CN113278072B - 一种抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗体的制备方法。针对现有PD‑1抗体或PD‑L1抗体不能对PD‑1或PD‑L1已被识别的细胞进行再检测，灵敏度差、特异性一般等情况，本发明通过基因工程构建特异性抗原并使用杂交瘤技术筛选制备得PD‑1抗体和PD‑L1抗体。本发明制备的检测抗体空间位阻小、特异性强、灵敏度高、与抗癌药物不会竞争识别位点、对较低含量的PD‑1和PD‑L1也能够快速检测。

Description

一种抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及生物蛋白检测领域，具体涉及一种特异性单克隆抗体的制备方法。

背景技术

程序性细胞死亡蛋白1（PD-1），也称为CD279，是一种细胞表面受体，与其配体PD-L1相互作用抑制T细胞的活性。PD-1通过一种双重机制发挥其抑制作用，一方面促进淋巴结中的抗原特异性T细胞细胞凋亡，同时减少调节性T细胞的凋亡。通过这些机制，PD-1在外周耐受中发挥关键作用，并且可以预防自身免疫性疾病。但是经研究发现，在多种肿瘤细胞如肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和结肠癌上均有PD-L1的大量表达，PD-L1与T细胞上的PD-1结合，抑制T细胞的增殖活化，诱导肿瘤细胞的免疫逃逸。

目前抗PD-1和抗PD-L1疗法在临床开发过程中取得了令人鼓舞的结果。抗PD-1单抗与PD-1结合或者抗PD-L1单抗与PD-L1结合后抑制了PD-1与PD-L1的结合，从而解除了T细胞的抑制，起到抗肿瘤作用。Nivolumab、pembrolizumab等PD-1抑制剂和atezolizumab、durvalumab等PD-L1抑制剂被广泛应用于抗肿瘤治疗。然而在临床实践中，其实际功效仍然不够稳定且难以预测。对患者进行治疗后，由于细胞本身抗原抗体结合后空间位阻过大，现有PD-1抗体或PD-L1抗体不能对PD-1或PD-L1已被识别的细胞进行再识别检测，不利于病患治疗后的进一步观察，影响临床对患者的及时诊疗。因此，需要特异性更强，灵敏度更好，不与商用抗癌药如pembrolizumab等产生竞争关系的检测抗体。与免疫相关的生物标志物sPD-1和sPD-L1，可以预测抑制剂治疗的预后和疗效。血浆中sPD-1和sPD-L1的水平与癌症患者体内炎症水平，癌症患者的预后成正相关。评估患者亚组中的免疫生物标志物sPD-1和sPD-L1，有助于理解生物标志物与患者对免疫检查点抑制剂的敏感性之间的关系。开发特异功能性PD-1单克隆抗体和PD-L1单克隆抗体，建立快速检测sPD-1和sPD-L1的方法，最终建立多免疫点功能检测方法，对寻求快速评估免疫生物标志物sPD-1和sPD-L1具有特殊意义，可大大促进临床免疫治疗的精准和优化。

