CN112316127A - 基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒以及由其制备的猪圆环疫苗和应用 - Google Patents

基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒以及由其制备的猪圆环疫苗和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒以及由其制备的猪圆环疫苗和应用。本发明将猪圆环病毒的衣壳蛋白与自组装铁蛋白纳米颗粒亚基N端融合进行表达，将猪圆环病毒衣壳蛋白展示在自组装铁蛋白笼形结构表面。本发明进一步获得该融合蛋白的同感序列并进行密码子优化，在优化后序列上进行氨基酸单位点，双位点和多位点突变，显著提升了可溶性表达量和表达效率，提高了猪圆环疫苗的免疫效力与宽度，有效提高了猪圆环病毒衣壳蛋白的免疫原性。本发明利用大肠杆菌原核表达系统、家蚕AcMNPV‑昆虫细胞真核表达系统来表达融合蛋白并制备得到猪圆环疫苗，或者通过重组杆状病毒在脊椎动物体内组织进行融合蛋白抗原基因呈递产生抗原诱导抗体产生。

Description

基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒以及由其制备的猪圆环疫苗 和应用
技术领域
本发明涉及基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒，尤其涉及包含由猪圆环病毒衣壳蛋白和单体铁蛋白亚基融合在一起的纳米抗原颗粒以及由该纳米颗粒抗原制备的猪圆环疫苗，属于猪圆环疫苗领域。
背景技术
猪圆环病毒感染是由猪圆环病毒所引起的一系列疾病的总称，通常是哺乳期和保育期的仔猪容易感染，易感性较强，猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，无囊膜，基因组为单股环状DNA，有3个血清型，PCVI、PCV-II和PCV-III，只在猪源细胞上增殖，不产生细胞病变，对外界的抵抗力强，可耐受pH 3的酸性环境，猪圆环病毒病是全球公认的危害养猪业的重要疫病，可造成T、B淋巴细胞在外周血中含量降低，并可诱导CD4、CD8等细胞凋亡，造成免疫抑制，不仅造成该类疫苗的免疫失败，而且容易继发或并发副猪嗜血杆菌、猪附红细胞体、猪蓝耳病、伪狂犬等病原，因此，研发高效、安全、廉价的PCV疫苗成为防控该病的必然趋势。
近年来，纳米生物学被认为是纳米技术中最有潜力的领域之一，铁蛋白是最为常见的纳米颗粒，广泛应用于多个领域。其具有纳米尺寸的水和氧化铁内核和笼状结构的蛋白质外壳，且铁蛋白非常稳定，能够耐受高温和多种变性剂而不影响其天然蛋白结构，对pH较敏感，在酸性条件下蛋白质外壳发生解体，当pH恢复到生理条件时，解体的蛋白亚基又能重新组装成完整的铁蛋白，通过改变溶液的pH使其解聚和重组装向铁蛋白腔内装载药物或纳米颗粒。近年来对铁蛋白的研究主要集中在通过对铁蛋白内表面的修饰使铁蛋白壳内包裹上特定药物或者促进纳米材料的合成，对铁蛋白外表面的修饰与PEG或抗体连接以扩展新的功能，通过铁蛋白外表面或亚基间接触面的修饰控制铁蛋白的自组装。铁蛋白纳米颗粒展示抗原，能够显著地增强抗原的免疫原性，引起更强的体液、细胞免疫反应，因此铁蛋白是理想的纳米疫苗平台。
因此，研制一种基于自组装铁蛋白纳米颗粒将猪圆环病毒的抗原展示在该自组装铁蛋白笼形结构表面，能够显著地增强抗原的免疫原性，对于PCV的防治将具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种包含融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒；
本发明的目的之二是将所述融合蛋白进行突变进而提高融合蛋白的表达量或表达效率；
本发明的目的之三是提供基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒得到的纳米颗粒猪圆环疫苗；
本发明目的之四提供高效表达所述融合蛋白的方法；
本发明目的之五是提供一种将自组装铁蛋白纳米颗粒与衣壳蛋白所构建的融合基因呈递给动物体内并在动物体内呈递抗原诱导产生抗体的方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先提供了一种包含融合蛋白的纳米抗原颗粒，所述融合蛋白由猪圆环病毒衣壳蛋白和单体铁蛋白亚基的N端连接得到；优选的，将猪圆环病毒衣壳蛋白和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白。
所述单体铁蛋白亚基包括细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白或哺乳动物铁蛋白中的任何一种；优选的，所述单体铁蛋白亚基是幽门螺杆菌铁蛋白单体，其序列为WP_000949190所示的氨基酸序列。
所述猪圆环病毒衣壳蛋白是PCV-II病毒衣壳蛋白或PCV-III病毒衣壳蛋白；优选的，所述猪圆环病毒衣壳蛋白所选区域包含选自以下区域：能够容许衣壳三聚体形成的区域、茎区、胞外结构域；最优选的，所述PCV-II病毒衣壳蛋白选取PCV-II病毒完整衣壳蛋白部分，所述PCV-II病毒衣壳蛋白的序列为WP_000949190所示的氨基酸序列；所述PCV-III病毒衣壳蛋白选取PCV-III病毒完整衣壳蛋白部分，所述PCV-III病毒衣壳蛋白的序列为APA21932.1所示的氨基酸序列；
作为本发明的一种优选的实施方式，本发明所提供的一种原始融合蛋白(PCV-IICAP-Ferritin)包括铁蛋白单体序列(WP_000949190)和PCV-II病毒衣壳蛋白(AMJ50231.1)；本发明所提供的另一种原始融合蛋白(PCV-III CAP-Ferritin)包括铁蛋白单体序列(WP_000949190)和PCV-III病毒衣壳蛋白序列(APA21932.1)。
为了提高猪圆环病毒衣壳蛋白与铁蛋白单体连接后得到的原始融合蛋白的表达量，本发明进一步将两种原始融合蛋白(PCV-II CAP-Ferritin和PCV-III CAP-Ferritin)融合蛋白的同感序列进行突变优化并在序列优化之后进行糖基化位点分析以消除糖基化位点来增加可溶性表达，进而在同感序列优化之后进行氨基酸单位点突变，双位点突变和多位点突变，以提高其可溶性表达量和表达效率：
具体的，本发明通过分析了17条最近年份，流行于不同地区的PCV-II、PCV-III毒株的衣壳蛋白氨基酸序列进行比对分析，找出一条最为通用的同感序列，作为相应毒株的抗原基因，以期取得最佳的保护效果；在此基础上，本发明进一步利用OptimumGeneTM技术对PCV-II、PCV-III衣壳蛋白氨基酸序列进行优化，将优化后的衣壳蛋白氨基酸序列和铁蛋白单体亚基氨基酸序列根据大肠杆菌密码子偏好性对氨基酸序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。此外，为了提高铁蛋白的表达量，同时提高可溶表达对铁蛋白单体亚基进行点突变N19Q；最终，PCV-II的原始融合蛋白的同感序列的氨基酸序列为SEQID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，按照上述方式将该编码基因的序列进行优化得到的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；PCV-III的原始融合蛋白的同感序列的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，按照上述方式将该编码基因的序列进行优化得到的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示。
本发明将优化后的同感序列在家蚕表达系统中进行表达，根据基因表达产物ELISA效价结果可见，密码子优化后的同感序列的表达量相比优化前有了显著提高。
本发明获得了PCV-II CAP-Ferritin-C、PCV-III CAP-Ferritin-C突变体，以PCV-II CAP-Ferritin-C、PCV-III CAP-Ferritin-C突变体密码子优化后的基因序列为模板，设计多对引物对保守序列进行定点突变：
将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照R12D、Q21H、R35S、L49T、V62Q、F74K、P88T、F105D、V118S、A133E、I150H、Y160R、P176S、A190D、N204T、M217H或P233K的氨基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体；
将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列按照R15P、K27S、Y43T、W60H、A75E、L90D、M103R、N118Q、V134K、P147R、G160D、Y176K、V191Q、W207H的氨基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体；
本发明将突变后的这些单位点突变体在家蚕表达系统中进行表达，根据表达结果可见：将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照Q21H、F74K、F105D、A133E、P176S或N204T的氨基酸单位点突变方式获得的6个突变体的表达产物的效价呈显著提升；将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列按照K27S、W60H、A75E、M103R、Y176K、W207H的氨基酸单位点突变方式获得的6个突变体的表达产物的效价呈显著提升。
本发明所述氨基酸单位点突变“Q21H”表示将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第21位氨基酸由Q突变成H；其余的单位点突变的表述依此类推。
基于所确定的部分单位点的突变是有效突变，可以达到提高PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M突变体表达量的目的，考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构并决定着蛋白质的高级结构且上述进行的氨基酸单位点突变有部分突变位点的位置可能是相互关联的，本发明进一步进行氨基酸双位点突变，即：本发明将可以提高表达量的单突变位点PCV-II CAP：Q21H、F74K、F105D、A133E、P176S、N204T；PCV-III CAP：K27S、W60H、A75E、M103R、Y176K、W207H两两组合进行双位点突变，具体如下：
将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照Q21H-F74K、Q21H-F105D、Q21H-1133E、Q21H-P176S、Q21H-N204T、F74K-F105D、F74K-A133E、F74K-P176S、F74K-N204T、F105D-A133E、F105D-P176S、F105D-N204T、A133E-P176S、A133E-N204T、P176S-N204T的氨基酸双位点突变方式获得15个双位点突变体；
将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列按照K27S-W60H、K27S-A75E、K27S-M103R、K27S-Y176K、K27S-W207H、W60H-A75E、W60H-M103R、W60H-Y176K、W60H-W207H、A75E-M103R、A75E-Y176K、A75E-W207H、M103R-Y176K、M103R-W207H、Y176K-W207H的氨基酸双位点突变方式获得15个位点突变体；
本发明所述氨基酸双位点突变“Q21H-F74K”表示将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸的第21位氨基酸由Q突变成H并且将第74位氨基酸由F突变成K；其余的多位点突变的表述依此类推。
