KR20040074067A - 폭스바이러스를 포함하는 제형 및 폭스바이러스를포함하는 안정한 조성물을 제조하기 위한 방법 - Google Patents

폭스바이러스를 포함하는 제형 및 폭스바이러스를포함하는 안정한 조성물을 제조하기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제형에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (1) 오르쏘폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 파라폭스바이러스, 카프리폭스바이러스 및 수이폭스바이러스 속에 속하는 한가지 폭스바이러스, (2) 이당류, (3) 약학적으로 허용되는 폴리머 및 선택적으로는 (4) 완충액을 포함하는 수용성 제형에 관한 것이다.

Description

폭스바이러스를 포함하는 제형 및 폭스바이러스를 포함하는 안정한 조성물을 제조하기 위한 방법{Poxvirus Containing Formulations and Process for Preparing Stable, Poxvirus Containing Compositions}
폭스바이러스는 척추동물 및 무척추동물 세포의 세포질에서 복제되는 복잡한 DNA 바이러스의 큰 과(family)를 포함한다. 인간에 있어서, 천연두는 지금까지 가장 중요한 폭스바이러스 감염이었다. 천연두의 원인 물질은 오르쏘폭스바이러스 속의 일원(member)인 바리올라(variola) 바이러스이다. 또한, 폭스비리대(Poxviridae) 과에 속하는 오르쏘폭스바이러스 속의 일원인 백시니아 바이러스는 천연두에 대한 면역을 위하여 생균 백신으로 사용되었다. 백시니아 바이러스를 이용한 성공적인 전세계적 백신화는 드디어 바리올라 바이러스의 박멸에 이르렀다(천연두의 지구적인 박멸. 천연두 박멸의 보증을 위한 지구 위원회의 최종 보고서; 공중 보건의 역사, 제4권, 제네바: 세계 보건 기구, 1980). 그 동안, 대부분의 감염성 바리올라 바이러스 스톡(stock)은 파괴되어 왔다. 그러나, 천연두 또는 천연두-유사 질환을 유발시키는 폭스바이러스가 주된 보건 문제로 다시 대두될 수 있다는 점은 배제될 수 없다. 따라서, 백시니아 바이러스에 기초한 백신에서와 같이 폭스바이러스 감염, 특히 바리올라 감염에 대한 안정한 백신을 생산하는 위치에 놓여 있는 것이 필요하다.
또한, 과거에는 재조합 유전자 발현 또는 재조합 생균 백신과 같이 잠재적인 용도로 사용되기 위한 바이러스 벡터를 제조하기 위하여 백시니아 바이러스가 사용되어 왔다(Mackett, M., Smith, G.L. 및 Moss, B.[1982] P.N.A.S.USA, 79, 7415-7419; Smith. G.L., Mackett, M. 및 Moss, B., 1984, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 2, 383-407). 이를 위해서는 그 중에서도(inter alia) DNA 재조합 기술의 도움으로 백시니아 바이러스의 게놈 속으로 도입된 외래 항원을 코딩하는 DNA 서열(유전자)을 필요로 한다. 상기 유전자가 바이러스 생활 주기에 비-필수적인 바이러스 DNA 부위에 삽입된다면, 새롭게 생산된 재조합 백시니아 바이러스가 감염성을 가지게 되는 것이 가능하며, 즉 상기 바이러스가 외래 세포를 감염시켜 삽입된 DNA 서열을 발현시킬 수 있다(EP 83286 및 EP 110385). 상기와 같은 방식으로 제조된 재조합 백시니아 바이러스는 감염성 질환의 예방을 위한 생균 백신으로 사용될 수 있으며, 다른 한편으로는 진핵세포에서 이형 단백질을 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 재조합 백시니아 바이러스의 다른 예로는 자살 유전자(suicide gene), 라이보자임(ribozyme) 유전자 또는 안티센스(antisense) 유전자와 같은 치료 유전자를 운반하는 바이러스가 있다.
변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)는 예외적으로 안전한 것으로 알려져 있다. MVA는 병아리 배아 섬유아세포에서 백시니아 바이러스의 앙카라 균주(CVA)를 오랜 기간 순차적으로 계대배양시킴으로써 제조되어 왔다(Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. 및 Stickl, H., 1975, Infection, 3, 6-14; 스위스 특허 제568,392호). 부다페스트 조약의 요구조건을 충족시키는 기탁된 MVA 바이러스 균주의 예로는 살리스베리(영국)에 위치하는 ECACC (European Collection of Animal Cell Culture)에 기탁번호 ECACC V94012707로 기탁된 MVA572 균주 및 ECACC V00120707로 기탁된 MVA 575 및 기탁번호 ECACC V00083008로 기탁된 MVA-BN이 있다.
MVA는 높은 면역원성(immunogenicity)을 유지하는 동안 높은 약독화, 다시 말하면 감소된 독성(virulence) 또는 감염성(infectiosity)을 가지는 것에 의해 구별된다. 야생형 CVA 균주에 대하여 게놈상에서 상대적으로 변형된 곳을 결정하기 위하여 상기 MVA 바이러스가 분석되어 왔다. 총 31,000 염기쌍으로 이루어진 게놈 DNA의 여섯 개의 주된 결실부위(결실부위 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ 및 Ⅵ)가 확인되었다(Meyer, H., Sutter, G. 및 Mayr A., 1991, J. Gen. Virol., 72, 1031-1038). 상기 결과로 나타나는 MVA 바이러스는 숙주 세포가 조류 세포로 심각하게 한정되게 된다. 아울러, MVA는 극단적인 약독화에 의해 특정된다. 다양한 동물 모델에서 시험할 때, MVA는 심지어 면역억제된(immunosuppressed) 동물에서조차도비독성인 것으로 판명되었다. 더욱 중요하게는, MVA 균주의 뛰어난 특성은 광범위한 임상 실험에서 설명되어 왔다(Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B, 167, 375-390, [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr., 99, 2386-2392, [1974]). 고위험군 환자를 포함하는 120,000명 이상에 대한 상기 연구 동안, MVA 백신의 사용과 관련된 어떠한 부작용도 일어나지 않았다. 백신으로서 유용한 재조합 MVA는 이미 구축되어 있으며(예를 들면, WO97/02355 참조), 임상 시험에서 유용하다. WO98/13500은 뎅기(dengue) 바이러스 항원을 코딩하는 DNA 서열을 포함하고 발현시킬 수 있는 재조합 MVA에 대해 개시하고 있다. 상기 외래 DNA 서열은 MVA 게놈의 자연 발생 결실부위에서 바이러스 DNA 속으로 재조합(recombine)된다. 훨씬 강한 약독화 및 향상된 안정성 특성을 보이는 MVA 균주가 영국 살리스베리의 ECACC에 기탁번호 V00083008로 기탁된 MVA-BN 균주이다.
백시니아 바이러스 이외에도 유전 정보를 포유동물 세포로 전달하기 위한 벡터로 다른 폭스바이러스가 사용되어 왔다. 본 명세서에는 파울폭스바이러스와 같은 아비폭스 바이러스에 대한 참고문헌이 기재되어 있다. 게놈내에 HIV 유전자를 포함하는 파울폭스바이러스는 US5,736,368 및 US6,051,410에 개시되어 있다.
백신으로 적합한 조성물을 포함하는 폭스바이러스를 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들면, Joklik W.K., Virology, [1962], 18, 9-18; Richter, K.H., Abhandlungen aus dem Bundesgesundheitsamt, [1970], 9, 53-57). 공지된 정제 방법에 의해 수용성이며 폭스바이러스를 함유하는 용액 또는 폭스바이러스를 함유하는 침전물(sediment)이 생기게 된다. 상기 용액 및 침전물에 존재하는 폭스바이러스는 안정적이지 않다. 즉, 바이러스의 감염성(infectivity)이 급속하게 감소한다. 그러나, 특히 백신이 제한된 배급 기간시설이 있는 열대 지역으로 운반될 필요가 있을 때, 상기 백신은 저장 및 안정적인 형태로 분배될 수 있어야 한다. 동결건조 제품은 4℃ 내지 25℃ 범위의 온도에서 저장될 수 있다. 이것은 -20℃ 이하에서 저장되어야 하는 액체 제형에 대한 표준 저장 조건과 비교할 때 명백한 이점이다(냉동보존 및 동결건조 프로토콜, Day J, McLellan M; Methods in Molecular Biology, 38, 1995, Humana Press).
폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스의 동결건조 방법 및 바이러스를 포함하는 상기 목적에 적합한 조성물 및 용액에 대해서는 공지되어 있다(Burke et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1999, 16, 1-83). 일반적인 용어로, 백신의 동결건조는 동결건조에 적합한 수용성 제형을 포함하는 백신을 냉동한 후, 감압 및 저온 조건하에서 승화에 의해 물을 제거시키는 단계 및 추가로 감압 및 고온 조건하에서 탈착(desorption)에 의해 물을 제거하는 단계를 포함한다.
동결건조를 위한 공지된 폭스바이러스 함유 제형은 중요한 결점을 가지고 있다. 동결건조를 위한 공지된 많은 백시니아 바이러스 함유 조성물은 펩톤(peptone) 또는 해마셀(haemaccel)을 포함하고 있는데, 이들은 종종 동물로부터 기원한다. 그러나, BSE와 같은 동물 질병들이 펩톤, 젤라틴 또는 해마셀과 같은 동물 식품을 통하여 동물로부터 인간에게 전달될 수 있다는 관련성이 있다. 아울러, 동결건조를 위한 공지된 바이러스 함유 제형에 존재하는 폭스바이러스는 정제되지 않았다. 따라서, 동결건조를 위한 당업계의 폭스바이러스 함유 조성물은 각각 세포 또는 조직 배양 시스템의 세포 유래 및 세포 배양 과정 동안 사용된 소 혈청 유래의 많은 양의 단백질을 포함하고 있다.
