CN1851463A - 间接酶联免疫吸附试验检测马动脉炎病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

一种间接酶联免疫吸附试验检测马动脉炎病毒的方法，其操作程序是：分析马动脉炎病毒GL蛋白的抗原性，设计引物并克隆GL蛋白的抗原域编码基因，构建GL蛋白表达载体pET－GL1，将pET－GL1质粒转化BL－21宿主菌，高效表达GL蛋白，纯化重组GL蛋白作为检测抗原，建立了检测马动脉炎病毒抗体的间接酶联免疫吸附试验(iGL1－ELISA)。iGL1－ELISA与病毒中和试验、西班牙INGEZIM－ARTERITIS试剂盒的检测结果符合率分别达到94.1％、95.6％。iGL1－ELISA方法检测马动脉炎病毒，特异性好、灵敏度高，可提高检测效率，降低检测成本，具有很强的推广性和实用性。

Description

间接酶联免疫吸附试验检测马动脉炎病毒的方法
所属技术领域
本发明是属于马动脉炎病毒感染的检测技术，是一种采用间接酶联免疫吸附试验的检测方法。
背景技术
马动脉炎病毒(Equine Arteritis Virus，EAV)是马病毒性动脉炎的病原，马病毒性动脉炎是引起马的散发性呼吸系统和繁殖系统的接触性传染病，可导致病变器官的小动脉中膜变性和坏死。国际兽疫局(OIE)将马病毒性动脉炎列为B类传染病，我国农业部宣布其为禁止进境的二类动物传染病。马动脉炎病毒为套式病毒目(Nidoviales)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)成员。1953年美国专家Doll等首次从马流产胎儿中分离出该病毒，并命名为Bucyrus株。EAV是线性单股正链RNA病毒，含有七个ORF(开放阅读框架)，编码四种结构蛋白：核衣壳蛋白N、膜蛋白M、大囊膜糖蛋白GL和小囊膜糖蛋白Gs。大囊膜糖蛋白GL含有EAV最主要的中和抗原决定簇，是EAV的主要保护性抗原，GL蛋白和M蛋白通过二硫键形成二聚体复合物，是病毒颗粒的主要组成单位。
在EAV流行地区，马匹一般呈隐性感染或出现比较轻的感染症状，如果在牧场发生流行可造成妊娠母马的高流产率。持续感染的种公马虽然没有明显的临床症状，但是精液中的病毒可传播给雌马，引起EAV的传播。该病呈世界性分布，血清学试验证实，中国也存在此病。由于目前还无法区别自然感染产生的抗体和免疫接种产生的抗体，许多国家为了出口的需要，禁止使用疫苗接种来控制本病。
本发明在做出之前，对马动脉炎病毒的检验检疫方法，世界动物卫生组织(OIE)规定其方法包括：血清中和试验、补体结合试验、血凝和血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。
血清中和试验(SNT)：动物受到病毒感染后，体内产生特异性的中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。中和试验是以测定病毒的感染力为基础，比较病毒受免疫血清中和后的感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释的病毒混合；然后把血清-病毒混合物置适当条件下作用一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，测定血清阻止病毒感染宿主的能力及其效价。如果接种血清-病毒混合物的宿主与对照一样都出现病变或死亡，则说明血清中没有相应的中和抗体。中和试验不仅能定性而且能定量。