本发明将获得的30个双位点突变体分别在家蚕表达系统中进行表达，根据表达结果可见：将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照Q21H-1133E、F74K-A133E或F105D-A133E的氨基酸双位点突变方式获得的3个位点突变体的表达产物的效价呈显著提升，其中，将SEQID NO.1所示的氨基酸按照F74K-A133E氨基酸双位点突变获得的突变体的效价提升最为显著。
将氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸按照K27S-Y176K、W60H-Y176K或Y176K-W207H中的氨基酸双位点突变方式获得的3个位点突变体的表达产物的效价呈显著提升，其中，将氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸按照W60H-Y176K氨基酸双位点突变获得的位点突变体的效价提升最为显著。
鉴于部分双位点突变能够有效提升表达量后效价，考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构，并决定着蛋白质的高级结构，推测可能是由于进行的氨基酸单位点突变有部分突变点的位置相互靠近彼此关联的，本发明进一步尝试进行氨基酸多位点突变。本发明通过分析糖基化位点，得出6个单突变位点能有效提高目的基因的表达量，因此多位点突变是基于上述获得有效的双位点突变序列的基础之上，通过融合PCR的方法进行多突变位点的定点突变，具体突变方式如下：
将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照Q21H-F74K-F105D-A133E-P176S-N204T氨基酸多位点突变方式获得多位点突变体；将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列按照K27S-W60H-A75E-M103R-Y176K-W207H氨基酸多位点突变方式获得的多位点突变体。
本发明所述氨基酸多位点突变“Q21H-F74K-F105D-A133E-P176S-N204T”表示同时SEQ ID NO.1所示的氨基酸的第21位氨基酸由Q突变成H、第74位氨基酸由F突变成K、第105位氨基酸由F突变成D、第133位氨基酸由A突变成E、第176位氨基酸由P突变成S以及第204位氨基酸由N突变成T；其余的多位点突变的表述依此类推。
本发明将获得的上述两个多位点突变体分别在家蚕表达系统中进行表达，根据表达结果可见：所得的两个多位点突变体的表达量相比上述单突变体、双突变体的表达量均有显著提升。本发明进一步将这两个多位点突变体在家蚕表达系统中的表达产物经过初步纯化后采用电镜进行观察，观察结果可见产物大小与预期符合的纳米颗粒，笼状体的直径为12纳米左右，仔细观察可见有天线状突出。
本发明将获得的两个多位点突变体编码基因克隆到杆状病毒哺乳动物的表达载体中构建得到呈递基因的重组杆状病毒；将重组杆状病毒呈递给小鼠，结果发现小鼠所产生的抗体效价明显高于健康蚕蛹对照和传统疫苗。
因此，本发明所提供的包含融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒能应用于制备猪圆环疫苗，其应用方法包括：
(Ⅰ)将所述的融合蛋白编码基因采用原核系统表达系统在原核细胞中进行表达得到纳米抗原颗粒，将所表达的纳米抗原颗粒产物纯化后与医学上可接受的免疫佐剂或载体混合在一起得到猪圆环疫苗；
作为参考，采用原核系统表达系统在原核细胞中表达纳米抗原颗粒的步骤包括：
(1)将融合蛋白原始序列或突变优化后的融合蛋白序列克隆到表达载体pET28a上，得到重组质粒pET28a-PCV-II CAP-Ferritin、pET28a-PCV-III CAP-Ferritin；
(2)将重组质粒pET28a-PCV-II CAP-Ferritin、pET28a-PCV-III CAP-Ferritin转化到BL21(DE3)感受态细胞中表达，随后经过镍柱纯化，即得。
(Ⅱ)将所述的融合蛋白编码基因采用真核表达系统在真核细胞中进行表达，将所表达的抗原产物纯化后后与医学上可接受的免疫佐剂或载体混合在一起得到猪圆环疫苗。
作为参考，所述的融合蛋白编码基因采用真核表达系统在真核细胞中进行表达的方法包括：
将所述的融合蛋白编码基因在家蚕表达系统中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；优选的，将所述的融合蛋白编码基因构建到家蚕杆状表达载体中制备得到重组家蚕杆状病毒；将重组家蚕杆状病毒在家蚕细胞中扩增后在家蚕或蚕蛹中进行表达；
或者将所述的融合蛋白编码基因在AcMNPV-昆虫细胞真核表达系统中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；优选的，将融合蛋白编码基因克隆到杆状病毒转移载体中构建得到重组杆状病毒转移载体；将重组杆状病毒转移载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞，培养被感染的昆虫细胞或昆虫宿主表达相应的抗原，纯化，即得；
(Ⅲ)还可将所述的融合蛋白编码基因克隆到基因呈递载体上构建得到向脊椎动物细胞或个体中呈递外源基因的重组杆状病毒转移载体，将重组杆状病毒转移载体转染家蚕细胞得到重组病毒；所得到的重组病毒通过注射或口服的方式在动物体内呈递抗原并诱导动物产生抗体。
本发明进一步提供了一种防治猪圆环的疫苗，包括：预防或治疗上有效量的包含融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒以及药学上可接受的免疫佐剂或载体。
本发明的疫苗可以以各种不同的药物赋形剂或载体配制，它们可以包括盐和缓冲剂以提供生理学的离子强度和pH，表面活性剂诸如聚山梨醇酯20和80以防止抗原聚集，用于抗原稳定的稳定剂，诸如PEG、海藻糖和明胶及用于缓释的聚合物诸如CMC、HEC和葡聚糖。疫苗还可以受控释放或增强的展示系统配制，诸如水凝胶、病毒体、纳米颗粒和乳液。疫苗还可以配制佐剂以进一步增加交叉反应免疫应答和交叉保护，所述合适的佐剂可以选自多糖诸如脂多糖和皂苷或核酸、脂质诸如MPL(单磷酰脂质A)、蛋白质诸如细菌鞭毛蛋白、无机盐诸如铝盐和磷酸钙、乳剂诸如弗氏不完全佐剂、MF59和AS03和各种Toll样受体配体。可以用处理的抗原测试不同的佐剂，以鉴定在合适的佐剂剂量产生较高水平的交叉反应免疫应答和交叉保护，包括完全的或100％的保护的合适的佐剂。
本发明的猪圆环疫苗可通过各种途径使用，如肌内、皮下、鼻内、局部、舌下、或口服。
本发明所提供的疫苗能通过在幽门螺杆菌铁蛋白笼形结构表面展示猪圆环病毒蛋白，从而能够引起广泛中和性猪圆环抗体。此种疫苗诱导个体产生的中和性抗体不仅增加了免疫效力，还增加了免疫范围，能免疫不同年份同型以及异型猪圆环病毒。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1、本发明利用原核表达系统大肠杆菌、家蚕杆状病毒和AcMNPV-昆虫细胞真核表达系统表达重组蛋白疫苗，疫苗制备过程不涉及到活的有害病毒，相比传统制备疫苗方法操作更加安全、简便，适合进行快速大规模生产；
2、本发明提供的猪圆环猪圆环疫苗可以诱导具有广谱性质的猪圆环抗体，为制备一种通用猪圆环疫苗打下基础。
3、本发明提供的纳米猪圆环疫苗，用这种纳米猪圆环疫苗免疫接种动物而诱导产生的抗猪圆环抗体水平明显比传统疫苗的高。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
词语“抗原”和“免疫原”可互换使用，且是指能够诱导特异性体液(抗体)和细胞免疫应答的分子、物质、蛋白质、糖蛋白、或活病毒。
术语“抗原性”是指抗体与特异性抗原反应或结合的能力；术语“免疫原性”是指抗原或疫苗诱导特异性免疫应答的能力；术语“免疫应答”是指针对抗原、疫苗或感染因子的体液或抗体介导的和细胞介导的免疫应答；术语“疫苗”是指用于针对感染性或非感染性疾病的治疗性处理或预防性免疫的包括抗原的组合物；术语“免疫”是指通过接种疫苗或感染产生的免疫应答，其提供针对感染性或外来试剂的保护；术语“重组蛋白质或抗原”是指以重组DNA技术产生的蛋白质或抗原，其可用于在包括细菌、哺乳类细胞、昆虫细胞和植物的各种宿主中克隆和表达基因以产生蛋白质。术语“效力”是指如通过指定的效力测定测量的在抗原制剂或疫苗中抗原的量。
术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
术语“转染”指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。
附图说明
图1 PCV-II CAP-Ferritin在原核表达系统中表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；M为Marker；1为PCV-II CAP-Ferritin原核表达样品；2为pET-28a载体的原核表达样品；3为未诱导的原核表达样品。
图2 PCV-III CAP-Ferritin在原核表达系统中表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；M为Marker；1为PCV-III CAP-Ferritin原核表达样品；2为pET-28a载体的原核表达样品；3为未诱导的原核表达样品。
图3 PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6在家蚕表达系统中表达产物Westernblotting检测图；A为PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6家蚕表达产物；B为阴性对照。
图4 PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6在家蚕表达系统中表达产物Westernblotting检测图；A为PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6家蚕表达产物；B为阴性对照。
图5 PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6在家蚕表达系统中表达产物的电镜图。
图6 PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6在家蚕表达系统中表达产物的电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、试验材料与试剂
(1)菌株、病毒株与载体：原核表达载体pET-28a(+)、大肠杆菌TOP10菌株、转移载体pVL1393、原核表达菌株BL21(DE3)、家蚕细胞BmN、家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid、家蚕品种JY1均为中国农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保存；
(2)铁蛋白序列和猪圆环病毒衣壳蛋白基因序列：通过分析得到的共有序列送至金斯瑞公司合成并克隆到原核表达载体pUC57载体上。
(3)酶与试剂：限制性内切酶、T4 DNA连接酶及所对应的缓冲液均购自Promega公司；LA Taq聚合酶及缓冲液购自TaKaRa公司；各种规格的DNA和蛋白质分子量标准为TranGen Biotech公司产品；2K PlusⅡDNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自MBL公司；DEPC、M-MLV-Rtase(逆转录酶)购自Promega公司；
(4)生化试剂：Tris、Ampicillin、Kanamycin、IPTG、SDS、尿素、咪唑、TritonX-100、TEMED(N,N,N',N'-Tetramethylethylene diamine)、过硫酸铵(Ammonium Persulfate)、卡那霉素(Kanamycin)购自Sigma公司；bisacrylamide、acrylamide、IPTG、X-Gal购自Promega公司；琼脂糖为Sunbiotech公司产品；酵母抽提物(Yeast Extract)、胰蛋白胨均购自英国OXOID公司；0.2um、0.45um滤器购自Gelman Sciences公司；溴化乙锭(EB)、考马斯亮兰R-250购自Fluka公司；Ni-NTA Agarose、Proteinase K、胎牛血清购自Invitrogen公司；牛血清白蛋白购自罗氏公司；其它均为国产或进口分析纯试剂。引物合成与基因测序均由北京擎科新业生物技术有限公司完成。
