（ＵＣＰ２およびＵＣＰ３）、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１および２（Ｇｌｐ１およびＧｌｐ２）、エキセンジン（エキセンジン４など）、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）、Ｇｌｐ２ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（ＰＰＡＲα）、レプチン受容体（ＯＢ−Ｒｂ）、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、スルホニル尿素、または他のインクレチンペプチドと併用して投与することもできる。当業者は、糖尿病または糖尿病関連状態の治療に現在使用されている多種多様な作用物質が分かるはずである。
糖尿病または糖尿病関連状態を治療し、インスリン分泌を増大させ、または血中グルコースレベルを減少させるために使用される他の治療剤と併用した、本発明の組成物またはその薬学的に許容できる誘導体の潜在的な治療有効性を評価するために、これらの組合せを当技術分野で公知の方法を使用して試験することができる。例えば、インスリン分泌を増大させる、本発明の組成物と別の治療剤の組合せの能力は、インビトログルコース刺激性インスリン分泌アッセイを使用して測定することができる。このようなアッセイでは、膵β細胞が、一定期間、様々な濃度のグルコースで処理され、インスリンレベルが当技術分野で公知の方法、例えば、ラジオイムノアッセイなどを使用して測定される。インスリン分泌に対する本発明の組成物と他の治療剤の効果は、対象に直接作用物質を投与し、様々な時点で体液試料中のインスリンレベルを測定することによって、インビボで測定することもできる。併用療法で使用するのに、対象に公知の治療剤を投与するための方法は、臨床医療提供者に十分に分かるであろう。
投与される本発明の組成物の有効投与量は、生物学的半減期、バイオアベイラビリティー、および毒性のようなパラメータを扱う当業者に周知の手順を通じて決定することができる。本発明の組成物またはその薬学的に許容できる誘導体と併用して使用される治療剤の有効量は、これらの作用物質について当業者に公知の推奨用量に基づく。これらの推奨レベルまたは公知のレベルは、好ましくは、本発明の組成物または薬学的に許容できる誘導体と併用してこれらの投与量の有効性を試験した後、言及された投与量の１０％〜５０％下げられることになる。主治医は、毒性、骨髄、肝臓、もしくは腎臓の機能不全、または有害な薬物間相互作用のために投与量を下げるのに、どのようにかついつ療法を終わらせ、中断し、または調整するかが分かるはずであることに留意されるべきである。主治医は、臨床応答が不十分である場合、レベルを高めるために処置を調整することも知っているはずである（毒性を防いで）。
治療有効用量は、患者における症状の寛解、または生存時間の延長をもたらすのに十分な化合物の量を指す。本発明の組成物の有効なインビトロ濃度は、ＥＣ５０を測定することによって求めることができる。インビボでのこのような作用物質の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死性である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を求めるための、細胞培養液または実験動物における標準的な薬学的手順によって判定することができる。毒性作用と治療効果の用量比は、治療指数であり、これは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことできる。大きい治療指数を示す化合物が好適である。これらの細胞培養液アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトで使用するための投与量範囲を構築するのに使用することができる。このような化合物の投与量は、ほとんどまたはまったく毒性を伴わないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用される剤形、および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変更することができる。任意の化合物について、治療有効用量は、細胞培養液アッセイから最初に推定することができる。ＩＣ５０（すなわち、細胞培養液中で求めた未処置対照と比較して、感染細胞からのＲＴ産生の最大半量阻害を実現する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を実現する用量を動物モデルにおいて構築することができる。このような情報を使用することによって、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定することができる。
本発明の組成物が他の治療剤と併用して投与される実施形態では、作用物質の併用効果は、式：
Figure 0006165168
 を使用して、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの多剤分析法（Ｔ．Ｃ．ＣｈｏｕおよびＰ．Ｔａｌａｌａｙ、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．２２：２７〜５５（１９８４））によって計算することができ、式中、ＣＩは、併用指数であり、（Ｄｘ）１は、単独でｘパーセントの効果を生じさせるのに必要とされる薬物１の用量であり、Ｄ１は、Ｄ２と併用して、同じｘパーセントの効果を生じさせるのに必要とされる薬物１の用量である。（Ｄｘ）２および（Ｄ）２の値は、薬物２から同様に得られる。αの値は、半有効方程式（ｍｅｄｉａｎ ｅｆｆｅｃｔ ｅｑｕａｔｉｏｎ）：
Figure 0006165168
 を使用して用量効果曲線のプロットから求められ、式中、ｆａは、用量Ｄによって影響される部分であり、ｆｕは、影響されない部分であり、Ｄｍは、５０％の効果に必要とされる用量であり、ｍは、用量−効果曲線の傾きである。相互に排他的な薬物（すなわち、同様の作用機序）について、単独での薬物および半有効プロットにおけるこれらの平行線の両方。相互に非排他的な薬物（すなわち、独立した作用機序）は、半有効プロットにおいて平行線を与えることになるが、混合物では、上に凹の曲線を与えることになる。作用物質が相互に排他的である場合、αは０であり、これらが相互に非排他的である場合、αは１である。相互の非排他性を仮定して得られる値は、相互に排他的な薬物より常にわずかに大きい。１未満のＣＩ値は、相乗作用を示し、１超の値は、アンタゴニズムを示し、１に等しい値は、相加効果を示す。併用薬物効果も、Ｂｉｏｓｏｆｔ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）からのＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアパッケージを使用して計算することができる。
本発明による化合物は、溶媒和、特に水和することができる。水和は、化合物または化合物を含む組成物を製造する間に行うことができ、または水和は、化合物の吸湿性のために経時的に起こり得る。本発明の化合物は、凍結乾燥することができる。
本発明は、本発明の化合物の立体異性体、互変異性体、溶媒和物、プロドラッグ、および薬学的に許容できる塩も提供する。本発明は、本明細書に開示される配列のいずれかによる化合物も提供する。
定義
「約」または「およそ」は、測定可能な数値変数に関連して使用するとき、変数の示された値、および示された値の実験誤差内（例えば、平均の９５％信頼区間内）、または示された値の１０パーセント以内のいずれか大きい方である変数のすべての値を指す。
Ａｉｂは、２−アミノイソ酪酸であり、構造：
Figure 0006165168
 を有する。
「エキセンジン４相同体」は、野生型エキセンジン４（配列番号３５）と少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有し、野生型エキセンジン４の親和性に等しいか、それより大きい、または少なくとも２桁低い範囲内である親和性でグルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）に結合する分子を意味する。エキセンジン４相同体には、変異体（天然アミノ酸の欠失、付加、および置換を含む）、ならびに誘導体（非天然アミノ酸の付加および置換、ならびに／またはさらなる化学修飾を含む）が含まれる。いくつかの態様では、エキセンジン４相同体は、本明細書に提供されるＥｘ４配列の１つから選択することができる。
「ＦＧＦ２１相同体」は、野生型ヒトＦＧＦ２１（配列番号２）と少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有し、野生型ＦＧＦ２１の親和性に等しいか、それより大きい、または少なくとも２桁低い範囲内の親和性でＦＧＦＲ１ｃおよびβ−クロトーのそれぞれに結合する分子を意味する。ＦＧＦ２１相同体には、変異体（天然アミノ酸の欠失、付加、および置換を含む）、ならびに誘導体（非天然アミノ酸の付加および置換、ならびにさらなる化学修飾を含む）が含まれる。公知の多型も含まれる（Ｐ／Ｌ１４６など）。いくつかの態様では、ＦＧＦ２１相同体は、本明細書に提供されるＦＧＦ２１配列の１つから選択することができる。
Figure 0006165168
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配列番号１は、Ｈ１は任意選択であり、残基１４６は、ＬまたはＰとすることができる、１８１残基の発現タンパク質を示す。コンジュゲーションについて試験される残基位置には下線が引かれ、太字である。配列番号１の番号付けは、全体を通して使用される。
ヒト化３８ｃ２ ＩｇＧ１の一実施形態の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２５および２６）も示されている。可変領域（ＶＣおよびＶＨ）には下線が引かれており、相補性決定領域（ＣＤＲ）は太字で示されている。側鎖が、本明細書に記載されるリンカーと共有結合により結合するリシン９９は、ＨＣ ＣＤＲ３に隣接する。
ｍ３８ｃ２、ｈ３８ｃ２、およびヒト生殖系列の可変ドメインのアミノ酸配列のアライメントを示す図である。フレームワーク領域（ＦＲ）およびＣＤＲは、Ｋａｂａｔらによって定義されている。アステリスクは、ｍ３８ｃ２とｈ３８ｃ２の間またはｈ３８ｃ２とヒト生殖系列の間の差異に印をつける。 図２Ａ：Ｌ−２、Ｌ−３、またはＬ−４と比較した、リンカー−１（Ｌ−１）とコンジュゲートしたＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを用いた単回用量マウス薬物動態学的試験を示す図である。若い成体の雄のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに３ｍｇ／ｋｇのＩＶまたはＳＣで投与した。すべての場合において、Ｌ−１とのコンジュゲートは、半減期（Ｌ−１コンジュゲートについて約３３時間のＳＣおよびＩＶ、Ｌ−２、Ｌ−３、およびＬ−４コンジュゲートについて１３〜２３時間のＳＣ、および２２〜３７時間のＩＶ）、ならびに／またはＳＣバイオアベイラビリティー（Ｌ−１コンジュゲートについて約１００％、Ｌ−２、Ｌ−３、もしくはＬ−４コンジュゲートについて４８〜５３％）に関してより良好に機能した。 図２Ｂ：Ｌ−２、Ｌ−３、またはＬ−４と比較した、リンカー−１（Ｌ−１）とコンジュゲートしたＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを用いた単回用量マウス薬物動態学的試験を示す図である。若い成体の雄のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに３ｍｇ／ｋｇのＩＶまたはＳＣで投与した。すべての場合において、Ｌ−１とのコンジュゲートは、半減期（Ｌ−１コンジュゲートについて約３３時間のＳＣおよびＩＶ、Ｌ−２、Ｌ−３、およびＬ−４コンジュゲートについて１３〜２３時間のＳＣ、および２２〜３７時間のＩＶ）、ならびに／またはＳＣバイオアベイラビリティー（Ｌ−１コンジュゲートについて約１００％、Ｌ−２、Ｌ−３、もしくはＬ−４コンジュゲートについて４８〜５３％）に関してより良好に機能した。 図２Ｃ：Ｌ−２、Ｌ−３、またはＬ−４と比較した、リンカー−１（Ｌ−１）とコンジュゲートしたＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを用いた単回用量マウス薬物動態学的試験を示す図である。若い成体雄のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに３ｍｇ／ｋｇのＩＶまたはＳＣで投与した。すべての場合において、Ｌ−１とのコンジュゲートは、半減期（Ｌ−１コンジュゲートについて約３３時間のＳＣおよびＩＶ、Ｌ−２、Ｌ−３、およびＬ−４コンジュゲートについて１３〜２３時間のＳＣ、および２２〜３７時間のＩＶ）、ならびに／またはＳＣバイオアベイラビリティー（Ｌ−１コンジュゲートについて約１００％、Ｌ−２、Ｌ−３、もしくはＬ−４コンジュゲートについて４８〜５３％）に関してより良好に機能した。 図３Ａ：Ｌ−２と比較した、Ｌ−１とコンジュゲートしたＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを用いた単回用量ラット薬物動態学的試験を示す図である。成体雄のスプラーグドーリーラットに３ｍｇ／ｋｇのＩＶまたはＳＣで投与した。両投与経路について、Ｌ−１とのコンジュゲートは、半減期（Ｌ−１コンジュゲートについて約３９時間のＳＣおよび約６０時間のＩＶ、Ｌ−２コンジュゲートについて約３３時間のＳＣ、および約５２時間のＩＶ）、ならびにＳＣバイオアベイラビリティー（Ｌ−１コンジュゲートについて約５２％、Ｌ−２コンジュゲートについて３６％）に関して、Ｌ−２コンジュゲートより良好に機能した。 図３Ｂ：Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ、Ａｂ−Ｌ７−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ、およびＡｂ−Ｌ８−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９ＣのＰＫの比較を示す図である。 図４Ａ：単回ＳＣ用量（角括弧中に平均グルコースＡＵＣ（ビヒクル対照の％））：ビヒクル［１００］、ＦＧＦ２１ΔＨ（１ｍｇ／ｋｇ［７４］）、ＦＧＦ２１ΔＨ（０．６ｍｇ／ｋｇ［１０３］）（明確にするために図４Ｂに示していない）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ（３ｍｇ／ｋｇ［６６］および１ｍｇ／ｋｇ［８７］）（Ｌ１とコンジュゲートした）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５９（３ｍｇ／ｋｇ［１０５］）（Ｌ５とコンジュゲートした）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋ（３ｍｇ／ｋｇ［１００］）（Ｌ５とコンジュゲートした）、無脂肪（ｌｅａｎ）対照［５６］を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおける経口糖耐性試験（ＯＧＴＴ）の間のグルコース曲線下面積（ＡＵＣ）を示す図である。一元配置ＡＮＯＶＡによるＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図４Ｂ：単回ＳＣ用量（角括弧中に平均グルコースＡＵＣ（ビヒクル対照の％））：ビヒクル［１００］、ＦＧＦ２１ΔＨ（１ｍｇ／ｋｇ［７４］）、ＦＧＦ２１ΔＨ（０．６ｍｇ／ｋｇ［１０３］）（明確にするために図４Ｂに示していない）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ（３ｍｇ／ｋｇ［６６］および１ｍｇ／ｋｇ［８７］）（Ｌ１とコンジュゲートした）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５９（３ｍｇ／ｋｇ［１０５］）（Ｌ５とコンジュゲートした）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋ（３ｍｇ／ｋｇ［１００］）（Ｌ５とコンジュゲートした）、無脂肪対照［５６］を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおける経口糖耐性試験（ＯＧＴＴ）の間のグルコース曲線下面積（ＡＵＣ）を示す図である。一元配置ＡＮＯＶＡによるＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図５Ａ：単回ＳＣ用量（角括弧中に平均体重（ｇ）、中括弧中に平均肝重量（ｇ））：ビヒクル［２．６］｛２．４｝、ＦＧＦ２１ΔＨ（１ｍｇ／ｋｇ［２．５］｛２．２｝）、ＦＧＦ２１ΔＨ（０．６ｍｇ／ｋｇ［３．２］｛２．４｝）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（３ｍｇ／ｋｇ［１．７］｛２．０｝）（Ｌ１とコンジュゲートした）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５９（３ｍｇ／ｋｇ［２．７］｛２．４｝）（Ｌ５とコンジュゲートした）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋ（３ｍｇ／ｋｇ［２．６］｛２．４｝）（Ｌ５とコンジュゲートした）、無脂肪対照［０．６］｛１．０｝を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるＯＧＴＴの間の累積体重（Ａ）および肝重量（Ｂ）の変化を示す図である。二元配置ＡＮＯＶＡ（Ａ）および一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｂ）によるＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図５Ｂ：単回ＳＣ用量（角括弧中に平均体重（ｇ）、中括弧中に平均肝重量（ｇ））：ビヒクル［２．６］｛２．４｝、ＦＧＦ２１ΔＨ（１ｍｇ／ｋｇ［２．５］｛２．２｝）、ＦＧＦ２１ΔＨ（０．６ｍｇ／ｋｇ［３．２］｛２．４｝）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（３ｍｇ／ｋｇ［１．７］｛２．０｝）（Ｌ１とコンジュゲートした）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５９（３ｍｇ／ｋｇ［２．７］｛２．４｝）（Ｌ５とコンジュゲートした）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋ（３ｍｇ／ｋｇ［２．６］｛２．４｝）（Ｌ５とコンジュゲートした）、無脂肪対照［０．６］｛１．０｝を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるＯＧＴＴの間の累積体重（Ａ）および肝重量（Ｂ）の変化を示す図である。二元配置ＡＮＯＶＡ（Ａ）および一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｂ）によるＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図６Ａ：単回用量（角括弧中に平均体重（ｇ））：ビヒクル［１．７］、ＦＧＦ２１ΔＨ［１．９］、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ（２ｍｇ／ｋｇ［２．１］）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ［１．４］）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ［０．８］）、およびＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ［０．９］）、無脂肪ビヒクル［０．６］を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおける累積体重変化を示す図である。ｄ０：０日目。すべてのＡｂコンジュゲートはＬ１を使用した。二元配置ＡＮＯＶＡによるＰＢＳに対して＊＊Ｐ＜０．０１。 図６Ｂ：単回用量（角括弧中に平均グルコースＡＵＣ％）：ビヒクル［１００］、ＦＧＦ２１ΔＨ［６３］、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ（２ｍｇ／ｋｇ［８６］）、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ（１０ｍｇ／ｍｌ［５４］）、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ（１０ｍｇ／ｍｌ［５１］）、およびＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ［５４］）、無脂肪対照［４８］を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるＯＧＴＴの間のグルコースＡＵＣを示す図である。すべてのＡｂコンジュゲートはＬ１を使用した。一元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクルに対して＊＊Ｐ＜０．０１。 図６Ｃ：ＦＧＦ２１ΔＨおよびＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるＯＧＴＴの間のグルコースＡＵＣを示す図である。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃは、リンカー−１とコンジュゲートさせた。ビヒクルに対して＊＊Ｐ＜０．０１。 図６Ｄ：６日目にＦＧＦ２１ΔＨおよびＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるＯＧＴＴの間のグルコースＡＵＣを示す図である。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。ｏｂ／ｏｂ−ＰＢＳに対して＊＊Ｐ＜０．０１。 図６Ｅ：０日目、１日目、２日目、または３日目に単回用量のＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを投与された（３ｍｇ／ｋｇ）ｏｂ／ｏｂマウスにおける、６日目に行ったＯＧＴＴの間のグルコースＡＵＣを示す図である。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。一元配置ＡＮＯＶＡによるＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図６Ｆ：単回用量のＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて白色脂肪組織中のＵｃｐ１発現を増大させることを示す図である（１０ｍｇ／ｋｇ）。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。 図６Ｇ：単回用量のＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて肝臓トリグリセリドを減少させることを示す図である（１０ｍｇ／ｋｇ）。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。一元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクルに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図６Ｈ：０日目、１日目、２日目、または３日目に単回用量のＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与されたｏｂ／ｏｂマウスにおける累積体重変化を示す図である。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。 図７Ａ：Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの反復投与（０日目および７日目に１０ｍｇ／ｋｇ）は、ＤＩＯマウスにおける糖耐性を改善することを示す図である。ＯＧＴＴは、１０日目に行った。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。一元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクルに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図７Ｂ：０日目および７日目にＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを２回投与された（１０ｍｇ／ｋｇ）ＤＩＯマウスにおける累積体重変化を示す図である。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。二元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクルに対して＊Ｐ＜０．０５。 図７Ｃ：Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの反復投与は、ＤＩＯマウスにおいて白色脂肪組織中のＵｃｐ１発現を増大させることを示す図である（１０ｍｇ／ｋｇ）。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。一元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクルに対して＊＊Ｐ＜０．０１。 図７Ｄ：Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、ＤＩＯマウスにおいて血清トリグリセリドを下げることを示す図である（１０ｍｇ／ｋｇ）。 図７Ｅ：Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、ＤＩＯマウスにおいて血清非エステル化脂肪酸を下げることを示す図である（１０ｍｇ／ｋｇ）。 図７Ｆ：Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて肝重量を下げることを示す図である。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。一元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクル（Ａ、Ｂ）に対して、およびＰＢＣ（Ｃ）に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図７Ｇ：ｏｂ／ｏｂマウスにおける肝臓遺伝子発現に対するＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。ＳＣＤ１：ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ１。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。一元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクルに対して＊＊Ｐ＜０．０１。 図７Ｈ：ｏｂ／ｏｂマウスにおける肝臓遺伝子発現に対するＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。ＭＯＧＡＴ２：モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。一元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクルに対して＊＊Ｐ＜０．０１。 図７I：ｏｂ／ｏｂマウスにおける肝臓遺伝子発現に対するＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果を示す図である。ＦｏｘＡ２：フォークヘッド転写因子Ａ２。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣをＬ１とコンジュゲートさせた。一元配置ＡＮＯＶＡによるビヒクルに対して＊＊Ｐ＜０．０１。 ｄｂ／ｄｂマウスにおける、化合物を繰り返しＳＣ注射して３日後のＯＧＴＴの間の血中グルコースを示す図である。Ａｂ［ＦＧＦ２１］２＝ｈ３８Ｃ２（ＩｇＧ２）−［配列番号１０−Ｌ１］２。Ａｂ［Ｅｘ４］２＝ｈ３８Ｃ２（ＩｇＧ１）−［配列番号６４−Ｌ１］２。ＡＢＣ−１＝［配列番号１０−Ｌ１］１−［ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１］−［Ｌ１−配列番号６４］１。
本発明の多用性は、以下の実施例によって例示されており、これらは、本発明の一般的な実施形態を例示し、特許請求の範囲または明細書を決して限定しない。
（実施例１）
ＦＧＦ−２１の最適な係留部位の同定
ＦＧＦ２１を、リンカーを介して触媒抗体結合部位にコンジュゲートするための最適部位を同定するための試験を行った。２つのコンジュゲーションストラテジー、すなわち、表面リシン側鎖を通じたコンジュゲーション、および表面システイン側鎖を通じたコンジュゲーションを考察した。一般に、球状タンパク質は、その表面上に対になっていないシステイン残基を有さず、したがって、特定のコンジュゲーションのために単一部位において操作するために、タンパク質表面内の１つのシステインの組込みを使用することができる。しかし、システインを用いた表面残基の突然変異は、多くの場合、分子間二量体化、天然のジスルフィド結合の誤対合、および受容体結合に対する障害などの問題を引き起こし得る。これらの理由のために、タンパク質コンジュゲーションは、リシン残基を通じて最も一般に影響される。
ＦＧＦ２１受容体の相同性モデリングおよびその活性化機構
ＦＧＦ２１は、ＦＧＦＲ１ｃおよびＦＧＦＲ４の両方に結合するが、受容体複合体は、ＦＧＦＲ１ｃを通じてのみ活性化され得る。ＦＧＦＲ１ｂとＦＧＦＲ１ｃは、８７％の同一性を共有するが（ＦＧＦＲ１ｂは、ＩＩＩｂ／ｃ代替スプライシング領域を除いてＦＧＦＲ１ｃと同一である）、ＦＧＦ２１は、ＦＧＦＲ１ｃのみを特異的に認識する。ここでは、ＦＧＦ２１−ＦＧＦＲ１ｃの複合体構造の相同性モデリングを、鋳型としてＦＧＦＲ２−ＦＧＦＲ１ｃ結晶構造を使用することによって実施した。相同性モデリングおよび構造分析のためにＭＯＥソフトウェアを使用した。受容体の活性化は、別の細胞−表面受容体、βＫｌｏｔｈｏを必要とする。βＫｌｏｔｈｏは、ヒト細胞質ゾルβ−グルコシダーゼに非常に類似した（約３５％同一）２つのドメインを有する。ヒトβＫｌｏｔｈｏ構造を、ヒト細胞質ゾルβ−グルコシダーゼを使用することによってモデル化し、ＦＧＦ２１−ＦＧＦＲ１ｃのモデル化された構造における構造を位置合わせした。このモデル化された複合体構造は、最適なリシンコンジュゲーション部位およびＦＧＦ２１中の最適なシステイン残基組込みについての合理的な指針をもたらし、これらは、ＦＧＦ２１とＦＧＦＲ１ｃの間、およびＦＧＦ２１とβＫｌｏｔｈｏの間の結合界面を遮るべきでない。
コンジュゲーション部位選択のために、以下の基準を使用した。（１）残基は、可能な限り多く構造中で溶媒に曝露されるべきであり、（２）残基は、ジスルフィド結合から離れているべきであり、（３）残基は、受容体結合表面およびβ−Ｋｌｏｔｈｏ結合表面から離れているべきである。
溶媒への曝露は、アクセス可能な表面積（ＡＳＡ）に基づいて評価することができる。ＦＧＦ２１のモデル化された構造からのＡＳＡの計算は、ＣＣＰ４ソフトウェア（Ｔｈｅ ＣＣＰ４ Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」、（１９９４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０、７６０〜７６３）および社内プログラムを用いて行った。簡単に言えば、ＣＣＰ４中のプログラムは、そのログファイルにおいて１残基当たりの平方オングストロームでの値を計算する。ＡＳＡの割合（ｆＡＳＡ）を計算するために、社内プログラムを使用することによって、１残基当たりのＡＳＡを正規化した。表１は、ＡＳＡの残基およびｆＡＳＡを示す。側鎖が表面によって覆い隠されると予測される残基は含まれない。列１は、アミノ酸名称であり、列２は、残基数であり、列３は、ＡＳＡ（平方オングストロームとして）であり、列４は、曝露される割合である。ｆＡＳＡ値は、所与のポリペプチド中のアミノ酸残基への溶媒のアクセスのしやすさを定義する。０に近いｆＡＳＡ値は、残基が溶媒にアクセス不能であることが予測されることを示し、これが、コンジュゲーションのためにリンカーにアクセス可能である可能性がより低いことを示唆する。特に可能性のある候補コンジュゲーション部位を示唆する１．００超の表面積値とともに、０．３の絶対最小ｆＡＳＡ値を使用した。
ＡＳＡ分析に基づいて、Ｋ１２２（１６４．４の表面積）およびＫ５９（１１７．２の表面積）を、コンジュゲーションにとって最も有望な候補部位とみなした。Ｋ６９（表面積９１）およびＫ５６（表面積７３）も、比較による目的のためにコンジュゲートした。
Figure 0006165168
（実施例２）
ＦＧＦ２１タンパク質および突然変異体の生成
ＦＧＦ２１ ｃＤＮＡは、ＡＴＣＣから購入した。哺乳動物発現ベクターおよび細菌発現ベクターを、それぞれ、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）およびｐＥＴ２１ｂ（ＥＭＤ）を使用することによって構築した。ＦＧＦ２１の突然変異体のために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））を使用して、発現ベクター中に突然変異を導入した。所望の突然変異の存在は、ＤＮＡ配列決定によって検証した。