补体结合试验(CFT)：补体是一组正常血清蛋白成分，可被免疫复合物激活产生具有裂解细胞壁的因子。如果该过程发生在红细胞表面则导致红细胞裂解而出现溶血。利用这种反应来检测血清中的抗体或抗原，称作补体结合试验(complement fixation test，CFT)。CFT包括两种系统，第一个为反应系统，已知抗原(抗体)，被检血清(或抗原)和补体。第二个系统为指示系统(又称溶血系统)，即溶血素+绵羊红细胞，溶血素即为抗绵羊红细胞抗体，补体常用豚鼠血清，它对红细胞有较强的裂解能力。但补体只有和抗原抗体复合物结合后被激活才能够产生溶血作用。因此，如果试验中的抗原和抗体是对应的，形成免疫复合物，定量的补体就被结合，这时加入指示系统，由于没有游离的补体，就不产生溶血现象，即为阳性反应。反之试验中缺乏抗原或特异性抗体，就不能形成免疫复合物，补体就游离于反应液中，就被指示系统，即绵羊红细胞和溶血素免疫复合物激活，而出现溶血，即阴性反应。
血凝和血凝抑制试验：其基本原理是某些病毒或者病毒的血凝素，能选择性的使几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝。当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，成为血凝抑制反应。该方法的优点是简单快速，但是由于它检测的是病毒抗体，而抗体必须在感染后相当一段时间内才能产生，因此，该方法的应用范围受到限制。
酶联免疫吸附试验(ELISA)：ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。该酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判断有无相应的免疫反应，颜色的深浅与标本中相应抗体或抗原的量成呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪(酶标仪)来测定。
上述方法因敏感性、特异性、确诊时间过长或环境污染等问题，很难满足进出口贸易中快速、敏感、特异、经济的需求。
技术内容
本发明的目的是采用间接酶联免疫吸附试验的检测技术，建立一种敏感、特异、快速、准确的检测方法，并应用于马动脉炎病毒的检验检疫，以提高检测方法的敏感性、特异性，缩短检测时间，降低检测成本，保护和促进我国畜牧业和对外贸易的发展。
本发明是按以下技术方案完成的，其检测方法是：
分析马动脉炎病毒GL蛋白的抗原性，设计引物并克隆GL蛋白的抗原域编码基因，构建GL蛋白原核表达载体pET-GL1，将pET-GL1质粒转化BL-21宿主菌，高效表达EAV GL蛋白，Western-blot鉴定表达产物，表达产物的大小约为26kD，His-Bind柱纯化蛋白，优化马动脉炎病毒抗体的iGL1-ELISA方法的反应条件，并建立结果判断的标准，分析该检测方法的特异性，对待检血清分别用间接酶联免疫吸附试验、病毒中和试验、以及西班牙的INGEZIM-ARTERITIS试剂盒这3种方法进行检测，比较检测结果的符合率。
分析马动脉炎病毒GL蛋白的抗原性：根据GenBank上登陆的EAVBucyrus的基因序列(NC-002532)，应用DNAstar软件分析GL蛋白的抗原性，结果表明GL蛋白54Aa-98Aa抗原指数较高。
设计引物并克隆GL蛋白的抗原域编码基因：用Primer 5.0软件设计引物，目标扩增基因为EAV GL蛋白的54Aa-98Aa区域。在引物P1中加入Bam HI酶切位点，引物P2中加入Xho I酶切位点。引物序列为：
P1：5′-CGT GGATCCTACAACTGTTCCGCCAGTAA-3′，划线部分是Bam HI酶切位点；
P2：5′-ATA CTCGAGCGGACCATGCGCCTGTTC-3′，划线部分是Xho I酶切位点。
取病毒悬液，提取总RNA，进行逆转录反应。取5μL反转录产物为PCR模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，用胶回收试剂盒回收。
