CN111197061A - 大脑类器官疾病模型构建、检测方法及过表达Aβ胚胎细胞系 - Google Patents

大脑类器官疾病模型构建、检测方法及过表达Aβ胚胎细胞系 Download PDF

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Abstract

本发明涉及阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型构建方法及检测方法。构建方法：1、建立胚胎干细胞过表达β‑淀粉样蛋白细胞系；1.1构建淀粉样β前体蛋白(APP)突变慢病毒表达载体质粒；1.2包装淀粉样β前体蛋白(APP)突变慢病毒；1.3构建稳转淀粉样β前体蛋白(APP)过表达胚胎干细胞单克隆细胞系；2、建立阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型；2.1构建淀粉样β前体蛋白(APP)突变的阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型；3.分析疾病模型理化指标的变化，以确定是否成功培育出阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型。

Description

大脑类器官疾病模型构建、检测方法及过表达Aβ胚胎细胞系
技术领域
本发明涉及类器官疾病模型的构建方法，特别涉及一种阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型构建方法、检测方法及胚胎干细胞过表达β-淀粉样蛋白细胞系。
背景技术
动物模型一直是疾病机制研究和临床前药物评测的关键工具。阿尔茨海默病的机制研究的缓慢和临床实验的失败一定程度上源于目前使用的AD转基因动物模型的弊端和局限性。目前的动物模型将人疾病过程复杂的病因某一单一的因素或者几个因素联合在一起在动物模型中表现甚至放大出来，可以特异性的研究某一特定因素的病因所引起的疾病变化，但都无法完全模拟人疾病的进程，此外，动物从基因一直到组织器官层次与人类还是有很大的差异。这些往往是导致很多在实验动物上有治疗效果的药物在临床阶段却失败的原因。
由于人类大脑组织很难获得，研究人员通过分化人多能干细胞(hPSCs)，包括诱导多能干细胞(iPS)和胚胎干细胞(ES)，来获取人神经细胞。这种相对简单且划算的获取人神经细胞的方式为神经科学的发展铺平了道路。研究人员现在可以利用模拟人体生理环境的模型来开发新药、验证细胞疗法和研究神经疾病。而且由于现在可以生成患者特异性的分化细胞类型，iPS细胞还可以用来弥补动物模型研究和临床研究之间的差距。一直以来，成年和胚胎神经元细胞一直采用2D组织培养技术的传统方法进行培养。科学家们通过这种简化方法即可识别相对简单症候相关的关键机理路径。
然而，由于动物组织(尤其是脑组织)是由细胞和细胞外基质组成的极为复杂的3D结构，2D细胞培养无法充分体现完整的组织结构。没有建立神经元和胶质细胞之间的相互联系。很多疾病的发生是由于多种不同类型细胞相互作用的结果，单一类型的细胞并不能模拟疾病的真实过程。类器官属于三维(3D)细胞培养物，包含其代表器官的一些关键特性。此类体外培养系统包括一个自我更新干细胞群，可分化为多个器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统含有成体干细胞的组织样本、单一成体干细胞或者通过多能干细胞的定向诱导分化都能够产生类器官。
神经系统疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病，发病率逐年升高，对社会危害极大，同时，相关研究需要的病理组织很难获取。因此，迫切需要建立来源于患者的疾病细胞模型，研究患者来源的细胞分化过程中的问题及机制，利用这些细胞进行疾病相关药物研发、药物的精准医疗等。并且随着基因编辑技术发展，类器官模型在人的大脑发育、疾病机制的研究上将进一步展现出极其重要的价值。目前国内在类器官尤其是大脑各脑区特异性的类器官的研究几乎处于空白状态。
发明内容
本发明的目的是提供一种阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的构建方法、检测方法及过表达Aβ胚胎细胞系。本发明所解决的第一个技术问题是提供一种构建胚胎干细胞过表达β-淀粉样蛋白(Aβ)细胞系的方法，该方法利用重叠PCR和无缝克隆技术将野生型的APP770DNA序列克隆到慢病毒表达载体，同时引入Swedish(KM670/671NL)，Arctic(E693G)，Beyreuther/Iberian(I716F)三种来源于不同AD病人APP突变基因，将构建好的表达质粒在293T细胞中进行包装病毒，用包装形成的病毒感染胚胎干细胞细胞系h9，得到稳转APP过表达胚胎干细胞单克隆细胞系。本发明所解决的第二个技术问题是提供一种阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的方法，该方法利用胚胎干细胞过表达β-淀粉样蛋白细胞系在类器官生物反应器中经过培养和诱导分化，形成阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型(AD organoid)。本发明所解决的第三个技术问题是提供一种阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型检测方法。本发明建立的阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型用于AD的疾病机制研究，为进一步了解疾病的发生机制开创新的研究方向。本发明所解决的第四个技术问题是提供一种能更有效、更便捷以及更高效地筛选新的AD药物；对药物在临床试验前进行初步的验证，给药物研发带来新改变的阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型构建方法及检测方法。