哺乳動物の発現のために、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））に、２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）））を使用してＦＧＦ２１の哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトし、無血清培地で増殖させた。滅菌濾過した馴化培地を、緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス−ＨＣ１、ｐＨ７．５）に対して透析し、緩衝液Ａでプレ平衡化されたＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標））に装填した。ＦＧＦ２１タンパク質を、緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（２０ｍＭのトリス−ＨＣ１、ｐＨ７．５、および１００ｍＭのＮａＣｌ）への線形勾配を用いて溶出した。プールした画分を濃縮し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を含むセファデックス３００に装填した。得られたタンパク質溶液を濃縮し、−８０℃未満で貯蔵した。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣによって確認した。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＦＧＦ２１ΔＨを生成するために、細菌発現ベクターを、宿主系統ＢＬ２１−（ＤＥ３）−ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））中にトランスフォームした。トランスフォーム細胞を、ＬＢ培地１リットル中で、３７℃で増殖させ、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加することによって、発現を開始した。４時間後に細胞を回収し、−２０℃で凍結させた。凍結細胞ペーストを、溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に懸濁させ、微小流動化装置（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）に４回通過させた。１７，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した後、封入体（ＩＢ）含有ペレットを、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５中に再懸濁させた。洗浄したＩＢスラリーを遠心分離した（３０分、１７，０００×ｇ、４℃）。このＩＢペレットを−８０℃で貯蔵した。１〜１０ｍｇ／ｍｌのＦＧＦ２１で、７Ｍの尿素、５ｍＭのＤＴＴ、および５０ｍＭのビス−トリスプロパン、ｐＨ１０．５を用いて凍結ＩＢペレットを可溶化し、１時間撹拌することによって、タンパク質を溶解および還元した。次いで、可溶化したＩＢを、５０ｍＭのビス−トリスプロパン、ｐＨ８．０中に１０倍希釈した。最終的なタンパク質濃度は、０．１〜１ｍｇ／ｍＬであった。溶液を約２日間撹拌し、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５ ４リットルに対して透析した。タンパク質溶液を、１４，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清をＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標））に装填し、緩衝液Ａで平衡化した（上記を参照）。非結合の細菌タンパク質を、緩衝液Ａで洗浄し、ＦＧＦ２１タンパク質を、緩衝液Ｂの線形勾配を用いて溶出した。次いで、ＦＧＦ２１画分を、ＰＢＳ緩衝液でプレ平衡化されたＨｉＴｒａｐキレート化ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標））に装填した。ＦＧＦ２１タンパク質を、ＰＢＳからＰＢＳ緩衝液と１００ｍＭのイミダゾール（ｐＨを７．４に調整した）への線形勾配を用いて溶出した。画分を収集および濃縮し（最大５０ｍｇ／ｍＬまで）、タンパク質溶液を、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ｐＨ７．４）で平衡化されたサイズ排除カラム（Ｈｉｌｏａｄ２６／６０、スーパーデックス３００）に施した。精製タンパク質を０．２２μｍフィルターによって滅菌し、−８０℃で貯蔵した。培地８ＬからのＦＧＦ２１ΔＨの一般的な収量は、６００〜７００ｍｇであった。一般的な純度は、９５％超であった。一般的なエンドトキシンレベルは、約１ＥＵ／ｍｇであった。ＦＧＦ２１のシステインおよびリシンからアルギニンへの突然変異体を生成し、ＦＧＦ２１ΔＨと類似の様式で精製した。精製タンパク質の一般的な収量は、３５０〜４００ｍｇであった。遊離システインは、エルマン試薬を使用して確認した。
（実施例３）
リンカー１の合成
Figure 0006165168
 リンカー１の合成：約３５℃で、窒素雰囲気下で、１３Ａ（例えば、約５ｇ、約２０．１ｍｍｏｌ）のメタノール（例えば、約２００ｍＬ）懸濁液に、炭素上のパラジウム（例えば、約１．０ｇ、約０．４７ｍｍｏｌ）を１回で、その後塩酸（例えば、約２．５ｍＬ、約３０．２ｍｍｏｌ）を滴下添加した。約３５℃で、溶液に水素をゆっくりとバブリングして入れ、この溶液を、その温度で約２時間撹拌した。固体をセライトのベッドに通して濾過し、収集した。濾液を減圧下で濃縮し、固体を真空下で乾燥させることによって、塩酸塩として１３Ｂを得た。化合物１３Ｂをジクロロメタン（例えば、約２００ｍＬ）および炭酸水素ナトリウムの飽和溶液（例えば、約２５０ｍＬ）と混合し、ジクロロメタン層を分離した。ジクロロメタン層を飽和した塩化ナトリウム（例えば、約２５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。有機層を濾過し、減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン中約６０％の酢酸エチル）を使用して精製することによって、約６８％の収率（例えば、約２．９４ｇ）の１３Ｃを得た。１３Ｃ（例えば、約４．６５ｇ、約２１．３ｍｍｏｌ）、１３Ｄ（例えば、約７．００ｇ、約２１．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（例えば、約３．３ｇ、約２１．３ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（例えば、約２．７５ｇ、約２１．３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（例えば、約２００ｍＬ）溶液を、約０℃で、窒素下で５分間撹拌し、室温で約４時間撹拌した。有機層を希炭酸水素ナトリウム溶液、および飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、真空下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、アセトニトリル）を使用して精製することによって、リンカー１を得た（例えば、約８．２５ｇ、約７３％の収率）。
（実施例４）
リンカー２の合成
Figure 0006165168
 シトラコン酸無水物、１４（例えば、約２．０ｍｇ、約１６．７ｍｍｏｌ）、β−アラニン、１７（例えば、約１．５ｇ、約１６．７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（例えば、約１０ｍＬ）溶液を、室温で約５時間撹拌した。次いで、反応溶液を約０℃に冷却し、ジイソプロピルカルボジイミド（例えば、約２．６ｍＬ、約１６．７ｍｍｏｌ）およびＨＯＢＴ（例えば、約１．９ｇ、約１６．７ｍｍｏｌ）を含有するＤＭＦ（例えば、約１０ｍＬ）溶液を添加した。ジイソプロピルエチルアミン（例えば、約５当量、約８３．５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温に加温し、さらに約１６時間撹拌した。反応物を水中に注ぎ、１ＮのＨＣｌで酸性化し、酢酸エチル（例えば、約３×約３０ｍＬ）で抽出した。有機層を水（例えば、約２×約３０ｍＬ）およびブライン（例えば、約３０ｍＬ）で洗浄し、次いで硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、粗混合物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。所望の画分をプールし、減圧下で濃縮することによって、１７Ａを得た。
化合物１７Ａ（例えば、約０．５ｇ、約２．０９ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン中約１５％のトリフルオロ酢酸中で、室温で約２時間撹拌し、減圧下で濃縮して乾燥させた。遊離酸１８を、テトラヒドロフラン（例えば、約２０ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（例えば、約０．２５ｇ、約２．０９ｍｍｏｌ）に添加し、その後、ジイソプロピルカルボジイミド（例えば、約０．３３ｍｌ、約２．０９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で約４時間撹拌した。ジイソプロピル尿素を濾別した（ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｏｆｆ）。濾液を蒸発させて乾燥させた。石油エーテル（例えば、約３０ｍＬ）を残渣に添加し、粉砕し、振盪し、石油エーテル層をデカンテーションした。この手順を、石油エーテルを用いてさらに１回繰り返し、生成物１８を真空下で乾燥させた。
アミン−ｐｅｇ２−ｔブチルエステル、１９（例えば、約０．５ｇ、２．０９ｍｍｏｌ）を、活性化された１８のＴＨＦ溶液に添加し、その後、過剰のＤＩＰＥＡ（例えば、約３当量）を添加した。この溶液を室温で最低１時間撹拌し、３４３および３９９の質量を収集してＨＰＬＣ−ＭＳによって精製した。所望の生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥することによって２０を収集した。残渣を、ジクロロメタン中の約１５％のトリフルオロ酢酸および数滴の水中に溶解させ、室温で約２時間撹拌した。反応物を濃縮して約１ｍｌにし、水で処理することによって生成物を沈殿させた。粗物質をＨＰＬＣ−ＭＳを使用して精製することによって２１を得た（Ｍ＋３４３）。
酸２１（例えば、約６０ｍｇ、約０．１８ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（例えば、約１３７ｍｇ、約０．３６ｍｍｏｌ）、およびアニリン塩酸塩１３Ｂ（例えば、約４５ｍｇ、約０．１８ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（例えば、約０．１４ｍｌ、約０．９０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（例えば、約２ｍＬ）溶液を、室温で約３０分間撹拌し、ＨＰＬＣ−ＭＳで精製した。所望の画分をプールし、濃縮することによってＬ２（例えば、約１６ｍｇ、約０．０３ｍｍｏｌ）を収集した。
（実施例５）
リンカー３の合成
Figure 0006165168
 シトラコン酸無水物、１４（例えば、約０．５ｇ、約１６．４ｍｍｏｌ）、アミン−ｐｅｇ２−ｔブチルエステル２３（例えば、約１．０ｇ、約４．２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（例えば、約１０ｍＬ）溶液を室温で約２時間撹拌した。ジイソプロピルカルボジイミド（例えば、約０．８ｍＬ、約５．２ｍｍｏｌ）およびＨＯＢＴ（例えば、約０．７ｇ、約６．１ｍｍｏｌ）を添加し、この反応物を約８０℃で約２時間加熱した。この反応物を室温まで一晩冷却させ、尿素を濾過した。濾液を水中に注ぎ、ＤＣＭで抽出した。有機層をブラインで洗浄し濃縮して油状物にした。粗生成物をアセトニトリル中約５０％の６ＮのＨＣｌ中に溶解させることによって、酸を脱保護した。生成物をＤＭＦ中に溶解させ、濾過し、ＨＰＬＣ−ＭＳを使用して精製することによって、２４（例えば、約２０８ｍｇ、約０．７ｍｍｏｌ）を収集した。
マレイミド、２４（例えば、約０．１６ｇ、約０．６ｍｍｏｌ）、およびアニリン塩酸塩１３Ｂ（例えば、約１５０ｍｇ、約０．６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液に、過剰のＨＢＴＵおよびＤＩＥＡ（例えば、それぞれ約３当量超）を添加した。粗物質を、ＨＰＬＣ−ＭＳ上で約２回の注入を介して精製した。最も純粋な物質を含有する所望の画分をプールし、凍結乾燥することによって、Ｌ３（例えば、約１７．３ｍｇ、約３６．７ｍｍｏｌ）を収集した。
（実施例６）
リンカー４の合成
Figure 0006165168
 窒素（Ｎ２）下の、シトラコン酸無水物（１４、例えば、約５１０ｍｇ、約４．５５ｍｍｏｌ）、およびｔｒａｎｓ−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸（１３、例えば、約７１６ｍｇ、約４．５５ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（例えば、ＤＭＦ、約５ｍＬ）溶液を、室温で約６時間撹拌した。反応溶液を約０℃に冷却し、ＤＩＰＥＡ（例えば、約１．９８ｍＬ、約１１．４ｍｍｏｌ）を添加し、その後ＤＭＦ（例えば、約３ｍＬ）中のペンタフルオロフェニルトリフルオロ酢酸塩（例えば、約１．９６ｍＬ、約１１．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温に加温し、Ｎ２下でさらに約１６時間撹拌した。固体を濾過し、濾液を水約３０ｍＬ中に注ぎ、ジクロロメタン（例えば、約２×約３０ｍＬ）で抽出し、ジクロロメタン層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、粗混合物をカラムクロマトグラフィーにより精製することによって、ペンタフルオロフェニルエステル中間体約５５０ｍｇを得た（１５、例えば、約２９％の収率）。
Ｎ−メチルモルホリン（例えば、約２９０μＬ、約２．６４ｍｍｏｌ）を、ペンタフルオロフェニルエステル中間体（１５、例えば、約５５０ｍｇ、約１．３２ｍｍｏｌ）、および３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（例えば、約２９５ｍｇ、約１．３２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、例えば、約５ｍＬ）溶液に添加し、室温で約２時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をＤＭＦ中に溶解させ、分取ＨＰＬＣによって精製した。得られたｔｅｒｔ−ブチルエステル中間体を、ジクロロメタン（例えば、約４ｍＬ）中の約５０％のトリフルオロ酢酸で約３０分間処理した。溶媒を真空下で除去し、残渣を分取ＨＰＬＣにより精製することによって、白色固体として酸中間体１６約３００ｍｇを得た（例えば、約５５％の収率；ＭＳ：４１１．２（Ｍ＋Ｈ＋））。
上記酸中間体（１６、例えば、約３３ｍｇ、約０．０８ｍｍｏｌ）、１−［３−（４−アミノ−フェニル）−プロピオニル］−アゼチジン−２−オン（１３Ｂ、例えば、約１８ｍｇ、約０．０８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（例えば、約２５ｍｇ、約０．１６ｍｍｏｌ）、およびＨＢＴＵ（例えば、約６１ｍｇ、約０．１６ｍｍｏｌ）、およびＮ−メチルモルホリン（例えば、約４４μＬ、約０．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（例えば、約１ｍＬ）溶液を、室温で約２時間撹拌した。粗混合物を分取ＨＰＬＣにより精製することによって、無色油状物としてＬ４を得た（例えば、約２２ｍｇ、４５％の収率；ＭＳ：６１１．４（ＭＨ＋））。
（実施例７）
リンカー５の合成
Figure 0006165168
 ジイソプロピルカルボジイミド（例えば、約３．１１ｍＬ、約１９．８６ｍｍｏｌ、約２．９５当量）を、リンカー６（例えば、約６．６３ｇ、約２０．６９ｍｍｏｌ、約３．０７当量）、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（例えば、約２．２９ｇ、約１９．８６ｍｍｏｌ、約２．９５当量）の乾燥テトラヒドロフラン（例えば、約５００ｍＬ）溶液に約０℃で添加した。混合物を約０℃で約１時間撹拌し、次いで室温で一晩撹拌した。溶媒を真空で除去し、残渣を石油エーテル（例えば、約２×約２００ｍＬ）で洗浄し、粉末を真空下で約２時間乾燥させ、後続のステップで使用した。
（実施例８）
リンカー６の合成
Figure 0006165168
（実施例９）
リンカー７の合成
Figure 0006165168
 Ｉ（例えば、約４３８ｍｇ、約４．４７ｍｍｏｌ）およびＩＩ（例えば、約１．０４ｇ、約４．４７ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（例えば、約２５ｍＬ）溶液を、窒素雰囲気下で約２．５時間撹拌した。反応物を、氷浴を使用して約０℃に冷却した。１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（例えば、約６４７ｍｇ、約５．６２ｍｍｏｌ）、およびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（例えば、約１．７１ｇ、約８．９２ｍｍｏｌ）を添加し、およそ室温で一晩撹拌した。有機層をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄し、減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン中約７５％の酢酸エチル〜ジクロロメタン中約５％のメタノールを使用して精製することによってＩＩＩ（例えば、約７６７ｍｇ）を得た。ＩＩＩ（例えば、約５７３ｍｇ、約１．８３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（例えば、約１５ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（例えば、約１．１６ｍＬ）中の溶液を、およそ室温で約９．５時間撹拌した。この物質を減圧下で濃縮し、真空ポンプで一晩乾燥させることによってＩＶを得た。粗製のＩＶをジクロロメタン（例えば、約１５ｍＬ）、およびジメチルホルムアミド（約２滴）中に溶解させ、塩化オキサリル（例えば、約４６５ｍｇ、約３．６６ｍｍｏｌ）とともに約２時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、油状物を真空下で１時間乾燥させた。この油状物をジクロロメタン（例えば、約１５ｍＬ）中に溶解させ、１３Ｂ（例えば、約４６４ｍｇ、約１．８３ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（例えば、約２．９ｍＬ、約１６．５ｍｍｏｌ）とともに、窒素下で約３０分間撹拌した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサン中約８５％の酢酸エチル〜約１００％の酢酸エチル）を使用して精製することによって、リンカー７を得た（例えば、約３２３ｍｇ、約３９％）。
（実施例１０）
リンカー８の合成
Figure 0006165168
 Ｖ（例えば、約９８０ｍｇ、約１．９１ｍｍｏｌ）、１３Ｃ（例えば、約４８４ｍｇ、約１．９１ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（例えば、約２ｍＬ、約１１．５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液を、およそ室温で約６時間撹拌した。別の約１当量の１３Ｃ（例えば、約４８４ｍｇ、約１．９１ｍｍｏｌ）および約３当量のジイソプロピルエチルアミン（例えば、約１ｍＬ、約５．７３ｍｍｏｌ）を添加し、およそ室温で一晩撹拌した。この反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し、減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（約１００％酢酸エチル〜酢酸エチル中約５％のメタノール〜酢酸エチル中約１０％のメタノール）を使用して精製することによって、リンカー８を得た（例えば、約２８５ｍｇ、約２４％）。
（実施例１１）
タンパク質およびリンカーのコンジュゲーション
ＦＧＦ２１変異タンパク質を、関連したリンカーと１：１０のモル比で、室温で２時間反応させた。次いで、すべてのリンカー結合ＦＧＦ２１タンパク質を、ＰＤ−１０カラムを使用して精製し、緩衝液を２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０中に交換した。
（実施例１２）
タンパク質−リンカー複合体の抗体とのコンジュゲーション
すべてのリンカー結合ＦＧＦ２１タンパク質を、ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１（配列番号２５および２６）（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）と６：１のモル比で、室温で一晩融合させた。タンパク質−リンカー−抗体複合体をＳＥＣによって精製した。コンジュゲーション効率は、ＬＣＭＳ分析によって確認した。
（実施例１３）
タンパク質産生アッセイ
すべてのＦＧＦ２１タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させた。細菌によって発現されたＦＧＦ２１タンパク質は、封入体中に見出された。細胞を溶解させ、上清を除去した後、ペレットを、４℃で７Ｍの尿素、５０ｍＭのビス−トリスプロパン、ｐＨ１０．５中に溶解させた。可溶化した封入体を５０ｍＭのビス−トリスプロパン、１０ｍＭの酸化型グルタチオン、ｐｈ９．０中に希釈し、２時間撹拌し、その後、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐｈ７．５に対して４℃で一晩透析した。可溶性画分をＨｉＴｒａｐ Ｑカラムによって精製した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって特徴づけた。リシン突然変異体の発現レベルは、１０〜５０ｍｇ／Ｌであった。
（実施例１４）
Ｇｌｕｔ１ Ｔａｑｍａｎアッセイ
ｑＰＣＲ法によってＧｌｕｔ１ ｍＲＮＡ発現を測定するために、分化３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を使用した。一晩血清飢餓した１０〜１４日目の分化３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、化合物で６時間処理した。トータルＲＮＡをこれらの細胞から抽出し、Ｇｌｕｔ１およびＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現を、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＲＴ−ＰＣＲキットを使用し、Ｔａｑｍａｎ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））で定量的リアルタイムＰＣＲ反応を実行して測定した。化合物の生物活性は、各試料からのＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルによって正規化されたＧｌｕｔ１ ｍＲＮＡレベルの倍率変化によって判定した。化合物の効力の測定としてのＥＣ５０値を、アッセイにおける用量応答曲線から得た。
（実施例１５）
グルコース取込みアッセイ
分化３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、血清の非存在下で、化合物で２４時間処理した。次いで細胞を１４Ｃ−２−デオキシグルコースとともに１時間インキュベートし、細胞内へのグルコース取込みを、Ｗａｌｌａｃ １４５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（Ｔｒｉｌｕｘ）機器で定量化した。グルコース取込みは、１分当たりのカウント（ＣＰＭ）で表した。化合物の効力の測定としてのＥＣ５０値を、アッセイにおける用量応答曲線から得た。
（実施例１６）
マウスの薬物動態
ＦＧＦ２１抗体コンジュゲートのＰＫを、ＩＶまたはＳＣ投与後のマウスにおいて検査した。抗体コンジュゲートを若い成体雄のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（２０〜２５ｇ）に注射し、血液試料を、投薬後５分〜１２０時間の時点で得た。血清中の抗体コンジュゲート濃度は、ＥＬＩＳＡを使用して求め、ＥＬＩＳＡは、９６ウェルプレートに結合したモノクローナル抗−ｈＦＧＦ２１抗体を通じて、抗体コンジュゲートのＦＧＦ２１部を捕捉した。プレートに結合したＦＧＦ２１抗体コンジュゲートは、抗ｈＦｃモノクローナル抗体を通じて検出し、濃度は、血清含有アッセイ緩衝液中に希釈されたＰＫ投薬溶液（ＰＫ ｄｏｓｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）の検量線を使用して求めた。ＳＣバイオアベイラビリティーは、ＳＣ血清濃度プロファイルの曲線下面積（ＡＵＣ）をＩＶ血清濃度プロファイルのＡＵＣで除した比として計算した。
（実施例１７）
マウスでの効力
ＦＧＦ２１抗体コンジュゲートの効力を、２つのマウス肥満インスリン耐性モデル、すなわち、ｏｂ／ｏｂマウスおよび高脂肪食誘発肥満マウスにおいて評価した。両モデルについて、雄マウス（ｏｂ／ｏｂについて生後６〜８週間、年齢生後６週間で高脂肪食を開始したＤＩＯについて生後１２〜１４週間）を、２〜４／ケージで収容し、ＦＧＦ２１抗体コンジュゲートをＳＣ注射によって投与した。毎日午前中に体重を測定した。糖耐性を、経口ブドウ糖負荷試験によって評価した。簡単に言えば、マウスに、試験日の午前中４〜５時間絶食させた。基礎血液試料を得、血中グルコースレベルを、携帯型グルコメーターを使用して求めた。基礎試料の後、グルコースを経口強制飼養によって投与し、血液試料を、その１５〜１２０分後に抜き取った。糖耐性を、基礎時点から１２０分の時点までのＡＵＣとして計算した。
（実施例１８）
Ｋ５６ Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６の活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２Ｒ（配列番号１８）を上述したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２Ｒは、Ｇｌｕｔ１ Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力があることが判明した（ＥＣ５０＝０．９ｎＭ；ｎ＝２）。グルコース取込みは、５．５ｎＭであることが示された。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２Ｒを、記載したようにＫ５６においてＬ５と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６を形成した。Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６は、Ｇｌｕｔ１ Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力を保持し（ＥＣ５０＝１．９ｎＭ；ｎ＝１）、１７時間のＩＶ半減期および１３時間のＳＣ半減期を示した。バイオアベイラビリティーは６６％であった。
（実施例１９）
Ｋ５９ Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５９の活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６Ｒ−Ｋ５９−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２Ｒ（配列番号１９）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６Ｒ−Ｋ５９−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２Ｒは、Ｇｌｕｔ１ Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力があった（ＥＣ５０＝０．６ ｎＭ；ｎ＝１）。グルコース取込みは、０．９ｎＭであった。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６Ｒ−Ｋ５９−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２Ｒを、Ｋ５９においてＬ５と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５９を形成した。Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５９は、Ｇｌｕｔ１ Ｔａｑｍａｎアッセイにおいてインビトロでの効力を保持し（ＥＣ５０＝６．５ｎＭ；ｎ＝２）、１３時間のＩＶ半減期を示した。
（実施例２０）
Ｋ６９ Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ６９の活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６Ｒ−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９−Ｋ１２２Ｒ（配列番号２０）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６Ｒ−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９−Ｋ１２２Ｒは、Ｇｌｕｔ１ Ｔａｑｍａｎアッセイ（ＥＣ５０＝１．３ｎＭ；ｎ＝１）およびグルコース取込みアッセイ（ＥＣ５０＝５．２ｎＭ）の両方において効力があることが判明した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６Ｒ−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９−Ｋ１２２Ｒを、Ｋ６９においてＬ５と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ６９を形成した。
（実施例２１）
Ｋ１２２ Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ１２２の活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２（配列番号２１）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２は、Ｇｌｕｔ１ Ｔａｑｍａｎアッセイ（ＥＣ５０＝２．６ｎＭ；ｎ＝２）およびグルコース取込みアッセイ（ＥＣ５０＝１．７ｎＭ）の両方において効力があった。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６−Ｋ５９Ｒ−Ｋ６９Ｒ−Ｋ１２２を、Ｋ１２２においてＬ５と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ１２２を形成した。Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ１２２は、インビトロでの効力を保持し（Ｇｌｕｔ１ ＴａｑｍａｎアッセイにおいてＥＣ５０＝１．６ｎＭ；ｎ＝２）、１６時間のＩＶ半減期および１４時間のＳＣ半減期を示した。バイオアベイラビリティーは、４０％であった。
（実施例２２）
Ｋ−ヌル−Ｐ２ Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｐ２の活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｐ２（配列番号２２）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｐ２は、Ｇｌｕｔ１ Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力があった（ＥＣ５０＝１．２ｎＭ；ｎ＝２）。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｐ２を、Ｐ２のＮ’末端においてＬ５と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｐ２を形成した。Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｐ２は、インビトロでの効力の低減（Ｇｌｕｔ１ ＴａｑｍａｎアッセイにおいてＥＣ５０＝１６．６ｎＭ；ｎ＝１）、および１７時間のＩＶ半減期を示した。
（実施例２３）
Ｋヌル−Ｈ１Ｋ Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋの活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋ（配列番号２３）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋは、Ｇｌｕｔ１ Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力があった（ＥＣ５０＝６．４ｎＭ；ｎ＝２）。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋを、Ｈ１ＫにおいてＬ５と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＫ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋを形成した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋは、インビトロでの効力を保持し（Ｇｌｕｔ１ ＴａｑｍａｎアッセイにおいてＥＣ５０＝４．３ｎＭ；ｎ＝２）、１６時間のＩＶ半減期、１１時間のＳＣ半減期、および５１％のＳＣバイオアベイラビリティーを示した。
（実施例２４）
Ｋ−ヌル−Ｓ１８１Ｋ Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｓ１８１Ｋの活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｓ１８１Ｋ（配列番号２４）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｓ１８１Ｋは、Ｇｌｕｔ１ Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力があった（ＥＣ５０＝７．５ｎＭ；ｎ＝２）。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｓ１８１Ｋを、Ｓ１８１ＫにおいてＬ５と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｓ１８１Ｋを形成した。Ａｂ−Ｌ５−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｓ１８１Ｋは、インビトロでの効力の喪失を示した（Ｇｌｕｔ１ ＴａｑｍａｎアッセイにおいてＥＣ５０≧５００ｎＭ；ｎ＝２）。
