CN103374567A - 日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白、制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种日本血吸虫含EF-hand结构域钙结合蛋白(SjEFCAB)重组抗原蛋白的制备方法，包括设计SEQ ID NO.3或其互补链为5′引物，SEQ ID NO.4或其互补链为3′引物，进行日本血吸虫SjEFCAB基因序列的扩增；日本血吸虫SjEFCAB重组质粒的构建和鉴定；重组蛋白的诱导表达和纯化等步骤。此外，本发明还公开了采用上述方法制得的日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白在制备检测日本血吸虫病患者血清抗体的产品中的应用。经过酶联免疫吸附试验(ELISA)的验证，本发明的日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白用于日本血吸虫病的诊断具有较高的敏感性和特异性，是潜在的诊断候选靶标，可以作为日本血吸虫病诊断的目的抗原。

Description

日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白、制备方法及用途

技术领域

本发明涉及分子、细胞生物学研究领域，具体涉及日本血吸虫含EF-hand结构域钙结合蛋白(SjEFCAB)的重组抗原蛋白及其制备方法。此外，本发明还涉及该日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白在制备检测日本血吸虫病患者血清抗体的产品中的应用。

背景技术

血吸虫病是一种严重危害人类健康并阻碍流行区社会经济发展的人兽共患寄生虫病。寄生于人和动物体内的血吸虫主要有3种，即曼氏血吸虫、日本血吸虫和埃及血吸虫，在我国仅有日本血吸虫病的流行，是卫生部规划防治的五大寄生虫病之一。至2009年，全国约有血吸虫病患者36.58万，病牛1.62万头，钉螺面积37.24亿平方米，受威胁人口3000万以上。

诊断是确定血吸虫感染率以及感染度的有效手段，为流行区的划分提供判断标准，并为血吸虫病防治活动的各个环节提供必不可少的信息和科学依据，在防治工作中处于重要位置。无论从个体水平确定药物化疗的对象、考核化疗的效果，还是在群体水平监测血吸虫病疫情的变化、考核血吸虫病控制效果和评估流行趋势等等，均需要以诊断结果作为评判依据之一。

传统的病原学方法是诊断血吸虫病最为经典和可靠的途径，但费时、费力，且敏感性不高，流行区人群的依从性呈逐年下降趋势。由于免疫学的诊断方法具有操作简便、敏感性和特异性较好的优点，近年来发展迅速。

免疫诊断中最常用的抗原是成虫和虫卵抗原，但抗原成分复杂易产生交叉反应，来源有限且不易质控，难以适应大规模现场疾病普查的需求。随着分子生物学、免疫学和蛋白质组学的不断发展，成分明确、特异性好的重组抗原逐渐成为血吸虫病诊断抗原研究的一个重要方向。

钙是真核生物体内一种重要的第二信使，在细胞信号转导途径中发挥重要的作用，很多生理活动的控制调节都由钙来完成，例如腺体分泌、肌肉收缩、转录调控、细胞分裂等。因此，组织中钙离子的浓度必须在系统和细胞水平得到精细的调节，这项功能则由种类繁多的钙结合蛋白来完成。

钙结合蛋白包括EF-hand家族蛋白和非EF-hand家族蛋白。EF-hand结构域是一种具有钙结合位点的螺旋-中央环-螺旋的结构，其中E、F两段螺旋几乎是垂直的，这有利于它们结合钙离子。常见的含有EF-hand结构域的蛋白按照功能可以分为调节型蛋白和结构组成型蛋白两类，前者在结合钙离子之后产生构象的变化，并且有酶活性的改变；后者结合钙离子后并没有产生类似的变化，它们似乎仅是起到胞内钙离子水平的缓存作用。

Moser等克隆了在曼氏血吸虫虫卵阶段表达的钙结合蛋白SmE16基因，利用表达载体pEx34b，在大肠杆菌中以MS2融合蛋白的形式表达(MS2-SmE16)；该蛋白含有4个EF-hand基序，Mr为16000，与钙调蛋白和肌原蛋白C同源，属于钙结合蛋白家族，并被证明是血清学诊断的一种优势抗原。用MS2-SmE16诊断血吸虫病的敏感性为87％，且具有较好的特异性。王兆军等克隆和表达了日本血吸虫钙结合蛋白SjE16基因，该重组蛋白用于日本血吸虫病兔抗体ELISA检测，特异性和敏感性分别为94.1％和88.2％，并可以反映动物感染和治疗情况；检测血吸虫病患者血清抗体的特异性为98.3％，检测急性和慢性血吸虫病患者的敏感性分别为85.5％和70.2％；上述研究表明SjE16重组蛋白具有诊断现症感染和疗效考核的潜能。

