CN108619503A

CN108619503A - 一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用

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Publication number: CN108619503A
Application number: CN201710184557.9A
Authority: CN
Inventors: 宋长绪; 王磊; 刘业兵; 申翰钦; 张乐宜; 刘艳玲; 梁鹏帅; 张鹏飞; 刘相聪
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2017-03-24
Filing date: 2017-03-24
Publication date: 2018-10-09

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用。通过克隆新型猪圆环病毒——PCV3的核衣壳蛋白，利用大肠杆菌或杆状病毒表达系统成功表达得到纯度较高的PCV‑Cap蛋白。利用该蛋白，本发明首次成功研制出了针对PCV3的亚单位疫苗，所制得的疫苗抗原纯度高、安全性好、免疫原性强，且对猪等动物没有致病性，抗原在中性PH的缓冲溶液中有很好的溶解性；同时，制备方法简单且成本低，适合工业化、规模化生产；为新型猪圆环病毒的防控提供了有效、有力的手段，在PCV3的防控领域具备广阔的应用前景。

Description

一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉生物制药技术领域，特别涉及一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，其基因组为一个2kb左右的环状单链DNA。圆环病毒可以感染多种动物，包括猪、犬、鸭、鸡、狐狸和鱼类。圆环病毒主要编码两个开放性阅读框(rep和cap)。众所周知，有两个圆环病毒可以感染猪。猪圆环病毒2型(PCV2)感染可以导致不同的临床疾病，对养猪业造成严重的经济损失，而圆环病毒1型(PCV1)不引起临床疾病。2015年，美国研究人员通过宏基因组测序，在美国检测到一个新型圆环病毒(PCV3)，该圆环病毒与皮炎肾病综合征、繁殖障碍、心肌炎以及多系统炎症相关。2016年12月，华南农业大学宋长绪研究员组在我国首次检出致病性的新型猪圆环病毒—PCV3-China/GD2016病毒株，通过对PCV3毒株全基因组和其部分基因的遗传进化研究发现，PCV3与PCV1和PCV2处于不同的进化分支(图1)，属于新型的猪圆环病毒(Genomecharacterization of a porcine circovirus type 3in South China,Changxu Song,Transbound Emerg Dis.2017Mar 13.)。目前，不管是国际还是国内，都没有PCV3疫苗，但疫苗是控制该病的重要手段。而现有的PCV2疫苗对PCV3的防控无效，因此，PCV3疫苗的研发迫在眉睫。

基因工程亚单位疫苗(Subunit vaccine)又称生物合成亚单位疫苗或重组亚单位疫苗，是指将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，并以基因产物-蛋白质或多肽制成疫苗。与传统减毒苗或灭活苗相比，安全性高，纯度高，稳定性好，产量高。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗，利用PCV3的核衣壳蛋白研制基因工程疫苗，用于防控PCV3。

本发明的又一目的在于提供所述疫苗的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述疫苗的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗，包含一种可溶性融合蛋白，所述的可溶性融合蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

所述的可溶性融合蛋白是免疫活性成分，其来自于猪圆环病毒3型核衣壳蛋白，特别是来自于猪圆环病毒PCV3-China/GD2016病毒株。

所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗还包括佐剂；优选为氢氧化铝胶佐剂和水包油佐剂中的一种或至少两种；进一步优选为SEPPIC公司的MONTANIDE^TM ISA 15A VG和ISA206VG中的一种或两种。

编码所述的可溶性融合蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：

将编码所述的可溶性融合蛋白的核苷酸序列克隆入表达载体构建重组表达载体；将所述重组表达载体转入表达系统中进行表达，纯化，得到所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗。

所述的构建重组表达载体的具体步骤优选为：针对编码所述的可溶性融合蛋白的核苷酸序列，通过设计引物进行PCR，将得到的PCV3-Cap基因片段双酶切后与表达载体连接构建得到重组表达载体。

其中，所述的引物为：

上游引物：5’-GGCggatccATGAGACACAGACCTATATTC-3’，下游引物为：5’-GGGctcgagGAGAACTGACTTGTAACGAAT-3’，其中，小写字母分别表示酶切位点BamHI和XhoI。