（実施例２５）
リシン突然変異体の活性の結果の要約
すべてのリシン突然変異タンパク質は、Ｇｌｕｔ１ Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて活性であった。コンジュゲートさせたとき、コンジュゲートの大部分（Ｋ５６、Ｋ５９、Ｋ１２２、Ｋヌル−Ｈ１Ｋ）は、Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて活性を保持し、ＥＣ５０値は、天然ＦＧＦ２１タンパク質のＥＣ５０値と同様であった。Ｋヌル−Ｐ２コンジュゲートは、初期効力のいくらかの低減を示し、Ｋヌル−Ｓ１８１Ｋコンジュゲートは、Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて活性の喪失を示した。
（実施例２６）
システイン−マレイミドコンジュゲーションを使用する、ＦＧＦ２１上の最適な係留部位の同定
連結残基としてシステイン置換突然変異を導入する際の課題の１つは、システイン残基は、それ自体他の残基と接触し、かつ／または塩橋もしくは水素結合を形成する場合があることである。モデル化された構造を使用して原子レベルの距離を予測することは困難であり得るが、いくつかの残基を、ＦＧＦＲ１ｃ結合部位およびβＫｌｏｔｈｏ結合部位から遠位に位置される潜在性に基づいて選択した：Ｈｉｓ１、Ｔｈｒ４０、Ａｓｐ７９、Ｌｅｕ８６、Ｈｉｓ１２５、およびＡｌａ１２９。
６つすべての残基は、構造要素（ターンおよびループ）、アクセス可能な表面積（ＡＳＡ）、ならびに環境の形状（凸面および凹面）に関して互いに異なっており、すべてをＦＧＦＲ１ｃ相互作用に対してタンパク質の反対側でモデル化した（表２）。特に、Ｈｉｓ１、Ａｓｐ７９、Ｌｅｕ８６、およびＨｉｓ１２５は、これらの部位に伴った高ＡＳＡ値のために、潜在的に魅力的なコンジュゲーション部位であると同定された。
Figure 0006165168
（実施例２７）
Ｈ１Ｃ ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１Ｃ
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１Ｃ（配列番号１６）を生成し、発現させた。しかし、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１Ｃ突然変異体は、Ｎ’システイン基を欠いており、したがって、この突然変異体の調査を中止した。
（実施例２８）
Ｔ４０Ｃ ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｔ４０Ｃ
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｔ４０Ｃ（配列番号１５）の生成により、重要な課題が示された。４０位におけるトレオニンのシステイン突然変異は、再折りたたみ後に、ＲＰ−ＨＰＬＣにおいてＦＧＦ２１ΔＨ−Ｔ４０Ｃの複数の化学種を生じさせた。グルタチオンを付加して、および付加しないで、タンパク質の濃度およびｐＨを変更することによって、再折りたたみプロセスを改善するためのさらなる試みを行った。再折りたたみプロセスは、ＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターした。グルタチオンを付加すると、Ｔ４０Ｃの再折りたたみが効率的になるが、グルタチオンは、最も確実には、４０位における導入されたシステインを通じて、ＦＧＦ２１上で結合されることが判明した。グルタチオン付加体は、野生型ＦＧＦ２１ΔＨと同じ生物活性を示し、４０位は、ＦＧＦ２１による受容体活性化に関与していないことを示した。
（実施例２９）
Ｄ７９Ｃ Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃの活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ（配列番号１２）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃは、Ｇｌｕｔ１ Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力があった（ＥＣ５０＝２．１ｎＭ；ｎ＝４）。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃを、Ｄ７９ＣにおいてＬ１と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃを形成した。Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃは、インビトロでの効力を保持し（Ｇｌｕｔ１ ＴａｑｍａｎアッセイにおいてＥＣ５０＝３．７ｎＭ；ｎ＝３）、１７時間および１９時間のＩＶ半減期（ｎ＝２）、２０時間および２０時間のＳＣ半減期（ｎ＝２）、および５５％および７０％のＳＣバイオアベイラビリティーを示した（ｎ＝２）。
（実施例３０）
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃの安定性アッセイ
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ突然変異タンパク質を、上述したように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で生成し、精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃを培養液１Ｌから発現させた。１５０ｍｇの封入体を得、８５ｍｇの精製タンパク質を得、６０％の収率に相当した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９ＣおよびＦＧＦ２１ΔＨ（配列番号２）の安定性を試験するために、新たに解凍した試料を７日にわたって４℃に保持し、０日目、３日目、および７日目に、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ＿ＨＰＬＣ、Ｅｌｌｍａｎアッセイ、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによってこれらの完全性について検査した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃは、中性のｐＨ７．４で安定であることが判明し、４℃で７日間インキュベートした後でさえ、わずかな量のＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃしか酸化および二量体化されないと考えられ、一方、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃの半分超が、４℃で３日間インキュベートした後、ｐＨ６．０で酸化された。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、および２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）は、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃの安定性の有意な差を生じなかった。
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃの遊離システインがｐＨ６．０よりｐＨ７．４においてより安定であった理由は明らかでない。ＷＴ ＦＧＦ２１の計算された等電点（ｐＩ）は、５．４３であり（ｅ．ｅ．、ＦＧＦ２１−Ｈ１−Ｐ１４６）、ＦＧＦ２１ΔＨのｐＩは５．２７であり、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９ＣのｐＩは５．４７であった。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃの溶解度がｐＨ６．０で低減され得る可能性がある。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃの安定性を、複数の凍結／解凍サイクルで検査した。タンパク質を９回繰り返して凍結（−８０℃）および解凍（４℃）させた。いずれの試料も、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびＥｌｌｍａｎアッセイにおいてサイクル１とサイクル９の間でまったく差を示さなかった。結論として、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃは、−８０℃より４℃において著しく不安定であると考えられた。
（実施例３１）
Ｌ８６Ｃ ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｌ８６Ｃ
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｌ８６Ｃ（配列番号１４）を記載したように生成および精製した。ほとんどの疎水性残基は、タンパク質コア内に埋もれているが、一部の残基は、溶媒に曝露され、これがタンパク質の不溶性の原因となり得る。Ｌｅｕ８６は疎水性残基であり、ＦＧＦ２１のモデル化された構造において、溶媒に曝露されているようである。突然変異Ｌ８６Ｃは、溶解度の利点をもたらし得るとみなした。
Ｌ８６Ｃ突然変異は、非効率な再折りたたみ、および低いタンパク質収率をもたらした。グルタチオンを付加すると、Ｌ８６Ｃの再折りたたみが効率的になったが、１つを超えるグルタチオンが、最も確実には、導入されたＣ８６および天然システイン残基を通じて１つのＦＧＦ２１分子上に結合されていることが判明した。グルタチオン付加体は、生物活性の約１０分の１の低減を示し、したがって、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｌ８６Ｃの調査を中止した。
（実施例３２）
Ｈ１２５Ｃ Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃの活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ（配列番号７）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃは、Ｇｌｕｔ１ Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力があった（ＥＣ５０＝１．２ｎＭ；ｎ＝３）。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃを、Ｈ１２５ＣにおいてＬ１と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃを形成した。コンジュゲートされたとき、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃは、インビトロでの効力を保持し（Ｇｌｕｔ１ ＴａｑｍａｎアッセイにおいてＥＣ５０＝３．２ｎＭ；ｎ＝４）、３７時間のＩＶ半減期、３２時間のＳＣ半減期、および６７％のＳＣバイオアベイラビリティーを示した。
（実施例３３）
Ａ１２９Ｃ Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの活性
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（配列番号１０）を記載したように生成および精製した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、Ｇｌｕｔ１ Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて効力があった（ＥＣ５０＝１．４ｎＭ；ｎ＝６）。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを、Ａ１２９ＣにおいてＬ１と結合させ、ｈ３８Ｃ２とコンジュゲートさせることによって、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを形成した。Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、インビトロでの効力を保持し（Ｇｌｕｔ１ ＴａｑｍａｎアッセイにおいてＥＣ５０＝２．７ｎＭ；ｎ＝７）、３３時間のＩＶ半減期、３７時間のＳＣ半減期、および６９％のＳＣバイオアベイラビリティーを示した（マウスにおいて）。Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、６０時間のラットにおけるＩＶ半減期、３９時間のラットにおけるＳＣ半減期、および５２％のラットにおけるＳＣバイオアベイラビリティーを示した。サルにおいて、ＩＶ半減期は６５時間であり、ＳＣ半減期は４８時間であり、ＳＣバイオアベイラビリティーは６８％であった。
（実施例３４）
エンドトキシン純度の改善
ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５ＣおよびＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃタンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵培養よって生成した。エンドトキシンレベルを低減するために、エンドトキシンレベルを１０ＥＵ／ｍｌから０．１ＥＵ／ｍＬに低減した最初のＱの後に、追加のＱステップを利用した。精製プロトコールを以下のように改変した。ＩＢ約１０ｇを培地１Ｌから得、７Ｍの尿素、５ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＢＴＰ（ビス−トリスプロパン）ｐＨ１０．５ ４０ｍＬで可溶化した（１〜２時間）。ＦＧＦ２１タンパク質の還元をＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターした。可溶化タンパク質を、５０ｍＭのＢＴＰ、ｐＨ８．０ ４００ｍＬ中に希釈することによって再折りたたみさせた（２４〜３６時間）。ＦＧＦ２１の天然ジスルフィド結合の酸化をＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターした。再折りたたみがほとんど完了した後、溶液を、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５ ４Ｌに対して２回透析した。未可溶化タンパク質を、２０，０００×ｇで６０分間、４℃で遠心分離することによって沈殿させた。上清をＨｉｔｒａｐ Ｑ ＦＦ上に装填し、０〜２００ｍＭのＮａＣｌの勾配（２０ＣＶ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．０１ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．５）を用いてＦＧＦ２１タンパク質を溶出した。収集画分を、０〜１００ｍＭのイミダゾールの勾配（１０ＣＶ、０．０１ｍＭのＴＣＥＰ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を伴ったＨｉｔｒａｐ Ｎｉ−ＮＴＡ ＦＦ上に装填することによって、残留ＤＮＡを効率的に除去した。所望の画分を、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．０１ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．５ ４Ｌに対して２回透析し、０〜１００ｍＭのＮａＣｌの勾配（２０ＣＶ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を伴ったＨｉｔｒａｐ Ｑ ＨＰ カラム上に装填して溶出した。精製タンパク質画分を収集し、０．２２μｍフィルターを用いて滅菌し、−８０℃で貯蔵した。
培地１Ｌからの一般的な収量は、約３５０〜約４００ｍｇであった。精製タンパク質の一般的な収量は、約２２０〜約２８０ｍｇであった。この精製技法により、９５％超の純度、および約１ＥＵ／ｍｇの一般的なエンドトキシンレベルを有するタンパク質を得た。振盪フラスコの代わりに発酵槽を使用すると、収量が約４〜約５倍改善した。
（実施例３５）
リンカーの選択
以下のＬ１のマレイミド環は、経時的に開環およびその後の生成物分解に感受性である場合があることが公知である（Ｗｏｏｄｎｕｔｔ，Ｇ；ＩＢＣ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、「Ｂｅｙｏｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、２００９年９月２１〜２３日）。
Ｌ１などのマレイミドリンカーは、スキーム１に示したように、チオールと反応してマレイミド部分とのチオール付加体を形成し得る。チオールのマレイミドへのこの付加反応は、マイケル反応と呼ばれる。その後、アミンを含有する基（抗体ｈ３８Ｃ２など）が、スキーム１に示したようにＡＺＤ（β−ラクタム）と反応することによって６を生じ得る。得られるチオール−スクシンイミド付加体は安定である。しかし、スクシンイミド環は、ゆっくりとした加水分解性開裂を経時的に起こし、７および／または８をもたらす場合がある。したがって、マイケル反応を起こすその能力を保存しつつ、加水分解性開裂に対する安定性が改善したマレイミド環を有することが望ましい。
Figure 0006165168
（実施例３６）
マレイミドの修飾
したがって、より安定なリンカーを、マレイミド環を修飾することによって生成することができるという予想とともに、Ｌ１中のマレイミド環の安定性を検査した。水によるマレイミド環の潜在的な加水分解性開裂を遅延させるために、３つの異なる手法（Ｌ２〜Ｌ４）を採用することによって環を修飾し、安定性を改善した。
Figure 0006165168
最初に、環に結合した小さいアルキル基は、スクシンイミド環の加水分解性開裂を遅延させ得ると想定した。スクシンイミド環上にメチル基を有するリンカー２を調製した。環が加水分解性開裂を起こすために、水分子がカルボニル基に付加し、遷移状態として四面体中間体を形成する。メチル基が存在すると、四面体中間体の形成が立体的かつ電子的に制限され、加水分解速度が相当に遅延するはずである。
第２の修飾は、マレイミド環のカルボニル基のすぐ近くにおけるプロピオンアミドカルボニル基に目を向けた。カルボニル基は一般に、水を引きつける。マレイミド環にごく接近してカルボニル基があると、水を引きつけることが助長され、マレイミド環のカルボニル基上の攻撃が促進される。プロピオンアミドカルボニル基を除去することによって、加水分解性開環反応が遅延される。この修飾は、Ｌ３において見られる。
第３の修飾は、Ｌ４において見られるように、プロピオンアミド基の代わりにシクロヘキシルメチレン基を導入することであった。シクロヘキシル環のかさ高い疎水性は、環が開いた加水分解性開裂に必要とされる、環のカルボニル基への水の付加による四面体中間体の形成に対して、電子的および立体的の両方で妨害する。これにより、加水分解性開裂が遅延されることが予想された。
安定性試験
安定性試験のために、リンカーＬ１〜Ｌ４から１−（３−（４−アミノフェニル）プロパノイル）アゼチジン−２−オン部を除去した。マレイミドが３アミノ酸ペプチドのグルタチオンとコンジュゲートした４つの試験化合物（３０〜３３）を作製した。
（実施例３７）
化合物３０の合成
３−（２−（２−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド）−エトキシ）エトキシ）プロパン酸（１６４ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）および還元グルタチオン（１５４ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（５ｍＬ）溶液を、室温で１７時間撹拌した。酢酸エチル（２５ｍＬ）をこの反応混合物に添加し、固体を濾過した。この固体を追加の酢酸エチル２５ｍＬで洗浄し、乾燥させることによって化合物３０ ２５２ｍｇを得た。
Figure 0006165168
（実施例３８）
化合物３１の合成
３−（２−（２−（３−（３−メチル−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド）エトキシ）エトキシ）プロパン酸（４２ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）および還元グルタチオン（３７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（１．２ｍＬ）溶液を、室温で２２時間撹拌した。エーテル（１０ｍＬ）中５０％の酢酸エチルをこの反応混合物に添加し、固体を濾過した。この固体を追加の酢酸エチル２５ｍＬで洗浄し、乾燥させることによって化合物３１ ６７ｍｇを得た。
Figure 0006165168
（実施例３９）
化合物３２の合成
３−（２−（２−（３−メチル−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エトキシ）プロパン酸（５０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）および還元グルタチオン（６１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（２ｍＬ）溶液を、室温で２５時間撹拌した。エーテル（３０ｍＬ）中６５％の酢酸エチルをこの反応混合物に添加し、固体を濾過した。この固体を追加の酢酸エチル２５ｍＬで洗浄し、乾燥させることによって化合物３２ ９２ｍｇを得た。
Figure 0006165168
（実施例４０）
化合物３３の合成
３−（２−（２−（４−（（３−メチル−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）メチル）シクロヘキサンカルボキサミド）エトキシ）エトキシ）プロパン酸（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）および還元グルタチオン（３７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（１．２ｍＬ）溶液を、室温で２２時間撹拌した。エーテル（１０ｍＬ）中５０％の酢酸エチルをこの反応混合物に添加し、固体を濾過した。この固体を追加の酢酸エチル２５ｍＬで洗浄し、乾燥させることによって化合物３３ ７５ｍｇを得た。
Figure 0006165168
（実施例４１）
化合物３０〜３３の安定性試験
Figure 0006165168
化合物３０、３１、３２、および３３を、開環生成物の形成およびグルタチオン開裂についてＬＣ−ＭＳでモニターした。これらの新規相同体を、４０℃でｐＨ＝６．５の緩衝液、４０℃でｐＨ＝７．５の緩衝液、および４℃でｐＨ＝７．５の緩衝液で、すべて２週間の期間にわたって、これらの安定性について検査した（表３Ａ〜Ｃ）。
化合物３０、３１、３２、および３３を室温で緩衝液中に溶解させた。試料を４０℃でインキュベートし、緩衝液を設定間隔で分析した。規定間隔で、緩衝液１０μＬをＡｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析計に注入して分析した。カラムからの溶離液を、２１０ｎｍおよび２５４ｎｍでＵＶ分光計を使用し、質量分析計も使用してモニターした。加水分解副生成物を、質量分析計を使用してモニターし、加水分解率を特定の質量の全イオン電流に基づいて計算した。
表３Ａ〜３Ｃ中の％加水分解を示すＬＣ−ＭＳデータから、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４（３１〜３３）の修飾されたマレイミド環は、Ｌ１（３０）中のマレイミド環と比較して、４０℃でｐＨ＝６．５において５〜１０倍より安定であり、４０℃でｐＨ＝７．５の緩衝液で４〜１５倍より安定であり、４℃でｐＨ＝７．５の緩衝液で最大２０倍より安定であることが明白であった。グルタチオンコンジュゲーションの結果（表３Ａ、３Ｂ、および３Ｃ中のデータを含む）は、ＩＢＣ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、「Ｂｅｙｏｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、２００９年９月２１〜２３日において論じられた。
Figure 0006165168
（実施例４２）
ＦＧＦ２１にコンジュゲートされたリンカーＬ１〜Ｌ４の安定性
ＦＧＦ２１にコンジュゲートした後の４つのリンカーの２週間にわたる化学的安定性を調査するために、以下の実験を実施した。各リンカーをＦＧＦ２１にコンジュゲートさせ、＋４℃の貯蔵条件に置き、特定の時点でアリコートを取り出し、凍結させることによって急冷し、リンカーの安定性をＬＣＭＳ分析によってモニターした。
４つのリンカーを、凍結乾燥ストック材料からＤＭＳＯ中に溶解させた。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃタンパク質を０．１ｍＭのＴＣＥＰを用いて部分的に３０分間還元した後、１：１のリンカー：タンパク質比でリンカーストックを付加した。コンジュゲーション反応におけるＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃタンパク質濃度は、５ｍｇ／ｍｌであった。Ｌ１は、３０分間タンパク質と反応させ、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、２時間反応させた。コンジュゲーション反応は、サイズ排除樹脂を通じて過剰のリンカーを除去することによって停止させた。コンジュゲートされたＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃタンパク質を、安定性試験のために＋４℃に置いた。ｔ＝０（安定性試験の前）、ならびにｔ＝１日、３日、８日、および１４日にアリコートを取り出した。リンカー安定性の分析を、ＬＣ−ＭＳ分析によって実施することによって、未コンジュゲートタンパク質、タンパク質＋リンカーコンジュゲーション、ならびにコンジュゲートされたタンパク質＋リンカーの１回および２回の加水分解事象の相対量を判定した。
リンカーの加水分解は、本実験において極めて重要な分析的変量である。加水分解は、ＦＧＦ２１−リンカー複合体へのＨ２Ｏの後続の付加を観察することによってモニターした。Ｈ２Ｏの１つの付加、＋（１）Ｈ２Ｏは、４つすべてのリンカー上に存在する活性なＡＺＤ基の加水分解を示す可能性が高い。第２のＨ２Ｏ分子の付加、＋（２）Ｈ２Ｏは、リンカー中の加水分解（例えば、化学的不安定性）の強い指標である。Ｌ１は、マレイミド官能基が存在するので特に感受性である。
以下の表４中の実験結果は、Ｌ１が＋（２）Ｈ２Ｏの最大の増加を起こすことを実証する。ｔ＝０において、Ｌ１〜Ｌ４のそれぞれは、測定される全タンパク質の６〜８％の間の＋（２）Ｈ２Ｏの測定値を有していた。２週間の間、これらの試料をモニターし、Ｌ１において観察された＋（２）Ｈ２Ｏは、１８％まで増加した一方で、残りのリンカーＬ２〜Ｌ４のそれぞれの値は、６〜８％で一定であった。このデータは、Ｌ１がＬ２〜Ｌ４と比較して相対的に不安定であることを示唆する。
Figure 0006165168
（実施例４３）
Ｌ１〜Ｌ４とコンジュゲートされたＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ
Ｌ２〜Ｌ４は、様々な条件（表３Ａ〜Ｃを参照）下でのグルタチオンコンジュゲーション、およびＦＧＦ２１（表４）を用いて、Ｌ１より安定であることが先に示された。修飾されたマレイミドリンカーＬ２〜Ｌ４は、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃと融合させ（表５に示したコンジュゲーション効率）、Ｇｌｕｔ１ Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて活性を示した（表５）：ＥＣ５０値は、ＦＧＦ２１ΔＨについての相対値に対して正規化されている）。
Figure 0006165168
しかし、前述の意に反して、Ａｂ−Ｌ２−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ、Ａｂ−Ｌ３−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ、Ａｂ−Ｌ４−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、それぞれ、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃよりインビボで不安定であった。これは、ＩＶ投薬後の血液循環中のより低い維持レベル、ならびにＳＣ投薬後の血液循環中のより低いピークおよび維持レベルとして明白であった（図２Ａ〜Ｃ、表６）。意外にも、これらの結果は、緩衝系において小ペプチドに融合されたリンカーを用いて行った安定性試験の結果と逆になった。
Figure 0006165168
これらの結果は、マウス血清中での追加の試験において裏付けられた。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４のそれぞれを使用してｈ３８Ｃ２にコンジュゲートさせた。各試料をマウス血清中で希釈して０．３ｍｇ／ｍｌにし、３７℃でインキュベートした後凍結させ、その後２ＤＬＣ／ＭＳによって分析した。参照標準と比較して、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、５分後に１４９％、３４時間後に６６％、７２時間後に８１％で検出され、１２０時間までに検出不可能であった。対照的に、Ａｂ−Ｌ２−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ、Ａｂ−Ｌ３−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ、Ａｂ−Ｌ４−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、すべての試料中で検出不可能であった。
（実施例４４）
Ｌ１＆Ｌ２とコンジュゲートされたＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃのラット試験
ＦＧＦ２１タンパク質を抗体骨格にコンジュゲートさせるのに使用したリンカーが異なる２つのバージョンのＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの単回用量薬物動態（ＰＫ）を、雄のスプラーグドーリーラットにおいて求めた。ラットにＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（マレイミドリンカー）またはＡｂ−Ｌ２−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（メチルマレイミドリンカー）をＩＶまたはＳＣ投与し（３ｍｇ／ｋｇ）、投与して５分後〜１４日後の期間で血液試料を抜き取った。血清Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣレベルをＥＬＩＳＡによって判定し、ＥＬＩＳＡにおいて、ＦＧＦ２１コンジュゲートは、ＦＧＦ２１に特異的なモノクローナル抗体を介して捕捉し、抗ヒトＦｃによって検出した。得られたＰＫデータは、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃコンジュゲートは、Ａｂ−Ｌ２−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃコンジュゲート（Ｔ１／２：ＩＶ＝５２時間、ＳＣ＝３３時間；ＳＣバイオアベイラビリティー＝３６％）と比較すると、優れたＰＫ特性（Ｔ１／２：ＩＶ＝６０時間、ＳＣ＝３８時間；ＳＣバイオアベイラビリティー＝５２％）を有することを実証した（図３Ａおよび表７）。これらの結果は、小ペプチドに融合されたこれらのリンカーを用いて緩衝系において行った安定性試験の結果を考慮すると予想されなかった。
Figure 0006165168
（実施例４５）
Ｇｌｕｔ１ ＲＮＡに対するＬ１およびＬ２を用いたＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの効果
８日目に、２４ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）、カタログ番号３５３０４７）中に３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を播種し、ＤＭＥＭ完全培地（１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％のＰ／Ｓ）中で、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。０．２％のＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地で一晩細胞を飢餓にし（１２日目）、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣおよびＡｂ−Ｌ２−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを用いて、０．２％のＢＳＡを含有する無血清ＤＭＥＭ中で、３７℃で６時間処理した。培地を吸引し、次いで、製造者の指示書に従ってＲＮｅａｓｙミニキットを使用して、ＲＮＡを細胞から抽出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ分光光度計を使用してＡ２６０ｎｍでＲＮＡを測定した。
Figure 0006165168
ＦＧＦ２１ΔＨ、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ、およびＡｂ−Ｌ２−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃによって３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を刺激すると、用量依存的にＧｌｕｔ１が誘導された。Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、Ａｂ−Ｌ２−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃより効力があると考えられた（表８）。
（実施例４６）
リンカー長試験