또한, 당업자는 동물 유래의 첨가 화합물(예를 들면, 펩톤 또는 해마셀)을 포함하지 않는 동결건조 조성물에 대해 알고 있다. 이런 경우, 상기 조성물은 하기 화합물을 단독 또는 조합하여 포함한다: 글루탐산 나트륨, 소르비톨(sorbitol), 락토스, 염, 아미노산 및 글리세린. 그러나, 동결건조 공정 후 얻어진 생성물은 종종 불안정하다. 즉, 바이러스 타이터(titer)에 있어서의 전체적인 손실이 수용할 수 없을 정도로 저장 과정동안 높게 나타난다. 아울러, 폭스바이러스는 이들 제형 중 몇몇에서 응집체를 형성하고, 다른 화합물들은 동결 과정 또는 그 전에 침전하는 경향이 있다고 알려져 있다.
US3,577,526은 수크로스(sucrose)에 분산된 백신의 기초(ground) 바이러스 물질에 의해 특정되는 천연두 백신에 대해 개시하고 있다. 수크로스의 양은 20% 내지 40% 범위이다. 상기 제형은 추가로 5%의 덱스트란을 포함할 수 있다. 기초 바이러스라는 용어는 펄프(pulp) 및 농포(pustule)로부터 유래된 바이러스를 의미한다. 기본적으로, 림프는 덩어리(lump)를 부수고 죽은 머리카락 및 피부로부터 액체를 분리하는 기초가 된다. 따라서, 백신 제제의 단백질 로드(load)는 매우 높아서 바이러스의 안정화에 기여하게 된다.
본 발명은 제형(formulation)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (1) 오르쏘폭스바이러스(orthopoxvirus), 아비폭스바이러스(avipoxvirus), 파라폭스바이러스(parapoxvirus), 카프리폭스바이러스(capripoxvirus) 및 수이폭스바이러스(suipoxvirus) 속(genera)에 속하는 한가지 폭스바이러스, (2) 이당류(disaccharide), (3) 약학적으로 허용되는 폴리머 및 선택적으로는 (4) 완충액(buffer)을 포함하는 수용성 제형에 관한 것이다.
도 1은 31℃ 온도에서 MVA 함유 동결건조 제형의 안정성을 보여준다. 검사된 제형은 GT23(실시예 부분 및 표 6 참조)이다. 본 발명에 따른 수용성 제형의 바이러스 타이터는 동결건조 전에 결정된다. 동결건조는 GT23(실시예 부분 및 표 6 참조)에 대해 기술된 것과 같이 제조되었다. 동결건조 후에 상기 제형은 31℃에서 보관되었다. 지시된 시점에서, 상기 동결건조 제형이 재구성되었고 바이러스 타이터가 다시 결정되었다.
도 2 및 도 3은 배양 온도가 도 2에서는 37℃이고 도 3에서는 45℃인 것을 제외하고는 도 1의 설명에서 기술된 것과 동일한 실험 결과를 보여준다.
본 발명의 목적은 폭스바이러스를 포함하는 제형을 제공하는 것으로서, 더욱상세하게는 동결건조용으로서 안정적인 동결건조 생성물을 생산하는 폭스바이러스를 포함하는 수용성 제형을 제공하는 데 있으며, 상기에서 폭스바이러스는 바람직하게는 정제되거나 또는 적어도 부분적으로 정제된 바이러스이다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 폭스바이러스가 응집하지 않고 구성성분이 동결과정 또는 이전에 침전하는 경향을 보이지 않는 폭스바이러스를 포함하는 수용성 제형을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 적은 양의 비-폭스바이러스 연관 단백질을 포함하는 폭스바이러스를 포함하는 제형, 특히 수용성 폭스바이러스를 포함하는 제형을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 안정적이고 동결건조된 폭스바이러스를 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 얻기 위한 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 폭스바이러스를 포함하는 제형, 특히 수용성 폭스바이러스를 포함하는 제형을 제공한다. 상기 제형, 특히 상기 수용성 제형은 상기 폭스바이러스의 동결건조에 적합할 수 있다. 아울러, 본 발명은 동결건조된 폭스바이러스를 포함하는 생성물을 제공한다. 본 발명에 따른 제형, 특히 수용성 제형은 상기 폭스바이러스, 이당류, 약학적으로 허용되는 폴리머 및 선택적으로는 추가로 완충액을 포함한다. 본 발명에 따른 동결건조 제형은 펩톤, 젤라틴, 해마셀과 같은 동물 유래의 안정화 첨가제 뿐만 아니라 바이러스를 증폭하기 위해 사용된 시스템(예를 들면, 세포 배양 시스템) 유래의 많은 양의 단백질도 포함하고 있지 않지만, 제형 내의 상기 바이러스는 놀라울 정도로 안정하다. 즉, 동결건조 조성물에 있는 상기 폭스바이러스는 심지어 실온 또는 37℃와 같은 높은 저장 온도에서조차도 오랜 기간동안 감염성이 있는 상태로 존재한다.
달리 특정하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 "실온"이라는 용어는 20℃ 내지 25℃의 온도에 상응한다.
동결건조되기 위한 상기 폭스바이러스는 오르쏘폭스바이러스, 파라폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 카프리폭스바이러스 및 수이폭스바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 어떤 바이러스라도 될 수 있다. 상기 바이러스는 인간 또는 동물에 대한 백신으로서 유용할 수 있다(Virology, 3판, 1995, ed.-in-chief: Fields, B.N.). 특히 바람직한 폭스바이러스는 오르쏘폭스바이러스 또는 아비폭스바이러스 속의 바이러스이다. 아비폭스바이러스 속에 속하는 바람직한 폭스바이러스의 예에는 카나리폭스바이러스 및 파울폭스바이러스가 있다. 오르쏘폭스바이러스 과에 속하는 바람직한 예에는 카울폭스바이러스 및 백시니아 바이러스가 있다.
본 발명에 따른 제형에 포함된 상기 폭스바이러스는 자연 발생 폭스바이러스, 약독화된 폭스바이러스 또는 재조합 폭스바이러스일 수 있다.
천연두에 대한 인간의 백신화를 위하여, 제형 내의 상기 폭스바이러스는 바람직하게는 백시니아 바이러스 균주이다. 상기 목적에 적합한 백시니아 바이러스 균주의 예로는 템플 오브 헤븐(Temple of Heaven), 코펜하겐, 파리, 부다페스트, 다이렌(Dairen), 감(Gam), MRIVP, 퍼(Per), 타쉬켄트(Tashkent), TBK, 톰(Tom), 베른(Berm), 패트와댄거(Patwadangar), BIEM, B-15, 리스터(Lister), EM-63, 뉴욕시 보건 위원회, 엘스트리(Elstree), 이케다(Ikeda) 및 WR 균주가 있다. 가장 바람직한 백시니아 바이러스 균주는 변형된 백시니아 바이러스 균주 앙카라(MVA) 및 그의유도체이며, 특히 ECACC에 기탁번호 V00083008로 기탁되어 있는 균주 및 엘스트리 균주이다.
본 발명에 따른 제형에 존재하는 상기 폭스바이러스는 바람직하게는 동물 또는 백신화되기 위한 대상에게 필수적으로 비병원성(apathogen)이다. 상기 목적을 위하여, 약독화된 바이러스 균주를 사용하거나 또는 백신화되기 위한 종과는 다른 숙주 종에서 자연적으로 복제되며 이형 숙주에서는 병원성이 없는 폭스바이러스를 사용하는 것이 바람직하다.
"약독화된 바이러스"는 비-약독화 양친(parent) 바이러스와 비교할 때 병원성 바이러스로부터 기원하지만 숙주 생물에 감염되면 낮은 치사율 및/또는 이환율을 보이는 바이러스이다. 약독화된 폭스바이러스의 예들은 당업자에게 있어서 공지되어 있다. 가장 바람직한 것은 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)이다. 전형적인 MVA 균주는 ECACC에 기탁번호 ECACC V00120707 및 ECACC V94012707로 각각 기탁되어 있는 MVA 575 및 MVA 572이다. 가장 바람직한 것은 MVA-BN 또는 그의 유도체로서, 이는 WO02/42480 (PCT/EP01/13628)에 기재되어 있다. 상기 출원의 내용은 본 명세서에서 참고문헌으로 포함되어 있다. MVA-BN은 ECACC에 기탁번호 ECACC V00083008로 기탁되어 있다.
인간이 이형 숙주이고 인간에서 병원성이 없는 폭스바이러스의 예로는 파울폭스바이러스 또는 카나리폭스바이러스가 있다.
"재조합 바이러스"라는 용어는 자연에서는 바이러스 게놈의 일부가 아닌 이형 유전자가 바이러스 게놈내로 삽입된 모든 바이러스를 의미한다. 이형 유전자는치료 유전자, 면역 반응을 유도하기 위한 적어도 하나의 에피토프(epitope)를 포함하는 펩타이드를 코딩하는 유전자, 안티센스 발현 카세트 또는 리보자임(ribozyme) 유전자가 될 수 있다. 재조합 바이러스를 제조하기 위한 방법은 당업자에게 있어서 공지되어 있다. 가장 바람직한 폭스바이러스 벡터는 MVA, 특히 MVA 575 및 MVA-BN이다(상기 내용 참조).