所述的双酶切的方法优选为通过限制性内切酶BamH I和Xho I对PCV3-Cap基因片段和载体分别进行双酶切。

所述的表达系统优选为大肠杆菌、杆状病毒表达系统、真核哺乳动物细胞表达系统和植物表达系统中的一种或至少两种；进一步优选为大肠杆菌(Rosetta菌株)和杆状病毒表达系统中的一种或至少两种。

当所述的表达系统为大肠杆菌时，所述的表达的具体步骤优选为将阳性重组子转化大肠杆菌，通过IPTG诱导表达。

当所述的表达系统为大肠杆菌时，所述的表达载体优选为pET-28a；所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌(Rosetta菌株)。

当所述的表达系统为杆状病毒表达系统时，所述的表达载体为pFASTBac-HTB。

当所述的表达系统为杆状病毒表达系统时，所述的表达的具体步骤为：

将阳性重组子转化入DH10Bac，在所得菌液中分离得到重组杆粒，再将重组杆粒转染Sf9细胞后进行大量培养。

上述的核苷酸序列、氨基酸序列，包含但不限于：将本发明所提供的序列，经突变(mutation)、删除(deletion)、插入(insertion)、或取代(replacement)等现有方式，将1至复数个核苷酸或氨基酸改变，但仍适用本发明目的。更优选地，其应至少具有80％的序列互补性(complementary)，或是至少90％的序列同一性(Identitty)。

所述的删除还包括删除第1～35位中的1至复数个氨基酸；进一步优选为删除包含第1-28位中的1至复数个氨基酸。

所述的纯化优选为通过Ni-NTA His镍柱进行纯化。

所述的疫苗在预防和/或治疗猪圆环病毒III型引起的猪相关疾病中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明的发明人首次成功研制出了针对新型猪圆环病毒——猪圆环病毒III型的疫苗，为新型猪圆环病毒III型的防控提供了有效、有力的手段，在防控猪圆环病毒III型的领域具备广阔的应用前景。

2.本发明的猪圆环病毒III型疫苗抗原纯度高、安全性好，免疫原性强，且对猪等动物没有致病性；同时抗原在中性PH的缓冲溶液中有很好的溶解性，有效降低免疫后的猪中相关组织中病毒含量。

3.本发明的疫苗制备工艺相对简单，成本低，适合工业化、规模化生产。

附图说明

图1是PCV3-China/GD2016病毒株的系统进化树图。

图2是实施例1中重组质粒pET28a-PCV3Cap的质粒图谱图。

图3是实施例2中重组质粒pFastBac-HTB-PCV3Cap的质粒图谱图。

图4是实施例1重组质粒转化的大肠杆菌(Rosetta菌株)SDS-PAGE分析电泳图，其中，对照为未诱导的重组大肠杆菌Rosetta，Marker为蛋白分子量标准，Cap-Ecoli为经IPTG诱导的重组大肠杆菌Rosetta。

图5是实施例2重组杆粒的SDS-PAGE分析电泳图，其中，M为蛋白marker，Cap-sf9为转染重组杆粒，对照为pFastBac-HTB空载杆粒。

图6是纯化后的Cap蛋白SDS-PAGE电泳图，泳道M为蛋白marker，泳道1为实施例1制得的重组蛋白Cap-Ecoli，泳道2为实施例2制得的重组蛋白Cap-sf9。

图7是实施例3中免疫后3周测特异性抗体滴度的结果分析图。

图8是实施例3中攻毒14天后淋巴结中PCV3病毒含量测定的结果分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用的蛋白分子量标准(14.4～116kD)购自碧云天生物技术公司。

实施例1通过大肠杆菌表达重组Cap蛋白

1.基因扩增

以PCV3-China/GD2016病毒株(PCV3-China/GD2016基因组信息已于论文中Genomecharacterization of a porcine circovirus type 3in South China,Changxu Song,Transbound Emerg Dis.2017Mar 13.中公开)为模板扩增Cap基因，反应体系如表1所示，反应程序如表2所示。

表1 Cap基因扩增的反应体系

其中，上游引物为：5’-GGCggatccATGAGACACAGACCTATATTC-3’，下游引物为：5’-GGGctcgagGAGAACTGACTTGTAACGAAT-3’，小写字母分别表示酶切位点BamHI和XhoI。