(5)培养基：大肠杆菌培养基为LB培养基；家蚕昆虫细胞培养基为TC-100购自AppliChem公司；
(6)猪圆环病毒与铁蛋白融合构建的纳米疫苗的动物实验在隔离实验室进行。
2、实验方法中用于定点突变的融合PCR方法
参照邝翡婷等人(一种载体构建的新方法：重组融合PCR法，基因组学与应用生物学，2012年，第31卷，第6期，第634-639页)所描述的方法进行。
实施例1 PCV-II CAP-Ferritin、PCV-III CAP-Ferritin原始序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测
1有关溶液和培养基的配置
有关溶液和培养基的配置方法参照相关工具书(Joseph et al.,分子克隆实验指南第三版，2002；奥斯伯，等人，精编分子生物学指南，1998)。
2PCV-II、PCV-III衣壳蛋白基因序列和铁蛋白基因序列的合成
为了使猪圆环病毒衣壳蛋白与铁蛋白更好的融合表达，利用信号肽分析软件分别对PCV-II和PCV-III猪圆环病毒衣壳蛋白的氨基酸序列进行分析，两者均没有信号肽，分别选取PCV-II病毒完整衣壳蛋白以及PCV-III病毒完整衣壳蛋白。
为了促进猪圆环病毒与铁蛋白融合纳米颗粒的表达效率并提高可溶表达，将幽门螺杆菌铁蛋白氨基酸序列中第19位天冬酰胺(N)突变为谷氨酰胺(Q)以消除糖基化位点；其中，猪圆环病毒衣壳蛋白序列与铁蛋白序列之间由一段连接肽连接(SGG)，将铁蛋白氨基酸序列前4个氨基酸去掉，然后将连接肽连在铁蛋白N端第5个氨基酸上。
为了提高目的基因在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因前面加了Kozak序列AAC，为了提高翻译终止效率，终止密码子改为TAA。此外，还去除了基因序列内部的BamHI、EcoRI等限制性酶切位点，在基因上游加上了BamHI，在基因下游加上了EcoRI限制性酶切位点，以便后续克隆到真核转移载体pVL1393中。将上述所设计的猪圆环病毒衣壳蛋白基因序列和铁蛋白序列进行人工合成。
3猪圆环病毒和铁蛋白融合蛋白的质粒构建
3.1猪圆环病毒和铁蛋白融合蛋白的PCR扩增
用融合PCR技术将猪圆环病毒衣壳蛋白和铁蛋白融合在一起。具体实验方法见上述实验方法2。
3.1.1大肠杆菌表达质粒的PCR扩增
PCR扩增PCV-II CAP蛋白序列：以质粒pUC57-PCV-II CAP为模板
F1：5’-CGGGATCCATGACATATCCTAGACGCCGTTAC-3’
R1：5’-CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGATGGATTCAAGGGCGGGTCTTTCAG-3’
PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板
F2：5’-CTGAAAGACCCGCCCTTGAATCCATCCGGTGGCGACATCATCAAGCTG-3’
R2：5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
以PCR产物PCV-II CAP和Ferritin为模板，Overlap-PCR扩增出PCV-II CAP-Ferritin
F1：5’-CGGGATCCATGACATATCCTAGACGCCGTTAC-3’
R2：5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
PCR扩增PCV-III CAP蛋白序列：以质粒pUC57-PCV-III CAP-Ferritin为模板
F3：5’-CGGGATCCATGAGACACCGCGCGATCTTCCGT-3’
R3：5’-CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGACAGCACGCTCTTGTAACGAATCCA-3’
PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板
F4：5’-TGGATTCGTTACAAGAGCGTGCTGTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTG-3’
R4：5’-GCGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
以PCR产物PCV-III CAP和Ferritin为模板，Overlap-PCR扩增出PCV-III CAP-Ferritin
F3：5’-CGGGATCCAACATGAGACACCGCGCG-3’
R4：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
3.1.2家蚕表达系统中表达质粒的PCR扩增
PCR扩增PCV-II CAP蛋白序列：以质粒pUC57-PCV-II CAP为模板
F5：5’-CGGGATCCAACATGACATATCCTAGA-3’
R5：5’-CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGATGGATTCAAGGGCGGGTCTTTCAG-3’
PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板
F6：5’-CTGAAAGACCCGCCCTTGAATCCATCCGGTGGCGACATCATCAAGCTG-3’
R6：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
以PCR产物PCV-II CAP和Ferritin为模板，Overlap-PCR扩增出PCV-II CAP-Ferritin
F5：5’-CGGGATCCAACATGACATATCCTAGA-3’
R6：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
PCR扩增PCV-III CAP蛋白序列：以质粒pUC57-PCV-III CAP-Ferritin为模板
F7：5’-CGGGATCCAACATGAGACACCGCGCG-3’
R7：5’-CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGACAGCACGCTCTTGTAACGAATCCA-3’
PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板
F8：5’-TGGATTCGTTACAAGAGCGTGCTGTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTG-3’
R8：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
以PCR产物PCV-III CAP和Ferritin为模板，Overlap-PCR扩增出PCV-III CAP-Ferritin
F7：5’-CGGGATCCAACATGAGACACCGCGCG-3’
R8：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
PCR反应体系如下所示：
模板1μL，10×LA Buffer 5μL，dNTP 1μL，上下游引物各1μL，LA Taq酶1μL，dd H2O40μL，总体积为50μL。
PCR参数设置：
95℃，5min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，3min，共30个循环；72℃，10min。
3.2玻璃奶纯化回收DNA片段
配置1％(w/v)琼脂糖凝胶，对PCR扩增的产物进行电泳；将琼脂糖凝胶置于紫外灯下，快速切下含有单一的目的核酸条带的凝胶，放入1.5mL的离心管中，称重，加三倍体积的6M NaI，放于37℃恒温培养箱中融化；向已经完全融化的溶液中加8μL Glassmilk，混匀，冰浴5min，中间摇匀两次；8000rpm离心10s，弃掉上清；加800μL New Wash洗涤，轻轻弹起后离心，重复2次；弃去上清，将离心管放37℃恒温培养箱干燥2～3min；干燥后加20μL 0.1×TE溶解，混合充分溶解DNA，12000rpm离心5min，取上清立即用于连接，其余放-20℃保存。
3.3感受态细胞的小量制备
制备大肠杆菌Top10感受态细胞，－80℃保存。
3.4目的基因与pET-28a(+)载体和pVL1393载体的连接与转化
3.4.1酶切处理pET-28a(+)和pVL1393载体
用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ对转移载体pVL1393和pET-28a(+)进行双酶切，65℃灭活20min，保存于－20℃备用。
酶切体系如下所示：载体5μL，10×Buffer E 5μL，BamH I 1μL，EcoRⅠ1μL，ddH2O38μL，共50μL。
3.4.2连接
酶切回收的目的片段与经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切处理后的转移载体pVL1393和pET-28a(+)的连接。用T4DNA连接酶，16℃，连接过夜。连接体系如下：回收目的片段7μL，10×buffer1μL，载体1μL，T4DNA连接酶1μL。
3.4.3转化
取-80℃保存的感受态细胞，快速融化一半，加入上述连接产物3μL，冰上放置半小时；42℃恒温水浴锅中放置90s，迅速置于冰上3～5min；向管中加入适量的1mL LB培养基，37℃恒温培养箱中静置培养60min；离心，弃去大部分上清，留200μL涂布于LB平板(100μg/mL Amp)上，37℃恒温培养箱正置培养30min，后倒置培养过夜。
3.5核酸快速抽提法粗筛阳性克隆
挑取LB平板上的单菌落，接种于LB液体培养基(100μg/mL Amp)中，置于37℃恒温震荡培养器中，设置转速为220rpm，过夜培养；取500μL菌液于离心管内，收集菌体；加入30μL Loading Buffer和20μL酚/氯仿(1:1)，用涡旋震荡器充分混匀，使菌体重悬；12000rpm离心3min，取8μL上清进行琼脂糖凝胶电泳，同时以同样方法处理的空载体作为对照。凝胶成像系统的紫外灯下观察条带，选取质粒带明显退后的菌液提取质粒。
3.6 SDS碱裂解法提取质粒DNA
收集3mL菌液于离心管中，SDS碱裂解法提取质粒DNA，-20℃保存备用。
3.7阳性克隆的酶切与测序鉴定
酶切体系如下所示：重组质粒DNA 3μL，10×Buffer E 3μL，BamH I 0.5μL，EcoRⅠ0.5μL，ddH2O 14μL，共20μL。37℃反应2h后，取7μL用1％的琼脂糖进行电泳检测。酶切检测正确的质粒DNA测序，结果和目的基因一致，得到的重组质粒命名为pET28a-PCV-II CAP-Ferritin、pET28a-PCV-III CAP-Ferritin、pVL1393-PCV-II CAP-Ferritin、pVL1393-PCV-III CAP-Ferritin。
4重组质粒的表达与纯化
4.1重组质粒在大肠杆菌中诱导表达
将鉴定正确的重组表达质粒pET28a-PCV-II CAP-Ferritin、pET28a-PCV-IIICAP-Ferritin转化BL21感受态细胞，在37℃，IPTG终浓度为0.5mM的条件下，分别诱导1h、2h、3h、4h、5h后收集菌液，用SDS-PAGE电泳分析表达情况，pET28a-PCV-II CAP-Ferritin在约47kD处出现了特异条带，pET28a-PCV-III CAP-Ferritin在约45kD处出现了特异条带，这与预期的带His的重组蛋白大小相符，而未诱导的重组表达载体没有产生该特异条带，表明融合蛋白在大肠杆菌内成功表达，在添加IPTG后1～4h，表达量逐渐增加，而诱导5h和诱导4h的多积累的重组蛋白几乎一样多。用超声波将菌体细胞破碎，发现上清有少量目的蛋白，沉淀中有明显目的条带，说明重组蛋白His-PCV-II CAP-Ferritin、His-PCV-III CAP-Ferritin主要以不可溶的包涵体形式存在。聚丙烯凝胶电泳图如图1、图2所示。
