CN101123992A - 缀合有结构完全确定的支化聚合物的促胰岛素剂的衍生物 - Google Patents

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Abstract

缀合有结构完全确定的聚合物的新的GLP－1和它们的治疗用途。

Description

缀合有结构完全确定的支化聚合物的促胰岛素剂的衍生物
发明领域
本发明总的来说涉及治疗患糖尿病的人的方法。更具体地说，本发明涉及缀合有结构完全确定的支化聚合物的促胰岛素剂(insulinotropic agent)。支化聚合物由单体结构单元组成。此外，本发明涉及这种缀合促胰岛素剂的用途，例如通过肺部递送经由肺来全身吸收以减少或清除对通过注射施用其它促胰岛素剂的需要，也涉及含有这些化合物的药物组合物，并涉及该化合物用于治疗与糖尿病相关的疾病的用途。
发明背景
自从20世纪20年代引入胰岛素以来，人们进行了不断的努力以改善对糖尿病的治疗。
糖尿病是一种影响约6％世界人口的疾病。此外，多数国家的人口正在老化而糖尿病在老年人口中尤其普遍。通常，正是该人群经历了通过注射来自我施用胰岛素的困难或者不情愿。在美国，大约5％的人口患有糖尿病并且大约三分之一的那些糖尿病患者每天通过皮下注射来自我施用一个或多个剂量的胰岛素。这种类型的强化治疗是降低血糖水平所必需的。高水平的血糖(其为低水平内源性胰岛素或缺乏内源性胰岛素的结果)改变正常的身体化学并且能够导致许多器官中微血管系统的衰竭。未经治疗的糖尿病患者常常遭受截肢手术并经历失明和肾衰竭。仅在美国由于糖尿病的不适当治疗引起的糖尿病副作用的医学治疗和丧失的生产力据估计每年费用约为400亿美元。
预期在糖尿病治疗中将会变得十分重要的一种肽是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。人GLP-1是一种源于前胰高血糖素原的37个氨基酸残基的肽，所述的前胰高血糖素原是(i.a.)在远侧回肠、胰腺和脑中的L-细胞中合成的。GLP-1是一种在葡萄糖代谢和胃肠分泌以及新陈代谢中具有调节功能的重要的肠激素。GLP-1以葡萄糖依赖性方式刺激胰岛素分泌、刺激胰岛素生物合成、促进β细胞拯救、减少胰高血糖素分泌、胃排空和食物摄取。PCT公开文本WO 98/08871和WO99/43706公开了具有亲脂性取代基的GLP-1类似物的稳定衍生物。这些GLP-1类似物的稳定衍生物与相应的GLP-1类似物比较，具有延长的作用曲线。
在最近十年里，已经从毒蜥蜴(钝尾毒蜥(Heloderma suspectum)和珠状毒蜥(Heloderma horridum))的毒液中分离了多种肽。毒蜥外泌肽(exendin)-4是一种从钝尾毒蜥毒液中分离的39个氨基酸残基的肽，并且该肽在重叠区域与GLP-1(7-37)共有52％的同源性。毒蜥外泌肽-4是一种有效的GLP-1受体激动剂，已经显示当将其注射入狗时，该受体激动剂刺激胰岛素释放并随之降低血糖水平。毒蜥外泌肽-4(1-39)、其某些片段、其类似物及其衍生物的组是有效的促胰岛素剂。最重要的是毒蜥外泌肽-4(1-39)、其促胰岛素片段、其促胰岛素类似物及其促胰岛素衍生物的组。
GLP-1和各种毒蜥外泌肽所共有的是，已经合成并研究了大量的变体，特别是研究了有关血浆半衰期。低血浆半衰期可能是由于对肽酶(主要是二肽氨基肽酶IV)的化学稳定性及肾清除率引起的。然而，促胰岛素肽的这些类似物和衍生物在通过肺途径施用时，即在施用至下呼吸道例如通过细支气管或肺泡时，缺乏令人满意的生物利用度。WO 00/66629公开了经由赖氨酸残基偶合至聚乙二醇来降低肾清除率的经修饰的毒蜥外泌肽激动剂。
WO 03/40309公开了作为GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体拮抗剂两者起作用的肽。在公开的肽之中的是经由C-端半胱氨酸残基偶合至聚乙二醇的两种肽。
WO 2004/093823公开了聚乙醇化的GLP-1肽。
GLP-1肽的肺部施用已经在WO 01/51071和WO 00/12116中公开。
源于GLP-1和毒蜥外泌肽-4的促胰岛素肽只在血糖水平高时刺激胰岛素释放，并因而使低血糖事件的风险降低。因此，该肽特别可用于不再对OHA′s(口服升高血糖药)响应和从严格的医学观点来看应施用胰岛素的糖尿病患者。患者以及在某种程度上也包括医生通常在绝对需要使用胰岛素前不喜欢开始使用胰岛素，大概是因为担心低血糖事件或害怕注射/针头。因此，需要充分有效且能够通过肺部施用的促胰岛素肽。
多年前就已经知道，一些蛋白质可以经由肺吸收。实际上，在1925年Gaensslen首先报道了将胰岛素作为吸入气雾剂施用至肺中。
显然，并不是所有的蛋白质都能够在肺中有效地吸收。有许多因素影响蛋白质是否能够通过肺来有效递送。通过肺吸收在很大程度上取决于要递送的特定治疗性蛋白质的物理特征。
蛋白质的有效肺部递送取决于递送该蛋白质至深部肺泡上皮组织的能力。沉积在上呼吸道上皮组织的蛋白质不会以显著的程度吸收。这归因于覆盖在其上的粘液，其大约30-40μm厚并起吸收的障碍的作用。而且，在该上皮组织上沉积的蛋白质会由向呼吸道上面转运的粘膜纤毛清除并随后经由胃肠道清除。这种机理也相当地促使某些蛋白质颗粒的低吸收。蛋白质不被吸收而是通过这些途径清除的程度取决于它们的溶解性、它们的大小，以及其它较不清楚的特征。
即便蛋白质可以成功地递送至深部肺泡上皮组织，也很难预测治疗性蛋白质能否从肺迅速运送进血液中。由于存在于肺中的广谱肽酶，较长的吸收时间增加了蛋白质在吸收之前受到显著降解或由粘膜纤毛转运清除的可能性。
而且，由于蛋白水解降解、肾或肝脏的清除，或在一些情况下中和抗体的出现，治疗目标的性肽例如激素、可溶性受体、细胞因子、酶等通常具有短的体内循环半衰期。这通常减少了肽的治疗效用。
然而人们很好地认识到，肽的特性可以通过在其上嫁接有机的链状分子来增强。这种嫁接可以改善药学特性例如血清中的半衰期、抗蛋白水解降解的稳定性，以及减少的免疫原性。
常用于增强特性的有机的链状分子是基于聚乙二醇或基于聚乙烯的链，即基于重复单元-CH2CH2O-的链。在下文中，缩写“PEG”用于聚乙二醇。然而，用于制备PEG或基于PEG的链，甚至分子量相当低的那些链的技术涉及很难控制的聚合步骤，所述的聚合步骤导致制备物具有在平均值周围多种多样的链长。从而，基于PEG嫁接的肽缀合物通常由宽范围的分子量分布来表征。
Kochendoefer等最近描述了(Science 2003，299，884-887)均一的聚合物修饰的红细胞生成蛋白的设计与合成，并且在WO 02/20033(PCT专利申请案)中设计了用于合成经充分确定的聚合物修饰的肽的方法。用于该工作的结构单元是基于改变水溶性线性长链的亲水二胺和琥珀酸，其在溶液或固体载体上用标准肽化学通过依次加入而延长。
用于制备大的完全确定的聚合物的可替代方案和更有吸引力的策略依赖于二、三或多分叉的单体的使用，所述的单体在有限数量的依次合成步骤中寡聚化。在这种情形中，聚合物的大量生长将会遵循指数曲线，指数由分叉数决定，例如二叉单体提供2次幂的生长，三叉单体提供3次幂的生长等。通过这种方法获得的多聚体类型已经在文献(S.M.Grayson和J.M.J.Frechet，Chem.Rev.2001，101，3819)中充分描述并通称为树枝状大分子。
最近已经报导了可生物降解的第四代聚酯树枝状大分子(E.R.Gillies和J.M.J.Frechet，J.Amer.Chem.Soc，2002，124，14137-14146)，该树枝状大分子是基于2，2-二(羟甲基)丙酸并经由氨基甲酸酯键用聚氧化乙烯加帽。该体系的结构与如上描述的由Kochendoefer等描述的体系非常类似，因为该结构的树枝状部分用于产生用作聚氧化乙烯尾的连接位点的多羟基支架。然而，虽然可以制备给人深刻印象的12KDa的结构，但是从每个聚氧化乙烯尾部引入了大的分散度，因为只有核结构在化学上是完全确定的。
根据有关缀合至生物药物的完全确定的聚合物的许多潜在应用(例如，改变药物动力学和药效学)，本领域仍然持续需要改进用于以精确充分确定的方式，从精确数量的单体单元制备完全确定的聚合物和共聚物的技术。
发明概述
本发明提供了缀合至促胰岛素剂的新的一类支化聚合物。这些新的化合物具有在下文中提及的通式I，所述的通式I具有下文中提及的定义。式I化合物包含受控制数量的单体结构单元(在下面称为Yb和Yt)。
本发明还提供了如上缀合物作为药物的用途。
发明详述
在本说明书中，下列术语具有指出的含义：
如在本申请中使用的，术语“多肽”和“肽”意指由通过肽键连接的至少5个组成氨基酸组成的化合物。组成氨基酸可来自由遗传密码编码的氨基酸并且它们可以是不是由遗传密码编码的天然氨基酸以及合成氨基酸。不被遗传密码编码的天然氨基酸是例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酸。合成氨基酸包括通过化学合成生产的氨基酸，即由遗传密码编码的氨基酸的D-异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Tle(叔丁基甘氨酸)、β-丙氨酸、3-氨甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸。
如在本申请中使用的，涉及多肽的术语“类似物”意指经修饰的肽，其中所述的肽的一个或多个氨基酸残基已经由其它氨基酸残基取代和/或其中一个或多个氨基酸残基已经从该肽中缺失和/或其中一个或多个氨基酸残基已经加入至该肽中。这种氨基酸残基的加入或缺失可以在肽的N-端和/或肽的C-端发生。通常用一个简单的系统来描述类似物：例如[Arg34]GLP-1(7-37)Lys指GLP-1(7-37)类似物，其中在位置34的天然存在的赖氨酸已经用精氨酸取代并且其中将赖氨酸加入至末端氨基酸残基，即加入至Gly37。旋光异构体未说明的所有氨基酸应该理解为意指L-异构体。人GLP-1水解为GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)-酰胺，两者都是促胰岛素肽。因此，例如，[Gly8]GLP-1(7-37)指通过用Gly取代位置8天然存在的氨基酸残基(Ala)而在形式上源于GLP-1(7-37)的GLP-1(7-37)类似物。类似地，(Nε34-十四烷酰)[Lys34]GLP-1(7-37)指其中在位置34的Lys残基的ε-氨基已经十四烷酰化的GLP-1(7-37)。在本发明的多个方面，GLP-1或毒蜥外泌肽-4的类似物与天然序列比较，已经加入、缺失或置换了最多15个氨基酸，在本发明的多个方面，已经加入、缺失或置换了最多12个氨基酸。在本发明的多个方面，已经加入、缺失或置换了最多10个氨基酸。在本发明的多个方面，已经加入、缺失或置换了最多8个氨基酸。在本发明的多个方面，已经加入、缺失或置换了最多6个氨基酸。在本发明的多个方面，已经加入、缺失或置换了最多4个氨基酸。在本发明的多个方面，已经加入、缺失或置换了最多2个氨基酸。
如在本申请中使用的，有关肽的术语“衍生物”意指经化学修饰的肽或其类似物，其中至少一个取代基不存在于未经修饰的肽或其类似物中，即意指已经经共价修饰的肽。典型的修饰是酰胺、糖类、烷基、酰基、酯等。GLP-1(7-37)衍生物的实例是Nε26-((4S)-4-(十六烷酰基氨基)-丁酰基)[Arg34，Lys26]GLP-1-(7-37)。
在本申请中使用的，术语“促胰岛素剂”意指为人GLP-1受体激动剂的化合物，即刺激cAMP在含有人GLP-1受体的合适培养基(在下文中公开了一种这样的培养基)中形成的化合物。促胰岛素剂的效力通过从如下面描述的剂量-反应曲线计算EC50值来测定。
将表达克隆的人GLP-1受体的幼仓鼠肾(BHK)细胞(BHK-467-12A)在加入了100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、5％胎牛血清和0.5mg/mL遗传霉素G-418(Life Technologies)的DMEM培养基中生长。在磷酸盐缓冲盐水中洗涤细胞两次并用Versene收获。在缓冲液1(20mM HEPES-Na，10mM EDTA，pH 7.4)中通过用Ultraturrax均质化从细胞制备质膜。于4℃将匀浆以48,000xg离心15分钟。通过匀化使沉淀颗粒悬浮于缓冲液2(20mM HEPES-Na，0.1mM EDTA，pH7.4)中，随后将其于4℃以48,000xg离心15分钟。将洗涤步骤再次重复一次。将最终的沉淀颗粒悬浮于缓冲液2中并立即用于检测或在-80℃下储存。
通过测量作为对促胰岛素剂刺激的反应的环磷腺苷(cAMP)进行功能受体测定法。通过AlphaScreenTM cAMP试剂盒(Perkin ElmerLife Sciences)定量形成的cAMP。孵育在半面积(half-area)96-孔微量滴定板中在50μL总体积的缓冲液3(50mM Tris-HCl，5mMHEPES，10mM MgCl2，pH7.4)中完成并随后加入：1mM ATP、1μM GTP、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.01％吐温20、0.1％BSA、6μg膜制备物、15μg/mL受体珠、用6nM生物素基-cAMP预孵育的20μg/mL供体珠。将要检测激动剂活性的化合物溶解并稀释于缓冲液3中。对每个试验新鲜制备GTP。在室温下于黑暗中缓慢搅动孵育平板3小时，随后将其在FusionTM仪器(PerkinElmer Life Sciences)中计数。使用Prism v.4.0用4参数逻辑模型(GraphPad，Carlsbad，CA)绘制每种化合物的浓度-反应曲线并估计EC50值。
在本申请中使用的，术语“GLP-1肽”意指GLP-1(7-37)(SEQ IDNo 1)、GLP-1(7-37)类似物、GLP-1(7-37)衍生物或GLP-1(7-37)类似物的衍生物。在一个实施方案中，GLP-1肽是促胰岛素剂。
如在本申请中使用的，术语“毒蜥外泌肽-4肽”意指毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID No 2)、毒蜥外泌肽-4(1-39)类似物、毒蜥外泌肽-4(1-39)衍生物或毒蜥外泌肽-4(1-39)类似物的衍生物。在一个实施方案中毒蜥外泌肽-4肽是一种促胰岛素剂。
在本申请中使用的，涉及多肽的术语“DPP-IV保护的”意指这样一种多肽，该多肽已经经化学修饰以便使所述化合物能够抗血浆肽酶二肽基氨基肽酶-4(DPP-IV)。已知血浆中的DPP-IV酶参与多种肽激素如GLP-1、GLP-2、毒蜥外泌肽-4等的降解。因此，正在做出相当大的努力来开发易受DPP-IV介导的水解作用影响的多肽的类似物和衍生物，以便减小DPP-IV降解速率。在一个实施方案中，DPP-IV保护的肽比GLP-1(7-37)或毒蜥外泌肽-4(1-39)更能抗DPP-IV。
肽对二肽基氨基肽酶IV降解的抗性可通过下面的降解测定法测定：
在37℃下于100μL的0.1M pH 7.4的三乙胺-HCl缓冲液中，将肽的等分样品(5nmol)用相当于5mU酶活性的1μL纯化的二肽基氨基肽酶IV孵育10-180分钟。通过加入5μL的10％三氟乙酸终止酶促反应，并使用HPLC分析分离和定量肽降解产物。用于实施该分析的一种方法是：根据Siegel等Regul.Pept.1999；79：93-102和Mentlein等.Eur.J.Biochem.1993；214：829-35，将混合物应用到Vydac C18widepore(30nm小孔，5μm粒子)250×4.6mm柱上并用0.1％三氟乙酸中的乙腈的线性阶式梯度(0％的乙腈3分钟，0-24％的乙腈17分钟，24-48％的乙腈1分钟)以1ml/分钟流速洗脱。肽和它们的降解产物可通过它们在220nm(肽键)或280nm(芳族氨基酸)处的吸光度监控，并通过将它们与标准品的那些相关的峰面积积分来定量。在引起少于10％的肽受到水解的孵育次数下估计二肽基氨基肽酶IV水解肽的速率。
使用所谓的游离脂肪细胞测定法的结果，任何熟练的技术人员(例如医师)知道施用GLP-1类似物的时间和剂量。
术语“共价连接”意指通过聚合体分子和GLP-1彼此直接共价连接或通过插入部分或多个部分，例如桥、间隔体，或键部分或多个部分彼此间接共价连接。
术语“支化聚合物”，或“树枝状聚合物”或“树枝状结构”或“树枝状大分子”意指从一些含有分支的单体结构单元的选择组装成的有机聚合物。
术语“缀合物”或“缀合物GLP-1”旨在表示通过共价连接一个或多个GLP-1类似物至一个或多个聚合物分子而形成的异质(从组合或嵌合的意义上说)分子。
术语“多分散性”用于表示聚合物的纯度。术语“多分散性指数”(PDI)是Mw与Mn的比率，其中Mw是∑(Mi 2Ni)/∑(MiNi)而Mn是∑(MiNi)/∑(Ni)，其中Mi是存在于混合物中的单个分子的分子量，而Ni是用某一分子量表示的分子的数目。PDI提供了存在于混合物中的特定聚合物的分布宽度的近似示度。如果某种聚合物的PDI是1，则所述的聚合物具有100％的纯度。对于小代数的聚合物，例如1-3代，标出表示PDI的纯度可能是更方便的。然而，对于更长的聚合物，使用PDI可能更方便。
在本申请中，术语“单分散性的”用于PDI小于1.09的聚合物。在一个实施方案中，其小于1.08。在一个实施方案中，其小于1.07并至少为1。
在本申请中，关于产物的术语“结构完全确定的”表示该产物具有高纯度的特定的、化学上完全确定的化合物。在一个实施方案中，这种纯度大于约80％。在一个实施方案中，这种纯度大于约90％。在一个实施方案中，这种纯度大于约95％。在一个实施方案中，这种纯度大于约97.5％。
聚合物修饰的GLP-1的“免疫原性”是指聚合物修饰的GLP-1在施用给人时引起免疫应答(体液免疫应答、细胞免疫应答，或两者)的能力。
术语“连接基团”旨在表示能直接或通过连接体间接连接聚合物分子的GLP-1或连接体修饰的GLP-1上的官能团。有用的连接基团是，例如胺、羟基、羧基、醛、酮、巯基、琥珀酰亚氨基、马来酰亚胺、乙烯基砜或卤代乙酸酯。
以举例说明的方式而不作为限制，术语“反应性官能团”意指任意游离的氨基、羧基、硫醇、烷基卤、酰卤、氯甲酸酯、芳氧基碳酸酯、羟基或醛基团，碳酸酯如对硝基苯基，或琥珀酰亚氨基；羰基咪唑类、碳酰氯类；在原位活化的羧酸；碳酰卤、活化的酯如N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、例如那些除基团如-NH2、-OH、-N3、-NHR’或-OR，(其中R’是如下面定义的保护基)、-O-NH2、炔烃之外，还含有1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮、亚膦酰胺和H-膦酸酯、原位活化的磷酸三酯(phosphortriesters)或磷酸二酯(phosphordiesters)、异氰酸酯或异硫代氰酸酯的酯，或任意下面基团：肼衍生物(-NH-NH2)、肼羧酸酯衍生物(-O-C(O)-NH-NH2)、氨基脲衍生物(-NH-C(O)-NH-NH2)、氨基硫脲衍生物(-NH-C(S)-NH-NH2)、碳酸二酰肼衍生物(-NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH2)、卡巴肼衍生物(-NH-NH-C(O)-NH-NH2)、硫代卡巴肼衍生物(-NH-NH-C(S)-NH-NH2)、芳基肼衍生物(-NH-C(O)-C6H4-NH-NH2)、酰肼衍生物(-C(O)-NH-NH2)，以及氧胺衍生物，例如-C(O)-O-NH2、-NH-C(O)-O-NH2和-NH-C(S)-O-NH2。
术语“受保护的官能团”意指已经以使其基本上无活性的方式保护的官能团。用于胺的保护基团的实例包括(但不限于)叔丁氧基羰基、9-芴甲氧羰基、叠氮化物等。对于羧基，相关的其它基团例如叔丁基，或更一般地是烷基。合适的保护基是技术人员已知的，并且可以在Green&Wuts“Protection groups in organic synthesis”，第3版，Wiley-interscience中找到实例。
术语“可裂解部分”旨在意指能够经选择性裂解而从例如固体载体释放支化聚合物连接体或支化聚合物连接体GLP-1的部分。
术语“代”指通过将有机分子上的一个或多个相同官能团与特定结构单元反应而产生的单个均匀的层。树枝状大分子合成需要高水平的合成控制，这可通过分步反应，一次构建树枝状大分子的一单体层或“代”而实现。每个树枝状大分子由多官能核心分子构成，该核心分子的一个树枝状楔与每个官能位点连接。将该核心分子称为“0代”。沿着所有分支的每个相继的重复单元形成了下一代，即“第1代”、“第2代”等，直到终端代。对于只由二叉单体构建的树枝状大分子，能反应的活性表面基团的数目是2m，其中m是表示特定代数的1、2、3...8的整数。对于仅由三叉单体构建的树枝状大分子，活性基团的数目是3m，并且对于仅由具有n个分支的多分叉单体构建的树枝状大分子，活性基团的数目是nm。对于其中每个单独的代中使用不同单体的支化聚合物，在一特定层或代中的活性基团的数目可以根据知道该层的位置和单独单体的分支的数目而递推计算。
术语“功能体内半衰期”是以它的正常含义使用的，即GLP-1或缀合物的50％的生物活性仍然存在于体内/靶器官内时的时间，或者是GLP-1或缀合物的活性为其初值的50％时的时间。作为测定功能体内半衰期的可替代方案，可以测定“血清半衰期”，即在被清除之前50％的GLP-1或缀合物分子在血浆或血流中循环时的时间。血清半衰期的测定通常比测定功能半衰期更简单，并且血清半衰期的大小通常是功能体内半衰期大小的好的指标。血清半衰期的可替代术语包括血浆半衰期、循环半衰期、循环的半衰期、血清清除率、血浆清除率，以及清除半衰期。GLP-1或缀合物通过一个或多个网状内皮系统(RES)、肾、脾或肝脏的作用而被清除，通过组织因子、SEC受体，或其它受体介导的清除而被清除，或通过特异性或非特异性蛋白质水解作用而被清除。通常，清除率取决于GLP-1的大小(相对于肾小球过滤的截断值)、电荷、连接的碳水化合物链，以及细胞受体的存在。要保留的功能性通常选自促凝血、蛋白水解、辅助因子结合或受体结合活性。功能体内半衰期和血清半衰期可以通过本领域已知的任何合适的方法测定。
关于功能体内半衰期或血浆半衰期使用的术语“增加的”用于表示GLP-1或缀合物相应的半衰期相对于参考分子统计学上显著地增加。例如，相关的半衰期可以增加至少约10％或至少25％，例如至少约50％，例如，至少约100％、150％、200％、250％或500％。
术语“卤素”表示氟、氯、溴或碘。
如在本申请中使用的，术语“重原子”表示摩尔重量等于或大于碳的原子，例如，C、N、O和S。
术语“烷基”、“亚烷基”、“烷三基(alkantriyl)”和“烷四基(alkantetrayl)”表示具有1-18个碳原子的饱和的、有分支的或直链烃基。在一个实施方案中，其为1-10个碳原子。在一个实施方案中，为分别具有一个、两个、三个或四个键的1-6个碳原子。典型的基团包括(但不限于)甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基。特定的亚烷基、烷三基和烷四基包括相应的二价、三价和四价基团。
术语“链烯基”和“亚链烯基”分别指C2-6-链烯基和C2-6-亚链烯基，并且分别表示具有2-6个碳原子和至少一个双键以及具有一个或两个键的支链或直链的烃基。典型的C2-6-链烯基包括(但不限于)乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、异丙烯基、1，3-丁二烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、1-乙基丙-2-烯基、1，1-(二甲基)丙-2-烯基、1-乙基丁-3-烯基，以及1，1-(二甲基)丁-2-烯基。C2-6-亚链烯基的实例包括相应的二价基团。
术语“炔基”或“亚炔基”指C2-6-炔基或C2-6-亚炔基，分别表示具有2-6个碳原子和至少一个三键以及具有一个或两个键的支链或直链的烃基。典型的C2-6-炔基包括，但不限于1-丙炔基、2-丙炔基、异丙炔基、1，3-丁二炔(1，3-butadynyl)、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、1-乙基丙-2-炔基、1，1-(二甲基)丙-2-炔基、1-乙基丁-3-炔基、1，1-(二甲基)丁-2-炔基，并且C2-6-亚炔基包括相应的二价基团。
术语“亚烷氧基”或“烷氧基”分别指表示基团-O-C1-6-烷基或-O-C1-6-亚烷基的“C1-6-烷氧基”或C1-6-亚烷氧基，其中C1-6-烷基(亚烷基)是如上定义的。代表性实例是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、异戊氧基、己氧基、异己氧基等。
术语“亚烷硫基”、“亚链烯硫基”和“亚炔硫基”指如上定义的氧-基团的相应硫代类似物。代表性实例是甲硫基、乙硫基、丙硫基、丁硫基、戊硫基、己硫基，以及也在上文中定义的相应的二价基团和相应的链烯基和炔基衍生物。
在本申请中，使用术语“-二基”和“-三基”并分别表示具有两个和三个连接点的不同的烷基、链烯基、炔基、环烷基或芳香基团。
在本申请中，术语“烷三氧基”指具有一个氧(-O-)连接至三个烷三基键的每一个的烷三基部分。代表性实例是丙三氧基、叔丁三氧基等。
术语“环烷基”指表示具有3-8个碳原子的单环的、碳环基团的C3-8-环烷基。代表性实例是环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。
术语“环烯基”指表示具有3-8个碳原子和至少一个双键的单环的、碳环、非芳族基团的C3-8-环烯基。代表性实例是环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基等。
术语“聚烷氧基”表示烷氧基-烷氧基-烷氧基-烷氧基等。其中每个烷氧基部分中的碳原子数是相同或不同的。在一个实施方案中，它们是相同的。类似地，聚烷氧烷基和聚烷氧烷基羰基分别表示(聚烷氧基)-烷基和(聚烷氧基)-烷基-CO-。术语聚烷氧二基表示具有两个游离键的烷氧基-烷氧基-烷氧基-烷氧基等。
术语“聚”表示许多。在一个实施方案中，它是范围为2-24的编号。在一个实施方案中，它是2-12。在一个实施方案中，它是3、4或5。
术语“氧烷基”是-O-烷基-，即一种二价基团。
如在本申请中使用的，术语“芳基”旨在包括碳环芳族环体系例如苯基、联苯基、萘基、蒽基、菲基、芴基、茚基、并环戊二烯基、甘菊环基等。芳基也旨在包括上面列举的碳环体系的部分氢化的衍生物。这种部分氢化的衍生物的非限制性实例是1，2，3，4-四氢萘基、1，4-二氢萘基等。
术语“芳烃三基”和“芳烃四基”是与如上定义的芳基一样的部分，条件是芳烃三基和芳烃四基中分别存在不是一个而是三和四个游离键。具有相同的条件，芳烃三基和芳烃四基的实例是如上关于芳基所提及的。
如在本申请中使用的，术语“杂芳基”旨在包括含有选自氮、氧和硫的一个或多个杂原子的杂环芳香环体系，例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、异噁唑基、异噻唑基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、吡喃基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、1，2，3-三嗪基、1，2，4-三嗪基、1，3，5-三嗪基、1，2，3-噁二唑基、1，2，4-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、1，2，3-噻二唑基、1，2，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、四唑基、噻二嗪基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并苯硫基(硫茚基)、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯异噻唑基、苯并噁唑基、苯异噁唑基、嘌呤基、喹唑啉基、喹嗪基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、二氮杂萘基、蝶啶基、咔唑基、氮杂基、二氮杂基、吖啶基等。杂芳基还旨在包括上面列举的杂环体系的部分氢化的衍生物。这种部分氢化的衍生物的非限制性实例是2，3-二氢苯并呋喃基、吡咯啉基、吡唑啉基、二氢吲哚基、噁唑烷基、噁唑啉基、氧氮杂基等。
如在本申请中使用的，术语杂芳基-C1-6-烷基表示如上定义的杂芳基和如上定义的C1-6-烷基。
如在本申请中使用的，术语“芳基-C1-6-烷基”和“芳基-C2-6-链烯基”表示如上定义的芳基并分别表示如上定义的C1-6-烷基和C2-6-链烯基。
如在本申请中使用的，术语“酰基”表示其中C1-6-烷基是如上定义的-(C＝O)-C1-6-烷基。
DMT是：
Figure A20068000537600251
三苯甲基是：
Figure A20068000537600252
Boc是：
Figure A20068000537600253
Fmoc是：
Figure A20068000537600254
某些上文中定义的术语可以不止一次出现于结构式中，并且在这样出现时每个术语应该是与另一个相互独立地定义。此外，当组合的术语用于二价或三价部分时，通过从左到右解读该组合的术语来将这种组合的术语解释成化学结构，或反之亦然。因此，术语像二价的氨基烷基部分也包括烷基-氨基部分。在本申请中，该术语部分优选用于二价和三价基团方面。
为了更具体说明，下面是由不同术语的组合组成的一些二价部分的名称，其后的方括号中为可替代的定义，和任选一个或多个这种二价部分的具体实例：亚烷基氨基羰基烷基氨基[-亚烷基-NH-CO-亚烷基-NH-，例如，-NH-CH2CH2-CO-NH-CH2CH2CH2CH2-]、亚烷基羰基氨基(聚烷氧基)烷基氨基[-亚烷基-CO-NH-(聚烷氧基)-亚烷基-NH-]、亚烷基氧烷基[-亚烷基-O-亚烷基-，例如-CH2CH2-O-CH2CH2-]、羰基烷基氨基[-CO-亚烷基-NH-，例如-NHCH2CH2C(O)-]、羰基烷基羰基氨基(聚烷氧基)烷基氨基[-CO-亚烷基-CO-NH-(聚烷氧基)-亚烷基-NH-]、羰基烷氧烷基氨基[-CO-烷氧基-亚烷基-NH-]、羰基烷氧烷基羰基氨基(聚烷氧基)烷基氨基[-CO-烷氧基-亚烷基-CO-NH-(聚烷氧基)-亚烷基-NH-]、羰基(聚烷氧基)烷基氨基[-CO-(聚烷氧基)-亚烷基-NH-]、(聚烷氧基)烷基[-(聚烷氧基)-亚烷基-，例如-CH2OCH2CH2OCH2CH2O-CH2-和-CH2CH2OCH2CH2O-CH2CH2O-CH2-]、(聚烷氧基)烷基羰基[-(聚烷氧基)-亚烷基-CO-]。在方括号中的式中，不同部分之间的键用“-”表示。
如在本申请中使用的，术语“任选取代的”意指所讨论的基团未经取代或经指定的一个或多个取代基取代。当所讨论的基团经不止一个取代基取代时，该取代基可以是相同的或不同的。
如在本申请中使用的，术语“治疗”意指预防、管理和看护患者，目的是对抗疾病、障碍或病症。该术语旨在包括预防疾病，延缓疾病、障碍或病症的发展，缓和或减轻症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症。在一个实施方案中，被治疗的患者是哺乳动物，尤其是人。
如在本申请中使用的，术语“赋形剂”意指通常加入至药物组合物中的化合物，例如缓冲剂、张力剂、防腐剂等。
在本申请中使用的，术语“有效量”意指与不治疗相比对患者的治疗足够有效的剂量。
在本申请中使用的，术语“药物组合物”意指包含活性化合物或其盐以及药物赋形剂(如缓冲剂、防腐剂和任选张力调节剂和/或稳定剂)的产品。因而，药物组合物在本领域也称为药物制剂。
本发明涉及连接至GLP-1的支化聚合物，所述的支化聚合物由精确数量的单体结构单元组成。单体结构单元可以用合适的单体保护和活化策略在固体载体或溶液中寡聚体化。连接至GLP-1的支化聚合物在这里也称为缀合的GLP-1或GLP-1缀合物。使用下面描述的方法，制备其中支化聚合物是结构完全确定的缀合GLP-1是可能的。因此，本发明化合物是单分散性的。使用在这里描述的方法，能够制备纯度大于50％的下面通式I的化合物。在一个实施方案中，其大于约75％。在一个实施方案中，其大于90％。在一个实施方案中，其大于95％。在一个实施方案中，其大于99％(重量/重量)。在一个实施方案中，本发明涉及含有如此高纯度的单个、特定的式I化合物的产品。