表2 用于Cap基因PCR反应程序

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳

参考《分子克隆实验指南》方法，配制1.2％琼脂糖凝胶，取5μL扩增产物加1μL 6×Loading Buffer混匀，加入上样孔，同时以标准DNA分子量DL2000作为对照。

2.Cap目的片段胶回收

按照小量胶回收试剂盒(购自Omega公司)使用说明书进行：

(1)在紫外灯下切下目的片段，放入1.5mL离心管中，加入300μL的GC Buffer，放入65℃水浴锅中，期间上下颠倒离心管，直至完全溶化，冷却至室温。

(2)把吸附柱放入2mL离心管中，将(1)中液体加入回收柱，10000r/min离心30s，弃去滤液。

(3)加入500μL DNA wash Buffer，10000r/min离心30s，弃去滤液。重复步骤(3)1次。

(4)12000r/min开盖离心2min，以彻底去除残留的乙醇。

(5)把吸附柱放于新的1.5mL的离心管中，加入50μL Elution Buffer，65℃水浴锅中放置5min，然后12000r/min离心1min，再将洗脱液加入柱子中，65℃水浴锅中放置5min，12000r/min离心1min，收集洗脱液-20℃保存。

3.pET28a质粒的提取

按质粒小抽提试剂盒(购自北京天根生物技术有限公司)说明书进行。

(1)取菌液，划板后，挑取单个菌落到5mL LB培养基中，37℃震荡14～16h，室温下10000r/min离心1min，收集菌体。

(2)向DNA收集管中加入500μL GBL，室温放置2min，12000r/min离心2min，弃去废液，收集管备用。

(3)向(1)收集的菌体中加入250μL Buffer A(确保已加入RNase A)，涡旋振荡，充分悬浮菌体。

(4)在步骤(3)中得到的重悬菌液中加入250μL Buffer B1，轻轻翻转10次，静置5min至溶液粘稠而澄清(不要剧烈震荡)，静置时间不超过5min。

(5)加入350μL Buffer N1(事先放入冰箱预冷)，立即反转10次，混合均匀，此时出现白色絮状沉淀，在室温下13000r/min离心10min。

(6)小心吸取离心后的上清至步骤(2)得到的DNA收集管中(勿吸起沉淀)，13000r/min离心1min，弃去废液。

(7)再将吸附柱放回收集管中，加入500μL DNA wash Buffer，13000r/min离心1min，弃去废液。重复步骤(7)1次。

(8)开盖，13000r/min离心2min，以彻底去除残留的乙醇。

(9)将吸附柱放入新的1.5mL的离心管中，加入50μL Elution Buffer，室温放置2min，13000r/min离心1min，再将洗脱液重新加入吸附柱中，13000r/min离心1min，收集洗脱液。-20℃保存备用。

4.Cap片段和pET-28a(+)双酶切

使用分光光度计测质粒和DNA浓度，然后分别用限制性内切酶BamH I和Xho I对Cap片段和pET-28a进行双酶切，按照限制酶使用说明书，配制pET-28a质粒双酶切反应体系见表3，Cap片段的双酶切体系见表4。

表3 pET-28a质粒的双酶切反应体系

表4 Cap片段的双酶切反应体系

质粒酶切混合液在37℃反应15min，Cap片段片段酶切混合液在37℃反应30min，反应完成后，琼脂糖凝胶电泳，切胶用凝胶回收试剂盒进行回收酶切后的质粒DNA和Cap片段。

5.Cap片段和pET-28a(+)连接

使用分光光度计测酶切回收后的Cap片段和pET-28a的浓度，用T4DNA连接酶(NEB公司)连接，根据T4DNA连接酶使用说明书配制反应体系见表5。将Cap片段克隆到pET-28a的BamH I和Xho I两个酶切位点之间。

表5 Cap片段和pET-28a连接体系

连接体系混匀后，置于4℃过夜。

6.连接产物转化DH5α

(1)从-80℃冰箱中取出100μL感受态细胞至于冰盒上，完全融化后加入10μL连接产物，DNA体积不超过总体积的10％，用吸头轻轻混匀，冰浴30min。

(2)42℃水浴锅内热击90s(不要超过90s)，冰浴3min。

(3)在超净台中加入700μL液体无抗LB培养基(配方为：胰蛋白胨(tryptone)10g，酵母提取物(yeast extract)5g，氯化钠(NaCl)10g，用水定容至1L，121℃，21分钟高压灭菌后，保存于4℃冰箱备用)，37℃200r/min振荡培养1h。

