CN109265545A - 鼠抗人C1orf109单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents
鼠抗人C1orf109单克隆抗体及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种鼠抗人C1orf109单克隆抗体及其制备方法与应用,属于生命科学技术领域。技术方案为:利用人胚肾细胞扩增C1orf109基因;制备重组表达载体PET28a‑C1orf109;转化大肠杆菌;诱导获得C1orf109蛋白;免疫BALB/c小鼠,细胞融合;接种BALB/c小鼠,制备腹水,提取并纯化得到鼠抗人C1orf109单克隆抗体。本发明提供的鼠抗人C1orf109单克隆抗体,可与C1orf109蛋白特异性结合,具有高亲和性和高特异性。可以检测人源调控细胞死亡的C1orf109蛋白的诱导细胞死亡的同源区序列,与多克隆抗体相比,显著提高了C1orf109蛋白免疫检测的特异性和可靠性。
Description
技术领域
本发明涉及生命科学技术领域,具体涉及发明一种鼠抗人C1orf109单克隆抗体及其制备方法与应用。
背景技术
C1orf109(chromosome 1open reading frame 109)是前期研究中通过生物信息技术、RACE(RapidAmplification ofcDNAEnds)技术获得的一个功能未知基因,该基因定位于人1号染色体短臂3区4带3亚带(1p34.3),此区域是一个细胞增殖与细胞周期调控相关基因密集区。根据NCBI中相关序列信息的提示,C1orf109由于可变剪接以及基因插入等原因可以产生多个长度不同的转录本。主要的四种转录本编码蛋白的氨基酸长度分别为203、218、265、280,分子量分别为22.3kDa,23.9kDa,29.1kDa和30.8kDa。通过分析预测其等电点为5.44,无N端信号肽,具有多个潜在的磷酸化位点并具有糖基化等翻译后修饰。
研究证实,C1orf109的四种转录本中存在第一外显子的变异和四-五外显子之间的可变剪切,结果造成编码的氨基酸1-62位的有或无以及羧基端的变异。280转录本的第63位至215位氨基酸残基区为四个转录本的同源区。同时研究还显示C1orf109的280转录本在多种上皮细胞中维持低水平的表达,但当其在细胞内高表达时可以诱导细胞死亡。四种转录本在细胞内分布呈多样性,203,218和265转录本在细胞核和细胞质中均有分布,在细胞核内呈点状分布,在细胞核周围呈现弥散样分布。而280转录本绝大部分分布于细胞核中,提示其可能发挥转录调控的作用。
目前,国外相关生物公司已经有商品化C1orf109多克隆抗体,但经过western实验验证均不能有效识别内源性C1orf109蛋白。本课题组尝试利用原核表达的C1orf109蛋白与佐剂乳化后通过皮下注射的方法免疫家兔后,采血分离血清经纯化后得到兔源多克隆抗体,但是依然无法有效识别内源性C1orf109蛋白。并且,由于C1orf109存在多个转录本的情况,给抗体的识别造成了较大的困难。鉴于C1orf109的生物学功能并没有完全得到揭示,因此获得具有较高特异性的C1orf109单克隆抗体对于后续的科学研究具有重要意义。
发明内容
为解决上述问题,本发明针对C1orf109四种转录本的同源区,提供了一种高亲和性的、可用于科学研究中检测C1orf109表达的小鼠抗人C1orf109单克隆抗体及其制备方法与应用。
本发明所述鼠抗人C1orf109单克隆抗体可与C1orf109蛋白特异性结合,与多克隆抗体相比,显著提高了C1orf109蛋白免疫检测的特异性和可靠性,广泛适用于各种肿瘤细胞和组织中C1orf109不同转录本的检测。
为实现上述发明目的,本发明提供的技术方案如下:
首先,本发明所提供的鼠抗人C1orf109单克隆抗体,来源于人HEK293细胞C1orf109基因的编码序列,包括C1orf109蛋白四种变异体的同源区,所述同源区的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
其次,本发明提供的上述鼠抗人C1orf109单克隆抗体制备方法如下:
步骤一、提取人胚肾HEK293T细胞的总RNA,通过逆转录PCR的方法将总RNA逆转录成cDNA,以该cDNA为模板,利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物对,通过PCR扩增得到C1orf109基因;
步骤二、采用双酶切连接体系,将步骤一得到的C1orf109基因连接到带有His标签pET28a质粒,得到重组表达载体pET28a-C1orf109;