日本血吸虫含EF-hand结构域的钙结合蛋白(SjEFCAB)的相对分子量(Mr)约为8200，等电点为4.78，定位于细胞核，预测其二级结构中含有较多的α螺旋区(Alpha helix，60.56％)、无规则卷曲(Random coil，29.58％)和少量的β转角(Beta turn，9.86％)。生物信息学分析结果同时表明SjEFCAB蛋白含有两个EF-hand结构域，分别位于第7-35位、第44-71位氨基酸残基之间，无信号肽和跨膜结构。

在本发明之前，还没有出现涉及本发明日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白及其用于日本血吸虫病诊断的公开报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一对用于日本血吸虫SjEFCAB基因PCR扩增的特异性引物。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白的制备方法。

本发明要解决的技术问题之三是提供采用上述方法制得的日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白。

本发明要解决的技术问题之四是提供该日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白在制备检测日本血吸虫病患者血清抗体的产品中的应用。

本发明通过生物信息学分析获得了日本血吸虫SjEFCAB的编码基因序列(如SEQ IDNO.1所示序列(GenBank登录号为FN324043.1)。利用分子生物学技术对日本血吸虫SjEFCAB基因进行PCR扩增，纯化扩增产物，将所得产物、质粒载体pGEX-4T-1分别进行酶切、回收，连接构建成SjEFCAB基因原核表达的重组质粒pGEX-4T-1-SjEFCAB，通过转化筛选，抽提重组质粒，经PCR、测序及酶切鉴定确认后，转化至宿主细胞大肠肝菌中表达；取表达量较高的克隆，发酵制备菌体，鉴定重组蛋白的溶解性；由于表达的重组蛋白为可溶性蛋白，经Glutathione Sepharese^TM 4B填料亲和层析纯化后，获得了纯度较高的重组蛋白，完成了SjEFCAB基因的体外克隆表达及纯化。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

本发明第一个方面是提供了一对用于日本血吸虫SjEFCAB基因PCR扩增的特异性引物，其序列为：

上游：5′-CCG GAATTC ATGAAACCATCAATGGAAGAGA-3′(如SEQ ID NO：3所示)或其互补链；

下游：5′-CCG CTCGAG TTAACAAGAGAACATTTTAACC-3′(如SEQ ID NO：4所示)或其互补链。

本发明第二个方面提供了一种日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)日本血吸虫SjEFCAB基因序列的扩增(用PCR技术从pBluescript-SjEFCAB重组质粒中获得SjEFCAB的DNA片段)；

2)日本血吸虫SjEFCAB重组质粒的构建和鉴定：用pGEX-4T-1载体构建日本血吸虫SjEFCAB重组表达质粒pGEX-4T-1-SjEFCAB；

3)将pGEX-4T-1-SjEFCAB重组质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，得到表达的重组蛋白SjEFCAB(即含谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase，GST)标签的融合蛋白)；

4)用Glutathione Sepharese^TM 4B填料经亲和层析法纯化表达的重组蛋白SjEFCAB。

步骤1)日本血吸虫SjEFCAB基因序列的扩增，具体为：

以含有日本血吸虫SjEFCAB基因序列的pBluescript-SjEFCAB质粒为模板，SEQ ID NO.3(CCG GAATTC ATGAAACCATCAATGGAAGAGA)或其互补链为5′引物，SEQ ID NO.4(CCG CTCGAG TTAACAAGAGAACATTTTAACC)或其互补链为3′引物，进行PCR扩增，所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，用

胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)回收纯化。所述PCR扩增的反应条件为95℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，72℃延伸10min，30个循环；最后保存于4℃。

步骤2)构建可在宿主细胞中表达SjEFCAB编码基因的重组质粒pGEX-4T-1-SjEFCAB，具体为：

将纯化的SjEFCAB基因PCR产物片段和质粒载体pGEX-4T-1分别用限制性内切酶EcoRI和Xho I进行酶切，用

胶回收试剂盒(

Gel Extraction Kit)回收纯化。纯化后的目的基因片段和载体酶切片段按照3∶1(摩尔比)的比例进行连接，构建成SjEFCAB编码基因原核表达的重组质粒pGEX-4T-1-SjEFCAB。将此质粒通过CaCl₂法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养后涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，随机挑取上述平板上的菌落，培养后收集菌体，用AxyPrep质粒小量制备试剂盒抽提菌体中所含重组质粒，进行PCR鉴定、测序鉴定及酶切鉴定。