构建GL蛋白原核表达载体pET-GL1：将回收的目的片段和pET-32a质粒分别用Bam HI、Xho I酶切，用胶回收试剂盒回收纯化的目的产物。将目的片段和载体按用T4DNA连接酶连接。氯化钙法制备BL21(DE3)感受态细胞，转化连接产物。自氨苄(Amp)平板上挑取单菌落，接种于LB培养基，37℃震荡培养14-16h，碱裂解法提取质粒用Bam HI和Xho I双酶切鉴定。将阳性质粒命名为pET-GL1，测序。
将pET-GL1质粒转化BL-21宿主菌，高效表达EAV GL蛋白：将阳性转化菌接种于含50μ/mL Amp的LB培养基37℃震荡培养过夜。次日以2％的量接种于2×YT培养基(50μ/mL Amp)震荡培养至OD600约为0.4-0.5时分别加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mmol/L的IPTG进行诱导培养4h。取样进行SDS-PAGE电泳鉴定。分别在30℃和37℃的培养条件下用最佳浓度的IPTG进行诱导培养4h。取样进行SDS-PAGE电泳鉴定。表达产物的大小约为26kD。
Western-blot鉴定表达产物：将经诱导表达的菌液处理进行SDS-PAGE电泳后，按《分子克隆实验指南》介绍的方法进行转印及反应，一抗为抗马动脉炎病毒阳性血清，二抗为羊抗马IgG-HRP。显色用DAB试剂。
His-Bind柱纯化蛋白：根据Novagen公司的His·BindPurificationKit说明书进行，取不同时间的洗脱液进行电泳鉴定分析。
优化马动脉炎病毒抗体的iGL1-ELISA方法的反应条件，建立结果判断的标准：进行iGL1-ELISA方阵滴定，选取某一P/N(阳性血清OD值/阴性血清OD值)最大且P在1.0左右的抗原和血清稀释度，确定抗原最佳包被浓度和抗体适宜稀释倍数。结果表明最佳的抗原最佳稀释倍数为1∶40，抗体最佳稀释倍数为1∶80，最佳抗原包被浓度为9.65μg/mL。结果判断的标准是：当待检血清OD490＞0.4，且待检血清OD490/阴性血清OD490＞2时，样品判定为阳性。
分析检测方法的特异性：将马动脉炎阳性血清、马动脉炎阴性血清、血清马鼻肺炎阳性血清、马鼻肺炎阴性血清、马传贫阳性血清、马传贫阴性血清从1∶20开始做倍比稀释，每个样品设3个重复，利用iGL1-ELISA进行检测。
与病毒中和试验进行比较：取病毒中和试验检测过的900份马血清样品，应用本研究建立的iGL1-ELISA进行检测，对检测结果作比较分析。
与西班牙的INGEZIM-ARTERITIS试剂盒进行比较：将180份待检马血清样品分别用进口的试剂盒INGEZIM-ARTERITIS和本研究建立的iGL1-ELISA进行检测，对检测结果作比较分析。
本发明与已有技术对比其特点是：
1、通过基因克隆技术获取抗原性较高的目的基因，构建原核表达载体，转化大肠杆菌，可以方便的得到大量质优价廉的重组抗原，与通过细胞增殖病毒提取抗原相比，iGL1-ELISA与病毒中和试验的符合率达到94.1％，可以节省大量人力、物力，效率更高，表达产物经过纯化后可以作为检测抗原包被微量板。
2、间接ELISA法可以检测抗体，而ELISA法检测抗原。
3、简便快速。利用该方法，从提取核酸到最后结果判定，仅需要8小时。
4、结果判定准确，可靠性高。当待检血清OD490＞0.4，且待检血清OD490/阴性血清OD490＞2时，样品判定为阳性。
附图说明：
图1.EAV GL蛋白分析及目标扩增基因的编码蛋白的抗原性分析
A：EAV GL蛋白；B：目标扩增基因的编码蛋白
图2.目标基因的扩增及表达载体构建鉴定
1.DL15000；2.Bam HI、Xho I酶切的pET-GL1；3.扩增产物；4.DL2000
图3.IPTG最佳诱导浓度的确定
1-5.IPTG浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L，
M.蛋白质分子量标准
图4培养温度对表达的影响
1. 30℃下E.coli孵育pET-GL1；2. 37℃下E.coli孵育pET-GL1；
