CN108164603B - 重组羊痘病毒融合蛋白的可溶性表达方法及其所用生物材料 - Google Patents

重组羊痘病毒融合蛋白的可溶性表达方法及其所用生物材料 Download PDF

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Abstract

本发明公开了重组羊痘病毒融合蛋白的可溶性表达方法及其所用生物材料。该生物材料是a)、b)或c)的蛋白质的生物材料：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2第8‑629位氨基酸残基的蛋白质；b)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与a)相同活性的可溶性蛋白质。将利用该生物材料制备的重组羊痘病毒融合蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA检测羊痘病毒抗体的方法不仅可用于羊痘的诊断,而且可评价疫苗免疫效果,此外,该方法可快速准确的检测羊痘,从而为我国更好的控制羊痘的传播将会产生积极作用。

Description

重组羊痘病毒融合蛋白的可溶性表达方法及其所用生物材料
技术领域
本发明涉及生物技术领域中重组羊痘病毒融合蛋白的可溶性表达方法及其所用生物材料。
背景技术
羊痘，又叫羊“天花”，是由羊痘病毒(Capripoxvirus，CaPV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，具有高发病率和能造成严重畜牧业经济损失的特点。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须上报的传染病，可见其重要性。因该病发病急、发病率高、发病后对羊毛、羊绒质量和肉制品的产量都有很大的影响，给我国养羊业造成了巨大的经济损失。目前检测抗羊痘病毒抗体的标准方法是羊痘血清中和试验，该方法是检测羊痘病毒属抗体的有效方法，但是也存在很多的缺点。该方法的主要缺点是羊痘病毒培养困难，中和试验周期一般为7-14天，既费时费力，又需要活病毒进行试验，而在无羊痘流行的国家和地区是禁止活病毒入境的，所以说该方法并不适用于基层羊痘净化，同时目前国内外也没有一个很好的血清学抗体检测方法。
羊痘诊断中面临的难题是感染羊血清中抗体水平太低，尤其是疫苗免疫羊血清中抗体水平更低，往往检测不到。目前，为了检测痘病毒诱导产生的抗体，国外学者试图建立多种抗体检测方法，并且不断努力改进这些方法，以提高其敏感性和特异性。Lamien等2011年报道利用密度梯度超速离心纯化的病毒抗原，建立了间接ELISA方法，但是其敏感性取决于纯化抗原的纯度。兰州兽医研究所的马维民博士等2006年利用羊痘病毒主要抗原蛋白P32蛋白建立的iELISA方法，其特异性较好，与羊口疮、牛痘感染血清无交叉反应，但是敏感性方面较差。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是如何提高羊痘病毒抗体检测的灵敏度，并且降低漏检率。
为了解决上述技术问题，本发明提供了与重组羊痘病毒融合蛋白相关的生物材料。
本发明所提供的与重组羊痘病毒融合蛋白相关的生物材料中，所述重组羊痘病毒融合蛋白为a)、b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第8-629位氨基酸残基的蛋白质；
b)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与a)相同活性的可溶性蛋白质；
所述生物材料为下述B1)至B16)中的任一种：
B1)编码所述重组羊痘病毒融合蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述生物材料中，a)的蛋白质名称为L1-P32-A33-Y，b)的蛋白质名称为His-L1-P32-A33-Y-His。SEQ ID No.2由637个氨基酸残基组成。
上述生物材料中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述生物材料中，所述核酸分子为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列是SEQ ID No.1的第25-1890位核苷酸的DNA分子；
2)核苷酸序列是SEQ ID No.1的第25-1890位核苷酸的DNA分子；
3)编码序列是SEQ ID No.1的第4-1917位核苷酸的DNA分子；
4)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
5)与1)、2)、3)或4)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
上述生物材料中，SEQ ID No.1由1917个核苷酸组成，1)和2)是L1-P32-A33-Y基因，3)和4)是His-L1-P32-A33-Y-His基因。
上述生物材料中，5)中，90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％或99％的同一性的DNA分子。
上述生物材料中，所述重组载体为pET30a-L1-P32-A33-Y；所述pET30a-L1-P32-A33-Y是用核苷酸序列是SEQ ID No.1的第1-1896位的DNA替换pET30a(+)的Nde I和XhoI识别位点间的片段(包括Nde I识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到的所述重组羊痘病毒融合蛋白的重组表达载体；
所述重组微生物为E1)或E2)：
E1)所述重组微生物为将所述重组羊痘病毒融合蛋白的编码基因导入受体微生物，得到表达所述重组羊痘病毒融合蛋白的重组微生物，所述受体微生物为C1)-C4)中的任一种:
C1)原核微生物；
C2)革兰氏阴性细菌；
C3)埃希氏菌属细菌；
C4)大肠杆菌BL21(DE3)；
E2)所述重组微生物为将所述pET30a-L1-P32-A33-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物。
本文中，术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，B9)至B16)可包括繁殖材料也可不包括繁殖材料。
为解决上述技术问题，本发明还提供了重组羊痘病毒融合蛋白的可溶性表达方法。
本发明所提供的重组羊痘病毒融合蛋白的可溶性表达方法包括：使所述重组羊痘病毒融合蛋白的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质；所述生物为微生物、植物或非人动物。
上述方法中，使所述重组羊痘病毒融合蛋白的编码基因在生物中进行表达包括将所述重组羊痘病毒融合蛋白的编码基因导入受体微生物，得到表达所述重组羊痘病毒融合蛋白的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述重组羊痘病毒融合蛋白。
上述方法中，所述受体微生物可为C1)-C4)中的任一种:
C1)原核微生物；
C2)革兰氏阴性细菌；
C3)埃希氏菌属细菌；
C4)大肠杆菌BL21(DE3)。
上述方法中，所述重组羊痘病毒融合蛋白的编码基因可为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列是SEQ ID No.1的第25-1890位核苷酸的DNA分子；
2)核苷酸序列是SEQ ID No.1的第25-1890位核苷酸的DNA分子；
3)编码序列是SEQ ID No.1的第4-1917位核苷酸的DNA分子；
4)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
5)与1)、2)、3)或4)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
上述方法中，所述重组微生物可为所述pET30a-L1-P32-A33-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物。
上述方法中，所述表达可为诱导表达，所述诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13-16小时或13-24小时或13小时或16小时。
上述生物材料和上述方法在制备检测羊痘病毒抗体的试剂盒中的应用、在制备羊痘诊断抗原中的应用、或在制备羊痘诊断试剂盒中的应用，均属于本发明的保护范围。
本发明将羊痘病毒L1蛋白、P32蛋白和A33蛋白截短后并对其基因进行密码子优化后融合串联后在大肠杆菌中获得了可溶性融合高表达抗原，即重组羊痘病毒融合蛋白His-L1-P32-A33-Y-His：本发明表达的重组羊痘病毒融合蛋白的含量达到菌体总蛋白的40％，56％可溶。将本发明表达的重组羊痘病毒融合蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA检测羊痘病毒抗体的方法具有较高的特异性、敏感性和良好的精确度,且能快速、简便的操作,有利于临床上对羊痘的监测。将本发明表达的重组羊痘病毒融合蛋白His-L1-P32-A33-Y-His作为包被抗原建立的间接ELISA检测羊痘病毒抗体的方法的敏感性明显高于分别采用His-L1-P32-Y-His、His-L1-A33-Y-His、His-P32-A33-Y-His、His-L1-Y-His、His-A33-Y-His和His-P32-Y-His作为包被抗原建立的间接ELISA检测羊痘病毒抗体的方法的敏感性，也明显高于羊痘血清中和试验方法的敏感性。将本发明表达的重组羊痘病毒融合蛋白His-L1-P32-A33-Y-His作为包被抗原建立的间接ELISA检测羊痘病毒抗体的方法与羊痘血清中和试验方法的总符合率和阳性符合率显著高于分别以His-L1-P32-Y-His、His-L1-A33-Y-His、His-P32-A33-Y-His、His-L1-Y-His、His-A33-Y-His和His-P32-Y-His作为包被抗原建立的间接ELISA检测羊痘病毒抗体的方法。将本发明表达的重组羊痘病毒融合蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA检测羊痘病毒抗体的方法不仅可用于羊痘的诊断,而且可评价疫苗免疫效果,此外,该方法可快速准确的检测羊痘,从而为我国更好的控制羊痘的传播将会产生积极作用。
附图说明
图1为各菌株表达蛋白的SDS-PAGE电泳图谱。
图中，泳道Marker为蛋白质分子量标准，从上到下分别为180kDa、135kDa、100kDa、75kDa、65kDa、45kDa、35kDa、25kDa、15kDa、10kDa，1为诱导表达的BL21(DE3)/pET30a全菌蛋白液体，2为诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-W全菌蛋白液体，3为诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-obL1-P32-A33-Y全菌蛋白液体，4为诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-Y的全菌蛋白液体，5为诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-Y含蛋白上清液，6为诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-Y含蛋白沉淀，7为镍柱纯化的His-L1-P32-A33-Y-His蛋白，8为分子筛纯化的His-L1-P32-A33-Y-His蛋白，9为诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-Y含蛋白上清液，10为诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-A33-Y含蛋白上清液，11为诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-P32-A33-Y含蛋白上清液，12为诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-Y含蛋白上清液，13为诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-A33-Y含蛋白上清液，14为诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-P32-Y含蛋白上清液。