本发明的一个实施方案提供了如上描述的GLP-1缀合物，其由通式I表示：
ITA-L4-(L3)m-Y1(Y2(Y3(Y4(Y5(Y6)r)q)p)s)n    (I)
其中，ITA表示促胰岛素剂，从所述的促胰岛素剂中，一个氢已经从促胰岛素剂中存在的α-氨基上除去，或从存在于促胰岛素剂中任意位置的赖氨酸中的ε氨基上除去，
对于第一代二叉化合物，
Y1是Yb；Y2是Z；r、q、p和s都是0；并且n是2；
对于第二代二叉化合物，
Y1和Y2是Yb；Y3是Z；r、q和p都是0；s是4；并且n是2；
对于第三代二叉化合物，
Y1、Y2和Y3都是Yb；Y4是Z；r和q是0；p是8；s是4；
并且n是2；
对于第四代二叉化合物，
Y1、Y2、Y3和Y4都是Yb；Y5是Z；r是0；q是16；p是8；s是4；并且n是2；
并且对于第五代二叉化合物，
Y1、Y2、Y3、Y4和Y5都是Yb；Y6是Z；r是32；q是16；p是8；s是4；并且n是2；
其中
Yb是
Figure A20068000537600281
对于第一代三叉化合物，
Y1是Yt；Y2是Z；r、q、p和s都是0；并且n是3；
对于第二代三叉化合物，
Y1和Y2是Yt；Y3是Z；r、q和p都是0；s是9；并且n是3；
对于第三代三叉化合物，
Y1、Y2和Y3都是Yt；Y4是Z；r和q是0；p是27；s是9；
并且n是3；
并且对于第四代三叉化合物，
Y1、Y2、Y3和Y4都是Yt；Y5是Z；r是0；q是81；p是27；
s是9；并且n是3；
其中
Yt是
Figure A20068000537600282
其中A是-CO-、-C(O)O-、-P(＝O)(OR)-或-P(＝S)(OR)-，其中R是氢、烷基或任选取代的芳基；
并且B是-NH-或-O-；
条件为，当B是-NH-时，则A是-CO-或-C(O)O-，以及当B是-O-时，则A是-P(＝O)(OR)-或-P(＝S)(OR)-；
并且其中一个单体层(代)(例如Y1、Y2和Y3)的基团B连接至其中Y具有后面下标数字(例如分别为Y2；Y3和Y4)的邻近的、后一层的基团A，或者连接至Z；
X3是氮原子、烷三基、芳烃三基、烷三氧基、式-CO-N＜的氨基羰基部分、式-CH2CO-N＜的乙酰氨基部分或下式的部分
Figure A20068000537600291
其中Q是烷三基；
X4是烷四基或芳烃四基；
在本发明的实施方案中，L1是价键、氧、亚烷基、亚烷基氧烷基、聚烷氧二基、(聚烷氧基)烷基羰基、氧烷基或(聚烷氧基)烷基，其中最后的3个部分的末端烷基部分连接至A；
在本发明的实施方案中，L1在最后三个部分的氧-部分中连接至A。
在本发明的实施方案中，L2是价键、氧、亚烷基、亚烷基氧烷基、聚烷氧二基、(聚烷氧基)烷基羰基、氧烷基或(聚烷氧基)烷基，其中最后3个部分的末端烷基部分连接至B；
在本发明的实施方案中，L2在该二价基团的另一端连接至B。
在本发明的实施方案中，L3表示价键、亚烷基、氧、聚烷氧二基、氧烷基、烷基氨基、羰基烷基氨基、烷基氨基羰基烷基氨基、羰基烷基羰基氨基(聚烷氧基)烷基氨基、羰基烷氧烷基羰基氨基(聚烷氧基)烷基氨基、烷基羰基氨基(聚烷氧基)烷基氨基、羰基(聚烷氧基)烷基氨基或羰基烷氧烷基氨基，其中最后10个部分的末端羰基、烷基和氧部分任选通过L4部分连接至ITA基团；
在本发明的一个实施方案中，所述部分在该二价基团的另一端连接。
m是0、1、2或3；
在本发明的实施方案中，L4选自价键和式-CO-L5-CH＝N-O-的部分，其中L5是价键、亚烷基或亚芳基，并且其中所述的L4部分的末端羰基部分连接至ITA部分；
在本发明的实施方案中，这些部分在该二价基团的另一端连接。
并且
Z是氢、烷基、烷氧基、羟烷基、聚烷氧基、氧烷基、酰基、聚烷氧烷基、或聚烷氧烷基羰基。
如上定义的，L1、L2、L3和L4都应该理解为二价基团，X3是三价基团而X4是四价基团。
在本申请中上面和别处的式I定义中，使用二叉、三叉和代这三个术语来试图促进关于此点的理解并且它们不应该以任何方式导致受限的解释。
因此，第一代二叉化合物可以用式Ia说明：
ITA-L4-(L3)m-Y1(Y2)2(Ia)
其也可以用式Ia’说明：
Figure A20068000537600301
其中ITA、Y1、Y2、L3、L4、m、Yb和Z的每个是如上定义的。此外，第二代二叉化合物可以用式Ib说明：
ITA-L4-(L3)m-Y1(Y2(Y3)4)2(Ib)
其也可以用式Ib’说明：
Figure A20068000537600302
其中ITA、Y1、Y2、Y3、L3、L4、m、Yb和Z的每个是如上定义的。
可替代地，本发明可以通过绘制例如，如下面式Ic中的第四代二叉化合物的式来说明：
其中所有的符号是如上面提及的(并且垂直线不是式的一部分，而是说明不同的水平)。给出式Ic只是试图说明本发明并不用于限制保护的范围。
在本发明的实施方案中，r是0。在本发明的另一个实施方案中，r和q各自为0。在本发明的另一个实施方案中，n是2(对于二叉化合物)或3(对于三叉化合物)。在本发明的另一个实施方案中，s是4(对于二叉化合物)或9(对于三叉化合物)。在本发明的另一个实施方案中，s是4，以及p是8(对于二叉化合物)或者s是9以及p是27(对于三叉化合物)。
如上面提及的，式I化合物含有一个或多个Yb部分。如果式I化合物含有不止一个Yb部分，则那些部分可以是相同的或不同的。在本发明的一个实施方案中，所有的Yb部分是相同的。在本发明的另一个实施方案中，在式I中，相同水平上的Yb部分是相同的，但是一个水平上的Yb与另一水平上Yb部分不同，每个水平分别通过下标n、s、p、q和r确定。在特定的部分Yb中，两个B部分是相同的或不同的。在一个实施方案中，这样的两个B部分是相同的。此外，在一个实施方案中，特定的部分Yb、两个L2部分是相同的或不同的。在一个实施方案中，这样的两个L2部分是相同的。类似地，这适用于在本申请中给出的Yt部分以及B和L2部分。
在本发明的一个实施方案中，其涉及二叉化合物，在另一个实施方案中，其涉及三叉化合物。
分别存在于任意Yb或Yt部分中的两个或三个L2部分可以是相同的或不同的。在本发明的一个实施方案中，分别存在于任意Yb或Yt部分中的两个或三个L2部分是相同的。
至少用于说明目的而且在某种程度上于实践中，式I化合物的非促胰岛素剂的主要部分能够由具有下列式的式IVb或IVc化合物构建：
式IVb：
Figure A20068000537600321
式IVc：
其中L1、L2、X3和X4是如上定义的，并且其中-A’和-B’是能够反应形成部分-A-B-的基团；其中A和B是如上定义的。
通过基团A’和B’之间反应形成的共价键的性质取决于对A’和B’的选择，并且包括，如上面指出的，酰胺键、氨基甲酸酯键、磷酸酯键、硫代磷酸酯键和亚磷酸酯(phosphit)键。
在一个实施方案中，A’选自-COOH、-COOR、-OCOOR、-OP(NR2)OR、-(O＝)P(OR)2、-(S＝)P(OR)(OR′)、-(S＝)P(SR)(OR′)、-(S＝)P(SR)(SR′)、-COCl、-COBr、-OCOBr、-P(OR)3、对硝基苯基碳酸酯(-OC(＝O)OC6H4NO2)、琥珀酰亚胺基碳酸酯(-OC(＝O)-Nhs，其中Nhs是N-羟基琥珀酰亚胺)、羰基咪唑(-C(＝O)-Im，其中Im是咪唑)、氧基羰基咪唑(-OC(＝O)-Im，其中Im是咪唑)、碳酰氯类(-C(＝O)Cl)、氯甲酸酯(-OC(＝O)Cl)、异氰酸酯(-N＝C＝O)和异硫氰酸酯(-N＝C＝S)，其中R和R’表示C1-6-烷基、芳基或经取代的芳基。
在另一个实施方案中，B’选自-NH2、-OH、-N3、-NHR’和-OR’；其中R’是保护基团，其有利于如，例如在肽化学和寡核苷酸化学中使用的分步的单体寡聚化。
保护基团的非限制性实例包括9-芴基甲氧羰基(称为Fmoc)、叔丁氧羰基(称为Boc)、邻苯二甲酰基、三苯甲基和经取代的三苯甲基、三卤乙酰基例如三氟乙酰基或三氯乙酰基、pixyl、三甲代甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基，以及叔丁基二苯基甲硅烷基。合适的保护基的其它实例是技术人员已知的，并且可以在Green&Wuts“Protection groups in organic synthesis”，第3版，Wiley-interscience中找到建议。
X3可以是分支的、三价有机基团(连接体)。在一个实施方案中，X3具有亲水性。在一个实施方案中，它包括含有至多18的多官能化烷基。在一个实施方案中，其含有1至约10个碳原子。在另一个实施方案中，X3是单个氮原子。在另一个实施方案中，X3是烷三基。在另一个实施方案中，X3是丙烷-1，2，3-三基。在另一个实施方案中，X3是烷三氧基。在另一个实施方案中，X3是烷三基、烷三氧基或式：-CO-NH-Q-NH-CO-的部分，其中Q是烷三基；
并且，因此，X3可以是式-CO-N＜的氨基羰基部分或者是式-CH2CO-N＜的乙酰氨基部分并且，在另一个实施方案中，X3具有下列式之一：
Figure A20068000537600341
最后两个部分是(R)和(S)-1，5-二(氨基羰基)戊基。
在本发明的一个实施方案中，X4是对称的。在一个实施方案中，X4是苯-1，3，4，5-四基。
在本发明的另一个实施方案中，X3或X4是对称的。
L1和L2的实例是亚烷基和-((CH2)m’O)n’-，其中m’是2、3、4、5或6，并且n’是0至10的整数。在一个实施方案中，L1和L2是具有亲水性。在本发明的另一个实施方案中，L1、L2或两者都是价键。
在本发明的另一个实施方案中，L1是-CH2(OCH2CH2)n”-OCH2C(O)-，其中n”是0至10的整数。
在本发明的另一个实施方案中，L1和L2独立地选自水溶性有机二价基团。在本发明的另一个实施方案中，L1或L2或两者都是含有约1-5个PEG(-CH2CH2O-)基团的二价有机基团。在本发明的另一个实施方案中，L1和L2每个彼此独立地是三、四或五乙二醇部分，即(-CH2CH2O-)3、(-CH2CH2O-)4或(-CH2CH2O-)5。在本发明的另一个实施方案中，L1是氧(-O-)或氧甲基(-OCH2-)，并且L2是式(-CH2CH2O-)2的部分，其也具有式：
Figure A20068000537600342
在本发明的一个实施方案中，L1是价键、氧、亚烷基氧烷基、氧烷基或(聚烷氧基)烷基。在一个实施方案中，L1是价键、-O-或下列三个部分之一：-OCH2-、-CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2-和-CH2OCH2-。在本发明的另一个实施方案中，L1是价键、氧、亚烷基、聚烷氧二基或氧烷基。在另一个实施方案中，L1是(聚烷氧基)烷基羰基、氧烷基或(聚烷氧基)烷基，其中末端烷基部分优选连接至A。在一个实施方案中，这些部分在该二价基团的另一端连接。
在本发明的一个实施方案中，L2是亚烷基、亚烷基氧烷基、聚烷氧二基或(聚烷氧基)烷基。在一个实施方案中，L2是下列四个部分之一：部分：-CH2CH2OCH2CH2O-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2-、-CH2CH2OCH2CH2-或-CH2CH2-。在本发明的另一个实施方案中，L2是价键、氧、亚烷基、聚烷氧二基或氧烷基。在另一个实施方案中，L2是(聚烷氧基)烷基羰基、氧烷基或(聚烷氧基)烷基，其中末端烷基部分优选连接至B。在一个实施方案中，这些部分在该二价基团的另一端连接。
在本发明的一个实施方案中，X3是氮原子、烷三基、芳烃三基或下列式的部分：
Figure A20068000537600351
其中Q是烷三基。
在本发明的一个实施方案中，Q是1，1，5-戊三基。
在本发明的一个实施方案中，m是整数或1、2或3。在本发明的另一个实施方案中，m是整数。在本发明的另一个实施方案中，m是1、2或3。
在本发明的一个实施方案中，L3是亚烷基、聚烷氧二基、氧、氧烷基和价键，L4是键，并且L3的一部分可以包含下面的部分之一：两种同分异构(顺式和反式)形式的氧基亚氨基芳基羰基(-O-N＝CH-Ar-CO-)和两种同分异构(顺式和反式)形式的氧基亚氨基羰基(-O-N＝CH-CO-)，在这种情况下，作为孔的L3是氨基链烯基或氨基聚烷氧二基衍生物例如氨基烷基氧基亚氨基芳基羰基或氨基聚烷氧基亚氨基羰基。在本发明的另一个实施方案中，L3是亚烷基、聚烷氧二基、氧、氧烷基和价键，L4是键，并且L3的一部分可以包含下面的部分之一：两种同分异构(顺式和反式)形式的氧基亚氨基甲基芳基羰基(-O-N＝CH-Ar-CO-)和两种同分异构(顺式和反式)形式的氧基亚氨基乙酰基(-O-N＝CH-CO-)，在这种情况下，作为孔的L3是氨基链烯基或氨基聚烷氧二基衍生物例如氨基烷基氧基亚氨基甲基芳基羰基或氨基聚烷氧基亚氨基乙酰基。在本发明的另一个实施方案中，L3是烷基氨基、羰基烷基氨基或烷基氨基羰基烷基氨基。在一个实施方案中，L3是下列三个部分之一：-C(O)CH2CH2NH-、-CH2CH2CH2CH2NHC(O)CH2CH2NH-或-CH2CH2CH2CH2NH-。
在一个实施方案中，L3是价键或二价连接体基团，例如通过下列六个式所说明的那些基团：
Figure A20068000537600361
其中所述二价基团的每一端能够连接至ITA基团。在一个实施方案中，ITA基团通过羰基连接。
在一个实施方案中，L4和邻近的L3是二价连接体基团，例如通过下面8个式所说明的那些基团：
Figure A20068000537600362
其中所述二价基团的每一端能够连接至ITA基团。在实施方案中，羰基连接至ITA基团。
在本发明的一个实施方案中，L4是氧基亚氨基烷基羰基部分，例如两种同分异构(顺式和反式)形式的氧基亚氨基乙酰基(-O-N＝CH-CO-)。在本发明的另一个实施方案中，L4是氧基亚氨基烷基芳基羰基部分，例如两种同分异构(顺式和反式)形式的氧基亚氨基烷基芳基羰基(-O-N＝CH-Ar-CO-)。在本发明的另一个实施方案中，L4是价键。在本发明的另一个实施方案中，L4是顺式或反式的下式部分之一：
Figure A20068000537600371
在本发明的另一个实施方案中，L4是顺式和反式的下式部分：
Figure A20068000537600372
在本发明的一个实施方案中，A是-CO-、-C(O)O-、-P(＝O)(OR)-或-P(＝S)(OR)-，其中R是氢。在一个实施方案中，A是-CO-、-C(O)O-、-P(O)O--或-P(S)O-
在本发明的一个实施方案中，B是-NH-或-O-。
在本发明的一个实施方案中，Z是氢、烷基、酰基或聚烷氧烷基羰基并且在一个实施方案中，Z是H-、CH3OCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)-、CH3-或C6H5C(O)-。在一个实施方案中，Z是氢或下面的三个基团之一：CH3OCH2CH2OCH2CH2O-CH2C(O)-、CH3-和C6H5C(O)-。
在本发明的一个实施方案中，A’是羧基，并且B’是受保护的氨基，所述受保护氨基在去保护后可以通过它的羧基偶合至相同结构的新单体上形成酰胺。如从标准的寡肽合成已知的，可以以重复的方式组装更大的聚合物。在本发明的另一个实施方案中，A’是对硝基苯基碳酸酯(-C(O)-O-pC4H6NO2)、羰基咪唑(-C(O)-Im)、-COOH或-C(O)Cl。在本发明的另一个实施方案中，B’是N3-、FmocNH-或下式之一的基团：
在一个实施方案中，L3是氨基烷基，它的碳原子连接至含有ITA-L4部分的式I的部分。在一个实施方案中，L3是氧烷基，它的碳原子连接至含有ITA-L4部分的式I的部分。在一个实施方案中，L1是聚烷氧二基、聚烷氧烷基或氧烷基，它的末端亚烷基部分连接至A部分。在一个实施方案中，L2是聚烷氧二基或氧烷基，它的氧基部分连接至X3和X4部分。
在本发明的另一个实施方案中，A’是亚磷酰胺而B’是经适当保护的羟基，其一旦去保护后能偶合至相同类型的另一个单体而形成亚磷酸三酯，所述的亚磷酸三酯随后氧化形成稳定的磷酸三酯或硫代磷酸三酯。因此，如从标准的寡核苷酸合成已知的，可以以重复的方式组装更大的聚合物。
在另一个实施方案中，A’是活性碳酸酯例如硝基苯基碳酸酯，并且B’是氨基。在一个实施方案中，这是其受保护形式。因此，如从标准的寡氨基甲酸酯类合成得知的，可以以重复的方式组装更大的聚合物。
在另一个实施方案中，A’是酰卤例如-COCl或-COBr，并且B’是氨基。在一个实施方案中，这是其保护形式的。在一个实施方案中，A是下列三个部分之一：-CO-、-P(O)O-和-P(S)O-。在一个实施方案中，B是氧或部分-NH-。
在一个实施方案中，本发明化合物的支化聚合物具有大于约500Da的分子量。在一个实施方案中，其大于约3kDa。在一个实施方案中，其大于约5kDa。
在一个实施方案中，本发明化合物的支化聚合物具有小于约10kDa的分子量。在一个实施方案中，其小于约7kDa。
在一个实施方案中，本发明化合物具有约3-约7的等电点。
在一个实施方案中，在生理条件下本发明化合物具有净负电荷。
在进一步的实施方案中，式A’-L1-X3-(L2-B’)2的单体结构单元是
Figure A20068000537600391
在另一个实施方案中，式A’-L1-X3-(L2-B’)2的单体结构单元是
在另一个实施方案中，式A’-L1-X3-(L2-B’)2的单体结构单元是
在一个实施方案中，L3是二价的连接体基团例如下面的三个式：
Figure A20068000537600394
在一个实施方案中，Z是能够与末端氨基或羟基反应的加帽剂。在一个实施方案中，Z包括下面的三个实例：
Figure A20068000537600401
在一个实施方案中，对于二叉化合物，式I化合物的非ITA部分的主要部分由式A’-L1-X3-(L2-B’)2的单体构建：
Figure A20068000537600402
Figure A20068000537600411
Figure A20068000537600421
Figure A20068000537600431
在本发明的一个实施方案中，对于三叉化合物，式I化合物的非ITA部分的主要部分由式A’-L1-X4-(L2-B’)3的单体构建：
Figure A20068000537600432
在一个实施方案中，ITA是来自任意天然种类的GLP-1及其盐、GLP-1的活性衍生物，或GLP-1类似物，从中如上面提及的氢原子已经除去。依然在进一步的实施方案中，ITA是在下面实施例中特别提及的任意GLP-1分子，从中已经如上面提及的氢原子除去。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂衍生自具有27-45个氨基酸残基长的肽，所述的氨基酸残基中，最初的28个氨基酸残基中有22个与在GLP-1(7-37)(SEQ ID No.1)相应位置或在毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID No.2)相应位置发现的那些氨基酸残基一致。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂衍生自具有28-45个氨基酸残基长的肽，所述的氨基酸残基中，最初的28个氨基酸残基中有22个与在GLP-1(7-37)相应位置或在毒蜥外泌肽-4(1-39)相应位置发现的那些氨基酸残基一致。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂选自包含下列式(II)的氨基酸序列的肽：
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46
式(II)(SEQ ID No：3)
其中Xaa7是L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa8是Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸或(1-氨基环辛基)羧酸；
Xaa16是Val或Leu；
Xaa18是Ser、Lys或Arg；
Xaa19是Tyr或Gln；
Xaa20是Leu或Met；
Xaa22是Gly、Glu或Aib；
Xaa23是Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa25是Ala或Val；
Xaa26是Lys、Glu或Arg；
Xaa27是Glu或Leu；
Xaa30是Ala、Glu或Arg；
Xaa33是Val或Lys；
Xaa34是Lys、Glu、Asn或Arg；
Xaa35是Gly或Aib；
Xaa36是Arg、Gly或Lys；
Xaa37是Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺或不存在；
Xaa38是Lys、Ser、酰胺或不存在；
Xaa39是Ser、Lys、酰胺或不存在；
Xaa40是Gly、酰胺或不存在；
Xaa41是Ala、酰胺或不存在；
Xaa42是Pro、酰胺或不存在；
Xaa43是Pro、酰胺或不存在；
Xaa44是Pro、酰胺或不存在；
Xaa45是Ser、酰胺或不存在；
Xaa46是酰胺或不存在；
条件是假如Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45或Xaa46不存在，则下游每个氨基酸残基也不存在。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂是包含下列式(III)的氨基酸序列的肽：
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38
式(III)(SEQ ID No：4)
其中Xaa7是L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa8是Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸或(1-氨基环辛基)羧酸；
Xaa18是Ser、Lys或Arg；
Xaa22是Gly、Glu或Aib；
Xaa23是Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa26是Lys、Glu或Arg；
Xaa30是Ala、Glu或Arg；
Xaa34是Lys、Glu或Arg；
Xaa35是Gly或Aib；
Xaa36是Arg或Lys；
Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys；
Xaa38是Lys、酰胺或不存在。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂选自GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-36)-酰胺、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)、GLP-1(7-41)或其类似物。
在本发明的另一个实施方案中，与GLP-1(7-37)(SEQ ID No.1)比较，促胰岛素剂包含不多于15个经交换、加入或缺失的氨基酸残基，或者与GLP-1(7-37)(SEQ ID No.1)比较，包含不多于10个经交换、加入或缺失的氨基酸残基。
在本发明的另一个实施方案中，与GLP-1(7-37)(SEQ ID No.1)比较，促胰岛素剂包含不多于6个经交换、加入或缺失的氨基酸残基。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂包含不多于4个不是由遗传密码编码的氨基酸残基。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂包含Aib残基作为N-端的第二个氨基酸残基。
在本发明的另一个实施方案中，所述的促胰岛素剂的N-端氨基酸残基(式II和III的位置7)选自D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂选自[Arg34]GLP-1(7-37)、[Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Lys36Arg26，34]GLP-1(7-36)、[Aib8，22，35]GLP-1(7-37)、[Aib8，35]GLP-1(7-37)、[Aib8，22]GLP-1(7-37)、[Aib8，22，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Lys37]GLP-1(7-37)、[Aib8，35Lys37]GLP-1(7-37)、[Aib8，22Lys37]GLP-1(7-37)或其衍生物，其已经在C-端酰胺化。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂包含至少一个Aib残基。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂包含两个Aib残基。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂在相对于GLP-1(7-37)(SEQ ID.No.1)的位置18，相当于相对于毒蜥外泌肽-4(1-39)的位置12包含丝氨酸残基。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂在相对于GLP-1(7-37)(SEQ ID.No.1)的位置19，相当于相对于毒蜥外泌肽-4(1-39)的位置13包含酪氨酸残基。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂在相对于GLP-1(7-37)(SEQ ID.No.1)的位置22，相当于相对于毒蜥外泌肽-4(1-39)的位置16包含甘氨酸残基。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂在相对于GLP-1(7-37)(SEQ ID.No.1)的位置23，相当于相对于毒蜥外泌肽-4(1-39)的位置17包含谷氨酰胺残基。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂在相对于GLP-1(7-37)(SEQ ID.No.1)的位置26，相当于相对于毒蜥外泌肽-4(1-39)的位置20包含赖氨酸残基。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂在相对于GLP-1(7-37)(SEQ ID.No.1)的位置27，相当于相对于毒蜥外泌肽-4(1-39)的位置21包含谷氨酸残基。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂是毒蜥外泌肽-4(1-39)。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂是ZP-10，即[Ser38Lys39]毒蜥外泌肽-4(1-39)LysLysLysLysLys-酰胺(SEQ ID No.5)。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂通过相对于氨基酸序列SEQ ID No 1的位置25至45的氨基酸残基连接至支化聚合物。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂通过选自10个C-端氨基酸残基之一的氨基酸残基连接至支化聚合物。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂通过相对于氨基酸序列SEQ ID No：1的位置23、26、34、36或38的氨基酸残基连接至支化聚合物。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂通过相对于氨基酸序列SEQ ID No：2的位置17、20、28、30或32的氨基酸残基连接至支化聚合物。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂通过C-端氨基酸残基连接至支化聚合物。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂通过羧基、氨基、酮基、羟基、巯基或酰肼基团连接至支化聚合物。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂通过赖氨酸残基上的ε氨基连接至支化聚合物。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂只包含一个赖氨酸残基。
在本发明的另一个实施方案中，促胰岛素剂只包含一个赖氨酸残基，所述的赖氨酸残基是所述的促胰岛素剂的C-端氨基酸残基。
在另一个实施方案中，如通过本申请中公开的功能性受体测定法测定的，根据本发明的化合物具有小于1000pM、小于500pM、小于300pM、小于200pM、小于100pM、小于50pM或小于10pM的EC50。
在另一个实施方案中，根据本发明的化合物选自
GLP-1类似物可以使用t-Boc或F-Moc化学或其它充分确定的技术，通过就经典的肽合成法，例如固相肽合成法生产，见实例例如Houben-Weyl，Methods of organic Chemistry，Volume E 22a，E 22b and E22c；Green和Wuts，“Protecting Groups in Organic Synthesis”，JognWiley&Sons，1999。当促胰岛素剂是含有非天然氨基酸残基的肽时，这些方法是优选的。
当促胰岛素试剂是只包含由遗传密码编码的氨基酸残基的多肽时，该多肽可通过这样的方法生产：该方法包括培养含有编码多肽的DNA序列并能在合适的营养培养基中于允许该肽表达的条件下表达该多肽的宿主细胞，之后从培养物中回收产生的肽并然后将其衍生为式(I)化合物。
用于培养该细胞的培养基可以是适于生长宿主细胞的任何常规培养基，例如包含适当添加物的基本培养基或复合培养基。合适的培养基可从商业供应厂商获得或可以根据公开的配方(例如在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。然后可以通过常规方法从培养基回收细胞产生的肽，所述的常规方法包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞。对于胞外产物，上清液的蛋白质成分可通过过滤、柱色谱法或沉淀，如微过滤、超滤、等电沉淀，通过用多种色谱方法，如离子交换色谱法、疏水作用色谱法、凝胶过滤色谱法、亲合色谱法等纯化来分离，这取决于所讨论的多肽的类型。对于包内或周质产物，将从培养基中分离的细胞分裂或渗透并经萃取以回收产物多肽或其前体。
编码治疗多肽的DNA序列可适当地具有基因组或cDNA起源，可以例如根据标准技术(见，例如Sambrook，J，Fritsch，EF和Maniatis，T，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，1989)，通过制备基因组或cDNA文库并用合成的寡核苷酸探针通过杂交筛选编码全长肽或肽部分的DNA序列而获得。编码多肽的DNA序列也可以通过建立的标准方法，例如由Beaucage和Caruthers描述的亚磷酰胺(phosphoamidite)方法，Tetrahedron Letters22(1981)，1859-1869或由Matthes等描述的方法，EMBO Journal 3(1984)，801-805而合成制备。该DNA序列也可以使用特定引物，通过聚合酶链式反应制备，例如在US 4,683,202或Saiki等，Science 239(1988年)，487-491中描述的。
该DNA序列可以插入至可方便地接受重组DNA操作的任何载体中，并且载体的选择通常取决于其将被引入的宿主细胞。因此，该载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，该载体的复制不依赖于染色体复制，例如质粒。可替代地，该载体可以是当将其被引入宿主细胞时，整合进入宿主细胞基因组并与其已经整合进入的染色体一起复制的载体。