(4)4000r/min离心5min，弃约500μL上清，再重悬菌液。

(5)用灭菌L型涂布器将重悬菌体涂布在含Kna抗性的LB培养基的平板上。

(6)置于37℃温箱中，至完全吸收30min，待菌液渗入培养基后，倒置平皿继续培养12～16h。

7.重组子筛选

(1)PCR鉴定：当菌落长约12～16h时，于超净台上随机挑选单菌落。挑取平板上的单菌落，接至3mL Kna+抗性的LB液体培养液中，12～14℃振荡培养过夜，提取质粒(操作同前述“3.pET28a质粒的提取”)，按表1的反应体系和表2的反应程序进行PCR扩增及琼脂糖凝胶分析鉴定。

(2)双酶切鉴定：取PCR鉴定阳性的质粒用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行酶切鉴定。

(3)测序鉴定：将PCR鉴定和酶切鉴定阳性的质粒送广州美吉生物公司进行测序，测序结果如SEQ ID No.2所示。

用DNAMAN软件分析测序结果，以确定阅读框是否正确，将测序鉴定正确的阳性重组质粒命名为pET28a-PCV3Cap(图2)。

8.重组蛋白表达诱导表达

将测序正确的阳性重组子转化大肠杆菌(Rosetta菌株)(转化方法同实施例1中的“6.连接产物转化DH5α”)，37℃恒温培养12～16h，挑取单菌落接种于3mL LB(Kna+)液体培养基中，37℃恒温振荡培养约12h，次日菌液按1:50接种于300mL LB(Kna+)液体培养基中，以转速200r/min，在37℃条件下振荡培养至OD600＝0.4～1.0(约需2～3h)，取1mL菌液作为对照菌液；放4℃冷却，再加入IPTG至终浓度为0.1mol/L进行重组蛋白的诱导表达，诱导4h，取样1mL，4℃，10000r/min，离心2min，弃上清，收集菌体(命名为Cap-Ecoli)，于-20℃保存，用于后续的SDS-PAGE蛋白电泳分析。剩余菌液离心收集于50mL离心管中，存于-80℃，用于蛋白纯化。

将上述鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌(Rosetta菌株)并经IPTG诱导表达后收集得到的菌体Cap-Ecoli，以及前述加诱导剂前取的1mL对照菌液，处理后去上清进行SDS-PAGE分析。结果如图4所示，加诱导剂后，在Cap泳道的30KDa左右处出现明显特异性条带，与预期的重组Cap的蛋白分子量大小一致，说明Cap在大肠杆菌中得到表达，且表达蛋白为可溶的，将重组蛋白命名为重组蛋白Cap-Ecoli。

SDS-PAGE电泳：

①洗净玻璃板，固定在蛋白电泳制胶支架上。按分子克隆的方法配制12％的分离胶10mL，迅速注入两玻璃板之间，胶顶覆盖2mL双蒸水，待分离胶凝固后吸去水，用去离子水冲洗凝胶顶部数次，倒置空干液体，加入1.0mL 5％的积层胶溶液，插上梳子，等20min左右至胶凝固。

②将凝固好的胶板固定在电泳槽上，在电泳槽间加入Tris-甘氨酸缓冲液，数分钟后移去梳子，用注射器冲洗加样孔。

③分别向菌体Cap-Ecoli和对照菌液中入40μL去离子水，涡旋混合均匀后加10μL5×Loading Buffer，再次混合均匀，100℃煮沸5min裂解样品。室温放置数分钟使样品冷却，室温5000r/min离心4min后上样，取5μL上样。

④打开电源，用80V电压电泳至溴酚蓝进入分离胶，电压提高到100V，继续电泳2h～3h至溴酚蓝到凝胶底部。

⑤染色：取下凝胶用蒸馏水冲洗，用5倍体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，在平缓摇动的摇床上室温染色过夜。