4.2重组蛋白的大量表达与包涵体蛋白样品的处理
将保存于-80℃表达量高的菌种划线，37℃培养过夜，挑取单菌落接种于4mL LB液体培养基(50μg/mL Kan)中，37℃培养过夜；1％的菌液转接于200mL含的LB液体培养基(50μg/mL Kan)中，37℃震荡培养，使OD值达0.6左右，加入IPTG(终浓度为0.5mM)，37℃继续培养4h；4℃，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌ddH2O洗2次，离心收集菌体。用裂解缓冲液重悬菌体，用量为100μL裂解液/mL菌液，冰浴30min，冰上超声波破碎裂解菌体；4℃，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀即为重组蛋白包涵体；沉淀用适量包涵体洗涤液Ⅰ和包涵体洗涤液Ⅱ重悬并洗涤，弃上清；用适量脲NTA-0Buffer重悬沉淀，4℃，过夜溶解。
4.3镍柱亲和层析纯化重组蛋白
取上述溶解过夜的包涵体溶液，4℃，12000rpm离心15min，取上清，用0.45μm膜过滤；用Ni-NTA树脂层析柱纯化该表达蛋白，在脲NTA-25、脲NTA-50、脲NTA-100、脲NTA-250、脲NTA-500，5个梯度收集洗脱液，收集穿透液、洗脱液，每管收集一个NTA体积，SDS-PAGE分析确定蛋白质的结合情况、目标蛋白在洗脱液中的分布情况。蛋白电泳显示在50mM咪唑浓度洗脱下来的蛋白最多，在100mM浓度也有蛋白洗脱下来，而250mM浓度下洗脱下来的很少。纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，观察大小正确，条带单一的蛋白带，纯化后的蛋白含量分别为8mg/mL和5mg/mL。
4.4多克隆抗体的制备
将纯化后的His-Ferritin蛋白定量后收集1.5mg蛋白，经SDS-PAGE电泳后切下含有目的蛋白的凝胶，尽量切碎，37℃烘干后研磨成粉末，用生理盐水将抗原蛋白稀释到2倍最终浓度，充分混合佐剂，无菌条件下取出所需用量与抗原蛋白按体积比1：1迅速混匀，通过后腿小腿肌肉注射免疫小鼠，两免之后收集全部血清，测定血清的抗体效价。
5重组质粒在家蚕真核表达系统中表达与纯化
5.1家蚕核型多角体病毒亲本株FerrtiBmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备
按AppliChem公司产品说明配制1×TC-100培养基，用2M NaOH将pH调至6.22，过滤除菌后的培养基补加10％胎牛血清，27℃下培养家蚕细胞BmN。用家蚕核型多角体病毒亲本株感染对数生长期的细胞约50mL，3～4d后收集病毒感染液，10000rpm离心10min，除去沉淀，上清用25000rpm离心1小时，除上清，用1mL病毒DNA抽提液(1L中含Tris 12.1g，EDTA33.6g，KCl 14.1g，pH 7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5ml离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50μg/ml，50℃保温2小时，再加入35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续于50℃保温2小时，分别用等体积的饱和酚、苯酚:氯仿(1:1)、氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3M NaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，－20℃放置2小时以上沉淀病毒DNA，5000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100μL TE Buffer中，放4℃保存备用。
5.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(PPH-PCV-II CAP-Ferritin、PPH-PCV-III CAP-Ferritin)的构建和获得
接种大约1×106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株BmBcmid DNA(专利号为：ZL201110142492.4)，2μg重组转移质粒pVL1393-PCV-II CAP-Ferritin、或pVL1393-PCV-III CAP-Ferritin和5μL脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μL，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5mL无血清培养基和300μL FBS。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒rBmBacmid(PPH-PCV-II CAP-Ferritin、PPH-PCV-III CAP-Ferritin)的筛选。接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1mL共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4mL胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(PPH-PCV-II CAP-Ferritin、PPH-PCV-III CAP-Ferritin)。
5.3重组病毒rBmBacmid(PPH-PCV-II CAP-Ferritin、PPH-PCV-III CAP-Ferritin)在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(PPH-PCV-II CAP-Ferritin、PPH-PCV-III CAP-Ferritin)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(PPH-PCV-II CAP-Ferritin、PPH-PCV-III CAP-Ferritin)。
5.4重组病毒的鉴定
利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上清150μL，加入150μL(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μL(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μL的TE溶解DNA。
取上述病毒基因组DNA 1μL进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃1min、58℃1min、72℃3min，30个循环，最后72℃延伸10min。取15μL反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。
5.5 PCV-II CAP-Ferritin、PCV-III CAP-Ferritin在家蚕体内和蚕蛹中的表达
所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕及结茧七天后平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×105pfurBmBacmid(PPH-PCV-II CAP-Ferritin、PPH-PCV-III CAP-Ferritin)，4～5d后收集发病蚕蛹和取蚕血，-20℃冻存以进行ELISA法检测。
5.6 PCV-II CAP-Ferritin、PCV-III CAP-Ferritin类病毒颗粒的收集与纯化
将含表达有目的基因的蚕蛹用预冷的PBS(料液比为1：9)在匀浆器中研磨后，用0.45um滤器过滤。在30％蔗糖溶液中，1.5×105g超高速离心2h。用含0.1M NaCl的Tris-HCl(pH 7.0)的溶液把沉淀复溶到原体积，过阳离子交换层析填料SP(GE公司)，0.5M NaCl的Tris-HCl(pH 7.0)洗脱。再通过分子筛层析S200(GE公司)。纯度可达95％，得率可达40％以上。同时证明，在家蚕中表达的目的蛋白在高浓度下是可以自组装成类病毒颗粒。
6 Western blotting检测
将重组病毒感染的家蚕血淋巴用PBS(pH 7.4)稀释10倍超声波破碎后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，浓缩胶为5％，分离胶浓度为15％，再用半干转法，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用PBST配制3％BSA封闭，原核表达的His-Ferritin蛋白免疫小鼠后的血清为一抗(1:1000稀释,实验室自制)，HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗(1:5000稀释)，最后用DAB(二氨基联苯胺)显色，后用去离子水终止检测结果。Western blotting结果表明，在重组病毒感染后蚕血淋巴样品的上清液中可检测到47kDa(PCV-II CAP-Ferritin)、45kDa(PCV-III CAP-Ferritin)大小的特异性条带。
7 ELISA检测
将待检蚕血淋巴样品用包被液适度倍比稀释，另设亲本病毒感染的蚕血样品做阴性对照，只加包被液作为空白对照，每孔加100μL于酶标板中，4℃过夜。快速弃掉孔内液体，用PBST洗3次。每孔加300μL3％BSA封闭液，37℃作用3h，用PBST洗涤3次。将实验室自制His-Ferritin多克隆抗体稀释1：1000，每孔加100μL，37℃作用1.5h，用PBST洗4次。每孔加100μLHRP标记的羊抗鼠(1：5000)，37℃温育45～60min，用PBST洗涤4次。再加入新鲜配置的OPD(邻苯二胺)显色液100μL，室温，暗处显色10～30min。于各反应孔中加入2M硫酸50μL终止反应。在酶标仪上用492nm处波长测定OD值，以空白对照孔调零后测各孔OD值，以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性。
表1为PCV-II CAP-Ferritin、PCV-III CAP-Ferritin原始基因序列表达产物所测实验数据，结果表明PCV-II CAP-Ferritin、PCV-III CAP-Ferritin基因表达产物ELISA效价可达1：32、1：64。
表1 PCV-II CAP-Ferritin、PCV-III CAP-Ferritin原始序列表达产物ELISA效价
组别 效价
PCV-II CAP-Ferritin 1：32
PCV-III CAP-Ferritin 1：64
亲本病毒感染的蚕血样品(阴性对照) 1：4
实施例2 PCV-II CAP-Ferritin、PCV-III CAP-Ferritin原始序列进行同感序列设计以及优化后的纳米颗粒疫苗的制备与效力检测
1有关溶液和培养基的配置
具体溶液和培养基的配置方法见实施例1。
2猪圆环病毒衣壳蛋白保守序列的基因获取
将实施例1中猪圆环病毒衣壳蛋白原始氨基酸序列和从NCBI上获取的其他20条衣壳氨基酸序列进行比对，得到同感序列。将此同感序列进一步利用OptimumGeneTM技术对PCV-III、PCV-II衣壳蛋白氨基酸序列进行优化，将优化后的衣壳蛋白氨基酸序列和铁蛋白单体亚基氨基酸序列根据家蚕密码子偏好性对氨基酸序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定性、RNA不稳定性基因序列、重复序列等多种相关参数进行优化设计，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。将同感序列命名为PCV-II CAP-Ferritin-C(SEQ IDNO.1)、同感序列优化后的序列命名为PCV-II CAP-Ferritin-C-O(SEQ ID NO.3)；将同感序列命名为PCV-III CAP-Ferritin-C(SEQ ID NO.4)、同感序列优化后的序列命名为PCV-IIICAP-Ferritin-C-O(SEQ ID NO.6)体优化过程见实施例1。