步骤三、将步骤二得到的重组表达载体pET28a-C1orf109转化大肠杆菌BL21感受态细胞,筛选阳性克隆;
步骤四、步骤三所得阳性克隆IPTG诱导原核体外表达系统,获得C1orf109蛋白多肽,并纯化获得C1orf109蛋白;
步骤五、将步骤四得到的纯化C1orf109蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和筛选,获得能稳定分泌抗C1orf109的杂交瘤细胞株;
步骤六、将步骤五获得的能稳定分泌抗C1orf109的杂交瘤细胞接种至BALB/c小鼠腹腔,制备腹水,然后从腹水中提取并纯化得到鼠抗人C1orf109单克隆抗体。
步骤二所述双酶切连接体系,使用的酶是T4连接酶。
步骤四所述纯化,具体为:
(1)15000rpm,4℃15min离心,取沉淀;取50mL菌体重悬Buffer I重悬沉淀,15000rpm,4℃15min离心,重复此步骤,3-4次,最终取沉淀;所述菌体重悬Buffer I含25mMTris-HCl、2M尿素、2%Triton X-100、50mM NaCl、3mM DTT、1mM EDTA,pH 8.0;
(2)取50mL重悬Buffer II重悬步骤(1)所得沉淀,并于4℃15000rpm 15min,取沉淀;所述重悬Buffer II含25mM Tris-HCl、0.5M NaCl、0.05mM TCEP;
(3)取30mL重悬Buffer II重悬步骤(2)所得沉淀,再将其加入BufferⅢ中溶解5h,所述BufferⅢ含25mM Tris-HCl、50mMNaCl、2M尿素、0.05mM TCEP,pH 8.0;
(4)将该溶解液于15000rpm 4℃离心40min,取上清;
(5)将上清加入Ni-co柱;
(6)洗柱:加入50mL洗脱Buffer;所述洗脱Buffer含25mM Tris-HCl、50mM NaCl、15mM咪唑、0.05mM TCEP、8M尿素,pH 8.0;
(7)洗脱:加5mL洗脱Buffer,孵育25min后收集,之后再用2mL洗脱Buffer洗脱并收集。通过SDS-PAGE检测纯化后蛋白纯度达到95%以上。
步骤五所述细胞融合,具体操作为:取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合,加入促融合剂,使细胞发生融合,形成杂交瘤细胞。所述SP2/0骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞的细胞个数比为1:5-1:10。所述促融合剂为聚乙二醇,使用的分子量为4000,质量浓度为50%。
步骤六所述纯化方法为ProteinA亲和层析法,具体操作为ProteinA亲和柱用PBS平衡,取抗小鼠腹水过柱,PBS洗至OD值接近于零,以50mmol/LpH 2.5的甘氨酸-HCl溶液洗脱,收集峰值区的洗脱液。
步骤五所述免疫BALB/c小鼠,需要在三次免疫后,经过加强免疫。
上述制备方法制备的单克隆抗体,通过SDS-PAGE检测抗体的纯度,纯化后抗体纯度在95%以上;采用ELISA滴度测定单抗的效价,单抗的滴度均在1:10000以上(见表1)
表1 C1orf109单克隆抗体ELISA检测结果
最后,本发明还提供了上述鼠抗人C1orf109单克隆抗体在C1orf109蛋白检测中的应用。
利用上述抗体对多种肺癌、乳腺癌和正常细胞进行western检测,从实验结果上来看,本发明制备了高效价,高特异性的C1orf109单克隆抗体,用该抗体检测证实,其对细胞中的C1orf109蛋白具有高识别能力,可用于科研实验中检测C1orf109蛋白。
有益效果:
(1)本发明提供的鼠抗人C1orf109单克隆抗体,可与C1orf109蛋白特异性结合,具有高亲和性和高特异性。可以检测人源调控细胞死亡的C1orf109蛋白的诱导细胞死亡的核心肽段序列。本发明所述单克隆抗体与多克隆抗体相比,显著提高了C1orf109蛋白免疫检测的特异性和可靠性。
(2)所述的鼠抗人C1orf109蛋白单克隆抗体采用亲和层析纯化,其纯度达到95%以上。
(3)鼠抗人C1orf109蛋白单克隆抗体采用ProteinA亲和层析法纯化,纯化后的抗体纯度在95%以上;ELISA滴度测定单抗的效价在1:10000以上。
附图说明
图1.C1orf109原核表达产物经过亲和纯化后SDS-PAGE电泳结果;
图2.C1orf109多转录本示意图;
图3.C1orf109单克隆抗体用于检测肿瘤细胞内源性C1orf109蛋白的印迹杂交结果;
图4.IPTG诱导原核体外表达系统与操作流程示意图。
具体实施方式
实施例1鼠抗人C1orf109单克隆抗体的制备