リンカー長のトレランスを評価するために、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ、Ａｂ−Ｌ７−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ、およびＡｂ−Ｌ８−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃを互いに試験した。すべてが、細胞ベースアッセイにおいて同様のＰＫ（図３Ｂおよび表９）ならびに同等の効力（データを示さず）を示した。
Figure 0006165168
（実施例４７）
残基位置およびリンカー選択の要約
Ｈ１Ｃ、Ｔ４０Ｃ、Ｄ７９Ｃ、Ｌ８６Ｃ、Ｈ１２５Ｃ、およびＡ１２９Ｃを、チオール−マレイミドコンジュゲーションストラテジーを使用して、潜在的なコンジュゲーション部位として試験した。これらのうちで、Ｈ１Ｃ、Ｔ４０Ｃ、およびＬ８６Ｃは、発現および再折りたたみに問題を示した。Ｄ７９Ｃ、Ｈ１２５Ｃ、およびＡ１２９Ｃは、すべてが許容できるレベルのタンパク質生成を示し、未コンジュゲート突然変異タンパク質は、効力があるままであることを実証したので、さらに探求した。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９Ｃ、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ、およびＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、ＦＧＦ２１ΔＨと同様の生物活性を示し、これらの位置での抗体のコンジュゲーションは、受容体結合を妨害しないことを示唆した。Ｄ７９Ｃ、Ｈ１２５Ｃ、およびＡ１２９Ｃは、ＦＧＦ２１ΔＨと同様の安定性および生物活性を有する。
試験したすべてのリシン突然変異体抗体コンジュゲートは、Ｈ１２５ＣおよびＡ１２９Ｃ抗体コンジュゲートより劣ったマウスのＰＫを示し、ＩＶ半減期は１３〜１７時間であった（表１０）。
Figure 0006165168
Ａｌａ１２９は、溶媒にそれほど曝露されておらず、Ｄ７９またはＨ１２５より溶媒に曝露されていないが、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、意外にも、最も安定な突然変異体および抗体コンジュゲーションついて試験した最良の位置の１つであった。これは、突然変異が非保存的であるので予期されなかった。理論によって束縛されることを望まないが、Ａ１２９Ｃにおいてコンジュゲートすることの独特の適性についていくつかの可能な理由が存在する。第１に、Ａｌａ１２９およびＨｉｓ１２５はともに、ＦＧＦ２１のモデル化された構造において柔軟であるループ領域内に位置する。これらの領域は通常、他のヘパリン結合ＦＧＦメンバーのためのヘパリン結合部位である。ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ２３は、ヘパリンと相互作用しないので、この領域の配列忠実度を維持することは、これらの生物学的機能にとって極めて重要ではない場合がある。この位置の柔軟性は、受容体結合の妨害を回避するための抗体−コンジュゲーションにとって有利となり得る。第２に、Ａｌａ１２９は、正に帯電した残基、すなわち、Ｈｉｓ１２５、Ａｒｇ１２６、Ａｒｇ１３１、およびＡｒｇ１３５によって囲繞されている。この正に帯電したパッチは、強い帯電反発のためにＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣのＳＳ−二量体化を回避することができる。第３に、これらの帯電残基は、マレイミドリンカーＬ１の安定化を促進することができ、これは、これらが存在しない場合、マレイミドを開環した後にカルボキシレートを生成し得る。したがって、マレイミド連結ストラテジーを使用してＦＧＦ２１をコンジュゲートする場合、Ａ１２９の特定の残基位置で連結することは、特に有利であると考えられる。
Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣならびにＡｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃはともに、マウスモデルにおいて少なくとも３０時間の高いＩＶ半減期およびＳＣ半減期、ならびに良好なバイオアベイラビリティーを示す。両コンジュゲートは、Ｇｌｕｔ１ Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて４ｎＭ未満の効力を実証する。一般に、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃと比較してわずかに改善された半減期および効力を示す。Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９ＣにおいてＬ１を使用することはまた、インビトロ試験が示唆したものに対して意外なインビボでの利点を示し、試験したリンカーと比較して、全体的に最も有利なリンカーであると考えられた。
Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃの構成要素（抗体、リンカー、連結残基位置、連結残基、タンパク質）の特定の組合せは、半減期、バイオアベイラビリティー、効力、活性、生成の容易さ、および複数の選択肢と比較した加水分解に対する耐性において最適条件をもたらすと考えられる。
（実施例４８）
化合物の効力
化合物Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋ５６およびＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｋヌル−Ｈ１Ｋで処置したｏｂ／ｏｂマウスにおいて糖耐性について試験した。両化合物は、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ（図４Ａおよび４Ｂ）およびＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（図５Ａおよび５Ｂ）より劣っていた。対照的に、Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｄ７９ＣおよびＡｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃは、糖耐性を改善し、体重増加を低減することが示された（図４Ａ、４Ｂ、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、および表１１）。
Figure 0006165168
Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、糖耐性を改善することが判明し、白色脂肪組織（ＷＡＴ）内でのＵｃｐ１発現の増大によって証明されるエネルギー消費量の増大により体重増加を低減し、肝脂肪変性を逆行させる（図６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、および表１２）。Ｕｃｐ１発現について、インビボでの効力試験から収集した凍結内臓ＷＡＴ試料をホモジナイズした。トータルＲＮＡを組織ホモジネートから抽出し、Ｇｌｕｔ１およびＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現を、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＲＴ−ＰＣＲキットを使用し、Ｔａｑｍａｎ ｍａｃｈｉｎｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で定量的リアルタイムＰＣＲ反応を実行して測定した。各試料からのＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルによって正規化されたＧｌｕｔ１ ｍＲＮＡレベルの倍率変化によって、処置の効果を判定した。Ａｂ−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、ＷＡＴ内でのＵｃｐ１発現の増大、ＤＩＯマウスにおける血清トリグリセリドレベルおよび脂肪酸レベルの低減、ならびに肝重量の減少によって示唆されるエネルギー消費量の増大により、体重減少を引き起こした（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅ、および表１３）。肝重量の低減も、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて観察された（図７Ｆおよび表１４）。ｏｂ／ｏｂマウスにおいてさらに試験すると、ステアロイル−補酵素Ａデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）、モノアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＭＯＧＡＴ２）、およびフォークヘッドボックスＡ２（ＦｏｘＡ２）のＲＮＡレベルの低減が実証された（図７Ｇ、７Ｈおよび７ｉ、ならびに表１５）。
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（実施例４９）
エキセンジン４化合物に対するＧＳＩＳアッセイ
ある特定のエキセンジン４相同体の、インビトロで膵β細胞からのインスリン分泌を刺激する能力を、グルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイを使用して試験した。簡単に言えば、関連したエキセンジン４相同体を、ｈ３８Ｃ２の両結合部位にコンジュゲートさせ、このコンジュゲート分子を、グルコースと一緒に、膵β細胞培養液に様々な濃度で加えた。インスリン分泌を、経時的にインスリンレベルを測定することによって検出した。ＥＣ５０を各化合物について計算した。このアッセイの結果を以下の表１６に示す。
（実施例５０）
エキセンジン４化合物に対する糖耐性試験（ＧＴＴ）、体重変化、および食物摂取量
例示的なエキセンジン４相同体のインビボ効力を、単回投与または反復投与糖耐性試験パラダイムを使用して評価した。若い成体雄のｏｂ／ｏｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に、０．２〜０．３ｍｌの注射体積で、短時間マニュアル拘束を使用して、肩甲骨中央部の皮下に（ＳＣ）、本発明の試験化合物０．３ｍｇ／ｋｇを投与した。無脂肪同腹子対照マウス（ｎ＝８／群、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に、ビヒクルを同様に投与した。食物摂取量および累積体重変化を、午前中に毎日モニターした（０８：００−０９：００Ｈ；０６：００Ｈに点灯および１８：００Ｈに消灯）。結果を０〜９日目の平均値として、および９日目の値として示す。各化合物を８〜１０匹の動物で試験した。
マウスを、標準プロトコールに従って経口糖耐性試験（ＯＧＴＴ）にかけた。簡単に言えば、コロニー内の点灯期の開始時に４〜５時間、マウスを絶食させた。この期間の最後（昼過ぎ）に、経口グルコースチャレンジ（１．５ｇ／ｋｇ）の直前、およびその後の１５〜１２０分の一定間隔でマウスを尾採血した。１２０分の時点の収集後に、食物をケージに戻した。グルコースレベルを、自己テスト血中グルコースメーターを使用して求め、経口グルコースチャレンジ後の時間の関数としてのグルコースの曲線下面積（ＡＵＣ）を、線形台形方程式（ｌｉｎｅａｒ ｔｒａｐｅｚｏｉｄａｌ ｅｑｕａｔｉｏｎ）を使用して計算した。結果をビヒクル対照の％として計算した。これらを、４８時間および７２時間の試験について示す（表１６）。
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２３位で連結しても（配列番号４７）、４８時間において体重または摂食は減少せず、糖耐性は改善されなかった。１７位、２４位、３８位、およびＣ末端で連結すると（配列番号５１、４６、３９、および３８）、７２時間において体重および摂食が減少したが、糖耐性は改善しなかった。２６位で連結すると（配列番号４５）、４８時間において、体重または摂食は減少しなかったが、糖耐性が改善された。１２位、１４位、１９位、２０位、および２１位での連結について、明らかな利点が見られた。１４位での連結は、最大の全体的な利点をもたらすと見られた。すべての例で、連結残基としてＫまたはＫ（ＳＨ）残基を使用した。
（実施例５１）
非対称二機能性抗体コンジュゲートを生成するためのパラメータの評価
室温で製剤緩衝液（１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのグリシン、２％のスクロース、ｐＨ＝７）中の［第２リンカー−Ｅｘ４］とＡｂとの間の異なる融合比を検査した。［第２リンカー−Ｅｘ４］の量が増えるにつれて、［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の形成も増大し、約４５％に留まった（表１７）。［第２リンカー−Ｅｘ４］をさらに増やすと、［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］２の量が増加した。
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Ａｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］１を形成するための［第２リンカー−Ｅｘ４］と［Ａｂ］（２０ｍｇ／ｍＬ、０．６：１の比）のコンジュゲーションを、様々な共溶媒系を使用して検査した。これらの様々な共溶媒（表１８に示した）を添加することによって、Ａｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の形成が改善され得るか否かを確かめた。共溶媒、例えば、エタノール、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの濃度を５％から１０％〜１５％に増大させると、Ａｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の形成は影響されなかったが、Ａｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］２の形成および非コンジュゲート抗体の回収は確かに影響を受けた。有機共溶媒の量が増えるにつれて、より多い量の抗体が非コンジュゲートのままであったように思われる。同様に、共溶媒濃度が増大するにつれて、Ａｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］２の形成が減少した。エタノール、ＤＭＦ、およびＤＭＳＯなどの共溶媒は、Ａｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］２の形成を阻害する一方で、プロピレングリコールは、Ａｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］１またはＡｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］２の形成にいずれの効果もなかった。分析は、ＨＰＬＣを使用して行った。
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Ａｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の形成に対する尿素（０．５、１．０、および２Ｍ）ならびにＥＤＴＡ（５、１０、および１５ｍＭ）の効果を検査した。尿素もＥＤＴＡもＡｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］１またはＡｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］２の形成に対して、いずれの顕著な効果も有さなかった。
［第２リンカー−Ｅｘ４］および［Ａｂ］（２０ｍｇ／ｍＬ）からのＡｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の形成に対する塩酸グアニジンの効果も、塩酸グアニジンの異なる濃度（０、０．２、０．４、および０．５Ｍ）、ならびに異なる比の［第２リンカー−Ｅｘ４］１：Ａｂ（０．８５：１および１：１）で検査した。両方の比で、塩酸グアニジンの濃度を増大させると、Ａｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］２の形成が減少したが、Ａｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の収率を有意に改善することはできなかった。
製剤緩衝液（１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのグリシン、および２％のスクロース、ｐＨ＝７）を使用して、０．５：１、０．７５：１および１：１の比の［第２リンカー−Ｅｘ４］と抗体（２０ｍｇ／ｍＬ）とのコンジュゲーション反応に対するＮａＣｌ濃度（０、１００、２５０、５００ｍＭ）の効果を調査した。試験したＮａＣｌ濃度にわたるＡｂ−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の生成において、有意な差異はまったく観察されなかった。
製剤緩衝液（１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのグリシン、および２％のスクロース）を使用して、［第２リンカー−Ｅｘ４］１と抗体（２０ｍｇ／ｍＬ）とのコンジュゲーション反応に対するｐＨの効果を試験した。結果を表１９に示す。［第２リンカー−Ｅｘ４］１の形成は、ｐＨ＝６．５および７で最高であった。
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［第１リンカー−ＦＧＦ２１］：［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の比の系統的な調査を研究することによって、［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１−［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の形成を評価した。表２０は、［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１および［第１リンカー−ＦＧＦ２１］の濃度、ならびに［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１−［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の形成を示す。比は、ＨＩＣカラムを備えたＨＰＬＣを使用して確認した。［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の濃度は、［第１リンカー−ＦＧＦ２１］の添加量が変化するにつれて変化した。これらの結果に基づくと、［ＦＧＦ２１−第１リンカー］１−［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１形成の最大効率は、［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１の濃度が約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの間であり、［第１リンカー−ＦＧＦ２１］の量が、［Ａｂ］−［第２リンカー−Ｅｘ４］１と比較して約３〜約６倍の間で過剰であるとき実現されたように思われる。
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ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ内部の内部ジスルフィド結合に影響を及ぼすことなく、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ二量体間の相互ジスルフィド結合を破壊するのに要求されるＴＣＥＰの濃度を研究した。結果を表２１に示す。２０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７（約２ｍｇ／ｍＬ）中にＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃを含有する試料を、様々な濃度のＴＣＥＰで３０分間処理した。試料をＬＣ−ＭＳによって分析した。データに基づくと、０．３ｍＭのＴＣＥＰが、内部ジスルフィド結合に影響を及ぼすことなく、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃタンパク質間の相互ジスルフィド結合を破壊するのに最適な濃度である。
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ジスルフィド内結合の還元を、３つの異なるＴＣＥＰ濃度を使用して、１４０分にわたってＨＰＬＣを使用して追跡した。すべての内部ジスルフィド結合が、ＴＣＥＰを使用して３０〜４０分以内に切断された。これらの実験は、相互ジスルフィド結合が、０．３ｍＭのＴＣＥＰを使用して３０分以内に切断され得ることを示唆する（表２２）。
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（実施例５２）
非対称二機能性コンジュゲートの生成（ストラテジー１）
Ｈ３８Ｃ２＋エキセンジン４の反応：ｈ３８Ｃ２（配列番号２５および配列番号２６）２．７６グラム（１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのグリシン、２％のスクロース、ｐＨ６．５、１３６ｍＬ中）を、脱イオン水１．２９ｍｌ中で、リンカーＬ１にコンジュゲートしたＥｘ４ペプチド（ペプチド連結残基としてＫ（ＳＨ）を有する配列番号６４）６２．３ｍｇ（濃度１０ｍＭ）で処理し、室温で一晩放置した。少量の材料を、ＨＩＣ−ブチルカラムを備えた高速液体クロマトグラフィー、および質量分析を使用して分析することによって、Ａｂ−［Ｌ１−配列番号６４］１の形成をモニターした。
Ａｂ−エキセンジン４ １ＦＡ種の抽出：抗体、Ａｂ−［Ｌ１−配列番号６４］１、およびＡｂ−［Ｌ１−配列番号６４］２の混合物を含有する粗反応混合物（１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのグリシン、２％のスクロース、ｐＨ＝６．５でできた緩衝液１３６ｍＬ中２．７グラム）を、緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．０）４０９ｍＬで希釈し、ＣＭセファロース樹脂６８１ｍＬを充填したカラムに装填した。溶媒Ａ（０．７５Ｍの硫酸アンモニウムおよび５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０）中の、溶媒Ｂ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０＋２０％のイソプロパノール）の勾配を使用して、生成物を画分で（ｆｒａｃｔｉｏｎｗｉｓｅ）溶出した。Ａｂ−［Ｌ１−配列番号６４］１を含有する画分を合わせた（１１００ｍＬ）。５０ＫＤの膜を備えた限外濾過−透析濾過デバイスを１Ｎの水酸化ナトリウムで衛生化し、ｐＨ＝７．０の、２０ｍＭの２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール、５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した。Ａｂ−［Ｌ１−配列番号６４］１を含有する上記でプールした画分を、２０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．０を使用して緩衝液交換し、６２ｍＬに濃縮し、０．２ｕｍのフィルターに通して濾過することによって、ｐＨ＝７．０の２０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン＋５０ｍＭの塩化ナトリウム中でＡｂ−［Ｌ１−配列番号６４］１ １．０２ｇを得た。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）分離は、固定相と分子の疎水性特性との相互作用に基づく。抗体ｈ３８Ｃ２は、Ａｂ−［Ｌ１−配列番号６４］１より疎水性が低く、Ａｂ−［Ｌ１−配列番号６４］１は、Ａｂ−［Ｌ１−配列番号６４］２より疎水性が低い。溶出の間、未反応抗体がより早く溶出し、その後にＡｂ−［Ｌ１−配列番号６４］１が続く。Ａｂ−［Ｌ１−配列番号６４］２が最後に溶出する。抗体とペプチドの比を調整することによって、上述した３つの異なる化合物の％を変更することができる。
未反応抗体を単離し、ＵＦ／ＤＦにかけ、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのグリシン、２％のスクロース、ｐＨ＝６．５の緩衝液中に取り入れた。この単離抗体をＥｘ４ペプチド（ペプチド連結残基としてＫ（ＳＨ）を有する配列番号６４）と再び融合させ、精製した。本発明のいくつかの態様では、これを３回繰り返すことによって、約７０％のＡｂ−［Ｌ１−配列番号６４］１を得ることができる。
ＦＧＦ２１＋リンカー：ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ（ｐＨ＝７．０の、２０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン＋５０ｍＭの塩化ナトリウム１０５ｍＬ中７１５ｍｇ）を、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（０．３ｍＭの溶液）で４０分間処理した。ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃは、１２９位の未反応チオールに起因する二量体形成の問題を有する場合があり、それは、生成と後続のリンカーへの結合との間で未反応タンパク質が蓄えられる場合、特に不利となり得る。この問題は、約０．１ｍＭの最終濃度までＴＣＥＰを添加することによって克服することができる。
Ｌ１（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−（２−（２−（３−オキソ−３−（４−（３−オキソ−３−（２−オキソアゼチジン−１−イル）プロピル）フェニルアミノ）プロポキシ）エトキシ）エチル）プロパンアミド（ジメチルスルホキシド２．５７ｍＬ中２７．２ｍｇ）を、ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ溶液に添加し（およそ２：１のリンカー：タンパク質のモル比で）、断続的に回旋しながら室温で３０分間放置した。Ｌ１は一般に、１００％のＤＭＳＯ中で、１０ｍＭ（４８．２８ｍｇ／ｍｌ）で維持したが、他の溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、水、プロピレングリコール、およびこれらの混合物なども適している。Ｌ１は、メタノール中およびエタノール中の両方で加水分解を起こす潜在性を有する。Ｌ１の溶解度は、ジメチルスルホキシド中およびジメチルホルムアミド中の両方でより高い。ジメチルスルホキシドは、リンカー−タンパク質コンジュゲーションで使用される緩衝系と容易に混合するので、ジメチルスルホキシドがＬ１原液を調製するのに好適である。
ＵＦＤＦ膜を１Ｎの水酸化ナトリウムで３０分間衛生化し、ｐＨ＝７．０の、２０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン＋５０ｍＭの塩化ナトリウムで平衡化した。上記ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃインキュベーション混合物を、ＵＦＤＦを使用して濃縮することによって、緩衝液８１ｍＬ中の［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ］６１３ｍｇを得た。
［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ］溶液を、ｐＨ＝７．０の、２０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン＋５０ｍＭの塩化ナトリウム４２ｍＬで希釈し、Ａｂ−［Ｌ１−配列番号６４］１（ｐＨ＝７．０の、２０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン＋５０ｍＭの塩化ナトリウム６１ｍＬ中、１．０２ｇ）に添加し、反応混合物を一晩放置した。次いでこのインキュベーション混合物（１８４ｍＬ）を、緩衝液Ａ（０．７５Ｍの硫酸アンモニウム＋５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）３６６ｍＬで希釈し、緩衝液Ａ中の緩衝液Ｂ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム＋２０％のイソプロパノール、ｐＨ＝７．０）を使用して、ＨＩＣ−ブチルカラムで精製した。ＨＩＣ−ブチルカラムは、商業的生産に適した量にスケールアップするのに適しているという利点を有することが判明した。［ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ−Ｌ１］１−Ａｂ−［Ｌ１−配列番号６４］１分子を含有する画分を収集して９７０ｍＬを得た。
ＵＦ／ＤＦ ５０ｋＤ ５０ｃｍ２カセットを１Ｎの水酸化ナトリウムで衛生化し、ＵＦ／ＤＦ膜を、ｐＨ＝７．０の、２０ｍＭの２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール、５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した。上記合わせた画分を、ＵＦ／ＤＦ膜、および２０ｍＭのトリス、５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ＝７を使用して濃縮することによって、０．２ｕｍのフィルターに通して濾過した緩衝液６７ｍＬ中の［ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ−Ｌ１］１−Ａｂ−［Ｌ１−配列番号６４］１ ５９４ｍｇを得た。
濃縮した後、試料を０．２ｕｍの膜に通して濾過し、４℃で貯蔵した。最終的な試料をエンドトキシンについて分析し、純度および構造上の同一性をブチルＨＩＣ ＨＰＬＣおよび質量分析計で確認した。ＨＩＣ−ブチルカラムを備えたＨＰＬＣを使用して試料を分析すると、およそ７８％の［ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ−Ｌ１］１−Ａｂ−［Ｌ１−配列番号６４］１および約２２％の未反応Ａｂ−［Ｌ１−配列番号６４］１の収率が示された。
（実施例５３）
ＡＢＣ分子を開発するための代替のストラテジー
本発明は、Ａｂ−［Ｅｘ４−第２リンカー］１が［ＦＧＦ２１−第１リンカー］にコンジュゲートされるコンジュゲーションプロセスのための第１のストラテジー（ストラテジー１）を提供する。このプロセスは、有利であるが、最終的な二重特異性抗体ＡＢＣ−１のために、一方のＨＩＣがＡｂ−［Ｅｘ４−第２リンカー］１のためであり、他方が生成物ＡＢＣ−１を精製するためである、２つの高分解能クロマトグラフィーステップを必要とする。いくつかの好都合な態様では、このプロセスにより、１４％の未反応Ａｂ−［Ｅｘ４−第２リンカー］１プロセス中間体、および低収率の他の不純物を伴って、７４％の純度を有する最終生成物ＡＢＣ−１が得られる。
本発明は、ストラテジー２による、非対称二機能性抗体コンジュゲートを生成する代替法も提供する。ストラテジー２は、ストラテジー１に対して、ＦＧＦ２１化学量論比を劇的に改善し（ストラテジー２における約１．２５倍のモル比対ストラテジー１における３倍）、必要とされるＦＧＦ２１の量を低減し、著しいコスト削減をもたらすという著しい利点をもたらす。
ストラテジー２はまた、クロマトグラフィーステップを、Ａｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１プロセス中間体を精製するためのわずか１回のＨＩＣクロマトグラフィーに低減した。ＡＢＣ−１を形成するための［Ｌ１−配列番号６４］のＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１中間体とのコンジュゲーション効率は、ストラテジー２において十分規定された出発材料［Ｌ１−配列番号６４］を使用してほぼ完全であった。
ブチル６５０Ｓ逆相クロマトグラフィーステップを展開することによって、プロセス中間体としてＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１を生成した。単一のコンジュゲートされたＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１種が、溶出ステップにおいて９０％超の高収率および９０％超の高純度で選択的に回収され、遊離［配列番号１０−Ｌ１］、二量体［配列番号１０−Ｌ１］２、二重コンジュゲートされたＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］２、凝集体、および遊離ｈ３８Ｃ２種を含む他のコンジュゲーション反応種から十分に分割された。プロセスのスケールアップは、１９Ｌのスケールで順調に実証された。
第２のコンジュゲーションからの過剰の［Ｌ１−配列番号６４］をフロースルーＣａｐｔｏ−Ｑクロマトグラフィーにより急速に除去することによって、二重特異性抗体ＡＢＣ−１を精製した。ストラテジー２は、ＡＢＣ−１への完全反応性ｈ３８Ｃ２から計算して約４０％という前例のない収率、およびＳＥＣによる約９１％のＡＢＣ−１という優れた純度を実証した。全体的なプロセス効率は、高価な材料のＦＧＦ２１の利用を低減し、クロマトグラフィーステップを最少化することによって劇的に増大した。
（実施例５４）
ＡＢＣのためのコンジュゲーションパラメータの改善
Ａｂ−［ＦＧＦ２１−リンカー］１の収率に対する［ＦＧＦ２１−リンカー］：Ａｂのモル比の効果
Ａｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１プロセス中間体の収率を最大にするための［ＦＧＦ２１−第１リンカー］：Ａｂの様々な比の予備評価を実施した。［ＦＧＦ２１−第１リンカー］：Ａｂの最適なモル比は、約１．２５：１であり、約１．５：１〜約１：１が許容できる範囲であった（表２３を参照）。約１．２５：１の比により、所望の中間体について約４２％の収率が得られ、凝集体は、最低の％であった。
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Ａｂ−［ＦＧＦ２１−リンカー］１のための緩衝液、ｐＨ、およびコンジュゲーション温度のスクリーニング