당업자에게는 감염된 배양 세포에서 폭스바이러스가 어떻게 증폭되고 회복되는지 공지되어 있다. 일반적으로, 첫 번째 단계에서는 진핵 세포가 본 발명에 따른 제형의 일부분이 되길 원하는 폭스바이러스에 의해 감염된다. 상기 진핵 세포는 상기 폭스바이러스 감염에 대하여 수용적인 세포이며, 감염된 바이러스의 복제 및 생산을 허용한다. MVA의 경우, 상기 유형의 세포의 예로는 병아리 배아 섬유아세포(CEF)가 있다(Drexler I. et al., J. Gen. Virol., 1998, 79, 347-352). CEF 세포는 당업자에게 알려진 조건하에서 배양될 수 있다. 바람직하게는, 상기 CEF 세포는 혈청이 포함되지 않은 배지에서 배양된다. 배양 시간은 바람직하게는 37±2℃에서 48 내지 96시간이다. 감염을 위하여, 폭스바이러스는 0.05 내지 1 TCID50(TCID = 조직 배양 감염 투여량)의 MOI (multiplicity of infection)에서 사용되며, 배양은 동일한 온도에서 48 내지 72시간 이루어진다.
감염의 진행은 전형적으로는 감염된 세포가 현저하게 둥글게 변하는 CPE (cytopathic effect)를 살펴봄으로써 관찰될 수 있다.
폭스바이러스는 두 가지 다른 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다: 감염된세포의 세포질내 세포막에 부착된 형태(IMV, intracellular mature virion) 및 세포외 막 바이러스 형태(EEV, extracellular enveloped virion)의 바이러스(Vanderplasschen A. et al., J. Gen. Virol., 1988, 79, 877-997). 두 가지 바이러스 형태 모두 본 발명에 따른 제형에 사용될 수 있다. EEV는 원심분리에 의한 상등액(supernatant)으로부터 쉽게 얻어질 수 있으며, 이당류 및 약학적으로 허용되는 폴리머를 포함하는 수용성 제형에서 직접 현탁될 수 있다. 그러나, 바이러스를-함유 분획은 세포 파편(detritus) 및 다른 불순물(contaminant)을 포함할 수 있다. 특히 인간을 위한 백신화의 경우, 상기 바이러스는 본 발명에 따른 제형으로 포함되기 전에 추가로 정제되는 것이 바람직하다. 폭스바이러스를 정제하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 정제 단계는 예를 들면 배치(batch) 원심분리(예를 들면 수크로스 쿠션(cushion)을 이용한) 또는 연속-유동(continuous-flow) 초원심분리(수크로스 농도 구배), 한외여과(ultrafiltration)(예를 들면, 500 kDa 이상으로서 0.1 ㎛와 동일하거나 더 작은 세공 크기(pore size)를 가지는 막을 이용한 교차-유동 여과), 칼럼 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 소수성 상호작용, 크기 배제 또는 조합) 또는 이들 중 일부 또는 전부의 조합일 수 있다(Masuda N. et al., J. Bacteriol, 1981, 147, 1095, 1104).
IMV를 얻기 위하여, 세포는 첫 번째 단계에서 수확(harvest)되어야 하고 두 번째 단계에서 파쇄되어야 한다. 만일 감염된 세포가 부유 배양에서 배양될 수 있다면, 상기 감염된 세포는 원심분리에 의해 쉽게 수확될 수 있다. 만일 감염된 세포가 대체로 완전한(intact) 부착 세포라면, 파쇄 단계를 적용하기 전에 상기 세포를 수확하는 것이, 즉 배양 용기로부터 세포를 제거하는 것이 가능하다. 수확 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 유용한 기술로는 기계적 방법(예를 들면 고무로 된 세포 스크레이퍼(scraper)를 사용한), 물리적 방법(예를 들면 배양 용기를 -15℃ 이하에서 동결 및 15℃ 이상에서 해동하는), 또는 생화학적 방법(배양 용기로부터 세포를 떼어내기 위하여 예를 들면 트립신과 같은 효소의 처리에 의한) 등이 있다. 만일 이러한 목적을 위하여 효소가 사용된다면, 오랜 배양 시간 후에는 상기 효소가 또한 바이러스를 손상시킬 수 있기 때문에 상기 배양 시간은 조절되어야 한다.
세포를 파쇄하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 상기 동결-해동 방법으로 이미 부분적인 세포 파쇄가 이루어진다. 세포를 파쇄하기 위한 다른 공지된 기술로는 초음파의 사용이 포함된다. 세포를 초음파 처리하면 바이러스를 포함하는 균질체(homogenate)가 만들어진다. 동물의 백신화를 위하여, 상기 폭스바이러스를 포함하는 균질체는 본 발명의 제형에 사용될 수 있다. 그러나, 적어도 부분적으로 정제된 폭스바이러스를 사용하는 것이 바람직하다. 상기에서 개설(outline)한 것과 같이, 상기 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
상기 폭스바이러스는 제형내에, 특히 104내지 109TCID50/㎖ 농도 범위, 바람직하게는 예를 들면 105내지 5×108TCID50/㎖ 농도 범위, 가장 바람직하게는 예를 들면 106내지 108TCID50/㎖ 농도 범위의 수용성 제형내에 포함되어 있다. 실제 농도는 인간 또는 동물에게 투여되기 위한 바이러스의 양에 의존하며, 이것은 다시 투여되는 바이러스의 형태에 의존한다. 백시니아 바이러스 균주 엘스트리의 경우, 인간에 대한 전형적인 백신화 투여량(dose)은 2.5×105TCID50을 포함한다. 백시니아 바이러스 균주 MVA-BN의 경우, 인간에 대한 전형적인 백신화 투여량은 1×108TCID50을 포함한다.
상기에서 지적한 바와 같이, 본 발명에 따른 제형 내의 폭스바이러스는 바람직하게는 정제된 또는 적어도 부분적으로 정제된 바이러스이다. "정제된 또는 적어도 부분적으로 정제된 바이러스"라는 용어는 천연두의 박멸 때까지 사용된 백신에서 사용된 것과 같이(US3,577,526 참조) 본 발명에 따른 제형에 사용된 상기 바이러스가 비정제된 바이러스("기초(ground) 바이러스")의 경우보다 더 높은 정제도를 가지고 있음을 의미한다. 상기와 같은 높은 정제도는 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 하기 방법에 의해 얻어질 수 있다: 배치 원심분리(예를 들면 수크로스 쿠션을 이용한) 또는 연속-유동 초원심분리(수크로스 농도 구배), 한외여과(예를 들면, 500 kDa 이상으로서 0.1 ㎛와 동일하거나 더 작은 세공 크기를 가지는 막을 사용한 교차-유동 여과), 칼럼 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 소수성 상호작용, 크기 배제 또는 조합과 같은). 특히 바람직한 것은 한외여과 및/또는 수크로스 쿠션을 이용한 배치 원심분리이다. 보다 일반적인 용어로, "정제된 또는 적어도 부분적으로 정제된 바이러스"는 적어도 106, 바람직하게는 적어도 107, 더욱 바람직하게는 적어도 108, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 5×108TCID50/㎎ 전체 단백질의 타이터를 가지는 바이러스 조제물(preparation)(예를 들면 MVA 또는 엘스트리를 포함하는 조제물)을 의미한다. 엘스트리 균주의 경우, 전형적인 조제물은 8×108TCID50/㎎ 전체 단백질의 타이터를 가진다. 폭스바이러스를 포함하는 조제물의 타이터를 결정하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다; 이들 방법 중 하나는 실시예 부분에서 개설되어 있다. 전체 단백질 함량은 바람직하게는 크젤달(Kjeldahl)의 방법에 따라 결정된다(Lynch, J.M. 및 Barbano, D.M., 유제품의 단백질을 결정하기 위한 참고 방법으로서의 크젤달 질소 분석. J. AOAC Int., 1999, Nov-Dec, 82(6), 1389-98, Review). 전체 단백질 함량은 바이러스 단백질과 세포 단백질의 합을 나타낸다.
정제된 또는 부분적으로 정제된 바이러스, 이당류 및 약학적으로 활성형인 폴리머를 함유하는 제형이 안정적이라는 것은 예상치 못한 일인데, 그 이유는 비정제된 바이러스 조제물내의 많은 양의 비-바이러스 단백질이 종래에 기술된 제형의 안정성에 기여한다고 믿어져 왔기 때문이다.
본 발명에 따른 제형, 특히 수용성 제형은 이당류를 포함한다. 동결건조 과정 동안 훌륭한 생체방어를 주지만 낮은 붕괴(collapse) 온도 및 종종 붕괴를 동반하여 동결건조되는 포도당과 같은 단당류와는 달리, 이당류는 단당류보다 높은 붕괴 온도를 보이는 효과적인 동결건조 방어제가 될 수 있는 것으로 나타났다.
본 발명에 따른 제형에 포함되는 상기 이당류는 붕괴 온도(Tc)가 약 -25℃ 내지 -35℃ 범위인 약학적으로 허용되는 이당류이다. 전형적인 붕괴 온도는 수크로스의 경우에는 -31℃이고 트레할로스(trehalose)의 경우에는 -28.5℃이며, 락토스의 경우에는 -30.5℃이다. 본 발명에 따른 전체 제형에 대한 전형적인 붕괴 온도는 바람직하게는 -50℃ 내지 -20℃ 범위에 있다. 바람직한 하위범위(subrange)는 예를 들면, -37℃ 내지 -30℃, -36℃ 내지 -31℃ 또는 -35.7℃ 내지 -31.2℃이다.