本发明的技术解决方案是所述阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的构建方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
⑴建立胚胎干细胞过表达β-淀粉样蛋白细胞系；
(1.1)构建淀粉样β前体蛋白(APP)突变慢病毒表达载体质粒；
(1.2)包装淀粉样β前体蛋白(APP)突变慢病毒；
(1.3)构建稳转淀粉样β前体蛋白(APP)过表达胚胎干细胞单克隆细胞系；
⑵建立阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型(AD organoid疾病模型)；
(2.1)构建淀粉样β前体蛋白(APP)突变的阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型；
⑶分析疾病模型理化指标的变化；
(3.1)免疫印迹法分析类器官中淀粉样β前体蛋白(APP)的表达量；
(3.2)冰冻切片免疫荧光法分析阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型分化状况；
(3.3)冰冻切片免疫荧光法分析阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的病理变化。
作为优选：所述步骤(1.1)进一步包括：
(1.1.1)采用770个氨基酸的人淀粉样β前体蛋白(APP)cDNA序列作为构建突变质粒的模板,通过聚合酶链式反应法(PCR)将野生型的APP770 cDNA扩增出来；
(1.1.2)纯化PCR产物；
(1.1.3)再将纯化后的PCR产物采用一步法无缝克隆技术克隆到慢病毒表达载体中，慢病毒采用hPGK启动子表达APP；
(1.1.4)利用重叠PCR和无缝克隆技术的方法将三种来源不同阿尔茨海默病病人的APP突变位点引入到APP770野生型慢病毒表达载体中；这三种突变位点分别是：Swedish(KM670/671NL),Arctic(E693G)，Beyreuther/Iberian(I716F)。
(1.1.5)通过测序验证上述三种突变引入APP770慢病毒载体中。
所述步骤(1.2)进一步包括：
(1.2.1)采用三质粒系统在293T细胞中进行包装，用lippo2000作为转染试剂，将表达载体和辅助质粒共转染293T细胞；6小时后换成新鲜的完全培养基，48小时后收取培养上清；
(1.2.2)对病毒进行浓缩处理，将3体积的上清与1体积的40％PEG800(W/V)、1.4MNacl PBS溶液混匀，60转摇床4℃混匀4小时，4℃离心机1600xg离心60分钟,最后将沉淀中的病毒颗粒重新混悬在PBS缓冲液中。
所述步骤(1.3)进一步包括：
(1.3.1)在基质胶(matrigel)上用mTeSR培养基培养胚胎干细胞细胞系h9；
(1.3.2)将浓缩后的病毒感染h9，12小时后换液，先用PBS冲洗感染后的细胞三遍，最后换成mTeSR培养基继续培养；
(1.3.3)大约在4～5天的时候对h9细胞系进行传代，采用有限稀释法将感染后的h9进行单克隆培养；
(1.3.4)用DNA快速提取液(Quick Extract DNA Extraction Solution1.0)试剂对感染后的胚胎干细胞系进行高通量基因组提取：用PBS清洗细胞，然后用消化液消化，组后用100μL PBS重悬细胞，将10μL的重悬细胞液加入到50μL Quick Extract DNAExtraction Solution 1.0中，混匀；65℃30分钟,混匀，98℃15分钟；
(1.3.5)混匀后的样品可以直接用来作为DNA模板，在APP三个突变前后设计引物，PCR用来测序，筛选出含有三种APP基因突变的稳转APP过表达的单克隆细胞系；
(1.3.6)将筛选出来的不同株单克隆细胞进行细胞裂解提取蛋白，通过免疫印迹法(western blot)对APP蛋白的表达进行验证，获得胚胎干细胞过表达β-淀粉样蛋白细胞系，选取E4这株稳转APP过表达胚胎干细胞单克隆细胞系进行分化培养。
作为优选：所述步骤(2.1)进一步包括：
(2.1.1)将在基质胶(matrigel)上培养的含淀粉样β前体蛋白(APP)突变的胚胎干细胞，转移到MEF培养条件下培养，传代两次以上待胚胎干细胞状态调整好后，用来向类大脑皮层方向分化；
(2.1.2)培养在六孔细胞培养板上的胚胎干细胞克隆长到1.5mm的时候，去除培养基加入1mL 1mg/mL的胶原酶(collagenase)消化细胞；细胞培养箱中培养45～60分钟，记为0天；
(2.1.3)当消化后的克隆漂浮起来后，加入1mL人子宫内膜间质细胞系(hESC)培养基并用10mL移液管转移到15mL离心管中，静置两分钟后克隆会沉到离心管底部；
(2.1.4)将上清吸走后温和的加入5mL hESC培养基进行清洗，静置两分钟；
(2.1.5)再将上清吸走，加入培养基Ⅰ1mL；
(2.1.6)准备新的无吸附处理的六孔细胞培养板并加入培养基Ⅰ3mL；
(2.1.7)提前准备的1mL枪头头部用剪刀剪掉，使枪头口直径大于3mm以防止破坏克隆，并进行高温高压灭菌处理，用所述枪头将消化清洗后的克隆转移到步骤(2.1.6)中的六孔细胞培养板中培养形成拟胚体(Embryoid bodies，EBs),每孔中形成30～50个拟胚体；
(2.1.8)将步骤(2.1.7)处理后的细胞放回细胞培养箱中培养24小时待形成拟胚体；
(2.1.9)在第1天,换成新鲜的培养基Ⅰ,去除未形成拟胚体的细胞，重新放回培养箱培养；
(2.1.10)在第3天和第4天换成新鲜的培养基Ⅰ；
(2.1.11)在第5天和第6天吸出培养基1mL，并在所述培养基中加入培养基Ⅱ1.5mL，让拟胚体在两种培养基中逐渐过渡；
(2.1.12)第5天在显微镜下观察拟胚体，健康的拟胚体是圆形并且表面光滑，边缘相对透明；
(2.1.13)将200μL枪头剪口，口径在1.5～2mm之间，然后进行高温、高压灭菌处理；
