CN108299551A - 血清淀粉样蛋白a1突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

血清淀粉样蛋白a1突变体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血清淀粉样蛋白A1突变体，该突变体具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，或者该突变体具有将SEQ ID No:1所示的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加后仍具有血清淀粉样蛋白A1的活性不变的氨基酸序列，或者在SEQ ID NO:1的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列的蛋白质；其中所述突变体SEQ ID No:1的氨基酸序列相对于原始血清淀粉样蛋白A1的第111位天冬酰胺为缺失。通过定点突变，对SAA1的氨基酸序列第117位天冬酰胺进行了敲除设计，构建了一种SAA1突变体，在保留原有抗原活性的同时大大提高了SAA1的稳定性，为SAA1作为免疫原或者标准品在免疫学测定中奠定基础。

Description

血清淀粉样蛋白A1突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种血清淀粉样蛋白A1突变体及其制备方法和应用。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(Serum Amyloid A,SAA)是机体受到感染和损伤时分泌的一种主要的急性期蛋白，是组织淀粉样蛋白A的前体物质。SAA是一类多基因编码的多形态蛋白的总称，代表一个相对分子质量为12000的家族，由相关但各具独立基因的蛋白(SAA1-SAA4)组成。其中，人血清淀粉样蛋白A1(hSAA1)主要由肝细胞合成，人SAA2与人SAA1有7个氨基酸的差别，它们均为急性期蛋白，在炎症反应中作用相近。
与SAA1类似，C-反应蛋白(CRP)的浓度也是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标，细菌感染时二者浓度升高相平行，病毒感染时，SAA1浓度上升，而CRP的血清浓度几乎不升高或者升高不明显。在感染性疾病中，SAA1的绝对上升要高于CRP，因此SAA1测定，尤其对微小急性相反应可提供更好的鉴别。在临床上对SAA1在病人血清中含量的检测具有辅助诊断价值。
作为感染性疾病的初筛，SAA1检测已经在很多医院开展，市场上已经出现不同方法的检测试剂盒，采用的方法为双抗体夹心法测定SAA1浓度。上述方法中必须以SAA1抗原制备梯度浓度的标准品推算样本中SAA1浓度和SAA1作为免疫原制备抗SAA1抗体。而目前市面所售SAA1蛋白常规条件下存在不稳定、易降解等问题，极大地影响检测结果的稳定性，因此，获得一种高稳定的SAA1具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种SAA1突变体，所述SAA1突变体通过对原始SAA1基因进行定点突变获得，与已报道的SAA1蛋白存在一个碱基位点的不同，从而导致该SAA1突变体在保持原有抗原活性的同时，增强了稳定性，从而解决了现有SAA1不稳定易降解的缺陷。
本发明提供了一种血清淀粉样蛋白A1突变体，该突变体具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，或者该突变体具有将SEQ ID No:1所示的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加后仍具有血清淀粉样蛋白A1的活性不变的氨基酸序列，或者在SEQ ID NO:1的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列的蛋白质；其中所述突变体SEQ ID No:1的氨基酸序列相对于原始血清淀粉样蛋白A1的第117位天冬酰胺为缺失。
优选地，该突变体具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种编码血清淀粉样蛋白A1突变体的基因，所述基因具有SEQ IDNo:2所示的核苷酸序列，或者所述基因具有编码SEQ ID No:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
优选地，该基因具有SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体含有所述的基因。
本发明还提供了一种重组菌株，所述重组菌株上述的重组载体。
本发明还提供了一种血清淀粉样蛋白A1突变体的制备方法，包括以下步骤：
a.血清淀粉样蛋白A1突变体的氨基酸序列的设计：将NCBI网站公布的人类血清淀粉样蛋白A1的SEQ ID No:3所示的氨基酸序列的第111位天冬酰胺突变为缺失得到SEQ IDNo:1所示的氨基酸序列；
