CN86100747A - 专门测定胰α-淀粉酶的方法和试剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在有唾液α-淀粉酶的体液中，特别是血清，血浆，十二指肠液和尿中专门测定胰α-淀粉酶的方法，在有与唾液α-淀粉酶反应的单克隆抗体存在时与用于检测α-淀粉酶的系统反应，其中所用的单克隆抗体专门抑制唾液酶但对胰酶的抑制不超过50％。以及用于在有唾液α-淀粉酶存在的体液，特别是血清，血浆，十二指肠液和尿中专门测定胰α-淀粉酶的试剂，它包括检测α-淀粉酶的系统和唾液α-淀粉酶的单克隆抗体，其中含有的单克隆抗体专门抑制唾液酶但对胰酶的抑制不超过50％。

Description

本发明涉及一种在有唾液α-淀粉酶存在时，专门测定胰α-淀粉酶的方法和试剂。

α-淀粉酶（E.C3.2.1.1）在打开1，4-α-糖苷连接的寡糖和多糖时，主要是随机地水解1，4-α-糖苷键，生成麦芽糖和麦芽-寡糖。除了酶在工业发酵技术中的用途以外，酶在临床分析和诊断领域中也被认为是很重要的。因此，在某些疾病中，α-淀粉酶在体液中的含量，例如在血清，尿和十二指肠分泌物中的含量，会有相当的改变。然而，在体内事实上存在有两种α-淀粉酶，即胰酶和唾液酶。因为只有胰酶在诊断中具有重要性，所以存在着的分析性的任务是，在有其它不常见并以小量存在的酶存在时，区分这两种α-淀粉酶。困难的是，这两种多重形式具有相似的结构并且在免疫学上也相同（见K.Lorentz，Laborat    or    iumsblatter，32，118/1982）。为了消除唾液酶的活性，已知可使用阴离子交换剂吸附，麦蛋白抑制，电泳或电聚焦的方法。但是这些方法，要么是其分离作用不能令人满意，要么就是对常规诊断来讲太实验室化了。在以上所述及的方法中，对常规诊断来讲尚可接受的方法是描述于Clin.Chem.28/7，1525-1527/1982，它用从麦胚中获取的抑制剂抑制唾液型酶，但耗费时间，并且选择性也不能令人满意。甚至在最佳的抑制剂浓度时，仍保留了13%的唾液型酶活性，而胰酶的活性则被减少到81%。

在已有的，尚未公开的第84114172.4号欧洲专利申请中，已经提出了这样的建议，即在有对唾液α-淀粉酶起反应并显示出对胰α-淀粉酶的交叉反应活性为5%或更低的单克隆抗体存在时，在有唾液α-淀粉酶存在的情况下测定胰α-淀粉酶。用这种单克隆抗体，就可以在加入银沉淀剂的情况下，与唾液α-淀粉酶形成可从溶液中分离出的不溶性复合物，因此仅使胰酶保留在溶液中并且被测定。此外，用固定化形式的单克隆抗体也能分离唾液淀粉酶。但是，在这两种情况下，均需形成不溶性相并将其与可溶相分离开来。

因而，本发明的目的是克服这些缺点，并提供一种方法和试剂，从而可能在体液中，当有唾液型的α-淀粉酶存在时，不用进行这里所必须的相分离，就能快速，简便并可靠地测定胰α-淀粉酶。

这样，根据本发明，就提供了在有唾液α-淀粉酶存在的体液中，特别是在血清，血浆，十二指肠液和尿中测定胰α-淀粉酶的方法，即使用存在有单克隆抗体时检测α-淀粉酶的系统，其与唾液α-淀粉酶反应，其中所用的是专门抑制唾液酶并对胰酶的抑制不会高于50%的单克隆抗体。

本发明的方法是建立在对抑制唾液酶而并不抑制胰酶的单克隆抗体这一令人惊奇的发现之上。这一点在以往是没有料想到的，因为已知唾液酶和胰酶在免疫学上相同（见Gerhard    Pfleiderer，Lab.Med.，I，189-193，K.Lorentz，loc.cit.）。M.K.Schwarz在“Immunoassay    of    Enzymes-an    Overview”pp.4-9，1983，中述及，抗唾液α-淀粉酶的抗体对唾液型酶的抑制达78%并对胰型酶抑制达75%。因此，以往无法预见到可以创出这样的单克隆抗体，即由于选择性地，高度特异性地抑制从而可能实际上定量地区别这两种酶的单克隆抗体。用优选的抗体则获得了对唾液酶抑制达95%或更高的结果。