(2.1.14)用5mL移液管将拟胚体放入15mL移液管中，静置，将上清去除，再加入1mL培养基Ⅱ清洗一次拟胚体；
(2.1.15)用步骤(2.2.13)中准备好的枪头，将20～30个拟胚体重悬到67μL培养基Ⅱ中；
(2.1.16)将100μL基质胶加入到步骤(2.2.15)中的拟胚体中，然后用剪了口的枪头将基质胶和培养基混匀，加入到新的低吸附的六孔细胞培养板中，放到37℃培养箱中30分钟,让基质胶凝固；
(2.1.17)加入3mL的培养基Ⅱ在凝固后的包裹拟胚体的基质胶中；
(2.1.18)在第9天、第11天和第13天换取新鲜的培养基，中途不能破坏基质胶；
(2.1.19)第14天在显微镜下观察，每个拟胚体会分化成一簇类似神经管的神经上皮芽，神经上皮光镜下呈半透明状，表面光滑；
(2.1.20)第14天,用5mL移液管将分化后的类器官从基质胶上吹打下来，用培养基清洗几次，去除基质胶和状态不好的类器官；
(2.1.21)将分离后的类器官放入低吸附12孔细胞培养板中，加入培养基Ⅲ放在类器官生物反应器中培养；将直流电机调到7.5V,此时旋转速度大约在100转；培养过程中，类器官生物反应器由一个马达带动12个齿轮旋转，齿轮带动一个类似螺旋桨的装置旋转，有利于阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型接触到营养物质和氧气；
(2.1.22)每两天换入新鲜的培养基Ⅲ；在70天的时候换成培养基Ⅳ,每两天换液，最多可以培养到200多天；第71天时，阿尔茨海默病大脑类器官神经上皮芽向神经方向分化，大脑皮层类器官越长越大，在显微镜下观察到组织到达2mm左右的大小(标尺为200μm)，表面透光性差；
(2.1.23)细胞培养过程中，根据细胞的状态、实验目的和结果在不同培养阶段对培养基的成分进行调整，步骤(2.1.9)、步骤(2.1.10)、步骤(2.1.11)、步骤(2.1.14)、步骤(2.1.15)、步骤(2.1.22)中所用的培养基Ⅰ、培养基Ⅱ、培养基Ⅲ、培养基Ⅳ成分分别如下：
培养基Ⅰ 培养基Ⅱ 培养基Ⅲ 培养基Ⅳ
DMEM/F12 DMEM/F12 DMEM/F12 Neurobasal
20％KOSR 20％KOSR 1×N2supplement 1×B27supplement
1×GlutaMAX 1×GlutaMAX 1×B27supplement 1×GlutaMAX
1×MEM-NEAA 1×MEM-NEAA 1×GlutaMAX 1×MEM-NEAA
1×2-Mercaptoethanol 1×2-Mercaptoethanol 1×MEM-NEAA Pen/Strep
Pen/Strep Pen/Strep 1×2-Mercaptoethanol Ascorbicacid,0.2mM
Dorsomorphin,2μM CHIR-99021,1μM Pen/Strep cAMP,0.5mM
A-83,2μM SB-431542,1μM InsμLin,2.5μg/mL BDNF,20ng/mL
GDNF,20ng/mL
作为优选：所述步骤(3.1)进一步包括：
(3.1.1)在41天的时候取出2～3个类器官进行裂解提取蛋白，并进行蛋白定量；
(3.1.2)利用免疫印迹法对阿尔茨海默病大脑类器官与正常h9分化的类器官淀粉样β前体蛋白(APP)表达量进行分析。
所述步骤(3.2)进一步包括：
(3.2.1)将类器官在4％的福尔马林中室温固定30分钟～1小时；
(3.2.2)类器官用PBS洗三遍，放在30％蔗糖溶液中过夜4℃脱水；
(3.2.3)将类器官包埋在组织冷冻剂中冷冻后切片；
(3.2.4)PBS洗干净组织冷冻剂；
(3.2.5)0.2％的曲拉通-X(Triton-X)溶解在PBS进行通透，室温1小时；
(3.2.6)10％的驴血清溶解在0.1％吐温-20(Tween-20)PBST中进行封闭，室温30分钟；
(3.2.7)Anti-sox2用来染神经干细胞，Anti-Ctip2染分化后的神经元，一抗溶解在封闭液中，4℃过夜；
(3.2.8)PBST清洗后染二抗室温1小时；
(3.2.9)PBST清洗后加入DAPI染细胞核，室温15分钟；
(3.2.10)PBST清洗后封片观察类器官分化情况；在38天神经元标志性蛋白Ctip2大量表达，即大量神经元形成。
所述步骤(3.3)进一步包括：
(3.3.1)取第42天类器官，用PBS清洗三遍；
(3.3.2)将类器官在4％的福尔马林中室温固定30分钟～1小时；
(3.3.3)类器官用PBS洗三遍，放在30％蔗糖溶液中过夜4℃脱水；
(3.3.4)将类器官包埋在组织冷冻剂中冷冻后切片；
(3.3.5)将贴好的片子用PBS洗干净组织冷冻剂；
(3.3.6)0.2％的曲拉通-X(Triton-X)溶解在PBS进行通透，室温1小时；
(3.3.7)10％的驴血清溶解在0.1％吐温-20(Tween-20)PBST中进行封闭，室温30分钟；
(3.3.8)一抗用Mouse anti-Aβ(6E10)用来染Aβ，一抗溶解在封闭液中，4℃过夜；
(3.3.9)PBST清洗后染二抗室温1小时；
(3.3.10)PBST清洗后加入DAPI染细胞核，室温15分钟；
(3.3.11)PBST清洗后封片观察阿尔茨海默病中Aβ病理变化；在阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型发现Aβ大量沉积。
本发明的另一技术解决方案是所述阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的构建方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
⑴建立胚胎干细胞过表达β-淀粉样蛋白(Aβ)细胞系；
(1.1)构建淀粉样β前体蛋白(APP)突变慢病毒表达载体质粒；
(1.2)包装淀粉样β前体蛋白(APP)突变慢病毒；
(1.3)构建稳转淀粉样β前体蛋白(APP)过表达胚胎干细胞单克隆细胞系；