步骤3)重组质粒pGEX-4T-1-SjEFCAB在大肠肝菌(宿主细胞)中的表达，具体为：

通过钙转化将上述抽提所得pGEX-4T-1-SjEFCAB重组质粒转化入大肠杆菌BL21中，培养后涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上。随机挑取上述平板上的菌落，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂(IPTG)继续培养。SDS-PAGE鉴定诱导表达结果，直接以全菌体电泳显示。

步骤4)纯化SjEFCAB重组蛋白：

取表达重组蛋白SjEFCAB量较高的冻存菌种划线于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，培养过夜之后，随机挑取上述平板上的菌落接种至同样含氨苄青霉素的液体培养基，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养，最后收取菌体；在上述菌体中加入BugBuster蛋白抽提剂裂解细菌，离心后保留上清液与沉淀，用SDS-PAGE进行鉴定。电泳结果显示菌体裂解后目的蛋白主要位于上清中，为可溶性蛋白。经Glutathione Sepharese^TM 4B填料亲和层析纯化后，SDS-PAGE检测纯化结果，获得了纯度较高的重组蛋白。

本发明第三个方面是提供一种采用上述方法制得的日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白，其具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。

本发明第四个方面提供了一种采用上述方法制得的日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白在制备检测日本血吸虫病患者血清抗体的产品中的应用。本发明以纯化的日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白包被酶标板，4℃过夜。加入封闭液，100μl/孔，封闭酶标板上的非特异性结合位点。分别加入1∶100稀释的血吸虫病患者血清、其他常见人体寄生虫病患者血清和健康人血清，100μl/孔，每份样品均做复孔，于37℃反应2h。每孔加入100μl的HRP标记羊抗人IgG全分子(Sigma-Aldrich，1∶10000)，37℃反应1h。加入100μl/孔的TMB底物溶液，室温显色后加入100μl/孔的2M H₂SO₄终止反应。用酶标仪读取OD450_nm的数值。以上各步骤之间分别用PBST(磷酸盐吐温缓冲液)进行洗涤。

本发明通过PCR扩增出日本血吸虫SjEFCAB全基因，并在大肠杆菌中重组表达此基因，得到大小约为8200Da的日本血吸虫SjEFCAB重组蛋白，经间接ELISA试验的验证，本发明的日本血吸虫重组抗原蛋白用于日本血吸虫病的诊断具有较高的敏感性和特异性，是潜在的诊断抗原候选靶标，可以作为日本血吸虫病免疫诊断的目的抗原。

附图说明

图1是实施例1中日本血吸虫SjEFCAB基因序列的扩增结果示意图。图1中，M：DNA分子量标准；1：SjEFCAB；2：阴性对照。

图2是实施例3中日本血吸虫SjEFCAB基因重组质粒菌落PCR鉴定结果示意图。图2中，M：DNA分子量标准；1-3：SjEFCAB；4：阴性对照。

图3是实施例4、5中日本血吸虫重组蛋白(SjEFCAB)溶解性和纯化效果的SDS-PAGE分析结果示意图。图3中，M：蛋白分子量标准；1：未诱导对照；2：诱导后4h(1mmol/L IPTG)；3：菌体裂解后上清；4：菌体裂解后沉淀；5纯化后SjEFCAB重组蛋白。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

主要试剂如表1所示：

表1

主要仪器设备如表2所示：

表2

试验材料：

pBluescript-SjEFCAB质粒、宿主菌株大肠杆菌DH5α、BL21、质粒pGEX-4T-1，均由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所寄生虫病原与媒介生物学重点实验室提供。

实施例1日本血吸虫SjEFCAB基因的克隆

1.1SjEFCAB基因片段的扩增和纯化：

11.1根据SjEFCAB基因(Genbank登录号FN324043.1)的序列(如SEQ ID NO.1所示序列)，利用PrimerPremier5.0软件设计一对特异性引物，如下：