本发明的方法中所用的新型单克隆抗体已经储存于NCACC储存号为（99    D12）84122003和（89    E2）84122004（National    Collection    of    Animal    Cell    Cultures，Porton    Down，Great    Britain）。

根据本发明，所述的抗体可以这样获得，即用天然的或修饰过的唾液α-淀粉酶对实验动物进行免疫，用转化剂对所获的免疫动物进行B淋巴细胞融合，再对所获的能产生单克隆抗体的杂交细胞克隆化并培养，然后再从培养物中将其分离出来。特别适合用来生产唾液α-淀粉酶抗体的动物是大鼠和小鼠。免疫可用天然的或修饰过的人唾液α-淀粉酶。如果用天然的酶，就可以使用商品化的，电泳性为均质性的制剂。化学修饰的唾液α-淀粉酶可用已知的酶修饰方法获得，例如，详见联邦德国专利申请第2543994号。适宜的修饰剂包括有，例如，蛋白上的色氨酸基被氧化的N-溴代琥珀酰亚胺（NBS），（BBA，143，462-472/1967），被碘乙酸（IAA）羧甲基化，其主要作用于组氨酸，或用四硝基甲烷（TNM）硝化（J.Biol.Chem.238，3307/1963），以及用重氮化苯磺酸的重氮化（Meth.Enzymel.，25，515-531/1972）。当用Balb/c小鼠时，已证明使用被RNM修饰的酶最为适宜，而当使用AJ小鼠时，以使用天然的酶最好。

免疫按常规使用天然的或修饰的酶进行，但优选的是与佐剂相结合。作为佐剂，优先选用氢氧化铝，同时伴以百日咳博代氏杆菌（Bordetella    Pertusis）。

就免疫而言，当对AJ小鼠使用天然唾液α-淀粉酶，或对Balb/c小鼠使用TNM-修饰的唾液α-淀粉酶时，则免疫以历时9个月，其间至少进行7次免疫（腹膜内注射）为好。

免疫后，被免疫动物的B淋巴细胞用转化因素按照常规方法进行融合。本发明范围内可用的转化因素举例有，骨髓瘤细胞，转化病毒，例如Epstein-Barr病毒，或在联邦得国专利申请第3245665号中所述的转化因素。融合按Koehler和Milstein（Nature，256，495-497/1975）的已知方法进行。这样所形成的杂交细胞按常规方式克隆化，例如使用常规的细胞分类机，对所获的能产生预期单克隆抗体的克隆进行培养。由于杂交细胞的生长为类似癌细胞的生长类型，所以它们能被无限地培养，并取得任意所预期的产量。用这样所获的单克隆抗体，从体液中来的唾液α-淀粉酶可被定量地抑制，所以，剩下的淀粉酶活性均属胰α淀粉酶。

对本发明的测定方法而言，可以使用单克隆抗体本身，也可使用它们的显示出相应的免疫学性质的片段（Fc片段）。因而，“单克隆抗体”这一术语，也可理解为这些片段。不仅完整的抗体，而且它们的片段也可用固定化的形式。

令人惊奇地是，根据本发明所用的单克隆抗体，对胰α-淀粉酶的抑制为5%更低，在很多情况下，其抑制率为1%，甚至低于可测量的限度。因而，用其代替以前从麦胚中获取的已知抑制材料，或是上述专门测定体液中胰α-淀粉酶的在先专利申请中的结合性单克隆抗体，均为适宜的。

这样的对α-淀粉酶的测定是根据已知的这类方法进行。由于根据本发明的单克隆抗体选择性地抑制唾液型α-淀粉酶并且因此将其从酶活性测定中去除，所以在有单克隆抗体存在时，对α-淀粉酶的测定所获的数值就只是胰酶的活性。

根据本发明的方法，以配有检测α-淀粉酶的系统为好，该系统含有在分子中具4-7个葡萄糖残基的麦芽多糖麦芽糖磷酸化酶，β-磷酸葡糖变位酶，葡糖-6-磷酸脱氢酶和NAD。

本发明范围内另一优选的测定α-淀粉酶的系统，含有在分子中有4-7个葡糖残基的硝基苯基麦芽多糖的α-葡糖苷酶。

再者，优选的对α-淀粉酶的测定系统含有被可识别基团修饰的淀粉。术语“修饰的淀粉”包括，例如Pharmacia，Sweden的产品，其在“Phadebas”定名下是商品化的，还有联邦德国专利申请第2812154号中所述的产品，以及按淀粉断裂习性被修饰的淀粉，例如，羧甲基淀粉和边界糊精。所有这些系统约为已知的，因此也不用更详细地说明。