图2为重组蛋白His-L1-P32-A33-Y-His的分子筛纯化鉴定与结构鉴定。箭头所指的为纯化的目的蛋白峰，横坐标标题为保留时间(分钟)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1.下述实施例中的pET30a(+)为Novagen公司产品。
2.下述实施例中的羊痘血清中和试验方法如下：
2.1被检血清处理 血清于58℃灭活30分钟，用无血清的MEM培养基进行梯度稀释备用。
2.2对照血清 使用抗羊痘病毒标准阴性血清和抗羊痘病毒标准阳性血清(英国Pribright研究所(英国动物健康研究所))。
2.3中和 将浓度为2×105个/ml的Vero细胞悬液接种到96孔细胞板上，100μl/孔。37℃ 5％CO2温箱中培养1-2日，直到有70％-80％的细胞形成单层。将50μl已经稀释好的待检血清与含100 TCID50/50μl的羊痘病毒GanSuHN株悬液等体积混合，置37℃ 5％CO2温箱中作用1小时。
2.4培养 血清和病毒中和1小时后，细胞培养板的中和孔，每孔加100μl病毒与血清的混合悬液，37℃ 5％CO2温箱中继续培养。
2.5结果判定
2.5.1接种后72小时进行结果初判，弃掉有特异性病变的孔，并把其他孔的培养液换成维持液，并继续旋转培养7天，进行终判。
2.5.2判定标准能抑制50％或者50％以上的细胞出现细胞病变效应(CPE)者判为阳性。根据此标准计算血清的最大中和稀释倍数。
实施例1、可溶性表达重组羊痘病毒融合蛋白
1、重组表达载体的构建
1.1由三个羊痘病毒蛋白片段融合而成的重组羊痘病毒融合蛋白基因重组表达载体的构建
本申请设计了3种由三个羊痘病毒蛋白片段融合而成的重组羊痘病毒融合蛋白基因，分别为SEQ ID No.1所示的His-L1-P32-A33-Y-His基因(CDS为第4-1917位)、SEQ IDNo.3所示的His-L1-P32-A33-W-His基因(CDS为第4-1917位)(作为His-L1-P32-A33-Y-His基因的对照)和SEQ ID No.4所示的His-obL1-P32-A33-Y-His基因(CDS为第4-2436位)(作为His-L1-P32-A33-Y-His基因的对照)。His-L1-P32-A33-Y-His基因和His-L1-P32-A33-W-His基因均编码SEQ ID No.2所示的蛋白质His-L1-P32-A33-Y-His(即本发明的重组羊痘病毒融合蛋白)。His-obL1-P32-A33-Y-His基因编码SEQ ID No.5所示的蛋白质His-obL1-P32-A33-Y-His。
SEQ ID No.1由1917个核苷酸组成，其中，第4-1917位为His-L1-P32-A33-Y-His基因的CDS，第25-567位为L1片段的核苷酸序列，第568-612位为连接肽1的核苷酸序列，第613-1452位为P32片段的核苷酸序列，第1453-1497位为连接肽2的核苷酸序列，第1498-1890位为A33片段的核苷酸序列。
SEQ ID No.2由637个氨基酸残基组成，其中，第8-188位为L1片段的氨基酸序列，第189-203位为连接肽1的氨基酸序列，第204-483位为P32片段的氨基酸序列，第484-498位为连接肽2的氨基酸序列，第499-629位为A33片段的氨基酸序列。
SEQ ID No.3由1917个核苷酸组成，其中，第4-1917位为His-L1-P32-A33-W-His基因的CDS，第25-567位为L1片段的核苷酸序列，第568-612位为连接肽1的核苷酸序列，第613-1452位为P32片段的核苷酸序列，第1453-1497位为连接肽2的核苷酸序列，第1498-1890位为A33片段的核苷酸序列。
SEQ ID No.4由2436个核苷酸组成，其中，第4-2436位为His-obL1-P32-A33-Y-His基因的CDS，第25-567位为L1片段的核苷酸序列，第568-759为L1′片段的核苷酸序列，第760-804位为连接肽1的核苷酸序列，第805-1644位为P32片段的核苷酸序列，第1645-1770位为P32′片段的核苷酸序列，第1771-1815位为连接肽2的核苷酸序列，第1816-2016位为A33′片段的核苷酸序列，第2017-2409位为A33片段的核苷酸序列。
SEQ ID No.5由810个氨基酸残基组成，其中，第8-188位为L1片段的氨基酸序列，第189-252位为L1′片段的氨基酸序列，第253-267位为连接肽1的氨基酸序列，第268-547位为P32片段的氨基酸序列，第548-589位为P32′片段的氨基酸序列，第590-604位为连接肽2的氨基酸序列，第605-671位为A33′片段的氨基酸序列，第672-802位为A33片段的氨基酸序列。
SEQ ID No.5所示的蛋白质His-obL1-P32-A33-Y-His与SEQ ID No.2所示的蛋白质His-L1-P32-A33-Y-His的区别在于，将SEQ ID No.5的第189-252位所示的L1′片段、第548-589位的P32′片段和第605-671位的A33′片段均缺失即得到SEQ ID No.2。
用核苷酸序列是SEQ ID No.1的第1-1896位的DNA替换pET30a(+)的Nde I和XhoI识别位点间的片段(包括Nde I识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到His-L1-P32-A33-Y-His基因重组表达载体，命名为pET30a-L1-P32-A33-Y。pET30a-L1-P32-A33-Y含有核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子。pET30a-L1-P32-A33-Y含有His-L1-P32-A33-Y-His基因，His-L1-P32-A33-Y-His基因的核苷酸序列是SEQID No.1，编码序列是SEQ ID No.1的第4-1917位核苷酸，His-L1-P32-A33-Y-His基因编码SEQ ID No.2所示的蛋白质His-L1-P32-A33-Y-His。
用核苷酸序列是SEQ ID No.3的第1-1896位的DNA替换pET30a(+)的Nde I和XhoI识别位点间的片段(包括Nde I识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到His-L1-P32-A33-W-His基因重组表达载体，命名为pET30a-L1-P32-A33-W。pET30a-L1-P32-A33-W含有His-L1-P32-A33-W-His基因，His-L1-P32-A33-W-His基因的核苷酸序列是SEQ ID No.3，编码序列是SEQ ID No.3的第4-1917位核苷酸，His-L1-P32-A33-W-His基因编码SEQ ID No.2所示的蛋白质His-L1-P32-A33-Y-His。
用核苷酸序列是SEQ ID No.4的第4-2415位的DNA替换pET30a(+)的Nde I和XhoI识别位点间的片段(包括Nde I识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到His-obL1-P32-A33-Y-His基因重组表达载体，命名为pET30a-obL1-P32-A33-Y。pET30a-obL1-P32-A33-Y含有His-obL1-P32-A33-Y-His基因，His-obL1-P32-A33-Y-His基因的核苷酸序列是SEQ ID No.4，编码序列是SEQ ID No.4的第4-2436位核苷酸，His-obL1-P32-A33-Y-His基因编码SEQ ID No.5所示的蛋白质His-obL1-P32-A33-Y-His。
1.2由两个羊痘病毒蛋白片段融合而成的重组羊痘病毒融合蛋白基因重组表达载体的构建
作为His-L1-P32-A33-Y-His基因的对照，还设计了3种由二个羊痘病毒蛋白片段融合而成的重组羊痘病毒融合蛋白基因重组表达载体，分别为His-L1-P32-Y-His基因重组表达载体、命名为pET30a-L1-P32-Y，His-L1-A33-Y-His基因重组表达载体、命名为pET30a-L1-A33-Y，His-P32-A33-Y-His基因重组表达载体、命名为pET30a-P32-A33-Y。
pET30a-L1-P32-Y是将pET30a-L1-P32-A33-Y含有的核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子替换为His-L1-P32-Y-His基因，保持pET30a-L1-P32-A33-Y的其它核苷酸不变得到的His-L1-P32-Y-His基因重组表达载体。His-L1-P32-Y-His基因是将SEQ ID No.1第1453-1890位核苷酸(对应于连接肽2和A33片段的编码基因)缺失，保持SEQ ID No.1的其它核苷酸不变得到的DNA分子。pET30a-L1-P32-Y表达融合蛋白His-L1-P32-Y-His，His-L1-P32-Y-His是将SEQ ID No.2的第484-629位氨基酸残基(对应于连接肽2和A33片段的氨基酸序列)缺失，保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基不变得到的蛋白质。
pET30a-L1-A33-Y是将pET30a-L1-P32-A33-Y含有的核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子替换为His-L1-A33-Y-His基因，保持pET30a-L1-P32-A33-Y的其它核苷酸不变得到的His-L1-A33-Y-His基因重组表达载体。His-L1-A33-Y-His基因是将SEQ ID No.1第568-1452位核苷酸(对应于连接肽1和P32片段的编码基因)缺失，保持SEQ ID No.1的其它核苷酸不变得到的DNA分子。pET30a-L1-A33-Y表达融合蛋白His-L1-A33-Y-His，His-L1-A33-Y-His是将SEQ ID No.2的第189-483位氨基酸残基(对应于连接肽1和P32片段的氨基酸序列)缺失，保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基不变得到的蛋白质。
pET30a-P32-A33-Y是将pET30a-L1-P32-A33-Y含有的核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子替换为His-P32-A33-Y-His基因，保持pET30a-L1-P32-A33-Y的其它核苷酸不变得到的His-P32-A33-Y-His基因重组表达载体。His-P32-A33-Y-His基因是将SEQ ID No.1第25-612位核苷酸(对应于L1片段和连接肽1的编码基因)缺失，保持SEQ ID No.1的其它核苷酸不变得到的DNA分子。pET30a-P32-A33-Y表达融合蛋白His-P32-A33-Y-His，His-P32-A33-Y-His是将SEQ ID No.2的第8-203位氨基酸残基(对应于L1片段和连接肽1的氨基酸序列)缺失，保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基不变得到的蛋白质。
1.3 1个羊痘病毒蛋白片段基因重组表达载体的构建
作为His-L1-P32-A33-Y-His基因的对照，还设计了3种1个羊痘病毒蛋白片段基因重组表达载体，分别为His-L1-Y-His基因重组表达载体、命名为pET30a-L1-Y，His-A33-Y-His基因重组表达载体、命名为pET30a-A33-Y，His-P32-Y-His基因重组表达载体、命名为pET30a-P32-Y。