步骤一、提取人胚肾HEK293T细胞的总RNA,通过逆转录PCR的方法将总RNA逆转录成cDNA,以该cDNA为模板,利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物对,通过PCR扩增得到C1orf109基因;
所述RNA提取,使用的试剂盒为Invitrogen公司TRIZOL RNA提取试剂;所述逆转录,使用的试剂盒为TaKaRaPrimeScriptTMRT Reagent Kit Lot#AK4802。
PCR体系为50μL
PCR程序为95℃5min,95℃10s 60℃5s,72℃1min 72℃5min,4℃45min 30cycles
PCR扩增后回收产物C1orf109基因片段大小为609bp。
步骤二、采用双酶切连接体系,将步骤一得到的C1orf109基因连接到带有His标签pET28a质粒,得到重组表达载体pET28a-C1orf109;
使用的核酸内切酶是EcoRI和XhoI。
酶切体系为20μL。
酶切条件为37℃1h。
酶切C1orf109基因和pET28a质粒后回收片段大小分别为609bp和5300bp
连接体系为20μL。
连接条件为22℃1h。
步骤三、将步骤二得到的重组表达载体pET28a-C1orf109转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆;
所述筛选阳性克隆,具体操作为:将转化之后37℃活化1h的DH5α涂布在含有氨苄抗性的平板上,37℃过夜,次日可见平板上有单克隆菌落,之后挑取2-3个菌落于液体LB培养基中活化后1h后接种到含有氨苄抗性的LB培养基中培养过夜,次日提取重组质粒,测序。
步骤四、步骤三所得测序正确的pET28a-C1orf109转化转化大肠杆菌BL21感受态,次日挑取克隆,于液体LB培养基中活化后1h后接种到含有氨苄抗性的LB培养基中培养过夜至OD=0.8,之后通过IPTG诱导获得C1orf109蛋白多肽,并纯化获得C1orf109蛋白;
所述IPTG诱导原核体外表达系统与操作流程如图4所示:
(1)转化:取重组体质粒1-2μL加入感受态细胞中,冰上孵育30min之后42℃热激60s,取出后冰上放置5min,之后加入1mL LB培养基37℃150rpm活化1h,之后取出8000rpm离心2min,收集菌体去上清加入1mL LB重悬,从中取出100μL涂板,37℃过夜。
(2)诱导表达:挑去单克隆菌于1mL LB中活化2h,之后加入3mL带抗性的LB培养基中培养2h后加入IPTG 25℃150rpm培养20h。
(3)鉴定表达:收集步骤2中的菌体,超声破碎离心取上清(对照组为不加IPTG诱导组),SDS-PAGE检测表达量,western-blot确认目的蛋白。
(4)扩大培养:挑去单克隆菌于1mL LB中活化2h,之后加入3mL带抗性的LB培养基中220rpm培养过夜,之后将10mL菌液加入1L带抗性的LB培养基中37℃220rpm2h,
之后加入150μL IPTG(终浓度0.5mM)25℃150rpm 20h。
(5)取出步骤4中3mL菌液离心后,去培养基,加入loadingbuffer煮样后SDS-PGAE。
(6)步骤4中的菌液8000rpm离心,吸出剩余LB,在沉淀中加入30mL(25mM TrispH8.01-0.5M NaCl)重悬和300μL溶菌酶(终浓度0.1mg/mL)室温消化30min,之后超声破碎(30%功率,6次)。4℃15000rpm离心40min,弃上清。
步骤四所述纯化,具体为:
(1)15000rpm,4℃15min离心,取沉淀;取50mL菌体重悬Buffer I重悬沉淀,15000rpm,4℃15min离心,重复此步骤,3-4次,最终取沉淀;所述菌体重悬Buffer I含25mMTris-HCl、2M尿素、2%Triton X-100、50mM NaCl、3mM DTT、1mM EDTA,pH 8.0;
(2)取50mL重悬Buffer II重悬步骤(1)所得沉淀,并于4℃15000rpm 15min,取沉淀;所述重悬Buffer II含25mM Tris-HCl、1-0.5M NaCl、0.05mM TCEP;
(3)取30mL重悬Buffer II重悬步骤(2)所得沉淀,再将其加入BufferⅢ中溶解5h,所述BufferⅢ含(25mM Tris-HCl、50mM NaCl、2M尿素、0.05mM TCEP,pH8.0;
(4)将该溶解液于15000rpm 4℃离心40min,取上清;
(5)将上清加入Ni-co柱;
(6)洗柱:加入50mL洗脱Buffer;所述洗脱Buffer含25mM Tris-HCl、50mM NaCl、15mM咪唑、0.05mM TCEP、8M尿素,pH 8.0;