PF：5′-CCG GAATTC ATGAAACCATCAATGGAAGAGA-3′(如SEQ ID NO.3所示)；

PR：5′-CCG CTCGAG TTAACAAGAGAACATTTTAACC-3′(如SEQ ID NO.4所示)；

斜体部分表示的是上下游引物的保护性碱基，粗体部分是上游引物的EcoR I酶切位点和下游引物的Xho I酶切位点。上述特异性引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。11.2以pBluescript-SjEFCAB质粒为模板，进行PCR反应，扩增SjEFCAB基因，反应体系如下：

反应条件：

用1.5％琼脂糖凝胶(GoldView^TM核酸染料)电泳检测PCR产物，观察是否存在目的条带，结果如图1所示，M：DNA分子量标准，1：SjEFCAB，2：阴性对照。PCR反应的结果显示，约216bp处有一条清晰的条带，与预期片段的大小相符，表明SjEFCAB基因扩增成功。1.1.3PCR产物的纯化回收(QIAGEN公司的胶回收试剂盒)

1)电泳结束后，用干净、锋利的刀片将DNA目的片段从琼脂糖凝胶上切割下来。

2)将切下的凝胶块捣碎置于离心管中并称重，加入3倍于凝胶体积的Buffer QG(100mg的凝胶约折合为100μl的体积)。

3)离心管于50℃水浴中孵育10min，为加速凝胶溶解，每隔2-3min将离心管取出上下颠倒混匀。

4)待凝胶完全溶解后，观察离心管内液体颜色是否与Buffer QG未溶胶前的颜色基本一致；若管内液体变为橙色或紫色，需加入10μl 3mol的醋酸钠(pH5.0)调节pH值。

5)向离心管中加入1倍于凝胶体积的异丙醇，混匀。

6)试剂盒中的QIAquick spin column置于2ml收集管中；将离心管中的液体加入QIAquickspin column中，13000rpm，离心1min，弃滤液。

7)将QIAquick spin column置回原离心管中，加入500μl Buffer QG，13000rpm，离心1min，弃滤液。

8)向QIAquick spin column中加入750μl Buffer PE洗柱，静置2-5min，13000rpm，离心1min，弃滤液。

9)于13000rpm，再次离心2min，以除去残留的Buffer PE。

10)将QIAquick spin column置于新的1.5ml离心管中；加入30μl Buffer EB于QIAquick spincolumn的膜中央，静置4min，13000rpm，离心1min，收集洗脱液，保存于-20℃。

11)用琼脂糖凝胶电泳检测回收效率，并估算DNA片段的浓度。

实施例2SjEFCAB基因重组质粒pGEX-4T-1-SjEFCAB的构建

2.1PCR产物双酶切及回收

将回收的PCR目的片段于37℃水浴双酶切过夜，酶切反应体系如下：

酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶(GoldView^TM核酸染料)电泳，切下目的条带，再次回收DNA分子，回收方式同实施例1中11.3，回收产物保存于-20℃。

2.2pGEX-4T-1空载质粒的制备(AxyPrep质粒小量制备试剂盒)

在LB平板(含100μg/ml的氨苄青霉素)上挑取含pGEX-4T-1质粒的单菌落于5ml 2×YTA培养基(含100μg/ml的氨苄青霉素)中，37℃培养过夜。次日，取1ml培养液转入1.5ml离心管中，保存于4℃作为菌种。将剩余的培养液于5000rpm，离心10min，弃上清。用250μl已加入RNaseA1的Buffer S1重悬细菌沉淀(悬浮需均匀，不应留有小的菌块，否则会影响菌体的裂解)。加入250l Buffer S2，温和但充分地上下翻转混合6次，直至形成透亮的溶液。加入400μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合10次，室温静置2min，14000rpm离心10min(若仍有悬浮物，可轻轻颠倒混匀后再次离心3min)。将离心后的上清液转移到制备管中，置于2ml离心管，1400rpm离心1min。将滤液再次转移到制备管以同样的方法重复结合一次。弃滤液，将制备管置回到原离心管中，加入500μl Buffer W1进行洗涤，14000rpm离心1min。弃滤液，将制备管置回到原离心管中，加入700μl BufferW2(已加入适当体积的无水乙醇)，14000rpm离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μl BufferW2洗涤一次，弃滤液。将制备管置回到2ml离心管中，14000rpm离心1min。将制备管移入新的1.5ml离心管，在制备管的膜中央加20μl Eluent(提前加热至65℃，)，室温静置1min；14000rpm离心1min进行洗脱。将洗脱液重新加入制备管膜中央，室温静置1min，14000rpm离心1min再次洗脱DNA。洗脱液置于-20℃保存，用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的质粒DNA。(参照AxyPrep质粒小量制备试剂盒操作手册)