发明内容

因此，本发明提供一种抗体的制备方法，包括以下步骤：

S10：使用免疫原免疫小鼠，在初次免疫后加入转染的SP2/0细胞，在转染的SP2/0细胞免疫后加入转染的HEK293细胞进行加强免疫；

S20：分离成功免疫的小鼠脾脏淋巴细胞，与对数生长期的SP2/0细胞按1：（1.5-3）比例进行融合，获得杂交瘤细胞；

S30：选择性培养杂交瘤细胞，以免疫原重组人蛋白作为包被抗原，检测杂交瘤细胞培养液中抗体的分泌水平，根据检测结果选择杂交瘤细胞进行扩大培养，建株保存；

S40：采用腹腔注射方式将重悬的杂交瘤细胞注射到预致敏的小鼠体内，待腹水形成收集腹水，进行纯化制得抗体。

进一步地，所述转染的SP2/0细胞在初次免疫后的第37天加入，所述转染的HEK293细胞在初次免疫后的第58天加入。

进一步地，所述细胞融合要求抗体价效>10⁵，细胞融合前4~5天再次加强免疫。

进一步地，所述选择性培养包括DMEM完全培养基、HAT培养基、HT培养基。

进一步地，所述免疫原的制作包括以下步骤：

S10：从正常PBMC中提取RNA，逆转录得cDNA，以cDNA为模板得到基因片段，通过PCR反应得到扩增的基因产物；

S20：双酶切上述基因，并连接到经双酶切的pCBM、CMV及质粒pCDNA3.1-MCS的载体上，构建得外源质粒；

S30：将外源质粒转化包裹到293T细胞，转染SP2/0细胞，密度达到78％以上时细胞融合并进行瞬时转染，检测转染的效果；

S40：使用外源质粒转染293T细胞，用类新霉素G418来加压筛选，根据Westermblot检测结果筛选蛋白上调最显著的细胞株，即得免疫原。

进一步地，所述基因片段为PD-1基因片段，其PCR反应的上游引物：TATGGATTCGCCACCATGCAGATCCCACAGGCGC，下游引物：TATGTCGACTCAGAGGGGCCAAGAG，使用BamhI和salI进行双酶切，构建得pCBM-CMV-PD1外源质粒。

进一步地，所述基因片段为PD-L1基因片段，其PCR反应的上游引物：ATAAGATCTGCCACCATGAGGATATTTGCTGTCTTTAT，下游引物：ATAGTCGACTTACGTCTCCTCCAAATGTGT，使用bgl2和salI进行双酶切，构建得pCBM-CMV-PDL1外源质粒。

进一步地，所述转染的SP2/0细胞和转染的HEK293细胞由外源质粒分别转染SP2/0细胞和HEK293细胞获得。

进一步地，所述检测转染的效果为荧光显微镜下观察转染效率和Westemblot检测。

进一步地，所述Westemblot检测，使用RIPA buffer提取组织总蛋白，将含总蛋白的裂解产物进行电泳后，转印至PVDF膜，将膜浸入封闭液中4℃环境下过夜，加酶后标二抗温室反应，经过底物显色测定蛋白的相对含量。

本发明提供一种PD-1特异性单克隆抗体，根据上述抗体的制备方法制备得到。

本发明提供一种PD-L1特异性单克隆抗体，根据上述抗体的制备方法制备得到。

综上所述，本申请上述各个实施例可以具有如下一个或多个优点或有益效果：

1.本发明制备的抗体能够有效地标记T细胞表面的PD-1抗原，对较低含量的PD-1也能够快速检测，灵敏度、特异性较现有的抗体效果更好；

2.本发明制备的抗体，与抗癌药pembrolizumab不会竞争识别位点，避免空间位阻对检测造成的影响，能够实现对抗癌药存在下T细胞的准确定位，为观察患者治疗后情况提供有力条件。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例4中检测的最终结果。

图2为本发明实施例5中检测的最终结果。

图3为本发明实施例6中8E10的检测结果分析图。

图4为本发明实施例6中8G10的检测结果分析图。

图5为本发明实施例6中EH12.7的检测结果分析图。

图6为本发明实施例7中共定位实验等高线图。

图7为本发明实施例8中的测试结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

【实施例1】

1. PD-1免疫原的制备：

（1）细胞培养：将293T细胞用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基在37℃，5％CO2条件下孵箱中培养。

（2）基因PCR扩增：细胞总RNA的提取及RT-PCR分别从正常PBMC中提取13μgRNA，逆转录得到cDNA，以cDNA为模板扩增得到PD-1基因片段；Forward primer: TATGGATTCGCCACCATGCAGATCCCACAGGCGC，Reverse primer:TATGTCGACTCAGAGGGGCCAAGAG；PCR反应条件:94℃、2min，94℃、45s，57℃、45s，72℃、90s，30个循环，72℃、10min，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后采用凝胶试剂盒回收片段。