緩衝液ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）およびリン酸塩、ｐＨ（ｐＨ６＆７）、ならびに温度（ＲＴ対４℃）を含めた、コンジュゲーション効率を改善するための様々なパラメータをスクリーニングした。結果（表２４）は、％凝集体が、ＭＥＳおよびリン酸塩緩衝液の両方について、ｐＨ、温度、および様々な濃度範囲にわたって安定なままであることを示した。ＲＴで１００ｍＭのリン酸塩緩衝液、ｐＨ６．０により、他の条件と比較して有意により多いＡｂ−［ＦＧＦ２１］１が得られた。４℃でのコンジュゲーションは、同様の生成物プロファイルを示したが、ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１の収率はより低かった。ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１のコンジュゲーションのための許容できる操作条件は、約２５ｍＭ〜約１５０ｍＭの間の濃度で、約５．５〜約７．５、または約６．０〜約７．０のｐＨ範囲で、約０℃〜３７℃の間、好ましくは約４℃〜約ＲＴの間で、ＭＥＳまたはリン酸塩緩衝液を使用することと特定された。ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１の最適なコンジュゲーション条件は、ＲＴで約６．０〜約６．５のｐＨ範囲を有する約１００ｍＭのリン酸塩緩衝液から構成された。
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Ａｂ−［ＦＧＦ２１−リンカー］１の時間経過試験：［ＦＧＦ２１−第１リンカー］のｈ３８Ｃ２とのコンジュゲーションのモデル化で使用するために、時間経過試験を行った。表２５に示したように、ＲＴで１８時間後に、ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１中間体のコンジュゲーション効率が最大に達した。したがって、コンジュゲーション反応は、少なくとも３０分、少なくとも約６０分、少なくとも約９０分、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、および少なくとも約２４時間からなる群から選択される時間にわたって実施することができる。
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ＦＧＦ２１−リンカーのためのコンジュゲーション条件の微調整：様々な最適化された緩衝液およびｐＨを用いて、実験室のスケールアップを異なるスケールで実施した。ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１のためのコンジュゲーション効率は、約４０％〜約４５％の範囲内で同等のままであった（表２６）。配列番号１０−Ｌ１の反応基の加水分解が経時的に起こるので（表２７）、配列番号１０−Ｌ１の活性化後透析濾過は、約２〜約１０℃の間で操作されるべきである。活性化後透析濾過をした後の配列番号１０−Ｌ１の量は、異なる実験で変動し、この差異は、ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１のコンジュゲーション効率の変動の一因となり得る。約１００ｍＭのリン酸塩、ｐＨ約６．３により、再利用目的のために最少の凝集体および最高の％ｈ３８Ｃ２が残った。
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［第２リンカー−Ｅｘ４］およびＡｂ−［ＦＧＦ２１−リンカー］１のコンジュゲーションのための緩衝液およびｐＨのスクリーニング：活性化された［配列番号１０−Ｌ１］およびｈ３８Ｃ２を伴う第１のコンジュゲーションステップからのコンジュゲーション反応溶液をブチル６５０Ｓ逆相クロマトグラフィーステップで精製することによって、ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１を生成した。次いでこの材料を、適当な緩衝液（３０ｍＭの乳酸ナトリウム、ｐＨ４．８または２０ｍＭのグルタミン酸ナトリウム、ｐＨ４．５）中に透析濾過した。Ｌ１などのリンカーのＡＺＤ環と配列番号２６のＫ９９との間の自発的選択的融合反応は、通常、ｐＨ６．５で起こるが、ｐＨ４．５で起こらない。ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１の［Ｌ１−配列番号６４］へのコンジュゲーションのための最適なｐＨパラメータを調査した。１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０を使用して、ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１溶液のｐＨを調整した。結果（表２８および２９）は、ｐＨ約６．０〜ｐＨ約６．５の間の最適範囲を示した。より高いコンジュゲーション効率がＭＥＳ／乳酸塩緩衝液中で実現された。ＡＢＣ−１（［配列番号１０−Ｌ１］１−ｈ３８Ｃ２（ＩｇＧ１）−［Ｌ１−配列番号６４］１）の優れた融合効率は、［第２リンカー−Ｅｘ４］：Ａｂ−［ＦＧＦ２１−第１リンカー］＝約１．３：１のより高いモル比を使用して実現した。
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［第２リンカー−Ｅｘ４］１−Ａｂ−［ＦＧＦ２１−リンカー］１の時間経過試験：ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１の［Ｌ１ 配列番号６４］とのコンジュゲーションのモデル化で使用するために、時間経過試験を行った。表３０に示したように、ＲＴで１８時間後に、ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１のコンジュゲーション効率が最大に近づいた。
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（実施例５５）
ＦＧＦ２１のリンカーへのコンジュゲーション
ＦＧＦ２１の単量体と二量体の比を実験前に確かめた。ＦＧＦ２１ ＲＨＰＬＣ分析により、単量体：二量体比は、２７％：７３％であることが示された。０．２０７ｍＭの配列番号１０（２０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、２．３４６Ｌ、ｐＨ７．０中１７．１ｇ）を、２８０ｎｍの吸光度によって測定して、標的濃度の４ｇ／Ｌまで１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０（１．９２０Ｌ）で最初に希釈した。次に、ＴＣＥＰ原液（５０ｇ／Ｌ）７．６３１ｍＬを添加した。この混合物を５分間完全に混合し、次いで混合を周囲条件で低減させた。反応は、９０分間続いた。ＴＣＥＰで還元した後、試料をＦＧＦ２１ ＲＦによって分析し、工程内管理として単量体：二量体比が８９％：６．３％であることが示された。
９０分後に、Ｌ１（６５６．７ｍｇ）をＤＭＳＯ ８．７６ｍｌ中に溶解させ（Ｌ１の最終濃度は、０．２９ｍＭ、または約０．１５ｍｇ／ｍｌであった）、この溶液を配列番号１０の溶液に添加した。Ｌ１の容器に緩衝液を流すことによって、すべてのＬ１が添加されたことを保証した。活性化は、Ｌ１のすべてを配列番号１０のプールに添加した後、開始した。反応物を５分間完全に混合し、次いで混合をＲＴで低減させた。配列番号１０とリンカーＬ１との反応を完了するために、この混合物を回旋させながらＲＴで３０分間放置した。活性化温度は、必要であれば下げることができる。ＦＧＦ２１逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ）によるさらなる分析により、［配列番号１０−Ｌ１］の７３％の形成が示された。
上記試料をＵＦ／ＤＦにさらに通過させることによって、過剰のリンカーおよびＴＣＥＰを除去した。膜を１ＮのＮａＯＨで３０分間衛生化し、この溶液を切り、１００ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ７．０で平衡化した。緩衝液の１００ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ７．０を透析濾過に使用した（７×透析濾過）。透析濾過は、４ｇ／Ｌの保持液濃度で行った。発泡および飛沫を、ＵＦ／ＤＦの間に回避することができる。［配列番号１０−Ｌ１］の反応基の加水分解が、透析濾過プロセスにわたって起こった。活性化後ＤＦプールのホールドタイムは、最小限にするべきである。ＵＦは、１０ＫのＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜を使用して、２〜１０℃で操作することができる。ＦＧＦ２１ ＲＰによって確認した、合わせた種［配列番号１０−Ｌ１］は、ＵＦ／ＤＦ後に７３％から６４％に下がった。
濃度は、配列番号１０（濾過したＱ Ｓｅｐｈプール）および［配列番号１０−Ｌ１］（活性化後ＵＦ／ＤＦプール）の両方について１ｍｇに等しい０．４７ＯＤの吸光係数を使用して、ＵＶ２８０ｎｍによって推定した。この反応機構およびその変形、ならびに他のＦＧＦ２１変異体およびリンカーも、ストラテジー１で使用するのに適している。
（実施例５６）
［ＦＧＦ２１−リンカー］のＡｂへのコンジュゲーション
ｈ３８Ｃ２（配列番号２５および配列番号２６：１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ６．５中、１７．０５ｇ／Ｌ、５．６Ｌ）９５．０ｇを、１００ｍＭのリン酸塩緩衝液（１４．４Ｌ、ｐＨ６．２）で希釈した。次いで、１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０中の［配列番号１０−Ｌ１］１７．７２ｇ（４．４ｇ／Ｌ、３．８Ｌ、１．３５モルの［配列番号１０−Ｌ１］：１モルのｈ３８Ｃ２）を、ｈ３８Ｃ２混合物に添加した。最終的な反応混合物は、ＲＴで約４ｇ／Ｌのｈ３８Ｃ２となり得る。［配列番号１０−Ｌ１］成分を添加した後、反応が開始した。反応物を約５分間完全に混合し、次いで混合をＲＴで低減させた。この混合物を、穏やかに撹拌しながら、ＲＴで一晩、約１５〜約２０時間の間放置した。少量の材料を採取してＳＥＣクロマトグラフィーにより分析することによって、混合物中のｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１コンジュゲートの形成を確認した。ＳＥＣ分析により、表３３に示したように、ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１のコンジュゲーションステップ収率が４０％であると示された。コンジュゲーションステップ収率は、ＳＥＣ（％）によるｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１の結合価の純度として計算した。
（実施例５７）
反応性Ａｂ−［ＦＧＦ２１−リンカー］１プロセス中間体の濃縮
ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１を、２０ｃｍのベッド高まで充填された直径３５ｃｍのＸＫカラムを使用して、東ソーブチル６５０Ｓ樹脂を充填した１９Ｌスケールのカラムを使用して濃縮した。カラムは、３ＣＶ（カラム体積）のＷＦＩおよび５ＣＶの５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０でプレ平衡化し、洗浄した。ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１の濾過済みコンジュゲーションプールを、１７℃で、ブチル６５０Ｓカラム上に５ｍｇ／ｍＬで装填した。次いで、ブチル６５０Ｓ装填物を、１７〜１８℃で、自動クロマトグラフィースキッド上で、プログラムされたＵｎｉｃｏｒｎ法を使用して、Ｔｏｓｏｈブチル６５０Ｓ樹脂に通して処理した。溶出は、直線勾配、すなわち、最初に７ＣＶでの２．４％の１，６ヘキサンジオールアイソクラチック洗浄（８８％の緩衝液Ａ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）および１２％の緩衝液Ｂ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０％のヘキサンジオール、ｐＨ７．０））、その後に、１１ＣＶでの８８％のＡ＋１２％のＢ〜６０％のＡ＋４０％のＢの溶出勾配；５ＣＶでの６０％のＡ＋４０％のＢの勾配保持を使用して実施した。画分を収集し、純度についてＳＥＣアッセイにより分析することによって、どの画分をプールするかを判定した。最終プールのＳＥＣ分析結果を表３１に示す。ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１は、溶出ステップにおいて、カラム上に装填されたｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１種の約９０％の回収率に対応する高い収率で、かつまた９０％超の高純度で選択的に回収され、遊離［配列番号１０−Ｌ１］、［配列番号１０−Ｌ１］２二量体、ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］２、凝集体、および遊離ｈ３８Ｃ２（＋０ ＦＧＦ２１）種を含む他のコンジュゲーション反応種から十分に分割された。ブチル６５０Ｓクロマトグラフィーからの画分を一緒にプールし、さらに濃縮し、透析濾過した。濃度は、タンパク質１ｍｇに等しい１．４７の吸光度を使用して、ＵＶ２８０ｎｍによって推定した。
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（実施例５８）
［第２リンカー−Ｅｘ４］のＡｂ−［ＦＧＦ２１−リンカー］１へのコンジュゲーション
３０ｍＭの乳酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．８中のｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１３４．６ｇ（９．７ｇ／Ｌ、３．５６９Ｌ）を、２５ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０（２．１Ｌ）で処理することによって、ｐＨを６．３に調整した。次いで、ＷＦＩ（注射用水）９０．２ｍｌ中に溶解させた［Ｌ１−配列番号６４］１．８１ｇ（［Ｌ１−配列番号６４］の最終濃度は、０．０６５ｍＭ、または約０．３１ｍｇ／ｍｌであった）を、ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１溶液に添加した。［配列番号１０−Ｌ１］の容器に緩衝液を流すことによって、すべてのペプチドが添加されたことを保証した。最終的な反応混合物は、ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１について６．０ｇ／Ｌとなり得る。反応物を約５分間完全に混合し、次いで混合をＲＴで低減させた。この混合物を、穏やかに撹拌しながら、ＲＴで一晩、約１５〜約２０時間の間放置した。少量の材料を採取してＨＩＣクロマトグラフィーにより分析することによって、［配列番号１０−Ｌ１］−［配列番号：２５および２６］−［Ｌ１−配列番号６４］１（ＡＢＣ−１）の形成を確認した。ＨＩＣ分析により、（ＡＢＣ−１）の９０％の収率が示された。コンジュゲーションステップ収率は、ＨＩＣ（％）による［配列番号１０−Ｌ１］−［配列番号：２５および２６］−［Ｌ１−配列番号６４］１（ＡＢＣ−１）の＋２結合価の純度として計算した。
過剰の［Ｌ１−配列番号６４］を、陰イオン交換クロマトグラフィーＣａｐｔｏ Ｑを使用して除去し、Ｃａｐｔｏ Ｑクロマトグラフィーからの画分を一緒にプールし、さらに濃縮し、透析濾過することによって、最終的な原薬を得た。
（実施例５９）
フェニル６５０Ｓカラムを使用する完全反応性Ａｂの濃縮
完全反応性Ａｂ（ｈ３８Ｃ２）を、１４ｃｍのベッド高まで充填された直径３０ｃｍのカラムを使用して、Ｔｏｓｏｈフェニル６５０Ｓ樹脂を充填した９．５Ｌスケールのカラムを使用して濃縮した。カラムは、２ＣＶ（カラム体積）のＷＦＩおよび５ＣＶの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０でプレ平衡化し、洗浄した。ｈ３８Ｃ２プール（１５３ｇ）を、ＲＴで、フェニル６５０Ｓカラム上に１５ｍｇ／ｍＬで装填した。次いで、ｈ３８Ｃ２装填物を、自動クロマトグラフィースキッド上で、プログラムされたＵｎｉｃｏｒｎ法を使用して、Ｔｏｓｏｈフェニル６５０Ｓ樹脂に通して処理した。溶出は、最初に２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０を使用する１ＣＶの洗浄、次いで７ＣＶで１００％のＡ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）から６７％のＢ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、６ＣＶについて６７％のＢで保持、次いで３ＣＶで１００％のＢへの減塩、その後に、１ＣＶで１００％のＢから７０％のＣ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０％のヘキサンジオール、ｐＨ７．０）の溶出、次いで、５ＣＶについて７０％のＣでの勾配保持を用いて実施した。画分を収集し、純度についてＨＩＣアッセイにより分析することによって、どの画分をプールするかを判定した。完全にコンジュゲート可能なｈ３８Ｃ２は、所望の最終生成物をもたらす後続のバイオコンジュゲーションステップのフィード材料として機能を果たすことができる。
結論：ＡＢＣ−１バイオコンジュゲート二重特異性抗体原薬の生産プロセスの一部として、３つのコンジュゲーションステップを開発した。最終的な原薬の生成をもたらすはずであるプロセス中間体をコンジュゲートおよび精製するのに、２つの異なるストラテジーを探索した。ストラテジー２は、実験室内で順調にスケールアップされ、試行の繰り返しに対して一貫して機能した。
（実施例６０）
Ａｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１精製のためのブチルＲＰの最適化
実験プロトコール：
クロマトグラフィー実験を、以下に示すプロトコールおよび操作条件を使用して、４ｍＬまたは１０３ｍＬのスケールで実施した。
４ｍＬのカラム−周囲条件下で操作される直径０．５ｃｍ×高さ２０ｃｍ
緩衝液Ａ：５０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．０
緩衝液Ｂ：５０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．０、２０％の１，６−ヘキサンジオール
緩衝液Ｃ：５０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ６．５
流量：１２５ｃｍ／時間
洗浄および勾配にわたる２ｍＬの画分を、ＶＷＲ製のディープウェルマイクロタイタープレートを備えたＦｒａｃ９５０を使用して収集した。
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各カラム実行（ｃｏｌｕｍｎ ｒｕｎ）は、３カラム体積（ＣＶ）で、ＷＦＩでプレ平衡化した。平衡化は、５ＣＶで行い、その後、カラムにＦＧＦ２１コンジュゲーションプールを４ｍｇ／ｍｌで装填した。勾配溶出ステップの間に、任意の所与のステップでカラムが経験する移動相組成は、特定の比で混合されている緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物として表現される。例えば、１２％のＢから４０％のＢへの勾配ステップは、１１カラム体積の長さにわたって、１２％のＢ＋８８％のＡの混合物の組成から開始して、４０％のＢ＋６０％のＡの最終組成まで時間とともに直線的に変化することを意味する。勾配溶出ステップの後、各カラム実行に５ＣＶの１００％の緩衝液Ｂを流した。この後に、各カラム実行を、上昇流方向で５ＣＶの０．５ＮのＮａＯＨで浄化し、次いで、５ＣＶの０．１ＮのＮａＯＨを流した。すべての予備評価は、Ｔｏｓｏｈブチル６５０Ｓ樹脂を充填した４ｍＬのカラム（直径０．５ｃｍ×高さ２０ｃｍ）を使用して実施した。
実行番号１１８：最初のブチル６５０Ｓカラム実行番号１１８は、ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１コンジュゲーション反応溶液を使用して、５ｍｇ／ｍＬのカラム装填量で実施した。カラムに、いずれのリオトロピック塩も添加することなく装填し、周囲温度条件下で操作した。カラムは、３ＣＶ（カラム体積）のＷＦＩおよび５ＣＶの１００％の緩衝液Ａ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）でプレ平衡化し、洗浄した。ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１の濾過済みコンジュゲーションプールを、ブチル６５０Ｓカラム上に５ｍｇ／ｍＬで装填し、次いで、プログラムされたＵｎｉｃｏｒｎ法を使用して、ブチル６５０Ｓ樹脂に通して処理した。カラムを５ＣＶの１００％の緩衝液Ａで洗浄し、次いで、直線勾配を、１０ＣＶで、１００％のＡ＋０％のＢ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０％のヘキサンジオール、ｐＨ７．０）から１０％のＡ＋９０％のＢまで実行し、勾配を５ＣＶの１００％のＢで保持した。画分を収集し、ＳＥＣアッセイによって分析した。ＳＥＣ分析結果を表３３に示す。
結果は、Ａｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１とＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］２および遊離ＦＧＦ２１との間の良好な分離を示す。遊離ｍＡｂ（＋０）種の一部がＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１生成物ピークの前端中で共溶出することが判明したが、ｍＡｂ（＋０）種のほとんどは、１，６−ヘキサンジオール勾配中で後に溶出した。
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実行番号１２８：勾配をカラム実行番号１１８と同じに保持しながら、タンパク質装填量を１０ｍｇ／ｍＬに増やすことの効果を、カラム実行番号１２８で評価した。この実験に関して、異なるコンジュゲーション反応物を、装填材料として利用した。この反応物は、より高い相対濃度のＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１（すなわち、４４．７％）について最適化されていたが、カラム実行番号１１８で使用した装填溶液と比較して、ＳＥＣアッセイによって、より高い相対濃度のＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］２（すなわち、２４．４％）およびより低い濃度のｍＡｂ２４．７％種も有していた。より高いレベルのＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］２種およびより高いタンパク質装填量は、カラム性能および溶出プール生成物組成にインパクトを与えることが予期される。表３４で明白であるように、装填量を増やすと、Ａｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１からのＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］２種の分割が減少する。
Figure 0006165168
実行番号１３２：Ａｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１種の分割を改善するために、カラム実行番号１２８で使用した同じ装填材料を使用して、５ｍｇ／ｍＬのカラム装填量で、カラム実行番号１３２で、浅い勾配溶出（２０ＣＶで、１００％のＡ＋０％のＢから１０％のＡ＋９０％のＢ）を実施した。表３５は、溶出画分についてＳＥＣによって求めた場合の、様々なコンジュゲート種の溶出プロファイルおよび相対純度を示す。Ａｂ−［配列番号１０−Ｌ１］２種とＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１種との間の分離の改善が、浅い１，６ヘキサンジオールで得られた。これは、ある特定の低い濃度の１，６ヘキサンジオールを用いてＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］２種のほとんどを溶出するように設計されたステップ溶出が有益であることを示唆する。５ｍｇ／ｍＬの装填後にカラム実行番号１３４において５％のヘキサンジオールで洗浄すると、結合種のすべてが溶出された（データを示さず）。
Figure 0006165168
 実行番号１３８：引き続いて、２．４％の１，６−ヘキサンジオールアイソクラチック洗浄（すなわち、カラム実行番号１３８）、その後の３０ＣＶで２．４〜１８％の溶出勾配を用いる実験を、５ｍｇ／ｍｌの装填密度で実施した。表３６は、画分のＳＥＣアッセイを用いた、この実行からの溶出プロファイルを示す。この溶出プロファイルで見られるように、溶出勾配の前に２．４％の洗浄ステップを使用して分離の増強が得られた。これに基づくと、１２％の緩衝液Ｂおよび８８％の緩衝液Ａは、３０ＣＶにわたる直線勾配溶出に対して、適当な初期濃度の１，６ヘキサンジオールをもたらすと判定された一方、カラム実行番号１３４は、わずかにより高い初期１，６ヘキサンジオール濃度に起因して過剰のＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１を最初に洗出するように思われた。
Figure 0006165168
温度およびｐＨの効果
実行番号１４８：温度およびｐＨは、カラム性能および様々なコンジュゲート種の分割に影響する重要なプロセスパラメータであることが示された。この試験では、他の種からＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１種を分離することに関して、より低い温度のインパクトをカラム実行番号１４８で評価した。この実験については、カラムおよび緩衝液を、温度制御された冷蔵庫内で、１７℃で貯蔵および操作した。カラム実行番号１３８と同様のプロトコールを使用して、カラムに、最大５ｍｇ／ｍＬまで装填し、これを洗浄し、溶出した。温度を２２℃から１７℃に下げると、Ａｂ−［配列番号１０−Ｌ１］２種の結合能力が大いに減少した。表３７に示したプロファイルで明白であるように、下げられた温度（すなわち、約１７℃）でカラムを操作すると、洗浄ステップにおけるＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］２種の分離が増強されることが判明し、生成物Ａｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１の分割が改善された。
Figure 0006165168
実行番号１５２：１５２において、６．５のより低いｐＨでカラムを平衡化するが、７．０のより高いｐＨで溶出を実施すると、分離性能に有害であることが判明した。Ａｂ−［配列番号１０−Ｌ１］２種は、より低いｐＨでカラムに強く結合することが観察され、溶出プロファイルの右へのシフトが見られ、Ａｂ−［配列番号１０−Ｌ１］２種とＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１種との間の芳しくない分離をもたらした（表３８）。
Figure 0006165168
最終的な条件の開発およびプロセス一貫性の実証
実行番号１５６：カラム実行番号１４８で使用した操作条件、すなわち、ｐＨ、温度、洗浄、および直線勾配溶出の条件の選択された組合せは、Ａｂ−［配列番号１０−Ｌ１］２種からのＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１種の十分な分割をもたらした。ｍＡｂ種からのＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１種の分割を実現するための分離のさらなる改善を、勾配溶出の間に８％の１，６−ヘキサンジオールでのアイソクラチック保持ステップを使用して、カラム実行番号１５６で探索した。８％の１，６−ヘキサンジオールで、Ａｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１種のほとんどは、ｍＡｂ種の大部分をカラムに依然として結合したままにして、カラムから溶出される。次いでｍＡｂ種は、１００％の１，６−ヘキサンジオールアイソクラチック洗浄を用いた再生ステップの間に引き続いて溶出された。５ｍｇ／ｍＬのカラム装填密度で実施したカラム実行番号１５６からの画分のＳＥＣ結果を表３９に示す。勾配ステップの中間で観察された溶出ピークは、Ａｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１種に富み、非常に低レベルのＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］２種およびいくつかのｍＡｂ種を伴っている。代表的なプールを画分番号Ｃ８〜Ｄ６から調製し、２４％のカラムタンパク質収率に対応する０．２２５ｍｇ／ｍＬのプールのタンパク質濃度をもたらした。
Figure 0006165168
実行番号１６０：スケールアップ性能を、２０ｃｍのベッド高まで充填された直径２．６ｃｍのＸＫカラムを使用して充填した１０３ｍＬのカラムを使用して、カラム実行番号１６０において評価した。カラム実行番号１５６と同様のプロトコールを使用して、カラムに、最大５ｍｇ／ｍＬまで装填し、これを洗浄し、溶出した。５ｍｇ／ｍＬのカラム装填密度で実施したカラム実行番号１６０からの画分のＳＥＣ結果を、表４０に示す。直線勾配ステップにおける溶出ピークは、Ａｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１種に富む非常に高純度の画分を含有していた。溶出プールは、カラムに装填された＋１種の８５％超の回収率に対応する３６．４％の総タンパク質を含有していた画分Ｄ２〜Ｆ１をプールすることによって調製した。
Figure 0006165168
５ｍｇ／ｍＬの装填で性能の再現性を試験するために、いくつかのスケールアップカラム実行（番号１７８、番号１８０、および番号１８２）を、同一の条件下で実施した。溶出プールを各実行について調製した。同じ操作条件下で実施した３つの実行からの溶出プールプロファイルを表４１に示す。結果は、一貫した結果を示した。
Figure 0006165168
結論：コンジュゲーションプロセスを、最初にｍＡｂに、その後エキセンジン４ペプチドにカップリングされたＦＧＦ−２１タンパク質で実施したときの精製ステップの好適な候補樹脂として、ブチル６５０Ｓを選んだ。この樹脂は、リオトロピック塩の非存在下で５ｍｇ／ｍＬの良好な結合能力をもたらした。結合生成物（ｂｏｕｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）の溶出は、ｐＨ７．０で１，６−ヘキサンジオールの勾配を使用して達成した。単一のコンジュゲートされたＡｂ−［配列番号１０−Ｌ１］１種を、濃縮し、逐次溶出ストラテジー、すなわち、２．４％のヘキサンジオールを用いたアイソクラチック洗浄ステップ、その後の２．４％〜８％のヘキサンジオール直線勾配溶出を使用して選択的に溶出した。８５％超の収率が、カラムに装填されたｍＡｂ ＋１ ＦＧＦ２１種について得られた。
洗浄ステップの間のヘキサンジオールの濃度、カラムの装填密度、ｐＨ、および温度は、結合能力、分割、およびカラム性能にインパクトを与えた重要なパラメータであることが判明した。精製ステップは、実験室内で１００ｍＬスケールまで順調にスケールアップされ、試行の繰り返しに対して一貫して機能した。
（実施例６１）
ＡＢＣ分子のインビトロアッセイ
Ｇｌｕｔ１ Ｔａｑｍａｎアッセイでは、分化３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を使用することによって、以下に記載したリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法により、Ｇｌｕｔ１ ｍＲＮＡ発現を測定した。一晩血清飢餓させて１０〜１４日目の分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、化合物で６時間処理した。トータルＲＮＡをこれらの細胞から抽出し、Ｇｌｕｔ１およびＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現を、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＲＴ−ＰＣＲキットを使用して、Ｔａｑｍａｎ装置でリアルタイム定量的ＰＣＲ反応を実行して測定した。化合物の生物活性は、各試料からのＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルによって正規化したＧｌｕｔ１ ｍＲＮＡレベルの倍率変化によって求めた。ｃＡＭＰアッセイでは、ヒトＧＬＰ−１Ｒを過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＣＨＯ−ｈＧＬＰ−１Ｒ）を、９６ウェルプレート内に、３００ｕＭのＩＢＭＸを含む無血清培地中に播種した。細胞をＲＴで１時間、化合物とともにインキュベートした。ｃＡＭＰレベルは、製造者の指示書に従ってＣｉｓＢｉｏ ｃＡＭＰキットを使用して測定した。化合物の生物活性は、アッセイから得られたＥＣ５０値によって求めた（表４２を参照）。
Figure 0006165168
（実施例６２）
マウスモデルにおけるＡＢＣインビボアッセイ
薬物動態。非対称二機能性コンジュゲート−１（ＡＢＣ−１）とも呼ばれる［配列番号１０−Ｌ１］１−ｈ３８Ｃ２−（ＩｇＧ１）−［Ｌ１−配列番号６４］１の薬物動態を、雄Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（２２〜２４ｇ）で評価した。マウスに化合物を３ｍｇ／ｋｇでＩＶおよびＳＣ投与し、血液試料を、最大１２０時間の異なる時点で、時点ごとに３匹のマウスから採取した。血清試料を調製し、２つのＥＬＩＳＡアッセイによって分析した。ＧＬＰ−１アッセイでは、コンジュゲートをエキセンジン４ Ｃ末端特異的抗体によって捕捉し、ＧＬＰ−１ Ｎ末端特異的ｍＡｂによって検出した。ＦＧＦ２１アッセイでは、コンジュゲートを抗Ｉｄ抗体で捕捉し、ＦＧＦ２１ ｍＡｂによって検出した。ＰＫパラメータの推定値を表４３に要約する。
Figure 0006165168
体重およびグルコースＡＵＣ。ＡＢＣ−１のインビボ効力を、ｏｂ／ｏｂマウスにおける単回投与試験で評価した。化合物を１または３ｍｇ／ｋｇで０日目にＳＣで投与し、３日目にＯＧＴＴを行った。ＡＢＣ−１は、単回投与して３日後に、１および３ｍｇ／ｋｇで体重を有意に低減し、３ｍｇ／ｋｇで糖耐性を有意に改善した（表４４）。
Figure 0006165168
