JP4395004B2 - 胚細胞腫瘍の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、腫瘍の検出方法に関する。より詳細には、胚細胞腫瘍を特異的に検出する方法に関する。

癌や腫瘍の確定診断は、早期診断とともに治療法や治療時期を決定する上で重要である。確定診断において、手術などにより摘出した腫瘍組織の分化度などの判定は、判定者の主観に依存し、診断の再現性あるいは診断判定が困難である場合が存在する。

癌細胞に過剰発現していることが知られているタンパク質として、Y-box-bindingタンパク質（ＹＢ−１）がある（非特許文献１）。ＹＢ−１は、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターのＹ−ボックスに結合する転写因子として見出されたタンパク質であり（非特許文献２）、生物進化上よく保存されており、コールドショックドメイン（ＣＤＳ）タンパク質スーパーファミリーのメンバーである。ＹＢ−１は、転写調節、翻訳調節、ＤＮＡ修復、薬物耐性、およびストレス反応を含む様々な細胞機能に役割を果たすと考えられている。そのため、ＹＢ−１の発現は、癌細胞で過剰発現し、細胞増殖に密接に関連すると考えられている。

ＹＢ−１には、遺伝子レベルで相関性の高い関連タンパク質が存在することが報告されている。ＹＢ−１関連タンパク質としては、現在までに、３種類のタンパク質、ｄｂｐＡ、ｄｂｐＢ（ＹＢ−１と同一；ｄｂｐＢ／ＹＢ−１と記載する場合もある）、およびｄｂｐＣ（Ｃｏｎｔｒｉｎと同一；ｄｂｐＣ／Ｃｏｎｔｒｉｎと記載する場合もある）が同定されている（非特許文献１）。このうち、ヒトのｄｂｐＣ／Ｃｏｎｔｒｉｎは、胚細胞特異的なY-box-bindingタンパク質のホモログであり、マウスのY-box-bindingタンパク質であるＭＳＹ２と、非常に高い相同性がある。
Kohno, Kら，BioEssays，2003年，257巻，pp.691-698 Didier, DKら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1988年，85巻，pp.7322-7326

本発明は、胚細胞由来の腫瘍を特異的かつ容易に検出する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、ＹＢ−１関連タンパク質のうち、ｄｂｐＣ／Ｃｏｎｔｒｉｎ（以下、ｄｂｐＣという）の胚細胞腫瘍における発現を、抗ｄｂｐＣ抗体を用いる免疫組織化学的手段によって非常に特異的に検出できることを見出した。

本発明は、抗ｄｂｐＣ抗体を用いて胚細胞腫瘍のｄｂｐＣを免疫組織化学的に染色する工程を含む、胚細胞腫瘍の検出方法を提供する。

好適な実施態様では、上記抗ｄｂｐＣ抗体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体である。

本発明はまた、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体を提供する。

本発明はさらに、標識された抗ｄｂｐＣ抗体を含む、胚細胞腫瘍検出用キットを提供する。

本発明はまた、抗ｄｂｐＣ抗体、および該抗ｄｂｐＣ抗体に対する標識抗体を含む、胚細胞腫瘍検出用キットも提供する。

好適な実施態様では、上記のいずれかのキットにおいて、上記抗ｄｂｐＣ抗体は、上記の抗体である。

本発明によれば、胚細胞を由来とする腫瘍を特異的にかつ容易に検出することができる。したがって、臨床診断において有力な情報を与える。

本発明の胚細胞腫瘍の検出方法は、抗ｄｂｐＣ抗体を用いて胚細胞腫瘍のｄｂｐＣを免疫組織化学的に染色する工程を含む。ヒトｄｂｐＣは、上記のように胚細胞（生殖細胞）特異的なタンパク質であり、ＹＢ−１と同様に癌細胞で過剰発現すると予想される。そこで、本発明においては、胚細胞腫瘍に特異的に発現したｄｂｐＣを抗ｄｂｐＣ抗体を用いて免疫組織化学的に染色することによって、胚細胞腫瘍の存在を検出する。本発明において「免疫組織化学的に染色する」とは、組織中の抗原に対する特異的な抗体および標識を用いて、抗原が存在する部分を標識の発色、蛍光などによって可視化することをいう。

本発明の抗ｄｂｐＣ抗体は、公知のｄｂｐＣのアミノ酸配列の任意の部分のアミノ酸配列に対する抗体であり得、ｄｂｐＣに特異的に結合する抗体であれば特に限定されない。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、ポリクローナル抗体が好ましい。

このような抗体を産生するために用いられるｄｂｐＣのアミノ酸配列の情報は、当業者が通常用いる配列のデータベースより入手可能である。このｄｂｐＣのアミノ酸配列において、エピトープとして用い得る部分は、遺伝子ファミリーを形成しているｄｂｐＡやｄｂｐＢと相同性のない部分で、かつ抗原となりやすい部分を選定する。本発明においては、Ｃ末端領域より選定した配列番号１に記載のペプチドが特に好ましい。エピトープとして用いるペプチドは、当業者が通常用いる手段（例えば、自動ペプチド合成機）によって合成され得る。