b.血清淀粉样蛋白A1突变体基因的优化和获得：采用大肠杆菌优势密码子对NCBI网站公布的人类血清淀粉样蛋白A1的核苷酸序列进行人工优化，得到SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，通过退火延伸PCR技术，获得由大肠杆菌优势密码子组成的血清淀粉样蛋白A1突变体的基因；
c.血清淀粉样蛋白A1突变体表达载体的构建：将步骤(b)中获得的血清淀粉样蛋白A1突变体基因序列用NheI和XhoI进行双酶切，与同样经过NheI和XhoI双酶切的pET-30a(+)载体进行连接，得到表达载体；
d.血清淀粉样蛋白A1突变体的表达纯化：将步骤(c)中获得表达载体转化大肠杆菌BL-21感受态细胞，得到SAA1突变体表达菌株，进行培养、诱导表达以及纯化，最终获得所述血清淀粉样蛋白A1突变体。
本发明还提供了由上述方法制备的血清淀粉样蛋白A1突变体。
本发明还提供了上述血清淀粉样蛋白A1突变体在检测感染性疾病的早期炎症中的应用。
本发明的优点和有益效果：通过定点突变，对SAA1氨基酸序列第111位天冬酰胺进行了敲除设计，构建了一种SAA1突变体，在保留原有抗原活性的同时大大提高了SAA1的稳定性，为SAA1作为免疫原或者标准品在免疫学测定中奠定基础。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1 SAA1突变体氨基酸序列的设计
根据NCBI网站公布的人类血清淀粉样蛋白A1氨基酸序列，如SEQ ID No:3所示，将该SAA1氨基酸序列的第111位天冬酰胺突变为缺失，在保留天然SAA1抗原性的前提下，获得的SAA1突变体的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
实施例2 SAA1突变体基因序列的优化和获得
采用大肠杆菌优势密码子和密码子的简并性对SAA1突变体的核苷酸序列进行人工优化，最终得到SEQ ID No:2所示核苷酸序列，通过退火延伸PCR技术，获得由大肠杆菌优势密码子组成的SAA1突变体的基因，具体操作步骤可以参考CN201510085322.5。
实施例3 SAA1突变体表达载体的构建
将实施例2中获得到SAA1突变体的基因序列用NheI和XhoI进行双酶切后替换原核表达载体pET-30a(+)(根据Merck Millipore公司，目录号是69909)的Xho I/Nhe I之间的片段，得到pET-30a(+)-SAA1(突变型)。
对重组质粒pET-30a(+)-SAA1(突变型)、pET-30a(+)和SAA1突变体基因分别进行XhoI和Nhe I双酶切鉴定，结果如图1所示，其中M：DL5000Marker；1:pET-30a(+)-SAA1(突变型)重组质粒双酶切；2：pET-30a(+)质粒双酶切；3：SAA1突变体基因双酶切。由图1可以看出，pET-30a(+)-SAA1(突变型)重组质粒经Xho I和Nhe I双酶切后，电泳均可见到两条与预期分子量大小一致条带，与pET-30a(+)和SAA1突变体的基因的大小相符。
实施例4 SAA1突变体的表达菌株的构建
(1)-80℃低温冰箱中取出一支大肠杆菌感受态细胞BL-21(100μL/支)，迅速冰浴化开；
(2)取1μL上述重组载体pET-30a(+)-SAA1(突变型)加入100μL感受态细胞内，轻轻混匀，冰浴30分钟；
(3)于42℃下热激60秒；
(4)迅速冰浴2分钟；
(5)加入1mL LB培养基(无抗生素)，混匀，37℃水浴下复苏培养1h；
(6)取100μL全部培养物涂布于含卡那霉素的LB平板上，于37℃培养16小时，挑选单菌落，二次划线后于37℃培养16小时，提取单菌落小样摇起来6h左右至对数期，IPTG诱导过夜后SDS-PAGE电泳，选取表达目的蛋白量高的菌种进行测序，测序结果正确，此即为成功转化的宿主细胞，命名为BL21/pET-30a(+)-SAA1(突变型)。
实施例5 SAA1突变体的表达纯化
(1)将所得阳性克隆BL21/pET-30a(+)-SAA1(突变型)接种于含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃，150rpm下培养8～12小时，得到第一菌液；将第一菌液接种于LB培养基中，于37℃，150rpm下培养至OD600达到0.6，得到第二菌液；于第二菌液中添加终浓度为2mmol/L的IPTG，于32℃，150rpm下培养6小时，得到第三菌液；
(2)将所得第三菌液离心洗涤一遍菌体后(洗涤液为25mM PH 8.5Tris-HCl)，对菌体进行超声破碎，然后离心弃沉淀留上清；
(3)将上清进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示，M：Marker；1:pET-30a(+)-SAA1(突变型)上清，可以看出BL21/pET-30a(+)-SAA1(突变型)上清中含有约23KD的目标蛋白。