바람직하게는, 상기 이당류는 트레할로스, 락토스 및 수크로스로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 것은 수크로스이다. 상기 이당류, 바람직하게는 수크로스는 본 발명에 따른 제형, 특히 수용성 제형에서 바람직하게는 10 내지 100 g/ℓ 범위, 더욱 바람직하게는 20 내지 80 g/ℓ 범위, 가장 바람직하게는 25 내지 60 g/ℓ 범위의 농도로 포함되어 있다. 수크로스의 경우, 전형적인 농도는 45 g/ℓ이다.
본 발명에 따른 상기 제형, 특히 수용성 제형은 약학적으로 허용되는 폴리머를 추가로 포함한다. 상기 폴리머는 바람직하게는 덱스트란 및 PVP (polyvinylpyrrolidon)로 구성된 군으로부터 선택된다. 사용되는 상기 폴리머는 본 발명에 따른 제형에 용해될 수 있어야 한다. 만일, 덱스트란이 사용되는 경우, 그 분자량은 바람직하게는 20,000 내지 100,000 범위, 더욱 바람직하게는 30,000 내지 70,000 범위, 가장 바람직하게는 36,000 내지 44,000 범위이다. 가장 바람직한 덱스트란은 40,000의 평균 분자량을 가진다. 상기 덱스트란의 농도는 1 내지 50 g/ℓ 범위, 바람직하게는 2 내지 40 g/ℓ 또는 3 내지 30 g/ℓ 범위이다. 5 내지 50 g/ℓ, 5 내지 40 g/ℓ 또는 5 내지 30 g/ℓ 범위에서 특히 좋은 결과가 관찰되었다. 훨씬 더 바람직하게는 8 내지 30 g/ℓ 범위이다. 가장 바람직한 범위는 10 내지 27 g/ℓ이다. 바람직한 농도의 한 예는 18.9 g/ℓ이다. 상기에서 기재된 덱스트란의 바람직한 농도 및 농도 범위, 특히 5 내지 50 g/ℓ 및 대응하는 하위범위에서는 제형의 붕괴 온도가 상대적으로 높은 특별한 이점을 가지며, 이것은 산업적 규모에서 상기 공정을 수행하는 것을 가능하게 만든다. 만일 PVP가 사용된다면, 그 분자량은 바람직하게는 50,000 내지 400,000 범위, 더욱 바람직하게는 70,000 내지 360,000 범위 내에 있다. PVP의 농도는 5 내지 200 g/ℓ 범위, 더욱 바람직하게는 5 내지 100 g/ℓ 범위, 가장 바람직하게는 10 내지 40 g/ℓ 범위이다.
본 발명에 따른 상기 제형, 특히 수용성 제형은 추가로 완충액을 포함할 수 있다. 상기에서 지적한 바와 같이, 본 발명의 목적 중 하나는 수용성 폭스바이러스를 함유하는 제형을 제공하는 것으로서, 상기 폭스바이러스는 응집하지 않고 건조시에 침전이 일어나지 않는다. 상기와 같은 원하지 않는 효과가 수용성 제형내에 포스페이트(phosphate)를 포함하는 완충액이 존재하는 것과 연관되어 있다는 것을 예기치 않게 발견하였다. 포스페이트를 포함하는 완충액의 예로는 PBS (phosphate buffered saline) 및 포스페이트 완충액이 있다. 결과적으로, 상기와 같은 본 발명의 특별한 목적은 포스페이트 완충액을 포함하지 않는 동결건조용 수용성 제형에 의해 해결된다. 따라서, 본 발명에 따른 제형에 포함된 상기 완충액은 바람직하게는 TRIS, TBS, MOPS, HEPES 및 (바이)카보네이트(bi-carbonate) 완충액으로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 완충액은 요구되는 완충 용량을 발휘하기에 충분한 농도로 사용된다. TRIS 완충액의 경우, 바람직한 농도 범위는 1 내지 50 mM 이다; 가장 바람직한 농도는 10 mM이다. 상기 pH는 바람직하게는 한편으로는 인간 또는 동물에 투여되기 위하여 약학적으로 허용되는 수치로, 다른 한편으로는 바이러스에 손상을 입히지 않는 수치로 조정된다. 따라서, 상기 pH는 6.0 내지 9.0 범위, 더욱 바람직하게는 7.2 내지 7.8의 범위여야 한다. 가장 바람직한 pH는 7.4이다.
포스페이트가 제거된 완충액을 사용함으로써 제형에 포함된 바이러스가 비정제된, 정제된 또는 부분적으로 정제된 바이러스인지 여부와 관계없이 예상치 못한 좋은 결과가 얻어졌다. 정제된 또는 부분적으로 정제된 바이러스가 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 제형, 특히 수용성 제형은 NaCl과 같은 염을 포함할 수 있다. 전형적인 NaCl 농도는 10 내지 200 mM 범위이다. 바람직한 NaCl 농도의 예는 140 mM이다.
본 발명에 따른 상기 제형, 특히 수용성 제형은 추가로 L-글루탐산(glutamic acid) 염을 포함할 수 있다. 상기 염은 바람직하게는 모노칼륨(monopotassium) 염 또는 모노나트륨 염이다. L-글루탐산의 농도는 바람직하게는 0.05 내지 0.5 g/ℓ 범위이고, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.15 g/ℓ 범위이다.
본 발명에 따른 몇몇 특히 바람직한 수용성 제형은 하기 표 1에 나열되어 있다. 표 1에 나열된 모든 제형에서, 완충액은 10 mM TRIS, pH 7.4, 140 mM NaCl이다.
MVA[TCID50/㎖] 제1 첨가제(g/ℓ) 제2 첨가제(g/ℓ) 제3 첨가제(g/ℓ) 표 6에 따라 실행
5×108 25(수크로스) 10.5(덱스트란) 0.06(L-글루탐산) GT 8
5×108 34.5(수크로스) 14.5(덱스트란) 0.083(L-글루탐산) GT 8
5×108 45(수크로스) 18.9(덱스트란) 0.108(L-글루탐산) GT 9
5×108 60(수크로스) 25.2(덱스트란) 0.144(L-글루탐산) GT 9
1×108 45(수크로스) 18.9(덱스트란) 0.108(L-글루탐산)
1×108 45(수크로스) 3.78(덱스트란) 0.108(L-글루탐산)
본 발명에 따른 상기 수용성 제형은 동결건조에 적합하다. 투여를 위하여, 동결건조 생성물은 적당한 용매를 이용하여 재구성되어야 한다. 한 실시예에 따르면 화합물을 용액으로 만들기 위하여 동결건조 생성물에 멸균수가 첨가된다. 바람직하게는, 첨가된 물의 양은 동결건조 과정에서 제거되었던 물의 양과 대체로 상응한다. 따라서, 상기 실시예에 따르면 재구성된 생성물의 조성물은 최초 수용성 제형과 대체로 동일하다. 따라서, 본 발명에 따른 수용성 제형이 백신으로 사용되는 것은 본 발명의 범위에 포함된다. 다른 실시예에 따르면, 동결건조된 생성물은 또한 적당한 양으로 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 어떤 다른 희석제 내에서도 재구성될 수 있다. 예를 들면, 상기 희석제는 페놀, 글리세롤 및 완충액으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함하는 물이 될 수 있다. 재구성된 생성물에서의 페놀의 농도는 예를 들면 0.5%이다. 상기에서 지적한 바와 같이, 상기 완충액은 바람직하게는 포스페이트 완충액이 아니다.
요약하면, 본 발명의 이러한 측면은 그 중에서도 특히 바람직한 하기 실시예에 관한 것이다: (1) 오르쏘폭스바이러스, 파라폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 카프리폭스바이러스 및 수이폭스바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 정제된 또는 부분적으로 정제된 폭스바이러스, 이당류, 약학적으로 허용되는 폴리머 및 선택적으로는 완충액을 포함하거나 또는 심지어 그로 구성된 제형, 특히 수용성 제형으로서, 상기에서 완충액은 바람직하게는 포스페이트 완충액이 아니다. 바람직하게는, 상기 폴리머는 덱스트란이고, 바람직하게는 상기에서 특정된 양으로 존재한다. (2) 오르쏘폭스바이러스, 파라폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 카프리폭스바이러스 및 수이폭스바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 폭스바이러스, 이당류, 약학적으로 허용되는 폴리머 및 완충액을 포함하거나 또는 심지어 그로 구성된 제형, 특히 수용성 제형으로서, 상기에서 완충액은 포스페이트 완충액이 아니고 상기 폭스바이러스는 바람직하게는 정제된 또는 부분적으로 정제된 바이러스이다. (3) 오르쏘폭스바이러스, 파라폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 카프리폭스바이러스 및 수이폭스바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 폭스바이러스, 이당류, 약학적으로 허용되는 폴리머 및 선택적으로는 완충액을 포함하거나 또는 심지어 그로 구성된 제형, 특히 수용성 제형으로서, 상기에서 폴리머는 상기에서 특정된 양, 예를 들면 바람직하게는 5 내지 40 g/ℓ 범위의 덱스트란이다. 바람직하게는, 상기 완충액은 포스페이트 완충액이 아니다. 바람직하게는, 상기 폭스바이러스는 정제된 또는 부분적으로 정제된 바이러스이다.
상기 (1), (2) 및 (3)의 문맥에서 사용된 "구성된"이라는 용어는 상기에서언급된 화합물들만으로 구성된 제형 및 추가로 하나 또는 그 이상의 염을 포함하는 제형을 의미한다. 상기에서 정의된 화합물로 구성되는 제형 (1), (2) 및 (3)에 첨가될 수 있는 염의 예로는 KCl, NaCl, 글루탐산 나트륨이 있다. 따라서, 상기에서 정의된 제형 (1), (2) 및 (3)에서 정의된 "구성된" 이라는 용어는 하나 또는 그 이상의 염을 첨가할 가능성을 배제하지는 않는다.