(7)洗脱:加5mL洗脱Buffer,孵育25min后收集,之后再用2mL洗脱Buffer洗脱并收集。
通过SDS-PAGE检测纯化后蛋白纯度达到95%以上。
步骤五、将步骤四得到的纯化C1orf109蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和ELISA筛选,获得能稳定分泌抗C1orf109的杂交瘤细胞株;
步骤五所述细胞融合,具体操作为:取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合,加入促融合剂,使细胞发生融合,形成杂交瘤细胞。所述SP2/0骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞的细胞个数比为1:5。所述促融合剂为聚乙二醇,使用的分子量为4000,质量浓度为50%。
步骤五所述免疫BALB/c小鼠,需要在三次免疫后,再经过加强免疫。
步骤五具体操作为:
动物免疫,采血测试和评价:
选用6-8周龄的雌性BALB/c小鼠5只,按照预先制订的免疫方案进行三次免疫注射。
首次免疫。纯化的重组蛋白C1orf109(用适量生理盐水稀释)+完全弗氏佐剂,100μg/只,颈背部皮下多点注射;
二次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白C1orf109(用适量生理盐水稀释)+不完全弗氏佐剂,100μg/只,颈背部皮下多点注射;
三次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白C1orf109(用适量生理盐水稀释)+不完全弗氏佐剂,100μg/只,颈背部皮下多点注射;
三次免疫后7、10天采血,用建立的ELISA法检测效价,选择效价最高者用于细胞融合;
三次免疫后一周尾静脉采血分离血清用ELISA测抗体效价,选择抗体效价最高的小鼠加强免疫。
加强免疫(融合前3天),用纯化的重组蛋白50μg腹腔注射。3天后取脾脏融合。细胞融和,筛选,阳性克隆扩增:
采用眼球摘除放血法处死小鼠,无菌操作取出脾脏,在平皿内挤压研磨制备脾细胞悬液。将准备好的SP2/0骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合(细胞个数比1:5),并加入质量浓度为50%的促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下,各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合,形成杂交瘤细胞。采用HAT选择性培养基,进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。
用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清:以纯化的C1orf109蛋白(10μg/mL)包被酶标板,每孔100μL,4℃包被过夜。甩掉包被液,加入200μL 5%的脱脂奶粉,37℃封闭1小时后,洗涤3次,加杂交瘤细胞培养检测上清100μL(阴性对照为PBS 100μL),37℃孵育1小时。洗涤3遍后,加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP),37℃孵育1小时,去掉酶标二抗,洗涤3遍,加底物显色剂50μL,室温静置5分钟,加终止液50μL。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。OD值明显高于阴性对照2倍以上者定为阳性。最后筛选得到一株分泌性能最佳的抗C1orf109杂交瘤细胞株。
将选出的阳性杂交瘤细胞株克隆化培养(有限稀释法),获得能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培养,并冻存保种。
步骤六、将步骤五获得的能稳定分泌抗C1orf109的杂交瘤细胞接种至BALB/c小鼠腹腔,制备腹水,然后从腹水中提取并纯化得到鼠抗人C1orf109单克隆抗体。
单克隆抗体的大量制备与纯化:
将上述获得的杂交瘤细胞株接种至BALB/c小鼠腹腔,制备腹水,然后从腹水中提取抗体。