（3）pCBM-CMV-PD1真核载体的构建和鉴定：用限制性核酸内切酶BamhI和salI对pCBM、CMV及质粒pCDNA3.1-MCS进行双酶切后回收产物；用TaKaRaDNALigaionKit将酶切后片段连接，转化293T细胞，37℃过夜培养，转染SP2/0及HEK293细胞，密度达到80％左右融合，按照LipofectamineLTX&PLUS转染试剂说明进行瞬时转染；荧光显微镜下观察转染效率；用TRizol法提取细胞RNA逆转录得到cDNA，操作步骤按TaKaRaRNAKit说明书进行，内参GAPDH引物为上游5'-CCACCCTCAAGCCTGAGAA-3′；下游5′-GGTGAACACGCCAGTGGA-3′；Westemblot检测用RIPA buffer提取组织总蛋白，将含80μg总蛋白的裂解产物进行SDS-PACE电泳后，转印至PVDF膜，血清封闭，抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2h，ECL显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪采集，进行灰度值测定，用条带的积分光密度比值表示蛋白的相对含量。

（4）新霉素筛选稳定转染pCBM-CMV-PD1细胞株 ：将重组pCBM-CMV-PD1转染至293T细胞，经C418(400μg/ml)筛选2周后，大多数细胞死亡，仅少数细胞存活并形成克隆；用半量C418(200ug/ml)筛选，收集细胞并行Westermblot检测，根据Westermblot结果筛选蛋白上调最显著的细胞株。

2. PD-1特异性单克隆抗体8E10的制备：

（1）杂交瘤细胞株的建立：以基因工程技术构建细胞株为免疫原加弗氏完全佐剂（FCA）乳化后，采用背部多点皮下注射方式免疫Balb/c小鼠（12μg/只）；分别在初次免疫后的第37天加入pCBM-CMV-PD1转染的SP2/0细胞和第58天加入pCBM-CMV-PD1转染的HEK293细胞进行加强免疫，腹腔注射由FIA乳化的免疫原蛋白（24μg/只）；1周后对免疫小鼠断尾取血，ELISA法检测血清抗体效价，抗体效价需>10⁵可准备进行细胞融合实验；细胞融合前4~5天再次加强免疫，腹腔注射不含佐剂的免疫原蛋白（24μg/只）。将小鼠脾脏取出分离成功免疫的小鼠脾脏淋巴细胞，与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1：2比例融合。用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基、HAT培养基和HT培养基选择性培养杂交瘤细胞，以免疫原重组人蛋白作为包被抗原，ELISA法检测杂交瘤细胞培养液中PD-1单克隆抗体的分泌水平；收集ELISA检测结果为阳性的培养孔中的杂交瘤细胞，采用有限稀释法继续进行克隆化培养。经过连续多次克隆化培养后，最终选择ELISA检测阳性率为100%的克隆型杂交瘤细胞进行扩大培养，建株保存。

（2）腹腔积液单抗的制备、纯化：灭菌PBS溶液洗涤杂交瘤细胞，重悬至2×106/ml，采用腹腔注射方式将重悬的杂交瘤细胞注射到降植烷预致敏的Balb/c小鼠体内（0.5ml/只）。7~10d后待腹水形成收集腹水；室温下3000r/min离心10min，收集腹水上清，对腹水上清中的PD-1单克隆抗体进行纯化制得PD-1抗体8E10。

【实施例2】

1.PD-L1免疫原的制备：

（1）细胞培养：将293T细胞用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基在37℃，5％CO2条件下孵箱中培养。

（2）基因PCR扩增：细胞总RNA的提取及RT-PCR分别从正常PBMC中提取13μgRNA，逆转录得到cDNA，以cDNA为模板扩增得到PD-L1基因片段；Forward primer: ATAAGATCTGCCACCATGAGGATATTTGCTGTCTTTAT，Reverse primer: ATAGTCGACTTACGTCTCCTCCAAATGTGT；PCR反应条件:94℃、2min，94℃、45s，57℃、45s，72℃、90s，30个循环，72℃、10min，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后采用凝胶试剂盒回收片段。