예를 들면, 본 발명의 특정한 실시예에서는 오르쏘폭스바이러스, 파라폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 카프리폭스바이러스 및 수이폭스바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 정제된 또는 부분적으로 정제된 폭스바이러스, 이당류, 약학적으로 허용되는 폴리머 및 완충액을 포함하는 수용성 제형을 포함하며, 상기에서 이당류는 상기에서 특정된 양의 수크로스이고, 폴리머는 상기에서 특정된 양의 덱스트란이며, 완충액은 포스페이트 완충액이 아니다. 예를 들면, 본 발명의 다른 특정한 실시예에서는 오르쏘폭스바이러스, 파라폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 카프리폭스바이러스 및 수이폭스바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 폭스바이러스, 이당류, 약학적으로 허용되는 폴리머 및 선택적으로는 완충액으로 구성되는 수용성 제형을 포함한다. 상기 폭스바이러스는 바람직하게는 정제된 또는 부분적으로 정제된 폭스바이러스이다. 상기 이당류, 폴리머 및 완충액의 바람직한 양 및 예들은 상기에 개설되어 있다.
폭스바이러스를 포함하는 상기 제형, 특히 수용성 제형이 백신화를 위하여 어떻게 투여되고 어느 정도 양의 바이러스가 사용되어야 하는지는 숙련자의 기술 범위내에 있다. 상기에서 지적한 바와 같이, 상기 백신은 특히 만약 약독화된 또는 비병원성, 비-재조합 폭스바이러스가 사용되는 경우 폭스바이러스 자체에 대한 면역 반응을 유도하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 폭스바이러스가 재조합 폭스바이러스이면 면역반응은 폭스바이러스 벡터에 의해 발현된 재조합 단백질/펩타이드에 대해서도 추가적으로 일어난다.
상기에서 사용된 것과 같은 "제형"이라는 용어는, 달리 언급하지 않는 한, 통상 액체 제형, 바람직하게는 수용성 제형을 의미한다. 농도 또는 농도 범위가 "mM", "g/ℓ" 등으로 정의되어 있다면, 이것은 각각의 제형이 액체 또는 심지어 수용성 제형이라는 것을 의미한다. "수용성 제형"이라는 용어는 희석제가 물인 제형에 관한 것이다. 그러나, 또한 본 발명의 범위에는 본 발명에 따른 액체 또는 심지어 수용성 제형으로부터 액체를 제거함으로써 얻을 수 있는 건조 제형을 포괄하며, 상기에서 제거를 위하여 사용되는 방법과는 상관없다. 따라서, 또한 본 발명은 동결건조 이외의 방법에 의해서 얻어지는 건조 제형을 포괄한다.
특히, 본 발명은 추가로 본 발명에 따른 상기 제형, 특히 수용성 제형이 동결건조되는 것을 특징으로 하는, 폭스바이러스를 포함하는 안정한 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 있어서, "폭스바이러스를 포함하는 안정한 조성물" 및 "동결건조된 폭스바이러스를 포함하는 조성물"은 달리 언급하지 않으면 상호 교환가능하게 사용된다. "폭스바이러스를 포함하는 안정한 조성물"이라는 용어는 본 명세서에 있어서 37℃의 배양 온도에서 28일 동안의 바이러스 타이터의 전체적인 손실이 0.5 log 보다 작은, 바람직하게는 0.4 log보다 작은 폭스바이러스-포함 조성물을 정의하기 위해 사용된다. 바이러스 타이터를 결정하기 위한 상세한프로토콜(protocol) 및 바이러스 타이터의 전체적인 손실은 실시예 부분에 제시되어 있다. 그러나, 바이러스 타이터를 결정하기 위한 어떤 다른 프로토콜도 또한 사용될 수 있다.
동결건조 방법은 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다(Day, J. 및 McLellan,M., Methods in Molecular Biology, Humana Press, 1995, Vol.38).
동결건조 방법은 일반적으로 하기 단계로 구성되어 있으며, 이것은 아래에 좀더 상세히 설명되어 있다:
1. 백신의 조제;
2. 샘플의 동결;
3. 1차 건조(승화);
4. 2차 건조(탈착);
5. 생성물 마개(stoppering) 및 제거;
6. 백신의 저장;
7. 재구성.
백신의 조제:
백신으로 사용되기 위한 폭스바이러스의 생산 및 증폭은 상기에서 상세히 설명되어 있다. 상기 폭스바이러스는 선택적으로 정제된다. 본 발명에 따른 상기 제형은 상기에서 정의된 이당류, 폴리머 및 선택적으로는 완충액, L-글루탐산 및 선택적으로는 추가로 첨가제를 상기 폭스바이러스 조제물에 첨가함으로써 얻어진다.
샘플의 동결:
샘플을 동결하면 용액 속의 성분이 부동화되며(immobilize), 따라서 압력이 감소되었을 때 생성물에 거품이 생기는 것이 방지된다. 동결은 처음에는 물이 핵화되고(nucleate) 다음으로 얼음 결정이 성장되어서 결국 얼음과 용질 농축액의 혼합물이 되는 2단계 과정이다. 얼음의 핵화는 온도를 낮추고 냉각된 현탁액을 휘저어 줌으로써 촉진된다. 핵화와는 대조적으로, 얼음의 성장은 온도를 높여주고 따라서 현탁액의 점도(viscosity)를 감소시킴으로써 촉진된다. 정확한 동결 패턴과 상관없이, 배지에서의 얼음의 성장은 용질 농도의 증가를 가져온다. 용액 또는 현탁액에 존재하는 바이오폴리머(biopolymer)는 상기와 같은 증가하는 농도의 용질에 노출됨으로써 손상되거나 불활성화된다. 신속한 냉각은 농축액에 바이오생산물(bioproduct)이 노출되는 것을 최소화한다. 임계 온도(유리 전이 온도) 이상에서는 물질의 점도가 충분히 감소하여서 유리가 연해지고 일그러진다. 이것은 건조되어서 바이알(vial) 내에서 무정형의 점착성 잔기를 형성한다. 일그러지는 온도는 붕괴 온도라 부른다. 보다 구체적으로, 상기 붕괴 온도는 매트릭스의 간극(interstitial) 부위에 있는 물의 이동이 현저하게 되는 곳에서의 온도로 정의된다. 일그러짐을 방지하기 위하여, 상기 동결 온도는 수용성 제형의 붕괴 온도 이하여야 한다. 상기 붕괴 온도는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들면 시차열 분석(differential thermal analysis)에 따라 결정될 수 있다(Jennings, T.A., "동결건조, 도입 및 기초 원리", Interpharm Press, Denver, CO. US, 1999, ISBN 1-57491-081-7, 132-134).
만일 온도가 너무 낮다면, 바이러스로부터의 물의 확산이 억제될 수 있고 세포내 얼음에 의한 상해가 일어날 수 있다. 결과적으로, 당업자는 경험적으로 수용성 제형의 붕괴 온도 이하에서 동결 온도를 몇차례 검사할 것이며, 어떤 온도에서 감염성 폭스바이러스의 최고 타이터를 보이는 동결건조 생성물이 제조되는지를 검사할 것이다.
1차 건조(승화):
1차 건조는 동결된 매트릭스로부터 용매(얼음)를 승화시키게 하는 동결건조 과정 중의 일부이다. 상기 1차 건조 과정은 동결건조기가 요구되는 냉각 온도 및 챔버(chamber) 압력을 가진 후에 시작된다. 챔버에서의 압력은 일반적으로 1 mbar 이하이고, 바람직하게는 0.2 mbar 이하이다. 전형적으로는 상기 압력은 0.04 내지 0.12 mbar의 범위이다. 본 명세서에 있어서, 이러한 조건은 때때로 "낮은 압력"으로 기재된다. 선반의 온도는, 생성물 매트릭스 내의 얼음의 승화가 일어나고 생성물의 온도가 제형의 붕괴 온도보다 현저히 낮아서 전체 1차 건조 과정을 통하여 매트릭스가 완전히 동결되고 붕괴 없이 동결건조가 되도록 증가된다. 상기 온도는 전체 1차 건조 과정 동안 일정하게 유지될 수 있다. 한편으로는, 상기 선반 온도는 1차 건조 동안 지속적으로 증가될 수 있다. 그러나, 생성물의 온도는 전체 1차 건조 과정 동안 붕괴 온도보다 낮아야만 한다. 1차 건조가 끝나는 시점에서, 상기 건조된 생성물은 여전히 5% 이상(w/w)의 수분을 함유할 수 있다. 생물학적 성장 또는 화학 반응을 더 이상 돕지 않는(not to support) 수분 함량을 갖는 생성물을 얻기 위하여, 2차 건조 과정을 수행하는 것이 필요하다.