在一个实施方案中，该载体是其中编码多肽的DNA序列有效连接至DNA转录所需的额外片段(例如启动子)上的表达载体。该启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列并且可源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于在多种宿主细胞中引导编码本发明的肽的DNA转录的合适启动子的实例是本领域熟知的，参见例如Sambrook等，同上。
如果需要，编码多肽的DNA序列也可以有效地连接至合适的终止子、聚腺苷酸化信号、转录增强子序列和翻译增强子序列。本发明的重组体载体可进一步包含使该载体能在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。
该载体也可以包含可选标记，例如其产物补充宿主细胞的缺陷的基因或赋予对药物(如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或甲氨蝶呤)抗性的基因。在大规模生产的实施方案中，可选标记不是抗生素抗性的，例如，当载体用于大规模生产时切除了载体中的抗生素抗性基因。用于从载体中消除抗生素抗性基因的方法是本领域已知的，参见例如在这里通过引用作为参考的US 6,358,705。
为了将本发明母体肽引导进入宿主细胞的分泌路径中，可在重组体载体中提供分泌信号序列(也称为引导序列、前原序列或前序列)。将分泌信号序列连接至正确阅读框内的编码肽的DNA序列。分泌信号序列通常位于编码肽的DNA序列的5′。分泌信号序列可以是通常与肽结合的序列或者可能来自编码另一种分泌的蛋白质的基因。
用于连接分别编码本发明肽、启动子和任选终止子和/或分泌信号序列的DNA序列并将其插入至包含复制所需信息的合适载体的方法是本领域技术人员熟知的(参考，例如，Sambrook等，同上)。
DNA序列或重组体载体所引入的宿主细胞可以是能够生产本发明肽的任意细胞并包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。本领域熟知并使用的合适宿主细胞的实例是(而不限于)大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或哺乳动物BHK或CHO细胞系。
显然，通过组合在本申请中描述的一个或多个本发明实施方案(包括下文中的权利要求)，可得到新的实施方案。
通常，支化聚合物可使用称为趋异法和趋同法的两种基本不同的寡聚化策略之一，从上面描述的单体结构单元组装。
支化聚合物的发散型组装：
使用趋异法组装支化聚合物：
在一个实施方案中，支化化合物通过合成循环的迭代方法组装，其中每一次循环使用合适的活化的、活性二叉的或三叉单体结构单元，它们本身含有官能末端基团-使得进一步延伸(即，聚合物“生长”)。所述的官能末端基团通常需要保护以防止自身聚合，并且在这类情况下将需要去保护步骤以便产生进一步延伸所需的官能末端基团。在迭代方法中，加入活化的(活性)单体结构单元并随后去保护的这样一次循环完成一代。趋异方法在使用液相化学的反应方案4和使用固相化学的反应方案3中阐述。
支化聚合物的趋同组装：
然而，当在这种迭代方法中达到更高代数的材料时，常会出现高堆积密度的官能末端基团，其阻止了进一步规则生长而导致不完全的代。实际上，对于生长需要大量表面官能团反应的所有系统，确保所有官能团在每一生长步骤中反应是困难的。由于在分步生长序列的后面阶段，未反应的官能末端基团可能导致失败的序列(截短)或假反应性，这在规则单分散和高度组织化支化结构的合成中造成了重大问题。
因此，在一个实施方案中，支化聚合物通过在美国专利5,041,516中描述的趋同法组装。构建大分子的趋同法包括通过在其外围，而不是如趋异法中在其核心开始来构建最后的分子。这避免了通常与在逐渐增大数量的位点处的反应相关的问题，例如共价键的不完全形成。
用于组装第二代支化聚合物的趋同法在反应方案1和反应方案2中阐述，其使用了涉及单体结构单元之一的具体实例。
支化聚合物的刚性可以通过设计特定的单体，例如通过使用刚性的核心结构(X3或X4)或通过使用刚性的连接体部分(L1和L2)来控制。在另一个实施方案中，刚性的调节通过在一个或多个特定层中使用混合有更大柔性的单体的刚性单体来获得。在另一个实施方案中，聚合物的总亲水性是可控制的。这通过在一个或多个树枝状层中，选择具有更大疏水性核结构(X3或X4)或更大疏水性连接体部分(L1和L2)的单体而实现。
在另一个实施方案中，在支化聚合物的外端层(Z)中使用不同的单体，所述的外端层在最终的GLP-1缀合物中将会暴露于周围环境中。在本申请中描述的一些单体具有如末端基团(B’)的受保护的胺官能，其在去保护步骤后，并且在生理条件下，即中性生理性缓冲至pH值约7.4时，将会质子化，导致整体结构带多个阳离子电荷。可替代地，中性结构可以通过用多种酰化剂加帽制备。如反应方案5中描述的一个实例使用了CH3(OCH2CH2)2CH2COOH用于加帽树枝状结构的最后层(Z)，否则其将会以胺终止。
在另一个实施方案中，提供了模拟天然存在的糖肽的支化聚合物，其通常在它们的N-聚糖的触角结构上具有多个带阴离子电荷的唾液酸作为终止基团。通过适当选择用于产生最后层(Z)的单体，这类聚糖可以模拟它们的多阴离子性质。一个这样的实例在反应方案6中描述，其中支化聚合物用琥珀酸单叔丁基酯加帽，其在用酸去保护后产生了在生理条件下带负电荷的聚合物表面。
将单体组装成聚合物可以例如在如Biopolymers 47，381-396(1998)中由N.J.Wells，A.Basso和M.Bradley描述的固相支持体上进行，或者例如，如在美国专利5,041,516中由Frechet等描述的，通过经典的液相化学在合适的有机溶剂中进行。
因此在一个实施方案中，如上文中描述的和在反应方案3中阐述的，在迭代趋异法中在用合适的键衍生的固相支持体上组装支化聚合物。对于用Fmoc或Boc保护的氨基基团(B’)，以及活性官能酰化部分(A’)设计的单体，适用于常规肽合成的固相方案可以方便地适用。在适用性上来说，标准固相技术例如在文献(参见Fields，编者，Solid phase peptide synthesis，在Meth Enzymol 289中)中描述的那些技术可以利用合适的可编程仪器(例如，ABI 430A)或类似的自制设备实施，或者使用用于分离和洗涤支持体的标准过滤技术手动进行。
对于具有，例如DMT保护的醇基团(B’)和例如活性亚磷酰胺(A’)的单体，用于标准寡核苷酸合成的固相设备例如AppliedBiosystems Expidite 8909，以及条件例如最近由M.Dubber和J.M.J.Fréchet在Bioconjugate chem.2003，14，239-246中描述的那些条件可方便地应用。根据常规亚磷酰胺法的这种磷酸二酯的固相合成通常需要将中间产物亚磷酸三酯氧化成磷酸三酯。这种类型的固相支持体氧化通常用碘/水或过氧化物(例如但不限于叔丁基过氧化氢和3-氯过苯甲酸)实现，并且要求有保护或无保护的单体抵抗氧化条件。亚磷酰胺法还能够通过在吡啶或有机硫化试剂例如3H-1，2-苯并二硫杂环戊二烯-3-酮-1，1-二氧化物中用元素硫简单置换碘来方便合成硫代磷酸酯(见，例如M.Dubber和J.M.J.Fréchet in Bioconjugate chem.2003，14，239-246)。
连接树脂的支化聚合物，在完成时，随后能够在合适的条件下从树脂上裂解。重要的是，在生长的聚合物和固相支持体之间的可裂解连接体是以这样方式选择，即它在单个单体的寡聚化过程中，包括在单个合成循环中使用的任何去保护步骤、氧化或还原步骤中将会保持完整，但是期望时在合适的条件下可以裂解，保留最终支化聚合物完整。技术人员将能够对连接体和支持体，以及寡聚化过程、去保护过程和任选氧化过程的反应条件，根据所讨论的单体而进行适当的选择。
用允许能连接单体单元并随后用作可裂解部分的合适官能团衍生的树脂是可商业获得的(见，例如Bachem和NovoBiochem的商品目录)。
在另一个实施方案中，支化聚合物在具有合适连接体的树脂上合成，所述的连接体一旦裂解就会产生具有官能团的支化聚合物产物，所述的官能团能够如下面描述的，在随后的液相缀合法中直接用作促胰岛素剂(ITA)的连接基团或者，可替代地，通过合适的化学方法能够转化成这样一种连接基团。
在另一个实施方案中，一定大小的树枝状支化聚合物和组合物用经典的液相技术合成。
在该实施方案中，支化聚合物在合适的溶剂中，通过依次添加合适的活化的单体至生长的聚合物来组装。在每次添加后，在可以起始构建下一代之前可能需要去保护步骤。使用过量的单体以便达到完全反应可能是理想的。在一个实施方案中，过量单体的去除利用了如下优点：亲水聚合物在乙醚或类似类型的溶剂中具有低的溶解性。因而，能够沉淀出生长的聚合物，留下过剩的单体、偶联剂、副产物等等于溶液中。随后可通过简单的倾析进行相分离。在实施方案中，通过离心随后通过倾析进行相分离。聚合物也能够在例如硅胶上通过常规色谱技术与副产物分离，或者如P.R.Ashton等在J.Org.Chem.1998，63，3429-3437中描述的，在正相或反相条件下采用HPLC或MPLC系统分离。可替代地，相当大的聚合物可以如E.R.Gillies和J.M.J.Fréchet在J.Am.Chem.Soc.2002，124，14137-14146中描述的，使用分子排阻色谱法，任选与透析组合来与低分子量组分(例如过剩的单体和副产物)分离。
在另一个实施方案中，使用趋同液相合成法。与固相技术比较，液相技术也使得用如上文描述以及由S.M.Grayson和J.M.J.Fréchet在Chem.Rev.2001，101，3819-3867中进一步综述的趋同方法用于组装支化聚合物成为可能。在该方法中，使用单体起始合成是理想的，其中最初将受保护的官能末端基团(B’)转化成最终会出现于最终支化聚合物外表面上的部分。因此，在多数情况下通式I的官能部分(A’)将需要适当保护，使得能对末端基团(B’)进行逐步的化学操作。官能部分(A’)的保护基的选择取决于实际官能团。例如，如果通式IVb或IVc中的A’是羧基，则可以通过TFA除去的叔丁酯衍生物将是适当的选择。合适的保护基是技术人员已知的，并且可以在Green&Wuts“Protection groups in organic synthesis”，第3版，Wiley-interscience中找到其它实例。支化聚合物的趋同组装在反应方案1和反应方案2中阐述。反应方案可以在下文中找到。在反应方案1的步骤(i)中，叔丁酯官能(A’)通过将合适的前体与α-溴乙酸叔丁酯反应制备。在步骤(ii)中，末端基团(B’)以这样一种方式操作，这种方式使得步骤(iii)与羧酸酰化，该羧酸在步骤(iv)中转化成酰卤。在步骤(v)中，除去叔丁基酯官能(A’)，产生末端(B’)加帽的单体。这种末端加帽的单体在反应方案2中用作制备第二代产物的原料，其中两当量用于与反应方案1中的步骤(ii)产物的酰化反应。该反应的产物是新的叔丁基酯，其在去保护后能够以迭代的方式再次进入反应方案2的起始步骤，产生更高代数的物质。
为了实现支化聚合物分子与促胰岛素剂(ITA)在溶液中或固相支持体上的共价连接，必须为支化聚合物提供活性柄，即提供活性官能团，所述的活性官能团的实例包括羧酸、伯氨基基团、酰肼类、O-烷基化的羟胺、硫醇、琥珀酸酯、丁二酸琥珀酰亚氨酯、丙酸琥珀酰亚氨酯、琥珀酰亚氨基羧甲基化产物(succimidyl carboxymethylates)、酰肼芳基碳酸酯和芳基氨基甲酸酯例如硝基苯基氨基甲酸酯和硝基苯基碳酸酯、氯碳酸酯、异硫氰酸酯、异氰酸酯、顺丁烯二酰亚胺，以及活化的酯例如：
Figure A20068000537600561
支化聚合物缀合至ITA通过熟练技术人员已知的常规方法进行。技术人员将认识到：要使用的活化法和/或缀合化学(例如，反应基团等的选择)取决于ITA上选择的连接基团(例如氨基、羟基、硫醇基等)和支化聚合物上选择的连接基团(例如，丙酸琥珀酰亚氨酯、硝基苯基碳酸酯、顺丁烯二酰亚胺、乙烯基砜、卤代乙酸酯等)。在另一个实施方案中，支化聚合物上的合适的连接部分(例如上面提及的那些)是用常规液相化学在支化聚合物已经组装后产生的。说明了用于产生含有羧酸基团的支化聚合物上的亲核连接部分的不同方式的本发明的实施方案，在反应方案7中列出。
作为引导用支化聚合物衍生物酰化赖氨酸上的ε氨基的可替代方法，开始可以用甲酰基衍生的羧酸(例如用活化如N-羟基琥珀酰亚胺酯、1-羟基苯并三唑酯等)来酰化促胰岛素剂(ITA)。获得的携带醛官能的ITA随后可以依次与本发明的单-、寡-或聚合的结构单元，通过将这两种成分混合于含水介质中而缩合，所述的结构单元适当地衍生为例如O-取代的羟胺、肼或酰肼，所述的含水介质任选含有中性、酸性或碱性pH的有机共溶剂。在这种情况下，L4是价键，并且通式I中的二价基团L3含有肟基团。部分L4加上邻接的L3的典型的非限制性实例包括(顺式和反式)：
Figure A20068000537600562
Figure A20068000537600571
和
Figure A20068000537600572
在实施方案中，L3是根据定义的二价基，并且L4选自价键和式-CO-L5-CH＝N-O-的部分，其中L5是价键、亚烷基或亚芳基，并且其中所述的L4部分的末端羰基部分连接至ITA部分。L4的典型的非限制性实例包括(顺式和反式)：
Figure A20068000537600573
可替代地，可以用部分衍生促胰岛素剂(ITA)，该部分在化学反应(例如高碘酸盐氧化作用)后，可以产生含有醛官能的ITA分子。携带醛官能的ITA随后可以如上与本发明的单-、寡-或聚合的结构单元，通过将这两种成分混合于含水介质中而缩合，所述的结构单元类似地衍生为例如O-取代的羟胺、肼或酰肼，所述的含水介质任选含有中性、酸性或碱性pH的有机共溶剂。
一个特别的实例是最初用丝氨酸酰化赖氨酸上的ε氨基，之后通过高碘酸裂解产生乙醛酰衍生的ITA。在这种情形中，二价L4部分加上邻接的L3部分的典型的非限制性实例包括(顺式和反式)：
Figure A20068000537600574
Figure A20068000537600575
和
Figure A20068000537600576
L3也可以是根据定义的二价基团，并且L4可以是氧基亚氨基烷基羰基基团。典型的非限制性实例包括(顺式和反式)：
在含水反应介质中将生物活性ITA与活化的支化聚合物反应，所述的反应介质经任选缓冲，这取决于ITA的pH要求。反应的最佳pH值通常在约6.5和约8之间。在一个实施方案中，对大多数ITA类似物而言为约7.4。
促胰岛素剂(ITA)稳定性、反应效率等的最佳反应条件是在本领域一般技术人员水平内的。在一个实施方案中，温度范围是约4℃至约37℃。反应介质的温度不能超过促胰岛素剂(ITA)可能变性或分解的温度。在一个实施方案中，将促胰岛素剂(ITA)与过量的活化的支化聚合物反应。反应后，回收缀合物并例如通过透滤法，柱色谱法包括分子排阻色谱法、离子交换色谱、亲和色谱法、电泳或其组合等纯化。
在一个实施方案中，缀合的方法是基于标准化学，其以以下的方式进行。支化聚合物具有在合成期间，例如，在反应方案7中所述的通过酰化二氨基烷基连接的氨基氧乙酸而连接的氨基氧乙酰基。ITA具有末端丝氨酸或苏氨酸残基，其根据Rose在J.Am.Chem.Soc.1994，116，30-33)和欧洲专利0243929中所述在温和条件下用高碘酸盐氧化成乙醛酰基。可替代地，醛官可以通过用含有醛或暂时保护的醛基的酰化部分酰化暴露的氨基(例如赖氨酸残基的ε氨基)而引入。支化的聚合物的氨基氧成分和ITA的醛成分以大概相等的比例，在含水溶液中以约1-10mM的浓度，在适度酸性条件下，例如约2-约5的pH值下，特别是在大约室温下混合，并且在缀合反应(在该情况下是肟化)后，进行反相高压液相色谱法(HPLC)和电喷射离子化质谱法(ES-MS)。反应速度取决于浓度、pH值和位阻因素，但通常在几小时内处于平衡，并且平衡非常有利于缀合(Rose等，BioconjugateChemistry 1996，7，552-556)。稍微过量(至多五倍)的一种成分促使该缀合反应朝向完成。如先前关于肟描述的，将产物分离并表征。ITA类似物例如通过反向HPLC(Rose，J.Am.Chem.Soc.，同上和Rose等，Bioconjugate Chemistry，同上)纯化。
在另一实施方案中，缀合方法以以下方式进行：支化聚合物如反应方案3中描述的在Sasrin或Wang树脂(Bachem)上合成。使用树脂生产商(Bachem)推荐的方法，将支化聚合物通过用二氯甲烷中的TFA反复处理从树脂上裂解并用甲醇中的吡啶中和裂解的聚合物溶液。如同GLP-1一样，在室温下(不施加热)蒸发掉溶剂并纯化裂解的聚合物后，活化连接至树脂的羧基(例如，用HBTU、TSTU或HATU活化)并通过肽化学的标准技术偶合至促胰岛素剂(ITA)上的亲核基团(例如氨基，即赖氨酸侧链上的ε氨基)上。如果需要，可通过众多纯化方法的一种，将经修饰的靶标分子或物质从反应混合物中纯化，所述的纯化方法是本领域一般技术人员所周知的，例如分子排阻色谱法、疏水作用色谱法、离子交换色谱法、制备型等电聚焦等。用于大分子纯化，特别是肽纯化的通用方法和原理可以在例如Seeres的“Protein Purification：Principles and Practice”，第2版，Springer-Verlag，New York，NY，(1987)中找到，在本申请中将其通过引用作为参考。
用于制备本发明化合物的许多母体GLP-1类似物或GLP-1衍生物是已知的(见L.B.Knudsen等，J.Med.Chem.2000，43，1664-1669的一系列非限制性实例)并且其它的可以与已知化合物的制备类似地制备或通过对本领域技术人员来说显而易见的其它方法制备。
前面是阐述促胰岛素剂(ITA)，包括GLP-1类似物，其适合于用于与支化聚合物缀合。应该理解，没有具体提到但具有合适特性的促胰岛素剂及类似物也是期望的并且在本发明的范围内。
在另一实施方案中，提供了水溶性聚合物。作为用于增强GLP-1类似物的特性的物质这是重要的。例如，通过缀合水溶性聚合物至GLP-1类似物来降低溶解性。与由非缀合GLP-1类似物产生的免疫应答比较，支化聚合物连接至具有固有免疫原特性的GLP-1类似物提供了具有降低的免疫应答，或增加的药物动力学性质、增加的贮藏期和增加的生物半衰期的缀合物。本发明提供了GLP-1类似物，其通过连接亲水的水溶性支化聚合物被修饰而基本上没有减少或干扰非修饰的GLP-1类似物的生物学活性。
本发明提供了由结构十分确定的聚合物修饰的GLP-1类似物，其基本上是均质的化合物，其中所述支化聚合物的代数十分确定。
本发明提供缀合物，所述的缀合物保留了非缀合的GLP-1的生物学活性。在本发明另一实施方案中，与非缀合的GLP-1比较，缀合的GLP-1具有改良的特征。
在本发明的另一实施方案中，缀合至GLP-1的某些部分的支化聚合物减少了GLP-1的生物利用度、效价和效能或活性。这种减少在基于持续释放原理的药物递送系统中是理想的。在另一实施方案中，考虑其中支化聚合物与连接体结合使用的持续释放原理，所述的连接体在生理条件下可以裂解，因而从支化聚合物上缓慢释放生物活性GLP-1。在该情形中，GLP-1在支化聚合物除去前可以是没有生物活性的。在一特定的实施方案中，可裂解的连接体是可作为例如血清中存在的蛋白酶的底物的小肽。
应该理解，设计所述的聚合体缀合物以便产生关于支化聚合物分子的数目、大小和组成(例如，代数和在每代中使用的特别的单体)以及GLP-1上的连接位点最优的分子。要使用的支化聚合物的特定分子量可以例如基于要获得的期望效果来选择。例如，如果所述缀合物的主要目的是获得具有高分子量的缀合物(例如，用于减少肾清除率)，缀合尽可能少数的高分子支化聚合物分子来获得理想的分子量通常是理想的。在另外的情形中，防止特异性的或非特异性的蛋白水解裂解或遮蔽GLP-1上的免疫原性表位可能是理想的，并且具有特定的低分子量的支化聚合物可能是最佳的选择。
因而，通过本发明，获得了具有细调的预定质量的聚合物衍生的GLP-1类似物(缀合物)。
仍然在本发明的另一实施方案中，将如此处描述制备的支化聚合物缀合至GLP-1。在本发明的另一实施方案中，这产生了具有增加的肺生物利用度的缀合物。在本发明的另一实施方案中，这产生了具有增加的肺部作用持续时间的缀合物。
在一个相关的实施方案中，将如此处描述的支化聚合物用于遮蔽从非-人来源获得的生物药物GLP-1上的免疫原性表位。
然而在另一实施方案中，将支化水溶性聚合物缀合至GLP-1上，所述的GLP-1处于其未经修饰的状态和在生理学条件下具有低的溶解性。
在另一实施方案中，本发明的某些GLP-1缀合物的体内半衰期提高了多于10％。在一个实施方案中，某些GLP-1缀合物的体内半衰期提高了多于25％。在一个实施方案中，GLP-1缀合物的体内半衰期提高了多于50％。在一个实施方案中，某些GLP-1缀合物的体内半衰期提高了多于75％。在一个实施方案中，某些GLP-1缀合物的体内半衰期提高了多于100％。在另一实施方案中，某些GLP-1的体内半衰期在缀合支化聚合物后增加了250％。
在另一实施方案中，本发明的某些GLP-1缀合物的功能体内半衰期提高了多于10％。在另一个实施方案中，某些GLP-1缀合物的功能体内半衰期提高了多于25％。在另一个实施方案中，某些GLP-1缀合物的功能体内半衰期提高了多于50％。在另一个实施方案中，某些GLP-1缀合物的功能体内半衰期提高了多于75％。在另一个实施方案中，某些GLP-1缀合物的功能体内半衰期提高了多于100％。在另一实施方案中，某些GLP-1的功能体内半衰期在缀合支化聚合物后增加了250％。
一般而言，GLP-1类似物在溶液中的稳定性十分差。因而，在本发明的一个实施方案中，如在本申请中描述的十分确定的水溶性支化聚合物可以缀合GLP-1类似物并且通过使结构转换(例如重新折叠)最小而稳定GLP-1并保持GLP-1活性。
在一个相关的实施方案中，GLP-1的贮藏半衰期在缀合至如此处描述的支化聚合物后得以提高。
在本发明的另一实施方案中，所述的促胰岛素剂是DPPIV保护的肽。
在本发明另一实施方案中，所述的促胰岛素剂具有少于1nM的EC50，所述的EC50是由如此处公开的功能受体测定法测定的。
在本发明另一实施方案中，所述的促胰岛素剂具有少于300nM、少于200nM或少于100nM的EC50，所述的EC50是此处公开的功能受体测定法测定的。
反应方案1-在溶液中的趋同合成-加帽的-第一代
Figure A20068000537600621
反应方案2：具有受保护的焦点的第二代
Figure A20068000537600622
反应方案3：第二代支化聚合物的固相合成
Figure A20068000537600631
反应方案4：第二代物质在溶液中的趋异合成
反应方案5：用Me(PEG)2CH2COOH酸端加帽的第二代聚合物的说明
Figure A20068000537600641
反应方案6：用琥珀酸单叔丁酯端加帽连接至固相支持物或促胰岛素剂(R)的第二代聚合物来产生多阴离子糖模拟聚合物的说明
Figure A20068000537600651
反应方案7：用于聚合物缀合至ITA分子的合适活性柄的形成。第二代聚合物物质的说明
Figure A20068000537600661
药物施用
式I的本发明缀合的GLP-1类似物可以，例如皮下、经口或肺部施用。
对于皮下施用，将式I化合物与配制已知GLP-1类似物类似地配制。此外，对于皮下施用，将式I化合物与施用已知GLP-1类似物类似地施用并且，通常，医师熟悉该方法。
对于经口施用，将式I化合物与配制经口施用的其它药物类似地配制。此外，对于经口施用，将式I化合物与施用已知口服药物类似地施用并且，大体上，医师熟悉这种方法。
对于肺部施用的产品，给出了下面详细细节：
本发明缀合的GLP-1类似物可以通过吸入以剂量有效的方式施用来增加循环的GLP-1水平和/或降低循环的葡萄糖水平。这种施用可以有效用于治疗障碍例如糖尿病或高血糖症。获得有效剂量的GLP-1需要施用大于约0.5μg/kg至约50μg/kg本发明缀合的GLP-1的吸入剂量。治疗有效量可以由内行的医师确定，其将考虑多种因素，包括患者的GLP-1水平、血糖水平、身体条件、患者的肺状态等。
根据本发明，本发明缀合的GLP-1可以通过吸入递送以达到将其迅速吸收。通过吸入施用可能会导致与皮下施用GLP-1类似物相当的药物动力学。本发明缀合的GLP-1的吸入导致循环的GLP-1水平迅速上升，之后血糖水平迅速下降。在比较相似的粒度和相似的肺部沉积水平时，不同的吸入装置通常提供相似的药物动力学。
根据本发明，本发明缀合的GLP-1可以通过任意本领域已知的多种用于通过吸入施用治疗剂的吸入装置递送。这些装置包括定量吸入器、雾化器、干粉产生器、喷雾器等。在一个实施方案中，本发明缀合的GLP-1通过干粉吸入器或喷雾器递送。用于施用本发明缀合的GLP-1的吸入装置具数个理想的特征。例如，用吸入装置递送是有利可靠的、可再生的且准确的。吸入装置应递送细小的粒子，例如小于约10μm，例如约1-5μm，以便有好的呼吸性。适合用于实践本发明的可商业获得的吸入装置的一些具体的实例是TurbohalerTM(Astra)、Rotahaler(Glaxo)、Diskus(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、由Inhale Therapeutics上市销售的装置、AERxTM(Aradigm)、Ultravent雾化器(Mallinckrodt)、Acorn II雾化器(MarquestMedical Products)、Ventolin定量吸入器(Glaxo)、Spinhaler粉末吸入装置(Fisons)等。
如本领域那些技术人员将理解的，本发明缀合的GLP-1的配制、递送的制剂的量，以及施用单次剂量的持续时间取决于采用的吸入装置的类型。对于一些气溶胶递送系统，例如雾化器，施用频率和系统激活的时间长度将主要取决于气溶胶中GLP-1缀合物的浓度。例如，当雾化器溶液中GLP-1缀合物的浓度高时，可以采用短的施用周期。装置例如定量吸入器可以产生较高的气溶胶浓度，并且可以操作更短周期来递送期望量的GLP-1缀合物。装置例如粉末吸入装置递送活性剂直到给定量的药剂从装置中排出。在这种类型的吸入器中，给定量的粉末中的本发明缀合的GLP-1的量决定了单次施用中递送的剂量。
通过吸入装置递送的制剂中本发明缀合的GLP-1的粒度对于GLP-1使之进入肺的能力而言是关键的。在一个实施方案中，进入下气道或肺泡。在一个实施方案中，配制本发明缀合的GLP-1以便至少约10％递送的GLP-1缀合物在肺中沉积。在一个实施方案中，约10-约20％，或更多在肺中沉积。已经知道，用口呼吸的人的最大肺部沉积效率用约2μm至约3μm的粒获得。当粒度大于约5mμ时，肺部沉积大量减少。小于约1μm的粒度导致肺部沉积减少，并且使递送足够治疗有效量的颗粒变得困难。因此，在本发明的实施方案中，通过吸入递送的GLP-1缀合物颗粒具有小于约10μm的粒度。在实施方案中，粒度为约1μm至约5μm。选择GLP-1缀合物的制剂以在所选择的吸入装置中产生期望的粒度。
在作为干粉剂施用的实施方案中，本发明缀合的GLP-1以粒度小于约10μm的颗粒形式制备。在一个实施方案中，粒度约为1μm至约5μm。在一个实施方案中，所述粒度可有效用于递送至患者的肺的肺泡中。在一个实施方案中，干粉剂主要由产生而使大多数颗粒具有期望范围的大小的颗粒组成。在一个实施方案中，至少约50％的干粉剂由直径小于约10μm的颗粒组成。这样的制剂可以通过喷雾干燥、碾磨或临界点浓缩含有GLP-1缀合物和其它期望成分的溶液获得。也适合用于产生可用于本发明的颗粒的其它方法是本领域已知的。
颗粒通常从容器中的干粉剂分离并随后通过载体气流运送至患者的肺中。通常，在目前的干粉吸入器中，用于使固体分离的力仅通过患者的吸入提供。一种合适的干粉吸入器是由Astra(Sdertalje，瑞典)生产的TurbohalerTM。在另一种类型的吸入器中，患者吸入产生的气流激活推进马达，其使单体GLP-1类似物颗粒的解聚附。DuraSpirosTM吸入器是这样一种装置。
用于从干粉吸入器施用的本发明缀合的GLP-1制剂通常包括含有GLP-1缀合物的细粉碎干粉，但是所述粉剂还可以包含填充剂、载体、赋形剂、另外的添加剂等。添加剂可以包含于GLP-1缀合物的干粉剂中，例如用来稀释粉剂(按照从特定干粉吸入装置递送所必需的)，用来促进制剂的处理、用来给制剂提供有利的粉末特性、用来促进粉末从吸入装置分散、用来稳定制剂(例如，抗氧化剂或缓冲剂)、用来给制剂提供味道等。有利地是，所述的添加剂不会不利地影响患者的气道。GLP-1缀合物可以在分子水平上与添加剂混合或者固体制剂可以包含与添加剂颗粒混合或涂在添加剂粒子上的GLP-1缀合物颗粒。典型的添加剂包括单糖、二糖和多糖；糖醇和其它多元醇，例如乳糖、葡萄糖、棉子糖、松三糖、乳糖醇、麦芽糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇、淀粉或其组合；表面活性剂，例如山梨醇、双磷脂酰胆碱或卵磷脂等。通常，添加剂(例如填充剂)以有效用于上述目的的量存在，通常为制剂重量的约50％至约90％。另外的用于配制蛋白质例如GLP-1类似物蛋白质的本领域已知的试剂也可以包含于制剂中。
包含本发明缀合的GLP-1的喷雾剂可以通过在压力下促使GLP-1缀合物的混悬剂或溶液剂通过喷嘴产生。可以选择喷嘴的大小和结构、施加的压力以及流体进料速率来达到期望的输出量和粒度。电喷射可以例如通过与毛细管或喷嘴进料装置连接的电场产生。在一个实施方案中，通过喷雾器递送的GLP-1缀合物颗粒具有小于约10μm的粒度。在一个实施方案中，粒度为约1μm至约5μm。
适合与喷雾器使用的本发明缀合的GLP-1制剂通常包括浓度为每ml溶液约1mg-约20mg GLP-1缀合物的水溶液中的GLP-1缀合物。制剂可以包含试剂例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂。在一个实施方案中，制剂含有锌。制剂也可以包含用于稳定GLP-1缀合物的赋形剂或试剂，例如缓冲剂、还原剂、大体积的蛋白质(bulk protein)或糖类。可用于配制GLP-1缀合物的大体积的蛋白质包括白蛋白、鱼精蛋白等。适用于配制GLP-1缀合物的典型糖类包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。GLP-1缀合物制剂还可以包含表面活性剂，所述的表面活性剂可以减少或防止形成气溶剂时由于溶液雾化而引起的GLP-1缀合物的表面-诱导的聚集。可以采用多种常规的表面活性剂，例如脂肪酸聚氧乙烯酯和醇，以及聚氧化乙烯山梨醇脂肪酸酯。量将通常为制剂重量的约0.001和约4％之间。在一个实施方案中，对于本发明的目的来说，表面活性剂是聚氧乙烯山梨坦单油酸酯、聚山梨酯80、聚山梨酯20等。另外的用于配制蛋白质例如GLP-1类似物蛋白质的本领域已知的试剂也可以包含于制剂中。
本发明的缀合GLP-1可以通过雾化器，例如喷射雾化器或超声雾化器施用。典型地，在喷射雾化器中，压缩空气源用于产生通过喷嘴的高速空气喷射。当气体膨胀超出喷嘴时，产生一个低压区，该低压区通过连接至液体储蓄器的毛细管汲取GLP-1缀合物溶液。来自毛细管的液流在其离开毛细管时剪切成不稳定的细丝和液滴，形成气溶胶。可以采用一系列结构、流速和折流板类型以从给定的喷射雾化器获得期望的性能特性。在超声雾化器中，通常采用压电转换器，将高频率的电能量用来产生振动、机械能。该能量直接或通过耦合流体传递至GLP-1缀合物制剂，产生含有GLP-1缀合物的气溶胶。有利地，通过雾化器递送的GLP-1缀合物颗粒具有小于约10μm的粒度。在一个实施方案中，粒度的范围为约1μm至约5μm。
适合与雾化器(喷射雾化器或超声雾化器)使用的GLP-1缀合物制剂通常包括水溶液中的GLP-1缀合物，其浓度为每ml溶液约1mg-约20mg GLP-1缀合物。制剂可以包含试剂例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂。制剂也可以包含用于稳定GLP-1缀合物的赋形剂或试剂，例如缓冲剂、还原剂、大体积的蛋白质或糖类。可用于配制GLP-1缀合物的大体积的蛋白质包括白蛋白、鱼精蛋白等。适用于配制GLP-1缀合物的典型糖类包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。GLP-1缀合物制剂还可以包含表面活性剂，所述的表面活性剂可以减少或防止形成气溶剂时由于溶液雾化引起的GLP-1缀合物的表面-诱导的聚集。可以采用多种常规的表面活性剂，例如脂肪酸聚氧乙烯酯和醇，以及聚氧化乙烯山梨醇脂肪酸酯。量通常在制剂重量的约0.001至约4％之间。在一个实施方案中，对本发明目的来说，表面活性剂是聚氧乙烯山梨坦单油酸酯、聚山梨酯80、聚山梨酯20等。额外的用于配制蛋白质(例如GLP-1类似物蛋白质)的本领域已知试剂也可以包含于所述制剂中。