(4)用博格隆10mL Ni柱对所得上清液进行纯化，平衡液为25mM PH 8.5Tris-HCl,分别收集穿过峰，30mM咪唑洗脱液(配方25mM PH 8.5Tris-HCl+30mM咪唑)洗脱峰，60mM咪唑洗脱液洗脱峰，120mM咪唑洗脱液洗脱峰，240mM咪唑洗脱液洗脱峰，300mM咪唑洗脱液洗脱峰。300mM咪唑洗脱峰含有目的蛋白，25mM PH 8.5Tris-HCl透析后分装保存(收集原则为紫外检测仪数值上升开始收集，数值出现下降趋势停止收集)。
(5)取20μL 300mM咪唑洗脱峰液体进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图3所示，M：Marker；1:pET-30a(+)-SAA1(变型)，从图3可知蛋白分子量大小与理论大小一致。
实施例6 SAA1突变体抗原性测定
采用ELISA双抗体夹心法检测SAA1突变体和对照SAA1的抗原性，将两者分别作为样本进行检测。将本申请所述的SAA1突变体和对照SAA1分别与SAA1单克隆抗体以及HRP标记的SAA1单克隆抗体进行孵育，形成抗原抗体夹心复合物，再添加AB液进行显色孵育，最后添加终止液，450nm波长下读数，结果如表1所示：
表1 SAA1突变体和对照SAA1抗原性检测
从ELISA结果可以看出，SAA1突变体的抗原性和灵敏度都要比对照SAA1好，而且线性符合率也较好。
实施例7 SAA1突变体稳定性的测定
采用ELISA双抗体夹心法对SAA1突变体和对照SAA1的稳定性进行检测，将两者分别作为样本进行检测。将本发明所述的SAA1突变体和对照SAA1分别与SAA1单克隆抗体以及HRP标记的SAA1单克隆抗体进行孵育，形成抗原抗体夹心复合物，再添加AB液进行显色孵育，最后加终止液后，450nm波长下读数，即为检测结果。为了便于分析，稳定性实验中本申请SAA1突变体和对照SAA1各采用3个浓度梯度进行检测。
表2 SAA1突变体的稳定性
表3对照SAA1稳定性
由表2、3可知：以0d抗原浓度为参照:37℃破坏3d后，SAA1突变体和对照SAA1的稳定率分别为92％左右和88％左右；37℃破坏7d后，两者的稳定率分别为82％左右和68％左右；SAA1突变体的稳定性显著高于对照SAA1。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京市华信行生物科技有限公司
<120> 血清淀粉样蛋白A1突变体及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 129
<212> PRT
<213> 人类(human)
<400> 1
Ala Ser Gly Gly Gly Gly Met Lys Leu Leu Thr Gly Leu Val Phe Cys
1 5 10 15
Ser Leu Val Leu Gly Val Ser Ser Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly
20 25 30
Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp Met Val Arg Ala Tyr Ser Asp Met
35 40 45
Arg Glu Ala Asn Tyr Ile Gly Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly
50 55 60
Asn Tyr Asp Ala Ala Lys Arg Gly Pro Gly Gly Ala Val Ala Ala Glu
65 70 75 80
Val Ile Ser Asn Ala Arg Glu Asn Ile Gln Arg Leu Thr Gly Arg Gly
85 90 95
Ala Glu Asp Ser Leu Ala Asp Gln Ala Ala Asn Lys Val Gly Arg Ser
100 105 110
Gly Arg Asp Pro His Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr Leu
115 120 125
Glu
<210> 2
<211> 390
<212> DNA
<213> 人类(human)
<400> 2
gctagcggtg gtggtggtat gaaactgctg accggtctgg ttttctgctc tctggttctg 60
ggtgtttctt ctcgttcttt cttctctttc ctgggtgaag ctttcgacgg tgctcgtgac 120
atgtggcgtg cttactctga catgcgtgaa gctaactaca tcggttctga caaatacttc 180
cacgctcgtg gtaactacga cgctgctaaa cgtggtccgg gtggtgcttg ggctgctgaa 240
gttatctctg acgctcgtga aaacatccag cgtttcttcg gtcacggtgc tgaagactct 300