2.3pGEX-4T-1空载质粒的双酶切

加入限制性内切酶酶切pGEX-4T-1空载质粒，37℃水浴反应过夜，反应体系如下：

酶切产物进行1％琼脂糖凝胶(GoldView^TM核酸染料)电泳，切下目的片段进行回收纯化，回收方式同实施例1中11.3，样品保存于-20℃。

2.4重组质粒的构建

按照3∶1(摩尔比)的比例将回收后的外源基因片段与表达载体片段进行连接，连接体系如下：

反应体系于16℃水浴中连接过夜，构建pGEX-4T-1-SjEFCAB重组质粒。

实施例3日本血吸虫SjEFCAB表达载体的鉴定

3.1连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞

将实施例2的2.4中的连接产物与E.coli DH5α感受态细胞轻轻混合，冰浴30min，于42℃水浴热激1.5min，再次冰浴5min。无菌条件下向培养管中加入900μl的SOC培养基，37℃，200rpm，振荡培养1h。将培养好的菌液于3500rpm，离心3min，弃去大部分上清，留约100μl培养基重悬菌体。将重悬液均匀涂布于LB平板(含100μg/ml的氨苄青霉素)上，37℃倒置培养过夜，观察菌落生长情况。

3.2重组质粒的PCR鉴定

随机挑取平板上的单个菌落进行菌落PCR鉴定，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测(结果如图2所示)，经过PCR鉴定显示在预计的分子量大小处出现目的条带，表明有外源基因片段的插入。

3.3重组质粒的测序鉴定

选择可扩增出目的条带的单菌落送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，以检验插入片段的序列是否正确。测序分析结果表明插入的外源基因片段序列正确，重组质粒构建成功。

实施例4日本血吸虫SjEFCAB的重组质粒在E.coli中的表达及鉴定

4.1pGEX-4T-1-SjEFCAB重组质粒的诱导表达

1)取1μl测序正确的pGEX-4T-1-SjEFCAB重组质粒转化E.coli BL21感受态细胞，转化方法同实施例3中的3.1。

2)次日，分别于每个平板上各随机挑取6个单菌落接种于5ml的2×YTA培养基(含含100μg/ml的氨苄青霉素)，37℃，200rpm，振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。

3)取出1ml菌液作为菌种，再取出2ml菌液不加IPTG作为对照，剩余的2ml菌液加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，37℃，250rpm，继续培养4h。

4)将培养好的菌液于4℃，5000rpm离心10min收集菌体，弃去上清。

4.2SDS-PAGE鉴定诱导产物

向诱导管和对照管中分别加入200μl 1×PBS重悬菌体沉淀。分别从诱导管和对照管中取出5μl的重悬液，加入2×SDS-PAGE上样缓冲液5μl，混匀后于100℃煮沸5min变性。每个上样孔中分别加入8μl的样品，进行SDS-PAGE分析，分离胶为15％，浓缩胶为5％。凝胶配方如下表3所示：

表3

设置浓缩胶的电压为80V，分离胶的电压为100V进行电泳。待溴酚蓝指示剂逸出玻璃板下边缘时关闭电源。取下凝胶用考马斯亮蓝染色液染色2h，再用脱色液脱色，直到蛋白条带清晰可见。

如图3所示，将pGEX-4T-1-SjEFCAB重组质粒转化E.coli BL21感受态细胞，经IPTG诱导表达后较诱导前的菌体出现了分子量约为34200Da的明显表达条带，即为目的基因与GST标签融合表达的产物，大小与理论相对分子量相符。

4.3重组蛋白溶解性鉴定

将已确定可表达重组蛋白的E.coli BL21菌种接种到100ml 2×YTA培养基(含100μg/ml的氨苄青霉素)中，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀约为0.6。将培养的菌液取出1ml作为菌种，另取2ml作为对照。向剩余的菌液中加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，200rpm继续培养4h。