在定量吸入器(MDI)中，将推进剂、本发明GLP-1缀合物和任意赋形剂或其它添加剂作为混合物装入含有液化压缩气体的罐中。启动计量阀释放气溶胶形式的混合物。在一个实施方案中，含有的颗粒的大小小于约10μm。在一个实施方案中，约为1μm至约5μm。可以通过采用由本领域那些技术人员已知的多种方法(包括喷射研磨、喷雾干燥、临界点浓缩等)而生产的本发明GLP-1缀合物制剂获得期望的气溶胶粒度。在一个实施方案中，定量吸入器包括由3M或Glaxo制造并采用氢氟烃推进剂的那些定量吸入器。
用定量吸入器施用的本发明GLP-1缀合物制剂将通常包括含有本发明GLP-1缀合物的细粉末粉剂，所述的粉剂作为不含水的介质中的混悬剂，例如借助于表面活性剂悬浮于推进剂中。推进剂可以是为该目的而采用的任意常规材料，例如含氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷、HFA-134a(氢氟烷-134a)、HFA-227(氢氟烷-227)等。在一个实施方案中，推进剂是氢氟烃。可以选择表面活化剂来稳定作为推进剂中的悬浮剂的本发明GLP-1缀合物，以防止活性剂的化学降解等。合适的表面活性剂包括三油酸山梨坦、大豆卵磷脂、油酸等。在一些实施方案中，溶液型气雾剂使用溶剂例如乙醇。额外的用于配制蛋白质(例如GLP-1类似物蛋白质)的本领域已知试剂也可以包含于上述制剂中。
本领域一般技术人员将认识到，本发明方法可以通过未在本申请中描述的装置进行肺部施用本发明缀合的GLP-1而实现。
本发明还涉及含有本发明GLP-1缀合物并适合通过吸入施用的药物组合物或制剂。根据本发明，本发明的GLP-1缀合物可以用于生产适合通过吸入施用的制剂或药物。本发明还涉及用于生产适合通过吸入施用的形式的含有本发明GLP-1缀合物的制剂的方法。例如，干粉剂可以用常规技术以数种方式生产。适合在下呼吸道最大化沉淀的粒度范围的颗粒可以通过微粉化、碾磨、喷雾干燥等制备。并且液体制剂可以通过将本发明GLP-1缀合物溶解于适当pH的合适溶剂(例如水)中生产，所述的溶剂包含缓冲液或其它赋形剂。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及施用式II缀合的胰岛素的方法，所述的方法包括通过肺部途径施用有效量的式II缀合的胰岛素给需要它的患者；在一个实施方案中，所述的式II缀合的胰岛素通过所述患者的嘴吸入。
为了更加精确，本发明还涉及下列实施方案：
a)如在本申请中描述的方法，其中将式I缀合的GLP1类似物递送至患者的下气道。
b)如在本申请中描述的方法，其中式I缀合的GLP1类似物在肺泡中沉积。
c)如在本申请中描述的方法，其中所述的式I缀合的GLP1类似物以包含药学上可接受的载体中的所述式I缀合的GLP1类似物的药物制剂施用。
d)如在本申请中描述的方法，其中所述的制剂选自含水介质中的溶液剂和非含水介质中的混悬剂。
e)如在本申请中描述的方法，其中所述的制剂作为气溶胶施用。
f)如在本申请中描述的方法，其中所述的制剂呈干粉形式。
g)如在本申请中描述的方法，其中所述的式I缀合的GLP1类似物具有小于约10微米的粒度。
h)如在本申请中描述的方法，其中所述的式I缀合的GLP1类似物具有约1-约5微米的粒度。
i)如在本申请中描述的方法，其中所述的式I缀合的GLP1类似物具有约2-约3微米的粒度。
j)如在本申请中描述的方法，其中至少约10％的递送的式I缀合的GLP1类似物在肺部沉积。
k)如在本申请中描述的方法，其中所述的式I缀合的GLP1类似物通过适合肺部施用并能够使胰岛素类似物在患者肺部沉积的吸入装置递送。
l)如在本申请中描述的方法，其中所述的装置选自雾化器、定量吸入器、干粉吸入器和喷雾器。
m)如在本申请中描述的方法，其中所述的装置是干粉吸入器。
n)如在本申请中描述的方法，其中所述的装置是雾化器。
o)如在本申请中描述的方法，其中所述的装置是定量吸入器。
p)如在本申请中描述的方法，其中所述的装置是喷雾器。
q)如在本申请中描述的方法，其中启动所述的装置施用约3μg/kg至约20μg/kg所述的式I缀合的GLP1类似物。在实施方案中，施用约7μg/kg至约14μg/kg所述的式I缀合的GLP1类似物。
r)如在本申请中描述的方法，其中所述的式I缀合的GLP1类似物是在任意上述实例中特别提及的任意化合物。
s)如在本申请中描述的用于治疗糖尿病的方法，所述的方法包括通过肺部途径施用有效剂量的所述式I缀合的GLP1类似物给需要它的患者。
t)如在本申请中描述的方法，其中所述式I缀合的GLP1类似物作为包含药学上可接受的载体中的所述式I缀合的GLP1类似物的药物制剂施用。
如在本申请中描述的方法，其中所述的GLP1缀合物是在本申请中特别提及的，尤其在本申请中的特定实施例中特别提及的任意特定的式II化合物。即使相对于一种方法在本申请中特定地描述了上述实施方案，但它们类似地应用于要使用的产品或制剂。
本发明的一个目的是提供含有根据本发明的化合物的药物制剂，所述的化合物以约0.1mg/ml-约25mg/ml的浓度存在，其中所述的制剂的pH是2.0-10.0。该制剂可以进一步包含缓冲系统、防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，药物制剂是含水制剂，即含有水的制剂。这种制剂通常是溶液或混悬液。在本发明的进一步实施方案中，该药物制剂是水溶液。术语“水制剂”定义为含有至少50％w/w水的制剂。同样，术语“水溶液”定义为含有至少50％w/w水的溶液，并且术语“含水混悬液”定义为含有至少50％w/w水的混悬液。
在另一个实施方案中，药物制剂是一种冻干制剂，在使用前医师或患者向其中加入溶剂和/或稀释剂。
在另一个实施方案中，药物制剂是不需任何预先溶解就能使用的干的制剂(例如冰冻干燥或喷雾干燥)。
在另一方面，本发明涉及含有根据本发明的化合物的水溶液以及缓冲液的药物制剂，其中所述的化合物以0.1mg/ml或更大浓度存在，并且其中所述的制剂pH为约2.0至约10.0。
在本发明的另一个实施方案中，所述制剂的pH为约7.0至约9.5。在本发明的另一个实施方案中，所述制剂的pH为约3.0至约7.0。在本发明的另一个实施方案中，所述制剂的pH为约5.0至约7.5。在本发明的另一个实施方案中，所述制剂的pH为约7.5至约9.0。在本发明的另一个实施方案中，所述制剂的pH为约7.5至约8.5。在本发明的另一个实施方案中，所述制剂的pH为约6.0至约7.5。在本发明的另一个实施方案中，所述制剂的pH为约6.0至约7.0。
在本发明的另一个实施方案中，所述制剂的pH为约3.0至约9.0，并且所述的pH与本发明化合物的等电pH相差至少2.0pH单位。
在本发明的进一步实施方案中，缓冲剂选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、N-甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基甲烷、N，N-二(羟乙基)甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天门冬氨酸或其混合物。这些特定缓冲剂的每一种构成本发明的一个可替代实施方案。
在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包含药学上可接受的防腐剂。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂选自苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苄醇、三氯叔丁醇和硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲、氯己啶、甲醋吡喃酮钠、氯甲酚、对羟苯甲酸乙酯、氯化苄乙铵、氯酚醚(3对-氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)或其混合物。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以0.1mg/ml至20mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以0.1mg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以5mg/ml至10mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以10mg/ml至20mg/ml的浓度存在。这些特定防腐剂的每一种构成了本发明的一个可替代实施方案。防腐剂在药物组合物中的使用是技术人员熟知的。为了方便起见，可参考Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包含等渗剂。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂选自盐(如氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(如L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天门冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、醛糖醇(如丙三醇(甘油)、1，2-丙二醇(丙二醇)、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇)聚乙二醇(如PEG400)或其混合物。可以使用任何糖例如单糖、二糖或多糖，或者水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖苷、芽霉菌糖、糊精、环胡精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。在一个实施方案中，糖添加物是蔗糖。糖醇定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8碳氢化合物并包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一个实施方案中，糖醇添加剂是甘露醇。上面提及的糖或糖醇可以独立地或组合使用。对使用的量无固定限制，只要糖或糖醇可溶解于液体制剂并且对使用本发明方法达到的稳定效应无不利影响。在一个实施方案中，糖或糖醇的浓度在约1mg/ml和约150mg/ml之间。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂以1mg/ml至50mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂以1mg/ml至7mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂以8mg/ml至24mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂以25mg/ml至50mg/ml的浓度存在。这些特定等渗剂的每一种构成了本发明的一个可替代实施方案。等渗剂在药物组合物中的使用是技术人员熟知的。为了方便起见，可参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包含螯合剂。在本发明的进一步实施方案中，螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天门冬氨酸的盐及其混合物。在本发明的进一步实施方案中，螯合剂以0.1mg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，螯合剂以0.1mg/ml至2mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，螯合剂以2mg/ml至5mg/ml的浓度存在。这些特定的螯合剂的每一种构成了本发明的一个可替代实施方案。螯合剂在药物组合物中的使用是技术人员熟知的。为了方便起见，可参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包含稳定剂。稳定剂在药物组合物中的使用是技术人员熟知的。为了方便起见，可参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
更特别地，本发明组合物是稳定的液体药物组合物，该液体药物组合物的治疗活性成分包括在存储过程中液体药物制剂可能会显示出聚集体形成的多肽。“聚集体形成”旨在指导致寡聚物，或者是从溶液中沉淀出的大的可见聚集体形成的多肽分子之间的物理相互作用，所述的寡聚物可保持可溶。“在存储过程中”旨在指曾经制备的，未立即施用给受试者的液体药物组合物或制剂。而且，在制备后，将其以液体形式、冷冻状态或干燥形式包装存储用于随后将其重构为适合施用于受试者的液体形式或其它形式。“干的形式”旨在指通过冷冻干燥(即，冻干法；见例如Williams和Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.38：48-59)、喷雾干燥(见Spray-Drying Handbook中的Masters(1991)(5th ed；Longman Scientific and Technical，Essez，U.K.)，pp.491-676；Broadhead等(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.18：1169-1206；和Mumenthaler等(1994)Pharm.Res.11：12-20)或风干(Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology 25：459-470；和Roser(1991年)Biopharm.4：47-53)而干燥的液体药物组合物或制剂。在液体药物组合物存储过程中多肽的聚集体形成可能会不利地影响所述多肽的生物活性，导致药物组合物的治疗效果丧失。而且，当采用输注系统施用含有多肽的药物组合物时，聚集体形成可引起其它问题例如输液管、膜或泵阻塞。
本发明的药物组合物可以进一步包含足够用来减少在组合物存储过程中多肽聚集体形成的量的氨基酸碱。“氨基酸碱”旨在指氨基酸或氨基酸的组合，其中任何给定氨基酸是以其游离碱形式或其盐形式存在。如果使用氨基酸的组合，所有的氨基酸可以以它们的游离碱形式存在，全部可以以它们的盐形式存在，或者一些可以以它们的游离碱形式存在而其它的以它们的盐形式存在。在一个实施方案中，制备本发明组合物中使用的氨基酸是那些具有带电荷的侧链的氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸。特殊氨基酸(例如，甘氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸及其混合物)的任何立体异构体(即L、D或DL异构体)或这些立体异构体的组合可存在于本发明的药物组合物中，只要该殊氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在。在一个实施方案中，使用L-立体异构体。本发明组合物也可以使用这些氨基酸的类似物配制。“氨基酸类似物”旨在指天然存在的氨基酸的衍生物，所述的氨基酸衍生物引起减少在本发明液体药物组合物存储过程中的多肽聚集体形成的期望效果。合适的精氨酸类似物包括，例如氨基胍、鸟氨酸和N-单乙基L-精氨酸，合适的甲硫氨酸类似物包括S-乙基高半胱氨酸和S-丁基高半胱氨酸并且合适的半胱氨酸类似物包括S-甲基-L半胱氨酸。如同其它氨基酸一样，氨基酸类似物以它们的游离碱形式或它们的盐形式掺合进组合物。在本发明的进一步实施方案中，氨基酸或氨基酸类似物以足以防止或延迟蛋白质聚集的浓度使用。
在本发明的进一步实施方案中，当用作治疗剂的多肽是包含至少一个易于氧化的甲硫氨酸残基时，可以加入甲硫氨酸(或其它含硫的氨基酸或氨基酸类似物)以抑制甲硫氨酸残基氧化为甲硫氨酸亚砜。“抑制”旨在指随着时间的过去甲硫氨酸氧化的物的最小限度的积聚。抑制甲硫氨酸氧化导致多肽更多地保持以其适当的分子形式存在。可以使用甲硫氨酸的任意立体异构体(L、D或DL异构体)或其组合。加入的量应该是足以抑制甲硫氨酸残基氧化的量，这样甲硫氨酸亚砜的量对管理机构是可接受的。通常，这意味着该组合物包含不多于约10％-约30％的甲硫氨酸亚砜。通常，这可以通过加入甲硫氨酸而使得加入的甲硫氨酸与甲硫氨酸残基的比率为约1∶1-约1000∶1，例如10∶1-约100∶1来实现。
在本发明的进一步实施方案中，所述的制剂进一步包含选自高分子量聚合物或低分子量化合物的稳定剂。在本发明的进一步实施方案中，稳定剂选自聚乙二醇(如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基-/羟基纤维素或其衍生物(如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、含硫的物质如单硫代甘油、巯基乙酸和2-甲硫基乙醇以及不同的盐(例如氯化钠)。这些特定稳定剂的每一种构成了本发明的一个可替代实施方案。
药物组合物还可以包含额外的稳定剂，该稳定剂进一步增强其中的治疗活性多肽的稳定性。本发明特别令人感兴趣的稳定剂包括(但不限于)保护多肽免于甲硫氨酸氧化的甲硫氨酸和EDTA，以及保护多肽免于与冻融或机械剪切相关的聚集的非离子型表面活性剂。
在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包含表面活性剂。在本发明的进一步实施方案中，表面活性剂选自去垢剂、乙氧基化的蓖麻油、聚乙二醇化甘油酯、乙酰化单酸甘油乙酯、山梨坦脂肪酸酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合体(如泊洛沙姆类如PluronicF68、泊洛沙姆188和407、Triton X-100)、聚氧乙烯山梨坦脂肪酸酯、聚氧乙烯和聚乙烯衍生物如烷基化和烷氧基化衍生物(吐温如吐温20、吐温40、吐温80和布里杰35)、其单酸甘油酯或乙氧基化衍生物、其甘油二酯或聚氧乙烯衍生物、醇、甘油、卵磷脂和磷脂(如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、双磷脂酰甘油和神经磷脂)、磷脂的衍生物(如二棕榈酰磷脂酸)和溶血磷脂(如乙醇胺的棕榈酰溶血磷脂酰-L-丝氨酸和1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯、胆碱、丝氨酸或苏氨酸)以及溶血磷脂和磷酯酰胆碱的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物，如溶血磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱的十二酰和十四酰衍生物，以及极性头基团的变体，即胆碱、乙醇胺、磷脂酸、丝氨酸、苏氨酸、丙三醇、肌醇和带正电荷的DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰苏氨酸，以及甘油磷脂(如脑磷脂)、甘油糖脂(如吡喃半乳糖苷)、神经鞘氨糖脂(如神经酰胺、神经节苷脂)、十二烷基磷酸胆碱、鸡蛋溶血卵磷脂、羧链孢酸衍生物-(如牛磺-二氢羧链孢酸钠等)、长链脂肪酸和其盐C6-C12(如油酸和辛酸)、酰基肉毒碱和衍生物，赖氨酸、精氨酸或组氨酸的Nα酰化衍生物，或者赖氨酸或精氨酸的侧链酰化衍生物、包含赖氨酸、精氨酸或组氨酸和中性或酸性氨基酸的任何组合的二肽的Nα酰化衍生物、包含中性氨基酸和两种带电荷氨基酸的任何组合的三肽的Nα-酰化衍生物，DSS(多库酯钠、CAS登记号[577-11-7])、多库酯钙、CAS登记号[128-49-4])、多库酯钾、CAS登记号[7491-09-0])，SDS(十二烷基硫酸钠或十二烷基硫酸钠)、辛酸钠、胆酸或其衍生物、胆汁酸和其盐及甘氨酸或牛磺酸缀合物、熊脱氧胆酸、胆酸钠、去氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘胆酸钠、N-十六烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸酯、阴离子(烷基-芳基-磺酸酯)单价表面活性剂、两性离子表面活性剂(如N-烷基-N，N-二甲氨基-1-丙磺酸酯、3-胆酰氨基-1-丙基二甲氨基-1-丙磺酸酯、阳离子表面活性剂(季铵碱)(如十六基-三甲基溴化铵、氯化十六烷基吡啶)、非离子表面活性剂(如十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷)、泊洛沙姆(如Tetronic’s)，其是由相继添加氧化丙烯和氧化乙烯至乙二胺得到的四官能嵌段共聚物，或者该表面活性剂可选自咪唑啉衍生物或其混合物。这些特定表面活性剂的每一种构成本发明的一个可替代实施方案。
表面活性剂在药物组合物中的使用是技术人员熟知的。为了方便起见，可参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
其它成分可以存在于本发明的肽药物制剂中是可能的。这些额外的成分可以包括湿润剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力调节剂、螯合剂、金属离子、油质载体、蛋白质(例如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)以及两性离子(例如，氨基酸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然，这些额外成分不应该不利地影响本发明药物制剂的整体稳定性。
含有根据本发明化合物的药物组合物可以在多个位点施用给需要这种治疗的患者，例如在局部位点(如皮肤和粘膜位点)、在旁路吸收的位点(如在动脉、静脉、心脏内施用)、以及在涉及吸收的位点(如在皮肤内、皮下、肌肉内或腹部内施用)。
根据本发明的药物组合物的施用可以通过多种给药途径施用给需要这种治疗的患者，例如舌、舌下、口腔、口中、经口、在胃和肠内、鼻、肺(如通过细支气管和肺泡或它们的组合)、表皮、真皮、透皮、阴道、直肠、眼(例如通过结膜)、输尿管的和肠胃外施用。
在一方面，本发明涉及含有根据式(I)的化合物以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在一个实施方案中，药物组合物适于肺部施用。
在另一个方面，本发明涉及使用式(I)化合物用于制备肺部药物的用途。
本发明组合物可以以多种剂型施用，例如作为溶液剂、混悬剂、乳剂、微乳剂、多层乳剂、泡沫剂、油膏剂、糊剂、硬膏剂、软膏剂、片剂、包衣片剂、冲洗剂、胶囊剂(例如硬明胶胶囊剂和软明胶胶囊剂)、栓剂、直肠用胶囊剂、滴剂、凝胶剂、喷雾剂、粉剂、气溶剂、吸入剂、滴眼剂、眼膏剂、眼用冲洗剂、阴道栓剂、阴道环剂、阴道软膏剂、注射液、原位转化溶液剂(例如原位凝胶化、原位固定、原位沉淀、原位结晶)、输液剂和埋植剂施用。
本发明组合物可进一步例如通过共价、疏水的和静电相互作用在药物载体、药物递送系统和高级药物递送系统中复合或与其连接，以便进一步增强化合物的稳定性，提高生物利用度、增强溶解度、降低不良效应、达到本领域那些技术人员熟知的按时治疗，并且增强患者顺应性或任何它们的组合。载体、药物递送系统和高级药物递送系统的实例包括(但不限于)聚合物(如纤维素及衍生物)、多糖(如葡聚糖及衍生物、淀粉及衍生物)、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯和甲基丙烯酸聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及它们的嵌段共聚体、聚乙二醇、载体蛋白(如白蛋白)、凝胶如热胶凝(thermogelling)系统，如本领域那些技术人员熟知的嵌段共聚体系统、胶束、脂质体、微球体、纳米微粒、液晶及其分散体、脂-水系统的相行为领域中的那些技术人员熟知的L2相及其分散体、高分子胶束、多层乳剂、自乳化、自微乳化、环糊精和其衍生物，以及树枝状高分子。
本发明组合物可用于配制用于肺部施用化合物的固体、半固体、粉末和溶液，其中肺部施用是使用例如定量吸入器、干粉吸入器和喷雾器进行，全部为本领域那些技术人员熟知的装置。
本发明组合物特别可用于配制控制释放、持续释放、延长释放、阻释和缓释药物递送系统。更特别地，但不作为限制，组合物可用于配制本领域那些技术人员熟知的肠胃外控制释放系统和持续释放系统(两个系统都导致施用量减少许多倍)。在一个实施方案中，控制释放系统和持续释放系统经皮下施用。无意于限制本发明的范围，有用的控制释放系统和组合物的实例是水凝胶、油性凝胶、液晶、高分子微团、微球、纳米微粒。
生产适用于本发明组合物的控制释放系统的方法包括，但不限于结晶、浓缩、共结晶、沉淀、协同沉淀、乳化、分散、高压匀化、胶囊化、喷雾干燥、微胶囊化、凝聚、相分离、溶剂蒸发以产生微球、挤出和超临界流体方法。一般参考Handbook of PharmaceuticalControlled Release(Wise，D.L.，ed.Marcel Dekker，New York，2000)和Drug and the Pharmaceutical Sciences vol.99：Protein Formulationand Delivery(Ma cNally，E.J.，ed.Marcel Dekker，New York，2000)。
肠胃外施用可以用注射器，任选笔式注射器，通过皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射来实施。可替代地，肠胃外施用可以通过输注泵实施。进一步的选择是一种组合物，所述的组合物可以是用于以鼻或肺喷雾剂形式施用根据本发明化合物的溶液或混悬液。作为更进一步的选择，含有本发明化合物的药物组合物也可以适合透皮给药，例如通过无针注射或从贴剂，任选离子电渗疗法贴剂或透粘膜，例如颊，给药。
术语“稳定制剂”指具有增加的物理稳定性、增加的化学稳定性或增加的物理和化学稳定性的制剂。
在本申请中使用的术语蛋白制剂的“物理稳定性”指该蛋白由于其暴露于热-机械应力下和/或与去稳定化的界面和表面(如疏水表面和界面)相互作用而形成生物学上无活性的和/或不可溶的蛋白聚集物的倾向性。含水的蛋白质制剂的物理稳定性是通过在不同的温度下将装入合适容器(如药筒或管形瓶)中的制剂暴露于机械/物理应力(如搅动)下不同时间段后，通过视觉检查和/或浊度测量来评估的。制剂的视觉检查在具有黑色背景的强聚焦光下进行。制剂的浊度通过视觉打分评定混浊程度等级来表征，如以0-3的等级来表征(未显示混浊的制剂对应视觉打分0，而在日光下显示可见混浊的制剂对应视觉打分3)。当制剂在日光线显示可见的混浊度时，将根据蛋白聚集将制剂分类为物理不稳定的。可替代地，制剂的浊度可通过技术人员熟知的简单浊度测量来评估。含水蛋白质制剂的物理学稳定性也可以通过使用光谱剂或蛋白质构象状态的探针来评估。在一个实施方案中，所述的探针是小分子。在一个实施方案中，所述的探针结合至蛋白质的非天然构象异构体。蛋白质结构的小分子光谱探针的一个实例是硫黄素T。硫黄素T是已经广泛用于检测淀粉样蛋白原纤维的荧光染料。在有原纤维，和也许有其它蛋白质构型的情况下，硫黄素T在结合原纤维蛋白质形式时在约450nm处产生新的激发最大值并且在约482nm处发射增强。未结合的硫黄素T在这些波长下基本上是无荧光的。
其它小分子可以用作蛋白质结构改变(从天然到非天然状态)的探针。例如，结合蛋白质的暴露的疏水斑块的“疏水斑块”探针。疏水斑块通常是包埋于天然状态蛋白的三级结构中，但当蛋白开始去折叠或变性时其变为暴露在外。这些小分子、光谱探针的实例是芳香的、疏水染料如蒽、吖啶、二氮杂菲等。其它光谱探针是金属-氨基酸络合物，例如疏水氨基酸如苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸等的钴金属络合物。
在本申请中使用的术语，蛋白质制剂的“化学稳定性”指蛋白结构中的化学共价变化，其中所述的这种变化导致具有相比于天然蛋白结构具有潜在较小的生物学效力和/或潜在增加的免疫原特性的化学降解产物的形成。可以形成多种化学降解产物，这取决于天然蛋白质的类型和性质以及该蛋白质暴露的环境。化学降解的消除最可能不可能完全避免并且在存储和使用蛋白质制剂过程中通常可见化学降解产物的量增加，这是本领域技术人员熟知的。多数蛋白质易于脱酰胺，即谷氨酰或天冬酰胺酰残基中的侧链酰胺基水解形成游离羧酸的过程。其它降解途径包括高分子量转化产物的形成，其中两个或更多个蛋白分子通过转酰胺作用和/或二硫化物相互作用共价地彼此结合，导致形成共价结合的二聚体、寡聚体和多聚体降解产物(Stability of ProteinPharmaceuticals，Ahern.T.J.&Manning M.C.，Plenum Press，NewYork 1992)。氧化(例如甲硫氨酸残基的氧化)可认为是化学降解的另一种变体。蛋白制剂的化学稳定性可通过在其暴露于不同的环境条件(降解产物的形成通常可通过例如增加温度来加速)下后，在不同时间点测量化学降解产物的量来评估。每种单独的降解产物的量通常可根据分子大小和/或电荷，使用不同色谱技术(如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)而分离降解产物来测定。
因此，如上面所概括，“稳定的制剂”指具有增强的物理学稳定性、增强的化学稳定性或增强的物理和化学稳定性的制剂。一般而言，制剂在使用和存储过程中(根据推荐的使用和存储条件)必须是稳定的，直到达到失效期。
在本发明的一个实施方案中，包含根据本发明化合物的药物制剂在多于6周的使用和多于3年的存储是稳定的。
在本发明的另一个实施方案中，含有根据本发明化合物的药物制剂在多于4周的使用和多于3年的存储是稳定的。
在本发明进一步的实施方案中，含有根据本发明化合物的药物制剂在多于4周的使用和多于2年的存储是稳定的。
在本发明更进一步的实施方案中，含有该化合物的药物制剂在多于2周的使用和多于2年的存储是稳定的。
在另一方面，本发明涉及根据本发明的化合物用于制备药剂的用途。
在一个实施方案中，根据本发明的化合物用于制备用于治疗或预防高血糖、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、1型糖尿病、肥胖症、高血压、X综合征、血脂异常、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管障碍、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡的药物。
在另一个实施方案中，根据本发明的化合物用于制备用于延缓或预防2型糖尿病的疾病发展的药物。
在另一个实施方案中，根据本发明的化合物用于制备用于减少食物摄取、减少β-细胞调亡、增加β-细胞功能和β-细胞量和/或恢复对β-细胞的葡萄糖敏感性的药物。
使用根据本发明化合物的治疗也可以与第二种或更多种药理学活性物质，例如选自抗糖尿病剂、减肥药、食欲调节剂、抗高血压剂、用于治疗和/或预防由糖尿病引发或与其相关的并发症的药剂以及用于治疗和/或预防由肥胖症引发或与其相关的并发症和障碍的药剂的药理学活性物质组合。这些药理活性物质的实例是：胰岛素、磺酰脲类、双胍类、氯茴苯酸类、葡萄糖苷酶抑制剂、胰高血糖素拮抗剂、DPP-IV(二肽基肽酶-IV)抑制剂、参与刺激糖异生和/或糖原分解的肝脏酶抑制剂、葡萄糖摄取调节剂、调节脂类代谢的化合物如抗高血脂药剂如HMG CoA抑制剂(他汀类药物)、降低食物摄取的化合物、RXR激动剂和作用于β细胞的ATP依赖性钾通道的制剂；考来烯胺、考来替泊、氯贝丁酯、吉非贝齐、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、普罗布考、右旋甲状腺素、内他列奈、瑞格列奈；β-阻滞剂如烯丙心安、氨酰心安、噻吗心安、吲哚心安、萘心安和甲氧乙心安、ACE(血管紧张素转化酶)抑制剂如贝那普利、卡托普利、恩纳普利、福森普利、赖诺普利、alatriopril、喹那普利和雷米普利、钙通道阻滞剂如硝苯吡啶、二氯苯吡啶、硝苯苄吡啶、依拉地平、尼莫地平、地尔硫和维拉帕米，以及α阻滞剂如多沙唑嗪、哌胺甲尿啶、哌唑嗪和特拉唑嗪；CART(可卡因安非他明调节的转录物)激动剂、NPY(神经肽Y)拮抗剂、MC4(黑皮质素4)激动剂、食欲肽拮抗剂、TNF(肿瘤坏死因子)激动剂、CRF(促皮质素释放因子)激动剂、CRF BP(促皮质素释放因子结合蛋白)拮抗剂、尿皮质素(urocortin)激动剂、β3激动剂、MSH(黑素细胞-刺激激素)激动剂、MCH(黑素细胞浓缩激素)拮抗剂、CCK(胆囊收缩素)激动剂、5-羟色胺重摄取抑制剂、5-羟色胺和去甲肾上腺素重摄取抑制剂、混合的5-羟色胺和去甲肾上腺素能化合物、5HT(5-羟色胺)激动剂、蛙皮素激动剂、甘丙肽拮抗剂、生长激素、生长激素释放性化合物、TRH(促甲状腺激素释放激素)激动剂、UCP 2或3(解偶联蛋白2或3)调节剂、瘦素激动剂、DA激动剂(溴隐亭、doprexin)、脂肪酶/淀粉酶抑制剂、RXR(视黄醇类X受体)调节剂、TRβ激动剂；组胺H3拮抗剂。