2차 건조(탈착):
2차 건조 과정동안, 1차 건조과정에서 형성된 케이크(cake)의 표면으로부터 증기가 탈착된다. 이것은 챔버가 여전히 낮은 기압인 동안에 온도를 증가시켜서 수분이 케이크 표면으로부터 탈착되도록 함으로써 수행된다. 2차 건조를 위한 선반의 온도는 생성물의 안정성에 의해 결정되며, 0℃ 내지 30℃의 범위에 있을 수 있다. 상기 생성물의 온도는 대개 -5℃ 내지 30℃의 범위에 있다. 상기 2차 건조는 2단계로 이루어질 수 있다. 첫 번째 단계에서, 상기 생성물 온도는 -5℃ 내지 15℃의 범위, 바람직하게는 0℃ 내지 10℃의 범위, 더욱 바람직하게는 2℃ 내지 7℃ 범위에 있을 수 있다. 두 번째 단계는 2차 건조의 첫 번째 단계보다 높은 온도에서 이루어진다. 상기 온도는 0℃ 내지 30℃ 범위, 바람직하게는 5℃ 내지 20℃ 범위에 있을 수 있다. 또한, 제형의 잔류 수분 함량은 생성물의 요구조건에 의존한다. 최적의 생성물 안정성을 얻기 위하여 어떤 생성물은 높은 수분 함량을 요구하고, 다른 생성물은 낮은 수분 함량을 요구한다. 최적 잔류 수분 함량뿐만 아니라 여기에 도달되기 위한 시간은 경험적으로 결정되어야 한다.
2차 건조 과정은 원하는 수분이 얻어질 때까지 계속된다. 생성물의 수분을 결정하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 특히, 전기량적(coulometric) 칼-피셔(Karl-Fischer) 적정이 사용될 수 있다(Jennings, T.A., "동결건조, 도입 및 기본 원리", Interpharm Press, Denver, CO, US, 1999, ISBN 1-57491-081-7, 415-418). 상기 잔류 수분 함량은 바람직하게는 5% 이하이고, 더욱 바람직하게는 0.5% 내지 4% 범위이고, 훨씬 더 바람직하게는 1% 내지 3% 범위이다.
생성물 마개처리(stoppering) 및 제거:
생성물을 포함하는 모든 바이알은 당업자에게 공지된 방법에 따라 밀봉된다. 상기 바이알은 매우 낮은 압력(예를 들면, 0.04 내지 2.56 mbar) 하에서 동결건조기 내에서 직접 밀봉될 수 있다. 또한, 상기 바이알을 질소 또는 헬륨과 같은 화학적 불활성화 가스를 사용하여 어느 정도 정상 압력하에서 밀봉하는 것도 가능하다. 전형적으로, 상기 바이알은 질소 공기에서 900 mbar의 압력으로 밀봉될 수 있다. 상기 바이알은 바람직하게는 부틸(butyl) 고무 마개를 사용하여 밀폐한다. 생성물이 마개처리 되면, 상기 시스템은 공기압으로 되돌아갈 수 있고, 선반은 비워졌다. 이후, 상기 바이알은 장기간의 보관을 위하여 추가로 알루미늄 캡(cap)으로 밀봉될 수 있다.
백신의 보관:
상기 동결건조 생성물은 실온(25℃)에서 보관될 수 있으며, 적어도 18주, 바람직하게는 적어도 20주, 더욱 바람직하게는 적어도 22주동안 상기 온도에서 안정하게 유지된다. "일정한 기간동안 일정한 온도에서 안정한"이라는 것은 상기 온도에서의 바이러스 타이터의 손실이 상기 기간동안 0.5 log 이하인 것을 의미한다. 그러나, 냉각이 가능하다면 상기 동결건조 생성물은 4℃와 같은 낮은 온도에서 보관되는 것이 바람직하다. 바람직하게는 상기 생성물은 어두운 곳에서 보관된다. 이것이 가능하지 않다면, 보관을 위하여 유해한 빛에 노출되는 것을 방지하는 색이 있는 유리 또는 다른 바이알을 사용하는 것이 바람직하다.
재구성.
동결건조 생성물을 재구성하기 위하여, 적당한 양의 용매가 동결건조 생성물에 첨가되어 인간 또는 동물에게 투여될 수 있는 약학적으로 허용되는 제형이 된다. 상기 용매는 바람직하게는 물이다. 일반적으로, 상기 용매는 동결건조 과정동안 손실된 용매의 양에 실질적으로 상응하는 양으로 상기 제형에 첨가된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어진 동결건조 생성물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명에 따른 동결건조 생성물은 (1) 폭스바이러스, 바람직하게는 오르쏘폭스바이러스 또는 아비폭스바이러스 속의 폭스바이러스, (2) 이당류, (3) 약학적으로 허용되는 폴리머 및 선택적으로는 (4) 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기에서 폭스바이러스, 이당류, 폴리머 및 완충액은 상기에서 정의된 바와 같다.
동결건조 생성물의 전형적인 조성을 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타난 모든 제형에서, 바이러스의 양은 5×108TCID50/㎖ 이다.
동결건조 전 수용성 제형내의 DSG의 양(%) 20 30 40
동결건조 생성물내의 수크로스(%) 54.7(36 ㎎) 58.7(54 ㎎) 58.4(72 ㎎)
동결건조 생성물내의 덱스트란(%) 23(15.12 ㎎) 24.7(22.68 ㎎) 24.6(30.24 ㎎)
동결건조 생성물내의 L-글루탐산 모노칼륨염 일수화물(monohydrate)(%) 0.13(0.0864 ㎎) 0.14(0.1296 ㎎) 0.14(0.1728 ㎎)
동결건조 케이크의 평균값 (㎎)(1.2 ㎖로 채울 때) 65.8 92 123.1
상기에서, DSG는 63 g/ℓ 덱스트란 (분자량 36,000-44,000), 150 g/ℓ 수크로스, 0.36 g/ℓ L-글루탐산 모노칼륨염 일수화물을 의미한다.
본 발명에 따른 상기 동결건조 생성물은 백신의 제조에 사용된다. 상기 목적을 위하여, 상기 동결건조 생성물은 상기에서 기술된 바와 같이 용해/재구성되어서 당업자에게 공지된 방법에 따라 인간 또는 동물에게 투여된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 변형된 백시니아 바이러스 균주 앙카라(MVA)를 포함하는 제형의 동결건조
본 실시예에서 MVA를 포함하는 본 발명에 따른 제형은 여러 가지 조건하에서 동결건조되었다. 동결건조된 생성물들은 서로 다른 온도에서 보관되었다. 조제물 내의 MVA의 안정성은 동결건조 생성물을 재구성한 후 MVA의 타이터를 결정하고 동결건조 전의 MVA 타이터와 비교함으로써 분석되었다. 바이러스 타이터에 미치는 다른 보관 시간의 영향을 결정하였다. MVA를 포함하는 제형의 타이터를 결정하기 위한 프로토콜은 실시예 2에 나타나 있다.
1. 실험 세팅(setting):
백신 조제물/제형
본 발명에 따른 동결건조 방법을 테스트하기 위하여, 몇 가지 MVA 조제물이 사용되었다. 동결건조 실험을 위하여, 변형된 백시니아 바이러스 균주 앙카라(MVA)가 사용되었다(표 6의 GT1 내지 4, 6 내지 10 및 13 내지 15열). 상기 바이러스는 36% 및 40% 수크로스 쿠션 원심분리에 의해 정제되었고, 이후 1 mM Tris 완충액 (pH 9)에 재현탁되었다. 동결건조 실험 GT1 내지 4 (표 6)에서, 첨가제는 사용되지 않았다. 사용된 완충액 시스템은 140 mM NaCl을 포함하는 10 mM Tris, pH 7.4 이었다. 번호 GT6 (표 6)로 시작되는 동결건조의 경우에는 완충액 시스템을 변화시킴 없이 다른 첨가제들이 사용되었다.
다른 첨가제가 포함된 두 가지 다른 제형이 선택되었다. 첨가제는 희석 완충액을 첨가함으로써 바이러스를 포함하는 용액에 제공되었다. 사용된 희석 완충액의 조성은 하기 표 3 및 표 4에 나타나 있다. 희석 완충액 1(DSG)의 첨가로 본 발명에 따른 수용성 제형이 제조된다. 희석 완충액 2 (DGG)의 사용으로 비교 분석을 위해 사용된 제형이 제조된다.
희석 완충액 1 (DSG) 스톡 용액에서의 농도(g/ℓ)
덱스트란 (MW 36,000-44,000) 63
수크로스 150
L-글루탐산 모노칼륨염 일수화물 0, 36
희석 완충액 2 (DGG) 스톡 용액에서의 농도(g/ℓ)
덱스트란 (MW 36,000-44,000) 63
포도당 150
L-글루탐산 모노칼륨염 일수화물 0, 36
상기 희석 완충액들은 최종 제형에서 다른 농도로 사용되었다. 희석 완충액 1 (DSG)은 16.7%, 23%, 30% 및 40% (v/v)으로 사용되었고, 희석 완충액 2 (DGG)는 20% (v/v)으로 사용되었다. 최종 제형의 TCID50/㎖은 생리학적 Tris 완충액(10 mM Tris 완충액; 140 mM NaCl; pH 7.4)을 이용하여 5×108TCID50/㎖로 조정되었다.
샘플의 동결
상기 샘플은 동결건조기(Christ freeze dryer, Type Alpha 2.4) 내에서 동결되었다. 수크로스를 포함하는 제형(DSG)의 경우, 다른 동결 온도 (-30℃ 내지 -45℃)에서 비교한 결과, 완전한 케이크 구조를 얻기 위해서는 제형의 붕괴 온도 아래인 -40℃로 현탁액이 동결되어야 함을 보였다. 동결건조기 내에서 동결될 때, -40℃는 약 3.5 내지 4.5시간 이내에 도달되었다(약 20℃에서 시작).