3. 37℃下E.coli孵育pET-32a；M.蛋白质分子量标准
图5.表达产物的免疫印迹分析
M.蛋白质分子量标准；1.PET-32a-BL21；2.PET-GL1-BL21
图6.表达产物的分离与纯化
M.蛋白质分子量标准；1.BL21(PET-32a)；2.纯化蛋白样品13.纯化蛋白样品2；4.离心后的裂解上清液
具体实施方式
下面通过实施例结合附图详细叙述本发明的马动脉炎病毒GL蛋白间接ELISA的检测方法：
分析马动脉炎病毒GL蛋白的抗原性，设计引物并克隆GL蛋白的抗原域编码基因，构建GL蛋白原核表达载体pET-GL1，之后将pET-GL1质粒转化BL-21宿主菌，高效表达EAV GL蛋白，Western-blot鉴定表达产物，His-Bind柱纯化蛋白，最后优化马动脉炎病毒抗体的iGL1-ELISA方法的反应条件，并建立结果判断的标准，分析该检测方法的特异性，对待检血清分别用间接酶联免疫吸附试验、病毒中和试验、以及西班牙的INGEZIM-ARTERITIS试剂盒这3种方法进行检测，比较检测结果的符合率。
1、分析马动脉炎病毒GL蛋白的抗原性
参照GenBank上登陆的EAV Bucyrus的基因序列(NC 002532)，应用DNAstar软件分析大囊膜蛋白(GL蛋白)的抗原性。具体步骤为：
(1)打开DNAstar软件包，选择“Protean”程序。
(2)在“Protean”程序中，选择“File”下拉菜单中的“New”，新建一个文件，并输入GL蛋白的序列(见核苷酸序列表)。
(3)在界面显示的信息中，选取Antigenic index-Jameson-wolf指数信息(见附图1)，作为分析抗原性的依据。
经过分析，GL蛋白54Aa-98Aa抗原指数较高，设计引物扩增该区域的编码基因，作为目标表达蛋白。选取GL蛋白是因为EAV的中和抗体表位主要位于GL上，分析抗原性的目的是找到抗原指数较高的区域，以得到较好的抗原。
2、设计引物并克隆GL蛋白的抗原域编码基因
用Primer 5.0软件设计一对引物，目标扩增基因为EAV GL蛋白的主要抗原域编码基因，对应于EAV GP5 163-294bp。在引物P1中加入BamHI酶切位点，引物P2中加入Xho I酶切位点。引物序列为：
P1：5′-CGT GGATCCTACAACTGTTCCGCCAGTAA-3′(Bam HI)
P2：5′-ATA CTCGAGCGGACCATGCGCCTGTTC-3′(Xho I)
取500μL病毒悬液，按TripureTM试剂盒的操作说明提取总RNA。提取的病毒总RNA立即用于RT-PCR。反转录的体系为病毒总RNA 9.2μL、5×Buffer 4μL、10mmol/L dNTP2μL、25mmol/L MgCl2 0.8μL、Rnasin1.0μL及下游引物P22μL。65℃反应15min后取出，冰浴条件下加入反转录酶M-MLV 1.0μL，37℃、1h，94℃、5min后结束反应，总体系为20μL。取5μL反转录产物为PCR模板，按常规体系进行PCR扩增，退火温度为56℃，时间为1min，共30个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，用胶回收试剂盒回收。应用设计的引物RT-PCR扩增出大小约为150bp的片段(图2)。
3、构建GL蛋白原核表达载体pET-GL1