3融合蛋白的质粒构建
具体实验方法见实施例1。
PCV-II CAP-Ferritin-C融合PCR引物：
PCV-II CAP衣壳蛋白PCR引物：
F9:5’-CGGGATCCAACATGACATATCCTAGA-3’
R9:5’-CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGATGGATTCAAGGGCGGGTCTTTCAG-3’
Ferritin PCR引物：
F10：5’-CTGAAAGACCCGCCCTTGAATCCATCCGGTGGCGACATCATCAAGCTG-3’
R10：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
Over-lapPCR引物：
F9：5’-CGGGATCCAACATGACATATCCTAGA-3’
R10：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
PCV-III CAP衣壳蛋白PCR引物：
F11:5’-CGGGATCCAACATGAGACACCGCGCG-3’
R11:5’-CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGACAGCACGCTCTTGTAACGAATCCA-3’
Ferritin PCR引物：
F12：5’-TGGATTCGTTACAAGAGCGTGCTGTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTG-3’
R12：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
Over-lapPCR引物：
F11：5’-CGGGATCCAACATGAGACACCGCGCG-3’
R12：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
PCV-II CAP-Ferritin-C-O融合PCR引物：
PCV-II CAP衣壳蛋白PCR引物：
F13:5’-CGGGATCCAACATGACATATCCTAGA-3’
R13:5’-CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGATGGATTCAAGGGCGGGTCTTTCAG-3’
Ferritin PCR引物：
F14：5’-CTGAAAGACCCGCCCTTGAATCCATCCGGTGGCGACATCATCAAGCTG-3’
R14：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
Over-lapPCR引物：
F13：5’-CGGGATCCAACATGACATATCCTAGA-3’
R14：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
PCV-III CAP-Ferritin-C-O融合PCR引物：
PCV-III CAP衣壳蛋白PCR引物：
F15:5’-CGGGATCCAACATGAGACACCGCGCG-3’
R15:5’-CAGCTTGATGATGTCGCCACCGGACAGCACGCTCTTGTAACGAATCCA-3’
Ferritin PCR引物：
F16：5’-TGGATTCGTTACAAGAGCGTGCTGTCCGGTGGCGACATCATCAAGCTG-3’
R16：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
Over-lapPCR引物：
F15：5’-CGGGATCCAACATGAGACACCGCGCG-3’
R16：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT-3’
4重组质粒pVL1393-PCV-II CAP-Ferritin-C、pVL1393-PCV-III CAP-Ferritin-C、
pVL1393-PCV-II CAP-Ferritin-C-O、pVL1393-PCV-III CAP-Ferritin-C-O在家蚕表达系统中表达与纯化
具体实验方法见实施例1。
5 ELISA检测
具体实验方法见实施例1。
6结果鉴定
ELISA结果判定：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性。从表2的结果可见，PCV-II CAP-Ferritin-C、PCV-III CAP-Ferritin-C基因表达产物ELISA效价可达1：32、1：64，PCV-II CAP-Ferritin-C-O、PCV-III CAP-Ferritin-C-O基因表达产物ELISA效价可达1：128、1：256。可见，密码子优化后的同感序列的表达量有了很大的提高，说明本实施例的改造和优化工作是成功的。
表2 PCV-II CAP-Ferritin-C、PCV-III CAP-Ferritin-C、PCV-II CAP-Ferritin-C-O、PCV-III CAP-Ferritin-C-O基因表达产物ELISA效价
组别 效价
PCV-II CAP-Ferritin 1：32
PCV-III CAP-Ferritin 1：64
PCV-II CAP-Ferritin-C 1：64
PCV-III CAP-Ferritin-C 1：128
PCV-II CAP-Ferritin-C-O 1：128
PCV-III CAP-Ferritin-C-O 1：256
亲本病毒感染的蚕血样品(阴性对照) 1：4
实施例3 PCV-II CAP-Ferritin-C-O、PCV-III CAP-Ferritin-C-O突变体进行氨基酸单位点突变、双位点突变和多位点突变后的纳米颗粒疫苗制备与效力检测
1实验方法
1.1 PCV-II CAP-Ferritin-C-O、PCV-III CAP-Ferritin-C-O氨基酸序列单位点、双位点、多位点突变体基因的构建
基于实施例2的结果，本发明获得了PCV-II CAP-Ferritin-C、PCV-III CAP-Ferritin-C突变体，以PCV-II CAP-Ferritin-C、PCV-III CAP-Ferritin-C突变体密码子优化后的基因序列为模板，设计多对引物对保守序列进行定点突变，定点突变是利用融合PCR的方法进行，融合PCR的方法见实施例1。
突变位点分别为PCV-II：R12D、Q21H、R35S、L49T、V62Q、F74K、P88T、F105D、V118S、A133E、I150H、Y160R、P176S、A190D、N204T、M217H、P233K；所得突变体命名为PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M(R12D、Q21H、R35S、L49T、V62Q、F74K、P88T、F105D、V118S、A133E、I150H、Y160R、P176S、A190D、N204T、M217H、P233K)、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M(R15P、K27S、Y43T、W60H、A75E、L90D、M103R、N118Q、V134K、P147R、G160D、Y176K、V191Q、W207H)。所得突变体命名为PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M(R15P、K27S、Y43T、W60H、A75E、L90D、M103R、N118Q、V134K、P147R、G160D、Y176K、V191Q、W207H)。
在此基础上，本发明将单突变位点PCV-II CAP：Q21H、F74K、F105D、A133E、P176S、N204T；PCV-III CAP：K27S、W60H、A75E、M103R、Y176K、W207H两两组合，进行双位点突变，双位点突变是在单位点突变序列的基础之上，以其(PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M、PCV-IIICAP-Ferritin-C-O-M)作为模板，利用相应的引物，通过融合PCR的方法进行第二位的定点突变，从而获得双位点突变的目的片段，融合PCR的方法见实施例1。
双突变位点为PCV-II CAP：Q21H-F74K、Q21H-F105D、Q21H-1133E、Q21H-P176S、Q21H-N204T、F74K-F105D、F74K-A133E、F74K-P176S、F74K-N204T、F105D-A133E、F105D-P176S、F105D-N204T、A133E-P176S、A133E-N204T、P176S-N204T共15种组合，所获得的突变体命名为PCV-II CAP-Ferritin-C-O-D(Q21H-F74K、Q21H-F105D、Q21H-1133E、Q21H-P176S、Q21H-N204T、F74K-F105D、F74K-A133E、F74K-P176S、F74K-N204T、F105D-A133E、F105D-P176S、F105D-N204T、A133E-P176S、A133E-N204T、P176S-N204T)、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-D(K27S-W60H、K27S-A75E、K27S-M103R、K27S-Y176K、K27S-W207H、W60H-A75E、W60H-M103R、W60H-Y176K、W60H-W207H、A75E-M103R、A75E-Y176K、A75E-W207H、M103R-Y176K、M103R-W207H、Y176K-W207H)突变体。
本发明通过分析糖基化位点，得出6个单突变位点能有效提高目的基因的表达量，因此多位点突变是在双位点突变序列的基础之上以其(PCV-II CAP-Ferritin-C-O-D、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-D)为模板，利用相应的引物通过融合PCR的方法进行多突变位点的定点突变，从而获得多位点突变的目的片段，融合PCR的方法见实施例1。
将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照Q21H-F74K-F105D-A133E-P176S-N204T氨基酸多位点突变方式获得多位点突变体；将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列按照K27S-W60H-A75E-M103R-Y176K-W207H氨基酸多位点突变方式获得的多位点突变体。
获得了以下2种组合：PCV-II CAP(Q21H-F74K-F105D-A133E-P176S-N204T)；PCV-III CAP(K27S-W60H-A75E-M103R-Y176K-W207H)。命名为PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6(Q21H-F74K-F105D-A133E-P176S-N204T)、PCV-IIICAP-Ferritin-C-O-M6(K27S-W60H-A75E-M103R-Y176K-W207H)。
将PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6分别在家蚕真核表达系统及AcMNPV-昆虫细胞表达系统中表达。
PCV-II CAP-Ferritin-C-O、PCV-III CAP-Ferritin-C-O进行氨基酸单位点所需引物：
PCV-II CAP-Ferritin-C-O:
(1)两侧上下游引物：
F：CGGGATCCAACATGACATATCCTAGA
R:CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT
(2)中间上下游引物：
1.