⑥脱色：取出凝胶，加入脱色液，在脱色摇床上进行脱色，期间更换脱色液3～4次。待蓝色背景完全脱净后，将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色。(6)将SDS-PAGE分析条带正确的蛋白，加入透析袋中，放入预冷的PBS中4℃透析6～7h。

9.重组蛋白的纯化

采用碧云天生物科技有限公司的Ni-NTA His镍柱对重组蛋白进行纯化，具体纯化步骤如下：

(1)按照每克细菌沉淀湿重加入2～5mL非变性裂解液的比例，向步骤8中得到的菌体Cap-Ecoli中加入裂解液，充分重悬菌体。

(2)加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL并混匀，冰水浴或冰上放置30min。

注：如果没有溶菌酶，也可以直接进入步骤(3)。

(3)冰上超声裂解细菌。超声功率200～300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。

(4)(可选做)如果超声处理后裂解液非常粘稠，可以加入RNase A至10μg/mL及DNase I至5μg/mL，冰上放置10-15min。或者也可以使用适当的装好了较细针头的注射器，反复抽吸数次，以剪切粘稠的基因组DNA等。

(5)在4℃下10,000g离心20～30min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上。可以取20μL上清留作后续检测用。

注：上清必须保持澄清，即不含任何不溶物，才能进行下一步的纯化。上清中如果混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度。

(6)取适量混合均匀的50％BeyoGold^TM His-tag Purification Resin，4℃离心(1000g×10s)弃去储存液，向凝胶中加入一个柱体积的非变性裂解液混匀以平衡凝胶，4℃离心(1000g×10s)弃去液体，再重复重复平衡1～2次，弃去液体。

(7)按照每0.5mL凝胶(相当于1mL 50％的凝胶)中加入4mL细菌裂解液上清的比例(1:8)，混合BeyoGold^TM His-tag Purification Resin和细菌裂解液上清。4℃在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动60min。

(8)将裂解液和BeyoGold^TM His-tag Purification Resin的混合物装入适当的空柱管中，如碧云天的亲和层析柱空柱管。

(9)将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，收集约20微升穿流液作后续分析用。

(10)洗柱5次，每次加入1～2个柱体积的非变性洗涤液，每次均收集约20微升穿柱的洗涤液用于后续的分析检测用。例如1mL混合均匀的50％BeyoGold^TM His-tagPurification Resin装柱后的柱体积为0.5mL，即1mL混合均匀的50％BeyoGold^TM His-tagPurification Resin装柱后每次洗柱的洗涤液体积为0.5mL。洗柱及下一步洗脱过程中可以用Bradford法(P0006)简单快速地检测每次洗涤液和洗脱液中的蛋白含量，从而考虑增加或减少洗涤和洗脱的次数。

(11)洗脱目的蛋白6～10次，每次用一个柱体积的非变性洗脱液。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱液即为纯化的His标签蛋白样品。对纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE分析，结果如图6所示，结果显示在大约25～35KDa处(泳道1)，有一较为单一条带，大约30KDa，与目的蛋白大小一致，从图片来看，其纯度较纯，杂质较少，可以用于下一步实验。

实施例2杆状病毒表达重组Cap蛋白

1.基因扩增

同实施例1。

2.Cap目的片段胶回收

同实施例1。

3.Cap片段和pFastBac-HTB双酶切

用BamHI和XhoI分别对得到的Cap基因片段和pFastBac-HTB质粒分别进行酶切，酶切体系表6、表7所示。

表6 pFastBac-HTB质粒的双酶切反应体系

表7 Cap基因片段的双酶切反应体系

37℃金属浴孵育20min，反应完成后，根据分子克隆手册，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，将目的片段回收，回收方法参考凝胶回收试剂盒(Omega公司)说明书。

4.Cap片段和pFastBac-HTB连接

使用分光光度计测酶切回收后的Cap片段和pFastBac-HTB的浓度，用T4DNA连接酶(NEB公司)连接，根据T4DNA连接酶使用说明书配制反应体系见表8。将Cap片段克隆到pFastBac-HTB的BamH I和Xho I两个酶切位点之间。