单克隆抗体C1orf109的纯化:采用ProteinA亲和层析法。首先制备ProteinA亲和柱,用PBS平衡柱子后,取抗C1orf109的小鼠腹水过柱,然后用PBS洗至OD值接近于零,以50mmol/LpH 2.5的甘氨酸-HCl溶液洗脱,收集峰值区的洗脱液,经透析浓缩后备用。SDS-PAGE结果显示,纯化后抗体纯度在95%以上。步骤六所述纯化方法为ProteinA亲和层析法,具体操作为:取含有本抗体的小鼠腹水(参照1mLProteinA约结合14mg抗体计算)将小鼠腹水于4℃10000rpm离心20分钟,去除碎片。上清再经0.45μm滤膜过滤去除未沉降的杂质蛋白,再用10mM的NaOH调节上清的pH值至7.0。ProteinA亲和层析柱使用0.1M PB磷酸盐缓冲液(pH 7.0)进行平衡,充分去除乙醇和杂质,平衡至OD280<0.01。将处理过的样本液以流速1mL/min过柱,保持样本温度与柱床温度一致。然后对纯化柱进行洗涤和洗脱,保留待检样本。纯化后样本进行检测分析。
直接ELISA法测定纯化抗体的滴度:以纯化的C1orf109蛋白(10μg/mL)包被酶标板,每孔100μL,4℃包被过夜。甩掉包被液,加入200μL 5%的脱脂奶粉,37℃封闭l小时后,洗涤3次,将纯化的抗体按1:200,1:400,1:800,1:1600,1:3200,1:6400,1:12800进行稀释,以每孔100μL加入酶标板中(阴性对照为PBS 100μL),37℃孵育1小时。洗涤3遍后,加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP),37℃孵育1小时,去掉酶标二抗,洗涤3遍,加底物显色剂50μL,室温静置5分钟,加终止液50μL。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。ELISA滴度测定结果显示,单抗的滴度均在1:10000以上。
实施例2C1orf109单克隆抗体用于检测肿瘤细胞内源性C1orf109蛋白
首先在60mm细胞培养皿中,利用含有10%血清的DMEM培养基进行HeLa、A375和293T细胞的培养,在细胞汇合率达到70%左右时,进行细胞收获和蛋白的提取,将培养基吸出后,在各皿中加入100μL的RIPA细胞裂解液(150mM NaCl,1%NP-40,1%sodiumdeoxycholate,0.1%SDS,25mM Tris-HCl pH 7.6)置于冰上,利用细胞刮在尽量短时间内将细胞刮下并转移到1.5mL EP管中,在冰上裂解30min,期间涡旋震动4-5次,然后在4℃12000rpm离心10min,吸取上清后转移到新的EP管中,利用Lowry法进行蛋白定量后,加入25μL的5x loadingbuffer混匀,在95℃加热10min即可进行蛋白电泳检测。根据蛋白定量的结果,在预制的SDS-PAGE胶内加入蛋白marker和适量的蛋白裂解液,安装好蛋白电泳系统后以120V恒压进行电泳直到蛋白marker完全分散开即可停止。将PAGE胶取下浸入转膜液中,准备大小合适的PVDF膜,利用甲醇激活后,按照顺序夹紧滤纸PVDF膜和PAGE胶后插入到转膜槽内,加入转膜液连接好转膜装置,100V恒压转膜60min左右。取出转好的PVDF膜,置于10%脱脂牛奶中封闭1h,用TBST洗净PVDF膜后,加入适当比例稀释的C1orf109内源性抗体,在4℃摇床孵育过夜。第二天将膜取出后,利用TBST洗膜3次,每次10min,将非特异性结合的抗体充分洗去。加入1:5000稀释的山羊抗鼠荧光标记二抗在室温孵育1h,再利用TBST洗膜3次,每次10min。最后利用可识别荧光标记蛋白的western-blot扫描仪进行western显影。结果如图3所示,内源性C1orf109蛋白分子量在35kDa和40kDa蛋白marker之间,说明C1orf109单克隆抗体可特异性识别三种细胞系的内源性C1orf109蛋白。
SEQUENCE LISTING
<110> 哈尔滨工业大学
<120> 鼠抗人C1orf109单克隆抗体及其制备方法与应用
<160> 3
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 同源区氨基酸序列
<400> 1
mtqdrpllav qealkkcfpv veeqqglwqs alrdcqplls slsnlaeqlq aaqnlrfedv 60
palrafpdlk erlrrkqlva gdivldklge rlaillkvrd mvsshvervf qiyeqhadtv 120
gidavlqpsa vspsvadmle wlqdierhyr ks 152
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 上游引物
<400> 2
cggaattcat gactcaagac cggcctctg 29
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 下游引物
<400> 3
gcctcgagac tgtggtaccc gtggtctcc 29
Claims (9)