1차 건조
수크로스를 포함하는 제형의 경우, 수크로스의 붕괴 온도(-31℃)로 인하여 약 -30℃ 내지 -37℃의 붕괴 온도가 추정되었다. 따라서, 생성물의 온도는 완전히 동결된 매트릭스를 얻기 위하여 -37℃ 내지 -41℃ 범위의 값으로 조정되었다. 0.04 내지 0.12 mbar의 압력(물의 상 도해(phase diagram)에서 -50℃ 및 -40℃)이 사용되었다.
1차 건조 동안의 승화 추진력은 온도 차이에 의해 발생하는 생성물과 동결건조기의 응축기 사이의 압력 차이이다. 자연 법칙은 물의 온도가 감소할 때 상기 물위의 압력 또한 감소한다는 것이다. 물의 특정한 온도는 항상 특정한 압력과 연관되어 있다. 상기 응축기는 -83℃ 내지 -89℃ 범위 온도에 맞춰져 있다. 챔버의 압력 및 선반의 온도는 생성물의 온도를 조절한다. 이것은 응축기의 온도가 고정되어 있기 때문에 1차 건조 기간이 매우 쉽게 단축될 수는 없다는 것을 의미한다.
2차 건조
2차 건조를 위한 온도는 생성물의 안정성에 의해 결정된다. 또한, 제형의 잔류 수분 함량은 생성물의 요구조건에 의존한다. 최적의 생성물 안정성을 얻기 위하여 어떤 경우에는 높은 수분 함량을, 다른 경우에는 낮은 수분 함량을 필요로 한다. 최적 잔류 수분 함량뿐만 아니라 여기에 도달되는 시간은 경험적으로 결정되어야 한다. 2차 건조는 상기 생성물이 0℃ 이상 온도에 도달할 때 개시되기 때문에, 2차 건조는 두 가지 단계에 의해 수행된다. 첫 번째 단계에서, 선반의 온도는 상기 생성물의 온도가 0℃ 이상이 되도록 (4℃ 내지 6℃ 범위) 수시간 동안 조절되었다(4 내지 7시간 범위). 상기와 같은 방식으로, 1차 건조 이후에 존재할 가능성이 있는 모든 얼음이 용해되었다. 2차 건조를 개시하기 위하여 상기와 같은 완급의 조건을 이용함으로써 생성물에 대한 손상이 최소화 될 것이다. 이후, 생성물의 온도를 18℃ 내지 21℃ 범위로 20 내지 30시간동안 증가시킴으로써 두 번째 단계가 시작되었다. 두 번째 단계를 위한 시간은 동결건조 생성물의 원하는 잔류 수분에 크게 의존한다. 다른 잔류 수분 함량을 얻기 위하여, 다른 시간이 사용되었다. 동결건조 물질의 잔류 수분 함량을 측정하는 방법으로는 전기량적 칼-피셔 적정이 사용되었다(Jennings, T.A., "동결건조, 도입 및 기본 원리", Interpharm Press, Denver, CO, US, 1999, ISBN 1-57491-081-7, 415-418).
생성물 마개처리 및 제거
공정 중에 만들어진 모든 생성물들은 매우 낮은 압력(0.04 내지 2.56 mbar)하에서 동결건조기 내에서 직접 밀봉되었다. 상기 바이알은 부틸 고무 마개를 이용하여 밀폐했다. 일단 상기 생성물이 마개처리 되면, 상기 시스템은 대기 압력으로 되돌아가게 되고 선반은 비워졌다. 이후, 바이알들은 장기간의 보관을 위하여 알루미늄 캡으로 밀봉되었다.
백신의 보관
제형 제조(exercise)의 중요한 측면은 선반-안정성(shelf-stable) 백신을 생산하는 것이다. 안정성에 영향을 미치는 인자로는 잔류 수분 함량, 밀봉 분위기 조성물 및 온도, 습도 및 빛을 포함하는 보관 조건들을 포함한다.
공정 개발 과정에서 생산된 다른 배치들은 모두 4℃ 및 실온에서 보관되었다. 아울러, 몇몇 배치들은 또한 31℃, 37℃ 및 45℃에서 보관되었다. 모든 샘플들은 어두운 곳에 보관하였다.
재구성
동결건조 샘플은 멸균된 Milli-Q 물로 재구성되었다. 더욱 구체적으로, 주사기를 이용하여 1.2 ㎖의 물이 상기 샘플에 첨가되었다. 상기 현탁액은 부드럽게 흔들어줌으로써 혼합시켰다. 재구성된 생성물의 바이러스 타이터가 결정되었고 이것을 동결건조 이전의 바이러스 타이터와 비교하였다.
가속화된 안정성 검사
제형 GT23의 안정성(표 6 참조)을 31℃, 37℃ 및 45℃에서 측정하였다. 바이러스 타이터는 규칙적으로 관찰되었다. 그 결과는 도 1 내지 3에 나타나 있다.
2. 결과 및 결론:
MVA는 다른 첨가제를 사용하거나 또는 사용하지 않고 동결건조되었다. 첨가제가 포함되지 않은 제형은 불안정한 것으로 나타났다(표 6 참조). 본 명세서에서, 타이터가 0.5 log 이상 떨어지지 않을 때 샘플은 안정한 것으로 간주되었다. 따라서, "일정한 기간동안 일정한 온도에서 안정한"이라는 용어는 상기 온도에서의 바이러스 타이터의 손실이 상기 기간동안 0.5 log 이하인 것을 의미한다. 지시된 온도에서 지시된 기간동안 바이러스 타이터의 손실이 0.5 log 또는 그 이상이라면 제형은 "실패한다(fail)". 덱스트란 및 포도당을 포함하는 제형은 실온에서 매우 낮은 안정성을 보였다. 다른 농도의 수크로스 및 덱스트란을 포함하는 본 발명에 따른 제형은 안정한 것으로 판명되었다. 본 발명에 따른 제형내의 MVA의 안정성은 4℃ 및 실온에서 적어도 25주간이다.
각각의 실험에 대한 상세한 정보는 표 6에 나타나 있다:
표 6에서, 첨가제가 포함되지 않은 제형(표 6, GT1 내지 4)의 안정성은 매우 낮은 것으로 나타났다. 단지 몇 주 후에 이들은 최초 시작 타이터의 0.5 log를 잃어버렸으며, 이런 것은 받아들여질 수 없다.
20%(v/v) DGG를 포함하는 제형은 동결건조 과정 동안 물질이 붕괴되었기 때문에 허용되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 상기 붕괴는 포도당의 낮은 Tc에 의해 설명될 수 있으며, 이것은 높은 Tc(-11℃)를 가지는 덱스트란의 사용에 의해 두드러지게 증가되지는 않았다. 1차 건조를 위하여, 동결건조 장치의 가장 낮은 가능한 온도(-45℃)가 사용되었다. 따라서, 포도당의 Tc 아래로 온도를 떨어뜨리는 것은 가능하지 않다. 30%(v/v) DGG를 포함하는 제형은 붕괴되지 않았다. 이러한 현상은 아마도 높은 전체 덱스트란 함량에 기인하는 것으로 보이며, 이것은 1차 건조를 위해 사용된 온도보다 높은 수치로 Tc를 증가시킨다. 비록 물질이 붕괴되지는 않았지만, 안정성, 특히 실온에서의 안정성은 만족스럽지 않았으며, 이것은 포도당의 낮은 고체 상태 Tc에 기인하는 것으로 보인다(표 6, GT10).
대부분의 실험에서 희석 완충액 1(DSG)이 사용되었다. 상기 첨가제를 사용한 안정화는 매우 우수했다. 수크로스의 높은 Tc(-31℃) 때문에, 붕괴는 상기 제형에서는 문제가 되지 않았다. 동결건조 물질의 안정성은 항상 좋았다(표 6). 제형에서 16.7%, 20%, 23%, 28.6%, 30% 및 40%(v/v) DSG를 사용한 것 사이에 큰 차이는 없었다. 4℃ 및 실온에서의 안정성은 모든 6가지 제형에 대하여 증명되었다. 30% 및 40% DSG를 사용한 동결건조 생성물은 약간 더 나은 안정성을 보였다.
제형들 중 하나(표 6의 GT23 참조)를 가속화된 안정성 검사에서 상세히 분석하였다. 결과는 도 1 내지 도 3에 나타나 있고, 하기 표 5에 요약되어 있다.
온도(℃) 타이터의 손실(실험 데이터) 0.5 log의 손실이 발생한 때(일수)(계산됨)
31 29일에 0.245 log 59
37 35일에 0.321 log 54
45 29일에 0.332 log 44
31℃에서, 상기 백신은 약 1개월 동안 보관되었으며, 여전히 제품사양(specification)을 충족했다(바이러스 타이터의 손실이 0.5 log 보다 작다). 심지어 높은 온도에서도 상기 백신을 한달 이상 동안 보관하는 것이 가능할 수 있으며, 이것은 열대 지역의 경우에는 특히 중요할 것이다.
오래된 천연두 백신에 대하여, WHO는 안정성을 측정하기 위한 방법을 제시하였다. 만일 백신이 37℃에서 4주 이내에 1 log 이하로 손실되면, 4℃에서 보관될 때 적어도 1년동안 안정한 것으로 가정하였다(오래된 백신의 사용을 위한 허용 기준은 1 log 이하의 손실이었다). 상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 GT23 제형은 상기 기준을 충족한다.
실시예 2: 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)의 적정
변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)의 적정은 TCID50에 기초한 분석에서 96-웰(well) 포맷(format)에서 10배 희석액을 사용하여 수행된다. 분석이 끝날때, 감염된 세포는 항-백시니아 바이러스 항체 및 적당한 염색 용액을 사용하여 가시화된다.