インビボでの異なるＡＢＣ分子の比較。２種の非対称二官能性分子（ＡＢＣ）ＡＢＣ分子、ＡＢＣ−１およびＡＢＣ−２を比較した。両ＡＢＣは、式：［配列番号１０−Ｌ１］１−［Ａｂ］−［Ｌ１−配列番号６４］１を有する。両ＡＢＣは、抗体として１つのバージョンのｈ３８Ｃ２を含む。ＡＢＣ−１は、ｈ３８Ｃ２のＩｇＧ１バージョンを含み（配列番号２５および２６）、ＡＢＣ−２は、ｈ３８Ｃ２のＩｇＧ２バージョンを含む（配列番号２５および７６）。ＡＢＣ−１およびＡＢＣ−２のインビトロ効力の比較を、細胞ベースアッセイ（ＦＧＦ２１アームについてＧｌｕｔ１アッセイ、およびＧＬＰ−１アームについてｃＡＭＰアッセイ）で評価し、これらは、同等の活性を示した。
ＡＢＣ−２の薬物動態を、雄Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（２２〜２４ｇ）で評価した。マウスに３ｍｇ／ｋｇで化合物をＩＶおよびＳＣ投与し、血液試料を、最大１２０時間の異なる時点で、時点ごとに３匹のマウスから採取した。血清試料を調製し、２つのＥＬＩＳＡアッセイによって分析した。ＧＬＰ−１アッセイでは、コンジュゲートを抗Ｉｄ抗体によって捕捉し、ＧＬＰ−１ Ｎ末端特異的ｍＡｂによって検出した。ＦＧＦ２１アッセイでは、コンジュゲートを抗Ｉｄ抗体で捕捉し、ＦＧＦ２１ ｍＡｂによって検出した。ＰＫパラメータの推定値を、表４５に要約する。
Figure 0006165168
ＡＢＣ−１およびＡＢＣ−２のインビボ効力を、ｏｂ／ｏｂマウスにおける単回投与試験で評価した。化合物を０．３または３ｍｇ／ｋｇで０日目にＳＣで投与し、３日目にＯＧＴＴを行った。両化合物は、３ｍｇ／ｋｇで、単回投与して３日後に、有意に体重を低減し、糖耐性を改善した（表４６）。
Figure 0006165168
（実施例６３）
カニクイザルにおけるＡＢＣインビボアッセイ
ＡＢＣ−１の薬物動態はまた、３ｍｇ／ｋｇの用量レベルで単回ＩＶおよびＳＣボーラス投与した後、雄カニクイザルにおいて調査した。血液試料を、最大２１日の指定時点で動物から収集した。血清試料を調製し、２つのＥＬＩＳＡアッセイによって分析した。ＧＬＰ−１アッセイでは、コンジュゲートをエキセンジン４ Ｃ末端特異的抗体によって捕捉し、ＧＬＰ−１ Ｎ末端特異的ｍＡｂによって検出した。ＦＧＦ２１アッセイでは、コンジュゲートを抗Ｉｄ抗体で捕捉し、ＦＧＦ２１ ｍＡｂによって検出した。ＰＫパラメータの推定値を、表４７に要約する。
Figure 0006165168
（実施例６４）
ＡＢＣ−１の投与効力
ＡＢＣ−１の反復投与効力。ＡＢＣ−１の反復投与効力を、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、Ａｂ−［配列番号１０−Ｌ１］２（Ａｂ［ＦＧＦ２１］２とも呼ばれる）およびＡｂ［Ｌ１−配列番号６４］２（Ａｂ［Ｅｘ４］２とも呼ばれる）と比較して評価した。化合物を、０日目および７日目に投与した。体重を毎週２回測定し、ＯＧＴＴを１０日目に行った。１１日目に、肝臓、膵臓、および血清の試料を収集し、脂質および免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を行った。ＡＢＣ−１（１０ｍｇ／ｋｇ）は、これらのマウスにおいて、２回目の投与の３日後に、ビヒクル処置群と比較して体重増加を有意に低減し、また、２回目の投与の３日後に、単剤単独より大きい程度に、空腹時血中グルコースレベルを正常化し、糖耐性を有意に改善した（表４８）。さらに、ＡＢＣ−１は、血清トリグリセリドおよびコレステロールレベルを有意に低下させ、肝臓トリグリセリド含量を、ビヒクル処置群と比較して約４３％低減した（表４９）。膵臓では、ＩＨＣによって分析して２．７倍のβ細胞質量の著しい増加が、ＡＢＣ−１処置マウスで観察された（表４９）。
Figure 0006165168
Figure 0006165168
ｄｂ／ｄｂマウスにおける単剤Ａｂ［ＦＧＦ２１］２およびＡｂ［Ｅｘ４］２と比較したＡＢＣ−１での追加の反復投与効力データを収集することによって、膵臓機能およびβ細胞質量に対するこの分子の効果をより良好に明確化した。化合物を０日目および７日目に投与し、ＯＧＴＴを１０日目に行った。ＯＧＴＴの１５分の時点で、血液を収集し、グルコース刺激性血漿インスリン分泌の測定を行った。１１日目に、膵臓試料を収集し、生化学的および免疫組織化学的分析を行った。すべての処置は、ビヒクル処置対照と比較して糖耐性を有意に改善した。グルコース誘導インスリン分泌およびインスリン免疫反応性細胞（％ＰＣＮＡ陽性β細胞）の増殖の増大の相乗作用が、最高用量のＡＢＣ−１（１０ｍｇ／ｋｇ）を例外として、ビヒクル処置対照と比較して、すべての処置群で観察された。したがって、試験したＡＢＣ−１のより低い用量で、膵臓に対する化合物の効果は、単剤のものと一致する。予想外に、ＡＢＣ−１の１０ｍｇ／ｋｇの用量は、β細胞増殖またはグルコース刺激性インスリン分泌の有意な増大を伴わない、インスリン免疫反応性染色（β細胞質量）および膵インスリン含量の増大と関連していた。これらのデータは、より大きい体重減少に関連するＡＢＣ−１の用量で（上記表４８および以下のＤＩＯマウスにおける試験を参照）、インスリン感作性効果が、β細胞の増殖およびインスリン分泌の原動力に優先し、既存のβ細胞中のインスリン蓄積をもたらすことを示唆する。
Figure 0006165168
亜慢性投与効力。ＡＢＣ−１の亜慢性投与効力を、ＤＩＯマウスにおいて、Ａｂ［ＦＧＦ２１］２およびＡｂ［ＥＸ４］２と比較して評価した（結果を表５１に示す）。すべての化合物を毎週１回ＳＣ投与し、体重および食物摂取量を毎週２回測定し、３回目の毎週投与の３日後である１７日目にＯＧＴＴを行った。２０日目に、肝臓および血清の試料を収集し、脂質分析を行った。ＡＢＣ−１は、有意にかつ用量依存的に体重を低減させた。３ｍｇ／ｋｇで、ＡＢＣ−１は、同じ用量の単剤単独より大きい体重減少を生じさせた。ＡＢＣ−１は、最大３ｍｇ／ｋｇのＡｂ［ＥＸ４］２の量まで食物摂取を阻害し、ＡＢＣ−１のＧＬＰ−１効果を示した。しかし、食物摂取阻害の量は、ＡＢＣ−１によって生じる大きい体重減少を説明することができず、ＡＢＣ−１誘導体重減少は、ＦＧＦ２１アームおよびＧＬＰ−１アームの両方の組合せに起因しなければならないことを示唆する。すべてのＡＢＣ処置群は、３回目の毎週投与の３日後に、空腹時血中グルコースレベルを有意に低下させ、糖耐性を改善し、３回目の毎週投与の６日後に、肝臓トリグリセリド含量も有意に低減させた。ｄｂ／ｄｂマウスにおいて観察されたものと同様に、毎週１回ＡＢＣ−１で処置すると、ＤＩＯマウスにおいて血清コレステロールレベルが有意に低減し、一方、単剤のいずれもあまり効果がなかった。
Figure 0006165168
効果の持続時間。インビボでのＡＢＣ−１の効果の持続時間を判定するために、単回投与効力試験をＤＩＯマウスにおいて行った。３ｍｇ／ｋｇのＡＢＣ−１を０日目にＳＣ投与し、体重を毎日測定し、１３日目にＯＧＴＴを行った。ＡＢＣ−１は、ＤＩＯマウスにおいて単回投与して最大１３日目まで、体重減少を生じさせ、維持すること、および糖耐性を改善することにおいて持続的効力を実証した。
Figure 0006165168
Figure 0006165168
インビボで、Ａｂ［ＦＧＦ２１］２およびＡｂ［Ｅｘ４］２単独、ならびに２つの物理的組合せと比較したＡＢＣ−１の効果の持続時間を判定するために、単回投与効力試験をＤＩＯマウスにおいて行った。すべての化合物を０日目にＳＣ投与し、体重を毎週２回測定し、７日目、１３日目、および２１日目にＯＧＴＴを行った。結果を表５４に示す。ＡＢＣ−１は、ＤＩＯマウスにおいて、単回投与して最大２１日目まで、体重減少を生じさせ、維持すること、および糖耐性を改善することにおいて持続的効力を実証した。ＡＢＣ−１誘導体重減少は、単剤単独より大きく、Ａｂ［ＦＧＦ２１］２およびＡｂ［Ｅｘ４］２を一緒にした組合せと同等であった。しかし、組合せ群におけるＯＧＴＴの間のグルコースＡＵＣは、ビヒクル処置群のレベルまで戻り、一方、ＡＢＣ−１処置群のグルコースＡＵＣは、ビヒクル処置群より依然として有意に下がっていた。これらのデータは、単剤単独、および２つの物理的組合せに対して、ＡＢＣ−１の優れた、かつ持続的な効力を示す。インビボでのＡＢＣ−１の持続的効力は、化合物の毎週１回の投与を支える。
Figure 0006165168
亜慢性投与効力。ＡＢＣ−１の亜慢性投与効力も、ＤＩＯマウスにおいて、Ａｂ［ＦＧＦ２１］２およびＡｂ［Ｅｘ４］２の物理的組合せと比較して評価した（表５５）。すべての化合物を毎週１回、ＳＣ投与した。体重を毎週２回測定し、３回目の毎週投与の３日後にＯＧＴＴを行った。ＡＢＣ−１は、同じ総量の用量またはインビトロ効力に匹敵する同様の用量の組合せ群と同様の程度に、有意に体重減少を低減させ、糖耐性を改善した。
Figure 0006165168
ＡＢＣ−１で処置することによって誘導される体重増加のより大きい規模の低減が、単剤Ａｂ［ＦＧＦ２１］２またはＡｂ［Ｅｘ４］２によって誘導されるものより、食物摂取量のより大きい低減の非存在下で観察された（表５１および５５を参照）。間接的な熱量測定試験をＤＩＯマウスにおいて行うことによって、単剤と比較したＡＢＣ−１によって誘導される追加の体重減少が、エネルギー消費量の増大に起因するか否かを判定した。化合物を０日目および７日目にＳＣ注射し、２回目の投与直後から始めて４８時間連続的にパラメータを評価した。Ａｂ［Ｅｘ４］２（１ｍｇ／ｋｇ）は、Ｏ２消費、ＣＯ２産生、熱産生、または呼吸商を変化させなかった。Ａｂ［ＦＧＦ２１］２（１０ｍｇ／ｋｇ）は、Ｏ２消費、ＣＯ２産生、および熱産生を増大させたが、呼吸商を変化させなかった。予想外に、Ｏ２消費、ＣＯ２産生、および熱産生に対するＡＢＣ−１（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果は、Ａｂ［ＦＧＦ２１］２（１０ｍｇ／ｋｇ）のものと同等であり、それ以下であった。したがって、ＡＢＣ−１によって誘導される体重減少の増大は、単剤の効果より大きいエネルギー消費量の増大によって説明することができない。
（実施例６５）
遺伝子アレイ分析
肝臓および白色脂肪組織中のより広い数の候補を調べることによって、ＡＢＣ−１によって誘発される体重減少の増大の機構を解明するために、遺伝子アレイ分析を行った。ＤＩＯマウスに、ＡＢＣ−１（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ａｂ［ＦＧＦ２１］２（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはＡｂ［Ｅｘ４］２（３ｍｇ／ｋｇ）を３週間にわたって毎週１回投与し、ＡＢＣ−１処置によって差別的に制御されるが、Ａｂ［ＦＧＦ２１］２またはＡｂ［Ｅｘ４］２によって差別的に制御されない遺伝子を同定した。アレイによって評価した４５０００超の遺伝子のうち、引き続くｑＰＣＲ分析により、ＡＢＣ−１で処置したマウスの肝臓中のサブセット遺伝子の選択的な上方制御または下方制御が確認されたが、Ａｂ［ＦＧＦ２１］２またはＡｂ［Ｅｘ４］２で処置したマウスにおいて確認されなかった（表５６）。同定された遺伝子のいくつかは、特に予期されていなかった。これらは、Ａｂ［ＦＧＦ２１］２またはＡｂ［Ｅｘ４］２によって予測されないＡＢＣ−１治療剤の新規の作用機序を示唆する（例えば、Ａｃｏｔ３、Ｓａａ１／２）。これらの遺伝子は、有用な予測的薬力学的マーカーでもあり得る。
Figure 0006165168
したがって、いくつかの態様では、本発明は、代謝異常を治療するための患者の適性を評価または判定する方法であって、Ａｂｃｄ２、Ａｃｏｔ３、Ｃｉｄｅａ、Ｃｙｐ２ｂ９、Ｃｙｐ４ａ１４、Ｆｍｏ２、Ｇｓｔｍ５、Ｈｍｇｃｒｋ、Ｋｌｂ、Ｌｅｐｒ、Ｓａａ１／２、Ｓｃｄ１、およびＳｒｅｂｆ２からなる群から選択される１種または複数の遺伝子の遺伝子発現レベルを測定するステップと、この遺伝子発現レベルを、処置の初期期間後のそれぞれの遺伝子発現レベルと比較するステップとを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、遺伝子は、Ａｃｏｔ３およびＳａａ１／２からなる群から選択される。遺伝子発現の測定は、インビトロであってもよい。遺伝子発現の測定は、体外であってもよい。
いくつかの態様では、本発明は、Ａｂｃｄ２、Ａｃｏｔ３、Ｃｉｄｅａ、Ｃｙｐ２ｂ９、Ｃｙｐ４ａ１４、Ｆｍｏ２、Ｇｓｔｍ５、Ｈｍｇｃｒｋ、Ｋｌｂ、Ｌｅｐｒ、Ｓａａ１／２、Ｓｃｄ１、およびＳｒｅｂｆ２からなる群から選択される遺伝子の相対的は発現レベルを判定する方法であって、本発明の化合物、またはＦＧＦ２１−受容体アゴニストおよび／もしくはＧＬＰ１−受容体アゴニストの一方もしくは両方で処置する前後に遺伝子発現レベルを測定するステップを含む、方法を提供する。次いでこのような判定を、臨床的行動方針を推奨するのに使用することができる。
いくつかの態様では、本方法は、肝臓中の前記遺伝子の発現を測定するステップを含む。いくつかの態様では、本方法は、本発明の化合物で処置する結果として体重を減らす患者の可能性を評価する方法であって、本発明の化合物、またはＦＧＦ２１−受容体アゴニストおよび／もしくはＧＬＰ１−受容体アゴニストで処置する結果として、患者が体重減少を経験する可能性がより高いことを示唆するために、Ａｃｏｔ３の発現の増大および／またはＳａａ１／２の発現の減少を利用する、方法に関する。
（実施例６６）
ｈ３８Ｃ２−［配列番号７−Ｌ１］２＆ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］２の安定性
ｈ３８Ｃ２−［配列番号７−Ｌ１］２（Ａｂ−［ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ−Ｌ１］２）およびｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］２（Ａｂ−［ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ−Ｌ１］２）の様々な製剤を調製し、一連のストレス条件にかけた（完全な詳細は、ＵＳ２０１１／１３２８９５３３、ＵＳ６１／５７９，６０９、およびＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５４８７４にあり、これらの内容のそれぞれ、特に実施例７２〜７６は、本明細書によって参照され、組み込まれている）。いくつかの安定性試験、例えば、外観アッセイ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、画像化キャピラリー電気泳動（ｉＣＥ）、および分析的超遠心分離法などのデータを比較して、Ａｂ−［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ］２の全体的な安定性プロファイルは、Ａｂ−［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ｈ１２５Ｃ］２より優れていると思われた。製剤のｐＨを下げると（例えば、アセテート、ｐＨ４）、より高いｐＨ（例えば、ｐＨ６〜８）と比較してより良好な安定性がもたらされることも明白である。
（実施例６７）
［ＦＧＦ２１−Ｌ１］１−［Ａｂ］−［Ｌ１−Ｅｘ４］１およびＡｂ−［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ］２の製剤
液体製剤を本発明の化合物とともに使用することができるが、凍結乾燥製剤は、より長い寿命の安定性をもたらし得る（その内容のそれぞれが本明細書に組み込まれている、ＵＳ２０１１／１３２８９５３３、ＵＳ６１／５７９，６０９、およびＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５４８７４の実施例７２〜７６を参照）。したがって、いくつかの態様では、本発明は、約０．１〜約２００ｍｇ／ｍｌの間のＡＢＣまたはＡｂ−［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ］２、および約４〜約５．５の間のｐＨの約１〜１５０ｍＭの間の乳酸または酢酸ナトリウム；および以下、すなわち、
（ｉ）約１０〜約１５０ｍｇ／ｍｌの間の凍結保護物質、
（ｉｉ）約０．００１〜約１．０ｍｇ／ｍｌの間のキレーター、
（ｉｉｉ）約０．０１〜約１０ｍｇ／ｍｌの間の抗酸化剤、
（ｉｖ）約０．０２〜２．０ｍｇ／ｍＬの間の界面活性剤
のうちの少なくとも１つを含む製剤を提供する。
いくつかの態様では、本発明の製剤は、（ｉ）〜（ｉｖ）の２種以上を含む。いくつかの態様では、本発明の製剤は、（ｉ）〜（ｉｖ）の３種以上を含む。いくつかの態様では、本発明の製剤は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）を含む。
いくつかの態様では、本発明は、
（ｉ）約０．１〜約２００ｍｇ／ｍｌの間のＡＢＣ、
（ｉｉ）約４〜約５．５の間のｐＨの約１〜１５０ｍＭの間の乳酸；および
（ｉｉｉ）約１０〜約１５０ｍｇ／ｍｌの間の凍結保護物質、
（ｉｖ）約０．０２〜２．０ｍｇ／ｍＬの間の界面活性剤
を含む凍結乾燥製剤を提供する。
いくつかの態様では、凍結乾燥製剤は、約０．００１〜約１．０ｍｇ／ｍｌの間のキレーターをさらに含むことができる。キレーターは、ＥＤＴＡまたはＤＴＰＡとすることができ、約０．０２〜約０．５ｍｇ／ｍＬの間の量で存在し得る。キレーターは、約０．０５ｍｇ／ｍＬの量で存在し得る。
いくつかの態様では、凍結乾燥製剤は、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｍｌの間の抗酸化剤をさらに含むことができる。いくつかの態様では、抗酸化剤は、Ｌ−メチオニンとすることができる。抗酸化剤は、約０．０２〜約５ｍｇ／ｍＬの間の量で存在し得る。抗酸化剤は、約０．０５〜約０．２ｍｇ／ｍＬの間の量で存在し得る。抗酸化剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬの量で存在し得る。
いくつかの態様では、ＡＢＣは、本明細書に記載される本発明の化合物である。いくつかの態様では、ＡＢＣは、特定の種［配列番号５６−Ｌ１］１−ｈ３８Ｃ２−［配列番号１０−Ｌ１］１である。いくつかの態様では、ＡＢＣは、約５ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの間の量で存在する。いくつかの態様では、ＡＢＣは、約５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの間の量で存在する。いくつかの態様では、ＡＢＣは、約５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの間の量で存在する。いくつかの態様では、ＡＢＣは、約１０ｍｇ／ｍｌの量で存在する。
いくつかの態様では、乳酸は、約１〜約１００ｍＭの間の量で存在する。いくつかの態様では、乳酸は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の量で存在する。いくつかの態様では、乳酸は、約３０ｍＭの量で存在する。ｐＨは、約４．３〜約５．３の間とすることができる。ｐＨは、約４．８±０．５であってもよい。ｐＨは、約４．８とすることができる。
いくつかの態様では、凍結保護物質は、トレハロース二水和物、スクロース、およびマンニトールからなる群から選択される。凍結保護物質は、トレハロース二水和物とすることができる。凍結保護物質は、約５０〜約１２０ｍｇ／ｍｌの間の量で存在することができる。凍結保護物質は、約９０ｍｇ／ｍｌの量で存在することができる。
いくつかの態様では、界面活性剤は、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、およびポロキサマーからなる群から選択することができる。界面活性剤は、ポリソルベート２０とすることができる。いくつかの態様では、界面活性剤は、約０．０５〜約１．０ｍｇ／ｍＬの間の量で存在する。いくつかの態様では、界面活性剤は、約０．１〜約０．５ｍｇ／ｍＬの量で存在する。いくつかの態様では、界面活性剤は、約０．２ｍｇ／ｍＬの量で存在する
いくつかの態様では、本発明は、以下、すなわち、
（ｉ）約１０ｍｇ／ｍＬのＡＢＣ、
（ｉｉ）ｐＨ４．８±０．５の約３０ｍＭの乳酸、
（ｉｉｉ）約９０ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物、
（ｉｖ）約０．０５ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物、
（ｖ）約０．１ｍｇ／ｍＬのＬ−メチオニン、および
（ｖｉ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０
を含む凍結乾燥に適した製剤を含む。
上記（実施例６６および６７のすべて）も、Ａｂ−［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ］２を含む製剤に関する。したがって、いくつかの態様では、本発明は、
（ｉ）約０．１〜約２００ｍｇ／ｍｌの間のＡｂ−［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ］２、
（ｉｉ）約４〜約５．５の間のｐＨの約１〜１５０ｍＭの間の乳酸、および
（ｉｉｉ）約１０〜約１５０ｍｇ／ｍｌの間の凍結保護物質、
（ｉｖ）約０．０２〜２．０ｍｇ／ｍＬの間の界面活性剤
を含む凍結乾燥製剤を提供する。
本発明は、優れた再構成時間（すなわち、再構成により短い時間を要する）および患者に優しい用量調製法をもたらす、凍結乾燥した粉末またはケーキのより望ましい性質（例えば、フワフワ感、多孔度）を得るために、所望の量で（例えば、２倍、３倍）出発製剤を前希釈した後に凍結乾燥されている凍結乾燥製剤も提供する。本発明は、より小さいまたはより大きい体積の希釈剤（例えば、３倍、２倍、１倍、０．５倍、０．３３倍、０．２５倍）をそれぞれ添加することによって、凍結乾燥前（ｐｒｅ−ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ（凍結乾燥前（ｐｒｅ−ｌｙｏ））の液体製剤の組成と比較して、より高いまたはより低い濃度の成分（例えば、０．３３倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、４倍）で再構成することができる凍結乾燥製剤も提供する。希釈剤の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、デキストロース溶液（例えば、５％）、または医薬品、酵素、界面活性剤、糖などを含有する水溶液である。
いくつかの態様では、本発明は、以下の製剤、すなわち、
（ｉ）約１０〜約６０ｍｇ／ｍＬの間のＡｂ−［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ］２、
（ｉｉ）ｐＨ４．８±０．５の約５〜約３０ｍＭの間の乳酸、
（ｉｉｉ）約１０〜約９０ｍｇ／ｍＬの間のトレハロース二水和物、
（ｉｖ）約０．０１〜約０．１ｍｇ／ｍＬの間のＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物、
（ｖ）約０．０１〜０．１ｍｇ／ｍＬの間のＬ−メチオニン、および
（ｖｉ）約０．０４〜約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０
を含む。
いくつかの態様では、本発明は、以下の製剤、すなわち、
（ｉ）約１０〜約２０ｍｇ／ｍＬの間のＡｂ−［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ］２、
（ｉｉ）ｐＨ４．８±０．５の約１０ｍＭの乳酸、
（ｉｉｉ）約３０ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物、
（ｉｖ）約０．０１７ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物、
（ｖ）約０．０３３ｍｇ／ｍＬのＬ−メチオニン、および
（ｖｉ）約０．０６７ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０
を含む。
いくつかの態様では、本発明は、以下の製剤、すなわち、
（ｉ）約１５〜約３０ｍｇ／ｍＬの間のＡｂ−［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ］２、
（ｉｉ）ｐＨ４．８±０．５の約１５ｍＭの乳酸、
（ｉｉｉ）約４５ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物、
（ｉｖ）約０．０２５ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物、
（ｖ）約０．０５ｍｇ／ｍＬのＬ−メチオニン、および
（ｖｉ）約０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０
を含む。
いくつかの態様では、本発明は、以下の製剤、すなわち、
（ｉ）約１０〜約５０ｍｇ／ｍＬの間のＡｂ−［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ］２、
（ｉｉ）ｐＨ４．８±０．５の約３０ｍＭの乳酸、
（ｉｉｉ）約９０ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物、
（ｉｖ）約０．０５ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物、
（ｖ）約０．１ｍｇ／ｍＬのＬ−メチオニン、および
（ｖｉ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０
を含む。
いくつかの態様では、本発明は、以下の製剤、すなわち、
（ｉ）約１０〜約３０ｍｇ／ｍＬの間のＡｂ−［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ］２、
（ｉｉ）ｐＨ４．８±０．５の約１５ｍＭの乳酸、
（ｉｉｉ）約４５ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物、
（ｉｖ）約０．０２５ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物、
（ｖ）約０．０５ｍｇ／ｍＬのＬ−メチオニン、および
（ｖｉ）約０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０
を含む。
いくつかの態様では、本発明は、以下の製剤、すなわち、
（ｉ）約２０〜約６０ｍｇ／ｍＬの間のＡｂ−［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ］２、
（ｉｉ）ｐＨ４．８±０．５の約３０ｍＭの乳酸、
（ｉｉｉ）約９０ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物、
（ｉｖ）約０．０５ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物、
（ｖ）約０．１ｍｇ／ｍＬのＬ−メチオニン、および
（ｖｉ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０
を含む。
いくつかの態様では、本発明は、以下の製剤、すなわち、
（ｉ）約１０〜約５０ｍｇ／ｍＬの間のＡｂ−［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ］２、
（ｉｉ）ｐＨ４．８±０．５の約３０〜６０ｍＭの乳酸、
（ｉｉｉ）約９０〜１８０ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物、
（ｉｖ）約０．０５〜０．１ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物、
（ｖ）約０．１〜０．２ｍｇ／ｍＬのＬ−メチオニン、および
（ｖｉ）約０．２〜０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０
を含む。
いくつかの態様では、本発明は、以下の製剤、すなわち、
（ｉ）約５〜約２５ｍｇ／ｍＬの間のＡｂ−［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ］２、
（ｉｉ）ｐＨ４．８±０．５の約３０ｍＭの乳酸、
（ｉｉｉ）約９０ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物、
（ｉｖ）約０．０５ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物、
（ｖ）約０．１ｍｇ／ｍＬのＬ−メチオニン、および
（ｖｉ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０
を含む。
いくつかの態様では、本発明は、以下の製剤、すなわち、
（ｉ）約１０〜約５０ｍｇ／ｍＬの間のＡｂ−［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ］２、
（ｉｉ）ｐＨ４．８±０．５の約３０ｍＭの乳酸、
（ｉｉｉ）約９０ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物、
（ｉｖ）約０．０５ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物、
（ｖ）約０．１ｍｇ／ｍＬのＬ−メチオニン、および
（ｖｉ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０
を含む。
いくつかの態様では、本発明は、以下の製剤、すなわち、
（ｉ）約５〜約２５ｍｇ／ｍＬの間のＡｂ−［Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ］２、
（ｉｉ）ｐＨ４．８±０．５の約１５ｍＭの乳酸、
（ｉｉｉ）約４５ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物、
（ｉｖ）約０．０２５ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物、
（ｖ）約０．０５ｍｇ／ｍＬのＬ−メチオニン、および
（ｖｉ）約０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０
を含む。
上記製剤のそれぞれは、本明細書で記載される追加の要素も含むことができる。さらに、上記製剤のそれぞれは、より小さい体積で引き続いて凍結乾燥および再構成するのに適している場合もある。いくつかの態様では、製剤は、約２倍〜約３倍の間で濃縮することができる。
（実施例６８）
［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］の安定性
［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］の様々な製剤を、１０ｋＤａの分子量カットオフ透析カセットを使用して緩衝液交換によって調製し、次いで滅菌濾過した（すべての実験は、ＡＢＣ−１を使用した）。製剤を様々なストレス条件に曝した（表５７を参照）。次いで、外観アッセイ、ＵＶ（紫外吸光度）、およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して試料を分析した。試料を様々な時点（表５７）で分析することによって、安定性傾向を評価した。
外観アッセイ
濁度は、様々な温度で貯蔵した後、増大する：２０ｍＭの乳酸および２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ５．８の製剤（製剤ＣおよびＤ）はともに、４０℃で１週間の貯蔵、または２５℃で２週間、または４０℃で２週間の後、濁度が増大することを示した。これらのデータは、製剤ＣおよびＤは、［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］の製剤の不安定性をもたらすことを示唆する。ストレスをかけたとき、酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０およびグルタミン酸、ｐＨ４．０はともに、貯蔵条件にかかわらず、濁度の増大をまったく示さなかった。
ＵＶの有意な変化は、経時的にまったく観察されず、表５７に列挙した製剤のいくつかにおいて粒状物形成が観察されても、タンパク質の正味の濃度は、経時的に有意に影響されなかったことを示す。
高分子量種（ＨＭＷ）形成
ＳＥ−ＨＰＬＣを使用することによって、表５７に列挙した様々な製剤についてＨＭＷ形成を測定した。ＳＥ−ＨＰＬＣは、ＨＭＷを確実に分離することができ、［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］にとって重要な安定性指示アッセイである。ＳＥ−ＨＰＬＣアッセイにおけるＨＭＷは、［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］ピークの前に溶出する化学種として定義される。両候補についての２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ５．８および２０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ８．０中の製剤は、ＨＭＷＳの高い初期形成および時間依存形成を示した。経時的なタンパク質製剤の非線形凝集傾向は、文献で公知である。２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０および２０ｍＭのグルタミン酸、ｐＨ４．０中の製剤は、他の製剤と比較したとき、最も少ない量のＨＭＷを示した。したがって、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０および２０ｍＭのグルタミン酸、ｐＨ４．０中の製剤は、ＨＭＷ形成に関して優れた安定性をもたらす。
ＳＥ−ＨＰＬＣによって測定した％ＨＭＷＳ（高分子量種）。ＳＥ−ＨＰＬＣ条件は、Ｔｏｓｏ Ｂｉｏｓｅｐ Ｇ３０００ＳＷＸＬ ５μｍ、７．８×３００ｍｍ ＳＥＣカラム、移動相：２００ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、カラム温度：２５℃、流量：０．３ｍｌ／分（アイソクラチック）、検出：２１４ｎｍにおけるＵＶ吸光度、実行時間：４２分を含む。
（実施例６９）
［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］のｐＨ−緩衝液スクリーニング