pET30a-L1-Y是将pET30a-L1-P32-A33-Y含有的核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子替换为His-L1-Y-His基因，保持pET30a-L1-P32-A33-Y的其它核苷酸不变得到的His-L1-Y-His基因重组表达载体。His-L1-Y-His基因是将SEQ ID No.1第568-1890位核苷酸(对应于连接肽1、P32片段、连接肽2和A33片段的编码基因)缺失，保持SEQ ID No.1的其它核苷酸不变得到的DNA分子。pET30a-L1-Y表达蛋白质His-L1-Y-His，His-L1-Y-His是将SEQ IDNo.2的第189-629位氨基酸残基(对应于连接肽1、P32片段、连接肽2和A33片段的氨基酸序列)缺失，保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基不变得到的蛋白质。
pET30a-A33-Y是将pET30a-L1-P32-A33-Y含有的核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子替换为His-A33-Y-His基因，保持pET30a-L1-P32-A33-Y的其它核苷酸不变得到的His-A33-Y-His基因重组表达载体。His-A33-Y-His基因是将SEQ ID No.1第25-1497位核苷酸(对应于L1片段、连接肽1、P32片段和连接肽2的编码基因)缺失，保持SEQ ID No.1的其它核苷酸不变得到的DNA分子。pET30a-A33-Y表达蛋白质His-A33-Y-His，His-A33-Y-His是将SEQ ID No.2的第8-498位氨基酸残基(对应于L1片段、连接肽1、P32片段和连接肽2的氨基酸序列)缺失，保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基不变得到的蛋白质。
pET30a-P32-Y是将pET30a-L1-P32-A33-Y含有的核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子替换为His-P32-Y-His基因，保持pET30a-L1-P32-A33-Y的其它核苷酸不变得到的His-P32-Y-His基因重组表达载体。His-P32-Y-His基因是将SEQ ID No.1第25-612位核苷酸(对应于L1片段和连接肽1的编码基因)和SEQ ID No.1第1453-1890位核苷酸(对应于连接肽2和A33片段的编码基因)缺失，保持SEQ ID No.1的其它核苷酸不变得到的DNA分子。pET30a-P32-Y表达蛋白质His-P32-Y-His，His-P32-Y-His是将SEQ ID No.2的第8-203位氨基酸残基(对应于L1片段和连接肽1的氨基酸序列)和SEQ ID No.2的第484-629位氨基酸残基(对应于连接肽2和A33片段的氨基酸序列)缺失，保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基不变得到的蛋白质。
2、重组菌的构建
将步骤1构建的pET30a-L1-P32-A33-Y、pET30a-L1-P32-A33-W、pET30a-obL1-P32-A33-Y、pET30a-L1-P32-Y、pET30a-L1-A33-Y、pET30a-P32-A33-Y、pET30a-L1-Y、pET30a-A33-Y、pET30a-P32-Y这9种表达载体分别单独转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将其均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒进行测序，将测序结果表明含有pET30a-L1-P32-A33-Y的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-Y，将测序结果表明含有pET30a-L1-P32-A33-W的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-W，将测序结果表明含有pET30a-obL1-P32-A33-Y的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a-obL1-P32-A33-Y，将测序结果表明含有pET30a-L1-P32-Y的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-Y，将测序结果表明含有pET30a-L1-A33-Y的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a-L1-A33-Y，将测序结果表明含有pET30a-P32-A33-Y的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a-P32-A33-Y，将测序结果表明含有pET30a-L1-Y的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a-L1-Y，将测序结果表明含有pET30a-A33-Y的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a-A33-Y，将测序结果表明含有pET30a-P32-Y的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a-P32-Y。同时将pET30a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)得到含有pET30a(+)的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET30a，作为空载体对照。
3、蛋白表达形式的分析与鉴定
将BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-Y、BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-W、BL21(DE3)/pET30a-obL1-P32-A33-Y、BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-Y、BL21(DE3)/pET30a-L1-A33-Y、BL21(DE3)/pET30a-P32-A33-Y、BL21(DE3)/pET30a-L1-Y、BL21(DE3)/pET30a-A33-Y、BL21(DE3)/pET30a-P32-Y和BL21(DE3)/pET30a这10个菌株分别单独接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D600值(以含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。上述10株菌的诱导表达均是用0.75mM的IPTG在16℃诱导16小时(该诱导表达条件是经过对温度、时间、IPTG浓度等条件进行优化得到的高效可溶性诱导表达条件)。
取上述诱导表达发酵液用于蛋白表达形式分析。具体步骤为，取1mL发酵液置于1.5mL离心管中，做好标记，4℃条件下8500rpm/min离心45min，弃掉上清液，收集菌体沉淀。加入1mL PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入200μL PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液体。将全菌蛋白液体于4℃离心机中18000rpm/min离心45min，分别收集上清液(命名为含蛋白上清液)和沉淀(命名为含蛋白沉淀)，向含蛋白沉淀中加入50μL PBS重悬洗涤沉淀。向全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入10μL 5×SDS-PAGE loading Buffer，充分混匀后，置沸水浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离心机瞬离。取6μL用于SDS-PAGE电泳分析，并且结合蛋白灰度分析软件初步分析蛋白含量。将电泳后的凝胶转印于NC膜，以抗His标签的羊抗鼠抗体为结合抗体DAB显色，进行Western-blot鉴定。将上述全菌蛋白液体和含蛋白上清液用0.22μm滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl，溶剂是水，pH8.0的溶液)平衡好的镍柱。将镍柱接入AKTA机器上，分别用10个柱体积的溶液1与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白，并在AKTA机器上监测蛋白峰。用溶液3(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)冲洗挂在镍柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，将该样品称为镍柱纯化目的蛋白样品。
将镍柱纯化的目的蛋白样品用GE公司生产的Superdex200凝胶柱通过分子筛进一步纯化。流动相使用溶液1。通过分子筛纯化后可以除去样品中的含有的大量咪唑，收集洗脱峰，得到分子筛纯化的目的蛋白样品，使用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)对得到的分子筛纯化的目的蛋白样品中蛋白(即可溶性目的蛋白)的含量进行定量分析。并用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)测定全菌蛋白液体中的蛋白质含量，得到菌体总蛋白含量。将含蛋白沉淀用尿素溶解后，用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)测定含蛋白沉淀中的蛋白质的含量。
结果表明诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-Y的全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均含有大小为71.3kDa的目的蛋白His-L1-P32-A33-Y-His；诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-Y的全菌蛋白液体中的目的蛋白His-L1-P32-A33-Y-His占菌体总蛋白(全菌总蛋白)的40％，诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-Y的含蛋白上清液中的目的蛋白His-L1-P32-A33-Y-His占诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-Y的全菌蛋白液体中目的蛋白His-L1-P32-A33-Y-His的56％，该56％的目的蛋白His-L1-P32-A33-Y-His为可溶性蛋白；诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-Y的含蛋白沉淀中的目的蛋白His-L1-P32-A33-Y-His占诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-Y的全菌蛋白液体中目的蛋白His-L1-P32-A33-Y-His的44％，该44％的目的蛋白His-L1-P32-A33-Y-His为不溶性包涵体蛋白；说明诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-Y的目的蛋白His-L1-P32-A33-Y-His占菌体总蛋白的40％，BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-Y表达的目的蛋白His-L1-P32-A33-Y-His中56％为可溶性蛋白，44％为不溶性包涵体蛋白。诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-W的全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均不含有大小为71.3kDa的目的蛋白His-L1-P32-A33-Y-His；说明BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-W没有表达目的蛋白His-L1-P32-A33-Y-His。诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-obL1-P32-A33-Y的全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均不含有大小为91.2kDa的目的蛋白His-obL1-P32-A33-Y-His；说明BL21(DE3)/pET30a-obL1-P32-A33-Y没有表达目的蛋白His-obL1-P32-A33-Y-His。可见，虽然采用同一种表达载体pET30a(+)和同一种宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，不同的外源目的基因的表达情况相差很大，将His-L1-P32-A33-Y-His基因通过pET30a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)可获得His-L1-P32-A33-Y-His基因的高效可溶性表达，将His-L1-P32-A33-W-His基因通过pET30a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)中，His-L1-P32-A33-W-His基因却没有表达。
诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-Y的含蛋白上清液中含有大小为54.9kDa的目的蛋白His-L1-P32-Y-His。诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-A33-Y的含蛋白上清液中含有大小为39kDa的目的蛋白His-L1-A33-Y-His。诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-P32-A33-Y的含蛋白上清液中含有大小为51.2kDa的目的蛋白His-P32-A33-Y-His。诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-L1-Y的含蛋白上清液中含有大小为27kDa的目的蛋白His-L1-Y-His。诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-A33-Y的含蛋白上清液中含有大小为17.2kDa的目的蛋白His-A33-Y-His。诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-P32-Y的含蛋白上清液中含有大小为34.6kDa的目的蛋白His-P32-Y-His(图1)。
4、His-L1-P32-A33-Y-His的可溶性表达及纯化
将BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-Y接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D600值(以含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入IPTG进行诱导表达。该诱导表达用0.75mM的IPTG在16℃诱导16h。取IPTG诱导表达16h后的发酵液收集菌体沉淀。加入PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，于4℃离心机中16000rpm/min离心30min，收集上清液(命名为BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-Y含蛋白上清液)，弃沉淀。将BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-A33-Y含蛋白上清液用0.22μm滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl，溶剂是水，pH8.0的溶液)平衡好的镍柱。将镍柱接入AKTA机器上，分别用10个柱体积的溶液1与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白，并在AKTA机器上监测蛋白峰。用溶液3(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)冲洗镍柱挂在镍柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，将该样品称为镍柱纯化的His-L1-P32-A33-Y-His蛋白(镍柱纯化目的蛋白样品，图1中泳道7)。
将镍柱纯化的His-L1-P32-A33-Y-His蛋白用GE公司生产的Superdex200凝胶柱通过分子筛进一步纯化，得到分子筛纯化的His-L1-P32-A33-Y-His蛋白(图1中泳道8)。该分子筛纯化中的流动相使用上述溶液1。通过分子筛纯化后可以除去样品中的含有的大量咪唑，His-L1-P32-A33-Y-His蛋白的结构为单体结构(图2)。收集单体结构的洗脱峰，得到分子筛纯化的His-L1-P32-A33-Y-His蛋白(分子筛纯化目的蛋白样品)，使用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)对得到的蛋白的纯度进行定量分析。
将分子筛纯化的His-L1-P32-A33-Y-His蛋白进行质谱分析其氨基酸序列，结果表明His-L1-P32-A33-Y-His的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
5、对照蛋白质的可溶性表达及纯化
参照步骤4的方法，利用BL21(DE3)/pET30a-L1-P32-Y、BL21(DE3)/pET30a-L1-A33-Y、BL21(DE3)/pET30a-P32-A33-Y、BL21(DE3)/pET30a-L1-Y、BL21(DE3)/pET30a-A33-Y和BL21(DE3)/pET30a-P32-Y进行诱导表达，分别得到分子筛纯化的如下对照蛋白质：His-L1-P32-Y-His、His-L1-A33-Y-His、His-P32-A33-Y-His、His-L1-Y-His、His-A33-Y-His、His-P32-Y-His。
实施例2、以His-L1-P32-A33-Y-His蛋白为包被抗原间接ELISA方法检测羊痘病毒抗体
本实施例中的相关溶液如下：
浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液的配制：8.5g NaCl、0.2g KCl、2.9gNa2HPO4·12H2O、0.59g NaH2PO4·2H2O，1L去离子水。
包被缓冲液：0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)，溶剂为水，溶质及其浓度如下：Na2CO3 1.59g/L和NaHCO3 2.93g/L。
洗涤液:0.5％吐温洗涤液。0.5％吐温洗涤液按照如下方法配制：在浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液中加入吐温20和叠氮化钠至叠氮化钠的含量为5g/L、吐温20的含量为5mL/L，得到0.5％吐温洗涤液。
封闭液：1％BSA封闭液。1％BSA封闭液按照如下方法配制：在浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液中加10％的BSA溶液，至BSA的体积百分含量为1％，得到1％BSA封闭液。
二抗稀释液：在浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液中加入BSA至BSA的含量为1％(体积百分含量)，得到二抗稀释液。
1、间接ELISA反应条件的建立与优化
采用棋盘方阵滴定法确定实施例1中分子筛纯化的His-L1-P32-A33-Y-His蛋白(以下简称His-L1-P32-A33-Y-His蛋白)最适包被浓度和最佳血清稀释度，以不同浓度的BSA封闭酶标板确定最佳封闭液浓度，确定血清和酶标二抗最佳工作时间，优化酶标二抗工作浓度，判定标准为：阳性血清与阴性血清的OD450比值(P/N)最大的孔所对应的反应条件为ELISA方法的最佳反应条件。
将实施例1中分子筛纯化的His-L1-P32-A33-Y-His蛋白梯度稀释后包被酶标板，采用棋盘方阵滴定法确定His-L1-P32-A33-Y-His蛋白的包被量和血清稀释度；并在抗原最佳包被浓度和血清稀释度基础上优化ELISA检测条件。结果如表1所示，His-L1-P32-A33-Y-His蛋白的质量浓度为2.0μg/mL，待测血清稀释倍数为1:50时，P/N值最大，因此确定抗原(His-L1-P32-A33-Y-His蛋白)的最佳包被浓度为2.0μg/mL，待测血清稀释倍数为1:50。同时本实验确定HRP标记的兔抗山羊IgG按1:50000的比例稀释，37℃作用0.5h，加入TMB显色液10min后OD值最佳。
表1.ELISA检测方法的反应条件优化结果
包被的抗原 封闭条件 待测血清 二抗IgG-HRP
优化稀释度 2.0μg/mL 1％BSA 1:50 1:50000
反应条件 4℃/16h 37℃/2h 37℃/1h 37℃/0.5h
该步骤确定的以His-L1-P32-A33-Y-His蛋白为包被抗原间接ELISA方法检测羊痘病毒抗体的优化实验方法(以下简称His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法)如下：
1.1包被：用包被缓冲液稀释实施例1中分子筛纯化的His-L1-P32-A33-Y-His蛋白(以下简称His-L1-P32-A33-Y-His蛋白)至His-L1-P32-A33-Y-His蛋白的浓度为2.0μg/ml，得到包被原溶液，用该包被原溶液包被实验孔，100μL/孔加至酶标板，4℃孵育16h。
1.2洗涤：倾去孔内包被原溶液，用0.5％吐温洗涤液洗涤5次，每次3min；拍干。
1.3封闭：加入1％BSA封闭液，250μL/孔，37℃孵育2h。
1.4加样：
1.4.1样品孔
用包被缓冲液将羊痘阳性血清稀释50倍，得到待测血清。将100μL待测血清加到酶标板上，37℃反应1h，倾去孔内液体，然后用洗涤液洗涤5次。其中，羊痘阳性血清为经羊痘血清中和试验方法检测为羊痘病毒抗体阳性的羊血清。
1.4.2空白对照孔
与1.4.1的区别仅在于将待测血清替换为等体积的高纯水，其它步骤不变。
1.5加酶标二抗：加入用二抗稀释液进行1:50000稀释的HRP标记兔抗山羊IgG，100μL/孔，37℃30min。
1.6显色：加入TMB，100μL/孔，反应10min。
1.7终止：加入0.2mol/L H2SO4溶液终止反应，100μL/孔。
1.8测定：用酶标仪读取各孔OD450nm数值。
2、ELISA阴阳性临界值的确定
将400份经羊痘血清中和试验方法检测为羊痘病毒抗体阴性的羊血清(简称羊痘阴性血清)采用步骤1的His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法(将1.4.1中的羊痘阳性血清分别替换为该400份羊痘阴性血清，其它操作相同)进行间接ELISA检测，计算该400份羊痘阴性血清的平均值(X)和标准偏差(SD)。
Figure BDA0001527986130000131
判为阳性；
Figure BDA0001527986130000132
判为阴性。
结果表明，该400份羊痘阴性血清平均值
Figure BDA0001527986130000133
为0.136，SD为0.051，因此阴阳性临界值