⑵建立阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型(AD organoid疾病模型)；
(2.1)构建淀粉样β前体蛋白(APP)突变的阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型。
本发明的再一技术解决方案是所述阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的检测方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
⑶分析疾病模型理化指标的变化，以确定是否成功培育出阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型；
(3.1)免疫印迹法分析类器官中淀粉样β前体蛋白(APP)的表达量；
(3.2)冰冻切片免疫荧光法分析阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型分化状况；
(3.3)冰冻切片免疫荧光法分析阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的病理变化。
与现有技术相比，本发明的有益效果:
⑴本发明在人源胚胎干细胞中利用慢病毒表达系统稳定转入Swedish(KM670/671NL)，Arctic(E693G)，Beyreuther/Iberian(I716F)三种来源于不同AD病人APP突变基因，建立了胚胎干细胞过表达β-淀粉样蛋白细胞系。这三种APP基因突变(APPSAB)在之前的已发表的小鼠AD模型中和我们实验室之前AD大鼠模型中已经得到确认，都展现了比之前动物模型更接近人AD患者疾病的病理表型。
⑵本发明利用已建立的胚胎干细胞过表达β-淀粉样蛋白细胞系和类器官生物反应器培育出阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型。该模型填补了目前国内在类器官尤其是大脑各脑区特异性的类器官研究的空白。
⑶本发明的阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型具有三维结构，相比二维细胞，可以更好地反应真实的疾病状况。
⑷本发明的阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型制造成本低，可以在12孔细胞培养板上培养，均一性好，能进行规模化的筛选。
⑸本发明的阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型可进行阿尔茨海默症的疾病机制研究，也可以更有效、更便捷以及更高效筛选新的阿尔茨海默症药物。
附图说明
图1是本发明三种突变引入APP770的序列示意图，其中红色标注的碱基分别是所引入的Swedish，Arctic，Beyreuther/Iberian三种APP突变位点(原GA突变成TC，原A突变成G，原A突变成T)；
图2是本发明三种突变引入APP770慢病毒载体测序结果示意图；
图3是本发明免疫印迹法检测淀粉样β前体蛋白(APP)在稳转APP过表达的单克隆细胞系的表达结果示意图，其中E4、H3、H4这三株细胞克隆APP蛋白表达量升高；
图4是本发明在显微镜下观察APP三点突变h9分化而来的类器官培养到第5天、第14天、第71天的形态示意图；其中图A为第5天时在显微镜下观察到的拟胚体，健康的EBs是圆形并且表面光滑，边缘相对透明；图B为第14天显微镜下观察到的拟胚体，每个会分化成一簇类似神经管的神经上皮芽，每个上皮芽形成类似神经管样的结构，神经上皮芽光镜下呈半透明状，表面光滑；神经上皮芽向神经方向分化，大脑皮层类器官越长越大；图C为第71天时在显微镜下观察到的阿尔茨海默病大脑类器官，组织可以到达2mm左右的大小(标尺为200μm)，表面透光性差；
图5是本发明免疫印迹法检测淀粉样β前体蛋白(APP)在正常h9分化的类器官与阿尔茨海默病大脑类器官的表达量结果，结果显示E4这株细胞克隆APP表达量升高；
图6是本发明冰冻切片免疫荧光法检测Ctip2在阿尔茨海默病大脑类器官的表达情况示意图，免疫荧光染色在第38天时，可以看到类器官中有大量神经元(Ctip2，红色荧光标记)形成；
图7是本发明冰冻切片免疫荧光法检测阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的Aβ沉积情况示意图，绿色荧光标记为Aβ沉积，结果表明Aβ大量沉积；
图8是图7的局部放大图。
具体实施方式
本发明下面将结合附图作进一步详述：
该阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的构建方法，包括以下步骤：
1、建立胚胎干细胞过表达β-淀粉样蛋白细胞系；
1.1构建淀粉样β前体蛋白(APP)突变慢病毒表达载体质粒：
请参阅图1和图2所示，⑴采用770个氨基酸的人淀粉样β前体蛋白(APP)cDNA序列作为构建突变质粒的模板；野生型的APP770 cDNA通过聚合酶链式反应法(PCR)扩增出来；
⑴纯化PCR产物
⑵再将纯化后的PCR产物采用一步法无缝克隆技术克隆到慢病毒表达载体中，慢病毒采用hPGK启动子表达APP；
⑶利用重叠PCR和无缝克隆技术的方法将三种来源不同阿尔茨海默病病人的APP突变位点引入到APP770野生型慢病毒表达载体中；这三种突变位点分别是：Swedish(KM670/671NL),Arctic(E693G)，Beyreuther/Iberian(I716F)；Swedish(KM670/671NL)突变位点由原来的GA突变成TC，Arctic(E693G)突变位点由原来的A突变成G，Swedish(KM670/671NL)突变位点由原来的A突变成T，请参阅图1；
⑷通过测序验证上述三种突变引入APP770慢病毒载体中，请参阅图2；
1.2包装淀粉样β前体蛋白(APP)突变慢病毒：