应该理解的是，根据本发明的化合物与一种或多种上面提及的化合物，以及任选一种或多种其它药理活性物质的任意合适的组合可以认为是在本发明范围内。
本文中引用的所有的参考文献，包括出版物、专利申请和专利在此通过全文引用并入本文并且和引用程度如同每篇参考文献单独且具体地指出通过引用作为参考并且在本申请中以其全文列出(在法律允许的最大程度上)。
所有的标题和副标题在本申请中使用只是为了方便并且不应该理解为以任何方式限制本发明。
在本申请中提供的任何以及所有实施例，或示范性语言(例如“例如”)的使用仅用于更好地阐明本发明并不造成对本发明范围的限制，除非另外申明。本说明书中没有语言应该解释为，表示任何未要求保护的要素是本发明的实践所必需的。
在本申请中专利文献的引用和引入只是为了方便并且不反映对这些专利文献的有效性、专利性和/或可执行性的任何观点。在本申请中提及参考资料不是承认它们构成了现有技术。
在本申请中，词语“包含”应被广泛解释为“包括”、“含有”或“包含”。
本发明包括适用法律所允许的在本申请中附加的权利要求中列举的主题的所有修饰形式和等价形式。
通过下面的实施例来进一步阐述本发明，然而，所述的实施例不应理解为限制保护范围。在前面描述和下面的实施例中公开的特征可以(分别地和以它们的任意组合)是用于以其多样的形式实现本发明的材料。
实施例
下面的实施例和一般方法涉及在结构说明和合成方案中鉴定的中间化合物和终产物。用下列实施例来详细描述本发明化合物的制备，但是描述的化学反应是就它们对所选择的本发明支化聚合物的制备的普遍适用性而言来公开的。偶尔，所述的反应可能不会如对包括在本发明公开范围内的每种化合物所描述的一样适用。本领域那些熟练技术人员将容易识别出现这种情况的化合物。在这些情况下，所述的反应可以通过本领域那些技术人员已知的常规修饰，即通过适当保护干扰基团，通过换成其它常规试剂，或通过常规修饰反应条件来成功地完成。可替代地，本申请中公开的其它反应或另外的常规反应将适用于制备相应的本发明化合物。在所有的制备方法中，所有的原料是已知的或可以容易地从已知原料制备。所有温度用摄氏温度表示并且除非另外说明，当涉及收率时，所有的份数和百分比按重量计算，并且当涉及溶剂和洗脱剂时，所有的份数按体积计算。所有试剂具有标准级，由Aldrich、Sigma等提供。质子、碳和磷的核磁共振(1H-、13C-和31P-NMR)在Bruker NMR仪器上记录，报告了从四甲基硅烷或磷酸往低磁场移动的化学位移(δ)。LC-MS质谱用如下所述的仪器和设置条件获得：
GLP-1缀合物通常使用下面的HPLC系统分析：
HPLC(方法A)：RP-分析用安装有Waters 996二极管阵列检测器的Waters 2690系统实施。紫外检测在218TP54 4.6 mm x 250 mm5μC-18二氧化硅柱(The Seperations Group，Hesperia)上于214、254、276和301 nm处收集，所述的二氧化硅柱在42℃下以1 ml/分钟洗脱。该柱用使用4M硫酸调节至pH 2.5的10％的0.5 M硫酸铵平衡。注射后，在50分钟期间，样品用相同的含水缓冲液中0％至60％的乙腈梯度洗脱。
LC-MS(方法A)分析(电喷射)在安装有二元泵、柱室、二极管阵列检测器和单个四级杆(quadropole)的质谱检测器的HP1100MSD上实施。该分析在40℃下在Waters Xterra Ms C-18X3mm柱上完成，柱用含有0.01％TFA的10％含水乙腈-100％乙腈的线性梯度洗脱7.5分钟。UV检测是在210nm下并且MS扫描范围是100-1000原子质量单位。
LC-MS(方法B)：在由Hewlett Packard系列1100 G1312A BinPump、Hewlett Packard系列1100柱室、Hewlett Packard系列1100G1315A DAD二极管阵列检测器、Hewlett Packard系列1100 MSD和由HP Chemstation软件控制的Sedere 75蒸发光散射检测器组成的装置上实施。该HPLC泵连接至两个洗脱剂贮液器，该贮液器含有：(A)在水中的10 mM NH4OH和(B)在90％乙腈中的10 mM NH4OH。该分析在23℃下，通过将适当体积的样品(优选为20μl)注射至柱上，用A和B的梯度洗脱该柱来进行。使用的HPLC条件、检测器设置和质谱仪设置如下：
柱    Waters Xterra MS C-18X3mm内径5um
梯度  在6.5分钟内以1.5 ml/分钟的5％-100％的乙腈线性梯度
检测    210nm(从DAD模拟输出)
ELS(从ELS模拟输出)
MS离子化模式API-ES。扫描100-1000原子质量单位步长为0.1原子质量单位
在下面实施例中显示的一些NMR数据只是选择的数据。
在下面的实施例中，下列术语将具有下面的通用含义：
缩写
AEEAc  氨基乙氧基乙氧基乙酰基
AcOEt：乙酸乙酯
Ala：丙氨酸
tBu：叔丁基
Boc：叔丁氧羰基
CDI：羰基二咪唑
CH3CN：乙腈
DBU：1，8-二氮杂二环[5，4，0]十一-7-烯
DCM：二氯甲烷，氯化亚甲基
Dde：1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基
DIC：二异丙基碳二亚胺
DIPEA：N，N-二异丙基乙胺
DhbtOH：3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮
DMAP：4-二甲基氨基吡啶
DMF：N，N-二甲甲酰胺
DMSO：二甲亚砜
DTT：二硫苏糖醇
Et：乙基
Et2O：乙醚
EtOH：乙醇
Fmoc：9-芴甲氧羰基
H2O：水
HBTU：2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1，1，3，3四甲基脲六氟磷酸盐
HCl：盐酸
HOBt：1-羟基苯并三唑
iVDde：1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)-3-甲基丁基
MeCN：乙腈
MeOH：甲醇
Mtt：4-甲基三苯甲基
Mmt：4-甲氧基三苯甲基
NMP：N-甲基-2-吡咯烷酮
NEt3：三乙胺
OtBu：叔丁酯
Pmc：2，2，5，7，8-五甲基-苯并二氢吡喃-6-磺酰基
PhMe：甲苯
Rf：保持因子
Rt：保留时间
r.t.：室温
SiO2：硅胶
THF：四氢呋喃
TFA：三氟乙酸
TIS：三异丙基硅烷
TLC：薄层色谱法
Trt：三苯甲基
TSTU：2-琥珀酰亚氨基-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐
下面的非限制性实例说明了单体的合成和采用固相合成或液相合成的聚合技术。
一般合成方法和步骤
树脂结合肽的合成。
受保护的肽基树脂在Applied Biosystems 431A肽合成仪上以0.25mmol或1.0mmol的规模，用制造商提供的FastMoc UV方法，根据Fmoc策略合成，所述的FastMoc UV方法采用在NMP(N-甲基吡咯烷酮(pyrrolidone))中的HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)或HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)介导的偶联，并紫外线监控Fmoc保护基团的去保护。用于合成GLP-1肽酰胺的起始树脂是Rink-Amide树脂并且将Wang或氯三苯甲基树脂用于具有羧基C-末端的GLP-1肽。除了非天然的氨基酸例如Fmoc-Aib-OH(Fmoc-氨基异丁酸)以外，使用的受保护的氨基酸衍生物是装于适合于ABI433A合成仪中的预称重药筒中的标准Fmoc-氨基酸(由例如Anaspec或Novabiochem提供)。N端氨基酸是在α氨基处保护的Boc(例如，将Boc-His(Boc)OH用于N端具有His的肽)。将必须进一步衍生的赖氨酸的ε氨基用Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Boc保护，这取决于连接白蛋白结合部分和间隔区的途径。
支化聚合物和连接体至结合粗制树脂的受保护的肽上的特定赖氨酸残基的连接，通过在自动化合成过程中掺入Fmoc-Lys(Dde)-OH、Lys(ivDde)-OH、Lys(Mtt)-OH或Lys(Mmt)-OH，之后使用肼或TFA选择性去保护，来在特定位置实施。
除去ivDde或Dde-保护的方法。将树脂(0.25mmol)置于一个手动振荡器/过滤装置中并用N-甲基吡咯烷酮中的2％肼(20ml，2×12分钟)处理以除去DDE基团并用N-甲基吡咯烷酮(4×20ml)洗涤。
除去Mtt或Mmt-保护的方法。
将树脂(0.25mmol)置于手动振荡器/过滤装置中并用DCM中的2％TFA(20ml，5-10分钟，重复6-12次)处理以除去Mtt或Mmt基团，并用DCM(2×20ml)、DCM中的10％MeOH和5％DIPEA(2×20ml)以及N-甲基吡咯烷酮(4×20ml)洗涤。
用于在树脂上将支化聚合物连接至赖氨酸残基的一般方法。
将支化聚合物(相对于树脂结合的肽，4摩尔当量)溶解于NMP/DCM(1∶1)中。加入羟基苯并三唑(HOBt)(相对于树脂结合的肽，4摩尔当量)和二异丙基碳二亚胺(相对于树脂结合的肽，4摩尔当量)并将溶液搅拌15分钟。将该溶液加入树脂中并加入二异丙基乙胺(相对于树脂结合的肽，4摩尔当量)。在室温下摇动树脂24小时。将树脂用NMP洗涤两次，用NMP/DCM(1∶1)洗涤两次并用DCM洗涤两次。
用于将肽从树脂上裂解的方法：
通过在室温下与三氟乙酸、水和三异丙基硅烷(95∶2.5∶2.5)的混合物搅拌180分钟来将肽从树脂上裂解。过滤裂解混合物并将滤液通过氮气流浓缩为油状物。用45ml乙醚从该油状物中沉淀出粗的肽并用45ml乙醚洗涤3次。
使用下面描述的方法之一纯化肽产物(除非在实施例中另外描 述)：
在基于TFA(酸)的溶剂系统中的制备型HPLC方法：在填充有7μC-18硅石的20mmx250mm柱上，通过半制备型HPLC纯化粗肽。干燥后，将所述的粗肽溶解于5ml 50％的乙酸H2O中，并用H2O稀释至20ml并将其注射至柱上，随后将该柱在40℃下于50分钟内用0.1％TFA中的40-60％的CH3CN梯度以10ml/分钟洗脱。收集含有肽的级分。用水稀释洗脱物后，冻干经纯化的肽。
在基于硫酸铵(碱性的)的溶剂系统中的制备型HPLC方法：在填充有7μC-18硅石的20mmx250mm柱上，通过半制备型HPLC纯化该粗肽。该柱用经浓H2SO4调节至pH 2.5的0.05M(NH4)2SO4中的40％CH3CN平衡。干燥后，将粗肽溶解于5ml 50％的乙酸H2O中，并用H2O稀释至20ml并注射至柱上，随后在40℃下在50分钟内将该柱用pH2.5的0.05M(NH4)2SO4中的40-60％的CH3CN梯度以10ml/分钟洗脱。收集含有肽的级分并用3体积的H2O稀释，并且使其通过已经用0.1％TFA平衡的Sep-PakC18药筒(Waters part.#：51910)。随后用含有0.1％TFA的70％CH3CN将其洗脱，并在用水稀释洗脱物后，通过低压冻干来分离经纯化的肽。
获得的终产物通过分析型RP-HPLC(保留时间)和LCMS进行表征。RP-HPLC分析用214nm处的UV检测和在42℃下以1ml/分钟洗脱的Vydac 218TP544.6mmx250mm 5μC-18硅石柱(TheSeparations Group，Hesperia，USA)进行。使用两种不同的洗脱条件：
A1：在由0.1M(NH4)2SO4组成的缓冲液中平衡该柱，并通过相同缓冲液中的0％-60％的CH3CN梯度洗脱50分钟，其中将所述的(NH4)2SO4溶液用浓H2SO4调节至pH 2.5。
B1：用0.1％TFA/H2O平衡该柱并用0％CH3CN/0.1％TFA/H2O至60％CH3CN/0.1％TFA/H2O的梯度洗脱50分钟。
B6：用0.1％TFA/H2O平衡该柱并用0％CH3CN/0.1％TFA/H2O至90％CH3CN/0.1％TFA/H2O的梯度洗脱50分钟。单体结构单元和连接体的合成：
实施例l
2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧甲基]环氧乙烷
Figure A20068000537600921
将2-(2-氯乙氧基)乙醇(100.00g；0.802mol)溶解于二氯甲烷(100ml)中并加入催化量的醚合三氟化硼(2.28g；16mmol)。将该澄清溶液冷却至0℃，并逐滴加入表溴醇(104.46g；0.762mol)，维持温度在0℃。将该澄清溶液在0℃下另外搅拌3小时，然后通过旋转蒸发除去溶剂。从乙腈中蒸发剩余的油状物一次，得到粗的1-溴-3-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]丙-2-醇，将其再溶解于THF(500ml)中。然后加入粉状的叔丁醇钾(85.0g；0.765mmol)，并且将混合物加热至回流30分钟。通过过滤除去未溶解的盐，并在真空中浓缩滤液产生澄清的黄色油状物。将该油状物通过真空蒸馏进一步纯化，以产生56.13g(41％)纯的标题物质。
bp＝65-75℃(0.65mbar)。1H-NMR(CDCl3)：δ＝2.61ppm(m，1H)；2.70(m，1H)；3.17(m，1H)；3.43(dd，1H)；3.60-3.85(m，9H)。13C-NMR(CDCl3)：δ＝42.73ppm；44.18；50.80；70.64&70.69(可能塌缩)；71.37；72.65。
实施例2
1，3-双[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]丙-2-醇
Figure A20068000537600922
将2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧甲基]环氧乙烷(2.20g；12.2mmol)溶解于DCM(20ml)中，并且加入2-(2-氯乙氧基)乙醇(1.52g；12.2mol)。将混合物冷却至0℃并加入催化量的醚合三氟化硼(0.2ml；1.5mmol)。在0℃下搅拌该混合物2小时，然后通过旋转蒸发除去溶剂。通过从乙腈中共蒸发两次除去醚合三氟化硼残留物。通过kuglerohr蒸馏纯化因此获得的油状物。得到2.10g(45％)收率的澄清粘性油状物的标题物质。bp.＝270℃，0.25mbar。1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.31(bs，1H)；3.55ppm(ddd，4H)；3.65-3.72(m，12H)；3.75(t，4H)；3.90(m，1H)。13C-NMR(CDCl3)：δ＝43.12ppm；69.92；70.95；71.11；71.69；72.69。
实施例3
1，3-双[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇
Figure A20068000537600931
将1，3-双[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(250mg；0.81mmol)溶解于DMF(2.5ml)中，并加入叠氮化钠(200mg；3.10mmol)和碘化钠(100mg；0.66mmol)。将该悬浮液加热至100℃(内部温度)过夜。然后将混合物冷却并过滤。将滤液处理至干燥，并将半结晶油状物再悬浮于DCM(5ml)中。通过过滤除去不溶解的盐；将滤液蒸发至干燥产生纯的标题物质，为无色油状物。收率：210mg(84％)。1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.48ppm(t，4H)；3.60-3.75(m，16H)；4.08(m，1H)。13C-NMR(CDCl3)：δ＝51.05ppm；69.10；70.24；70.53；70.78；71.37。LC-MS：m/e＝319(M+1)+；341(M+Na)+；291(M-N2)+。Rt＝2.78分钟。
实施例4
1，3-双[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基-对硝基苯基碳酸酯
Figure A20068000537600941
将1，3-双[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(2.00g；6.6mmol)溶解于THF(50ml)中并加入二异丙基乙胺(10ml)。然后加入4-二甲基氨基吡啶(1.60g；13.1mmol)和对硝基苯基氯甲酸酯(2.64g；13.1mmol)至该澄清的黄色溶液中并在环境温度下搅拌。沉淀物迅速形成。将该悬浮液在室温下搅拌5小时，然后将其过滤并在真空中浓缩。将残余物通过使用乙酸乙酯-庚烷-三乙胺(40/60/2)作为洗脱剂的色谱法进一步纯化。获得500mg(16％)收率的澄清黄色油状物的产物。1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.38ppm(t，4H)；3.60-3.72(m，12H)；3.76(m，4H)；5.12(q，1H)；7.41(d，2H)；8.28(d，2H)。LC-MS：m/e＝506(M+Na)+；456(M-N2)，Rt＝4.41分钟。
实施例5
1，3-双[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氯甲酸酯
将三氯乙酰氯(1.42g，7.85mmol)溶解于THF(10ml)中，并将该溶液冷却至0℃。10分钟内缓慢逐滴加入THF(5ml)中的1，3-双[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(1.00g；3.3mmol)和三乙胺(0.32g，3.3mmol)溶液。移除冷浴，并在环境温度下搅拌得到的悬浮液6小时。过滤该混合物，并蒸发滤液产生浅褐色油状物。蒸发后，用乙腈处理油状物两次，并在没有进一步纯化下使用该产物。
1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.40(t，4H)；3.55-3.71(m，12H)；3.75(d，4H)；5.28(m，1H)。
实施例6
2-(1，3-双[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸
Figure A20068000537600951
用庚烷洗涤氢化钠(7.50g；80％油悬浮液)三次，并然后再悬浮于无水THF(100ml)中。随后在室温下于30分钟内缓慢加入无水THF(100ml)中的1，3-双[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(10.00g；33.0mmol)溶液。然后20分钟内逐滴加入THF(100ml)中的溴乙酸(6.50mg；47mmol)溶液。-＞轻微放热。形成米色的悬浮液。在环境温度下搅拌该混合物过夜。通过加入水(20ml)小心地废除过量的氢化钠，同时冷却混合物。通过旋转蒸发使悬浮液至干燥，并让剩余物在DCM和水之间分配。用DCM萃取水相两次，随后通过加入乙酸(25ml)将其酸化。随后用DCM萃取水相两次，并且在硫酸钠上干燥合并的有机相，并蒸发至干燥。这时剩余的油状物含有标题物质以及溴乙酸。后者通过将该油状物再溶解于含有哌啶(5ml)的DCM(50ml)中；搅拌30分钟，并然后用1N含水HCl洗涤有机溶液三次(3×)。随后在干燥(Na2SO4)和蒸发溶剂后，获得纯的标题物质。收率：7.54g(63％)。
1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.48ppm(t，4H)；3.55-3.80(m，16H)；4.28(s，2H)；4.30(m，1H)；8.50(bs，1H)。13C-NMR(CDCl3)：δ＝51.04ppm；69.24；70.50；70.72；71.39；71.57；80.76；172.68。LC-MS：m/e＝399(M+Na)+；349(M-N2)。Rt＝2.34分钟。
实施例7
咪唑-1-羧酸1，3-双(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙-2-基酯
Figure A20068000537600961
将1，3-双[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(1.00g；3.3mmol)溶解于DCM(5ml)中并加入羰基二咪唑(1.18g，6.3mmol)。在室温下搅拌该混合物2小时。除去溶剂并将残留物溶解于甲醇(20ml)中并搅拌20分钟。除去溶剂并通过用DCM中的2％MeOH作为洗脱剂的硅石柱色谱法进一步纯化因此获得的澄清油状物。收率：372.4mg(35％)。1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.33(t，4H)；3.60-3.75(m，12H)；3.80(d，4H)；5.35(m，1H)；7.06(s，1H)；7.43(s，1H)；8.16(s，1H)。LC-MS：m/e＝413(M+1)。Rt＝2.35分钟。
实施例8
2-(1，3-双[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯
Figure A20068000537600962
将2-(1，3-双[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸(5.0g；13.28mmol)溶解于甲苯(20ml)中，并且在惰性气氛下将反应混合物加热至回流。然后30分钟内逐滴加入N，N-二甲基甲酰胺-二-叔丁基乙缩醛(13ml；54.21mmol)。继续回流24小时。随后通过硅藻土(Celite)过滤暗褐色溶液。在真空下除去溶剂，并通过用3％甲醇二氯甲烷作为洗脱剂的硅石急骤色谱法纯化油状残留物。合并纯的级分并蒸发至干燥。得到黄色澄清油状物的标题物质。收率：5.07g(88％)。1H-NMR(CDCl3)：δ＝1.42ppm(s，9H)；3.35(t，4H)；3.54-3.69(m，16H)；3.75-3.85(m，1H)；4.16(s，2H)。13C-NMR(CDCl3，选择的峰)：δ＝30.35ppm；52.93；70.65；72.25；73.12；73.90；80.44；83.55；172.28。TLC：在乙酸乙酯-庚烷(1∶1)中Rf＝0.33。
实施例9
2-(1，3-双[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯
Figure A20068000537600971
将2-(1，3-双[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯(5.97g，11.7mmol)溶解于乙醇-水(25ml；2∶1)中，并且加入醋酸(5ml)，之后加入阮丙镍(Raney-Nickel)的含水悬浮液(5ml)。随后在3大气压下用Parr仪器氢化该混合物16小时。然后通过过滤除去催化剂，并通过旋转蒸发使反应混合物至干燥。将油状残留物溶解于水中并将其冷冻干燥产生定量收率的标题物质。1H-NMR(CDCl3)：δ＝1.45ppm(s，9H)；3.15(bs，4H)；3.48-3.89(宽峰m，17H)；4.15(s，2H)。13C-NMR(CDCl3，选择的峰)：δ＝28.44ppm；39.81；68.17；70.58；70.79；70.99；78.81；82.31；170.59。
实施例10
2-(1，3-双[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸
Figure A20068000537600972
将2-(1，3-双[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸(1.00g；2.65mmol)溶解于1N含水盐酸(10ml)中并加入5％炭上钯(palladiumon carbon)的50％含水悬浮液(1ml)。在3.5大气压用Parr仪器氢化该混合物。在一小时后终止反应，并且通过过滤除去催化剂。通过旋转蒸发除去溶剂，并从乙腈中蒸发残留物两次。收率：930mg(88％)。1H-NMR(D2O)：δ＝3.11ppm(t，4H)；3.53-3.68(m，16H)；3.80(m，1H)；4.25(s，2H)。13C-NMR(D2O)：δ＝38.18ppm.；65.43；66.09；68.55；69.13；69.23；77.18；173.42。
实施例11
2-(1，3-双[2-(2-{9-芴甲氧羰基氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸
Figure A20068000537600981
将2-(1，3-双[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸(9.35g；28.8mmol)加入DIPEA(10ml；57mmol)中。在冰浴上冷却该反应混合物，并逐滴加入溶解于DCM(50ml)中的三甲基氯硅烷(15ml；118mmol)，之后加入DIPEA(11ml；62.7mmol)。将DCM(50ml)中的Fmoc-Cl(15.0g；57mmol)溶液逐滴加入至几乎澄清的该溶液中。搅拌反应混合物过夜，随后用DCM(500ml)稀释并将其加入至0.01N HCl水溶液(500ml)中。分离有机层；用水(3×200ml)洗涤并在无水硫酸钠上干燥。通过旋转蒸发除去溶剂。通过用乙酸乙酯-庚烷(1∶1)作为洗脱剂的硅石急骤色谱法纯化粗产物。收集纯的级分并干燥产生9.20g(42％)标题物质。
1H-NMR(D2O)：δ＝3.34ppm(t，4H)；3.45-3.65(m，16H)；3.69(bs，1H)；4.20(t，2H)；4.26(s，2H)；4.38(d，4H)；5.60(t，2H)；7.30(t，4H)；3.35(t，4H)；7.58(d，4H)；7.72(d，4H)。13C-NMR(D2O；选择的峰)：δ＝21.20ppm.；30.75；34.64；67.66；68.90；70.38；70.51；80.02；120.37；125.54；127.48；128.09；128.67；136.27；141.69；173.63；176.80。
实施例12
2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙醇
Figure A20068000537600991
将二甲基甲酰胺(250ml)中的2-(2-(-2-氯乙氧基)乙氧基)乙醇(25.0g，148mmol)和叠氮化纳(14.5g，222mmol)的浆液保持在100℃过夜。在冰浴上冷却该反应混合物，过滤并在真空中蒸发有机溶剂。将残留物溶解于二氯甲烷(200ml)中，用水(75ml)洗涤，用另外的二氯甲烷(75ml)萃取水相，并用硫酸镁(MgSO4)干燥合并的有机相，将其过滤并在真空中蒸发，产生油状物，其无需进一步纯化而使用。收率：30.0g(100％)。13C-NMR(CDCl3)：δ＝72.53；70.66-70.05；61.74；50.65
实施例13
(2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酸
Figure A20068000537600992
将上面的2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙醇(26g，148mmol)溶解于四氢呋喃(100ml)中并且在氮气气氛下缓慢加入至冰冷的四氢呋喃(250ml)中的氢化钠浆液(24g，593mmol，60％于油中)(其预先已经用庚烷(2×100ml)洗涤)中。将反应混合物保持40分钟。然后将其在冰浴上冷却，之后缓慢加入溶解于四氢呋喃(150ml)中的溴乙酸(31g，223mmol)中并随后在RT下保持约3小时。在真空中蒸发有机溶剂。将残留物悬浮于二氯甲烷(400ml)中。当在机械搅拌下保持该混合物30分钟后，缓慢加入水(100ml)。将水相分离，用盐酸(4N)酸化并用二氯甲烷(2×75ml)萃取。在真空中蒸发所有合并的有机相得到黄色的油状物。将二氯甲烷(250ml)中的哌啶溶液(37ml，371mmol)缓慢加入至该油状物中，在机械搅拌下保持该混合物1小时。将该澄清溶液用二氯甲烷(100ml)稀释并用盐酸(4N，2×100ml)洗涤。用额外的二氯甲烷(2×75ml)萃取水相并且在真空中蒸发合并的有机相，得到无需进一步纯化而使用的黄色油状物。收率：27.0g(66％)。13C-NMR(CDCl3)：δ＝173.30；71.36；70.66-70.05；68.65；50.65
实施例14
(S)-2，6-双-(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸甲酯
Figure A20068000537601001
将上面的(2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酸(13g，46.9mol)溶解于二氯甲烷(100ml)中。加入N-羟基琥珀酰亚胺(6.5g，56.3mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐(10.8g，56.3mmol)并且将反应混合物保持1小时。加入二异丙基乙胺(39ml，234mmol)和L-赖氨酸甲酯二盐酸盐(6.0g，25.8mmol)并且将反应混合物保持16小时。将反应混合物用二氯甲烷(300ml)稀释，用水(100ml)、盐酸盐(2N，2×100ml)、水(100ml)、50％饱和的碳酸氢钠(100ml)和水(2×100ml)萃取。将有机相用硫酸镁干燥、过滤并在真空中蒸发，得到无需进一步纯化而使用的油状物。收率：11g(73％)。LCMS：m/z＝591。13C-NMR(CDCl3)：(选择的)δ＝172.48；169.87；169.84；71.093-70.02；53.51；52.34；51.35；50.64；38.48；36.48；31.99；31.40；29.13；22.82。
实施例15
(S)-2，6-双-(2-{2-[2-(2-叔丁氧羰基氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸甲酯
Figure A20068000537601011
将二碳酸二叔丁酯(0.9g，4.24mmol)和10％的Pd/C(0.35g)加入至乙酸乙酯(15ml)中的上面的(S)-2，6-双-(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸甲酯(1.0g，1.7mmol)溶液中。然后将氢气持续通入该溶液中鼓泡3小时。将反应混合物过滤并在真空中除去有机溶剂。通过用乙酸乙酯/甲醇9∶1作为洗脱剂的急骤色谱法纯化残留物。合并含有产物的级分并在真空中除去有机溶剂得到油状物。收率：0.60g(50％)。LC-MS：m/z＝739(M+1)。
实施例16
(S)-2，6-双-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸甲酯