Figure BDA0001527986130000134
为0.289。
3、特异性试验
利用步骤1的His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法对各10份的羊副结核病阳性血清、羊布病阳性血清、结核病阳性血清、产气荚膜梭菌病阳性血清和口蹄疫阳性血清进行检测，观察与其它疾病有无交叉反应。其中，将1.4.1中的羊痘阳性血清分别替换为上述血清，其它操作相同。结果表明该His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法对几种羊源的病原(羊副结核病、羊布病、结核病、产气荚膜梭菌病和口蹄疫)阳性血清进行检测，其OD450值分别为：0.159、0.096、0.184、0.241、0.191，均小于临界值0.289，表明His-L1-P32-A33-Y-His与羊副结核病、羊布病、结核病、产气荚膜梭菌病和口蹄疫阳性血清均无交叉反应，步骤1的His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法具有良好的特异性。
4、敏感性试验
将步骤1的His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法中的His-L1-P32-A33-Y-His替换为His-L1-P32-Y-His，其它操作不变，建立His-L1-P32-Y-His优化间接ELISA方法。
将步骤1的His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法中的His-L1-P32-A33-Y-His替换为His-L1-A33-Y-His，其它操作不变，建立His-L1-A33-Y-His优化间接ELISA方法。
将步骤1的His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法中的His-L1-P32-A33-Y-His替换为His-P32-A33-Y-His，其它操作不变，建立His-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法。
将步骤1的His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法中的His-L1-P32-A33-Y-His替换为His-L1-Y-His，其它操作不变，建立His-L1-Y-His优化间接ELISA方法。
将步骤1的His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法中的His-L1-P32-A33-Y-His替换为His-A33-Y-His，其它操作不变，建立His-A33-Y-His优化间接ELISA方法。
将步骤1的His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法中的His-L1-P32-A33-Y-His替换为His-P32-Y-His，其它操作不变，建立His-P32-Y-His优化间接ELISA方法。
将经羊痘血清中和试验方法检测为羊痘病毒抗体阳性的羊血清(简称羊痘阳性血清)进行倍比稀释，分别采用步骤1的His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法、羊痘血清中和试验方法、His-L1-P32-Y-His优化间接ELISA方法、His-L1-A33-Y-His优化间接ELISA方法、His-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法、His-L1-Y-His优化间接ELISA方法、His-A33-Y-His优化间接ELISA方法和His-P32-Y-His优化间接ELISA方法进行检测，得出阳性临界值时的最大稀释度。
结果表明将羊痘阳性血清从1：25开始进行倍比稀释，采用步骤1的His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法进行检测羊痘阳性血清的稀释度为1∶3200时仍呈阳性；采用羊痘血清中和试验方法进行检测的羊痘阳性血清的最大稀释度为1∶1600；采用His-L1-P32-Y-His优化间接ELISA方法、His-L1-A33-Y-His优化间接ELISA方法、His-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法、His-L1-Y-His优化间接ELISA方法、His-A33-Y-His优化间接ELISA方法和His-P32-Y-His优化间接ELISA方法进行检测，羊痘阳性血清的最大稀释度分别为1∶800、1∶400、1∶800、1∶200、1∶200和1∶400。表明将His-L1-P32-A33-Y-His作为包被抗原建立的间接ELISA检测羊痘病毒抗体方法的敏感性明显高于采用His-L1-P32-Y-His、His-L1-A33-Y-His、His-P32-A33-Y-His、His-L1-Y-His、His-A33-Y-His和His-P32-Y-His作为包被抗原建立的间接ELISA检测羊痘病毒抗体方法的敏感性，也明显高于羊痘血清中和试验方法的敏感性。
5、重复性试验
采用步骤1的His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法对6份羊痘阳性血清在同批次板和不同批次板上分别进行检测，平行测定5次，计算批内、批间变异系数(CV)。结果显示，批内重复变异系数在2％～8％之间，批间重复变异系数小于9％(表2)。结果表明，步骤1的His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法具有良好的重复性。
表2.步骤1的组His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法重复性试验
Figure BDA0001527986130000141
6、符合性试验
使用羊痘血清中和试验方法从中国动物疫病预防控制中心草食动物与人畜共患病室保存的羊血清挑选出了90份羊痘病毒抗体阳性血清与90份羊痘病毒抗体阴性血清。对这180份羊血清分别采用步骤1的His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法、步骤4的His-L1-P32-Y-His优化间接ELISA方法、His-L1-A33-Y-His优化间接ELISA方法、His-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法、His-L1-Y-His优化间接ELISA方法、His-A33-Y-His优化间接ELISA方法和His-P32-Y-His优化间接ELISA方法和羊痘血清中和试验方法进行检测，计算与羊痘血清中和试验方法的符合率。
结果表明该180份羊血清，步骤1的His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法与羊痘血清中和试验方法的总符合率为95％(阳性符合率为97.78％，阴性符合率为92.22％)，步骤4的His-L1-P32-Y-His优化间接ELISA方法、His-L1-A33-Y-His优化间接ELISA方法、His-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法、His-L1-Y-His优化间接ELISA方法、His-A33-Y-His优化间接ELISA方法和His-P32-Y-His优化间接ELISA方法与羊痘血清中和试验方法的总符合率分别为85％(阳性符合率为88.89％，阴性符合率为81.11％)、86.11％(阳性符合率为81.11％，阴性符合率为91.11％)、82.78％(阳性符合率为87.78％，阴性符合率为77.78％)、74.44％(阳性符合率为65.56％，阴性符合率为83.33％)、72.22％(阳性符合率为68.89％，阴性符合率为75.56％)和77.78％(阳性符合率为76.67％，阴性符合率为78.89％)(表3-表9)。
表3.His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法血清样品检测结果
Figure BDA0001527986130000151
通过表3结果可以得出，步骤1的His-L1-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法，检测出了88份阳性，83份阴性。检测结果不相符的样品为9份。两种方法的阳性符合率为97.78％，阴性符合率为92.22％，总符合率为95％(见表3)。
表4 His-L1-P32-Y-His优化间接ELISA方法血清样品检测结果
Figure BDA0001527986130000152
通过表4结果可以得出，步骤4的His-L1-P32-Y-His优化间接ELISA方法，检测出了80份阳性，73份阴性。检测结果不相符的样品为27份。两种方法的阳性符合率为88.89％，阴性符合率为81.11％，总符合率为85％(见表4)。
表5.His-L1-A33-Y-His优化间接ELISA方法血清样品检测结果
Figure BDA0001527986130000153
Figure BDA0001527986130000161
通过表5结果可以得出，步骤4的His-L1-A33-Y-His优化间接ELISA方法，检测出了73份阳性，82份阴性。检测结果不相符的样品为25份。两种方法的阳性符合率为81.11％，阴性符合率为91.11％，总符合率为86.11％(见表5)。
表6.His-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法血清样品检测结果
Figure BDA0001527986130000162
通过表6结果可以得出，步骤4的His-P32-A33-Y-His优化间接ELISA方法，检测出了79份阳性，70份阴性。检测结果不相符的样品为31份。两种方法的阳性符合率为87.78％，阴性符合率为77.78％，总符合率为82.78％(见表6)。
表7.His-L1-Y-His优化间接ELISA方法血清样品检测结果
Figure BDA0001527986130000163
通过表7结果可以得出，步骤4的His-L1-Y-His优化间接ELISA方法，检测出了59份阳性，75份阴性。检测结果不相符的样品为46份。两种方法的阳性符合率为65.56％，阴性符合率为83.33％，总符合率为74.44％(见表7)。
表8 His-A33-Y-His优化间接ELISA方法血清样品检测结果
Figure BDA0001527986130000164
通过表8结果可以得出，步骤4的His-A33-Y-His优化间接ELISA方法，检测出了62份阳性，68份阴性。检测结果不相符的样品为50份。两种方法的阳性符合率为68.89％，阴性符合率为75.56％，总符合率为72.22％(见表8)。
表9 His-P32-Y-His优化间接ELISA方法血清样品检测结果
Figure BDA0001527986130000171
通过表9结果可以得出，步骤4的His-P32-Y-His优化间接ELISA方法，检测出了69份阳性，71份阴性。检测结果不相符的样品为40份。两种方法的阳性符合率为76.67％，阴性符合率为78.89％，总符合率为77.78％(见表9)。
说明将His-L1-P32-A33-Y-His作为包被抗原建立的间接ELISA检测羊痘病毒抗体的方法与羊痘血清中和试验方法的总符合率和阳性符合率显著高于分别以His-L1-P32-Y-His、His-L1-A33-Y-His、His-P32-A33-Y-His、His-L1-Y-His、His-A33-Y-His和His-P32-Y-His作为包被抗原建立的间接ELISA检测羊痘病毒抗体的方法。
序列表
<110> 中国动物疫病预防控制中心
<120> 重组羊痘病毒融合蛋白的可溶性表达方法及其所用生物材料
<130> GNCFH171742
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1917