表8 Cap片段和pFastBac-HTB连接体系

连接体系混匀后，置于4℃过夜。

5.连接产物转化DH5α

(2)42℃水浴锅内热击90s(不要超过90s)，冰浴3min。

(3)在超净台中加入700μL液体无抗SOC，37℃200r/min培养1h。

(4)4000r/min离心5min，弃约500μL上清，再重悬菌液。

(5)用灭菌L型涂布器将重悬菌体涂布在含Amp抗性的LB培养基的平板上。

(6)置于37℃温箱中，至完全吸收30min，待菌液渗入培养基后，倒置平皿继续培养14h。

6.重组子筛选

PCR鉴定：当菌落长至直径为1～2mm(约12～16h)时，于超净台上随机挑选单菌落。挑取平板上的单菌落，接至3mL Amp+抗性的LB液体培养液中，12～14℃振荡培养过夜，提取质粒DNA，并对质粒进行PCR鉴定(步骤同实施例1中的“7.重组子筛选”)。

测序鉴定：将PCR鉴定和酶切鉴定阳性的质粒送广州美吉生物公司进行测序。测序结果如SEQ ID No.2所示。

用DNAMAN软件分析测序结果，以确定阅读框是否正确，将测序鉴定正确的阳性重组质粒命名为pFastBac-HTB-PCV3Cap(图3)。

7.转化DH10BacTM大肠杆菌

将测序正确的阳性重组子转化DH10BacTM大肠杆菌：

(1)每次转化，在冰上解冻一支博迈德公司的DH10BacTM感受态细胞。

(2)每次转化时，轻轻混匀100μLDH10BacTM细胞并转移至一支预冷的15mL圆底聚丙烯管内。

(3)加入适量的pFastBac-Cap重组体至细胞中，轻轻混匀。切勿上下吹打混，pFastBac-Cap重组体：1ng(5μL)。

(4)冰孵细胞30分钟。

(5)42℃热激细胞45秒，切勿摇晃。

(6)立即将试管转移至冰上，冷却2分钟。

(7)向试管中添加900μL的室温LB养基。

(8)pFastBac^TM转化：37℃下，225rpm振荡试管4小时。pFastBac-HTB直接转化DH10Bac：37℃下，225rpm振荡试管1小时。

(9)每次pFastBac^TM转化：使用LB培养基制备10倍连续稀释的细胞(10^–1、10^–2、10^–3)。将100μL各种稀释度的细胞接种在含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素、100μg/mL Bluo-gal和40μg/mL IPTG的LB琼脂板上。

(10)将琼脂板置于37℃下孵育48小时。挑选白斑菌落分析。

8.PCR鉴定

选择白色菌斑点，接种到3mL含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素的LB培养基中培养，培养18h，取1μL作为模板之后进行PCR鉴定；对于每种样本，在0.5mL微量离心管中建立如下的20μL PCR反应：

表9 菌落PCR反应体系

其中，引物M13F的序列为：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’；

引物M13R的序列为：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’。

反应程序为：95℃，5min；以下反应34个循环：95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；之后72℃，5min；最后4℃保存。

9.分离重组杆粒DNA

将PCR鉴定正确的菌液，按照Thermo Fisher公司的PureLink^TM HiPure PlasmidMiniprep Kit(Invitrogen^TM)说明书进行分离操作。

10.杆粒转染Sf9细胞(CRL-1711^TM，购自ATCC)

(1)确认Sf9细胞处于对数期(1.5～2.5×10⁶个细胞/mL)，且存活率高于95％。

(2)如果细胞密度在1.5～2.5×10⁶个细胞/mL范围内，且培养物中无抗生素(如果细胞密度不在此范围内或者细胞培养物中含有抗生素)：温下贴壁15分钟。

a.将1.5mL添加有10％FBS的Grace昆虫细胞培养基(无抗生素，购自ThermoFisher公司)与8.5mL不含添加剂的Grace昆虫细胞培养基(无FBS或抗生素)混匀，制备10mL平板培养基。