⑴采用三质粒系统在293T细胞中进行包装，用lippo2000作为转染试剂，将表达载体和辅助质粒共转染293T细胞；6小时后换成新鲜的完全培养基，48小时后收取培养上清；
⑵对病毒进行浓缩处理，将3体积的上清与1体积的40％PEG800(W/V)、1.4M NaclPBS溶液混匀，60转摇床4℃混匀4小时，4℃离心机1600xg离心60分钟,最后将沉淀中的病毒颗粒重新混悬在PBS缓冲液中；
1.3构建稳转淀粉样β前体蛋白(APP)过表达胚胎干细胞单克隆细胞系：
请参阅图3所示，⑴在基质胶(matrigel)上用mTeSR培养基培养胚胎干细胞细胞系h9；
⑵将浓缩后的病毒感染h9，12小时后换液，先用PBS冲洗感染后的细胞三遍，最后换成mTeSR培养基继续培养；
⑶h9细胞系大约在4-5天的时候进行传代，采用有限稀释法将感染后的h9进行单克隆培养；
⑷用DNA快速提取液(Quick Extract DNA Extraction Solution1.0)试剂对感染后的胚胎干细胞系进行高通量基因组提取：用PBS清洗细胞，然后用消化液消化，再用100μLPBS重悬细胞，将10μL的重悬细胞液加入到50μLQuick Extract DNA Extraction Solution1.0中，混匀；65℃30分钟,混匀，98℃15分钟；
⑸混匀后的样品可以直接用来作为DNA模板，在APP三个突变前后设计引物，PCR用来测序，筛选出含有三种APP基因突变的稳转APP过表达的单克隆细胞系；
⑹将筛选出来的不同株单克隆细胞进行细胞裂解提取蛋白用免疫印迹法(western blot)对APP蛋白的表达进行验证，其中E4、H3、H4这三株细胞克隆APP表达量明显升高，请参阅图3所示；表明本发明成功构建了胚胎干细胞过表达β-淀粉样蛋白(Aβ)细胞系；选取E4这株稳转APP过表达胚胎干细胞单克隆细胞系进行分化培养；
请参阅图4所示，2、建立阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型；
2.1构建淀粉样β前体蛋白(APP)突变的阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型：
⑴将在基质胶(matrigel)上培养的含淀粉样β前体蛋白(APP)突变的胚胎干细胞，转移到MEF培养条件下培养，传代两次以上待胚胎干细胞状态调整好后，用来向类大脑皮层方向分化；
⑵培养在六孔细胞培养板上的胚胎干细胞克隆长到1.5mm的时候，去除培养基加入1mL1mg/mL的胶原酶(collagenase)消化细胞；细胞培养箱中培养45～60分钟，记为0天；
⑶当消化后的克隆漂浮起来后，加入1mL人子宫内膜间质细胞系(hESC)培养基并用10mL移液管转移到15mL离心管中，静置两分钟后克隆会沉到离心管底部；
⑷将上清吸走后温和的加入5mL hESC培养基进行清洗，静置两分钟；
⑸再将上清吸走，加入培养基Ⅰ1mL；
⑹准备新的无吸附处理的六孔细胞培养板并加入培养基Ⅰ3mL
⑺提前准备的1mL枪头头部用剪刀剪掉，使枪头口直径大于3mm以防止破坏克隆，并进行高温高压灭菌处理，用所述枪头将消化清洗后的克隆转移到步骤⑹中的六孔细胞培养板中培养形成拟胚体(Embryoid bodies，EBs),每孔中形成30～50拟胚体；
⑻将步骤⑺处理后的细胞放回细胞培养箱培养24小时待形成拟胚体；
⑼在1天,换成新鲜的培养基Ⅰ,去除未形成拟胚体的细胞，重新放回培养箱培养；
⑽在3天和4天换成新鲜的培养基Ⅰ；
⑾在5天和6天吸出培养基1mL，并在所述培养基中加入培养基Ⅱ1.5mL，让拟胚体在两种培养基中逐渐过渡；
⑿第5天在显微镜下观察拟胚体，健康的拟胚体是圆形并且表面光滑，边缘相对透明，请参阅图4的第一张图；
⒀将200μL枪头剪口，口径在1.5～2mm之间，然后进行高温高压灭菌处理；
⒁用5mL移液管将拟胚体放入15mL移液管中，静置，将上清去除，再加入1mL培养基Ⅱ清洗一次拟胚体；
⒂用步骤⒀中准备好的枪头将20～30个拟胚体重悬到67μL培养基Ⅱ中；
⒃将100μL基质胶加入到步骤⒂中的拟胚体中，然后用剪了口的枪头将基质胶和培养基混匀，加入到新的低吸附的六孔细胞培养板中，放到37℃培养箱中30分钟,让基质胶凝固；
⒄加入3mL的培养基Ⅱ在凝固后的包裹拟胚体的基质胶中；
⒅在9天、11天和13天换取新鲜的培养基，中途不能破坏基质胶；
⒆第14天在显微镜下观察，每个拟胚体分化成一簇类似神经管的神经上皮芽，神经上皮光镜下呈半透明状，表面光滑，请参阅图4的第二张图；
⒇第14天,用5mL移液管将分化后的类器官从基质胶上吹打下来，用培养基清洗几次，去除基质胶和状态不好的类器官；
(21)将分离后的类器官放入低吸附12孔细胞培养板中，加入培养基Ⅲ在类器官生物反应器中培养。将直流电机调到7.5V,此时旋转速度大约在100转；培养过程中，类器官生物反应器由一个马达带动12个齿轮旋转，齿轮带动一个类似螺旋桨的装置旋转，有利于阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型接触到营养物质和氧气；
(22)每两天换入新鲜的培养基Ⅲ；在70天的时候换成培养基Ⅳ,每两天换液，最多可以培养到200多天。71天时，阿尔茨海默病大脑类器官神经上皮芽向神经方向分化，大脑皮层类器官越长越大，在显微镜下观察到组织可以到达2mm左右的大小(标尺为200μm)，表面透光性差，请参阅图4的第三张图；
细胞培养过程中要根据细胞的状态以及实验目的和结果在不同培养阶段对培养基的成分进行调整，步骤(2.1.9)、步骤(2.1.10)、步骤(2.1.11)、步骤(2.1.14)、步骤(2.1.15)、步骤(2.1.22)中所用的培养基Ⅰ、培养基Ⅱ、培养基Ⅲ、培养基Ⅳ成分分别如下：
培养基Ⅰ 培养基Ⅱ 培养基Ⅲ 培养基Ⅳ
DMEM/F12 DMEM/F12 DMEM/F12 Neurobasal
20％KOSR 20％KOSR 1×N2supplement 1×B27supplement
1×GlutaMAX 1×GlutaMAX 1×B27supplement 1×GlutaMAX