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catatgcacc atcaccacca tcacatgggt gcagcagcat caattcaaac caccgtcaac 60
accctgaacg agaaaatcag cagcaaactg gaacagaccg cagaagcaac ctctgaagcg 120
aaatgcgaca tcgaaatcgg tagcatcgtc ttccgtcaga acaaaggctg caacgtcacc 180
gtcaaaaacc tgtgcagcag caaagcagaa agccaactgg acgcgattct gaaagcagca 240
accgaaacct acgatctgct gaccccggat caaaaagcat acgttccggg tctgatgacc 300
gcagcactga atattcagac cagcgtcaac accgtcgtta aagacttcga gacctacgtc 360
aaacagaaat gcaccagcaa aagcgtcatc gacaacaaac tgaaaatcca caacattttc 420
attgacgagt gcgcagcacc gaccggcacc accaccaact tcgaattcat caacagcggt 480
accagtcagg gtatttgcgc tattaaaacc ctgatggacg tcaccaccaa agcaagcacc 540
aaaattagcc cgagtcagag tagcggcggt ggcggtggaa tcggaggtgg tggaagcgga 600
ggaggtggaa gcatggcaga tatcccatta tatgttatac caatcgttgg tcgcgaaatt 660
tcagatgtag ttccagaatt aaaaagtggc aatgatatat tttataaaaa agttgacaca 720
gtaaaagatt ttaaaaattc agatgtaaaa ttttttttaa aagataaaaa agatatcagt 780
ttatcatata agttccttat atgggaaaag gtagaaaaat caggaggtgt tgaaaatttt 840
acagaatatt tttctggatt atgtaatgct ctttgtacaa aagaggtaaa aagttctatt 900
gcaaaacact ttagtttatg gaaatcgtat gctgatgcgg atataaaaaa ttctgagaat 960
aagtttattg ttgttataga agatgataac acattaaaag atttaataac aatatataac 1020
attataattg aaatgcaaga aaaaaatata gacattttcc aattacgtga aacttttcat 1080
aatagtaatt ctagaatatt gttcaatcaa gaaaataata attttatgta ttcgtacaca 1140
gggggatatg attttacctt atctgcatat gtaattagat tatcgtctgc cataaaaata 1200
ataaacgaaa ttataaaaaa taaaggtatt tctaccagtt tgagttttga aatgtataag 1260
ttggaaaaag aattaaaact caatagacaa gttttaaatg actcatctaa gtatatactt 1320
cacaatacta agtatttgtc aaaaaaaaga gctaacgaaa tgaaaaacgg tatatggaat 1380
agagttggaa aatggatggc tcatagattt cctgattttt cttactatgt atcccatcca 1440
ttggtttcat ttggtggcgg tggaatcgga ggtggtggaa gcggaggagg tggaagcatg 1500
ctggcgttct tcaacaacaa cacctgcgag ctgaaccagt tcaaagaaca taagccgtac 1560
ttcctgaaga atccgaatcc gaccacctac tctgacgatg ataccgaaag cgagctgaac 1620
atctaccgta gctgcaaagg catcgtctat agcggttact gctacacctt caacctggaa 1680
ccgaaaagct tcaacgacgc atacgacgac tgcgagaaga aaaacagcga actgccgtcc 1740
aacaacctga tgaacgactg gatcagcgat tatctggacg gtacctgggg cgaagacggt 1800
aacgtactgt tcaaagagaa aaaccaggaa ctggaagcga tcgatatctc cgacgaaatg 1860
cgcagctact attgcgttcg cagcttcttc ctcgagcacc accaccacca ccactga 1917
<210> 2
<211> 637
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met His His His His His His Met Gly Ala Ala Ala Ser Ile Gln Thr
1 5 10 15
Thr Val Asn Thr Leu Asn Glu Lys Ile Ser Ser Lys Leu Glu Gln Thr
20 25 30
Ala Glu Ala Thr Ser Glu Ala Lys Cys Asp Ile Glu Ile Gly Ser Ile
35 40 45
Val Phe Arg Gln Asn Lys Gly Cys Asn Val Thr Val Lys Asn Leu Cys
50 55 60
Ser Ser Lys Ala Glu Ser Gln Leu Asp Ala Ile Leu Lys Ala Ala Thr
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Asp Leu Leu Thr Pro Asp Gln Lys Ala Tyr Val Pro Gly
85 90 95
Leu Met Thr Ala Ala Leu Asn Ile Gln Thr Ser Val Asn Thr Val Val
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Tyr Val Lys Gln Lys Cys Thr Ser Lys Ser Val
115 120 125
Ile Asp Asn Lys Leu Lys Ile His Asn Ile Phe Ile Asp Glu Cys Ala
130 135 140
Ala Pro Thr Gly Thr Thr Thr Asn Phe Glu Phe Ile Asn Ser Gly Thr
145 150 155 160
Ser Gln Gly Ile Cys Ala Ile Lys Thr Leu Met Asp Val Thr Thr Lys
165 170 175
Ala Ser Thr Lys Ile Ser Pro Ser Gln Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Asp Ile Pro
195 200 205
Leu Tyr Val Ile Pro Ile Val Gly Arg Glu Ile Ser Asp Val Val Pro
210 215 220
Glu Leu Lys Ser Gly Asn Asp Ile Phe Tyr Lys Lys Val Asp Thr Val
225 230 235 240
Lys Asp Phe Lys Asn Ser Asp Val Lys Phe Phe Leu Lys Asp Lys Lys
245 250 255
Asp Ile Ser Leu Ser Tyr Lys Phe Leu Ile Trp Glu Lys Val Glu Lys
260 265 270
Ser Gly Gly Val Glu Asn Phe Thr Glu Tyr Phe Ser Gly Leu Cys Asn
275 280 285
Ala Leu Cys Thr Lys Glu Val Lys Ser Ser Ile Ala Lys His Phe Ser
290 295 300
Leu Trp Lys Ser Tyr Ala Asp Ala Asp Ile Lys Asn Ser Glu Asn Lys
305 310 315 320
Phe Ile Val Val Ile Glu Asp Asp Asn Thr Leu Lys Asp Leu Ile Thr
325 330 335
Ile Tyr Asn Ile Ile Ile Glu Met Gln Glu Lys Asn Ile Asp Ile Phe
340 345 350
Gln Leu Arg Glu Thr Phe His Asn Ser Asn Ser Arg Ile Leu Phe Asn
355 360 365
Gln Glu Asn Asn Asn Phe Met Tyr Ser Tyr Thr Gly Gly Tyr Asp Phe
370 375 380
Thr Leu Ser Ala Tyr Val Ile Arg Leu Ser Ser Ala Ile Lys Ile Ile
385 390 395 400
Asn Glu Ile Ile Lys Asn Lys Gly Ile Ser Thr Ser Leu Ser Phe Glu
405 410 415
Met Tyr Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Leu Asn Arg Gln Val Leu Asn
420 425 430
Asp Ser Ser Lys Tyr Ile Leu His Asn Thr Lys Tyr Leu Ser Lys Lys
435 440 445
Arg Ala Asn Glu Met Lys Asn Gly Ile Trp Asn Arg Val Gly Lys Trp
450 455 460
Met Ala His Arg Phe Pro Asp Phe Ser Tyr Tyr Val Ser His Pro Leu
465 470 475 480
Val Ser Phe Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
485 490 495
Gly Ser Met Leu Ala Phe Phe Asn Asn Asn Thr Cys Glu Leu Asn Gln
500 505 510
Phe Lys Glu His Lys Pro Tyr Phe Leu Lys Asn Pro Asn Pro Thr Thr
515 520 525
Tyr Ser Asp Asp Asp Thr Glu Ser Glu Leu Asn Ile Tyr Arg Ser Cys
530 535 540
Lys Gly Ile Val Tyr Ser Gly Tyr Cys Tyr Thr Phe Asn Leu Glu Pro
545 550 555 560
Lys Ser Phe Asn Asp Ala Tyr Asp Asp Cys Glu Lys Lys Asn Ser Glu
565 570 575
Leu Pro Ser Asn Asn Leu Met Asn Asp Trp Ile Ser Asp Tyr Leu Asp
580 585 590
Gly Thr Trp Gly Glu Asp Gly Asn Val Leu Phe Lys Glu Lys Asn Gln
595 600 605