b.吸出培养基，每孔中加入第(2)a步所述的平板培养基。

(3)对于每种转染样本，按下列方法制备复合物：

a.使用前混匀II(购自ThermoFisher公司)，取8μL稀释于100μL不含添加剂的Grace培养基中(无抗生素或血清)。短暂涡旋混匀。

注：可以将该混合物置于室温下至多30分钟。

b.取1μL杆状病毒DNA稀释于100μL不含添加剂的Grace培养基中(无抗生素或血清)，轻轻混匀。

c.将步骤b得到的稀释后的DNA与步骤a得到的稀释后的II混合(总体积209μL)。轻轻混匀并在室温下孵育15～30分钟。

(4)逐滴加入210μL DNA-脂质体混合物或转染混合物(第(3)c步)至第2步获得的细胞中。27℃下孵育细胞3～5小时。

(5)吸出转染混合物，加入2mL完全培养基(如含有添加剂的Grace昆虫细胞培养基和10％FBS)，可以选择使用抗生素。

(6)27℃下孵育细胞72小时，直至观察到病毒感染征象。

(7)转染2个孔(6孔板)，一个孔的细胞重悬，1500rpm离心5min，收集后用于SDS-PAGE分析，对照组同以上处理方法。另一个孔的细胞冻存，离心收集上清，此为病毒储液，用于蛋白大量培养。

收集转染重组杆粒和空载杆粒(pFastBac-HTB空载，对照)后的细胞，进行SDS-PAGE分析，结果如图5所示，转染重组杆粒样品(泳道Cap-sf9)在30KDa左右处出现明显特异性条带，与预期的重组Cap的蛋白分子量大小一致，说明Cap在sf9细胞中得到表达。

11.蛋白大量培养

将上述得到病毒储液按照1:100接种于500mL sf900II培养基(购自ThermoFisher公司)，130rpm振荡培养72h，1500rpm离心收集细胞，细胞加20mL非变性哺乳动物细胞裂解液(碧云天公司)，用于蛋白纯化步骤。

12.蛋白纯化

裂解液为非变性哺乳动物细胞裂解液，其余步骤和试剂同实施例1“9.重组蛋白的纯化”。将最终获得的重组蛋白命名为重组蛋白Cap-sf9。

将制得纯化后的Cap蛋白进行SDS-PAGE电泳分析结果如图6所示，如图所示，在泳道2大约25～35KDa处，有一较为单一条带，大约30KDa，与目的蛋白大小一致，从图片来看，其纯度较纯，杂质较少，可以用于下一步实验。

实施例3疫苗免疫效果实验

选取15头的约3周龄健康易感仔猪，无PCV3抗原和抗体，无PRRSV，PEDV，PRV，猪葡萄球菌等主要猪病病原感染，随机分为3组。注射前按表10将免疫原和佐剂等体积混合后，注射仔猪。免疫后3周后，采集血清，测定Cap特异性抗体滴度；采血后1周，进行攻毒。攻毒毒株为PCV3-China/GD2016，滴度为10^⁶TCID50，每头滴鼻1mL，攻毒后14天，采集淋巴结，用荧光定量PCR的方法测定组织中PCV3含量。

表10 免疫效果实验

荧光定量PCR的方法的具体操作为：针对Cap蛋白基因设计定量用引物：

F：5’-ATAGATCTAGACGGCGCCTGG-3’；

R：5’-GGTTTGGGGGTGAAGTAACGG-3’。

以实施例1鉴定正确的pET28a-Cap质粒作为模板，建立标准曲线。取猪的腹股沟淋巴结，每头猪取1g，提取组织中的DNA，测定组织中PCV3的拷贝数/g。

免疫3周后测定Cap特异性抗体滴度结果如图7所示，用纯化的Cap蛋白与佐剂一起免疫仔猪，PBS作为对照，免疫后3周，采集血清，用ELISA方法测定特异性抗体的OD45值，并计算S/P值，结果可以看出，免疫PBS加佐剂组的Cap蛋白特异性抗体的S/P值几乎是背景值，而免疫了大肠杆菌和杆状病毒表达的蛋白的猪的血清的S/P值，显著升高，达到1以上左右，说明表达的蛋白可以有效刺激机体产生抗体，是良好的免疫原性蛋白。

免疫28天后攻毒，第14天测定组织中PCV3含量，结果如图8所示，荧光定量PCR结果显示，PBS对照组的PCV3的拷贝数达到10¹⁰个/g，而免疫了实施例2杆状病毒和实施例1大肠杆菌表达的Cap蛋白的猪，组织中PCV3的含量下降到10⁶～10⁷个/g，前者与后者差异显著(p<0.05)，疫苗是组织病毒载量降低了1000倍左右。同时，杆状病毒表达的蛋白作为疫苗对于降低PCV3的拷贝数更加明显，但与大肠杆菌表达的蛋白的作用相比，差异不显著。说明本发明表达的重组Cap蛋白能有效降低组织的病毒含量，进而说明大肠杆菌和杆状病毒表达的Cap蛋白作为亚单位疫苗能有效的控制PCV3的感染，是理想的PCV3基因工程亚单位疫苗候选单位。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用