（3）pCBM-CMV-PDL1真核载体的构建和鉴定：用限制性核酸内切酶bgl2和salI对pCBM、CMV及质粒pCDNA3.1-MCS进行双酶切后回收产物；用TaKaRaDNALigaionKit将酶切后片段连接，转化293T细胞，37℃过夜培养，转染SP2/0及HEK293细胞，密度达到80％左右融合，按照LipofectamineLTX&PLUS转染试剂说明进行瞬时转染；荧光显微镜下观察转染效率；用TRizol法提取细胞RNA逆转录得到cDNA，操作步骤按TaKaRaRNAKit说明书进行，内参GAPDH引物为上游5'-CCACCCTCAAGCCTGAGAA-3′；下游5′-GGTGAACACGCCAGTGGA-3′；Westemblot检测用RIPA buffer提取组织总蛋白，将含80μg总蛋白的裂解产物进行SDS-PACE电泳后，转印至PVDF膜，血清封闭，抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2h，ECL显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪采集，进行灰度值测定，用条带的积分光密度比值表示蛋白的相对含量。

（4）新霉素筛选稳定转染pCBM-CMV-PDL1细胞株 ：将重组pCBM-CMV-PDL1转染至293T细胞，经C418(400μg/ml)筛选2周后，大多数细胞死亡，仅少数细胞存活并形成克隆；用半量C418(200ug/ml)筛选，收集细胞并行Westermblot检测，根据Westermblot结果筛选蛋白上调最显著的细胞株。

2.PD-L1特异性单克隆抗体8G10的制备：

（1）杂交瘤细胞株的建立：以基因工程技术构建细胞株为免疫原加弗氏完全佐剂（FCA）乳化后，采用背部多点皮下注射方式免疫Balb/c小鼠（12μg/只）；分别在初次免疫后的第37天加入pCBM-CMV-PDL1转染的SP2/0细胞和第58天加入pCBM-CMV-PDL1转染的HEK293细胞进行加强免疫，腹腔注射由FIA乳化的免疫原蛋白（24μg/只）；1周后对免疫小鼠断尾取血，ELISA法检测血清抗体效价，抗体效价需>10⁵可准备进行细胞融合实验；细胞融合前4~5天再次加强免疫，腹腔注射不含佐剂的免疫原蛋白（24μg/只）。将小鼠脾脏取出分离成功免疫的小鼠脾脏淋巴细胞，与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1:2.5比例融合。用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基、HAT培养基和HT培养基选择性培养杂交瘤细胞，以免疫原重组人蛋白作为包被抗原，ELISA法检测杂交瘤细胞培养液中PD-L1单克隆抗体的分泌水平；收集ELISA检测结果为阳性的培养孔中的杂交瘤细胞，采用有限稀释法继续进行克隆化培养。经过连续多次克隆化培养后，最终选择ELISA检测阳性率为100%的克隆型杂交瘤细胞进行扩大培养，建株保存。

（2）腹腔积液单抗的制备、纯化：灭菌PBS溶液洗涤杂交瘤细胞，重悬至2×106/ml，采用腹腔注射方式将重悬的杂交瘤细胞注射到降植烷预致敏的Balb/c小鼠体内（0.5ml/只）。7~10d后待腹水形成收集腹水；室温下3000r/min离心10min，收集腹水上清，对腹水上清中的PD-L1单克隆抗体进行纯化制得PD-L1抗体8G10。

【实施例3】

抗体与染料偶联方法

（1）取适量纯化的本发明抗体，用0.025mol/L pH9.0 碳酸盐缓冲液将抗体溶液的蛋白浓度稀释至20mg/ml，将溶液放置冰浴内；

（2）取相当于抗体蛋白1/100的荧光染料溶于抗体溶液量1/10的0.5mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液中（该溶液应即配即用）；

（3）在电磁搅拌器缓慢搅拌下将配置的染料溶液缓慢滴入抗体溶液中，注意避免产生气泡，约在5-10min内加完；

（4）将容器加塞密闭后，连同电磁搅拌器移置于4℃，继续缓慢搅拌，使荧光染料与抗体结合（偶联）12-18h；

（5）将偶联物经离心沉淀（3000r/m×20min）去除少量沉淀物，取上清夜置透析袋内，先用流水透析5min后，再用大量0.01mol/L pH7.2 PBS于4℃透析4h，一般PBS的用量为标记物的100倍；