Figure A20068000537601012
将上面的(S)-2，6-双-(2-{2-[2-(2-叔丁氧羰基氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸甲酯(0.6g，0.81mmol)溶解于二氯甲烷中(5ml)。加入三氟乙酸(5ml)并将反应混合物保持约1小时。将反应混合物在真空中蒸发，得到无需进一步纯化而使用的油状物。收率：0.437g(100％)。LC-MS m/z＝539(M+1)
实施例17
(S)-2，6-双-(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸
Figure A20068000537601021
将氢氧化钠(4N，1.8ml，6.94mmol)加入至甲醇(10ml)中的上面的(S)-2，6-双-(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸甲酯(2.0g，3.47mmol)溶液中并将该反应混合物保持2小时。将有机溶剂在真空中蒸发，并且将残留物溶解于水(45ml)中并用盐酸(4N)酸化。用二氯甲烷(150ml)萃取混合物，将其用饱和的含水氯化钠(2×25ml)洗涤。将有机相在硫酸镁上干燥，过滤并在真空中蒸发，得到油状物。LC-MS  m/z＝577(M+1)。
实施例18
N-(叔丁氧羰基氨基氧基丁基)邻苯二甲酰亚胺
Figure A20068000537601022
将DBU(15.0ml，101mmol)分几份加入至N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺(18.9g，67.0mmol)、MeCN(14ml)和N-Boc-羟胺(12.7g，95.4mmol)的搅拌混合物中。在50℃下搅拌得到的混合物24小时。加入水(300ml)和12M的HCl(10ml)，并且用AcOEt萃取产物三次。将合并的萃取物用盐水洗涤、干燥(MgSO4)，并在减压下浓缩。通过色谱法(140g SiO2，用庚烷/AcOEt梯度洗脱)纯化得到油状物形式的17.9g(80％)标题化合物。1H NMR(DMSO-d6)δ＝1.36(s，9H)，1.50(m，2H)，1.67(m，2H)，3.58(t.J＝7Hz，2H)，3.68(t，J＝7Hz，2H)，7.85(m，4H)，9.90(s，1H)。
实施例19
4-(叔丁氧羰基氨基氧基)丁胺
将水合肼(20ml)加入至EtOH(10ml)中的N-(叔丁氧羰基氨基氧基丁基)邻苯二甲酰亚胺(8.35g，25.0mmol)溶液中，并且在80℃下搅拌该混合物38小时。将混合物浓缩并且将残留物与EtOH和PhMe共蒸发。将EtOH(50ml)加入至残留物中，并将沉淀的邻苯二甲酰肼滤出并用EtOH(50ml)洗涤。将合并的滤出液浓缩产生5.08g油状物。将该油状物与水(20ml)中的K2CO3(10g)溶液混合，并且将产物用DCM萃取。干燥(MgSO4)并浓缩产生2.28g(45％)油状物形式的标题化合物，其无需进一步纯化而使用。1H NMR(DMSO-d6)：δ＝1.38(m，2H)，1.39(s，9H)，1.51(m，2H)，2.51(t，J＝7Hz，2H)，3.66(t，J＝7Hz，2H)。
实施例20
2-(1，3-双[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯
Figure A20068000537601032
将1，3-双[2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(0.3g，0.40mmol)从无水吡啶中蒸发一次并从无水乙腈中蒸发一次。在氮气下，将残留物溶解于无水DMF(2ml)中，加入60％NaH-油悬浮液(24mg，0.6mmol)。在室温下搅拌该混合物15分钟。加入溴乙酸叔丁酯(0.07mL，0.48mmol)并将混合物另外搅拌60分钟。用冰焠灭反应，然后在乙醚(100mL)和水(100mL)之间分配。将有机相收集、干燥(Na2SO4)，并且在真空中除去溶剂以产生油状物，将其用EtOAc/庚烷/Et3N(49∶50∶1)在硅胶柱上洗脱。收集含有主要产物的级分。在真空中除去溶剂并且将残留物溶解于80％的含水乙酸(5mL)中，并在室温下搅拌过夜。在真空中除去溶剂并且将粗物质溶解于乙醚(25mL)中，并用水(2×5mL)洗涤。收集水相并通过旋转蒸发除去水产生63mg的标题化合物。1H NMR(CDCl3)：δ＝4.19(s，2H)，3.78-3.55(m，21H)，1.49(s，9H)。
实施例21
N，N-双(2-(2-苯二甲酰亚氨基乙氧基)乙基)-O-氨基甲酸叔丁酯
将N，N-双(2-羟乙基)-O-氨基甲酸叔丁酯溶解于极性的，非质子溶剂例如THF或DMF中。缓慢加入氢化钠(矿物油中的60％悬浮液)至该溶液中。搅拌混合物3小时。加入N-(2-溴乙基)邻苯二甲酰亚胺。搅拌该混合物直到反应结束。通过缓慢加入甲醇焠灭反应。加入乙酸乙酯。用含水碳酸氢钠洗涤该溶液。将有机相干燥、过滤，并随后在真空下尽可能地浓缩。将粗化合物通过标准的柱色谱法纯化。
实施例22
N，N-双(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-O-氨基甲酸叔丁酯
Figure A20068000537601042
将N，N-双(2-(2-苯二甲酰亚氨基乙氧基)乙基)-O-氨基甲酸叔丁酯溶解于极性溶剂例如乙醇中。加入肼(或已知可除去邻苯二甲酰保护基的另一种试剂)。在室温(或者如果需要则在提高的温度)下搅拌该混合物直到反应结束。将混合物在真空下尽可能地浓缩。将粗化合物通过标准的柱色谱法纯化，或者如果需要通过真空蒸馏纯化。
实施例23
N，N-双(2-(2-苄氧基羰基氨基乙氧基)乙基)-O-氨基甲酸叔丁酯
Figure A20068000537601051
将N，N-双(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-O-氨基甲酸叔丁酯溶解于含水氢氧化钠和THF的混合物或含水氢氧化钠和乙腈的混合物中。加入苄氧基氯甲酸酯。在室温下搅拌该混合物直到反应结束。如果需要，在真空中减少体积。加入乙酸乙酯。用盐水洗涤有机相。将有机相干燥、过滤，并随后在真空中尽可能地浓缩。将粗化合物通过标准的柱色谱法纯化。
实施例24
双(2-(2-邻苯二甲酰亚氨基乙氧基)乙基)胺
Figure A20068000537601052
将双(2-(2-邻苯二甲酰亚氨基乙氧基)乙基)-氨基甲酸叔丁酯溶解于三氟乙酸中。在室温下搅拌该混合物直到反应结束。将混合物在真空中尽可能地浓缩。将粗化合物通过标准的柱色谱法纯化。
实施例25
11-氧代-17-邻苯二甲酰亚氨基-12-(2-(2-邻苯二甲酰亚氨基乙氧基)乙基)-3，6，9，15-四氧杂-12-氮杂十七烷酸
Figure A20068000537601053
将3，6，9-三氧杂十一烷酸溶解于二氯甲烷中。加入碳二亚胺(例如N，N-二环己基碳二亚胺或N，N-二异丙基碳二亚胺)。在室温下搅拌该溶液过夜。过滤该混合物。如果需要，可以在真空中浓缩滤液。胺与形成的分子内酐的酰化从文献中已知(例如，Cook，R.M.；Adams，J.H.；Hudson，D.Tetrahedron Lett.，1994，35，6777-6780或Stora，T.；Dienes，Z.；Vogel，H.；Duschl，C.Langmuir 2000，16，5471-5478)。将酐与非质子溶剂例如二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺中的双(2-(2-邻苯二甲酰亚氨基乙氧基)乙基)胺溶液混合。搅拌该混合物直到反应结束。将粗化合物通过萃取并随后通过标准的柱色谱法而纯化。
实施例26
5-氧代-11-邻苯二甲酰亚氨基-6-(2-(2-邻苯二甲酰亚氨基乙氧基)乙基)-3，9-二氧杂-6-氮杂十一烷酸
Figure A20068000537601061
将非质子溶剂例如二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺中的二甘醇酐溶液逐滴加入至非质子溶剂例如二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺中的双(2-(2-邻苯二甲酰亚氨基乙氧基)乙基)胺溶液中。搅拌该混合物直到反应结束。将粗化合物通过萃取并随后通过标准的柱色谱法而纯化。
实施例27
乙酸双-[2-(1，3-二氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)乙基]铵
Figure A20068000537601062
将二亚乙基三胺(15.8ml，145.4mmol)缓慢加入至冰醋酸(175ml)中，同时将其在冰浴上冷却。加入邻苯二甲酸酐(43.1g，290.8mmol)。将得到的混合物回流20小时。冷却该溶液。在真空中浓缩混合物。将得到的粘性油状物从乙腈中共蒸发3次。将油状物与乙腈(250ml)混合并且将该混合物加热至短暂回流。将溶液保持在冷藏箱中过夜。通过过滤分离形成的晶体。将分离的明黄色晶体在真空烘箱中干燥。
收率：33.5g，63％。
另外的材料可以通过在浓缩(真空中)后使滤液结晶而获得。
1H-NMR(d6-DMSO)：7.81-7.74(m，8H)，3.60(t，J＝6.32Hz，4H)，3.70-3.20(b，15H)，2.76(t，J＝6.32Hz，4H)，1.91(s，5H可能存在残留的乙酸)。
13C-NMR(d6-DMSO)：δ168.3，146.0，134.5，132.0，123.2，46.5，37.5-也观察到由乙腈和乙酸产生的小峰。
LC-MS(ES-正模式)，m/z：364
实施例28
2-[2-({双-[2-(1，3-二氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)乙基]氨甲酰基}甲氧基)乙氧基]-乙氧基}乙酸
Figure A20068000537601071
将3，6，9-三氧杂十一烷二酸(Trioxaununcandioic acid)(2.67g，12mmol)和N，N’-二环己基碳二亚胺(2.48g，12mmol)在二氯甲烷(90ml)中混合。将得到的混合物搅拌30分钟。过滤该混合物并随后在真空中浓缩。将形成的化合物溶解于二氯甲烷(250ml)中。将双-[2-(1，3-二氧代-1，3-二氢-异吲哚-2-基)-乙基]-乙酸铵(4.0g，9.45mmol)和N，N，N’，N’-四甲基胍(1.15g，10.0mmol)加入至该溶液中。将得到的混合物搅拌至少20小时。在真空中浓缩该混合物。加入乙酸乙酯(150ml)和含水碳酸氢钠(5％w/w，150ml)。分离相。将浓盐酸加入至水相中直到pH为1-2。用二氯甲烷(4×100ml)萃取该溶液。将合并的有机萃取物在硫酸镁上干燥、过滤，并在真空中浓缩以产生明黄色浆液。
收率：2.55g，48％
1H-NMR(CDCl3)δ：7.86-7.69(m，8H)，4.17(s，2H)，4.09(s，2H)，3.94-3.51(数个多重峰，16H)。
13C-NMR(CDCl3)δ：172.2，170.4，168.3，168.0，134.4，134.0，132.0，131.7，123.6，123.4，71.3，70.5，70.4，70.3，69.2，69.0，44.6，44.0，35.7，35.4
LC-MS(ES-正模式)，m/z：568[M+H]+和591[M+Na]+
实施例29
({双-[2-(1，3-二氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)乙基]氨甲酰基}甲氧基)乙酸
Figure A20068000537601081
将乙酸双-[2-(1，3-二氧代-1，3-二氢异吲哚-2-基)乙基]铵(25.8g，60.9mmol)悬浮于DCM(100ml)中。加入N，N，N’，N’-四甲基胍(7.00g，60.9mmol)，之后出现大量沉淀。加入另外的二氯甲烷(50ml)。将二甘醇酐(8.48g，73.0mmol)以一份加入。将该混合物搅拌至少20小时。在真空中浓缩该混合物。将得到的浆液溶解于乙酸乙酯(750ml)和饱和的含水碳酸氢钠(750ml)的混合物中。有机相用饱和的含水碳酸氢钠(2×200ml)萃取。将合并的水相用浓盐酸酸化(pH1-2)-产生大量的白色固体沉淀。用二氯甲烷(400和2×200ml)萃取合并的水相。将有机相在硫酸镁上干燥并过滤。在真空中浓缩有机相至约200ml，之后将其再次过滤。在过滤和浓缩过程中出现进一步的沉淀。蒸发滤出液得到白色固体。
收率：6.04g
1H-NMR(d6-DMSO)δ：12.65(b，1H)，7.89-7.80(m，8H)，4.08(s，2H)，3.81-3.75(m，6H)，3.59-3.50(m，4H)。
13C-NMR(CDCl3)δ：171.4，169.4，168.3，168.1，134.9，134.7，131.9，131.8，123.5，123.3，68.4，67.4，44.3，43.5，35.9，35.5
LC-MS(ES-正模式)，m/z：480[M+H]+
实施例30
碳酸苄基苯酯
Figure A20068000537601091
根据：Pittelkow，M.；Lewinsky，R.；以及Christensen，J.B.Synthesis 2002，15，2195-2202。
将氯甲酸苯酯(54.1g，500mmol)逐滴加入至具有冷凝器和添加漏斗的1l烧瓶中的苯甲醇(78.3g，500mmol)、二氯甲烷(90ml)和吡啶(50ml)的混合物中。将该混合物搅拌1小时。加入水(125ml)。分离相。用稀硫酸(2M，2×125ml)洗涤有机相。在最后的洗涤中必须加入盐水以便达到好的分离。将有机相在硫酸钠上干燥、过滤，并在真空中浓缩。将粗化合物真空蒸馏以产生无色液体。
收率：104.3g(91％)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.46-7.17(2个多重峰，10H)，5.27(s，2H)
13C-NMR(CDCl3)δ：152.5，149.9，133.5，128.3，127.6，127.5.127.3，124.8，119.8，69.1
实施例31
氯化双-(2-苄氧基羰基氨基乙基)铵
Figure A20068000537601101
根据：Pittelkow，M.；Lewinsky，R.；以及Christensen，J.B.Synthesis 2002，15，2195-2202。
将碳酸苄基苯酯(25.1g，110mmol)逐滴加入至二氯甲烷(100ml)中的二亚乙基三胺(5.16g，50mmol)溶液中。将该混合物搅拌至少20小时。用磷酸盐缓冲液(0.025M K2HPO4、0.025M NaH2PO4，2000ml，用2M硫酸调节pH至3)洗涤有机相。将有机相在硫酸钠上干燥、过滤，并在真空中浓缩。
收率：25.2g
将一份(5g)的粗油状物与盐酸(2M，15ml)混合。搅拌该混合物15分钟。将混合物过滤。将分离的固体与无水乙醇(600ml)混合。让该混合物达到回流。倾析沸腾的混合物以便除去不溶解的杂质。在5℃下使该化合物结晶过夜。
收率：2.84g(白色晶体)
1H-NMR(d6-DMSO)δ：8.96(b，2H)，7.51(t，J＝5.56Hz，2H)，7.40-7.30(b，10H)，5，04(s，4H)，3.33(q，J＝6.06Hz，4H)，3.00(b，4H)
13C-NMR(d6-DMSO)δ：156.6，137.2，128.7，128.3，128.2，66.0，46.8.37.1
LC-MS(ES-正模式)，m/z：372.5[M+H]+
实施例32
[2-(2-{[双-(2-苄氧基羰基氨基乙基)氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酸
将3，6，9-三氧杂十一烷二酸(1.83g，8.3mmol)和N，N’-二环己基碳二亚胺(1.70g，8.3mmol)在二氯甲烷(10ml)中混合。将得到的混合物搅拌30分钟。过滤该混合物并随后在真空中浓缩。将形成的化合物与N，N-二甲基甲酰胺(27ml)中的氯化双-(2-苄氧基羰基氨基乙基)铵(2.8g，6.87mmol)和N，N，N’，N’-四甲基胍(791mg，6.87mmol)(250ml)混合。将得到的混合物搅拌20小时。在真空中浓缩该混合物。加入乙酸乙酯(150ml)和含水的碳酸氢钠(5％w/w，150ml)。分离相。用含水的碳酸氢钠(5％w/w，2×100ml)萃取有机相。将合并的含水萃取物与乙酸乙酯(200ml)混合。将浓盐酸加入至该混合物中直到pH为2-3。立即分离相。用乙酸乙酯(2×200ml)萃取水相。将合并的萃取物用硫酸镁干燥、过滤，并在真空中浓缩产生无色浆液。
收率：2.17g，55％。
1H-NMR(CDCl3)δ：10.2(b，1H)，7.31(b，10H)，6.10(b，1H)，5.84(b，1H)，5.06(s，2H)，5.04(s，2H)，4.17-4.09(m，4H)，3.72-3.22(数个多重峰，16H)
13C-NMR(CDCl3)δ：172.9，171.2，157.3，137.0，128.9-128.4(数个信号)，71.3，70.8，70.7，70.3，68.9，67.1，67.0，47.5，46.0，39.6
LC-MS(ES-正模式)，m/z：576[M+H]+
实施例33
[2-(2-{[双-(2-氨乙基)氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酸
Figure A20068000537601121
将[2-(2-{[双-(2-苄氧基羰基氨基乙基)氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酸(725mg，1.26mmol)溶解于甲醇(50ml)中。加入活性炭上的钯(150mg，5％Pd，湿的，Degussa催化剂类型E101 NO/W)。在氢气气氛下搅拌该混合物20小时。过滤混合物。在真空中浓缩滤液。
LC-MS(ES-正-模式)，m/z：309[M+H]+，291[M-H2O]+
实施例34
[2-(2-{[双-(2-苄氧基羰基氨基乙基)氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酸2，5-二氧吡咯烷-1-基酯
Figure A20068000537601122
将[2-(2-{[双-(2-苄氧基羰基氨基乙基)氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酸(1.45g，2.52mmol)与N-羟基丁二酰亚胺(291mg，2.53mmol)、1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(485mg，2.53mmol)和N，N，N′，N′-四甲基胍(291mg，2.53mmol)混合。搅拌该混合物20小时。加入含水的硫酸氢钠(5％w/w，150ml)和二氯甲烷(100ml)。分离相。用二氯甲烷(2×100和2×50ml)萃取水相。将合并的有机相在固体硫酸钠上干燥、过滤，并在真空中浓缩。
LC-MS(ES-正模式)，m/z：674[M+H]+，577(未反应的原料)。
实施例35
1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮-3-基2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸酯
Figure A20068000537601131
将3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(10.0g；61.3mmol)和2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸(10.9g；61.3mmol)悬浮于DCM(125ml)中并加入DIC(7，7g；61.3mmol)。在环境温度下于干燥气氛中搅拌该混合物过夜。形成二异丙基脲沉淀物，将其滤出。将有机溶液用含水的饱和碳酸氢钠溶液充分洗涤，随后在真空中干燥(Na2SO4)并蒸发，产生标题产物的明黄色油状物。收率为16.15g(81％)。1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.39ppm(s，3H)；3.58(t，2H)；3.68(t，2H)；3.76(t，2H)；3.89(t，2H)；4.70(s，2H)；7.87(t，1H)；8.03(t，1H)；8.23(d，1H)；8.37(d，1H)。13C-NMR(CDCl3，选择的峰)：δ＝57.16ppm；64.96；68.71；68.79；69.59；69.99；120.32；123.87；127.17；130.96；133.63；142.40；148.22；164.97。
寡聚产物：
固相寡聚化：
下面描述的反应都在经Wang连接体官能化的聚苯乙烯上实施。一般而言，该反应也会在其它类型的固相支持物上，以及用其它类型的官能化连接体来进行。
固相叠氮化物还原：
该反应是已知的(Schneider，S.E.等，Tetrahedron，1998，54(50)15063-15086)并且可以通过在THF和水的混合物中，用过量的三苯基膦室温下处理结合支持物的叠氮化物12-24小时来完成。可替代地，可以使用如Chan，T.-Y.等，Tetrahedron Lett.1997，38(16)，2821-2824描述的在含水THF中的三甲基膦。叠氮化物的还原也可以用硫化物例如二硫苏糖醇(Meldal，M.等，Tetrahedron Lett.1997，38(14)，2531-2534)1，2-二巯基乙烷和1，3-二巯基丙烷(Meinjohanns，E.等，J.Chem.Soc，Perkin Trans 1，1997，6，871-884)或锡(II)盐例如氯化锡(II)(Kim，J.M.等，Tetrahedron Lett，1996，37(30)，5305-5308)在固相上完成。
固相氨基甲酸酯形成：
该反应是已知的并且通常通过优选在存在碱的情况下，将活化的碳酸酯或卤代甲酸酯衍生物与胺反应来完成。
实施例36
3-(1，3-双{2-[2-([苯甲酰基氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基羰基)-氨基)丙酸
Figure A20068000537601141
该实施例用实施例4中制备的1，3-双[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基-对硝基苯基碳酸酯单体结构单元，来合成第二代基于氨基甲酸酯的支化聚合物，所述的支化聚合物用2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸加帽。该偶联化学基于标准的固相氨基甲酸酯化学，并且保护方法基于如上描述的固相叠氮化物还原步骤。
步骤1：将Fmoc-β-Ala-Wang树脂(100mg；载荷0.31mmol/gBACHEM)悬浮于二氯甲烷中30分钟，并随后用DMF洗涤两次。加入DMF中的20％哌啶溶液，并将该混和物在环境温度下摇动15分钟。重复该步骤，并且将树脂用DMF(3×)和DCM(3×)洗涤。
步骤2：单体结构单元的偶联：将1，3-双[叠氮基乙氧基乙基]丙-2-基-对硝基苯基氨基甲酸酯(527mg；1,4mmol，4×)与DIPEA(240μl；1.4mmol，4×)一起加入至树脂中。将树脂摇动90分钟，随后排干并用DMF(3×)和DCM(3×)洗涤。
步骤3：用乙酸酐加帽：然后将树脂在环境温度下用乙酸酐、DIPEA、DMF(12∶4∶48)溶液处理10分钟。除去溶剂并且用DMF(3×)和DCM(3×)洗涤树脂。
步骤4：去保护(叠氮基的还原)：将树脂在50℃下用DMF中的DTT(2M)和DIPEA(1M)溶液处理1小时。随后用DMF(3×)和DCM(3×)洗涤树脂。提取少量树脂并用DMF中的苯甲酰氯(0.5M)和DIPEA(1M)溶液处理1小时。将树脂用50％TFA/DCM裂解并将双苯甲酰化产物用NMR和LC-MS分析。1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.50-3.75(m，20H)；3.85(s，1H)；4.25(d，2H)；6.95(t，1H)；7.40-7.50(m，6H)；7.75(m，4H)。LC-MS：m/z＝576(M+1)；Rt＝2.63分钟。
实施例37
3-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酸
Figure A20068000537601151
步骤1：将Fmoc-β-Ala连接的Wang树脂(A22608，NovaBiochem，3.00g；载荷0.83mmol/g)在DCM中膨胀20分钟。然后用DCM(2×20ml)和NMP(2×20ml)洗涤。随后用NMP中的20％哌啶处理树脂两次(2×15分钟)。用NMP(3×20ml)和DCM(3×20ml)洗涤树脂。
步骤2：将2-(1，3-双[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸(3.70g；10mmol)溶解于NMP(30ml)中并加入DhbtOH(1.60g；10mmol)和DIC(1.55ml；10mmol)。将该混合物在环境温度下搅拌30分钟，然后与DIPEA(1.71ml；10mmol)一起加入至步骤1获得的树脂中。将反应混合物摇动1.5小时，然后排干并用NMP(5×20ml)和DCM(3×20ml)洗涤。
步骤3：随后加入NMP(15ml)和DCM(15ml)中的SnCl2.2H2O(11.2g；49.8mmol)溶液。将该反应混合物摇动1小时。将树脂排干并用NMP：MeOH(5×20ml；1∶1)洗涤。随后将树脂在真空中干燥。
步骤4：将NMP(10ml)中的2-[2-(2-甲氧基乙基)乙氧基]乙酸(1.20g；6.64mmol)、DhbtOH(1.06g；6.60mmol)和DIC(1.05ml；6.60mmol)溶液在室温下混合10分钟，然后加入至步骤3中获得的3-[2-(1，3-双[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酸连接的wang树脂(1.0g；0.83mmol/g)中。加入DIPEA(1.15ml，6.60mmol)，并且将该反应混合物摇动2.5小时。除去溶剂，并用NMP(5×20ml)和DCM(10×20ml)洗涤树脂。
步骤5：将步骤4的树脂产物用TFA:DCM(10ml，1∶1)处理1小时。将树脂过滤并用TFA:DCM(10ml，1∶1)洗涤一次。然后将合并的滤液和洗涤液干燥，产生黄色油状物(711mg)。将油状物溶解于10％乙腈-水(20ml)中，并在使用C18柱，以及15-40％乙腈-水梯度的制备型HPLC仪器上纯化两次。级分随后通过LC-MS分析。将含有产物的级分合并并干燥。收率：222mg(37％)。LC-MS：m/z＝716(M+1)；Rt＝1.97分钟。1H-NMR(CDCl3)：δ＝2.56ppm(t，2H)；3.36(s，6H)；3.46-3.66(m，39H)；4.03(s，4H)；4.16(s，2H)；7.55(t，2H)；8.05(t，1H)。13C-NMR(CDCl3，选择的峰)：δ＝33.71ppm；34.90；58.89；68.94；69.40；69.98；70.09；70.33；70.74；70.91；71.07；71.74；79.07；171.62；171.97；173.63。
实施例38
3-(1，3-双{2-(2-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酸
Figure A20068000537601171
通过重复步骤2-5，使用的试剂的量加倍，从实施例的步骤3获得的3-[2-(1，3-双[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酸连接的wang树脂(1.0g；0.83mmol/g)制备该物质。收率：460mg(33％)。MALDI-MS(α-氰基-4-羟基肉桂酸)：m/z＝1670(M+Na)。1H-NMR(CDCl3)：δ＝2.57ppm(t，2H)；3.38(s，12H)；3.50-3.73(m，85H)；4.05(s，8H)；4.17(s，2H)；4.19(s，4H)；7.48(m，4H)；7.97(m，3H)。13C-NMR(CDCl3，选择的峰)：δ＝38.81ppm；58.92；69.46；69.92；70.05；70.05；70.13；70.40；70.73；70.97；71.11；71.88；76.74；77.06；77.38；171.33；172.02。
可替代的制备方式：
该实施例使用在实施例6中制备的2-(1，3-双[叠氮基乙氧基乙基]丙-2-基氧基)乙酸单体结构单元，来合成第二代基于酰胺的支化聚合物，所述的支化聚合物用2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸加帽。该偶联化学基于标准的固相肽化学，并且保护方法基于如上描述的固相叠氮化物的还原步骤。
步骤1：将Fmoc-β-Ala-Wang树脂(100mg；载荷0.31mmol/gBACHEM)悬浮于二氯甲烷中30分钟，并随后用DMF洗涤两次。加入DMF中的20％哌啶溶液，并将该混和物在环境温度下摇动15分钟。重复该步骤，并且将树脂用DMF(3×)和DCM(3×)洗涤。
步骤2：单体结构单元的偶联：将2-(1，3-双[叠氮基乙氧基乙基]丙-2-基氧基)乙酸(527mg；1.4mmol，4×)和DhbtOH(225mg；1.4mmol，4×)溶液溶解于DMF(5ml)中并加入DIC(216μl，1.4mmol，4×)。将该混合物放置10分钟(预活化)随后与DIPEA(240ul；1.4mmol，4×)一起加入至树脂中。将树脂摇动90分钟，随后排干并用DMF(3×)和DCM(3×)洗涤。
步骤3：用乙酸酐加帽：然后将树脂在环境温度下用乙酸酐、DIPEA、DMF(12∶4∶48)的溶液处理10分钟。除去溶剂并且将树脂用DMF(3×)和DCM(3×)洗涤。
步骤4：去保护(叠氮基的还原)：将树脂在50℃下用DMF中的DTT(2M)和DIPEA(1M)溶液处理1小时。随后用DMF(3×)和DCM(3×)洗涤树脂。提取少量树脂并用DMF中的苯甲酰氯(0.5M)和DIPEA(1M)溶液处理1小时。将树脂用50％TFA/DCM裂解并将二苯甲酰化的产物用NMR和LC-MS分析。1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.50-3.75(m，20H)；3.85(s，1H)；4.25(d，2H)；6.95(t，1H)；7.40-7.50(m，6H)；7.75(m，4H)。LC-MS：m/e＝576(M+1)；Rt＝2.63分钟。
步骤5-7如步骤2-4实施，使用双倍摩尔量的试剂，但使用相同量的溶剂。
步骤8：用2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸加帽：将2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸(997mg；5.6mmol，相当于树脂载荷的16倍)和DhbtOH(900mg；5.6mmol，16×)溶液溶解于DMF(5ml)中并加入DIC(864ul，5.6mmol，16×)。将该混合物放置10分钟(预活化)随后与DIPEA(960ul；5.6mmol，16×)一起加入至树脂中。将树脂摇动90分钟，随后排干并用DMF(3×)和DCM(3×)洗涤。
步骤9：从树脂上裂解：将树脂在环境温度下用50％TFA-DCM溶液处理30分钟。收集溶剂并用50％TFA-DCM另外洗涤树脂。将合并的滤液蒸发至干燥，并将残留物通过色谱法纯化。
实施例39
3-(1，3-双{2-(2-[2-(1，3-双{2-(2-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酸