要进行根据本发明的方法，样品液最好用根据本发明的抗体培养，然后直接用于常规的淀粉酶测试中。培养的时间根据所用抗体的活性而定，并且以15～30分钟为好。

就对唾液α-淀粉酶的分离达到理象的程度而言，不仅可用完整形式的单克隆抗体，而且也可用其片段，以及固着于固体载体的形式，例如，固着于免疫吸附纸上或合成树脂软管或管子的表面。以这种方式，唾液型α-淀粉酶就联到载体上，即联于固相上。

也可用这样的单克隆抗体制剂，即由几种根据本发明的抑制性单克隆抗体混合而成，这些单克隆抗体由几种不同的克隆所产生。

本发明还提供了一种在有唾液α-淀粉酶存在时，于体液中，特别是血清，十二指肠液，血浆或尿浆中专门测定胰α-淀粉酶的试剂，其包括检测α-淀粉酶的系统和抗唾液α-淀粉酶的单克隆抗体，其中含有专门抑制唾液酶但对胰酶的抑制不超过50%（交叉反应活性≤50%）的单克隆抗体。

考虑到根据本发明的试剂中所含的检测α-淀粉酶的系统以及其它条件，则以上所述应同方法相应地结合起来使用。

本发明使得在有唾液型α-淀粉酶存在时，于体液中对胰α-淀粉酶进行简便，快速的测定成为可能，并且具有高度特异性，因此改善了临床诊断的可能性。

以下给出的实施例用于解释本发明：

A）用100微克人唾液淀粉酶存在于氢氧化铝中以及百日咳博代氏杆菌（Bordetella    Pertussis）对AJ小鼠免疫。以约8周为节律，对动物再进一步免疫叁或四次，每次使用存在于同样佐剂中的人唾液淀粉酶50微克。融合前节4天，进行最后一次免疫，用存在于生理盐水中的唾液淀粉酶50微克静脉注射。

B）用100微克人TNM-修饰的唾液淀粉酶存在于氢氧化铝中和百日咳博代氏杆菌（Bordelella    Pertussis）对Balb/c小鼠免疫。以约8周为节律，进一步免疫三或四次，每次用50微克存在于同样佐剂中的人TNM唾液淀粉酶。融合前4天，静脉内进行最后一次免疫，用50微克存在于生理盐水中的唾液淀粉酶。

C）腺细胞与Ag 8.653（ATCC CRL 1580）或SP2/0（ATCC CRL 1581）骨髓瘤细胞的融合，按在J.of Imm.Meth，39，285-308所述的标准方法进行。脾细胞与骨髓瘤细胞的融合比率为5∶1。融合产物接种于20-24个培养器（Costar）中，并给每个培养杯中喂以5×10⁴个腹膜渗出细胞。融合后3-4周，阳性初级培养物（见实施例3），在有荧光活化的细胞分类器的帮助下克隆化。各细胞以单个放入96-Costar板中，并喂以2×10⁴个腹膜渗出细胞。作为培养基，使用商品化的RPM I1640培养基并配以10%牛胎儿血清（描述于J.A.M.A，199，519/1957）。

实施例2

用四硝基甲烷（TNM）对α-淀粉酶的修饰

5.2毫克人唾液淀粉酶（Sigma）溶于1.6毫升tris缓冲液（90mMtris    HCl，1mM氯化钙，PH8.0）。在搅拌条件下，向其中加入10微升10%（v/v）四硝基甲烷（Roth）于无水乙醇中的溶液。混合物在室温条件下静置12小时。对上述缓冲液透析过夜将蛋白质从过量的四硝基甲烷中游离出来。在381毫微密处进行区别测定，表明每个α-淀粉酶分子有2.6个硝基。

实施例3

要对免疫小鼠血清中，或杂交细胞的培养上清液中或腹水中淀粉酶抑制抗体的浓度和特异性进行确定的话，使用了一种淀粉酶抑制试验作为筛选检测。

为此目的，在96-Elisa板（Nunc）中，放入50微升胰酶和存在于缓冲液（50mMtris，1%牛血清白蛋白，0，1M氯化钠，PH7.5）的唾液淀粉酶（约400mμ/ml），并用50微升用于检测的溶液（例如培养上清液）预温育20分钟。

然后，以50微升淀粉酶底物（4-硝基苯基麦芽庚糖苷，BoehringerMannheim    Gm6H，序列号568589）开始酶反应。在室温下约20-60分钟后，用光度计于405毫微米处测定差别（Elisa-Reader，Kontron，Switzerland）。

同样测定了以下的对照：

1.新鲜培养基（参见实施例1C）;

2.欧洲专利申请第84114172.4的克隆的培养上清液;