（6）准备Sephadex G-25（或G-50）柱（1.2×30cm），用0.01mol/L pH7.2 PBS流洗平衡后上样，一般上样量小于柱床容积的1/2，1.2×30cm柱床容积为33.9ml，上样量不大于15ml；

（7）用0.01mol/L pH7.2 PBS洗脱，搜集第一洗脱峰，合并后即为目标荧光抗体。

【实施例4】

基线性能分析比较

使用本发明抗体8E10、8G10与目前所用商用抗体EH12.7、MIH4分别对已标记CD3+细胞、CD4+细胞和CD8+细胞进行识别标记。采用流式细胞仪筛选，具体操作步骤如下：分别取100μL样本，加入体积当量约1:20的溶血素，于室温避光孵育15min后经两次离心除去细胞碎片和非细胞成分，后加入少量的鞘液，分别加入20μL不同种类但相同浓度的抗体，室温孵育15min，加入2mL 鞘液再次离心，后加入500μL鞘液上机进行检测，最终检测结果如图1所示。目前所用商业抗体EH12.7和MIH4在三种细胞中单参数直方图波型不好，在同种细胞中商业染料特异性一般，而本发明所示抗体8E10、8G10对三种细胞的检测波形单一，特异性强。

【实施例5】

PD-1表达实验对比

对处理过的人外周血单核细胞（PBMC）进行抗体检测，使用本发明抗体8E10、8G10与商用抗体EH12.7、MIH4分别对样本进行识别。采用流式细胞仪筛选，利用降维流形技术UMAP对其分析。其具体操作步骤如下：分别取处理过后的100μL细胞样本，加入体积当量约1:20的溶血素，于室温避光孵育15min后经两次离心除去细胞碎片和非细胞成分，后加入少量的鞘液，分别加入20μL不同种类但相同浓度的抗体，室温孵育15min，加入2mL 鞘液再次离心，后加入500μL鞘液上机进行检测。最终检测结果如图2所示，可以看出本发明抗体8E10和8G10对PD-1表达识别上要优于目前市面上所用商业抗体，可以实现流式检测过程中的特异性识别。

【实施例6】

PD-1特异性实验—在sPD-1参与下进行滴定实验：

在不同浓度的sPD-1与等浓度的检测抗体结合后，对4例新鲜制备的外周血淋巴细胞（标记CD3+、CD4+、CD8+三种细胞）进行抗体8E10、8G10、EH12. 7占比检测。实验步骤如下：选取sPD-1浓度梯度为50pg/ml、500pg/ml、5ng/ml、50ng/ml、500ng/ml、5μg/ml，与等浓度的检测抗体室温结合，共同避光孵育15min，再次加入2mL鞘液，充分混匀，1700r/min离心5min，除去上清液后加入500ul鞘液，震荡混匀，上机检测，对所测细胞含有的抗体浓度分析如图3、4、5所示。可以看出本发明制备抗体8E10和8G10含量曲线在不同浓度的sPD-1条件下变化缓和，对浓度变化反应较为灵敏，随着浓度的变化而逐渐发生变化，而抗体EH12.27曲线则变化较快，曲线斜率较大，对低浓度的抗体反应迟钝，特异性灵敏性不够强。

【实施例7】

共定位实验：

对制备的外周血淋巴细胞（抗体EH12.7、MIH4已分别标记CD3⁺细胞）进行抗体8E10、8G10识别检测。实验步骤如下：选取等浓度的本发明抗体8E10和8G10对CD3⁺细胞进行结合，共同避光孵育15min，再次加入2mL鞘液，充分混匀，1700r/min离心5min，除去上清液后加入500ul鞘液，震荡混匀，上机检测，对所测细胞含有的抗体分析作等高线图，如图6所示。可以看出抗体8E10、8G10与抗体EH12.7识别效果都较好，如图所示8E10⁺EH12.2H7⁺及8G10⁺EH12.2H7⁺能够很好的对细胞进行识别，而在MIH4+的条件下，则图形区分效果不好，区分不明显。通过对比可以看出，抗体8E10和8E10以及EH12.7相较于MIH4都能够较好的实现抗体特异性识别检测。