Glu Leu Glu Ala Ile Asp Ile Ser Asp Glu Met Arg Ser Tyr Tyr Cys
610 615 620
Val Arg Ser Phe Phe Leu Glu His His His His His His
625 630 635
<210> 3
<211> 1917
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catatgcacc atcaccacca tcacatggga gcagccgcaa gtatacaaac tacagtaaat 60
acgttgaatg aaaaaataag tagtaaattg gaacaaactg ctgaagccac ttcagaagca 120
aaatgcgata tagaaattgg tagtattgta tttagacaaa ataaaggttg taatgttact 180
gttaaaaact tgtgttcgtc taaagcagaa tctcaattag atgctatatt aaaagcagca 240
acagaaacat atgatttact tactcctgat caaaaagcat atgttccagg attgatgaca 300
gcagcattaa atatccaaac aagtgttaat actgtggtta aagattttga aacgtatgta 360
aaacaaaagt gtacatcaaa atcggttatt gataataaat taaagattca taatattttt 420
atagatgagt gtgctgcacc aaccggaaca actacaaact ttgaatttat taattctgga 480
accagtcagg gaatatgtgc aataaaaacg ttaatggatg taaccacaaa ggcgagtaca 540
aaaatttccc ctagtcaaag ttcgggaggt ggcggtggaa tcggaggtgg tggaagcgga 600
ggaggtggaa gcatggcaga tatcccatta tatgttatac caatcgttgg tcgcgaaatt 660
tcagatgtag ttccagaatt aaaaagtggc aatgatatat tttataaaaa agttgacaca 720
gtaaaagatt ttaaaaattc agatgtaaaa ttttttttaa aagataaaaa agatatcagt 780
ttatcatata agttccttat atgggaaaag gtagaaaaat caggaggtgt tgaaaatttt 840
acagaatatt tttctggatt atgtaatgct ctttgtacaa aagaggtaaa aagttctatt 900
gcaaaacact ttagtttatg gaaatcgtat gctgatgcgg atataaaaaa ttctgagaat 960
aagtttattg ttgttataga agatgataac acattaaaag atttaataac aatatataac 1020
attataattg aaatgcaaga aaaaaatata gacattttcc aattacgtga aacttttcat 1080
aatagtaatt ctagaatatt gttcaatcaa gaaaataata attttatgta ttcgtacaca 1140
gggggatatg attttacctt atctgcatat gtaattagat tatcgtctgc cataaaaata 1200
ataaacgaaa ttataaaaaa taaaggtatt tctaccagtt tgagttttga aatgtataag 1260
ttggaaaaag aattaaaact caatagacaa gttttaaatg actcatctaa gtatatactt 1320
cacaatacta agtatttgtc aaaaaaaaga gctaacgaaa tgaaaaacgg tatatggaat 1380
agagttggaa aatggatggc tcatagattt cctgattttt cttactatgt atcccatcca 1440
ttggtttcat ttggtggcgg tggaatcgga ggtggtggaa gcggaggagg tggaagcatg 1500
ttagcatttt ttaataataa tacatgtgaa ttaaatcaat ttaaggaaca caaaccgtac 1560
tttttaaaaa atccaaatcc tactacatat agtgacgacg atactgaatc tgagttaaat 1620
atttatagat catgtaaagg tattgtttat agcggatact gttacacttt taacttagaa 1680
cctaaaagtt ttaatgatgc atacgatgat tgtgaaaaaa aaaatagcga attaccatca 1740
aataatttaa tgaatgattg gataagtgac tacttagatg ggacgtgggg agaagacggt 1800
aacgtacttt ttaaagaaaa aaatcaagaa cttgaagcta tagatataag cgatgagatg 1860
agaagctatt actgtgtaag atcttttttt ctcgagcacc accaccacca ccactga 1917
<210> 4
<211> 2436
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catatgcacc atcaccacca tcacatgggt gcagcagcat caattcaaac caccgtcaac 60
accctgaacg agaaaatcag cagcaaactg gaacagaccg cagaagcaac ctctgaagcg 120
aaatgcgaca tcgaaatcgg tagcatcgtc ttccgtcaga acaaaggctg caacgtcacc 180
gtcaaaaacc tgtgcagcag caaagcagaa agccaactgg acgcgattct gaaagcagca 240
accgaaacct acgatctgct gaccccggat caaaaagcat acgttccggg tctgatgacc 300
gcagcactga atattcagac cagcgtcaac accgtcgtta aagacttcga gacctacgtc 360
aaacagaaat gcaccagcaa aagcgtcatc gacaacaaac tgaaaatcca caacattttc 420
attgacgagt gcgcagcacc gaccggcacc accaccaact tcgaattcat caacagcggt 480
accagtcagg gtatttgcgc tattaaaacc ctgatggacg tcaccaccaa agcaagcacc 540
aaaattagcc cgagtcagag tagcggctac ggttaccaat tctacattat tgcagcagta 600
gtagtaattt tatctatggt attcttatac tacgtaaaaa aaatgttatt cacatctaca 660
aaagataaaa ttaaaattat tttagcaaac aaaccagaag tacattggac atcttactta 720
gatacattct tctctaacac accaacaatt attgaaaaag gtggcggtgg aatcggaggt 780
ggtggaagcg gaggaggtgg aagcatggca gatatcccat tatatgttat accaatcgtt 840
ggtcgcgaaa tttcagatgt agttccagaa ttaaaaagtg gcaatgatat attttataaa 900
aaagttgaca cagtaaaaga ttttaaaaat tcagatgtaa aatttttttt aaaagataaa 960
aaagatatca gtttatcata taagttcctt atatgggaaa aggtagaaaa atcaggaggt 1020
gttgaaaatt ttacagaata tttttctgga ttatgtaatg ctctttgtac aaaagaggta 1080
aaaagttcta ttgcaaaaca ctttagttta tggaaatcgt atgctgatgc ggatataaaa 1140
aattctgaga ataagtttat tgttgttata gaagatgata acacattaaa agatttaata 1200
acaatatata acattataat tgaaatgcaa gaaaaaaata tagacatttt ccaattacgt 1260
gaaacttttc ataatagtaa ttctagaata ttgttcaatc aagaaaataa taattttatg 1320
tattcgtaca cagggggata tgattttacc ttatctgcat atgtaattag attatcgtct 1380
gccataaaaa taataaacga aattataaaa aataaaggta tttctaccag tttgagtttt 1440
gaaatgtata agttggaaaa agaattaaaa ctcaatagac aagttttaaa tgactcatct 1500
aagtatatac ttcacaatac taagtatttg tcaaaaaaaa gagctaacga aatgaaaaac 1560
ggtatatgga atagagttgg aaaatggatg gctcatagat ttcctgattt ttcttactat 1620
gtatcccatc cattggtttc atttttcggt attttcgata tttctattat gggtgcatta 1680
attattttat tcattattat tatgattatt ttcaacttaa actctaaatt attatggttc 1740
ttagcaggta tgttattcac atacattgta ggtggcggtg gaatcggagg tggtggaagc 1800
ggaggaggtg gaagcatgtt agtagatatt caaaaatctg gtacagaaac agattacgat 1860
gaatctaaca acttcacaga attcgcaggt tctacaattt acggttacgg tttaaaatct 1920
aaaaaaaaca ttaaaaaaaa agtaaaatta attaacttct gtattaaaat ttctattatt 1980
acatctatgg tatctttaat tacaattaca attttaatgc tggcgttctt caacaacaac 2040
acctgcgagc tgaaccagtt caaagaacat aagccgtact tcctgaagaa tccgaatccg 2100
accacctact ctgacgatga taccgaaagc gagctgaaca tctaccgtag ctgcaaaggc 2160
atcgtctata gcggttactg ctacaccttc aacctggaac cgaaaagctt caacgacgca 2220
tacgacgact gcgagaagaa aaacagcgaa ctgccgtcca acaacctgat gaacgactgg 2280
atcagcgatt atctggacgg tacctggggc gaagacggta acgtactgtt caaagagaaa 2340
aaccaggaac tggaagcgat cgatatctcc gacgaaatgc gcagctacta ttgcgttcgc 2400
