JP4439263B2 - ポックスウイルス含有調合物およびその調製方法 - Google Patents

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ｉ）オルトポックスウイルス、アビポックスウイルス、パラポックスウイルス、カプリポックスウイルスおよびスイポックスウイルス属のうち１つのポックスウイルス、（ｉｉ）ジサッカライド、（ｉｉｉ）薬学的に許容可能なポリマー、および任意に（ｉｖ）緩衝液を含む調合物、特に水性調合物 に関する。この水性調合物は、結果として、安定した、凍結乾燥ポックスウイルス含有調製物となる、凍結乾燥処理にとりわけ好適である。本発明はさらに、凍結乾燥ポックスウイルス含有調製物の調製のための方法、およびそのようにして得られた生成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポックスウイルスには、脊椎動物および無脊椎動物細胞の細胞質内で複製する、複合ＤＮＡの発現ウイルスの大きなファミリーが含まれる。ヒトにおいて、天然痘が今まで、もっとも重要なポックスウイルス感染であった。天然痘の原因物は、オルトポックスウイルス属の１つである、痘瘡ウイルスである。ポックスウイルスのファミリーにおいて、オルトポックスウイルス属の１つである、ワクシニアウイルスが、天然痘に対して免疫する生ワクチンとして使用された。ワクシニアウイルスによる世界的に成功したワクチン接種によって、痘瘡ウイルスの撲滅となった（天然痘の世界的撲滅。天然痘撲滅の証明に関する世界委員会の最終報告書。Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｎｏ．４，Ｇｅｎｅｖａ：Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，１９８０）。同時に、ほとんどの感染痘瘡ウイルスのストックが破壊された。しかしながら、天然痘および天然痘様疾患を含むポックスウイルスが、再び主要な健康問題となる可能性があることは排除できない。したがって、痘瘡ウイルスに基づくワクチンのような、ポックスウイルス感染、特に痘瘡感染に対して安定なワクチンを産出することができることが必要である。
【０００３】
過去、ワクシニアウイルスもまた、組換え体遺伝子発現のため、および組換え体生ワクチンとしての可能性ある使用のために、ウイルスベクターを遺伝子工学的に修飾するためにも使用されてきた（Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｌ．ａｎｄ Ｍｏｓｓ，Ｂ．［１９８２］Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ ７９，７４１５−７４１９；Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｌ．，Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．ａｎｄ Ｍｏｓｓ，Ｂ．［１９８４］ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２，３８３−４０７）。これは、ＤＮＡ組換え体技術を用いて、ワクシニアウイルスのゲノム内へ誘導される外来抗原をコードしているとりわけＤＮＡ配列（遺伝子）が必要である。遺伝子が、ウイルスの生存周期に必須ではないウイルスＤＮＡ内の部位に統合される場合、新規に産出された組換え体ワクシニアウイルスが、感染性になる可能性があり、すなわち、ウイルスが、外来細胞に感染し、したがって、統合ＤＮＡ配列を発現することが可能である（欧州特許ＥＰ ８３２８６号およびＥＰ１１０３８５号）。この方法で調製された組換え体ワクシニアウイルスを、一方では、感染性疾患の予防のための生ワクチンとして、他方では、真核細胞における異種タンパク質の調製のために使用可能である。組換え体ワクシニアウイルスの他の例は、自殺遺伝子、リボザイム遺伝子またはアンチセンス遺伝子のような治療遺伝子を含有するウイルスである。
【０００４】
改変（修飾）ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ；ＭＶＡ）は、特に安全であることが知られている。ＭＶＡは、ニワトリ胎児繊維芽細胞における、ワクシニアウイルス（ＣＶＡ）のアンカラ種の、長期連続継代によって産出されてきた（Ｍａｙｒ Ａ．，Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ−Ｍｉｎｔｚｅｌ，Ｖ．ａｎｄ Ｓｔｉｃｋｌ，Ｈ．［１９７５］ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３，６−１４の概論；スイス特許第５６８，３９２号を参照）。ブタベスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ）の要求に沿って寄託されたＭＶＡウイルス株の例は、寄託番号第ＥＣＡＣＣ Ｖ９４０１２７０７号にて、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ（ＵＫ）にて寄託されたＭＶＡ ５７２、および寄託番号ＥＣＡＣＣ Ｖ００１２０７０７にて寄託されたＭＶＡ５７５、および寄託番号ＥＣＡＣＣ Ｖ０００８３００８号のＭＶＡ−ＢＮである。
【０００５】