将回收的目的片段和pET-32a质粒分别用Bam HI、Xho I酶切，用胶回收试剂盒回收纯化的目的产物。将目的片段和载体按3∶1的摩尔比用进行T4 DNA连接酶进行4℃过夜连接。按《分子克隆实验指南》介绍的氯化钙法制备BL21(DE3)感受态细胞，并按常规方法转化连接产物。自氨苄(Amp)平板上挑取单菌落，接种于含50μ/mL Amp的LB培养基，37℃震荡培养14-16h，碱裂解法提取质粒用Bam HI和Xho I双酶切鉴定。将阳性质粒命名为pET-GL1，送大连TaKaRa公司测序。测序结果表明扩增片段为目的基因，编码EAV GL蛋白55位Asn和97位Gly的密码子AAT和GGA分别突变为大肠杆菌偏嗜性密码子AAC和GGT。双酶切鉴定的电泳结果(图2)表明目的片段已成功插入表达载体。在本步骤中应用的表达载体为pET-32a，是Novagen公司研制的一种新型融合表达载体，该载体含有转录功能强大的T7启动子，在多克隆位点的上游含有大肠杆菌硫氧还原蛋白的编码基因，该蛋白可促进目标蛋白的融合表达。
4、将pET-GL1质粒转化BL-21宿主菌，高效表达EAV GL蛋白
将阳性转化菌接种于含50μ/mL Amp的LB培养基37℃震荡培养过夜。次日以2％的量接种于2×YT培养基(50μ/mL Amp)震荡培养至OD600约为0.4-0.5时分别加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mmol/L的IPTG进行诱导培养4h。取样进行SDS-PAGE电泳鉴定。分别在30℃和37℃的培养条件下用最佳浓度的IPTG进行诱导培养4h。取样进行SDS-PAGE电泳鉴定。不同浓度的IPTG诱导表达产物的SDS-PAGE电泳的结果(图3)表明，0.2-1.0mmol/L的IPTG均可有效诱导目标蛋白的表达，0.8mmol/L的IPTG的诱导效果最佳。表达产物的大小约为26kD。不同温度条件下的诱导表达结果(图4)表明，在30℃和37℃条件下目标产物的表达量没有明显的差别，均可高效表达目标产物。
5、Western-blot鉴定表达产物
将经诱导表达的菌液处理后进行SDS-PAGE电泳，按《分子克隆实验指南》介绍的方法进行转印及反应，一抗为抗马动脉炎病毒阳性血清，二抗为羊抗马IgG-HRP。显色用DAB试剂。经Western-blot检测，在目标条带所处的位置(26kD左右)出现一棕红色印迹(图5)，表明表达产物具有良好的抗原性。
6、His-Bind柱纯化蛋白
将发酵的菌体进行超声波裂解，收集包涵体，变性液溶解后，根据Novagen公司的His·BindPurification Kit层析柱纯化说明书进行，取不同时间的洗脱液进行电泳鉴定分析。见图6，目标蛋白有较高的浓度，尽管存在极少量的杂蛋白，但目标蛋白占有绝对多的含量，表明纯化效果达到预期的目的。pET-32a表达载体的载体阅读框编码了6个连续的His作为亲和标签，使得表达的重组蛋白能通过金属离子(Ni2+)配体亲和层析，为快速纯化目的蛋白提供了便利的条件。
7、优化马动脉炎病毒间接酶联免疫吸附试验的反应条件、建立结果判定标准
根据抗原抗体的某一稀释孔其OD490值为1.0左右，且P/N最大的原则确定抗原抗体的最佳稀释度。本实验设计如表1，结果表明最佳的抗原最佳稀释倍数为1∶40，抗体最佳稀释倍数为1∶80，最佳抗原包被浓度为9.65μg/mL。分析数据、进行结果判断，是依据如下标准：当待检血清OD490＞0.4，且待检血清OD490/阴性血清OD490＞2时，样品判定为阳性。
                     表1EAV间接ELISA方阵滴定结果
  抗原稀释倍数   阳性血清稀释梯度   阴性血清稀释梯度
  20   40   80   160   320   640   1280   2460   20   40   80   160