ctggctgacc aggctgctaa cgaatggggt cgttctggta aagacccgca cttccgtccg 360
gctggtctgc cggaaaaata ctaactcgag 390
<210> 3
<211> 130
<212> PRT
<213> 人类(human)
<400> 3
Ala Ser Gly Gly Gly Gly Met Lys Leu Leu Thr Gly Leu Val Phe Cys
1 5 10 15
Ser Leu Val Leu Gly Val Ser Ser Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly
20 25 30
Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp Met Val Arg Ala Tyr Ser Asp Met
35 40 45
Arg Glu Ala Asn Tyr Ile Gly Ser Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly
50 55 60
Asn Tyr Asp Ala Ala Lys Arg Gly Pro Gly Gly Ala Val Ala Ala Glu
65 70 75 80
Val Ile Ser Asn Ala Arg Glu Asn Ile Gln Arg Leu Thr Gly Arg Gly
85 90 95
Ala Glu Asp Ser Leu Ala Asp Gln Ala Ala Asn Lys Val Gly Arg Ser
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Asn His Phe Arg Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr
115 120 125
Leu Glu
130

Claims (9)

1.一种血清淀粉样蛋白A1突变体，其特征在于，该突变体具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，或者该突变体具有将SEQ ID No:1所示的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加后仍具有血清淀粉样蛋白A1的活性不变的氨基酸序列，或者在SEQID NO:1的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列的蛋白质；其中所述突变体SEQ ID No:1的氨基酸序列相对于原始血清淀粉样蛋白A1的第117位天冬酰胺为缺失。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。
3.一种编码血清淀粉样蛋白A1突变体的基因，其特征在于，所述基因具有SEQ ID No:2所示的核苷酸序列，或者所述基因具有编码SEQ ID No:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因具有SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有如权利要求3或4所述的基因。
6.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求5所述的重组载体。
7.一种血清淀粉样蛋白A1突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.血清淀粉样蛋白A1突变体的氨基酸序列的设计：将NCBI网站公布的人类血清淀粉样蛋白A1的SEQ ID No:3所示的氨基酸序列的第117位天冬酰胺突变为缺失得到SEQ ID No:1所示的氨基酸序列；
b.血清淀粉样蛋白A1突变体基因的优化和获得：采用大肠杆菌优势密码子对NCBI网站公布的人类血清淀粉样蛋白A1的核苷酸序列进行人工优化，得到SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，通过退火延伸PCR技术，获得由大肠杆菌优势密码子组成的血清淀粉样蛋白A1突变体的基因；
c.血清淀粉样蛋白A1突变体表达载体的构建：将步骤(b)中获得的血清淀粉样蛋白A1突变体基因序列用NheI和XhoI进行双酶切，与同样经过NheI和XhoI双酶切的pET-30a(+)载体进行连接，得到表达载体；
d.血清淀粉样蛋白A1突变体的表达纯化：将步骤(c)中获得表达载体转化大肠杆菌BL-21感受态细胞，得到SAA1突变体表达菌株，进行培养、诱导表达以及纯化，最终获得所述血清淀粉样蛋白A1突变体。
8.由权利要求7所述方法制备的血清淀粉样蛋白A1突变体。
9.权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A1突变体在检测感染性疾病的早期炎症中的应用。
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