様々な水性緩衝液中の［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］の安定性を、凍結乾燥することもできる適切な安定化媒体を見つける目的で調査した（すべての実験は、ＡＢＣ−１を使用した）。実施例６８では、本発明の化合物は、ｐＨ４．０の酢酸ナトリウムおよびグルタミン酸中で最も安定であるという意外な結果が実証された。しかし、酢酸ナトリウムは昇華し、したがって、凍結乾燥した緩衝液中に組み込むことが困難である。したがって、凍結乾燥製剤中で最適な長期安定性をもたらす、本発明の化合物の代替の緩衝液を開発する必要性が存在する。リンカーの不安定性、およびタンパク質成分の任意の加水分解性切断（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）は、低分子量種（ＬＭＷ）の生成をもたらす。さらに、コンジュゲートが試験した製剤中で凝集する場合、高分子量種が形成され得る。製剤を、７〜９ｍｇ／ｍＬの範囲内の目標タンパク質濃度で、緩衝液交換によって調製して所望の製剤にした。製剤を、０．２μｍフィルターを使用して濾過し、ガラスバイアル中に包装し、所望の温度で貯蔵した。指定時点で、試料をアッセイした。
外観アッセイ
濁度は、様々な温度および条件で貯蔵した後増大する：２０ｍＭのクエン酸（すべてのｐＨ）および２０ｍＭのコハク酸（ｐＨ４．８超）の製剤（製剤Ａ〜Ｃ、ＫおよびＬ）はともに、２５℃で２週間または３０℃で２週間貯蔵した後、濁度が増大することを示した。ストレスをかけたとき、グルタミン酸および乳酸試料はともに、貯蔵条件にかかわらず、最低の濁度増大を示した。
クエン酸試料を例外として、ＵＶの著しい変化は、経時的にまったく観察されず、粒子形成が表５７に列挙した製剤のいくつかに観察されても、タンパク質の正味の濃度は、経時的に有意に影響されないことを示した。
ＳＥ−ＨＰＬＣによるＨＭＷ測定およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＬＭＷモニタリング
緩衝液およびｐＨの顕著な効果を、２週間にわたる温度ストレスの後に観察した。データを表５９に提示する。初期の時点で、ＨＭＷが増大する傾向が、クエン酸製剤およびより高いｐＨの製剤（４．８超）中で見られた。グルタミン酸のｐＨ４．２および４．５の製剤は、％ＨＭＷに関して相対的に優れた性能を示した。
ＬＭＷの傾向は、ｐＨに正比例した。３０℃で１週間貯蔵した後、より低いｐＨの製剤は、おそらく断片化に起因して、％ＬＭＷの顕著な増大を示した。グルタミン酸製剤の中で、製剤のｐＨのバランスが、リンカー不安定性およびタンパク質クリッピング（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌｉｐｐｉｎｇ）に起因する過剰な断片化を防止するのに必要とされる。例えば、液体状態での製剤Ｄ、ｐＨ４．２は、他のグルタミン酸製剤と比較して、実質的な断片化を生じる。ｐＨ依存性％ＬＭＷの傾向は、ｐＨ４．５の製剤が適当であることを示唆する（ＳＤＳ ＰＡＧＥによって裏付けられた、データを示さず）。
Figure 0006165168
さらに、グルタミン酸のｐＨ４．５の製剤も使用することによって、コンジュゲートが高濃度で水性緩衝溶媒中に可溶性であるか否かを評価し、高濃度での安定性を評価した。濃度（Ａ２８０）関連増大が、貯蔵後の％ＨＭＷにおいて観察された。結果を表６０に示す。
Figure 0006165168
（実施例７０）
［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］の凍結乾燥製剤
液体製剤を本発明の化合物とともに使用することができるが、凍結乾燥製剤は、より長い寿命の安定性をもたらし得る。実施例６８および６９は、グルタミン酸のみを含む［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］の製剤は、ヒスチジンなどの他の緩衝液より優れていても、望まれるより長期間の使用に適切な安定性をもたらすことができないことを示す（すべての実験は、ＡＢＣ−１を使用した）。凍結保護物質およびリオプロテクタントとして役割を果たす糖またはポリオールなどの様々なタイプの安定剤（例えば、トレハロース、スクロース、マンニトール）、ならびに撹拌安定性のための界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー）、ならびにキレーター（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ）、ならびに抗酸化剤（例えば、Ｌ−メチオニン）とグルタミン酸を組み合わせると、安定性が相乗的に増強される。したがって、組合せは、［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］の安定性を明らかに増強する。
製剤同士間で多様であった目標タンパク質濃度で、緩衝液交換および賦形剤添加によって製剤を調製した（すべての実験は、ＡＢＣ−１を使用した）。調製した製剤を、０．２μｍフィルターを使用して濾過し、ガラスバイアル中に包装した。凍結乾燥製剤を調製するために、バイアルを、凍結乾燥し、ストッパーを付け、キャップを付けた。指定時点で、ＳＥＣ、ｉＣＥ、および還元ｃＧＥを含む様々な分析的方法によって試料をアッセイした。さらに、液体製剤の安定性傾向を評価するために、液体製剤も４週間評価した。凍結乾燥製剤の含水量を凍結乾燥後に試験し、すべて０．５％未満であった。
凍結乾燥製剤を様々な温度ストレス下で貯蔵した。表６１は、指定時点におけるＳＥＣ、ｉＣＥ、および還元ｃＧＥ（キャピラリーゲル電気泳動）データを示す。ｃＧＥにより、タンパク質断片が半定量的に推定される。凍結乾燥製剤は、すべての方面（Δ％ＨＭＷ、Δ％酸性種、およびΔ％Ｆｒａｇ）に対して、これらの液体対応物と比較した場合、より良好な安定性を示した。安定化賦形剤の存在下（凍結保護物質／リオプロテクタントの存在下）でのグルタミン酸（乳酸ナトリウム）の凍結乾燥製剤は、良好な安定性を示した。したがって、凍結乾燥グルタミン酸製剤は、より長期の貯蔵安定性を試験するのに適切であると結論づけられる。最後に、金属キレーター（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ）が、安定性を実現するのに有利であると予期される。
凍結乾燥製剤（ｌｙｏ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）試料を、相対的な生物活性についても試験した。生物活性を、非競合的結合ＥＬＩＳＡ（ＦＧＦ２１）およびＧＬＰ−１エキセンジン効力アッセイ（Ｅｘ４ペプチド）の両方を使用して測定し、基準材料の生物活性に対する相対的な％として表した。生物活性データを表６２に提示する。これらのデータは、Ｌｙｏ製剤の成分によってもたらされる安定性および機能的完全性のさらなる信頼度をもたらす。
（実施例７１）
撹拌に対する［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］の安定性
グルタミン酸／トレハロース／ＥＤＴＡ／ＰＳ８０製剤を、１５ｍｇ／ｍＬの範囲内の標的タンパク質濃度で、緩衝液交換および賦形剤添加をすることによって調製した。調製した製剤を、０．２μｍフィルターを使用して濾過し、ガラスバイアル中に包装した。３００ｒｐｍの速度で軌道振盪機を使用して撹拌を施した。指定時点で、試料をアッセイした。表６３中の結果は、ポリソルベート８０が存在すると、撹拌誘導性不安定性を防止するのに役立つことを実証する（すべての実験は、ＡＢＣ−１を使用した）。
Figure 0006165168
したがって、いくつかの態様では、本発明は、約０．１〜約２００ｍｇ／ｍｌの間の［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］、および約４．０〜約５．０の間のｐＨの約１〜１５０ｍＭの間のグルタミン酸；および以下のうちの少なくとも１つを含む製剤を提供する：
（ｉ）約１０〜約１５０ｍｇ／ｍｌの間の凍結保護物質；
（ｉｉ）約０．００１〜約１．０ｍｇ／ｍｌの間のキレーター；
（ｉｉｉ）約０．０２〜２．０ｍｇ／ｍＬの間の界面活性剤。
いくつかの態様では、本発明の製剤は、（ｉ）〜（ｉｖ）のうちの１つ以上を含む。いくつかの態様では、本発明の製剤は、（ｉ）〜（ｉｖ）のうちの２つ以上を含む。いくつかの態様では、本発明の製剤は、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を含む。
いくつかの態様では、本発明は、
（ｉ）約０．１〜約２００ｍｇ／ｍｌの間のＦＧＦ２１−コンジュゲート、
（ｉｉ）約４．０〜約５．０の間のｐＨの約１〜１５０ｍＭの間のグルタミン酸；および
（ｉｉｉ）約１０〜約１５０ｍｇ／ｍｌの間の凍結保護物質；
（ｉｖ）約０．０２〜２．０ｍｇ／ｍＬの間の界面活性剤
を含む凍結乾燥製剤を提供する。
いくつかの態様では、凍結乾燥製剤は、約０．００１〜約１．０ｍｇ／ｍｌの間のキレーターをさらに含むことができる。キレーターは、ＥＤＴＡまたはＤＴＰＡとすることができ、約０．０２〜約０．５ｍｇ／ｍＬの間の量で存在し得る。キレーターは、約０．０５ｍｇ／ｍＬの量で存在し得る。
いくつかの態様では、［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］は、本明細書に記載される本発明の化合物である。いくつかの態様では、ＦＧＦ２１−Ｅｘ４−コンジュゲートは、［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］である。いくつかの態様では、ＦＧＦ２１−Ｅｘ４−コンジュゲートは、約５ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの間の量で存在する。いくつかの態様では、ＦＧＦ２１−Ｅｘ４−コンジュゲートは、約５ｍｇ／ｍｌ〜約９０ｍｇ／ｍｌの間の量で存在する。いくつかの態様では、ＦＧＦ２１−Ｅｘ４−コンジュゲートは、約５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの間の量で存在する。いくつかの態様では、ＦＧＦ２１−コンジュゲートは、約１０ｍｇ／ｍｌの量で存在する。
いくつかの態様では、グルタミン酸は、約１〜約１００ｍＭの間の量で存在する。いくつかの態様では、グルタミン酸は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの間の量で存在する。いくつかの態様では、グルタミン酸は、約２０ｍＭの量で存在する。ｐＨは、約４．２〜約５．３の間とすることができる。ｐＨは、約４．５±０．５とすることができる。ｐＨは、約４．５であってもよい。
いくつかの態様では、凍結保護物質は、トレハロース二水和物、スクロース、およびマンニトールからなる群から選択される。凍結保護物質は、トレハロース二水和物とすることができる。凍結保護物質は、約５０〜約１２０ｍｇ／ｍｌの間の量で存在し得る。凍結保護物質は、約９０ｍｇ／ｍｌの量で存在してもよい。
いくつかの態様では、界面活性剤は、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、およびポロキサマーからなる群から選択することができる。界面活性剤は、ポリソルベート２０とすることができる。いくつかの態様では、界面活性剤は、約０．０５〜約１．０ｍｇ／ｍＬの量で存在する。いくつかの態様では、界面活性剤は、約０．１〜約０．５ｍｇ／ｍＬの量で存在する。いくつかの態様では、界面活性剤は、約０．２ｍｇ／ｍＬの量で存在する。
いくつかの態様では、本発明は、以下のものを含む、凍結乾燥に適した製剤を含む：
（ｉ）約３０〜約６０ｍｇ／ｍＬの間の［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］、
（ｉｉ）ｐＨ４．５±０．５の約１０〜約６０ｍＭの間のグルタミン酸、
（ｉｉｉ）約５０〜約１００ｍｇ／ｍＬの間のトレハロース二水和物、
（ｉｖ）約０．０１〜約０．０ｍｇ／ｍＬの間のＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物、
（ｖ）約０．１〜約０．３ｍｇ／ｍＬの間のポリソルベート２０。
いくつかの態様では、本発明は、以下のものを含む、凍結乾燥に適した製剤を含む：
（ｉ）約３０ｍｇ／ｍＬの［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］；
（ｉｉ）ｐＨ４．５±０．５の約２０ｍＭのグルタミン酸；
（ｉｉｉ）約８５ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物；
（ｉｖ）約０．０５ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物；
（ｖ）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０。
いくつかの態様では、本発明は、以下のものを含む、凍結乾燥に適した製剤を含む：
（ｉ）約３０ｍｇ／ｍＬの［ＦＧＦ２１］−［第１リンカー］−［抗体］−［第２リンカー］−［Ｅｘ４］；
（ｉｉ）ｐＨ４．５±０．５の約２０ｍＭのグルタミン酸；
（ｉｉｉ）約８．５％のトレハロース二水和物；
（ｉｖ）約０．００５％のＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物；および
（ｖ）約０．０２％のポリソルベート８０。
（実施例７２）
抗体濃縮プロセス
ｈ３８Ｃ２がコンジュゲーションのためにペプチドまたはタンパク質とともにインキュベートされるいくつかの状況では、反応が完了せず、一部の未反応抗体が残る。この現象を調査するための分析的ＨＩＣアッセイ（以下に記載される方法）により、２つの早期に溶出するピーク（一般に、それぞれ約０．６〜１．８％のタンパク質、ならびに１６．９および１９．４％のタンパク質）と、主ピーク（一般に、約７５．２〜７９．５％タンパク質であるが、最大７３．５％および８３．３％タンパク質の変動が観察された）とを分離した。主ピークのタンパク質は、完全に反応性であった一方、ピーク１および２は、非反応性であった。したがって、抗体ｈ３８Ｃ２を精製するための改善されたプロセスを開発する必要性がある。
ＨＩＣ法
このセクションでは、ｈ３８Ｃ２抗体の工程内試料および原薬試料中に存在する異なるアイソフォームのパーセンテージを評価するためのＨＩＣクロマトグラフィーの使用を記載する。これらの種は、Ｌｙｓ−９９位（ｈ３８Ｃ２ １つ当たり２つのＦａｂのそれぞれについて１つ）で、ゼロ（ピーク１）、１つ（ピーク２）、または２つのペプチド（主ピーク）をコンジュゲートすることになる出発材料成分であると考えられる。分離および溶出は、逆相クロマトグラフィーと同様に、この方法における勾配にわたって、有機溶媒（イソプロピルアルコール）を同時に増やしながら減塩勾配によって行い、それにより、移動相についてより多くの疎水性タンパク質の親和性が増大する。ピーク面積を積分して各アイソフォームの相対存在量を求める。
ｈ３８Ｃ２ ＩｇＧ１抗体から、非反応性（Ｐ１、Ｐ２）および反応性ｍＡｂ主ピークを分離するために、ＴＳＫゲルフェニル−５ＰＷカラム（７．５ｍｍ×７５ｍｍ、１０μｍ、ＴＯＳＯＨ）を用いる分析的ＨＩＣ法を展開した。移動相は、Ａ：０．７５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０、およびＢ：５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０、１０％のＩＰＡである。カラムを３５℃で、０．６５ｍｌ／分で実行し、２１４ｎｍで吸光度を測定した。希釈剤（移動相Ａ：水、５０：５０）で試料または標準物質を１ｍｇ／ｍＬに希釈することによって、注射用に１００μｇの試料を調製した。
Figure 0006165168
（実施例７３）
非反応性ｈ３８Ｃ２の増大とのｉＣＥ、Ｍｅｔ−Ｏｘデータ相関
保持試験を、ｈ３８Ｃ２の清澄化済み収穫ブロスを用いて２５℃で実施した。試料を指定時間に凍結させた。試料を解凍し、プロテインＡスピンカラムによって精製し、アッセイに送った。酸性種および酸化種の増大と、非反応性形態のｍＡｂの増大との間に相関があった（表６５）。ｈ３８Ｃ２を非反応性にすることに関与する他の要因があり得るが、酸性種および硫黄部分の酸化が、関与する要因の２つであると思われる。
Figure 0006165168
（実施例７４）
カラム選択
最初に、ＴＳＫゲルフェニル−５ＰＷカラム（１０μＭの粒径）を使用することによって、非反応性形態からコンジュゲート可能なｍＡｂを分離するためのＨＩＣアッセイを展開した。ＴＳＫゲルフェニル−５ＰＷカラム（２０μＭの粒径）をスケールアップすることによって、完全反応性ｈ３８Ｃ２を生成した。カラム能力は、４〜５ｇ／Ｌであり、高圧下で実行した。コンジュゲーション試験のための材料を作製するのに、以下の方法を使用していた。カラムを、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７中の０．５〜１ＭのＮａＣｌで平衡化し、４〜５ｇ／Ｌの樹脂で装填した。カラムを洗浄せず、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０％のＩＰＡ、ｐＨ７を含む溶出緩衝液にさらした。５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７中の、４２〜６０％の溶出緩衝液の直線勾配を、４．８カラム体積（ＣＶ）にわたって展開し、次いで、材料が収集され、吸光度がベースラインレベル付近に戻るまで、それぞれの溶出緩衝液の１００％まで濃度を上昇させた。この方法は、実験室規模備品に十分であったが、より高い装填能力を伴うより高いスループット法を必要とした。様々なＨＩＣ樹脂を考慮または試験した（表６６）。
Figure 0006165168
フェニル５ＰＷ、フェニル６００Ｍ、ブチル６００Ｍ、およびフェニル６５０Ｓクロマトグラフィーについて、平衡化緩衝液は、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０であった。装填物は、同じｐＨおよび伝導率を有する同様の組成に調整した。装填量は、フェニル６００Ｍ（５〜１０ｇ／Ｌ、および２０ｇ／Ｌ）、ＴＳＫゲルフェニル５ＰＷ、およびブチル６００Ｍ上で、４〜５０ｇ／Ｌの樹脂の範囲であった。フェニル６５０Ｓカラム上の装填量は、１５〜２２ｇのｍＡｂ／Ｌの樹脂であった。カラムを５ＣＶの平衡化緩衝液で平衡化させ（表６７）、次いでカラムに装填し、これを１〜２ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄し、次いで０〜２ＣＶの基底緩衝液で洗浄した。２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０％のＩＰＡ、ｐＨ７．０からなる４０〜４３％の溶出緩衝液の１〜２ＣＶの段階勾配でｍＡｂを溶出した。次に、４０〜６３％の溶出緩衝液を用いる５〜１０ＣＶの直線勾配。最後に、カラムを、３〜６ＣＶの溶出緩衝液にさらすことによって、残っているｍＡｂの溶出を保証した。勾配がどのぐらい速く展開されるかに応じて、３〜１５ＣＶの過程にわたってタンパク質を溶出した。収率は、フェニル５ＰＷ、フェニル６００Ｍ、およびブチル６００Ｍ樹脂について０〜４３％であり、生成物の濃度は０．５〜２ｍｇ／ｍＬであった。物質収支は、一般に、約９０〜１００％であった。フェニル６５０Ｓについての結果を以下に記載する。
Figure 0006165168
フェニル５ＰＷ（２０μＭ）樹脂を４ｍｌのカラム内で試験したが、主ピークを濃縮するのに有効ではなく、９０％の反応性ｈ３８Ｃ２を示しただけであった。さらに、フェニル５ＰＷは、２０μｍのビーズサイズで、高圧で動作し、低い能力、約４〜５ｇ／Ｌの樹脂を有するので、スケーラブルでなかった。ブチル６００Ｍカラムに２３ｇ／Ｌで装填したとき、これは、まったく濃縮を達成しなかった。２０ｇ／Ｌで装填したフェニル６００Ｍカラムは、９１〜９２％の主ピークという良好な濃縮を示したが、約４３％の全収率は、約５０％の収率および約９５％の主ピークという好適な最低より低かった。同じカラムを５ｇ／Ｌの樹脂で少なく装填したとき、ピーク画分は、装填材料より低い主ピークを有し、より高いカラム装填量とより高い生成物純度との関係を実証した。次いで、３５μｍのビーズを用いるフェニル６５０Ｓを試験した。ビーズがより小さいと、表面積および結合部位がより多くなり、それにより、より良好な分割がもたらされる。洗浄ステップの塩濃度および持続時間を微調整することによって、抗体の不活性形態のほとんどが排除された一方、より多くの完全反応性（ＦＲ）ｈ３８Ｃ２が樹脂に結合したままであった。最大５７〜５８％の収率、および９２〜９５％の主ピークを含有する生成物プールが得られた。
（実施例７５）
減塩、プラトー、および緩衝液洗浄ステップの展開
生成物の収率および純度を最大にするために、３つの洗浄ステップを展開する間に、いくつかのパラメータを評価した。減塩直線勾配ステップの間に、洗浄の傾き、持続時間、および最終濃度を試験した。この後に、プラトー洗浄（ｐｌａｔｅａｕ ｗａｓｈ）の最適濃度および持続時間、ならびに緩衝液洗浄の最適持続時間を確立する必要があった。いくつかの重要な実験実行の結果を、これらの実験実行の２つからのＨＩＣアッセイデータを比較する表６９とともに、表６８に示す。
Figure 0006165168
Figure 0006165168
フェニル６５０Ｓ実行１４０（表６８）は、実行の洗浄および溶出相の両方で有意な量のタンパク質を示した。これらの初期の実行では、１０ＣＶにわたる１Ｍ〜０ＭのＮａＣｌの直線勾配を使用した。勾配の後に、２０ｍＭのリン酸ナトリウムの２ＣＶ基底緩衝液洗浄を続けた。これは、非反応性成分を除去し、完全反応性ｈ３８Ｃ２のより許容できる収率を得る潜在性を実証した最初の実行であった。これは、表６９により詳細に示してあり、ここで、画分６（洗浄）は、８６．２％の非反応性ｈ３８Ｃ２を含有するが、１０．２％の主ピークしか含有しない。２０％のＩＰＡで溶出する間に、３画分は、９０％の反応性ｍＡｂを含有し、非反応性ｍＡｂの量は、約１０％に低減された。
フェニル６５０Ｓ実行１４３（表６８）では、８ＣＶにわたって０．７５Ｍ〜０ＭのＮａＣｌ直線勾配を使用した。勾配の後に５ＣＶの基底緩衝液洗浄を続け、それは、以前の実行よりはるかに多くの洗浄相におけるタンパク質を有しており、同時に１１％の低収率であった。この実行から得られた意外にも芳しくない収率に基づいて、この樹脂は、よりしっかりしたタンパク質結合をもたらすのに、塩平衡化から恩恵を受け得ることが仮定された。生成物の損失を最小限にしながら、塩および非反応性ｍＡｂを除去するために十分な体積の基底緩衝液を使用することの間で、バランスをとらなければならないことも仮定された。
後続の実行の多くでは、５ＣＶではなく２〜３体積の基底緩衝液を使用した。フェニル６５０Ｓ実行１５２では、７ＣＶにわたって１Ｍ〜０．３０ＭのＮａＣｌ直線勾配を使用した。勾配の後に、基底緩衝液中０．３０ＭのＮａＣｌを用いた３ＣＶプラトー洗浄、次いで基底緩衝液中０．１０ＭのＮａＣｌを用いた３ＣＶプラトー洗浄を続け、それは、洗浄液中のさらにより少ないタンパク質、および溶出ピークの同時の増大を含み、５３％の収率を示した（表６８）。３００ｍＭのＮａＣｌにおける減塩ステップでのプラトーの開始は、極めて重要な発見であり、それは、最終的に、必要な改善をもたらした。実行１５２からの溶出画分は、９４および９７％の主ピークを含有し（表６９）、この方法が機能することによって、フェニル６５０Ｓ生成物プール中で５０％超の収率および９０％超の主ピークという目的を実現したことを実証した。洗浄画分１０は、３１．５％の主ピークを有し、それは、０．３０Ｍ超のＮａＣｌを用いてプラトー洗浄すると、カラム上により多くの生成物を場合により保持することができることを示した。
フェニル６５０Ｓ実行１５５では、３ＣＶにわたって１Ｍ〜０．３５ＭのＮａＣｌ直線勾配を使用した（表６８）。勾配の後に、基底緩衝液中０．３５ＭのＮａＣｌを用いた３ＣＶプラトー洗浄を続け、それは、以前の実行より低い、４３％の収率をもたらした。一要因は、２倍の装填量の４５ｇ／Ｌをカラムに施したことであった。タンパク質のほとんどは、フロースルーおよび洗浄においてカラムから出て、装填量１６ｇ／Ｌを有効に築いた。より急な傾きの減塩勾配も、より多くの主ピークを洗出し、収率を低減させた。
フェニル６５０Ｓ実行１５９では、７ＣＶにわたって１Ｍ〜０．４４ＭのＮａＣｌ直線勾配を使用した（表６８）。勾配の後に、基底緩衝液中０．４４ＭのＮａＣｌを用いた４ＣＶプラトー洗浄、その後、基底緩衝液中０．３ＭのＮａＣｌを用いた４ＣＶプラトー洗浄、基底緩衝液を用いた２ＣＶプラトー洗浄を続け、それは、以前の実行より低い、５０％の収率をもたらした。しかし、基底緩衝液洗浄を最適化することは、純度および収率の両方を最大することに役立つ別の重要発見であった。
フェニル６５０Ｓ実行１６７では、７ＣＶにわたって１Ｍ〜０．３ＭのＮａＣｌ直線勾配を使用した（表６８）。勾配の後に、基底緩衝液中０．３ＭのＮａＣｌを用いた８ＣＶプラトー洗浄、その後、基底緩衝液を用いた２ＣＶプラトー洗浄を続けた。収率は、５１％であった。０．３ＭのＮａＣｌ洗浄の濃度がより大きくなっていれば、収率がより大きくなった可能性があると仮定された。
フェニル６５０Ｓ実行１７１では、７ＣＶにわたって１Ｍ〜０．３３ＭのＮａＣｌ直線勾配を使用した（表６８）。勾配の後に、基底緩衝液中０．３３ＭのＮａＣｌを用いた６ＣＶプラトー洗浄、その後、基底緩衝液を用いた２ＣＶ洗浄を続け、それは、５７％の収率をもたらした。
最終プロセス開発実行を行うことによって、２０ｍＭのリン酸塩洗浄の間のＮａＣｌを排除するための条件を微調整した。洗浄ステップをいくつかの実験の過程にわたって確立し、洗浄ステップにおける最終微調整を、実行１７１および１８５に示したように完了し（表６８）、それにより、非反応性ｍＡｂのほとんどが溶出された。カラムに装填し、これを１ＣＶの１ＭのＮａＣｌ緩衝液で洗浄した後、７ＣＶにわたる１〜０．３３ＭのＮａＣｌ直線勾配により、非反応性ｍＡｂが効率的に除去された。５〜６ＣＶにわたる０．３３ＭのＮａＣｌのプラトー洗浄により、非反応性材料をカラムから完全に洗出することが可能になった。基底緩衝液を用いた２〜３ＣＶの洗浄は、残っている塩を除去し、カラムを溶出のためにコンディショニングし、最適な方法として確認された。引き続いて、３３Ｌスケールのパイロットプラント実行のために、生成物品質を失うことなく、０．３３ＭのＮａＣｌ洗浄を５ＣＶに低減し、２０ｍＭのリン酸ナトリウムを２ＣＶに低減した。
溶出緩衝液を１４％のＩＰＡから１５％の１，６ヘキサンジオールに変更した。目的は、大規模におけるＩＰＡの可燃性の可能性を排除することであった。通常１．５ＣＶ以内である実験室スケールで高い収率の完全反応性ｈ３８Ｃ２が収集されたので、溶出緩衝液のＩＰＡ濃度を１４％に設定した。ヘキサンジオール溶出緩衝液を、実行１７７において小規模で試験した（表６８）。生成物プールを１．５ＣＶ中に収集し、収率は７３％であり、８８％の主ピークを含有していた。個々の画分を、実験室規模カラム実行のために収集した。プールした画分は一般に、上昇ピーク上で、２００ｍＡＵで、下降ピーク上で、２００〜４００ｍＡＵの間で収集した。ショルダーの生成物品質を点検した後、これらは、主ピークの％が十分に高く、その結果、３３Ｌカラム実行のプールストラテジーは、１００ＡＵ〜１００ｍＡＵの生成物ピークを収集することであった。
（実施例７６）
水性溶出スクリーニング
別の考慮事項は、完全反応性ｈ３８Ｃ２を依然として濃縮しながら、溶出緩衝液中に有機成分を用いることなく溶出することができるカラムを見つけることであった。ｍＡｂが樹脂にそれほどしっかりと結合しないように、より親水性のカラムをこのスクリーニングのために選択した。タンパク質がそれほどしっかりと結合しない状態で、水性緩衝液でｍＡｂを溶出する可能性は、より大きかった。有効な手法であるために、この方法は依然として、完全反応性ｈ３８Ｃ２および非反応性ｈ３８Ｃ２を分離する必要があった。ＰＰＧ６００Ｍ、ブチルＨＰ、およびフェニルＨＰカラムを、本明細書に記載したフェニル６５０Ｓカラムで開発したプロセスに非常に類似した方法を使用して試験した（表７０）。ＰＰＧ６００Ｍ、ブチルＨＰ、およびフェニルＨＰクロマトグラフィー（４ｍＬスケール）について、平衡化緩衝液は、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０であった。装填物を、同じｐＨおよび伝導率を有する同様の組成に調整した。１８〜１９ｇのｍＡｂ／Ｌの樹脂を装填した後、平衡化緩衝液を用いた５ＣＶの洗浄を続けた。次に、１３〜１５ＣＶにわたる２．５Ｍ〜０ＭのＮａＣｌの減塩洗浄、その後、３ＣＶの２０ｍＭのリン酸塩緩衝液。代わりに、１つのブチル実行は、１Ｍ〜０．３ＭのＮａＣｌの減塩洗浄、その後の、３ＣＶの２０ｍＭのリン酸塩緩衝液を有した。５ＣＶの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０％のＩＰＡ、ｐＨ７．０でカラムをストリップした。
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ＰＰＧ６００Ｍカラムに、１８ｇ／Ｌでわずかに過剰装填し、ｍＡｂの約５％が高塩洗浄の間に流れた。ｍＡｂは、伝導率が低下するにつれて溶出した。しかし、反応性／非反応性種の分離を示す定義を伴わない大きな広いピークがあった。ブチルＨＰカラムは、最も有望であり、実際に、相当量のｍＡｂがより低い塩溶出の間に溶出された。しかし、ＨＩＣアッセイ結果は、プールが、４３％のピーク２および５３％の主ピーク種を含有することを示した。ｈ３８Ｃ２は、フェニルＨＰカラムから、減塩洗浄の間に水相中に溶出しなかった。濃縮されたｈ３８Ｃ２は、ＩＰＡ勾配でのみ溶出された。ｍＡｂは、ＩＰＡでのみ溶出され得るので、フェニルＨＰカラムは、水性溶出法に適していなかった。したがって、これらのカラムのいずれも、代替の精製ストラテジー、またはフェニル６５０Ｓ樹脂から切り替える理由をもたらすことができなかった。
（実施例７７）
洗練されたフェニル６５０Ｓ精製プロセス
２０ｇ／ＬのｍＡｂのｈ３８Ｃ２を解凍し、４０ｍＭのリン酸ナトリウム、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７で１：１に希釈し、０．４５／０．２μＭのフィルターに通して濾過し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化したフェニル６５０Ｓ ＨＩＣカラム（ＴＯＳＯＨ）上に１６〜１８ｇ／Ｌで装填した（表７１）。カラムを１ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄し、次いで７ＣＶの勾配を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７中、１〜０．３３ＭのＮａＣｌで展開した。５ＣＶで、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中、０．３３ＭのＮａＣｌで勾配を保持し、その後、基底緩衝液、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７で２ＣＶの洗浄を続けた。反応性のより少ない形態のｈ３８Ｃ２は、これらの洗浄ステップを施す間に溶出した。溶出相について、０〜１５％の１，６ヘキサンジオール勾配を１ＣＶにわたって展開し、溶出が完了するまで１５％で保持した。完全反応性ｈ３８Ｃ２生成物を、約１〜２ＣＶのプールとして収集した。
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次いで、９０〜９５％の完全反応性ｈ３８Ｃ２を含有するフェニル６５０Ｓ生成物プールを、膜１ｍ２当たり１３０〜２８０ｇのｍＡｂで、３０ｋＤ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓによる３ｍ２）を用いて、１０ｍＭのヒスチジン（８透析容量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ））中に透析濾過した。ＵＦ保持液を、ＵＦ緩衝液のＵＦリンス液の適切な量を用いて２５ｇ／Ｌに調整した。最終的なバルク原薬中間製剤を確立するために、４〜５倍量の残っている賦形剤を含有する原液を、透析濾過したタンパク質溶液中にスパイクした。最終的な製剤は、１０ｍＭのヒスチジン、１０ｍＭのグリシン、２％のスクロース、ｐＨ６．５±０．３であった。製剤化したＤＳ中間体溶液を０．４５／０．２μＭの最終フィルターに通過させ、適切なサイズのＳｔｅｄｉｕｍバッグまたは等価物中に、２〜８℃で最大６カ月貯蔵した。より長期間の貯蔵のために、ＤＳ中間体を、１Ｌまたは４ＬのＰＥＴＧボトル中に−７０〜８０℃で凍結させた。
表７２＆７３は、洗練されたフェニル６５０Ｓプロセスを使用するＧＬＰおよびＧＭＰグレードプロセスの実行からの収率を示す。
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（実施例７８）
完全反応性ｈ３８Ｃ２のＥｘ４−リンカーとのコンジュゲーション効率
試料中の主ピークを報告するＨＩＣアッセイ結果と、両コンジュゲーション部位の、基質と反応する能力との間の関係を、以下の（表７４）に示す。様々なＨＩＣ精製を実行した後、ｈ３８Ｃ２の各試料は、１：３のモル比の［配列番号５３−Ｌ１］とともにインキュベートし、次いで、抗体１つ当たりのＥ４−リンカーコンジュゲーションの数を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用してカウントした。
ｈ３８Ｃ２ ＦＲ実行１７１を、実施例７７の洗練されたプロセスに従ってフェニル６５０Ｓ上で精製し、基底緩衝液および１５％のＩＰＡの溶液中に含めた。ｈ３８Ｃ２ ＦＲ実行１７１から合計３ＣＶの溶出画分をプールし、プールは、ＨＩＣアッセイによって９２．４％の主ピークを示した。ｈ３８Ｃ２を、１：３のモル比のＥｘ４−リンカーとともにインキュベートした。コンジュゲーション反応は、８７．８％の完了まで進み、ｍＡｂの１１．８％が、１種のペプチドと反応した。
ｈ３８Ｃ２ ＦＲ実行１７７を、実施例７７の洗練されたプロセスに従ってフェニル６５０Ｓ上で精製し、基底緩衝液および１５％の１，６ヘキサンジオールの溶液中に含め、次いで、１０ｍＭのグリシン、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．５中に透析濾過した。ｈ３８Ｃ２ ＦＲ実行１７７から合計１．５ＣＶの溶出画分をプールし、プールは、８８％の主ピークを示した。ｈ３８Ｃ２を、１：３のモル比のＥｘ４−リンカーとともにインキュベートした。コンジュゲーション反応は、９６％の完了まで進み、ｍＡｂの３．９％が、１種のペプチドと反応した。
実行１７１と１７７を比較すると、実行１７７は、ＩＰＡを用いずにより高いコンジュゲーション効率を有し、他のすべては等価であったので、ＩＰＡが反応を妨害することが明白であった。
ｈ３８Ｃ２ ＦＲ実行「Ｅ−ｔｏｘ」を、実施例７７の洗練されたプロセスに従ってフェニル６５０Ｓ上で精製し、基底緩衝液および１５％のＩＰＡの溶液中に含めた。ｈ３８Ｃ２ ＦＲ実行「Ｅ−ｔｏｘ」から合計５ＣＶの溶出画分をプールし、プールは、ＨＩＣアッセイによって９０．７％の主ピークを示した。ｈ３８Ｃ２を、１：３のモル比のＥｘ４−リンカーとともにインキュベートした。コンジュゲーション反応は、９３．２％の完了まで進み、ｍＡｂの６．７％が、１種のペプチドと反応した。
試料中の完全反応性抗体の量を測定するサイズ排除分析は、主ピーク分析と非常によく相関することが、表７４から分かる。