  102040801603206401280   2.6902.5182.8962.4381.9411.7001.3481.090   1.7911.6391.4891.0830.8500.6940.5170.500   1.0760.9791.1930.6770.5530.4330.3800.326   0.6730.6410.7540.5410.5140.3910.3840.374   0.3820.3870.420.3050.2660.2350.2070.202   0.2240.2330.2310.2410.2350.1910.1870.185   0.1580.1810.1710.1690.1780.1620.1590.159   0.0640.070.0620.0680.0720.0710.0880.082   0.8700.5390.4300.4520.0830.0760.0810.071   0.4130.3510.2880.2740.0610.0650.0630.057   0.2910.2270.1940.1820.0740.0570.0520.067   0.2400.1970.1650.1790.0660.0720.0690.072
第1-8列A-H排为阳性血清；第9-12列A-D排为阴性血清；第9-12列E-H排为空白对照。
8、分析检测方法的特异性
利用iGL1-ELISA检测马动脉炎阳性血清、马动脉炎阴性血清、马鼻肺炎阳性血清、马鼻肺炎阴性血清、马传贫阳性血清、马传贫阴性血清。只有马动脉炎阳性血清样品OD490值与马动脉炎阴性血清样品OD490值的比值远大于2，其余样品的OD490值与马动脉炎阴性血清样品OD490值的比值均小于2。建立的iGL1-ELISA具有较好的特异性。
9、iGL1-ELISA与病毒中和试验检测结果的比较
应用iGL1-ELISA对病毒中和试验检测过的900份马血清样品进行了检测。结果病毒中和试验检测为阳性的138份血清，iGL1-ELISA结果也全为阳性(待检血清OD490/阴性血清OD490＞2)；病毒中和试验检测为阴性的762份血清中iGL1-ELISA结果为阴性的为729份(待检血清OD490/阴性血清OD490＜2)，但有53份为阳性(待检血清OD490/阴性血清OD490＞2)。在900份马血清样品中，病毒中和试验检测阳性率为15.3％，iGL1-ELISA检测为阳性的样品有171份，阳性率19％。
iGL1-ELISA与病毒中和试验进行对比发现，在900份马血清样品中iGL1-ELISA与中和试验的结果相符合的样品为867份，两种方法的检测符合率为94.1％。
iGL1-ELISA结果为阴性的729份马血清的OD490的平均值为0.243±0.067。因此，初步确定iGL1-ELISA检测结果的阳性标准为：待检血清OD490＞0.4，且待检血清OD490/阴性血清OD490＞2。
10、iGL1-ELISA与INGEZIM-ARTERITIS比较试验结果
对该检测方法与西班牙INGEZIM-ARTERITIS试剂盒进行了比较，按照实施例7的方法，及西班牙INGEZIM-ARTERITIS试剂盒说明书，对180份待检血清进行了检测，结果显示，iGL1-ELISA检测结果的阳性率为18.3％，INGEZIM-ARTERITIS试剂盒检测结果的阳性率17.2％。本研究制备的iGL1-ELISA试剂盒与INGEZIM-ARTERITIS试剂盒的检测符合率为95.6％(表2)。
    表2本检测方法与西班牙检测试剂盒比较试验结果
  检测方法   检测结果   样品数量   血清样品总数
  本方法   阳性(+)   28 180
  西班牙试剂盒   阳性(+)
  本方法   阴性(-)   144
  西班牙试剂盒   阴性(-)
  本方法   阴性(-)   3
  西班牙试剂盒   阳性(+)
  本方法   阳性(+)   5
  西班牙试剂盒   阴性(-)
                        核苷酸序列表
<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>间接酶联免疫吸附试验检测马动脉炎病毒的方法
<160>3
<170>Patent In Version 2.1
<210>1
<211>768
<212>RNA
<213>马动脉炎病毒(Arterivirus SP.)