<130> 1

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 猪圆环病毒3型（PCV-3）

<400> 1

Met Arg His Arg Pro Ile Phe Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Arg Leu Phe Ile Arg Arg

20 25 30

Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val

35 40 45

Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His

50 55 60

Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Ser Phe Glu Tyr

65 70 75 80

Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro

85 90 95

Ala Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp

100 105 110

Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu

115 120 125

Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Lys His Ser Arg Tyr

130 135 140

Phe Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly

145 150 155 160

Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr

165 170 175

Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro

180 185 190

Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Asp Thr Lys Glu Val Trp Ile

195 200 205

Arg Tyr Lys Ser Val Leu

210

<210> 2

<211> 645

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒3型（PCV-3）

<400> 2

atgagacaca gacctatatt cagaagaaga ccccgcccac gcagacgacg acgccacaga 60

aggcgctatg ccagaagaag actattcatt aggaggccca cagctggcac atactacaca 120

aagaaatact ccaccatgaa cgtcatctcc gttggaaccc ctcagaataa caagccctgg 180

cacgccaacc acttcattac ccgcctaaac gaatgggaaa ctgcaattag ctttgaatat 240

tataagatac taaagatgaa agttacactc agccctgtaa tctcaccggc tcagcaaaca 300

aaaactatgt tcgggcacac agccatagat ctagacggcg cctggaccac aaacacttgg 360

ctccaagacg acccttatgc ggaaagttcc actcgtaaag taatgacttc taaaaaaaaa 420

cacagccgtt acttcacccc taaaccaatt ctggcgggaa caacctccgc tcacccagga 480

caaagcctct tctttttctc caggcccacc ccatggctca acacatatga ccccaccgtt 540

caatggggag cactgctttg gagcatttat gtcccagaaa aaactggaat gacagacttc 600

tacgacacca aagaagtttg gattcgttac aagtcagttc tctaa 645

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR上游引物

<400> 3

ggcggatcca tgagacacag acctatattc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR下游引物

<400> 4

gggctcgagg agaactgact tgtaacgaat 30

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 菌落PCR引物M13 F

<400> 5

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 菌落PCR引物M13R

<400> 6

caggaaacag ctatgacc 18

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 荧光定量PCR引物F

<400> 7

atagatctag acggcgcctg g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 荧光定量PCR引物R

<400> 8

ggtttggggg tgaagtaacg g 21

Claims

1.一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗，包含一种可溶性融合蛋白，其特征在于：所述的可溶性融合蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或是具有通过突变、删除、插入或取代方式将如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的至少1个氨基酸改变的序列。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于：所述的可溶性融合蛋白是免疫活性成分，其来自于猪圆环病毒3型核衣壳蛋白。

3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于：所述的可溶性融合蛋白来自于猪圆环病毒PCV3-China/GD2016病毒株。

4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于：所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗还包括佐剂。

5.根据权利要求1所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于：编码所述的可溶性融合蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

6.权利要求1～5任一项所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将编码所述的可溶性融合蛋白的核苷酸序列克隆入表达载体构建重组表达载体；将所述重组表达载体转入表达系统中进行表达，纯化，得到所述的猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述的表达系统为大肠杆菌、杆状病毒表达系统、真核哺乳动物细胞表达系统和植物表达系统中的一种或至少两种。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的构建重组表达载体的具体步骤为：针对编码所述的可溶性融合蛋白的核苷酸序列，通过设计引物进行PCR，将得到的PCV3-Cap基因片段双酶切后与表达载体连接构建得到重组表达载体。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的引物为：

上游引物：5’-GGCGGATCCATGAGACACAGACCTATATTC-3’，

下游引物：5’-GGGCTCGAGGAGAACTGACTTGTAACGAAT-3’。

10.权利要求1所述的疫苗在预防和/或治疗猪圆环病毒III型引起的猪相关疾病中的应用。