1×MEM-NEAA 1×MEM-NEAA 1×GlutaMAX 1×MEM-NEAA
1×2-Mercaptoethanol 1×2-Mercaptoethanol 1×MEM-NEAA Pen/Strep
Pen/Strep Pen/Strep 1×2-Mercaptoethanol Ascorbicacid,0.2mM
Dorsomorphin,2μM CHIR-99021,1μM Pen/Strep cAMP,0.5mM
A-83,2μM SB-431542,1μM InsμLin,2.5μg/mL BDNF,20ng/mL
GDNF,20ng/mL
3.分析疾病模型理化指标的变化，以确定是否成功培育出阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型；
3.1免疫印迹法分析类器官中APP蛋白的表达量：
请参阅图5所示，类器官在分化第28天左右出现神经元的分化，在41天的时候取出2～3个类器官进行裂解提取蛋白，经蛋白定量后，利用免疫印迹法对阿尔茨海默病大脑类器官与正常h9分化的类器官淀粉样β前体蛋白(APP)表达量进行分析，结果APP三点突变h9分化而来的类器官APP表达量大量增加；
3.2冰冻切片免疫荧光法分析阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型分化状况：
请参阅图6所示，⑴将类器官在4％的福尔马林中室温固定30分钟～1小时；
⑵类器官PBS洗三遍，放在30％蔗糖溶液中过夜4℃脱水；
⑶将类器官包埋在组织冷冻剂中冷冻后切片；
⑷PBS洗干净组织冷冻剂；
⑸0.2％的曲拉通-X(Triton-X)溶解在PBS进行通透，室温1小时；
⑹10％的驴血清溶解在0.1％吐温-20(Tween-20)PBST中进行封闭，室温30分钟；
⑺Anti-sox2用来染神经干细胞，Anti-Ctip2染分化后的神经元，一抗溶解在封闭液中，4℃过夜；
⑻PBST清洗后染二抗室温1小时，PBST清洗后加入DAPI染细胞核，室温15分钟；
⑼PBST清洗后封片观察类器官分化情况；在38天神经元标志蛋白Ctip2大量表达，表明大量神经元形成；
3.3冰冻切片免疫荧光法分析阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的病理变化。
请参阅图7、8所示，⑴取第42天类器官，用PBS清洗三遍；
(2)将类器官在4％的福尔马林中室温固定30分钟～1小时；
(3)类器官用PBS洗三遍，放在30％蔗糖溶液中过夜4℃脱水；
(4)将类器官包埋在组织冷冻剂中冷冻后切片；
(5)将贴好的片子用PBS洗干净组织冷冻剂；
(6)0.2％的曲拉通-X(Triton-X)溶解在PBS进行通透，室温1小时；
(7)10％的驴血清溶解在0.1％吐温-20(Tween-20)PBST中进行封闭，室温30分钟；
(8)一抗用Mouseanti-Aβ(6E10)用来染Aβ，一抗溶解在封闭液中，4℃过夜；
(9)PBST清洗后染二抗室温1小时；
(10)PBST清洗后加入DAPI染细胞核，室温15分钟；
(11)PBST清洗后封片观察阿尔茨海默病中Aβ病理变化，结果如图7和图8所示，在阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型发现Aβ大量沉积(绿色荧光标志)；
4、成功培育出了AD类器官疾病模型。
所述类器官生物反应器包括设置12孔的细胞培养板盖子，所述12孔内嵌设旋转组件，所述旋转组件由旋转轴、旋转轴底部径向延设的旋转桨、旋转桨顶部的旋转轴上径向延设的支架，旋转轴顶部套装的齿轮组成；位于细胞培养板盖子12孔陈列中的细胞培养板盖子上还设有电机孔，12孔陈列中延伸出所述12孔外的各齿轮相互啮合，所述电机的输出轴安装的齿轮与12孔陈列中的一个齿轮啮合；工作时，电机带动12孔陈列中的每个齿轮以相同的速度带动旋转桨旋转，螺旋桨部分与细胞培养物接触，将分离后的类器官放入低吸附12孔细胞孔板中，加入培养基Ⅲ放在类器官生物反应器中培养；将直流电机调到7.5V,此时旋转速度大约在100转；培养过程中，类器官生物反应器由所述直流电机带动12个齿轮旋转，齿轮带动螺旋轴螺旋桨旋转，有利于阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型接触到营养物质和氧气。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明权利要求的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
⑴建立胚胎干细胞过表达β-淀粉样蛋白细胞系；
(1.1)构建淀粉样β前体蛋白(APP)突变慢病毒表达载体质粒；
(1.2)包装淀粉样β前体蛋白(APP)突变慢病毒；
(1.3)构建稳转淀粉样β前体蛋白(APP)过表达胚胎干细胞单克隆细胞系；
⑵建立阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型(AD organoid疾病模型)；
(2.1)构建淀粉样β前体蛋白(APP)突变的阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型；
⑶分析疾病模型理化指标的变化；
(3.1)免疫印迹法分析类器官中淀粉样β前体蛋白(APP)的表达量；
(3.2)冰冻切片免疫荧光法分析阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型分化状况；
(3.3)冰冻切片免疫荧光法分析阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的病理变化。
2.根据权利要求1所述阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(1.1)进一步包括：