agcttcttcc tcgagcacca ccaccaccac cactga 2436
<210> 5
<211> 810
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met His His His His His His Met Gly Ala Ala Ala Ser Ile Gln Thr
1 5 10 15
Thr Val Asn Thr Leu Asn Glu Lys Ile Ser Ser Lys Leu Glu Gln Thr
20 25 30
Ala Glu Ala Thr Ser Glu Ala Lys Cys Asp Ile Glu Ile Gly Ser Ile
35 40 45
Val Phe Arg Gln Asn Lys Gly Cys Asn Val Thr Val Lys Asn Leu Cys
50 55 60
Ser Ser Lys Ala Glu Ser Gln Leu Asp Ala Ile Leu Lys Ala Ala Thr
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Asp Leu Leu Thr Pro Asp Gln Lys Ala Tyr Val Pro Gly
85 90 95
Leu Met Thr Ala Ala Leu Asn Ile Gln Thr Ser Val Asn Thr Val Val
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Tyr Val Lys Gln Lys Cys Thr Ser Lys Ser Val
115 120 125
Ile Asp Asn Lys Leu Lys Ile His Asn Ile Phe Ile Asp Glu Cys Ala
130 135 140
Ala Pro Thr Gly Thr Thr Thr Asn Phe Glu Phe Ile Asn Ser Gly Thr
145 150 155 160
Ser Gln Gly Ile Cys Ala Ile Lys Thr Leu Met Asp Val Thr Thr Lys
165 170 175
Ala Ser Thr Lys Ile Ser Pro Ser Gln Ser Ser Gly Tyr Gly Tyr Gln
180 185 190
Phe Tyr Ile Ile Ala Ala Val Val Val Ile Leu Ser Met Val Phe Leu
195 200 205
Tyr Tyr Val Lys Lys Met Leu Phe Thr Ser Thr Lys Asp Lys Ile Lys
210 215 220
Ile Ile Leu Ala Asn Lys Pro Glu Val His Trp Thr Ser Tyr Leu Asp
225 230 235 240
Thr Phe Phe Ser Asn Thr Pro Thr Ile Ile Glu Lys Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Asp Ile Pro
260 265 270
Leu Tyr Val Ile Pro Ile Val Gly Arg Glu Ile Ser Asp Val Val Pro
275 280 285
Glu Leu Lys Ser Gly Asn Asp Ile Phe Tyr Lys Lys Val Asp Thr Val
290 295 300
Lys Asp Phe Lys Asn Ser Asp Val Lys Phe Phe Leu Lys Asp Lys Lys
305 310 315 320
Asp Ile Ser Leu Ser Tyr Lys Phe Leu Ile Trp Glu Lys Val Glu Lys
325 330 335
Ser Gly Gly Val Glu Asn Phe Thr Glu Tyr Phe Ser Gly Leu Cys Asn
340 345 350
Ala Leu Cys Thr Lys Glu Val Lys Ser Ser Ile Ala Lys His Phe Ser
355 360 365
Leu Trp Lys Ser Tyr Ala Asp Ala Asp Ile Lys Asn Ser Glu Asn Lys
370 375 380
Phe Ile Val Val Ile Glu Asp Asp Asn Thr Leu Lys Asp Leu Ile Thr
385 390 395 400
Ile Tyr Asn Ile Ile Ile Glu Met Gln Glu Lys Asn Ile Asp Ile Phe
405 410 415
Gln Leu Arg Glu Thr Phe His Asn Ser Asn Ser Arg Ile Leu Phe Asn
420 425 430
Gln Glu Asn Asn Asn Phe Met Tyr Ser Tyr Thr Gly Gly Tyr Asp Phe
435 440 445
Thr Leu Ser Ala Tyr Val Ile Arg Leu Ser Ser Ala Ile Lys Ile Ile
450 455 460
Asn Glu Ile Ile Lys Asn Lys Gly Ile Ser Thr Ser Leu Ser Phe Glu
465 470 475 480
Met Tyr Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Leu Asn Arg Gln Val Leu Asn
485 490 495
Asp Ser Ser Lys Tyr Ile Leu His Asn Thr Lys Tyr Leu Ser Lys Lys
500 505 510
Arg Ala Asn Glu Met Lys Asn Gly Ile Trp Asn Arg Val Gly Lys Trp
515 520 525
Met Ala His Arg Phe Pro Asp Phe Ser Tyr Tyr Val Ser His Pro Leu
530 535 540
Val Ser Phe Phe Gly Ile Phe Asp Ile Ser Ile Met Gly Ala Leu Ile
545 550 555 560
Ile Leu Phe Ile Ile Ile Met Ile Ile Phe Asn Leu Asn Ser Lys Leu
565 570 575
Leu Trp Phe Leu Ala Gly Met Leu Phe Thr Tyr Ile Val Gly Gly Gly
580 585 590
Gly Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Leu Val Asp
595 600 605
Ile Gln Lys Ser Gly Thr Glu Thr Asp Tyr Asp Glu Ser Asn Asn Phe
610 615 620
Thr Glu Phe Ala Gly Ser Thr Ile Tyr Gly Tyr Gly Leu Lys Ser Lys
625 630 635 640
Lys Asn Ile Lys Lys Lys Val Lys Leu Ile Asn Phe Cys Ile Lys Ile
645 650 655
Ser Ile Ile Thr Ser Met Val Ser Leu Ile Thr Ile Thr Ile Leu Met
660 665 670
Leu Ala Phe Phe Asn Asn Asn Thr Cys Glu Leu Asn Gln Phe Lys Glu
675 680 685
His Lys Pro Tyr Phe Leu Lys Asn Pro Asn Pro Thr Thr Tyr Ser Asp
690 695 700
Asp Asp Thr Glu Ser Glu Leu Asn Ile Tyr Arg Ser Cys Lys Gly Ile
705 710 715 720
Val Tyr Ser Gly Tyr Cys Tyr Thr Phe Asn Leu Glu Pro Lys Ser Phe
725 730 735
Asn Asp Ala Tyr Asp Asp Cys Glu Lys Lys Asn Ser Glu Leu Pro Ser
740 745 750
Asn Asn Leu Met Asn Asp Trp Ile Ser Asp Tyr Leu Asp Gly Thr Trp
755 760 765
Gly Glu Asp Gly Asn Val Leu Phe Lys Glu Lys Asn Gln Glu Leu Glu
770 775 780
Ala Ile Asp Ile Ser Asp Glu Met Arg Ser Tyr Tyr Cys Val Arg Ser
785 790 795 800
Phe Phe Leu Glu His His His His His His
805 810

Claims (4)

1.与重组羊痘病毒融合蛋白相关的生物材料，其特征在于：所述重组羊痘病毒融合蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
所述生物材料为下述B1)至B8)中的任一种：
B1)编码所述重组羊痘病毒融合蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
所述核酸分子为核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
所述重组载体为pET30a-L1-P32-A33-Y；所述pET30a-L1-P32-A33-Y是用核苷酸序列是SEQ ID No.1的第1-1896位的DNA替换pET30a(+)的Nde I和XhoI识别位点间的片段，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到的重组表达载体；
所述重组微生物为将所述pET30a-L1-P32-A33-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物。
2.制备重组羊痘病毒融合蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括：使所述重组羊痘病毒融合蛋白的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质；所述重组羊痘病毒融合蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
使所述重组羊痘病毒融合蛋白的编码基因在生物中进行表达包括将所述重组羊痘病毒融合蛋白的编码基因导入受体微生物，得到表达所述重组羊痘病毒融合蛋白的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述重组羊痘病毒融合蛋白所述重组微生物为将pET30a-L1-P32-A33-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物；
所述pET30a-L1-P32-A33-Y是用核苷酸序列是SEQ ID No.1的第1-1896位的DNA替换pET30a(+)的Nde I和XhoI识别位点间的片段，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到的重组表达载体。
3.权利要求1所述的生物材料在制备检测羊痘病毒抗体的试剂盒中的应用、在制备羊痘诊断抗原中的应用、或在制备羊痘诊断试剂盒中的应用。
4.权利要求2所述的方法在制备检测羊痘病毒抗体的试剂盒中的应用、在制备羊痘诊断抗原中的应用或在制备羊痘诊断试剂盒中的应用。
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