<221>CDS
<222>(11146)…(11913)
<400>1
atgttatcta tgattgtatt gctattcttg ctttggggtg cgccatcaca tgcttacttc   60
tcatactaca ccgctcagcg cttcacagac ttcaccttgt gtatgctgac ggatcgcggc  120
gttattgcca atttgctgcg atatgatgag cacactgctt tgtacaattg ttccgccagt  180
aaaacctgtt ggtattgcac attcctggac gaacagatta tcacgtttgg aaccgattgt  240
gatgacacct acgcggtccc agttgctgag gtcctggaac aggcgcatgg accgtacagt  300
gcgctgtttg atgacatgcc cccttttatt tactatggcc gtgaattcgg catagttgtg  360
ttggatgtgt ttatgttcta tcccgtttta gttctgtttt tcttatcagt actaccctat  420
gctacgctta ttcttgaaat gtgtgtatct attctgttta taatctatgg catttacagc  480
ggggcctact tggccatggg catatttgcg gccacgcttg ctatacattc aattgtggtc  540
ctccgccaat tactgtggtt atgcctggct tggcgatacc gctgtacgct tcacgcgtcc  600
tttatatcag ctgaggggaa agtgtacccc gtagaccccg gactcccggt tgccgccgtg  660
ggcaatcggt tgttagtccc aggtaggccc actatcgatt atgcagtggc ctacggcagc  720
aaagtcaacc ttgtgaggtt gggggcagct gaggtatggg agccatag               768
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据PCR反应要求设计，用于扩增马动脉炎病毒的正链引物。
<400>2
CGTGGATCCT ACAACTGTTC CGCCAGTAA  29
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据PCR反应要求设计，用于扩增马动脉炎病毒的负链引物。
<400>3
ATACTCGAGC GGACCATGCG CCTGTTC    27

Claims (4)

1、一种间接酶联免疫吸附试验检测马动脉炎病毒的方法，其特征在于它的程序是：分析马动脉炎病毒GL蛋白的抗原性，设计引物并克隆GL蛋白的抗原域编码基因，构建GL蛋白原核表达载体pET-GL1，将pET-GL1质粒转化BL-21宿主菌，高效表达EAV GL蛋白，Western-blot鉴定表达产物，His-Bind柱纯化蛋白，优化马动脉炎病毒抗体的iGL1-ELISA方法的反应条件，建立判定结果的标准，分析该检测方法的特异性，对待检血清分别用间接酶联免疫吸附试验、病毒中和试验、以及西班牙的INGEZIM-ARTERITIS试剂盒这3种方法进行检测，比较检测结果的符合率。
2.根据权利要求1所述的一种间接酶联免疫吸附试验检测马动脉炎病毒的方法，其特征在于所述的分析马动脉炎病毒GL蛋白的抗原性，设计引物克隆GL蛋白的抗原域编码基因，其步骤是：根据GenBank上登陆的EAV Bucyrus的基因序列NC-002532，应用DNAstar软件分析GL蛋白的抗原性，其中GL蛋白54Aa-98Aa抗原指数较高，用Primer 5.0软件设计一对引物扩增该区域，引物序列为：
P1：5′-CGT GGATCCTACAACTGTTCCGCCAGTAA-3′，划线部分是Bam HI酶切位点；
P2：5′-ATA CTCGAGCGGACCATGCGCCTGTTC-3′，划线部分是Xho I酶切位点。
3.根据权利要求1所述的一种间接酶联免疫吸附试验检测马动脉炎病毒的方法，其特征在于所述的高效表达EAV GL蛋白，其程序是将阳性转化菌接种于LB培养基37℃震荡培养过夜，次日以2％的量接种于含有50μ/mL Amp的2×YT培养基，震荡培养至OD600约为0.4-0.5时，加入0.8mmol/L的IPTG，在30℃和37℃的培养条件下进行诱导培养4小时，SDS-PAGE电泳鉴定表达产物的大小约为26kD。
4.根据权利要求1所述的一种间接酶联免疫吸附试验检测马动脉炎病毒的方法，其特征在于所述的建立了判定结果的标准，其标准是：当待检血清OD490＞0.4，且待检血清OD490/阴性血清OD490＞2时，样品判定为阳性。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102768276A (zh) * 2012-07-23 2012-11-07 甘肃农业大学 脂环酸芽孢杆菌的间接elisa检测试剂盒及其应用
CN102981000A (zh) * 2012-11-20 2013-03-20 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种基于合成肽检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒

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