【实施例8】

对整体PD-1的评估—与pembrolizumab的共染实验：

利用CD3、CD28标记活化的纯外周血单核细胞，与派姆单抗（pembrolizumab）或同种型（IgG4）混合处理，再将抗体8E10、8G10与其共同孵育，标记分析。其具体实验步骤为：利用抗体aIgG4与荧光染料FITC混合偶联制得aIgG4-FITC，抗体8E10、8G10与染料A647混合偶联制得8E10-A647、8G10-A647，利用细胞计数获取已标记CD3+、CD28+的纯外周血单核细胞约10⁶个细胞，再与10μg/ml的aIgG4-FITC混合，避光孵育15min，后分别加入10μg/ml的8E10-A647和8G10-A647，避光孵育15min后加入少量鞘液离心除去上清液，再加入500μL鞘液，震荡混匀后上机检测，测试结果如图7所示，可以看出抗体8E10和8G10能够在aIgG4结合的前提下实现对T细胞的特异性识别，能够识别定位经过抗癌药pembrolizumab治疗后的T细胞。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S10：使用免疫原免疫小鼠，在初次免疫后加入转染的SP2/0细胞，在转染的SP2/0细胞免疫后加入转染的HEK293细胞进行加强免疫；

S20：分离成功免疫的小鼠脾脏淋巴细胞，与对数生长期的SP2/0细胞进行细胞融合，获得杂交瘤细胞；

S30：选择性培养杂交瘤细胞，以免疫原重组人蛋白作为包被抗原，检测杂交瘤细胞培养液中抗体的分泌水平，根据检测结果选择杂交瘤细胞进行扩大培养，建株保存；

S40：采用腹腔注射方式将重悬的杂交瘤细胞注射到预致敏的小鼠体内，待腹水形成收集腹水，进行纯化制得抗体；

所述转染的SP2/0细胞在初次免疫后的第37天加入，所述转染的HEK293细胞在初次免疫后的第58天加入；

所述细胞融合要求抗体价效>10⁵；

所述选择性培养包括DMEM完全培养基、HAT培养基、HT培养基。

2.根据权利要求1所述的抗体的制备方法，其特征在于，所述免疫原的制作包括以下步骤：

S10：从正常PBMC中提取RNA，逆转录得cDNA，以cDNA为模板得到基因片段，通过PCR反应得到扩增的基因产物；

S20：双酶切上述基因，并连接到经双酶切的pCBM、CMV及质粒pCDNA3.1-MCS的载体上，构建得外源质粒；

S30：将外源质粒转化包裹到293T细胞，转染SP2/0细胞，细胞融合并进行瞬时转染，检测转染的效果；

S40：使用外源质粒转染293T细胞，用类新霉素G418来加压筛选，根据检测结果筛选蛋白上调最显著的细胞株，即得免疫原。

3.根据权利要求2所述的抗体的制备方法，其特征在于，所述基因片段为PD-1基因片段，其PCR反应的上游引物：TATGGATTCGCCACCATGCAGATCCCACAGGCGC，下游引物：TATGTCGACTCAGAGGGGCCAAGAG，使用BamhI和salI进行双酶切，构建得pCBM-CMV-PD1外源质粒。

4.根据权利要求2所述的抗体的制备方法，其特征在于，所述基因片段为PD-L1基因片段，其PCR反应的上游引物：ATAAGATCTGCCACCATGAGGATATTTGCTGTCTTTAT，下游引物：ATAGTCGACTTACGTCTCCTCCAAATGTGT，使用bgl2和salI进行双酶切，构建得pCBM-CMV-PDL1外源质粒。

5.根据权利要求3或4所述的抗体的制备方法，其特征在于，所述转染的SP2/0细胞和转染的HEK293细胞由外源质粒分别转染SP2/0细胞和HEK293细胞获得。

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