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（実施例７９）
重要なフェニル６５０Ｓ展開の知見
ＴＯＳＯＨ（商標）および他の供給業者製のいくつかのＨＩＣ樹脂をスクリーニングした後、フェニル６５０Ｓカラムを選んだ。この樹脂は、高い装填能力を有する（ＨＩＣ樹脂について、約１６〜約１８ｇ／Ｌの範囲）。３５μＭの粒径は、反応形態の抗体を濃縮しながらコンジュゲート可能でないｍＡｂを除去するのに必要な分割をもたらす。大規模で、１０、１３．５、および２０ｃｍのベッド高を有するカラムを使用した。流量は、２つのより短いカラムについて約２〜約４倍高く、したがって、本発明は、より低い圧力でより効率的な処理を可能にする、約１０ｃｍ〜約２０ｃｍ、好ましくは約１０ｃｍ〜約１５ｃｍのカラムベッド高のカラムの使用を提供する。２０ｃｍのカラムベッド高を、処理要求事項を満たすのに使用することができるが、より長い工程所要時間を必要とする。上述したカラム装填範囲および洗浄ストラテジーを、完全反応性ｈ３８Ｃ２の濃縮および収率の両方について最適化した。以前のストラテジーおよび他の樹脂は、約１１〜約５５％のタンパク質回収率をもたらし、完全反応性ｈ３８Ｃ２の所望の濃縮レベルを実現しなかった。小規模展開作業では、溶出緩衝液として２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中、２０％のＩＰＡを使用した。本発明は、大規模における可燃性問題を回避するためにＩＰＡの使用を回避するための１，６，ヘキサンジオールの使用を提供する。
フェニル６５０Ｓカラムは、ロバストであり、フェニル５ＰＷカラムより４倍高い装填能力を有し、より大きい粒径に起因して、フェニル５ＰＷカラムより高い流量を実現し、スケーラブルで再現可能である。
同様の精製法を用いて４ｍｌ、７５ｍｌ、９．５Ｌ、および３３Ｌスケールでフェニル６５０Ｓを使用する開発したプロセスの結果は、すべて優れた収率を実現し、完全反応性ｈ３８Ｃ２を生成した。９．５Ｌスケール実行は、１１０ｇのｈ３８Ｃ２ ＦＲを達成し（８０〜９０ｇの目標の十分上）、それは、７２％の総タンパク質収率を代表した。ＨＩＣアッセイは、主ピークが総タンパク質の９３％を構成することを示した。
本発明は、少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７０％、最も好ましくは少なくとも約７２％の総タンパク質収率とともに、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９２％、より好ましくは少なくとも約９５％の主ピーク収率で完全反応性ｈ３８Ｃ２を達成するためのプロセスを提供する。
本精製法は、ＡＢＣ１を調製するためにＦＧＦ２１に、引き続いてＥｘ４ペプチドにコンジュゲートするのに必要とされる完全反応性ｈ３８Ｃ２をもたらした。
フェニル６５０Ｓカラムを用いた大規模での総タンパク質収率は、少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約６８％、より好ましくは少なくとも約７０％、最も好ましくは少なくとも約７５％を実現するように最適化された。本発明は、少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約８８％、より好ましくは少なくとも約９０％の完全反応性ｈ３８Ｃ２をもたらすためのプロセスも提供する。
コンジュゲーションのための完全反応性ｈ３８Ｃ２の濃縮の成功は、フェニル６５０Ｓ樹脂を用いて実現された。フェニル６５０Ｓカラムの最大装填能力は、およそ２０〜２２ｇ／Ｌであった。
最大装填能力は、緩衝液でカラムを平衡化し、次いで、吸光度のブレークスルーが観察されるまでタンパク質装填を施すことによって確認される。ブレークスルーのレベルは、通常、最大吸光度の５〜１０％に設定する。カラム装填を停止し、平衡化緩衝液でカラムを洗浄しながらブレークスルーを収集する。加えたタンパク質の質量からタンパク質ブレークスルーの量を差し引いた差異が、最大装填能力である。別のカラム実行で、計算した最大装填量をカラムに施し、その量のタンパク質がカラムに結合することを検証する。
６５０Ｓカラムは、少なくとも２／３の能力まで装填されるとき、最適な性能を示す。カラム装填量は、一般に約１５〜１８ｇ／Ｌであった。これは、最大装填能力の約７０〜８０％である。カラムの結合能力付近に装填することが有利であることが判明した。カラムが、装填後に過剰の利用可能な結合部位を有する場合、非反応性ｍＡｂの溶出が洗浄ステップの間に遅延され、完全にコンジュゲート可能な形態の溶出の前に除去されない場合がある。したがって、いくつかの態様では、カラムに、少なくとも約５０％の能力、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％まで装填することができる。実行１５５（表６７）では、カラムに４５ｇ／Ｌで過剰装填し、材料のほとんどは、カラムに結合しなかった。カラム実行を継続し、タンパク質を実行の残りから回収した。総装填量からブレークスルーにおけるタンパク質の量を差し引いて計算すると、１６ｇ／Ｌの実用上の装填量が得られる。カラムに通常のブレークスルー点を超えて過剰装填すると、予期されたものより多くのタンパク質がカラムから洗出された。フェニル６５０Ｓカラムの結合能力は、約２２〜３０ｇ／Ｌの間であり、ブレークスルーを見ることなく試験した２２ｇ／Ｌ付近またはそれより上である。
精製の重要な部分は、非反応性抗体を溶出する３ステップ水性減塩洗浄を規定することである。目標塩濃度、減塩洗浄の傾き、および洗浄の持続時間を微調整することによって、不活性形態のほとんどがカラムから溶出される一方、完全反応性ｈ３８Ｃ２のほとんどは、樹脂に結合したままである。溶出は、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）または１，６ヘキサンジオールによって逆相モードで達成される。水性溶出条件を特定するために追加のカラム試験を実施したが、適当な方法は、特定されなかった。
したがって、いくつかの態様では、本発明は、ｈ３８Ｃ２を精製するための、プロセスの意外な微調整を提供する。いくつかの態様では、ｈ３８Ｃ２は、配列番号２５および２６を含む。いくつかの態様では、本発明は、ｈ３８Ｃ２およびその変異体を微調整するためのプロセスを提供する。この脈絡において、「その変異体」は、配列番号２７に示した軽鎖可変領域（ＶＬ）配列のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬ、ならびに配列番号２８に示した重鎖可変領域（ＶＨ）配列のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨを含む抗体に関する。好ましくは、ｈ３８Ｃ２は、ＩｇＧ１抗体である。好ましくは、ｈ３８Ｃ２変異体は、配列番号２７に示したＶＬ、および配列番号２８に示したＶＨを含み、配列番号７８、７９、８０、および８１の１つまたは複数と少なくとも９５％同一である軽鎖定常領域、ならびに配列番号８２と少なくとも９５％同一である重鎖定常領域をさらに含む。いくつかの態様では、各定常鎖の同一性は、配列番号２７または２８の１つに対して独立して、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であり得る。いくつかの態様では、軽鎖定常領域は、配列番号７８、７９、８０、および８１の１つまたは複数と５個以下のアミノ酸残基が異なる。いくつかの態様では、軽鎖定常領域は、配列番号８１を含む。いくつかの態様では、軽鎖定常領域は、配列番号８１と５、４、３、２、または１個以下のアミノ酸が異なる。
いくつかの態様では、本発明は、部分的非反応性ｈ３８Ｃ２またはその変異体、および完全非反応性ｈ３８Ｃ２またはその変異体の混合物から、完全反応性ｈ３８Ｃ２またはその変異体を抽出するためのプロセスであって、試料をフェニルカラム上で逆相クロマトグラフィーにかけるステップを含む、プロセスを提供する。
いくつかの態様では、本発明は、完全反応性ｈ３８Ｃ２またはその変異体を含む組成物に関する。ｈ３８Ｃ２またはその変異体の反応性試料は、試料中の抗体の少なくとも約８５％、約８８％、約９０％において、両方の抗原結合部位が抗原結合に完全に利用可能である、ｈ３８Ｃ２またはその変異体の試料として定義することができる。
抗体がｈ３８Ｃ２またはその変異体などの触媒抗体である場合、反応性抗原結合部位は、それぞれの反応を触媒し、かつｈ３８Ｃ２またはその変異体の場合では、本明細書に記載した式Ｘ−Ｙ−Ｚのリンカーへの共有結合性コンジュゲートを形成するのに利用可能となる。理論に束縛されることを望むわけではないが、試料中に部分的および完全非反応性抗体が存在することの一仮説は、抗体の一方または両方の抗原結合部位が、先の生成サイクルにわたるある時点で、天然に存在する「粘着性」低分子と結合した場合である。
カラムビーズの粒径は、直径約５０μｍ未満とすることができる。カラムビーズの粒径は、約４０μｍ未満であってもよい。カラムビーズの粒径は、約５０μｍ〜約２０μｍの間とすることができる。カラムビーズの粒径は、約４０μｍ〜約３０μｍの間であってもよい。カラムビーズの粒径は、約３５μｍであってもよい。いくつかの態様では、「Ｓ」グレードのフェニルカラムを使用することができる。
いくつかの態様では、ビーズは、少なくとも約５００Åの孔を含み得る。いくつかの態様では、ビーズは、少なくとも約６５０Åの孔を含み得る。いくつかの態様では、ビーズは、少なくとも約７００Åの孔を含み得る。いくつかの態様では、ビーズは、約５００Å〜１０００Åの間の孔を含むことができる。いくつかの態様では、ビーズは、約７００Å〜８００Åの間の孔を含むことができる。
いくつかの態様では、ＨＩＣカラムは、約７５０Åの孔を含む約３５μＭのフェニルコンジュゲート樹脂ビーズを含むことができる。いくつかの態様では、カラムは、フェニル６５０Ｓカラムとすることができる。
ＨＩＣは、約０℃〜３７℃の間で実施することができる。これは、ＲＴ（約１５℃〜約２５℃）であってもよい。これは、約１６℃〜約２３℃の間の温度でのものとすることができる。
カラムの線流速は、約１０〜約１００ｃｍ／時間の間とすることができる。好適な流速は、約５０〜約９０ｃｍ／時間の間であり得る。
基底緩衝液は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム、ＨＥＰＥＳ、トリス、またはビス−トリスからなる群、好ましくはリン酸ナトリウムから選択される緩衝剤を、約１５ｍＭ〜約１００ｍＭの間、好ましくは約２０ｍＭ〜約７０ｍＭの間、より好ましくは約２０ｍＭ〜約５０ｍＭの間、最も好ましくは約２０ｍＭの濃度で含むことができる。約５ｍＭの濃度未満で、塩濃度が弱すぎて有効に緩衝することができない可能性があり、約１００ｍＭ超で、塩濃度の増大が溶液の溶解度に負のインパクトを与え得る。ｐＨは、約６．５〜約７．５の間、より好ましくは約６．８〜約７．２の間、最も好ましくは約７とすることができる。
いくつかの態様では、カラムを、装填前に、装填前平衡化洗浄にかけることができる。装填前平衡化洗浄は、基底緩衝液および約０．５Ｍ〜約１．５Ｍの間の塩を含むことができる。
いくつかの態様では、カラムを、基底緩衝液を含み、約０．５Ｍ〜約１．５Ｍの間の塩をさらに含む装填後平衡化洗浄にかけることができる。
ステップ（装填前、装填、および装填後の平衡化緩衝液を含む）のいずれかのための塩は、下限が、約０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．７５Ｍ、および０．８Ｍからなる群から選択され、上限が、約０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、および１．５Ｍからなる群から選択される濃度範囲のものとすることができる。塩濃度は、約０．７５Ｍであってもよい。塩濃度は、約０．５Ｍであってもよい。塩濃度は、約１Ｍであってもよい。塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびクエン酸一ナトリウムからなる群から選択することができる。塩は、ＮａＣｌとすることができる。塩は、約１ＭのＮａＣｌとすることができる。
いくつかの態様では、カラムを、出発塩濃度が約０．５〜約１．５Ｍの間であり、好ましくは約１Ｍであり、最終濃度が約０．２５〜約０．４Ｍの間であり、好ましくは約０．３Ｍ〜約０．３５Ｍの間であり、より好ましくは約０．３３Ｍである、基底緩衝液中の直線塩勾配にかけることができる。勾配にわたる塩（特にＮａＣｌ）の濃度の低減が、１ＣＶ当たり９０〜１００ｍＭの減少に等しい場合（例えば、１．５Ｍから０．５Ｍに塩濃度を低減するのに約１０〜１１ＣＶの間が使用される）、特に有利な結果が得られることが判明した。したがって、いくつかの態様では、直線塩勾配は、１ＣＶ当たり約９０ｍＭ〜１００ｍＭの間の塩濃度の低減を特徴とする。したがって、ＮａＣｌ勾配を使用する場合、約７ＣＶ当たり少なくとも約０．６５〜０．７ＭのＮａＣｌ、いくつかの態様では、約７ＣＶ当たり約０．６７ＭのＮａＣｌを維持することが望ましいことが判明した。直線勾配は、少なくとも約４、好ましくは少なくとも約４．５、より好ましくは少なくとも約５ＣＶから構成することができる。直線勾配の体積が小さすぎると、険しすぎる勾配の傾きをもたらす場合があり、非反応性材料が溶出する時間が不十分である。いくつかの態様では、直線塩勾配は、約４〜約１０ＣＶの間から構成され得る。いくつかの態様では、直線塩勾配は、約５〜約７ＣＶの間から構成され得る。いくつかの態様では、直線塩勾配は、約７ＣＶから構成され得る。塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびクエン酸一ナトリウムからなる群から選択することができる。塩は、ＮａＣｌとすることができる。
好都合には、次いでカラムを、約４ＣＶ〜約７ＣＶの間、好ましくは約６ＣＶ、より好ましくは約５ＣＶで、約０．２５Ｍ〜約０．４Ｍの塩（上記の通り）、好ましくは０．３３Ｍの塩を含む、基底緩衝液中のプラトー洗浄にかけることができる。塩は、ＮａＣｌとすることができる。ＮａＣｌは、０．３３Ｍのものとすることができる。
いくつかの態様では、次いでカラムを、下限が、約１、２、３、４、および５からなる群から選択され、上限が、約５、６、７、８、９、および１０からなる群から選択され、範囲を、約１〜約１０、または約２〜約８、または約３〜約８の間、または約５〜約６の間とすることができる、一連のＣＶ中の基底緩衝液を用いたさらなる洗浄にかけることができる。いくつかの態様では、基底緩衝液中のさらなる洗浄は、約２〜約３ＣＶの間の基底緩衝液中である。
いくつかの態様では、カラムでの溶出は、基底緩衝液、および１，６ヘキサンジオールの直線濃度勾配を使用して行うことができる。溶出直線勾配は、約０〜約１％の間、好ましくは約０％の１，６ヘキサンジオールの初期濃度から、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、および約２２％からなる群から選択される上限まで進めることができる。ヘキサンジオール溶出は、約０．５ＣＶ〜約３ＣＶの間の溶出緩衝液のカラム体積にわたって、または溶出プールが収集されるまで増大させることができる。いくつかの態様では、最大５ＣＶで、または溶出プールが収集されるまで、基底緩衝液、ならびに約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、および２２％、約０％〜約２２％からなる群から選択される濃度の１，６ヘキサンジオールを含む、さらなる溶出ステップを実行することができる。いくつかの態様では、総溶出ＣＶは、約７ＣＶである。いくつかの態様では、総溶出ＣＶは、約６ＣＶである。
２０％のヘキサンジオールは、十分に機能するが、１５％が、ＵＦ／ＤＦに対してより良好な流量を可能にすることが判明した。
次いで、溶出したｈ３８Ｃ２を、適当な緩衝液（例えば、約１０ｍＭのヒスチジン、約１０ｍＭのグリシン、約２％のスクロース、ｐＨ６．５±０．３）中に透析濾過することができる。
いくつかの態様では、本発明は、ｈ３８Ｃ２またはその変異体の試料を精製するためのプロセスであって、試料中の抗体の少なくとも約８５％で、両方の抗原結合部位が抗原結合に完全に利用可能であり、
（ｉ）ｐＨ約６．５〜約７．５の間で、約１５ｍＭ〜約１００ｍＭの間のリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはリン酸アンモニウム、ＨＥＰＥＳ、トリス、およびビス−トリスを含み、約０．５Ｍ〜１．５Ｍの間の第１濃度で、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびクエン酸一ナトリウムからなる群から選択される塩をさらに含む基底緩衝液を含む装填前平衡化洗浄液でＨＩＣカラムを平衡化するステップであって、ＨＩＣカラムは、直径が約５０μｍ未満であり、少なくとも約５００Åの孔を含むフェニルコンジュゲート樹脂ビーズを含む、ステップと、
（ｉｉ）基底緩衝液を含み、第１濃度の塩をさらに含む装填緩衝液中の約４〜約８０ｇ／Ｌの間のｈ３８Ｃ２の試料をカラムに装填するステップと、
（ｉｉｉ）基底緩衝液および第１濃度の塩を含む装填後平衡化洗浄液でカラムを洗浄するステップと、
（ｉｖ）基底緩衝液を含み、塩濃度が１ＣＶ当たり約９０ｍＭ〜１００ｍＭの間で減少することを特徴とする、約１．５Ｍ〜約０．２５Ｍの塩の直線濃度勾配をさらに含む、塩勾配でカラムを洗浄するステップと、
（ｖ）約４ＣＶ〜約８ＣＶの間の、基底緩衝液中、約０．２５Ｍ〜約０．４Ｍの間の塩を含む塩プラトー洗浄液でカラムを洗浄するステップと、
（ｖｉ）基底緩衝液を含む緩衝洗浄液でカラムを洗浄するステップと、
（ｖｉｉ）基底緩衝液、ならびに約０．５ＣＶ〜約３ＣＶの間にわたって、または溶出プールが収集されるまで、約０〜約１％の間の１，６ヘキサンジオールの濃度で始まり、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、および２２％、約０％〜約２２％の１，６ヘキサンジオールからなる群から選択される上限で終わる１，６ヘキサンジオールの直線濃度勾配を含む溶出緩衝液でｈ３８Ｃ２を溶出するステップと、
（ｖｉｉｉ）最大５ＣＶで、または溶出プールが収集されるまで、基底緩衝液、ならびに約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、および２２％、約０％〜約２２％からなる群から選択される濃度の１，６ヘキサンジオールを含むさらなる溶出ステップを任意選択により実行するステップと
を含む、プロセスを提供する。
いくつかの態様では、本発明は、ｈ３８Ｃ２またはその変異体の試料を精製するためのプロセスであって、試料中の抗体の少なくとも約８５％で、両方の抗原結合部位が抗原結合に完全に利用可能であり、
（ｉ）約２０ｍＭのリン酸ナトリウム、約１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ約７を含む装填前平衡化洗浄液でフェニル６５０Ｓ ＨＩＣカラムを平衡化するステップと、
（ｉｉ）ｐＨ約７の約２０ｍＭのリン酸ナトリウム中、約５〜約２０ｇ／Ｌの間でｈ３８Ｃ２の試料をカラムに装填するステップと、
（ｉｉｉ）約１ＣＶの、ｐＨ約７の約２０ｍＭのリン酸ナトリウム中、１ＭのＮａＣｌを含む装填後平衡化洗浄液でカラムを洗浄するステップと、
（ｉｖ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７を含み、塩濃度が１ＣＶ当たり約９０ｍＭ〜１００ｍＭの間で減少することを特徴とする、約１Ｍ〜約０．３３ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配をさらに含む、ＮａＣｌ勾配でカラムを洗浄するステップと、
（ｖ）約５ＣＶの、ｐＨ約７の約２０ｍＭのリン酸ナトリウム中、約０．３３ＭのＮａＣｌを含むＮａＣｌプラトー洗浄液でカラムを洗浄するステップと、
（ｖｉ）約２ＣＶの、ｐＨ約７の２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む緩衝洗浄液でカラムを洗浄するステップと、
（ｖｉｉ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７、および約１ＣＶで、約０〜約１％の１，６ヘキサンジオールの濃度で始まり、約１４％、約１５％、または約１６％からなる群から選択される上限の１，６ヘキサンジオールで終わる、１，６ヘキサンジオールの直線濃度勾配を含む溶出緩衝液でｈ３８Ｃ２を溶出するステップと、
（ｖｉｉｉ）約２〜約５ＣＶで、または溶出プールが収集されるまで、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７、および約１４％、約１５％、および約１６％からなる群から選択される濃度の１，６ヘキサンジオールを含むさらなる溶出ステップを実行するステップと
を含むプロセスを提供する。
（実施例８０）
ＡＢＣ−１処置後の脂肪細胞分析
白色脂肪組織中のアレイによる遺伝子発現分析に加えて、ＡＢＣ−１、Ａｂ［Ｅｘ４］２、またはＡｂ［ＦＧＦ２１］２で処置したＤＩＯマウスに由来する白色脂肪組織に対して組織化学的評価を行った。化合物を毎週１回（０日目および７日目）投与し、体重および食物摂取量を毎週２回測定した。終了の日に（１０日目）、１つの生殖腺白色脂肪貯蔵物を、切除、秤量、固定化、パラフィン包埋、および切断し、細胞サイズおよびアポトーシスの組織化学的分析（ＴＵＮＥＬ染色）を行った。ＡＢＣ−１は、脂肪細胞アポトーシスの低減に向かう傾向を伴って、体重および脂肪組織湿重量、ならびに脂肪細胞サイズを有意に低減させた。
Figure 0006165168
（実施例８１）
高脂肪食後のサルに対するＡＢＣ−１の効果
６カ月にわたって高脂肪食を摂食させた後のカニクイザルにおけるＡＢＣ−１の効力を調査するように設計された試験において、８匹の成体雄に、１．０ｍｇ／ｋｇ（１週目および２週目）、３．０ｍｇ／ｋｇ（３週目および４週目）、および１０ｍｇ／ｋｇ（５週目および６週目）の用量レベルで、２週間にわたって毎週２回ＡＢＣ−１を静脈内投与した。ベースラインにおいて一晩絶食させた後、および６週間の投薬期間の最後に、麻酔下で全身ＤＸＡスキャンを撮った。脂肪量、除脂肪体重、および骨ミネラル量（ＢＭＣ）からなる３つの身体コンパートメントの組成を分析および推定した。顕著な体重の変化は、ベースラインと１．０ｍｇ／ｋｇおよび３．０ｍｇ／ｋｇの投薬期間との間でまったく確認されなかった。しかし、１０．０ｍｇ／ｋｇ処置の最後に、平均体重の相当な減少が観察された（±５．４％の標準誤差を伴って９．０％）。平均ボディーマスインデックス（ＢＭＩ）値は、平均ベースライン値と比較して、投薬期間の最後（６週目）で、１２．０９％低かった。ＤＸＡ身体組成分析により、ベースライン値と比べて、投薬期間の最後（６週目）に記録した胴体および全身を伴う、組織（−３４．９±１２．９％）および局所（−３５．６±１２．９％）のパーセンテージ脂肪ならびに脂肪量（−４２．１±１４．０％）についてより低い平均パーセント値が示された。除脂肪組織量、骨ミネラル量（ＢＭＣ）、および総質量の顕著な変化は、観察期間全体の間でまったく確認されず、ＡＢＣ−１によって誘導される体重減少は、ユニークに脂肪量の減少を対象としていることを示唆した。
Figure 0006165168
別段の指定のない限り、用語「Ａｂ−Ｌ１−ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ」が具体例の脈絡において使用される場合、これは、抗体の各アームが配列番号２６のＫ９９を通じてリンカー−１（Ｌ１）に共有結合により連結され、各Ｌ１分子が配列番号１０中のＣｙｓ１２９のチオール基に共有結合によりコンジュゲートされた、ｈ３８Ｃ２抗体（配列番号２５および２６）を指す（配列番号１の番号付けによる）。この化合物は、Ａｂ−（ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ−Ｌ１）２、ｈ３８Ｃ２−（ＦＧＦ２１ΔＨ−Ａ１２９Ｃ−Ｌ１）２、およびｈ３８Ｃ２−（配列番号１０−Ｌ１）２と記載することもできる。抗体、特定のリンカー、およびＦＧＦ２１分子の配列、特に、ＬまたはＰであり得る、１４６位などの公知の多型部位に、軽微な修飾が可能であり得ることが明らかになるであろう。ＦＧＦ２１のＰ１４６およびＬ１４６変異体は、いずれの生物学的差異も示さないように思われることが注目される。
非対称二機能性コンジュゲート（ＡＢＣ）分子、ならびにこれらの中間体および誘導体が、具体例との関連で記載されている場合、下付き文字の１または２は、抗体１つ当たりのコンジュゲートされたタンパク質−リンカーまたはペプチド−リンカー種の数を表す。
文字がリンカー基、または化学変数を記載する関連で使用される場合（例えば、認識基を定義するためのＹ）、式は、単一文字によって表される式と、１文字ＩＵＰＡＣコードによって表されるアミノ酸またはヌクレオチドとの間のいずれの予想される混乱も回避するために、文字の大文字と小文字の組合せ、またはダブル小文字によって表すことができる。したがって、認識基としてのＹは、Ｙｙまたはｙｙとして記載される場合もある。
こうして、本発明を、上述した代表的な実施形態を参照して広く開示し、例示してきた。当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な改変を本発明に行うことができることを認識するであろう。すべての刊行物、特許出願、および発行済み特許は、各個々の刊行物、特許出願、または発行済み特許が、その全体が参照により組み込まれているように具体的かつ個々に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。参照により組み込まれているテキスト中に含まれる定義は、これらが本開示における定義と矛盾する程度に応じて除外される。
明確にするために別個の実施形態の脈絡において記載されている本発明のある特定の特徴は、１つの実施形態において組合せで提供することもできることが理解される。反対に、簡潔にするために１つの実施形態の脈絡において記載されている本発明の様々な特徴を、別個に、または適当なサブコンビネーションで提供することもできる。
本発明の一実施形態に関して論じたいずれの限定事項も、本発明の任意の他の実施形態に適用することができることが特に企図されている。さらに、本発明の任意の組成物は、本発明の任意の方法において使用することができ、本発明の任意の方法は、本発明の任意の組成物を生成または利用するのに使用することができる。特に、請求項に記載される本発明の任意の態様は、単独で、または１つもしくは複数の追加の請求項および／もしくは明細書の態様と組み合わせて、特許請求の範囲および／または明細書の他の箇所で述べた本発明の他の態様と組み合わせられると理解されるべきである。
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すことが明確に示され、または選択肢が相互に排他的であるのでなければ、「および／または」を意味するのに使用されるが、本開示は、選択肢のみ、および「および／または」を指す定義を支持する。
本明細書において文中で使用される「ａ」または「ａｎ」は、別段の明らかな指示のない限り、１つまたは複数を意味することができる。請求項（複数可）において文中で使用される、単語「含む」とともに使用される場合の、「単語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは１つより多いことを意味することができる。本明細書において、「別の」は、少なくとも第２、またはそれ以上を意味することができる。
単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）／含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および単語「有する／含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、本発明を参照して本明細書で使用する場合、述べた特徴、整数、ステップ、または構成要素の存在を指定するのに使用されるが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、構成要素、またはこれらのグループの存在または追加を排除しない。
Figure 0006165168
Figure 0006165168
Figure 0006165168
Figure 0006165168

Claims (16)

  1. ｈ３８Ｃ２抗体またはその変異体の試料を精製するためのプロセスであって、試料中の
    抗体の少なくとも８５％で、両方の抗原結合部位が抗原結合に完全に利用可能であり、
    （ｉ）ｐＨ６．５〜７．５の間で、１５ｍＭ〜１００ｍＭの間のリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはリン酸アンモニウム、ＨＥＰＥＳ、トリス、およびビス−トリスを含み、０．５Ｍ〜１．５Ｍの間の第１濃度で、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびクエン酸一ナトリウムからなる群から選択される塩をさらに含む基底緩衝液を含む装填前平衡化洗浄液でＨＩＣカラムを平衡化するステップであって、ＨＩＣカラムは、直径が５０μｍ未満であり、少なくとも５００Åの孔を含むフェニルコンジュゲート樹脂ビーズを含む、ステップと、
    （ｉｉ）基底緩衝液を含み、第１濃度の塩をさらに含む装填緩衝液中の４〜８０ｇ／Ｌの間のｈ３８Ｃ２の試料をカラムに装填するステップと、
    （ｉｉｉ）基底緩衝液および第１濃度の塩を含む装填後平衡化洗浄液でカラムを洗浄するステップと、
    （ｉｖ）基底緩衝液を含み、塩濃度が１カラム体積（ＣＶ）当たり９０ｍＭ〜１００ｍＭの間で減少することを特徴とする、１．５Ｍ〜０．２５Ｍの塩の直線濃度勾配をさらに含む、塩勾配でカラムを洗浄するステップと、
    （ｖ）４ＣＶ〜８ＣＶの間の、基底緩衝液中、０．２５Ｍ〜０．４Ｍの間の塩を含む塩プラトー洗浄液でカラムを洗浄するステップと、
    （ｖｉ）基底緩衝液を含む緩衝洗浄液でカラムを洗浄するステップと、
    （ｖｉｉ）基底緩衝液、ならびに０．５ＣＶ〜３ＣＶの間にわたって、または溶出プールが収集されるまで、０〜１％の間の１，６ヘキサンジオールの濃度で始まり、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、および２２％の１，６ヘキサンジオールからなる群から選択される上限で終わる１，６ヘキサンジオールの直線濃度勾配を含む溶出緩衝液でｈ３８Ｃ２を溶出するステップと、
    （ｖｉｉｉ）最大５ＣＶで、または溶出プールが収集されるまで、基底緩衝液、ならびに１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、および２２％からなる群から選択される濃度の１，６ヘキサンジオールを含むさらなる溶出ステップを任意選択により実行するステップと
    を含み、ｈ３８Ｃ２抗体またはその変異体は、配列番号２７に示した軽鎖可変領域（ＶＬ）配列のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬを含み、および配列番号２８に示した重鎖可変領域（ＶＨ）配列のＶＨ ＣＤＲ１，ＶＨ ＣＤＲ２，およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨを含む、プロセス。
  2. 抗体が、配列番号２７に示したＶＬおよび配列番号２８に示したＶＨを含む、請求項１に記載のプロセス。
  3. 抗体が、配列番号７８、７９、８０、および８１の１つまたは複数と少なくとも９５％同一である軽鎖定常領域、ならびに配列番号８２と少なくとも９５％同一である重鎖定常領域をさらに含む、請求項１または２に記載のプロセス。
  4. 抗体がＩｇＧ１である、請求項１から３のいずれか一項に記載のプロセス。
  5. 抗体が配列番号２５である軽鎖、および配列番号２６である重鎖を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のプロセス。
  6. ＨＩＣカラムが約７５０Åの孔を含む３５μＭのフェニルコンジュゲート樹脂ビーズを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のプロセス。
  7. ステップ（ｉ）における装填前平衡化洗浄液が、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のプロセス。
  8. ステップ（ｉｉ）において、ｈ３８Ｃ２の試料が、ｐＨ７で２０ｍＭのリン酸ナトリウム中、１５から１８ｇ／Ｌでカラムへ装填される、請求項１から７のいずれか一項に記載のプロセス。
  9. ステップ（ｉｉｉ）において、１ＣＶの、ｐＨ７の２０ｍＭのリン酸ナトリウム中、１ＭのＮａＣｌを含む装填後平衡化洗浄液でカラムを洗浄する、請求項１から８のいずれか一項に記載のプロセス。
  10. ステップ（ｉｖ）において、ＮａＣｌ勾配が２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７を含み、塩の直線濃度勾配が１Ｍ〜０．３３ＭのＮａＣｌであり、かつ塩濃度が１ＣＶ当たり９０ｍＭ〜１００ｍＭの間で減少することを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載のプロセス。
  11. ステップ（ｉｖ）において、直線塩勾配が少なくとも４ＣＶである、請求項１から１０のいずれか一項に記載のプロセス。
  12. ステップ（ｖ）における塩プラトー洗浄液が、５ＣＶの、ｐＨ７の２０ｍＭのリン酸ナトリウム中、０．３３ＭのＮａＣｌを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のプロセス。
  13. ステップ（ｖｉ）における基底緩衝液が、２ＣＶの、ｐＨ７の２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のプロセス。
  14. ステップ（ｖｉｉ）における溶出緩衝液が、ｐＨ７の２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のプロセス。
  15. ステップ（ｖｉｉ）の直線濃度勾配が、１ＣＶで、０〜１％の１，６ヘキサンジオールの濃度で始まり、１４％、１５％、および１６％からなる群から選択される上限の１，６ヘキサンジオールで終わる直線濃度勾配を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のプロセス。
  16. ２ＣＶ〜５ＣＶで、または溶出プールが収集されるまで、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７、および１４％、１５％、および１６％からなる群から選択される濃度の１，６ヘキサンジオールを含むさらなる溶出ステップを実行する、請求項１から１５のいずれか一項に記載のプロセス。
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