F：CGTTACAGGAGACGCGATCACAGACCACGCTCA
R：TGAGCGTGGTCTGTGATCGCGTCTCCTGTAACG
2.
F：CTCACATTTAGGCCACATCCTTAGGAGAAGGC
R：GCCTTCTCCTAAGGATGTGGCCTAAATGTGAG
3.
F：GTGCACCCACGTCATAGTTATAGATGGCGTAGG
R：CCTACGCCATCTATAACTATGACGTGGGTGCAC
4.
F：AATATTCAATACTAGGACCAGCAGAACGTTTGG
R：CCAAACGTTCTGCTGGTCCTAGTATTGAATATT
5.
F：CAAAAGGACAACTCAAAAGACCCCTTCCTGG
R：CCAGGAAGGGGTCTTTTGAGTTGTCCTTTTG
6.
F：GTTGACATGATGCGCAAAAACATTAATGACTTC
R：GAAGTCATTAATGTTTTTGCGCATCATGTCAAC
7.
F：CAGGTGGAGGCTCAAACACAAGATCAGTTCCAT
R：ATGGAACTGATCTTGTGTTTGAGCCTCCACCTG
8.
F：AAGTGAAGGTTGAGGACTGGCCGTGCTCCCCCATAA
R：TTATGGGGGAGCACGGCCAGTCCTCAACCTTCACTT
9.
F：CAGGGTGACAGAGGTTCAGGATCATCTGCCGTA
R：TACGGCAGATGATCCTGAACCTCTGTCACCCTG
10.
F：AACTTCGTCACAAAGGAAACTGCCTTAACCTAC
R：GTAGGTTAAGGCAGTTTCCTTTGTGACGAAGTT
11.
F：GCTCCCGCCACACCCACACGCAACCCTTCTCGT
R：ACGAGAAGGGTTGCGTGTGGGTGTGGCGGGAGC
12.
F：CTCGTATCATAGTCGTCGCTTTACTCCTAAACC
R：GGTTTAGGAGTAAAGCGACGACTATGATACGAG
13.
F：GATTACTTCCAGTCAAACAATAAGCGCAAC
R：GTTGCGCTTATTGTTTGACTGGAAGTAATC
14.
F：TGCGTCTCCAGACGAACGGAAATGTCGACC
R：GGTCGACATTTCCGTTCGTCTGGAGACGCA
15.
F：GGTACAGCGTTTGAAACCAGTATCTACGATCAA
R：TTGATCGTAGATACTGGTTTCAAACGCTGTACC
16.
F：AACATTAGGGTGACTCATTACGTTCAGTTCAGA
R：TCTGAACTGAACGTAATGAGTCACCCTAATGTT
17.
F：GACCCGCCCTTGAATAAGTCCGGTGGCGACATC
R：GATGTCGCCACCGGACTTATTCAAGGGCGGGTC
PCV-III CAP-Ferritin-C-O:
(1)两侧上下游引物：
F：CGGGATCCAACATGAGACACCGCGCG
R：CGGAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGGCGAT
(2)中间上下游引物：
1.
F：GCCCGCGTCCGCGCCCCCGTCGTCGCCACAAAC
R：GTTTGTGGCGACGACGGGGGCGCGGACGCGGGC
2.
F：CTATGTGAAGCGTTCACTGTTCATTCGCCG
R：CGGCGAATGAACAGTGAACGCTTCACATAG
3.
F：ACTATACCAAGAAAACAAGCACCATGAACGTTA
R：TAACGTTCATGGTGCTTGTTTTCTTGGTATAGT
4.
F：CAGGACAACAAACCGCACCATGCGAACCACTTC
R：GAAGTGGTTCGCATGGTGCGGTTTGTTGTCCTG
5.
F：CGAGTGGGAAACCGAAATCAGCTTCGAGTA
R：TACTCGAAGCTGATTTCGGTTTCCCACTCG
6.
F：AAAATGAAAGTGACCGACAGCCCGGTTATTAGC
R：GCTAATAACCGGGCTGTCGGTCACTTTCATTTT
7.
F：AGCAGACCAAAACCCGATTCGGTCACACCGCG
R：CGCGGTGTGACCGAATCGGGTTTTGGTCTGCT
8.
F：GGTGCGTGGACCACCCAGACCTGGCTGCAAGAC
R：GTCTTGCAGCCAGGTCTGGGTGGTCCACGCACC
9.
F：AGCAGCACCCGTAAAAAAATGACCAGCAAGAAA
R：TTTCTTGCTGGTCATTTTTTTACGGGTGCTGCT
10.
F：AGCCGTTACTTCACCCGAAAACCGATTCTGGCG
R：CGCCAGAATCGGTTTTCGGGTGAAGTAACGGCT
11.
F：CCAGCGCGCATCCGGATCAAAGCCTGTTCTTTT
R：AAAAGAACAGGCTTTGATCCGGATGCGCGCTGG
12.
F：GTGGCTGAACACCAAGGACCCGACCGTTCAGT
R：ACTGAACGGTCGGGTCCTTGGTGTTCAGCCAC
13.
F：CTGTGGAGCATCTACCAGCCGGAAAAGACCGGT
R：ACCGGTCTTTTCCGGCTGGTAGATGCTCCACAG
14.