ポリクローナル抗体を産生する場合は、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）に、エピトープを免疫する。この場合、エピトープペプチドは、適切なキャリアタンパク質と予め結合させた後、動物に免疫することが好ましい。当業者が通常用いる手段によって動物に免疫し、適切な免疫期間の後動物から採血し、そして公知の手順に従って処理して血清を得る。所望のｄｂｐＣエピトープに対するポリクローナル抗体を含む抗血清が、他の抗原に対する抗体を含む場合、ポリクローナル抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。

モノクローナル抗体を作成する場合、ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作成するための一般的方法論（例えば、細胞融合による不死化抗体産生細胞株の調製）、または他の技法（例えば、発癌性ＤＮＡでのＢリンパ球の直接形質転換、またはエプスタイン−バーウイルスでのトランスフェクション）が用いられ得る。１つの実施態様では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡイソタイプファミリーに属する。

本発明の抗ｄｂｐＣ抗体は、それ自体が標識されていてもよく、標識されていなくてもよい。抗ｄｂｐＣ抗体が標識されていない場合は、さらに、抗ｄｂｐＣ抗体に対する標識された二次抗体を用いて検出する。二次抗体は、抗ｄｂｐＣ抗体に対する抗体であり、通常、一次抗体（抗ｄｂｐＣ抗体）の起源動物の免疫グロブリンに対する抗体である。

標識としては、酵素標識、蛍光標識、放射標識などが挙げられるが、取り扱いの点で、酵素標識および蛍光標識が好ましい。酵素標識は、少量でも活性が検出可能な高感度の酵素を抗体に結合させるものであり、酵素としては、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。蛍光標識は、蛍光物質を抗体に結合させるものであり、蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどが挙げられる。このような標識を一次抗体または二次抗体に結合させる方法は、当業者に周知である。

本発明の胚細胞腫瘍の検出方法は、例えば、以下のように行われ得る。まず、卵巣または精巣の組織片などの検体を、抗ｄｂｐＣ抗体を含む溶液と適切な条件下で接触させた後、適切な洗浄液で未結合抗体を洗浄する。蛍光標識されている抗ｄｂｐＣ抗体を用いる場合は、そのまま、蛍光顕微鏡などの下で観察する。酵素標識されている抗ｄｂｐＣ抗体を用いる場合は、洗浄後の検体と酵素の基質とを適切な条件下で接触させて酵素反応させた後、標識に応じて光学顕微鏡や電子顕微鏡の下で観察する。また、標識されていない抗ｄｂｐＣ抗体を用いる場合は、洗浄後の検体を標識された二次抗体を接触させ、未結合二次抗体を洗浄後、標識に応じた検出機器下で観察する。

本発明のキットは、少なくとも抗ｄｂｐＣ抗体を含む。このキットに含まれる抗ｄｂｐＣ抗体は、標識されている抗体であっても、非標識抗体であってもよい。必要に応じて、標識された二次抗体、洗浄用緩衝液、ブロッキング液、作業手順指示書などが含まれ得る。

（実施例１：抗ｄｂｐＡ抗体、抗ｄｂｐＢ抗体、および抗ｄｂｐＣ抗体の作成）
（１）ＭＢＳ法によるキャリアタンパク質の調製
Imject Mariculture Keyhole Limpet Hemocyanin（mcKLH、PIERCE社製）２０ｍｇを超純水２ｍＬに溶解して、１０ｍｇ／ｍＬのmcKLH溶液を調製した。スルホ−m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミド（Sulfo-MBS；PIERCE社製）を１５ｍｇ／ｍＬになるように超純水に溶解してＭＢＳ溶液を得た。５０μＬのＭＢＳ溶液に、mcKLH溶液を200μＬを加えて、３０分間穏やかに攪拌しながら混合し、mcKLH/MBS溶液を得た。

（２）ペプチドの調製
抗ｄｂｐＣ抗体のエピトープとして、公知のｄｂｐＣのアミノ酸配列中、Ｃ末端領域より選定した配列番号１のペプチドをペプチド合成機（PE Biosystems社製）により作成した。また、抗ｄｂｐＡ抗体および抗ｄｂｐＢ抗体のエピトープとして、それぞれ配列番号２および３に記載のアミノ酸配列をペプチド合成機により合成した。各ペプチド３ｍｇを、200μＬのImject Purification Buffer Salts（IPBS溶液、PIERCE社製）に溶解し、0.1N水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７〜８に調整し、５分間静置し、ペプチド溶液を得た。