Figure A20068000537601191
通过重复步骤2-3，使用2倍量的所用试剂，然后重复步骤2-5，使用4倍量的所用试剂，从实施例的步骤3获得的3-[2-(1，3-双[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酸连接的wang树脂(1.0g；0.83mmol/g)制备该物质。收率：84mg(4％)。LC-MS：(m/2)+1＝1758；(m/3)+1＝1172；(m/4)+1＝879；(m/5)+1＝704。Rt＝2.72分钟。1H-NMR(CDCl3)：δ＝2.51ppm(t，2H)；3.33(s，24H)；3.44-3.70(m，213H)；3.93(s，16H)；4.08(s，14H)；7.25(m，8H)；7.69(m，7H)。13C-NMR(CDCl3，选择的峰)：δ＝38.94ppm；59.33；69.78；70.08；70.37；70.44；70.56；70.82；71.10；71.26；71.51；72.17；79.24；170.60；171.22。
实施例40
N-羟基琥珀酰亚氨基3-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酸酯
Figure A20068000537601201
将3-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酸(67mg；82μmol)溶解于THF(5ml)中。将该反应混合物在冰浴上冷却。加入DIPEA(20μl；120μmol)和TSTU(34mg；120μmol)。将该混合物在环境温度下搅拌过夜，此时根据LC-MS，反应完成。LC-MS：m/z＝813(M+H)；Rt＝2.22分钟。
实施例41
N-羟基琥珀酰亚氨基3-(1，3-双{2-(2-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酸酯
Figure A20068000537601211
与实施例40中描述类似地，从3-(1，3-双{2-(2-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酸和TSTU制备。LC-MS：(m/2)+1＝873，Rt＝2.55分钟。
实施例42
N-羟基琥珀酰亚氨基3-(1，3-双{2-(2-[2-(1，3-双{2-(2-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酸酯
Figure A20068000537601212
如实施例40中描述的，从N-羟基琥珀酰亚氨基3-(1，3-双{2-(2-[2-(1，3-双{2-(2-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酸和TSTU制备。LC-MS：(m/4)+1＝903，Rt＝2.69分钟。
实施例43
N-(4-叔丁氧羰基氨基氧基丁基)3-(1，3-双{2-(2-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酰胺
Figure A20068000537601221
将N-羟基琥珀酰亚氨基3-(1，3-双{2-(2-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酸酯(105mg；0.06mmol)溶解于DCM(2ml)中。随后加入4-(叔丁氧羰基氨基氧基)丁胺(49mg；0.24mmol)的溶液，之后加入DIPEA(13μl；0.07mmol)。将该混合物在环境温度下搅拌1小时，然后减压浓缩。将残留物溶解于20％乙腈-水(4ml)中，并且在使用C18柱，以及0、10、20、30和40％(各自为10ml洗脱)的乙腈-水的台阶式梯度的制备型HPLC仪器上纯化。将含有纯产物的级分浓缩并在真空烘箱中干燥16小时以产生黄色的油状物。收率：57mg(51％)。LC-MS：(m/2)+1＝918，Rt＝2.75分钟。1H-NMR(CDCl3)：δ＝1.42ppm(s，9H)；2.40(t，2H)；3.21(dd，2H)；3.33(s，12H)；3.38-3.72(m，99H)；3.80(m，2H)；3.95(s，8H)；4.08(s，6H)；6.99(m，1H)；7.23(m，4H)；7.69(m，2H)；7.85(m，1H)；8.00(m，1H)。13C-NMR(CDCl3，选择的峰)：δ＝28.27ppm；38.58；58.97；69.42；69.72；70.01；70.08；70.20；70.41；70.46；70.73；70.91；71.16；71.22；71.81；78.89；81.33；170.27；170.89。
实施例44
N-(4-氨基氧基丁基)3-(1，3-双{2-(2-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酰胺
Figure A20068000537601231
将N-(4-叔丁氧羰基氨基氧基丁基)3-(1，3-双{2-(2-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酰胺(19mg；10μmol)溶解于50％TFA/DCM(10ml)中，并将该澄清的溶液在环境温度下搅拌30分钟。通过旋转蒸发除去溶剂，并将残留物从DCM除去溶剂(strip)两次，产生定量收率(19mg)的标题产物。LC-MS：(m/2)+1＝868，(m/3)+1＝579，Rt＝2.35分钟。
实施例45
2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯
将2-(1，3-双[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯(1.74g；4.5mmol，实施例9)和1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮-3-基2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸酯(2.94g；9mmol，实施例35)溶解于DCM(100ml)中。加入DIPEA(3.85ml；22.3mmol)并将该澄清的混合物在室温下搅拌90分钟。在真空中除去溶剂，并通过使用MeOH-DCM(1∶16)作为洗脱剂的硅石色谱法纯化残留物。将纯的级分合并并干燥产生澄清油状物的标题物质。收率为1.13g(36％)。1H-NMR(CDCl3)：δ＝1.46ppm(s，9H)；3.38(s，6H)；3.49-3.69(m，37H)；4.01(s，4H)；4.18(s，2H)；7.20(bs，2H)。
实施例46
2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸：
Figure A20068000537601241
将2-(1，3-双[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯(470mg；0.73mmol)溶解于DCM-TFA(25ml，1∶1)中并将该混合物在环境温度下搅拌30分钟。在真空中除去溶剂，并将残留物从DCM中除去溶剂两次。LC-MS：(M+1)＝645，Rt＝2.26分钟。1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.45ppm(s，6H)；3.54-3.72(m，37H)；4.15(s，4H)；4.36(s，2H)。
实施例47
N-羟基琥珀酰亚氨基2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸酯
Figure A20068000537601242
将2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸(115mg；0.18mmol)溶解于THF(5ml)中。将该反应混合物置于冰浴上。加入TSTU(65mg，0.21mmol)和DIPEA(37μl；0.21mmol)并将该反应混合物在0℃下搅拌30分钟，随后在室温下搅拌过夜。然后将反应至干燥，产生130mg标题物质的澄清油状物。LC-MS：(m+1)＝743，(m/2)+1＝372，Rt＝2,27分钟。
实施例48
3-(1，3-双{2-(2-[2-(1，3-双{2-(2-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯
Figure A20068000537601251
使用实施例45中描述的方案和纯化方法，从两当量的N-羟基琥珀酰亚氨基2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸酯和一当量的2-(1，3-双[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯制备该物质。
进一步的树枝状生长可以这样完成：如实施例46中描述的除去叔丁基基团并随后如实施例47中描述的形成N-羟基琥珀酰亚氨基酯，之后如本实施例中描述的偶联至2-(1，3-双[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸叔丁酯。
实施例49
(S)-2，6-双(2-[2-(2-[2-(2，6-双-[2-(2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸甲酯
Figure A20068000537601261
将(S)-2，6-双-(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸(1.8g，3.10mmol)溶解于二甲基甲酰胺/二氯甲烷1∶3(10ml)的混合物中，用二异丙基乙胺将pH调节成碱性反应，加入N-羟基苯并三唑和N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐并将该反应混合物保持30分钟。然后将该反应混合物加入至(S)-2，6-双-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)己酸甲酯(0.37g，0.70mmol于二氯甲烷中)溶液中并将反应混合物保持过夜。将反应混合物用二氯甲烷(150ml)稀释，用水(2×40ml)、50％饱和碳酸氢钠(2×30ml)和水(3×40ml)洗涤。将有机相在硫酸镁上干燥，过滤并在真空中蒸发得到油状物。收率：1.6g(89％)。LC-MS：m/z＝1656(M+1)，828.8(M/2)+1和553(M/3)+1。
实施例50
(S)-2，6-双(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-双-[2-(2-[2-(2-叔丁氧羰基氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸甲酯
Figure A20068000537601271
将二碳酸二叔丁酯(1.0g，4.8mmol)和Pd/C(10％，1.1g)加入至乙酸乙酯(60ml)中的上面的(S)-2，6-双(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-双[2-(2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸甲酯(1.6g，0.97mmol)溶液中。将氢气持续通入该反应混合物中鼓泡2小时。过滤反应混合物并在真空中除去有机溶剂，得到无需进一步纯化而使用的油状物。收率：1.8g(98％)。LC-MS：m/z＝1953(M+1)，977(M/2)+1。
实施例51
(S)-2，6-双(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-双[2-(2-[2(2氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸甲酯
Figure A20068000537601281
将上面的(S)-2，6-双(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-双[2-(2-[2-(2-叔丁氧羰基氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸甲酯溶解于二氯甲烷(20ml)中并加入三氟乙酸(20ml)。保持反应混合物2小时。在真空中蒸发有机溶剂，得到油状物。
收率：1.4g(100％)。LC-MS：m/z＝1552(M+1)；777.3(M/2)+1；518.5(M/3)+1和389.1(M/4)+1。
实施例52
(S)-2，6-双-(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-双-[2-(2-[2-(2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸甲酯
Figure A20068000537601291
将N-羟基琥珀酰亚胺(0.8g，7.32mmol)和N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1.4g，7.32mmol)加入至二氯甲烷和二甲基甲酰胺3∶1的混合物(20ml)中的2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸(1.3g，7.32mmol)溶液中。将该反应混合物保持1小时，随后将该混合物加入至二氯甲烷(10ml)中的(S)-2，6-双(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-双[2-(2-[2(2氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸甲酯(1.42g，0.92mmol)和二异丙基乙胺(2.4ml，14.64mmol)溶液中。将该反应混合物保持过夜。将反应混合物用二氯甲烷(100ml)稀释并用水(3×25ml)萃取。用额外的二氯甲烷(2×75ml)萃取合并的水相。将合并的有机相在硫酸镁上干燥、过滤并在真空中蒸发。通过用500ml乙酸乙酯，之后用500ml乙酸乙酯/甲醇9∶1并最后用甲醇作为洗脱剂的急骤色谱法纯化残留物。将含有产物的级分在真空中蒸发得到油状物。收率：0.75g(38％)。LC-MS：m/z＝1097(M/2)+1；732(M/3)+1和549(M/4)+1。
(S)-2，6-双-(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-双-[2-(2-[2-(2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸甲酯能够皂化成游离酸，并可用活化酯连接至ITA的游离氨基上，例如赖氨酸残基的ε氨基或末端α氨基上。可以生产所述的活化酯并通过本领域已知的标准偶联方法(例如二异丙基乙胺和N-羟基苯并三唑或其它活化条件)，将其偶联至ITA肽的氨基基团。
可替代地，可以将上面的叔丁基保护的羧酸中间产物去保护并随后活化为OSu酯(例如，如实施例40中描述的)，用于连接至ITA肽。
实施例53
[2-(2-{[双-(2-{2-[2-(2-{[双-(2-苄氧羰基氨基乙基)氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙基)氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酸：
将四氢呋喃(50ml)中的[2-(2-{[双-(2-苄氧羰基氨基乙基)氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(2.53mmol-来自先前的实验，质量未测定)溶液和含水碳酸氢钠(5％w/w，50ml)中的[2-(2-{[双-(2-氨乙基)氨甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙氧基]乙酸(1.26mmol-来自先前的实验，质量未测定)溶液混合。将该混合物搅拌至少20小时。加入固体硫酸氢钠直到pH为2-3。分离相。用二氯甲烷(3×50ml)萃取水相。将合并的有机相用含水的硫酸氢钠(5％w/w，50ml)洗涤。用二氯甲烷(2×50ml)萃取水相。将合并的有机相在硫酸镁上干燥、过滤，并在真空中浓缩。
收率：989mg
LC-MS(ES-正模式)，m/z：1423[M+H]+
用于合成具有带电荷磷酸酯主链的树枝状高分子的一般方法。
可替代地，可以将上面的叔丁基保护的羧酸中间产物去保护并随后活化为OSu酯(例如，如实施例47中描述的)，用于连接至胰岛素。
实施例54
Figure A20068000537601312
2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙醇：
将三苯基氯甲烷(10g，35.8mmol)溶解于无水吡啶中，加入二甘醇(3.43mL，35.8mmol)并将该混合物在氮气下搅拌过夜。在真空中除去溶剂。溶解于二氯甲烷(100mL)并用水洗涤。将有机相在Na2SO4上干燥并在真空中除去溶剂。通过从庚烷/甲苯(3∶2)中再结晶来纯化粗产物得到标题化合物。
1H NMR(CDCl3)：δ＝7.46(m，6H)，7.28，(m，9H)，3.75(t，2H)，3.68(t，2H)，3.62(t，2H)，3.28(t，2H)。LC-MS：m/z＝371(M+Na)；Rt＝2.13分钟。
2-[2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙氧甲基]环氧乙烷：
Figure A20068000537601322
将2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙醇(6.65g，19mmol)溶解于无水THF(100mL)中。缓慢加入60％NaH(0.764mg，19mmol)。将该悬浮液搅拌15分钟。加入表溴醇(1.58mL，19mmol)并将该混合物在室温下于氮气下搅拌过夜。用冰焠灭反应，然后在乙醚(300mL)和水(300mL)之间分离。用二氯甲烷萃取水相。将有机相收集、干燥(Na2SO4)并在真空中除去溶剂得到油状物，其在用DCM/MeOH/Et3N(98∶1∶1)洗脱的硅胶柱上纯化产生标题化合物。
1H NMR(CDCl3)：δ＝7.45(m，6H)，7.25，(m，9H)，3.82(dd，1H)，3.68(m，6H)，3.45(dd，1H)，3.25(t，2H)，3.15(m，1H)，2.78(t，1H)，2.59(m，1H)。LC-MS：m/z＝427(M+Na)；Rt＝2.44分钟。
1，3-双[2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇：
Figure A20068000537601331
将2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙醇(1.14g，3.28mmol)溶解于无水DMF(5mL)中。缓慢加入60％NaH(144mg，3.61mmol)并将混合物在室温下于氮气下搅拌30分钟。将混合物加热至40℃。将2-[2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙氧甲基]环氧乙烷(1.4g，3.28mmol)溶解于无水DMF(5mL)中并于氮气下逐滴加入至上面的溶液中，同时保持搅拌。加入结束后，在40℃下于氮气下搅拌该混合物过夜。移除热浴并在冷却至室温后用冰焠灭反应，并将其倾注入饱和的含水NaHCO3(100mL)中，用乙醚(3×75mL)萃取。将有机相收集、干燥(Na2SO4)，并在真空中除去溶剂得到油状物，其在用EtOAc/庚烷/Et3N(49∶50∶1)洗脱的硅胶柱上纯化产生标题化合物。1H NMR(CDCl3)：δ＝7.45(m，12H)，7.25，(m，18H)，3.95(m，1H)，3.78-3.45(m，16H)，3.22(t，4H)，LC-MS：m/z＝775(M+Na)；Rt＝2.94分钟。
1，3-双[2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(2-氰基乙基二异丙基亚磷酰胺)：
Figure A20068000537601332
将1，3-双[2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(0.95g，1.26mmol)从无水吡啶中蒸发两次并从无水乙腈中蒸发一次。溶解于无水THF(15mL)，当在氮气下搅拌时，加入二异丙基乙胺(1.2mL，6.95mmol)。将该混合物用冰浴冷却至0℃，在氮气下加入2-氰基乙基二异丙基氯代亚磷酰胺(0.39mL，1.77mmol)。将混合物在0℃下搅拌10分钟，之后在室温下搅拌30分钟。加入含水NaHCO3(50mL)并用DCM/Et3N(98∶2)(3×30mL)萃取该混合物。将有机相收集、干燥(Na2SO4)，并在真空中除去溶剂得到油状物，其在用EtOAc/庚烷/Et3N(35∶60∶5)洗脱的硅胶柱上纯化而产生703mg标题化合物。31P-NMR(CDCl3)：δ149.6ppm
{2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]-1-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧甲基]乙氧基}乙酸叔丁酯
Figure A20068000537601341
将1，3-双[2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙氧基]丙-2-醇(0.3g，0.40mmol)从无水吡啶中蒸发一次并从无水乙腈中蒸发一次。在氮气下溶解于无水DMF(2mL)中，加入60％的NaH(24mg，0.6mmol)。在室温下搅拌该混合物15分钟。加入溴乙酸叔丁酯(0.07mL，0.48mmol)并将混合物另外搅拌60分钟。用冰焠灭该反应。在乙醚(2×50mL)和水(2×50mL)之间分离，将有机相收集、干燥(Na2SO4)，并且在真空中除去溶剂得到油状物，将其用EtOAc/庚烷/Et3N(49∶50∶1)在硅胶柱上洗脱。收集合有主要产物的级分，在真空中除去溶剂并且将其溶解于80％含水乙酸(5mL)中，并在室温下搅拌过夜。在真空中除去溶剂。并将粗物质溶解于乙醚(25mL)中，用水(2×5mL)洗涤。收集水相，并通过旋转蒸发除去水产生63mg的标题化合物。1H NMR(CDCl3)：δ＝4.19(s，2H)，3.78-3.55(m，21H)，1.49(s，9H)。
将2-(1，3-双[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]丙-2-氧基)乙酸叔丁酯(63mg，0.16mmol)在无水乙腈中蒸发两次。将1，3-双[2-(2-三苯甲基氧基乙氧基)乙氧基]丙-2-氧基β-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺(353mg，0.37mmol)从无水乙腈蒸发两次，溶解于无水乙腈(2mL)中并将其加入。在氮气下加入无水乙腈中的四唑溶液(0.25M，2.64mL)并在室温下搅拌该混合物1小时。加入5.5mL的I2-溶液(0.1M于THF/卢剔啶/H2O 7∶2∶1中)并另外搅拌混合物1小时。将反应混合物用乙酸乙酯(20mL)稀释，并用2％含水亚硫酸钠洗涤直到碘的颜色消失。将有机相干燥(Na2SO4)，并在真空中除去溶剂。将残留物溶解于80％的含水乙酸(5mL)中并在室温下搅拌过夜。在真空中除去溶剂，并加入乙醚(25mL)和水(10mL)至粗产物中。收集水相并在真空中除去水。将产物在含有0.1％TFA的0-40％乙腈梯度下，于反相制备型HPLC C-18柱上纯化而产生标题叔丁基保护的第二代支化聚合物产物。LC-MS：m/z＝1171(M+Na)；1149(M+)，1093(MS中叔丁基的丢失)；Rt＝2.76分钟。
随后用如本领域技术人员已知的常规的碱和酸处理，来完成β-氰基乙基基团的去保护和叔丁酯基团的去除。
树枝状高分子至ITA的连接：
实施例55
N-ε26，3-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酰基[Arg34]GLP-1-(7-37)-OH
Figure A20068000537601361
将R34-GLP-1(7-37)(L.B.Knudsen等，J.Med.Chem.2000，43，1664-1669)(110mg；33umol)悬浮于水(30ml)中。加入DIPEA(156ul；1.6mmol)至该混浊的悬浮液中，并将混合物搅拌10分钟，在该时间内溶液变得澄清。测量pH为10。然后加入水(6.0ml)中的N-羟基琥珀酰亚氨基3-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酸酯(80.4mg；99umol，实施例32)溶液。该反应混合物变成黄色并变得稍微混浊。在室温下搅拌混合物45分钟。随后加入甘氨酸溶液(5.3ml，浓度＝10mg/ml)。在室温下搅拌该混合物5分钟。然后使用C18柱(20×2cm)，用25-55％水-乙腈线性梯度和10ml/分钟的流速，使用直接注射(分别为20ml和16ml)通过制备型HPLC纯化反应混合物两次，收集10ml级分。使用LC-MS(电喷射)和HPLC(方法A)分析含有产物的单独的级分。合并含有纯化合物的样品得总体积为80ml的样品，其终浓度为1.05mg/ml，该浓度从λ＝276nm处的相对吸收测量而测定。将样品冷冻并在-18℃保存，直到使用。收率：84.6mg(67％)。MALDI-TOF-MS(α-氰基-4-羟基肉桂酸)：m/z＝4080。LC-MS(电喷射)：(m/3)+1＝1261；(m/4)+1＝1021；Rt＝3.54分钟。HPLC(方法A)：Rt＝36.46分钟。
实施例56
N-ε26-3-(1，3-双{2-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}-乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基])乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)-丙酰基[Arg34]GLP-1-(7-37)-OH
Figure A20068000537601371
将R34-GLP-1(7-37)(15.6mg；4.5umol)悬浮于水(10ml)中。加入DIPEA(86ul；0.88mmol)至该混浊的悬浮液中，并将混合物搅拌10分钟，在该时间内溶液变得澄清。测量pH为10。然后加入水(2.0ml)中的N-羟基琥珀酰亚氨基3-(1，3-双{2-(2-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]乙氧基)乙氧基}丙-2-基氧基)乙酰氨基)丙酸酯(93.0mg；53umol，实施例33)溶液。反应混合物保持澄清。在室温下搅拌混合物40分钟。随后加入甘氨酸溶液(3.0ml，浓度＝10mg/ml)。在室温下搅拌该混合物5分钟。如下通过制备型RP-HPLC纯化混合物：将总样品体积(15ml)注射至C18柱(20×2cm)上，并以10ml/分钟的流速使用25％-55％水-乙腈线性梯度洗脱。收集10ml级分。使用LC-MS(电喷射)和HPLC(方法A)分析含有产物的单独的级分。合并含有纯化合物的样品得总体积为24ml的样品，其终浓度为0.25mg/ml，该浓度从λ＝276nm处的相对吸收测量而测定。将样品冷冻并在-18℃保存，直到使用。收率：5.8mg(24％)。LC-MS(电喷射)：(m/3)+1＝1672；(m/4)+1＝1254；(m/5)+1＝1004；Rt＝3.25分钟。HPLC(方法A)：Rt＝35.64分钟。
实施例57
Nε37-((S)-2，6-双-(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-双-[2-(2-[2-(2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酰基)[Aib8，22，35，Lys37]GLP-1(7-37)酰胺的制备
1.a受保护的肽基树脂的合成。
Boc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Aib-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg(Pmc)-Lys(Dde)-Rink酰胺树脂用制造商提供的FastMoc UV方案，根据Fmoc策略在Applied Biosystems 433A肽合成仪上以0.25mmol规模制备，所述的FastMoc UV方案采用在NMP中HBTU介导的偶联，并UV监控Fmoc保护基团的去保护。为了提高偶联效率，使用HATU而不是HBTU作为偶联试剂，来偶联这些残基(Aib残基和Aib后面的残基)。用于合成的起始树脂(438mg)是置换容量为0.57mmol/g的4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基树脂(Rink酰胺树脂)(Merck Biosciences GmbH，德国。cat.#：01-12-0013)。使用的受保护的氨基酸衍生物是(2S)-6-[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代-亚环己基)-乙氨基]-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)己酸(Fmoc-Lys(Dde)-OH)、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Boc)-OH。
收率为1.37g的无水肽基树脂。
1.b肽基树脂的表征
该树脂通过将粗肽从50mg这种树脂上裂解来表征，所述的裂解是通过用14μl TIS、14μl H2O和0.5ml TFA的混合物将其处理2小时来进行的。通过过滤除去树脂并且将粗肽通过沉淀分离并用Et2O洗涤。HPLC和LC-MS分析在干沉淀物上实施。
分析结果：
  分析方法   结果
  HPLC A1   r.t.：37.41分钟。
  LC-MS   r.t.3.48分钟，(M+3H+)/3的质量：1221.3Da，(计算值：1220Da)
1.c Dde的去保护
将从(1.a)得到的受保护的肽基树脂(1.35g，250μmol)在NMP:DCM 1∶1(15ml)中洗涤两次。加入新鲜制备的NMP中的2％水合肼溶液(20ml)。在室温下摇动反应混合物12分钟，并随后过滤。将所述的肼处理重复两次。此后，将树脂用NMP、DCM和NMP彻底洗涤。
1.d支化聚合物的连接
将Dde去保护的树脂悬浮于NMP(20ml)中。将如实施例39中描述的用TSTU预活化的(S)-2，6-双-(2-[2-(2-[2-((S)-2，6-双-[2-(2-[2-(2-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基]乙氧基)乙酰氨基]己酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)己酸与DIPEA一起加入并且将该悬浮液摇动过夜。然后通过过滤分离树脂并且用NMP、DCM、2-丙醇、甲醇和Et2O彻底洗涤并在真空中干燥。
1.e产物的裂解
将来自1.d的树脂与350μl TIS、350μl H2O和14ml TFA的混合物一起在室温下搅拌3小时。将树脂通过过滤除去并用3ml TFA洗涤。将收集的滤液在真空中浓缩至5ml，并将粗产物通过加入40mlEt2O沉淀，随后离心。将沉淀颗粒用40ml Et2O洗涤两次并随后风干。
1.f产物的纯化