F：GGCACCAAAGAAGTGCATATTCGTTACAAGAGC
R：GCTCTTGTAACGAATATGCACTTCTTTGGTGCC
2 PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M、PCV-II CAP-Ferritin-C-O-D、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-D、PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、PCV-IIICAP-Ferritin-C-O-M6突变体的质粒构建
具体实验方法见实施例1。
3重组质粒的转化与鉴定
具体实验方法见实施例1。
4重组质粒在家蚕表达系统及AcMNPV-昆虫细胞表达系统中表达与纯化
具体方法同实施例1。
另外，AcBacmid DNA的构ZS建和制备：按下述方法(张志芳，李轶女，易咏竹，等.表达多外源基因的昆虫生物反应器及其构建方法和应用[P].中国：CN102286534A,2011.)进行制备
重组病毒rAcBacmid的鉴定和在昆虫细胞中的表达：利用PCR方法分析外源基因整合。提取病毒基因组DNA。取上述病毒基因组DNA 1μL进行PCR扩增，取15μL反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒rAcBacmid-PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6。将上述重组病毒rAcBacmid-PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、PCV-IIICAP-Ferritin-C-O-M6培养液按106-7pfu感染100mL的昆虫细胞，96小时后收集感染的细胞，-20℃冻存以进行ELISA检测。
5结果鉴定
ELISA结果判定标准：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性。
从表3数据可以看出在同感序列(SEQ ID NO.1)的基础上进行氨基酸单位点突变，所得突变体有六个单突变体(Q21H、F74K、F105D、A133E、P176S、N204T)的表达产物的表达量相比同感序列的表达量有了明显提高；在同感序列(SEQ ID NO.4)的基础上进行氨基酸单位点突变，所得突变体有六个单突变体(K27S、W60H、A75E、M103R、Y176K、W207H)的表达产物的表达量相比同感序列的表达量有了明显提高。
表3 PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M、PCV-III CAP-Ferritin-C-M突变体表达产物的ELISA效价
Figure BDA0002155723950000171
Figure BDA0002155723950000181
ELISA结果判定标准：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性。
从表4中数据看出同感序列氨基酸双位点突变中，在同感序列(SEQ ID NO.1)的基础上进行氨基酸双位点突变所得突变体有三个双突变体(Q21H-A133E、F74K-A133E或F105D-A133E)的表达量相比同感序列的表达量有了明显提高；在同感序列(SEQ ID NO.4)的基础上进行氨基酸双位点突变，所得突变体有三个双突变体(K27S-Y176K、W60H-Y176K或Y176K-W207H)的表达量相比同感序列的表达量有了明显提高。
表4 PCV-II CAP-Ferritin-C-O-D、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-D突变体表达产物的ELISA效价
Figure BDA0002155723950000182
Figure BDA0002155723950000191
ELISA结果判定标准：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性。
从表5的数据可见，PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6基因表达产物ELISA效价可达1：2048、1：3200；相比单突变或双突变的产物，这两个多突变表达产物ELISA效价有明显提升。
表5 PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6突变体表达产物的ELISA检测
组别 效价
PCV-II CAP-Ferritin-C-O-D 1：1024
PCV-III CAP-Ferritin-C-O-D 1：2048
PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub> 1：2048
PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub> 1：3200
AcPCV-II CAP-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub> 1：1024
AcPCV-III CAP-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub> 1：1600
亲本病毒感染的蚕血样品(阴性对照) 1：4
6 Western blotting检测
具体实验方法见实施例1。Western blotting结果表明，在重组病毒感染后蚕血淋巴样品的上清液中可检测到47kDa(PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6)、45kDa(PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6)大小的特异性条带(见图3和图4)。
7电镜观察
用1ml注射器吸一定量的1％醋酸铀待用，用另一注射器吸一定数量的蒸馏水。将PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6纳米颗粒蚕血淋巴分别经过初步纯化后，用悬浮液稀释，将悬浮样品滴在封口膜上，使之形成一个小液珠，用镊子尖端夹住载网，并使带膜的一面朝下，沾取样品，而后用滤纸吸干，再洗去多余的悬浮物，清洗5次。吸干后，将载网摆在1％醋酸铀染液的液滴上，染色3分钟，用滤纸从铜网边缘吸干多余的染液，重复2-3次，待干燥后镜检。结果如图5、图6所示，可见大小与预期符合的纳米颗粒，笼状体的直径为12纳米左右，仔细观察可见有天线状突出。
实施例4 pVLCAG-PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、pVLCAG-PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6杆状病毒哺乳动物表达用重组病毒的构建和动物实验
1构建pVLCAG载体
具体实验方法参照(张志芳，姚斌，李轶女等。在动物细胞或动物组织中表达外源基因的方法[P].中国：ZL 201210408558.4.)进行，构建向脊椎动物细胞或个体中呈递外源基因的重组杆状病毒转移载体。
2构建呈递报告基因的重组病毒
2.1将PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6基因克隆到基因呈递转移载体上
将实施例3中带有酶切位点的PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6基因片段酶切回收连接到同样酶切处理的pVLCAG载体，鉴定正确后获得pVLCAG-PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、pVLCAG-PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6。
2.2构建基因呈递用的重组病毒并大量制备
分别用pVLCAG-PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6和pVLCAG-PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6转移载体用reBmBac共转染BmN细胞获得重组病毒Bm-CAG PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6和Bm-CAG PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6，在共转染过程中依然需要pVL1393-Luc作为对照来确定共转染的成功与否，病毒纯化过程同上。
用重组病毒感染5龄起家蚕幼虫，4-5d收获蚕血淋巴其中含有大量扩增的重组病毒。
将蚕血淋巴用PBS稀释后超声破碎(10s×10次)，然后用12000rpm离心10分钟去除细胞碎片，再用15×104g离心3h，去除上清，沉淀用适量PBS重悬获得初步纯化的重组杆状病毒的病毒粒子，这里一般10mL蚕血的重组病毒离心后用2mLPBS重悬，重悬后重组病毒量约为2.5×1012PFU/ML(约为5×1012viral genomes(vg)/mL，病毒拷贝数利用BmNPV病毒DNA骨架序列引物，GJ-1F(CGAACGGAGACGATGGATGTGG)和GJ-1R(GTGCCGAGCGATTGTAAGGGATC)通过荧光定量PCR计算。
3重组病毒在哺乳动物细胞中表达
采用VERO细胞作为基因呈递的目标，将重组病毒Bm-CAG PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6和Bm-CAG PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6各取100MOI的病毒来进行研究。方法步骤如下：
1)在六孔板中接种上VERO细胞(1×106cell/well)，37℃贴壁培养8-12h
2)取1×108PFU纯化后的重组病毒Bm-CAG PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6和Bm-CAGPCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6加到六孔板的细胞中，37℃孵育1h
3)孵育后去掉含有病毒的培养基，换上正常的DMEM含血清培养基，42小时左右处理细胞，收集表达产物，ELISA检测效价为1：800
4动物试验
4.1将杆状病毒表达的PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6和PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6表达产物免疫动物
将分析得出的最优序列PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6在家蚕真核表达系统中表达，将所得蚕蛹按照25μg/只的抗原量制备疫苗来注射动物。根据ELISA效价分别制备30份/g和40份/g蚕蛹的疫苗。(根据大肠杆菌相应表达产物25微克的ELISA效价而计算的)
制备方法为：分别称取10g表达PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6纳米颗粒抗原的蚕蛹，加入90ml PBS缓冲液，搅拌器搅拌5～10min使其充分混匀，制备成母液放入灭菌瓶中。206佐剂事先灭菌后放到30℃保温箱中保温。适量的母液先放在冰上并进行调整，与佐剂混合时，先在15ml离心管中加佐剂3ml，慢慢滴加母液3ml，用匀浆器匀浆3min。加入盐酸环丙沙星。疫苗呈乳白色，检测疫苗质量时可取出少量，3000rpm离心15min，疫苗不分层即为合格。用同样的方法处理健康蚕蛹，制成疫苗做对照。
将分析得出的最优序列PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6在AcBacmid-昆虫细胞真核表达系统中表达所得细胞沉淀，按照25μg/只的量来注射动物。
制备方法：昆虫细胞表达的抗原按测定的制备疫苗所需的单位的细胞沉淀量经超声破碎后，混合相应的佐剂而成。
取SPF小鼠50只适应性饲养一周后，随机分为5组，每组10只，两组小鼠分别通过腹腔或肌内注射PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6在家蚕真核表达系统中表达产物制备的疫苗1份(0.2mL)在AcBacmid-昆虫细胞真核表达系统表达产物制备的疫苗一份(0.2mL)。10只接种健康蚕蛹制备的疫苗作为阴性蚕蛹免疫组，10只不做免疫处理作为正常对照组，10只接种传统疫苗株作为阴性对照。接种15天后，采用眼眶取血，采1mL左右，放试管中倾斜放置，37℃放置2h后，转至室温过夜。将血清转移至离心管中，2000rpmin，10min，收集血清，分别用pET-28a-PCV-II CAP-Ferritin、pET-28a-PCV-IIICAP-Ferritin原核表达的蛋白做为目的蛋白，检测血清中抗体效价。阴性蚕蛹免疫组的抗体效价应不高于1：4，传统疫苗株的抗体效价均为1：64-128，而PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6在家蚕真核表达系统中表达样品组的抗体效价为1：256和1：512以上，PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6在AcMNPV-昆虫细胞表达系统中表达样品组的抗体效价为1：128和1：100以上。
4.2利用重组病毒向小鼠体内呈递外源基因PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6、PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6基因
4.2.1向小鼠体内呈递PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6基因
纯化的重组病毒Bm-CAG PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6通过尾静脉注射(1×1012vg/只)和灌注(1×1013vg/只)的方式送入小鼠体内，小鼠体重约为25g。分别在第5d、11d、17d、21d收集小鼠血清，用原核蛋白pET-28a-CAP-Ferritin、PCV-III CAP-Ferritin作为检测目的蛋白，检测血清中抗体效价。
4.2.2向小鼠体内呈递PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6基因
纯化的重组病毒Bm-CAG PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6通过尾静脉注射(1×1012vg/只)和灌注(1×1013vg/只)的方式送入小鼠体内，小鼠体重约为25g。分别在第5d、11d、17d、21d收集小鼠血清，用原核蛋白pET-28a-CAP-Ferritin、PCV-III CAP-Ferritin作为检测目的蛋白，检测血清中抗体效价。
5抗体效价检测
具体实验步骤见上，21天时的抗体效价为最高，具体结果见(表6)。
表6 PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6和PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6小鼠血清抗体效价检测(21天)
组成 效价
健康蚕蛹对照(小鼠) 1：4
传统疫苗(小鼠) 1：256
PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>小鼠血清(注射) 1：256
PCV-II CAP-Ferritin-C-O-M6小鼠血清(灌注) 1：512
PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M<sub>6</sub>小鼠血清(注射) 1：256
PCV-III CAP-Ferritin-C-O-M6小鼠血清(灌注) 1：512
从表6中的数据可以看出，融合蛋白氨基酸多位点突变后的突变体呈递给小鼠中所产生的抗体效价比健康蚕蛹对照和传统疫苗要优。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒以及由其制备的猪圆环疫苗和应用
<130> BJ-2002-190725A
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 399
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 1
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
195 200 205
Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Ser Gly Gly Asp Ile Ile Lys
225 230 235 240
Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr
245 250 255
Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly
260 265 270
Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys
275 280 285
Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser
290 295 300
Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln
305 310 315 320
Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile
325 330 335
Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu
340 345 350
Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp
355 360 365
Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr
370 375 380
Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
385 390 395
<210> 2
<211> 1203
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 2
aacatgacat atcctagacg ccgttacagg agacgccgtc acagaccacg ctcacattta 60
ggccaaatcc ttaggagaag gccatggcta gtgcacccac gtcatcgata tagatggcgt 120
aggaaaaacg gaatattcaa cactaggctg agcagaacgt ttggctacac aatcaaaagg 180
acaactgtga agaccccttc ctgggctgtt gacatgatgc gcttcaatat taatgacttc 240
ctgcctccag gtggaggctc aaaccctaga tcagttccat ttgaatacta tcgcattcgt 300
aaagtgaagg ttgagttttg gccgtgctcc cccataacgc agggtgacag aggtgtcgga 360
tcatctgccg taatcctcga cgataacttc gtcacaaagg ctactgcctt aacctacgat 420
ccgtatgtaa attacagctc ccgccacacc attacgcaac ccttctcgta tcatagtcgt 480
tactttactc ctaaaccagt gttggactcg accatagatt acttccagcc taacaataag 540
cgcaaccaac tgtggttgcg tctccagacg gcaggaaatg tcgaccacgt aggcctcggt 600
acagcgtttg aaaacagtat ctacgatcaa gagtacaaca ttagggtgac tatgtacgtt 660
cagttcagag aatttaacct gaaagacccg cccttgaatc catccggtgg cgacatcatc 720
aagctgctga acgaacaggt gaacaaggag atgcagtcca gcaacctgta catgtctatg 780
tcttcatggt gctacaccca ctcactggac ggagctggtc tgttcctgtt cgaccacgct 840
gccgaggaat acgaacacgc caagaagctg atcatcttcc tgaacgagaa caacgtgcct 900
gtccagctga cctccatcag cgctcccgaa cacaagttcg agggtctgac tcaaatcttc 960
cagaaggcct acgaacacga gcagcacatc tctgaatcaa tcaacaacat cgtggaccac 1020
gctatcaaga gcaaggacca cgccactttc aacttcctgc aatggtacgt ggctgagcag 1080
cacgaggaag aggtcctgtt caaggacatc ctggacaaga tcgaactgat cggcaacgag 1140
aaccacggac tgtacctggc tgaccagtac gtcaagggca tcgccaagtc ccgcaagagc 1200
taa 1203
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<211> 1203
<212> DNA
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cagttcagag aatttaacct gaaagacccg cccttgaatc catccggtgg cgacatcatc 720
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tcttcatggt gctacaccca ctcactggac ggagctggtc tgttcctgtt cgaccacgct 840
gccgaggaat acgaacacgc caagaagctg atcatcttcc tgaacgagaa caacgtgcct 900
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<213> Artifical sequence
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Arg Arg His Lys Arg Arg Tyr Val Lys Arg Lys Leu Phe Ile Arg Arg
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Pro Thr Ala Gly Thr His Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val
35 40 45
Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asp Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His
50 55 60
Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Ser Phe Glu Tyr
65 70 75 80
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Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Arg His Ser Arg Tyr
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Phe Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly
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Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr
165 170 175
Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro
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Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile
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Arg Tyr Lys Ser Val Leu Ser Gly Gly Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn
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Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met
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Ser Ser Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu
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260 265 270
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275 280 285
Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr
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agctaa 1146

Claims (10)

1.一种包含融合蛋白的纳米抗原颗粒，其特征在于，所述融合蛋白由猪圆环病毒衣壳蛋白和单体铁蛋白亚基的N端连接得到；优选的，将猪圆环病毒衣壳蛋白和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白。
2.按照权利要求1所述的包含融合蛋白的纳米抗原颗粒，其特征在于，所述单体铁蛋白亚基包括细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白或哺乳动物铁蛋白中的任何一种；优选的，所述单体铁蛋白亚基是幽门螺杆菌铁蛋白单体，其氨基酸序列为序列号WP_000949190所示的序列；所述的PCV-II病毒衣壳蛋白的氨基酸序列为序列号AMJ50231.1所示的序列；所述PCV-III病毒衣壳蛋白的氨基酸序列为序列号为APA21932.1所示的序列；
所述猪圆环病毒衣壳蛋白是PCV-II病毒衣壳蛋白或PCV-III病毒衣壳蛋白；优选的，所述PCV-II病毒衣壳蛋白选取PCV-II病毒完整衣壳蛋白部分，所述PCV-III病毒衣壳蛋白选取PCV-III病毒完整衣壳蛋白部分。
3.按照权利要求1所述的包含融合蛋白的纳米抗原颗粒，其特征在于，所述融合蛋白包括序列号WP_000949190所示的铁蛋白单体和序列号为AMJ50231.1的PCV-II病毒衣壳蛋白序列；或者，所述融合蛋白包括序列号WP_000949190的铁蛋白单体序列和序列号APA21932.1所示的PCV-III病毒衣壳蛋白序列。
4.按照权利要求3所述的包含原始融合蛋白的纳米抗原颗粒，其特征在于，含有PCV-II的融合蛋白的同感序列的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQID NO.2所示，该编码基因优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；含有PCV-III的融合蛋白的同感序列的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，该编码基因优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示。
5.按照权利要求4所述的包含融合蛋白的纳米抗原颗粒，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照R12D、Q21H、R35S、L49T、V62Q、F74K、P88T、F105D、V118S、A133E、I150H、Y160R、P176S、A190D、N204T、M217H或P233K中的任何一种氨基酸单位点突变方式获得的单位点突变体；
优选的，将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照Q21H、F74K、F105D、A133E、P176S或N204T中的任何一种氨基酸单位点突变方式获得的单位点突变体；
最优选的，将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照A133E氨基酸单位点方式获得的单位点突变体；
或者，将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列按照R15P、K27S、Y43T、W60H、A75E、L90D、M103R、N118Q、V134K、P147R、G160D、Y176K、V191Q或W207H中的任何一种氨基酸单位点突变方式获得的单位点突变体；
优选的，将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列按照K27S、W60H、A75E、M103R、Y176K或W207H中的任何一种氨基酸单位点突变方式获得的单位点突变体；
最优选的，将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列按照Y176K氨基酸单位点突变获得的单位点突变体。
6.按照权利要求4所述的包含融合蛋白的纳米抗原颗粒，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照Q21H-F74K、Q21H-F105D、Q21H-1133E、Q21H-P176S、Q21H-N204T、F74K-F105D、F74K-A133E、F74K-P176S、F74K-N204T、F105D-A133E、F105D-P176S、F105D-N204T、A133E-P176S、A133E-N204T或P176S-N204T中的任何一种氨基酸双位点突变方式获得的双位点突变体；
优选的，将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸按照Q21H-1133E、F74K-A133E或F105D-A133E中的任何一种氨基酸双位点突变方式获得的双位点突变体；
最优选的，将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸按照F74K-A133E氨基酸双位点突变获得的双位点突变体；
或者，将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列按照K27S-W60H、K27S-A75E、K27S-M103R、K27S-Y176K、K27S-W207H、W60H-A75E、W60H-M103R、W60H-Y176K、W60H-W207H、A75E-M103R、A75E-Y176K、A75E-W207H、M103R-Y176K、M103R-W207H或Y176K-W207H中的任何一种氨基酸双位点突变方式获得的双位点突变体；
优选的，将氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸按照K27S-Y176K、W60H-Y176K或Y176K-W207H中的任何一种氨基酸双位点突变方式获得的双位点突变体；
最优选的，将氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸按照W60H-Y176K氨基酸双位点突变获得的双位点突变体。
7.按照权利要求4所述的包含融合蛋白的纳米抗原颗粒，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照Q21H-F74K-F105D-A133E-P176S-N204T氨基酸多位点突变方式获得的多位点突变体；
或者，将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列按照K27S-W60H-A75E-M103R-Y176K-W207H氨基酸多位点突变方式获得的多位点突变体。
8.权利要求1-7任何一项所述的纳米抗原颗粒在制备猪圆环疫苗中的用途。
9.按照权利要求8所述的用途，其特征在于，包括：将权利要求1-7任何一项所述的融合蛋白编码基因在大肠杆菌原核表达系统中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；
或者，将权利要求1-7任何一项所述的融合蛋白编码基因在家蚕表达系统或AcMNPV-昆虫细胞真核表达系统中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；优选的，将所述的融合蛋白编码基因克隆到杆状病毒转移载体中构建得到重组转移载体；将重组转移载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染昆虫宿主或细胞，培养被感染的昆虫细胞或昆虫宿主表达相应的抗原，纯化，即得；
或者，将权利要求1-7任何一项所述的融合蛋白编码基因克隆到杆状病毒哺乳动物的表达载体中得到重组杆状病毒；将重组杆状病毒在脊椎动物体内组织进行基因呈递产生抗原。
10.一种猪圆环疫苗，其特征在于，包含有效量的权利要求1-7任何一项所述的纳米抗原颗粒和药学上可接受的佐剂或载体。
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