2 내지 3일령의 1차 CEF (chick embryo fibroblast) 세포는 7% RPMI에서 1×105세포/㎖로 희석된다. 희석 당 8개의 복제에 대해 10배 희석이 수행된다. 희석에 따라, 96-웰 플레이트의 웰 당 100 ㎕가 접종된다. 이후, 세포는 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양된다.
바이러스를 포함하는 용액의 희석은 우태아혈청(fetal calf serum)이 포함되지 않은 RPMI를 사용하여 (10-1내지 10-12범위로 적절히) 10배 단계로 이루어진다. 이후, 100 ㎕의 모든 바이러스 샘플이 세포를 포함하는 웰에 첨가된다. 상기 96-웰 플레이트는 감염 및 바이러스 복제를 위하여 37℃, 5% CO2에서 5일동안 배양된다.
세포는 감염 후 5일에 백시니아 바이러스 특이적 항체를 이용하여 염색된다. 특이적 항체의 검출을 위하여, 2차 항체와 결합된 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP, horseradish peroxidase)가 사용된다. MVA 특이적 항체는 토끼 폴리클로날(polyclonal) 항-백시니아 바이러스 항체의 IgG 부분이다(Quartett, Berlin, Germany #9503-2057). 상기 2차 항체는 HRP와 결합된 염소 폴리클로날 항-토끼 IgG 항체이다(Promega, Mannheim, Germany, #4011). 발색 반응은 공지된 기술에 따라 수행된다.
상기 발색 반응에서 양성을 보이는 세포를 포함하는 모든 웰들은 TCID50의 계산을 위하여 양성으로 표시된다. 타이터는 스피어만(Spearman, 1) 및 캐르버(Kaerber, 2)의 식을 사용하여 계산된다. 모든 분석 변수들이 일정하게 유지되기 때문에, 하기 간략 식이 사용된다:
a = 모든 8개의 웰이 양성인 마지막 칼럼의 희석 인자
xa= 칼럼 a+1에서 양성인 웰의 수
xb= 칼럼 a+2에서 양성인 웰의 수
xc= 칼럼 a+3에서 양성인 웰의 수
다른 동결건조 제형에서의 폭스바이러스 안정성 데이터
방법 첨가제 동결 1차 건조 2차 건조 안정성
GT1 - -30℃ 까지 압력 : 0.37 mbar선반 온도 :2℃(20시간) 압력 : 0.37 mbar선반 온도 :5℃ (2.5시간)8℃ (1시간)10℃ (2시간) 실온 및 37℃에서 1주일 후 실패
GT2 - -40℃ 까지 압력 : 0.12 mbar생성물 온도 :-13℃(24시간) 압력 : 2.56 mbar생성물 온도 :-4℃(3.5시간)12℃(4시간) 실온 및 37℃에서 11일 후 실패
GT3 - -39℃ 까지 압력 : 0.07 mbar생성물 온도 :-16℃(24시간) 압력 : 0.07 mbar생성물 온도 :-1℃(2.75시간)7℃(3.5시간) 실온에서 23일 후 실패
GT4 - -45℃ 까지 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :-37℃(25.5시간) 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :-3℃(6시간)14℃(26.5시간) 4℃ 및 실온에서 2주일 후 실패
GT6 30% DSG -44℃ 까지 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :-42℃(23시간) 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :5℃(6시간)16℃(25시간) 제형은 안정->4℃, 적어도 34주->실온, 적어도 20주
GT7 23% DSG -44℃ 까지 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :-37℃(22.5시간) 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :0℃(7시간)13℃(24시간) 4℃ 및 실온에서 적어도 46주 동안 제형은 안정
GT8 16.7% 및 23% DSG -42℃ 까지 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :-38℃(24시간) 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :4℃(8시간)17℃(21시간) 4℃ 및 실온에서 적어도 45주 동안 제형은 안정
GT9 30% 및 40% DSG -44℃ 까지 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :-37℃(25.5시간) 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :4℃(6.5시간)17℃(24시간) 30% DSG 포함 제형:안정->4℃, 적어도 57주->실온, 적어도 43주40% DSG 포함 제형:4℃ 및 실온에서 적어도 43주 동안 안정
GT10 30% DSG -35℃ 까지 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :-37℃(23시간) 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :6℃(6.5시간)19℃(24시간) 4℃에서 42주 동안 제형은 안정실온(RT)에서 10주 후에 제형은 실패
GT11 20% DSG -45℃ 까지 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :-41℃(23시간) 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :5℃(4시간)19℃(25.5시간) 4℃에서 56주 후 제형은 실패; RT에서는 14주 후 실패
GT12 30% DSG -40℃ 까지 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :-37℃(24시간) 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :4℃(6시간)17℃(24시간) 4℃에서 적어도 54주 동안 제형은 안정25℃에서 적어도 40주간 안정
GT13 30% DSG -40℃ 까지 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :-38℃(19시간)-15℃(9시간) 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :4℃(15.5시간)17℃(26.5시간) 4℃에서 적어도 36주간 제형은 안정
GT14 30% DSG -40℃ 까지 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :-38℃(21.5시간)-13℃(17.5시간) 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :15℃(6.5시간)18℃(26.5시간) 4℃에서 적어도 50주간 제형은 안정25℃에서 적어도 19주간 안정
GT15 30% DSG -41℃ 까지 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :-37℃(20시간) 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :5℃(3시간)17℃(24.5시간) 4℃에서 49주 후 제형은 실패;25℃에서 적어도 18주간 안정
GT23 30% DSG -40℃ 까지 압력 : 0.12 mbar생성물 온도 :-34℃(21시간) 압력 : 0.04 mbar생성물 온도 :7℃(18시간)17℃(28시간) 데이터는 도 1 내지 도 3의 가속화된 안정성 검사 참조
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 폭스바이러스를 포함하는 제형은 동결건조를 통한 백신의 제조를 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (23)

  1. (1) 오르쏘폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 파라폭스바이러스, 카프리폭스바이러스 및 수이폭스바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 정제된 또는 부분적으로 정제된 폭스바이러스, (2) 이당류 및 (3) 약학적으로 허용되는 폴리머를 포함하는 제형.
  2. 제 1항에 있어서,
    완충액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제형.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 폭스바이러스는 백시니아 바이러스인 것을 특징으로 하는 제형.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스는 엘스트리 균주 및 변형된 백시니아 바이러스 균주 앙카라(MVA)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제형.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폭스바이러스는 재조합 폭스바이러스인 것을 특징으로 하는 제형.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이당류는 수크로스, 락토스 및 트레할로스(trehalose)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제형.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이당류의 농도는 10 내지 100 g/ℓ 범위인 것을 특징으로 하는 제형.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적으로 허용되는 폴리머는 덱스트란 및 PVP (polyvinylpyrrolidon)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제형.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 덱스트란은 30,000 내지 70,000 범위의 분자량 및 1 내지 50 g/ℓ의 농도를 가지는 것을 특징으로 하는 제형.
  10. 제 2항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충액은 포스페이트 완충액이 제외되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제형은 글루탐산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제형.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제형의 붕괴 온도는 -37℃ 내지 -30℃ 범위인 것을 특징으로 하는 제형.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폭스바이러스는 MVA 균주 또는 엘스트리 균주이고, 상기 이당류는 수크로스이며, 상기 폴리머는 덱스트란이고, 또한 상기 완충액은 포스페이트 완충액이 아닌 것을 특징으로 하는 제형.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    백신으로 사용되는 것을 특징으로 하는 제형.
  15. 백신의 제조를 위한 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 제형의 사용 방법.
  16. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 제형이 동결건조되는 것을 특징으로 하는, 폭스바이러스를 포함하는 안정한 조성물의 제조 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    (1) 동결 생성물 매트릭스를 얻기 위하여, 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에서 정의된 제형을 상기 제형의 붕괴 온도보다 낮은 온도로 동결시키는 단계;
    (2) 생성물 매트릭스에 존재하는 물의 승화가 일어나는 낮은 압력 및 상기 제형의 붕괴 온도보다 낮은 생성물 온도하에서 상기 동결된 제형을 1차 건조시키는 단계; 및
    (3) 낮은 압력 및 0℃ 내지 30℃ 범위의 생성물 온도에서 생성물의 잔류 수분이 5%보다 낮아질 때까지 2차 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16항 또는 제 17항의 방법에 의해 제조될 수 있는 동결건조 생성물.
  19. (1) 폭스바이러스, (2) 이당류, (3) 약학적으로 허용되는 폴리머 및 선택적으로는 (4) 완충액을 포함하는 동결건조 생성물로서, 상기 폭스바이러스, 이당류, 폴리머 및 완충액은 제1항 내지 제6항, 제 8항, 제 10항 및 제 11항 중 어느 한 항에서 정의된 것임을 특징으로 하는 동결건조 생성물.
  20. 제 18항 또는 제 19항에 있어서,
    상기 잔류 수분 함량은 1 내지 3% 범위인 것을 특징으로 하는 동결건조 생성물.
  21. 백신의 제조를 위한 제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 동결건조 생성물의 사용 방법.
  22. 제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 동결건조 생성물의 재구성 방법에 있어서, 상기 생성물이 적정량의 약학적으로 허용되는 용매에 용해되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 제형, 제 14항에 따른 백신 또는 제 22항에 따른 방법에 의해 제조된 재구성된 생성물을 이용하여 이를 필요로 하는 인간을 포함하는 동물을 백신화하는 방법.
KR10-2004-7008900A 2001-12-10 2002-11-28 폭스바이러스를 포함하는 제형 및 폭스바이러스를포함하는 안정한 조성물을 제조하기 위한 방법 KR20040074067A (ko)

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Effective date: 20110428