诱导后的菌液经5000rpm，4℃，离心10min，弃尽上清，向菌体沉淀中加入5ml的BugBuster蛋白抽提剂(Novagen)，充分悬浮沉淀后，将悬浮液转入离心管中，置于摇床上，室温裂解菌体1h。将细菌裂解液于4℃，10000rpm离心10min，取上清保存于另一干净的离心管中，挑取少量沉淀用适当体积的PBS重悬。分别取出5μl的上清和沉淀重悬液作SDS-PAGE分析，鉴定重组蛋白的溶解性。电泳结果(图3)显示重组蛋白主要位于上清中，为可溶性蛋白。实施例5重组蛋白SjEFCAB的纯化

5.1重组蛋白的纯化

1)将已确定可表达重组蛋白的E.coli BL21单克隆于前一日接种到25ml 2×YTA培养基中(含100ug/ml的氨苄青霉素)，37℃，200rpm培养过夜。

2)次日，将培养过夜的菌液5ml转接到500ml的2×YTA(含100μg/ml的氨苄青霉素)培养基中，37℃，200rpm，培养至OD₆₀₀约为0.6。

3)取1ml菌液作为未诱导对照，剩余菌液中加入IPTG至终浓度为1mmol/L，18℃，200rpm，诱导培养过夜。

4)诱导后的1ml菌液10000rpm，4℃，离心5min，弃尽上清，用适当体积的PBS重悬菌体沉淀，加入等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀后于100℃煮沸5min变性。

5)诱导后的其余菌液经10000rpm，4℃，离心15min，弃尽上清，称量菌体沉淀的湿重。按1g湿重的菌体沉淀加入5ml BugBuster蛋白抽提剂(Novagen)比例，充分悬浮沉淀。将悬浮液转入50ml离心管中，置于摇床上，室温裂解1h。然后将细菌裂解液于4℃，14000rpm离心15min。

6)裂解细菌的同时，取2ml的Glutathione Sepharese^TM 4B凝胶装柱，待树脂自然沉降后，加入10ml 1×PBS冲洗三次，除去残留的乙醇，再加入10ml 1×PBS平衡三次。

7)将步骤5中离心后的上清液加入已经处理好的柱子中，与Glutathione Sepharese^TM 4B树脂轻轻混匀，转移到50ml的离心管，置于摇床上，室温振荡1h，使含GST标签的重组蛋白与Glutathione Sepharese^TM 4B树脂充分结合。

8)将步骤6中的混合物装柱，待树脂沉降后，收集柱子下端流出的液体，即为层析穿出液(Flow-through)。

9)用1×PBS洗柱两次，每次10ml，收集流出的液体，即为洗涤收集液(Wash)。

10)将树脂用3ml 1×PBS重悬，并加入10U的Thrombin(Sigma-Aldrich)于25℃在柱酶切过夜，使重组蛋白与GST标签分离。

11)装柱，收集流出液，即为含重组蛋白的溶液。

12)SDS-PAGE分析检测重组蛋白纯化的效果，如图3所示表明纯化后获得了纯度较高的重组蛋白。

5.2重组蛋白浓度的测定

利用Bradford蛋白质定量试剂盒(天根)测定重组蛋白的浓度，按照说明书进行操作。主要步骤包括：

考马斯亮蓝溶液在使用前先平衡至室温并温和颠倒混匀，预热分光光度计。将0、5、10、15、20、25、30μl牛血清白蛋白(BSA)标准溶液(1mg/ml)分别加入到离心管中，加PBS补足至75μl。将适当体积纯化的重组蛋白加入到离心管中，并用PBS补足75μl。向各离心管中加入1425μl考马斯亮蓝溶液，混匀，室温静置10min。用分光光度计测定595nm处的吸光值，并记录读数。以不含BSA样品的光吸收值作为空白对照，绘制标准曲线，计算待测样品的蛋白浓度。如果所得到的蛋白浓度超出标准曲线的范围，根据情况将样品稀释或浓缩后重新测定。根据公式和重组蛋白的稀释度计算出纯化后SjEFCAB重组蛋白的浓度为0.56mg/ml。

用于绘制标准曲线的各管溶液反应体系如下表4所示：

表4

实施例6日本血吸虫SjEFCAB重组蛋白的ELISA反应

6.1间接ELISA方法检测血清抗体的敏感性试验

1)重组蛋白以最佳包被浓度包被酶标板，4℃过夜。

2)PBST洗板3次，每次静置3min。然后加入封闭液，100μl/孔，于4℃封闭过夜。

3)PBST洗板3次，每次静置3min。分别加入1∶100稀释的血吸虫病患者血清(安徽省)和健康人血清(上海市)，100μl/孔，每份样品均做复孔，于37℃反应2h。每板同时设阳性参照(血吸虫病患者混合血清)、阴性参照(健康人混合血清)和空白参照(PBS)。