(1.1.1)采用770个氨基酸的人淀粉样β前体蛋白(APP)cDNA序列作为构建突变质粒的模板,通过聚合酶链式反应法(PCR)将野生型的APP770 cDNA扩增出来；
(1.1.2)纯化PCR产物；
(1.1.3)再将纯化后的PCR产物采用一步法无缝克隆技术克隆到慢病毒表达载体中，慢病毒采用hPGK启动子表达APP；
(1.1.4)利用重叠PCR和无缝克隆技术的方法将三种来源不同阿尔茨海默病病人的APP突变位点引入到APP770野生型慢病毒表达载体中；这三种突变位点分别是：Swedish(KM670/671NL),Arctic(E693G)，Beyreuther/Iberian(I716F)；
(1.1.5)通过测序验证上述三种突变引入APP770慢病毒载体中；
所述步骤(1.2)进一步包括：
(1.2.1)采用三质粒系统在293T细胞中进行包装，用lippo2000作为转染试剂，将表达载体和辅助质粒共转染293T细胞；6小时后换成新鲜的完全培养基，48小时后收取培养上清；
(1.2.2)对病毒进行浓缩处理，将3体积的上清与1体积的40％PEG800(W/V)、1.4M NaclPBS溶液混匀，60转摇床4℃混匀4小时，4℃离心机1600xg离心60分钟,最后将沉淀中的病毒颗粒重新混悬在PBS缓冲液中；
所述步骤(1.3)进一步包括：
(1.3.1)在基质胶(matrigel)上用mTeSR培养基培养胚胎干细胞细胞系h9；
(1.3.2)将浓缩后的病毒感染h9，12小时后换液，先用PBS冲洗感染后的细胞三遍，最后换成mTeSR培养基继续培养；
(1.3.3)大约在4～5天的时候对h9细胞系进行传代，采用有限稀释法将感染后的h9进行单克隆培养；
(1.3.4)用DNA快速提取液(Quick Extract DNA Extraction Solution 1.0)试剂对感染后的胚胎干细胞系进行高通量基因组提取：用PBS清洗细胞，然后用消化液消化，最后用100μL PBS重悬细胞，将10μL的重悬细胞液加入到50μL Quick Extract DNA ExtractionSolution 1.0中，混匀；65℃30分钟,混匀，98℃15分钟；
(1.3.5)混匀后的样品可以直接用来作为DNA模板，在APP三个突变前后设计引物，PCR用来测序，筛选出含有三种APP基因突变的稳转APP过表达的单克隆细胞系；
(1.3.6)将筛选出来的不同株单克隆细胞进行细胞裂解提取蛋白，通过免疫印迹法(western blot)对APP蛋白的表达量进行验证，获得胚胎干细胞过表达β-淀粉样蛋白细胞系；然后选取E4这株稳转APP过表达胚胎干细胞单克隆细胞系进行分化培养。
3.根据权利要求1所述阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(2.1)进一步包括：
(2.1.1)将在基质胶(matrigel)上培养的含淀粉样β前体蛋白(APP)突变的胚胎干细胞，转移到MEF培养条件下培养，传代两次以上待胚胎干细胞状态调整好后，用来向类大脑皮层方向分化；
(2.1.2)当培养在六孔细胞培养板上的胚胎干细胞克隆长到1.5mm的时候，去除培养基加入1mL1mg/mL的胶原酶(collagenase)消化细胞；细胞培养箱中培养45～60分钟，记为0天；
(2.1.3)当消化后的克隆漂浮起来后，加入1mL人子宫内膜间质细胞系(hESC)培养基并用10mL移液管转移到15mL离心管中，静置两分钟后克隆会沉到离心管底部；
(2.1.4)将上清吸走后温和的加入5mL hESC培养基进行清洗，静置两分钟；
(2.1.5)再将上清吸走，加入培养基Ⅰ1mL；
(2.1.6)准备新的无吸附处理的六孔细胞培养板并加入培养基Ⅰ3mL；
(2.1.7)提前准备的1mL枪头头部用剪刀剪掉，使枪头口直径大于3mm以防止破坏克隆，并进行高温高压灭菌处理，用所述枪头将消化清洗后的克隆转移到步骤(2.1.6)中的六孔细胞培养板中培养形成拟胚体(Embryoid bodies，EBs),每孔中形成30～50个拟胚体；
(2.1.8)将步骤(2.1.7)处理后的细胞放回细胞培养箱中培养24小时待形成拟胚体；
(2.1.9)在第1天,换成新鲜的培养基Ⅰ,去除未形成拟胚体的细胞，重新放回培养箱培养；
(2.1.10)在第3天和第4天换成新鲜的培养基Ⅰ；
(2.1.11)在第5天和第6天吸出培养基1mL，并在所述培养基中加入培养基Ⅱ1.5mL，让拟胚体在两种培养基中逐渐过渡；
(2.1.12)第5天在显微镜下观察拟胚体，健康的拟胚体是圆形并且表面光滑，边缘相对透明；
(2.1.13)将200μL枪头剪口，口径在1.5～2mm之间，然后进行高温、高压灭菌处理；
(2.1.14)用5mL移液管将拟胚体放入15mL移液管中，静置，将上清去除，再加入1mL培养基Ⅱ清洗一次拟胚体；
(2.1.15)用步骤(2.2.13)中准备好的枪头，将20～30个拟胚体重悬到67μL培养基Ⅱ中；
(2.1.16)将100μL基质胶加入到步骤(2.2.15)中的拟胚体中，然后用剪了口的枪头将基质胶和培养基混匀，加入到新的低吸附的六孔细胞培养板中，放到37℃培养箱中30分钟,让基质胶凝固；
(2.1.17)加入3mL的培养基Ⅱ在凝固后的包裹拟胚体的基质胶中；
(2.1.18)在第9天、第11天和第13天换取新鲜的培养基，中途不能破坏基质胶；
(2.1.19)第14天在显微镜下观察，每个拟胚体会分化成一簇类似神经管的神经上皮芽，神经上皮光镜下呈半透明状，表面光滑；
(2.1.20)第14天,用5mL移液管将分化后的类器官从基质胶上吹打下来，用培养基清洗几次，去除基质胶和状态不好的类器官；
(2.1.21)将分离后的类器官放入低吸附12孔细胞培养板中，加入培养基Ⅲ放在类器官生物反应器中培养；将直流电机调到7.5V,此时旋转速度大约在100转；培养过程中，类器官生物反应器由一个马达带动12个齿轮旋转，齿轮带动一个类似螺旋桨的装置旋转，有利于阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型接触到营养物质和氧气；