3.麦胚抑制子（欧洲专利申请第0079793），浓度2微克/毫升和0.2微克/毫升。

以下的结果得自上述试验：

抑制百分率（%）

克隆    麦胚抑制子    99D12    99Cl    88E8    89E2

79    2μg/ml    0.2μg/ml

唾液淀粉酶    0    75    40    58    .65    67    65

胰淀粉酶    0    17    6.2    1.8    4.6    0.5    0

在全部初级培养物的4%中，发现了特异性唾液淀粉酶抑制活性，其交叉反应活性低于10%。

实施例4

生产腹水和其活性的测定

对已用每次0.5毫升Pristan（Sigma，No.T7640）预处理过一次或二次的小鼠，静脉注射1-2×10⁶个杂交细胞（按实施例1生产）。大约15～20天后，每只小鼠取腹水3-5毫升，其中约含10mg·Ig G/ml。

用200微克/毫升的浓度，单克隆抗体89E2抑制人唾液α-淀粉酶（800mμ/ml）高于95%，但对胰α-淀粉酶的抑制低于2%（方法与实施例3中所述的类似）。

Claims (16)

1、专门测定胰α-淀粉酶的方法，在有唾液α-淀粉酶存在的体液中，特别是血清，血浆，十二指肠液或尿中，与用于检测α-淀粉酶的系统在有与唾液α-淀粉酶反应的单克隆存在时相反应，其中所用的单克隆抗体专门抑制唾液，但对胰酶的抑制不超过50%。

2、根据权利要求1所述的方法，其中所用的单克隆抗体，是用天然的或修饰过的唾液α-淀粉酶对AJ小鼠免疫，用转化剂对免疫过的动物进行B淋巴细胞融合，对所形成的杂交细胞克隆化并培养，再从培养物中分离单克隆而得到的。

3、根据权利要求1所述的方法，其中所用的单克隆抗体，是用被四硝基甲烷，N-溴代琥珀酰亚胺，碘乙酸或重氮化苯磺酸修饰过的唾液α-淀粉酶对Balb/c小鼠免疫，用转化剂对免疫过的动物进行B淋巴细胞融合，对这样形成的杂交细胞单克隆化并培养，再从培养物中分离而得到的单克隆抗体。

4、根据权利要求1所述的方法，其中所用的单克隆抗体是NCACC84122003号和NCACC第84122004号。

5、根据权利要求2或3所述的方法，其中进行免疫时，使用了氢氧化铝和百日咳博代氏杆菌（Bordetella  pertussis）作为佐剂。

6、根据权利要求2-5中任何一项所述的方法，其中以骨髓瘤细胞作为转化剂。

7、根据前述任何一个权项所述的方法，其中所用的单克隆抗体为固定化形式的。

8、根据前述任何一个权项所述的方法，其中所用的检测胰α-淀粉酶的系统包括，分子中有4-7个葡糖残基的麦芽多糖，麦芽糖磷酸化酶，β-磷酸葡糖变位酶，葡糖-6-磷酸脱氢酶和NAD。

9、根据权利要求1-7中任何一项所述的方法，其中所用的检测胰α-淀粉酶的系统包括，分子中有4-7个葡糖残基的硝基苯基麦芽多糖，同时还有α-葡糖苷酶。

10、根据权利要求1-7中任何一项所述的方法，其中所用的检测α-淀粉酶的系统包括，被可识别基团修饰的淀粉。

11、根据权利要求1所述的方法，在有唾液α-淀粉酶存在时测定胰α-淀粉酶，基本上如前所述和所举例。

12、用于在有唾液α-淀粉酶存在的体液中，特别是血清，血浆，十二指肠液或尿中专门测定胰α-淀粉酶的试剂，包括检测α-淀粉酶的系统和抗唾液α-淀粉酶的单克隆抗体，其中含有专门抑制唾液酶，但对胰酶的抑制不超过50%的单克隆抗体。

13、根据权利要求12所述的试剂，其中用于检测胰α-淀粉酶的系统包括，分子中含4-7个葡糖残基的麦芽多糖，麦芽糖磷酸化酶，β-磷酸葡糖变位酶，葡糖-6-磷酸脱氢酶和NAD。

14、根据权利要求12所述的试剂，其中用于检测胰α-淀粉酶的系统包括，分子中有4-7个葡糖残基的硝基苯基麦芽多糖和α-葡糖苷酶。

15、根据权利要求12所述的试剂，其中用于检测胰α-淀粉酶的系统包括被可识别基团修饰过的淀粉。

16、根据权利要求12所述的在有唾液α-淀粉酶存在的体液中测定胰α-淀粉酶的方法，基本如前述和所举例。