将粗肽溶解于H2O/AcOH(40∶4)(40ml)中并在装填有7μC-18硅石的25mm×250mm柱上，通过半制备型HPLC纯化两次。在40℃温度下，将该柱以10ml/分钟用相对于0.1％TFA/H2O的40-62％的CH3CN梯度洗脱47分钟。收集合有肽的级分，用3体积的H2O稀释并将其低压冻干。获得的终产物通过HPLC表征。
本发明的其它化合物包括：
Figure A20068000537601411
实施例58
N-ε26，3-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酰基[Aib8，22，35]GLP-1(7-37)酰胺
Figure A20068000537601421
Dde-Lys(Fmoc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pmc)-Aib-Arg(Pmc)-Gly-Rink酰胺树脂用制造商提供的FastMocUV方案，根据Fmoc策略在Applied Biosystems 433A肽合成仪上以0.25mmol规模制备，所述的FastMoc UV方案采用在NMP中HBTU介导的偶联，并UV监控Fmoc保护基团的去保护。末端Fmoc基团通过用DMF中2％DBU处理(3×3分钟)除去，并在赖氨酸侧链上酰化，首先用Fmoc-AEEAc-OH，并在Fmoc去保护后用3-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酸。随后用NMP中10％的肼除去末端Dde基团。然后使用制造商提供的FastMoc UV方案，将肽的N端用Boc-His(Boc)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Aib-Gln(Trt)-Ala-Ala-序列延长，所述的FastMoc UV方案采用NMP中HBTU介导的偶联，并UV监控Fmoc保护基团的去保护。用TFA中5％的三异丙基硅烷和5％的水将肽从树脂上裂解。滤出树脂，并用TFA洗涤。将合并的滤液减少至最小体积，并且通过加入冷的乙醚使肽沉淀，并通过离心分离。将沉淀物用冷的乙醚洗涤三次。
通过RP18-HPLC纯化粗肽。将柱用相对于0.1％TFA/H2O的36-60％CH3CN梯度以10ml/分钟洗脱。收集合有肽的级分，用H2O稀释并低压冻干。LC-MS(电喷射)：(m/3)+1＝1409.8；(m/4)+1＝1057.0；(m/5)+1＝846.2；Rt＝3.28分钟。HPLC(方法A)：Rt＝29.08分钟。
实施例59
N-α7-甲酰基，N-ε26，3-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酰基[Arg34]GLP-1-(7-37)-OH
Figure A20068000537601431
将N-ε26，3-[2-(1，3-双[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]丙-2-基氧基)乙酰氨基]丙酰基[Arg34]GLP-1-(7-37)-OH(实施例55)溶解于水(20ml)中并用三乙胺调节pH为9。制备乙酸酐和蚁酸的1∶1混合物，并加入5ul该溶液(3当量)，同时通过加入三乙胺保持pH为9。将反应混合物搅拌1小时，然后另外加入5ul乙酸酐和蚁酸的1∶1混合物。将最后一步重复一次，然后将混合物在室温下搅拌3小时。随后将产物如实施例58中描述的进行纯化，产生9mg标题物质。LC-MS(电喷射)：(m/3)+1＝1370.7；(m/4)+1＝1028.7；Rt＝3.25分钟。HPLC(方法A)：Rt＝37.75分钟。
用于测量肺生物利用度的方法。
本方案描述了用于开发用于肺部递送气溶胶的麻醉大鼠模型的方法和材料。气溶胶通过使用喷雾器导管产生，其具有非常确定的小滴/粒度(平均质量空气动力学直径，MMAD)。喷雾器导管是一种挤出的多腔导管，其提供细颗粒、无折流的、气溶胶。它包括在一个液体腔周围的多个(通常为4-6个)气体腔。每个腔延长了导管长度，其逐渐变细为细小(～0.5mm直径)的喷嘴，喷嘴在远端具有微小的孔。在远端处气体和液体之间的紧密接触产生无折流的精细气溶胶。喷雾器导管被引导通过气管内导管并位于主支气管支的正上方。气溶胶以由控制元件管理的脉冲沉积。
装置
用于肺部递送的装置从Trudell Medical International(London.Ontario，加拿大)获得。
喷雾器导管
由厂商提供许多不同结构和长度的喷雾器导管(Aeroprobe)。这些不同的设计将会适合多种不同的流体和流速，以及提供可以低到5μm MMAD(平均质量空气动力学直径)的气溶胶粒度。在本发明试验中，使用具有下列尺寸的导管：外腔气体流量为1.4L/分钟，内腔流体流量为0.7ml/分钟，以及MMAD为约7-8μm(PN 104504-050)，长度为50cm(1)。
控制元件
LABNeb导管控制系统(CCS)。将Aeroprobe导管与根据(2)的控制系统连接。
将压强为100psi的空气用作载气并且通常最大流体压强为98psi。将100μl注射器用作储液器。LABNeb CCS使用80毫秒(msec)的脉冲时间和20毫秒的气体延迟。因此，每个脉冲递送2.3ml空气和0.93μl试验溶液。
动物
重为250和350g的Sprague Dawley 大鼠。将动物在能自由接触食物(Altromine 1324)和饮水的标准化条件下圈养。在试验当天，使用其进食状态下的动物。
用于麻醉的溶液
将Hypnorm(芬太尼0.2mg/ml、fluansol 10mg/ml)用无菌水1+1稀释。将Dormicum(咪达唑仑5mg/ml)用无菌水1+1稀释。将这两种溶液1+1混合。
手术操作和气管内施用
通过皮下注射制备好的Hyponorm/Dormicum溶液0.25ml/100gBW，诱导麻醉。将气管内导管(PE 240，Becton Dickinson)插入并引导至两根主支气管支上方约cm的位置。通过用塑料屏蔽物包裹大鼠使任何热量丧失最小化。
在施用试验溶液至肺内之前，确保注射器和导管系统无气泡。在气管内施用试验溶液之前，将其喷射进管形瓶中以随后检验通过导管施用的物质的量。然后，引导导管通过气管内导管，让1-2mm导管管尖在气管内导管的管末端外并让试验溶液气溶胶化进入麻醉大鼠的肺中。
在i.v.或s.c.施用后GLP-1衍生物的延长
用下面描述的方法，通过在sc施用给健康的猪后，监控其在血浆中的浓度测定许多本发明GLP-1衍生物的延长。为了比较，也跟踪在sc施用后血浆中GLP-1(7-37)的浓度。其它本发明GLP-1衍生物的延长可以用相同的方法测定。
迷你猪中GLP-1类似物的药物动力学检测
将试验物质溶解于适合于皮下或静脉内施用的载体中。调节浓度使给药体积为约1ml。
该研究在购自Ellegaard Gttingen Minipigs ApS的12只雄性Gttingen迷你猪上进行。在动物进入研究前，允许约10天的适应环境期。在适应环境期的开始，迷你猪约5个月龄并且在8-10kg重量范围内。
该研究在合适的动物房中进行，室温设置为21-23℃以及相对湿度为≥50％。动物房照明以提供12小时光照和12小时黑暗的循环。光照从06.00至18.00点。
将动物在用稻草作为草垫的围栏中圈养，每个围栏中共有6只动物。
在研究期间动物自由接触家养质量的饮用水，但是从给药前那一天约4pm直到给药后约12小时禁食。
将动物在到来时和给药的天称重。
动物接受单次静脉内或皮下注射。皮下注射在颈部右侧，大约离耳朵5-7cm和离颈中部7-9cm处给予。注射用具有塞子的注射针进行，使得能引入0.5cm的针头。
将每种试验物质给予三只动物。每只动物接受2nmol/kg体重的剂量。
每周给药六只动物而剩下的六只动物不给药。
从每只动物获得完全血浆浓度-时间曲线。根据下面的时间表收集血样：
静脉内施用后：
给药前(O)、注射后0.17(10分钟)、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96和120小时。
皮下施用后：
给药前(O)、注射后0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96和120小时。
在每次取样时间，从每只动物抽取2ml血液。血样从颈静脉抽取。
将血样收集进试管中，试管含有用于稳定的缓冲液以便防止GLP-1类似物的酶促降解。
将血浆立即转移至Micronic管中。大约200μl血浆转移至每个Micronic管中。将血浆在-20℃下存储直到被测定。使用免疫测定法测定血浆样品的GLP-1类似物的含量。
通过非房室药物动力学分析来分析血浆浓度-时间曲线。计算每一时刻的下列药物动力学参数：AUC、AUC/剂量、AUC％外推、Cmax、tmax、λz、t、CL、CL/f、Vz、Vz/f和MRT。
在Danish Landrace猪中测试选择的本发明化合物。
GLP-1类似物在猪中的药物动力学测试
将猪(50％Duroc，25％Yorkshire，25％Danish Landrace，大约40kg)从试验开始时禁食。以50μM等渗溶液(5mM磷酸盐，pH 7.4，0.02％Tween-20(Merck)，45mg/ml甘露醇(无热原，Novo Nordisk))将每千克体重0.5nmol试验化合物施用给每只猪。从颈静脉中的导管抽取血样。将5ml血样注入含有175μl下列溶液的冷的玻璃杯中：0.18M EDTA、15000KIE/ml抑酶肽(Novo Nordisk)和0.30mM缬氨酸-吡咯烷(Pyrrolidide)(Novo Nordisk)，pH 7.4。在30分钟内，将样品在5-6000＊g下离心10分钟。保持温度在4℃。将上清液移液到不同的玻璃杯中并在-20℃下保持直到使用。
肽的血浆浓度使用不同的单-或多克隆抗体以夹层ELISA或通过RIA测定。抗体的选择取决于GLP-1衍生物。根据选择的特定GLP-1衍生物，达到血浆峰值浓度的时间在宽的范围内变化。
用于在96孔微量滴定板中夹层ELISA的一般测定方案
包被缓冲液(PBS)：磷酸盐缓冲盐水，pH7.2
洗涤缓冲液(PBS-洗涤)：磷酸盐缓冲盐水，0.05％v/v吐温20，pH 7.2
检测缓冲液(BSA-缓冲液)：磷酸盐缓冲盐水，10g/l牛血清白蛋白(Fluka 05477)，0.05％v/v吐温20，pH7.2
链霉抗生物素-缓冲液：磷酸盐缓冲盐水，0.5M NaCl，0.05％v/v吐温20，pH7.2
标准品：血浆基质中的单独化合物
A-TNP：无义(Nonsens)抗体
AMDEX：链霉抗生物素(Streptavin)-辣根过氧化物酶(Amersham RPN4401V)
TMB-底物：3，3’，5，5’四甲基联苯胺(＜0.02％)，过氧化氢测定法如下实施(容量/孔)：
1.)用100μl捕获抗体(PBS缓冲液中5μg/ml)包被
→孵育o/n，4℃
→5×PBS-洗涤→用最后的洗涤封闭至少30分钟
→然后倒空平板
2.)20μl样品+100μl生物素化的检测抗体(具有10μg/ml A-TNP的BSA缓冲液中1μg/ml)
→在室温下于振荡器上孵育2小时→5×PBS-洗涤，然后倒空平板
3.)100μl AMDEX，以1∶8000于链霉抗生物素缓冲液中
→在室温下振荡器上孵育45-60分钟
→5×PBS-洗涤，然后倒空平板
4.)100μl TMB-底物
→在室温下振荡器上孵育X分钟
→用100μl 4M H3PO4终止反应
读取在450nm处的吸光度，用620nm处的吸光度作为参照
从标准曲线计算出样品中的浓度。
用于RIA的一般测定方案
DB-缓冲液：80mM磷酸盐缓冲液、0.1％人血清白蛋白、10mMEDTA，0.6mM硫柳汞，pH7.5
FAM-缓冲液：40mM磷酸盐缓冲液、0.1％人血清白蛋白，0.6mM硫柳汞，pH7.5
活性炭：40mM磷酸盐缓冲液、0.6mM硫柳汞、16.7％牛血浆，15g/l活性炭，pH7.5(在4℃下于使用前混合该悬浮液最少1小时)
标准品：血浆基质中的单独化合物
测定法如下在minisorp管(12×75mm(容量/管))中实施：
  Db缓冲液   样品   抗体   FAM-缓冲液   示踪剂   活性炭   H2O
  第一天
  总量   100μL
  NSB   330μL   100μL
  样品   300μL   30μL   100μL   100μL
  混合，在4℃下孵育o/n第2天
  总量   1.5mL
  NSB   1.5mL
  样品   1.5mL
混合-在4℃下孵育30分钟-在3000rpm下离心30分钟-转移上清液至新的试管后，立即用塞子密封并在γ计数器上计数1分钟。
从各自的标准曲线计算出样品中的浓度。
GLP-1放射受体测定法(RRA)：
该方法是使用LEADseeker成像粒子的放射-配体结合测定法。该测定法由以下组成：含有GLP-1受体的膜片段、未标记的GLP-1类似物、用125I标记的人GLP-1和用麦胚凝集素(WGA)包被的PS LEADseeker粒子。冷的和经125I标记的GLP-1将会竞争结合至受体。当加入LEADseeker粒子时，它们将会通过WGA-残基与膜片段上的糖残基结合。125I-分子和LEADseeker粒子之间的接近引起粒子的光发射。LEADseeker将会使发射的光成像并将其可逆地与样品中存在的GLP-1类似物的量相互关联。
试剂&材料：
动物血浆的预处理：将动物血浆在56℃下加热处理4小时并在10.000rpm下离心10分钟。之后，加入Val-Pyr(10μM)和抑酶肽(aprotenin)(500KIE/mL)并在＜-18℃下保存直到使用。
GLP-1类似物校准品：将GLP-1类似物掺入热处理的血浆中以产生约1μM至1pM范围的稀释种类(lines)。
GLP-1 RRA测定缓冲液：25mM Na-HEPES(pH＝7.5)、2.5mMCaCl2、1mM MgCl2、50mM NaCl、0.1％卵清蛋白、0.003％吐温20、0.005％杆菌肽、0.05％NaN3。
GLP-1受体悬浮液：从表达人胰腺GLP-1受体的幼仓鼠肾(BHK)细胞纯化GLP-1受体膜片段。在＜-80℃下保存直到使用。
WGA-偶联的聚苯乙烯LEADseeker成像珠(RPNQ0260，Amersham)：将珠用GLP-1RRA检测缓冲液重构为13.3mg/mL的浓度。随后加入GLP-1受体膜悬浮液并且将其在使用前翻转地(endover end)冷(2-8℃)孵育至少1小时。
[125I]-GLP-1(7-36)酰胺(Novo Nordisk A/S)。在＜-18℃下保存直到使用。
99.9％vol的乙醇(De Dansk Spritfabrikker A/S)：在＜-18℃下保存直到使用。
MultiScreenSolvinert 0.45μm疏水性PTFE板(MSRPN0450.Millipore Corp.)
聚丙烯板(目录号650201，Greiner Bio-One)
白色聚苯乙烯384-孔平板(目录号781075，Greiner Bio-One)
仪器：
水平式平板混合器
具有标准吊桶式微量滴定板转头部件的离心机
UltraVap-Drydown样品浓缩仪(Porvair)
LEADseekerTM多模式成像系统(Amersham)
测定方法：
样品制备：
将MultiScreenSolvinert滤器板安装于化学相当的接收器板(即，聚丙烯板)上用来收集滤液。
将150μL冰冷的99.9％乙醇加入MultiScreenSolvinert滤器板的空孔中，之后加入50μL校准品或血浆样品。将保存盖置于滤板上。
在18-22℃下于水平式平板混合器上孵育15分钟。
将具有盖子的组装的滤器和接收器板置入标准吊桶式微量滴定板转头部件中。随后在1500rpm下将滤液收集于接收器板的空孔中2分钟。
用UltraVap在热的(40℃)N2下干燥滤液持续15分钟。通过加入100μL GLP-1RRA测定缓冲液至每孔中，重构所述干的材料。在水平式混合器中孵育5分钟。
GLP-1放射受体测定法：
使用下面的吸移方案和白色聚苯乙烯384-孔平板：
·35μL GLP-1RRA测定缓冲液
·5μL重构的滤液。
·10μL[125I]-GLP-1(7-36)酰胺。在使用前将储液在GLP-1RRA测定缓冲液中稀释至20.000cpm/孔。
·预包被至WGA-聚苯乙烯LEADseeker成像珠(0.2mg/孔)上的15μL GLP-1受体膜片段(≈0.5μg/孔)。
密封所述板并在18-22℃下孵育过夜。
每个孔的光发射用LEADseekerTM多模式成像系统检测，持续10分钟。
在表达克隆的人GLP-1受体的细胞系中cAMP形成的刺激。
将来自表达人GLP-1受体的稳定转染的细胞系BHK467-12A(tk-ts13)的纯化质膜用GLP-1和肽类似物刺激，并采用购自PerkinElmer Life Sciences的AlphaScreenTM cAMP测定试剂盒测量cAMP产生的效力。
稳定转染的细胞系已经在NN制备并选择高表达的克隆用于筛选。细胞在5％CO2下在DMEM、5％FCS、1％Pen/Strep和0.5mg/ml G418中生长。
将大约80％汇合的细胞用PBS洗涤2次并且用Versene收获，在1000rpm下离心5分钟并除去上清液。另外的步骤都在冰上进行。将细胞沉淀颗粒在10ml缓冲液1(20mM Na-HEPES、10mM EDTA，pH＝7.4)中用Ultrathurax均化20-30秒钟，在20.000rpm下离心15分钟并将沉淀颗粒再悬浮于10ml缓冲液2(20mM Na-HEPES、0.1mM EDTA，pH＝7.4)中。将悬浮液均化20-30秒钟并在20.000rpm下离心15分钟。将在缓冲液2中悬浮、均化和离心重复一次，并将膜再悬浮于缓冲液2中并准备用于进一步分析或在-80℃存储。功能受体测定法用AlphaScreen Technology通过测量肽诱导的cAMP产生来完成。AlphaScreen Technology的基本原理是内源性cAMP和外来加入的生物素-cAMP之间的竞争。cAMP的捕获通过使用与接受体珠缀合的特异性抗体来实现。计数形成的cAMP并在AlphaFusionMicroplate分析仪上测量。用Graph-Pad Prisme软件计算EC50值。

Claims (33)

1.一种缀合物，它含有共价连接至促胰岛素剂的结构完全确定的支化聚合物。
2.根据权利要求1的缀合物，它由如下通式I表示
ITA-L4-(L3)m-Y1(Y2(Y3(Y4(Y5(Y6)r)q)p)s)n    (I)
其中，ITA表示促胰岛素剂，从该促胰岛素剂中一个氢被从该促胰岛素剂中存在的α-氨基上除去，或从该促胰岛素剂中任意位置的赖氨酸上存在的ε氨基上除去，
对于第一代二叉化合物，
Y1是Yb；Y2是Z；r、q、p和s都是0；并且n是2；
对于第二代二叉化合物，
Y1和Y2是Yb；Y3是Z；r、q和p都是0；s是4；并且n是2；
对于第三代二叉化合物，
Y1、Y2和Y3都是Yb；Y4是Z；r和q是0；p是8；s是4；并且n是2；
对于第四代二叉化合物，
Y1、Y2、Y3和Y4都是Yb；Y5是Z；r是0；q是16；p是8；s是4；并且n是2；
并且对于第五代二叉化合物，
Y1、Y2、Y3、Y4和Y5都是Yb；Y6是Z；r是32；q是16；p是8；s是4；并且n是2；
其中
Figure A2006800053760002C1
对于第一代三叉化合物，
Y1是Yt；Y2是Z；r、q、p和s都是0；并且n是3；
对于第二代三叉化合物，
Y1和Y2是Yt；Y3是Z；r、q和p都是0；s是9；并且n是3；
对于第三代三叉化合物，
Y1、Y2和Y3都是Yt；Y4是Z；r和q是0；p是27；s是9；并且n是3；
并且对于第四代三叉化合物，
Y1、Y2、Y3和Y4都是Yt；Y5是Z；r是0；q是81；p是27；s是9；并且n是3；
其中
Figure A2006800053760003C1
其中A是-CO-、-C(O)O-、-P(＝O)(OR)-或-P(＝S)(OR)-，其中R是氢、烷基或任选取代的芳基；
并且B是-NH-或-O-；
条件为，当B是-NH-时，则A是-CO-或-C(O)O-，以及当B是-O-时，则A是-P(＝O)(OR)-或-P(＝S)(OR)-；
并且其中一个单体层(代)(例如Y1、Y2和Y3)的基团B连接至其中Y具有后面下标数字(例如分别为Y2；Y3和Y4)的邻近的、后一层的基团A，或者连接至Z；
X3是氮原子、烷三基、芳烃三基、烷三氧基、式-CO-N＜的氨基羰基部分、式-CH2CO-N＜的乙酰氨基部分或下式的部分：
-CO-NH-Q-NH-CO-
       |
其中Q是烷三基；
X4是烷四基或芳烃四基；
L1是价键、氧、亚烷基、亚烷基氧烷基、聚烷氧二基、(聚烷氧基)烷基羰基、氧烷基或(聚烷氧基)烷基；
L2是价键、氧、亚烷基、亚烷基氧烷基、聚烷氧二基、(聚烷氧基)烷基羰基、氧烷基或(聚烷氧基)；
L3表示价键、亚烷基、氧、聚烷氧二基、氧烷基、烷基氨基、羰基烷基氨基、烷基氨基羰基烷基氨基、羰基烷基羰基氨基(聚烷氧基)烷基氨基、羰基烷氧烷基羰基氨基(聚烷氧基)烷基氨基、烷基羰基氨基(聚烷氧基)烷基氨基、羰基(聚烷氧基)烷基氨基或羰基烷氧烷基氨基；
m是0、1、2、或3；
L4选自价键和式-CO-L5-CH＝N-O-的部分，其中L5是价键、亚烷基或亚芳基，
Z是氢、烷基、烷氧基、羟烷基、聚烷氧基、氧烷基、酰基、聚烷氧烷基或聚烷氧烷基羰基。
3.根据权利要求2的缀合物，其中Y1是Yb(即二叉化合物)。
4.根据权利要求2或3的缀合物，其中X3是下列6个式之一的有分支的三价有机基团：
Figure A2006800053760004C1
5.根据权利要求2-4的缀合物，其中Y1是Yt(即三叉化合物)。
6.根据权利要求2-5任一项的缀合物，其中X4是苯-1，3，4，5-四基。
7.根据权利要求2-6任一项的缀合物，其中L1是价键、氧(-O-)、氧甲基(-OCH2-)或通式-CH2(OCH2CH2)n”-OCH2C(O)-的部分，其中n”是0至10的整数。
8.根据权利要求2-7任一项的缀合物，其中L2是式(-CH2CH2O-)2的部分，也具有式：
Figure A2006800053760005C1
-CH2CH2OCH2CH2O-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2-、-CH2CH2OCH2CH2-或-CH2CH2-。
9.根据权利要求2-8任一项的缀合物，其中L3是价键或二价连接体基团，例如通过下列六个式所说明的那些基团：
Figure A2006800053760005C2
其中所述二价基团的每一端可以连接至ITA基团。
10.根据权利要求2-9任一项的缀合物，其中L4和邻接的L3是二价连接体基团，例如通过下面8个式所说明的那些基团：
Figure A2006800053760005C3
其中所述的二价基团的每一端可以连接至ITA基团。
11.根据权利要求2-10任一项的缀合物，其中L4是两种同分异构(顺式和反式)形式中的氧基亚氨基烷基羰基部分，两种同分异构(顺式和反式)形式中的氧基亚氨基烷基芳基羰基部分，或者价键。
12.根据权利要求2-11任一项的缀合物，其中Z是可以与末端氨基或羟基反应的加帽剂，优选具有下列三个式之一的基团：
Figure A2006800053760006C1
其中Me是甲基。
13.根据权利要求2-12任一项的缀合物，其中A是如下三个部分之一：-CO-、-P(O)O-和-P(S)O-。
14.根据权利要求2-13任一项的缀合物，其中B是氧或-NH-部分。
15.根据上述权利要求任一项的缀合物，其中所述的促胰岛素剂是GLP-1肽或毒蜥外泌肽-4肽。
16.根据上述权利要求任一项的缀合物，其中所述的促胰岛素剂(ITA)是DPPIV保护的肽。
17.根据上述权利要求任一项的缀合物，其中所述的促胰岛素剂(ITA)具有小于1nM的EC50，该EC50是通过本申请中公开的功能受体测定法测定的。
18.根据上述权利要求任一项的缀合物，其中所述的促胰岛素剂(ITA)具有小于300pM，小于200pM或小于100pM的EC50，该EC50是通过本申请中公开的功能受体测定法测定的。
19.根据上述权利要求任意一项的缀合物，其中所述的促胰岛素剂(ITA)选自含有式(II)氨基酸序列的肽：
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46
式(II)(SEQ ID No：3)
其中Xaa7是L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa8是Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸或(1-氨基环辛基)羧酸；
Xaa16是Val或Leu；
Xaa18是Ser、Lys或Arg；
Xaa19是Tyr或Gln；
Xaa20是Leu或Met；
Xaa22是Gly、Glu或Aib；
Xaa23是Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa25是Ala或Val；
Xaa26是Lys、Glu或Arg；
Xaa27是Glu或Leu；
Xaa30是Ala、Glu或Arg；
Xaa33是Val或Lys；
Xaa34是Lys、Glu、Asn或Arg；
Xaa35是Gly或Aib；
Xaa36是Arg、Gly或Lys；
Xaa37是Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺或不存在；
Xaa38是Lys、Ser、酰胺或不存在；
Xaa39是Ser、Lys、酰胺或不存在；
Xaa40是Gly、酰胺或不存在；
Xaa41是Ala、酰胺或不存在；
Xaa42是Pro、酰胺或不存在；
Xaa43是Pro、酰胺或不存在；
Xaa44是Pro、酰胺或不存在；
Xaa45是Ser、酰胺或不存在；
Xaa46是酰胺或不存在；
条件是如果Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45或Xaa46不存在，则下游的每个氨基酸残基也不存在。
20.根据权利要求19的缀合物，其中所述的促胰岛素剂(ITA)是包含式(III)氨基酸序列的肽：
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38
式(III)(SEQ ID No：4)
其中Xaa7是L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa8是Ala、D-Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸或(1-氨基环辛基)羧酸；
Xaa18是Ser、Lys或Arg；
Xaa22是Gly、Glu或Aib；
Xaa23是Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa26是Lys、Glu或Arg；
Xaa30是Ala、Glu或Arg；
Xaa34是Lys、Glu或Arg；
Xaa35是Gly或Aib；
Xaa36是Arg或Lys；
Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys；
Xaa38是Lys、酰胺或不存在。
21.根据上一权利要求任意一项的缀合物，其中所述的促胰岛素剂(ITA)选自GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-36)-酰胺、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)、GLP-1(7-41)或其类似物。
22.根据上述权利要求任意一项的缀合物，其中所述的促胰岛素剂(ITA)与GLP-1(7-37)(SEQ ID No.1)比较，包含不多于15个经交换、添加或缺失的氨基酸残基，或者与GLP-1(7-37)(SEQ ID No.1)比较，包含不多于10个经交换、添加或缺失的氨基酸残基。
23.根据上一权利要求的缀合物，其中所述的促胰岛素剂(ITA)与GLP-1(7-37)(SEQ ID No.1)比较，包含不多于6个经交换、添加或缺失的氨基酸残基。
24.根据上述权利要求任意一项的缀合物，其中所述的促胰岛素剂(ITA)包含不多于4个不被遗传密码编码的氨基酸残基。
25.根据上述权利要求任意一项的缀合物，其中所述的促胰岛素剂(ITA)包含Aib残基作为N-端的第二个氨基酸残基。
26.根据上述权利要求任意一项的缀合物，其中所述的促胰岛素剂(ITA)的N-端氨基酸残基(式II和III的位置7)选自D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸。
27.根据上述权利要求任意一项的缀合物，其中所述的促胰岛素剂(ITA)选自[Arg34]GLP-1(7-37)、[Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Lys36Arg26，34] GLP-1(7-36)、[Aib8，22，35]GLP-1(7-37)、[Aib8，35] GLP-1(7-37)、[Aib8，22]GLP-1(7-37)、[Aib8，22，35 Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22 Arg26，34] GLP-1(7-3 7)Lys、[Aib8，22，35Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35 Arg26，34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35 Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Arg26]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35 Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Arg34]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，35Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22Ala37]GLP-1(7-37)Lys、[Aib8，22，35 Lys37]GLP-1(7-37)、[Aib8，35Lys37]GLP-1(7-37)、[Aib8，22Lys37]GLP-1(7-37)或其在C-端被酰胺化的衍生物、毒蜥外泌肽-4(1-39)、ZP-10，即[Ser38Lys39]毒蜥外泌肽-4(1-39)LysLysLysLysLys-酰胺(SEQ ID No.5)。
28.根据上述权利要求任意一项的缀合物，其中所述的促胰岛素剂(ITA)通过羧基、氨基、酮基、羟基、巯基或酰肼基团连接至根据上述权利要求任意一项的支化聚合物。
29.根据上述权利要求任一项的缀合物，其中所述的化合物具有小于1000pM、小于500pM、小于300pM、小于200pM、小于100pM、小于50pM或小于10pM的EC50，该EC50是通过本申请中公开的功能受体测定法测定的。
30.一种药物组合物，它包含根据上述权利要求任意一项的化合物和药学上可接受的赋形剂。
31.根据权利要求1-29任意一项的化合物在制备药物中的用途，所述的药物用于治疗或预防高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、1型糖尿病、肥胖症、高血压、X综合征、血脂障碍、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡。
32.根据权利要求31的化合物在制备用于延缓或预防2型糖尿病中疾病发展的药物中的用途。
33.一种通过施用有效量的根据权利要求1-29任一项的化合物来治疗或预防高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、1型糖尿病、肥胖症、高血压、X综合征、血脂障碍、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中风、炎性肠综合征、消化不良和胃溃疡的方法。
CNA2006800053765A 2005-02-16 2006-02-16 缀合有结构完全确定的支化聚合物的促胰岛素剂的衍生物 Pending CN101123992A (zh)

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