(2.1.22)每两天换入新鲜的培养基Ⅲ；在70天的时候换成培养基Ⅳ,每两天换液，最多可以培养到200多天；第71天时，阿尔茨海默病大脑类器官神经上皮芽向神经方向分化，大脑皮层类器官越长越大，在显微镜下观察到组织到达2mm左右的大小(标尺为200μm)，表面透光性差；
(2.1.23)细胞培养过程中，根据细胞的状态、实验目的和结果在不同培养阶段对培养基的成分进行调整，步骤(2.1.9)、步骤(2.1.10)、步骤(2.1.11)、步骤(2.1.14)、步骤(2.1.15)、步骤(2.1.22)中所用的培养基Ⅰ、培养基Ⅱ、培养基Ⅲ、培养基Ⅳ成分分别如下：
培养基Ⅰ 培养基Ⅱ 培养基Ⅲ 培养基Ⅳ DMEM/F12 DMEM/F12 DMEM/F12 Neurobasal 20％KOSR 20％KOSR 1×N2supplement 1×B27supplement 1×GlutaMAX 1×GlutaMAX 1×B27supplement 1×GlutaMAX 1×MEM-NEAA 1×MEM-NEAA 1×GlutaMAX 1×MEM-NEAA 1×2-Mercaptoethanol 1×2-Mercaptoethanol 1×MEM-NEAA Pen/Strep Pen/Strep Pen/Strep 1×2-Mercaptoethanol Ascorbicacid,0.2mM Dorsomorphin,2μM CHIR-99021,1μM Pen/Strep cAMP,0.5mM A-83,2μM SB-431542,1μM InsμLin,2.5μg/mL BDNF,20ng/mL GDNF,20ng/mL
4.根据权利要求1所述阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(3.1)进一步包括：
(3.1.1)在41天的时候取出2～3个类器官进行裂解提取蛋白，并进行蛋白定量；
(3.1.2)利用免疫印迹法对阿尔茨海默病大脑类器官与正常h9分化的类器官淀粉样β前体蛋白(APP)表达量进行分析；
所述步骤(3.2)进一步包括：
(3.2.1)将类器官在4％的福尔马林中室温固定30分钟～1小时；
(3.2.2)类器官用PBS洗三遍，放在30％蔗糖溶液中过夜4℃脱水；
(3.2.3)将类器官包埋在组织冷冻剂中冷冻后切片；
(3.2.4)PBS洗干净组织冷冻剂；
(3.2.5)0.2％的曲拉通-X(Triton-X)溶解在PBS进行通透,室温1小时；
(3.2.6)10％的驴血清溶解在0.1％吐温-20(Tween-20)PBST中进行封闭，室温30分钟；
(3.2.7)Anti-sox2用来染神经干细胞，Anti-Ctip2染分化后的神经元，一抗溶解在封闭液中，4℃过夜；
(3.2.8)PBST清洗后染二抗,室温1小时；
(3.2.9)PBST清洗后加入DAPI染细胞核，室温15分钟；
(3.2.10)PBST清洗后封片观察类器官分化情况；在38天神经元标志性蛋白Ctip2大量表达，即大量神经元形成；
所述步骤(3.3)进一步包括：
(3.3.1)取第42天类器官，用PBS清洗三遍；
(3.3.2)将类器官在4％的福尔马林中室温固定30分钟～1小时；
(3.3.3)类器官用PBS洗三遍，放在30％蔗糖溶液中过夜4℃脱水；
(3.3.4)将类器官包埋在组织冷冻剂中冷冻后切片；
(3.3.5)将贴好的片子用PBS洗干净组织冷冻剂；
(3.3.6)0.2％的曲拉通-X(Triton-X)溶解在PBS进行通透,室温1小时；
(3.3.7)10％的驴血清溶解在0.1％吐温-20(Tween-20)PBST中进行封闭，室温30分钟；
(3.3.8)一抗用Mouse anti-Aβ(6E10)用来染Aβ，一抗溶解在封闭液中，4℃过夜；
(3.3.9)PBST清洗后染二抗室温1小时；
(3.3.10)PBST清洗后加入DAPI染细胞核，室温15分钟；
(3.3.11)PBST清洗后封片观察阿尔茨海默病中Aβ病理变化；在阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型发现Aβ大量沉积。
5.一种胚胎干细胞过表达β-淀粉样蛋白细胞系，其特征在于，包括以下步骤：
⑴建立胚胎干细胞过表达β-淀粉样蛋白细胞系；
(1.1)构建淀粉样β前体蛋白(APP)突变慢病毒表达载体质粒；
(1.2)包装淀粉样β前体蛋白(APP)突变慢病毒；
(1.3)构建稳转淀粉样β前体蛋白(APP)过表达胚胎干细胞单克隆细胞系。
6.一种阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
⑴建立胚胎干细胞过表达β-淀粉样蛋白细胞系；
(1.1)构建淀粉样β前体蛋白(APP)突变慢病毒表达载体质粒；
(1.2)包装淀粉样β前体蛋白(APP)突变慢病毒；
(1.3)构建稳转淀粉样β前体蛋白(APP)过表达胚胎干细胞单克隆细胞系；
⑵建立阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型(AD organoid疾病模型)；
(2.1)构建淀粉样β前体蛋白(APP)突变的阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型。
7.一种阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
⑶分析疾病模型理化指标的变化，以确定是否成功培育出阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型；
(3.1)免疫印迹法分析类器官中淀粉样β前体蛋白(APP)的表达量；
(3.2)冰冻切片免疫荧光法分析阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型分化状况；
(3.3)冰冻切片免疫荧光法分析阿尔茨海默病大脑类器官疾病模型的病理变化。
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