ＭＶＡは、弱毒性が大きいために、すなわち良好な免役原性を維持しながらの病原性または感染性の減少によって区別される。ＭＶＡウイルスは、野生型ＣＶＡ株と比較して、ゲノム内での修飾を決定するために解析されてきた。合計３１，０００塩基対のゲノムＤＮＡの６つの主な欠失（欠失Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩ）が同定された（Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．，Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍａｙｒ Ａ．［１９９１］Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１０３１−１０３８）。得られたＭＶＡウイルスは、鳥類細胞への、強い宿主細胞制限となる。さらに、ＭＶＡは、その極度の弱毒性によって特徴づけられる。種々の動物モデルで試験する場合、ＭＶＡは、免疫抑制動物においてでさえ、無発病性であると証明された。より重要なことは、ＭＶＡ株の優れた特性が、広範囲の臨床試験で示されてきたことである（Ｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．，Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．Ｉ，Ａｂｔ．Ｏｒｇ．Ｂ １６７，３７５−３９０［１９８７］、Ｓｔｉｃｋｌ ｅｔ ａｌ．，Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２［１９７４］）。高リスクの患者を含む、１２０，０００人以上のヒトでのこれらの試験の間、ＭＶＡワクチンの使用に関して、なんの副作用もなかった。ワクチンとして有用な組換え体ＭＶＡがすでに構築されており（国際特許第ＷＯ９７／０２３５５号）、臨床試験で使用されている。国際特許第ＷＯ９８／１３５００号は、デングウイルス抗原をコードしているＤＮＡ配列を含み、発現可能である組換え体ＭＶＡを開示している。外来ＤＮＡの発現配列を、ＭＶＡゲノム内の天然に存在する欠失の部位にて、ウイルスＤＮＡ内に組み換えた。強い弱毒性および増強された安全性特性を示しているＭＶＡ株が、株ＭＢＡ−ＢＮであり、寄託番号第Ｖ００８３００８号にて、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫにて寄託されている。
【０００６】
ワクシニアウイルスの他に、その他のポックスウイルスが、哺乳動物細胞内へ遺伝的情報を伝達するために、ベクターとして使用されてきた。これに関連して鶏痘（ホウル）ポックスウイルスのようなアビポックスウイルス類の参考文献が作成される。ゲノム内にＨＩＶ遺伝子を含むホウルポックスウイルスは、米国特許第５，７３６，３６８号および第６，０５１，４１０号にて開示されている。
【０００７】
ワクチンとして好適な調製物を含むポックスウイルスを調製するための工程は、当業者に公知である（例えば、Ｊｏｋｌｉｋ Ｗ．Ｋ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９６２），１８，９−１８；Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｋ．Ｈ．，Ａｂｈａｎｄｌｕｎｇｅｎ ａｕｓ ｄｅｍ Ｂｕｎｄｅｓｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔｓａｍｔ（１９７０），９，５３−５７）。公知の精製により、溶液を含む水性のポックスウイルス、または沈殿物を含むポックスウイルスが得られる。これらの溶液および沈殿物内のポックスウイルスは安定しておらず、すなわちウイルスの感染性が急速に減少する。しかしながら、特にワクチンを、流通構造が限定されている熱帯領域にて輸送する必要がある場合に、ワクチンを安定した形態で保存し、分配可能であることが必要である。凍結乾燥生成物は、４℃〜２５℃の範囲での温度にて保存可能である。これは、−２０℃以下で保存する必要のある、液体調合物のための標準の保存条件と比較して、明らかな利点である（「低温保存と凍結乾燥プロトコール（Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）」、Ｄａｙ Ｊ，ＭｃＬｅｌｌａｎ Ｍ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３８，１９９５，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）。
【０００８】
ポックスウイルス、特にワクシニアウイルスの凍結乾燥のための工程、および本目的のために好適な調製物および溶液を含むウイルスは、公知である（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９），１６，１−８３）。一般的な用語で、ワクチンの凍結乾燥には、凍結乾燥のために好適な水性調合物を含むワクチンの凍結、続く減圧、低温条件下での、昇華による水の除去、さらに続く減圧および高温条件下での脱離による水の除去が含まれる。
【０００９】
凍結乾燥のための公知のポックスウイルス含有調合物は、非常に不利な点を持つ。凍結乾燥のための調製物を含む多くの公知のワクシニアウイルスは、ペプトンまたはヘマセルを含み、これらはしばしば動物由来である。しかしながら、ＢＳＥのような動物疾患が、ペプトン、ゼラチンまたはヘマセルのような動物生成物を介して、動物からヒトへ伝播する可能性がある懸念が存在する。さらに、凍結乾燥のための調合物を含む公知のウイルスにおけるポックスウイルスは精製されてきていない。したがって、本技術分野で公知の凍結乾燥のための調製物を含むポックスウイルスは、とりわけ多量の、それぞれ細胞または組織培養の細胞から、および細胞培養の間に使用したウシ血清から由来するタンパク質を含む。
【００１０】