4)用PBST洗板6次，每次静置3min。每孔加入100μl的HRP标记羊抗人IgG全分子(Sigma-Aldrich，1∶10000稀释)，37℃反应1h。

5)PBST洗板6次，每次静置3min。加入100μl/孔的TMB底物溶液，室温显色后加入100μl/孔的2M H₂SO₄终止反应。

6)用酶标仪读取OD450_nm的数值。

6.2间接ELISA方法检测血清抗体的特异性试验

基本方法同实施例6中6.1，与重组蛋白反应的第一抗体分别为华支睾吸虫病患者血清(广东省)、猪囊尾蚴病患者血清(云南省)、并殖吸虫病患者血清(中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制门诊收集)、旋毛虫病患者血清(云南省)和健康人血清(上海市)。以健康人血清的OD均值+2×标准差作为阳性判断值(CUTOFF)，如表5所示，SjEFCAB重组蛋白检测日本血吸虫病患者血清的敏感性为82.1％(64/78)，检测非流行区健康人血清的特异性为98.0％(1/53)，与并殖吸虫病患者血清无交叉反应(0/6)，与华支睾吸虫病患者、猪囊尾蚴病患者和旋毛虫病患者的交叉反应率分别为20.0％(1/5)、10.0％(1/10)和11.1％(1/9)。该试验结果表明SjEFCAB重组蛋白用于日本血吸虫病的诊断具有较高的敏感性和特异性，是潜在的诊断抗原。

表5SjEFCAB重组蛋白检测血清抗体的敏感性和特异性

Claims (8)

1.一对用于日本血吸虫SjEFCAB基因PCR扩增的特异性引物，其特征在于，其序列为：

上游：5′-CCG GAATTC ATGAAACCATCAATGGAAGAGA-3′(如SEQ ID NO：3所示)或其互补链；

下游：5′-CCG CTCGAG TTAACAAGAGAACATTTTAACC-3′(如SEQ ID NO：4所示)或其互补链。

2.一种日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)日本血吸虫SjEFCAB基因序列的扩增：设计如权利要求1所述的引物序列，以pBluescript-SjEFCAB质粒为模板进行PCR扩增；

2)日本血吸虫SjEFCAB重组质粒的构建和鉴定；

3)将该重组质粒转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达，得到表达的重组蛋白SjEFCAB；

4)经Glutathione Sepharese^TM 4B填料亲和层析纯化表达的重组蛋白SjEFCAB。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述PCR扩增的反应条件为95℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，72℃延伸10min，30个循环；最后保存于4℃。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)具体为：将步骤1)所得的PCR产物片段与质粒载体pGEX-4T-1分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切，并回收纯化；根据纯化后的目的基因片段和载体酶切片段的浓度进行连接，构建成SjEFCAB编码基因原核表达的重组质粒pGEX-4T-1-SjEFCAB；将此重组质粒通过CaCl₂法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养后涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，随机挑取上述平板上的菌落，培养后收集菌体，抽提菌体中所含重组质粒，进行PCR鉴定、测序鉴定。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)具体为：通过钙转化将步骤2)测序鉴定无误的pGEX-4T-1-SjEFCAB重组质粒转化入大肠杆菌BL21中，培养后涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上；随机挑取上述平板上的菌落，培养大肠杆菌至对数生长期，加入诱导剂继续培养；十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定诱导表达结果，直接以全菌体电泳显示。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤4)具体为：取表达重组蛋白SjEFCAB量较高的冻存菌种划线于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，培养过夜之后，随机挑取上述平板上的菌落接种至同样含氨苄青霉素的液体培养基，培养菌液至对数生长期，加入诱导剂继续培养，最后收取菌体；在上述菌体中加入BugBuster蛋白抽提剂裂解细菌，离心后保留上清液与沉淀，由SDS-PAGE电泳鉴定结果；根据上述结果，用Glutathione Sepharese^TM 4B填料亲和层析纯化目的蛋白，SDS-PAGE检验纯化结果。

7.一种采用如权利要求2-6任一项所述的方法制得的日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白。

8.一种如权利要求7所述的日本血吸虫SjEFCAB重组抗原蛋白在制备检测日本血吸虫病患者血清抗体的产品中的应用。

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