（３）mcKLH/MBSとペプチドとの結合
NAP-10カラム（アマシャム社製）を３ｍＬのIPBS溶液で平衡化した後、上記（１）で調製したmcKLH/MBS溶液をアプライした。このカラムを７５０μＬのIPBS溶液で洗浄し、さらに３ｍＬのIPBS溶液でmcKLH/MBSを溶出させて回収した。回収したmcKLH/MBSに、上記（２）で調製した各ペプチド溶液をそれぞれ加え、穏やかに攪拌しながら２時間混合して、各ペプチド−KLH結合物を得た。NAP-10カラムを３ｍＬのIPBS溶液で平衡化した後、１ｍＬのペプチド−KLH結合物をそれぞれカラムに通し、カラム内の溶液を捨てた。次いで、残りのペプチド−KLH結合物をそれぞれアプライし、３ｍＬのIPBS溶液で溶出させて、５０ｍＬのチューブ中に５ｍＬの各ペプチド−KLH結合物を回収した。

（４）ウサギへの免疫
上記（３）で調製した各ペプチド−KLH結合物１ｍＬを、完全フロイントアジュバント１ｍＬと混和した後、ウサギ（日本白色種、雄、２．５〜３．０ｋｇ）の皮下にそれぞれ０．８ｍＬ／ｋｇの量を初回免疫した。その後、２週間隔で５回追加免疫を行った。追加免疫には、不完全フロイントアジュバント１ｍＬと各ペプチド−KLH結合物１ｍＬとの混和物を用いて、０．７〜０．８ｍＬ／ｋｇの投与量で行った。免疫完了後１週間に採血して、それぞれの抗体を含む抗血清を得た。抗血清の抗体価をウェスタンブロッティングにより確認した。ウェスタンブロッティングは、抗血清を１００００倍希釈したものを一次抗体として用い、その後二次抗体としてホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体を用いて行った。

（実施例２：抗ｄｂｐＣ抗体による各種腫瘍細胞の免疫組織化学染色）
種々の腫瘍の免疫組織化学染色による判定を、ＹＢ−１関連タンパク質に対する抗体（抗ｄｂｐＡ抗体、抗ｄｂｐＢ抗体、および抗ｄｂｐＣ抗体）を用いて検討した。

（１）卵巣または精巣の胚細胞腫瘍
卵巣または精巣の胚細胞腫瘍の組織片（１０検体）を、それぞれパラフィン包埋切片とした。上記実施例１で得た抗血清を５０００倍希釈したものを一次抗体として用い、次いで二次抗体としてホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウス・ウサギＩｇＧ（DAKO社製）を用いて、各検体を免疫染色した。結果を表１に示す。

表１に示すように、抗ｄｂｐＣ抗体は、卵巣および精巣における胚細胞腫瘍を特異的に染色した。一方、抗ｄｂｐＡ抗体は同一検体について染色不能であった。抗ｄｂｐＢ抗体は、染色性が抗ｄｂｐＣ抗体に比べて著しく低かった。このことから、抗ｄｂｐＣ抗体は、胚細胞腫瘍の染色性が非常に良好であることがわかる。

（２）卵巣の胚細胞腫瘍に分類されない癌
卵巣の胚細胞腫瘍に分類されない癌の組織片（１９検体）を、上記（１）と同様に免疫染色した。結果を表２に示す。

１９検体中１２検体が、抗ｄｂｐＢ抗体により染色され、他の７検体では染色微弱であった。抗ｄｂｐＣ抗体については、１９検体中１３検体が染色不能であり、５検体が染色微弱であった。したがって、抗ｄｂｐＣ抗体は、胚細胞腫瘍に分類されない癌を染色しにくいことがわかる。

（３）乳癌
乳癌の組織片について、上記（１）と同様に免疫染色した。結果を表３に示す。

抗ｄｂｐＣ抗体は、１０検体のいずれについても乳癌に対して染色不能または染色微弱であった。抗ｄｂｐＢ抗体は、検体によって染色性が大きくばらついていた。

（４）大腸癌
大腸癌の組織片について、上記（１）と同様に免疫染色した。結果を表４に示す。

抗ｄｂｐＣ抗体は、８検体のいずれについても乳癌に対して染色不能であった。抗ｄｂｐＢ抗体は、検体によって染色性が大きくばらついていた。

以上の（１）〜（４）の結果から、抗ｄｂｐＣ抗体は、胚細胞腫瘍特異的に染色することがわかった。

本発明によれば、胚細胞を由来とする腫瘍を特異的にかつ容易に検出することができる。したがって、癌や腫瘍の臨床診断において有力な情報を与えることができ、早期診断、あるいは治療法や治療時期を決定するために有用である。

Claims (5)

1. 抗ｄｂｐＣ抗体を用いて胚細胞腫瘍のｄｂｐＣを免疫組織化学的に染色する工程を含む、胚細胞腫瘍の検出方法。
2. 前記抗ｄｂｐＣ抗体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体である、請求項１に記載の方法。
3. 標識された抗ｄｂｐＣ抗体を含む、胚細胞腫瘍検出用キット。
4. 抗ｄｂｐＣ抗体、および該抗ｄｂｐＣ抗体に対する標識抗体を含む、胚細胞腫瘍検出用キット。
5. 前記抗ｄｂｐＣ抗体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体である、請求項３または４に記載のキット。