1.一种鼠抗人C1orf109单克隆抗体,其特征在于:来源于人HEK293细胞C1orf109基因的编码序列,包括C1orf109蛋白四种变异体的同源区,所述同源区的氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示。
2.一种权利要求1所述鼠抗人C1orf109单克隆抗体的制备方法,其特征在于:
步骤一、提取人胚肾HEK293T细胞的总RNA,通过逆转录PCR的方法将总RNA逆转录成cDNA,以该cDNA为模板,利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物对,通过PCR扩增得到C1orf109基因;
步骤二、采用双酶切连接体系,将步骤一得到的C1orf109基因连接到带有His标签pET28a质粒,得到重组表达载体pET28a-C1orf109;
步骤三、将步骤二得到的重组表达载体pET28a-C1orf109转化大肠杆菌BL21感受态细胞,筛选阳性克隆;
步骤四、步骤三所得阳性克隆IPTG诱导原核体外表达系统,获得C1orf109蛋白多肽,并纯化获得C1orf109蛋白;
步骤五、将步骤四得到的纯化C1orf109蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合,获得能稳定分泌抗C1orf109的杂交瘤细胞株;
步骤六、将步骤五获得的能稳定分泌抗C1orf109的杂交瘤细胞接种至BALB/c小鼠腹腔,制备腹水,然后从腹水中提取并纯化得到鼠抗人C1orf109单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:步骤二所述双酶切连接体系,使用的酶是T4连接酶。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:步骤四所述纯化,具体为:
(1)15000rpm,4℃15min离心,取沉淀;取50mL菌体重悬Buffer I重悬沉淀,15000rpm,4℃15min离心,重复此步骤,3-4次,最终取沉淀;所述菌体重悬Buffer I含25mM Tris-HCl、2M尿素、2%Triton X-100、50mM NaCl、3mM DTT、1mM EDTA,pH8.0;
(2)取50mL重悬Buffer II重悬步骤(1)所得沉淀,并于4℃15000rpm 15min,取沉淀;所述重悬Buffer II含25mM Tris-HCl、1-0.5M NaCl、0.05mM TCEP;
(3)取30mL重悬Buffer II重悬步骤(2)所得沉淀,再将其加入Buffer Ⅲ中溶解5h,所述Buffer Ⅲ含25mM Tris-HCl、50mM NaCl、2M尿素、0.05mM TCEP,pH 8.0;
(4)将该溶解液于15000rpm 4℃离心40min,取上清;
(5)将上清加入Ni-co柱;
(6)洗柱:加入50mL洗脱Buffer;所述洗脱Buffer含25mM Tris-HCl、50mM NaCl、15mM咪唑、0.05mM TCEP、8M尿素,pH 8.0;
(7)洗脱:加5mL洗脱Buffer,孵育25min后收集,之后再用2mL洗脱Buffer洗脱并收集。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:步骤五所述细胞融合,具体操作为:取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合,加入促融合剂,使细胞发生融合,形成杂交瘤细胞。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:所述SP2/0骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞的细胞个数比为1:5-1:10。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:所述促融合剂为聚乙二醇,使用的分子量为4000,质量浓度为50%。
8.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:步骤六所述纯化方法为Protein A亲和层析法,具体操作为Protein A亲和柱用PBS平衡,取抗小鼠腹水过柱,PBS洗至OD值接近于零,以50mmol/L pH 2.5的甘氨酸-HCl溶液洗脱,收集峰值区的洗脱液。
9.一种权利要求1所述鼠抗人C1orf109单克隆抗体在C1orf109蛋白检测中的应用。
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