当業者にはまた、動物由来の添加化合物（例えばペプトンまたはヘマセル）を含まない凍結乾燥調製物は既知である。この場合、調製物は、以下の化合物のみ、または特定の組み合わせで含む。グルタミン酸ナトリウム、ソルビトール、ラクトース、塩、アミノ酸およびグリセリン。しかしながら、凍結乾燥工程の後に得られた生成物はしばしば不安定であり、すなわちウイルスタイターの総欠損が、保存の間受け入れがたいほど高い。さらに、ポックスウイルスは、これらの調合物のいくつかの場合に凝集を形成すること、および他の化合物が、凍結の前または間に沈殿することが示されてきた。
【００１１】
米国特許第３，５７７，５２６号は、スクロース内に分散したワクチンの粉末ウイルス物質を作り出すという事実によって特徴づけられる、天然痘ワクチンを開示している。スクロースの量は、２０〜４０％の範囲である。本調合物はさらに、５％デキストランを含む。用語粉末ウイルスは、パルプおよび小膿疱から由来するウイルスを意味する。基本的に、固まりを崩壊させ、死髪および皮膚から脂肪を分離するために、リンパ液が粉末化される。したがって、ワクチン調製物のタンパク質負荷が非常に高く、ウイルスの安定化に寄与する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
安定な凍結乾燥生成物を導く凍結乾燥のための、ポックスウイルス含有調合物、特に水性ポックスウイルス含有調合物 を提供することが本発明の目的であり、この際 、ポックスウイルスは好ましくは精製されるか、または少なくとも部分的に精製されたウイルスである。ポックスウイルスが凝集する傾向になく、化合物が凍結の前、または間に沈殿することのない、水性ポックスウイルス調合物を提供することが、本発明のさらなる目的である。少量の非ポックスウイルス関連タンパク質を含む、ポックスウイルス含有調合物 、特に水性ポックスウイルス含有調合物 を提供することが、本発明のさらなる目的である。安定な、凍結乾燥ポックスウイルス含有調製物、および前記調製物を得るための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ポックスウイルス含有調合物、特に水性ポックスウイルス含有調合物 を提供する。前記調合物 、特に水性調合物 は、前記ポックスウイルスの凍結乾燥に好適であり得る。さらに、本発明は、凍結乾燥、ポックスウイルス含有生成物を提供する。本発明による調合物、特に水性調合物は、ポックスウイルス、ジサッカライド、薬学的に許容可能なポリマーおよび任意にさらに緩衝液を含む。本発明による凍結乾燥調合物は、ペプトン、ゼラチン、ヘマセルのような動物由来の安定化添加物を含まず、（細胞培養系のような）ウイルスを増幅するために使用した系から由来した多量のタンパク質を含まないが、調合物内のウイルスは、驚くべきことに安定であり、すなわち凍結乾燥調製物中のポックスウイルスが、室温または３７℃のような高い保存温度においてでさえ、長期間感染性のままである。
【００１４】
他に言及しない限り、本明細書で使用するところの用語「室温（ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）」は、２０〜２５℃の温度に相当する。
【００１５】
凍結乾燥すべきポックスウイルスは、オルトポックスウイルス類、パラポックスウイルス類、アビポックスウイルス類、カプリポックスウイルス類およびスイポックスウイルス類からなる群より選択した任意のポックスウイルスである。これらのウイルスは、ヒトまたは動物に対するワクチンとして有用であり得る（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３^ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ｅｄ．ｉｎ Ｃｈｉｅｆ：Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．）。とりわけ好ましいポックスウイルスは、オルトポックスウイルス属およびアビポックスウイルス属のウイルスである。アビポックスウイルスに属しているポックスウイルスの好ましい例は、カナリア痘（カナリポックス）ウイルスおよびホウルポックスウイルスである。オルトポックスウイルスファミリーに属している好ましい例は、牛痘（コウポックス）ウイルスおよびワクシニアウイルスである。
【００１６】
本発明による調合物に含まれるポックスウイルスは、天然に存在するポックスウイルス、弱毒化ポックスウイルスまたは組換え体ポックスウイルスでありうる。
【００１７】
天然痘に対するヒトのワクチン接種のために、調合物内のポックスウイルスは、好ましくはワクシニアウイルス株である。この目的のために好適なワクシニアウイルス株の例は、株Ｔｅｍｐｌｅ ｏｆ Ｈｅａｖｅｎ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｐａｒｉｓ、Ｂｕｄａｐｅｓｔ，、Ｄａｉｒｅｎ、Ｇａｍ、ＭＲＩＶＰ、Ｐｅｒ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、ＴＢＫ、Ｔｏｍ、Ｂｅｒｎ、Ｐａｔｗａｄａｎｇａｒ、ＢＩＥＭ、Ｂ−１５、Ｌｉｓｔｅｒ、ＥＭ−６３、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｅｌｓｔｒｅｅ、ＩｋｅｄａおよびＷＲである。もっとも好ましいワクシニアウイルス株は、修飾ワクシニアウイルス株アンカラ（Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）およびその誘導体であり、とりわけ、番号第Ｖ０００８３００８号にてＥＣＡＣＣに寄託された株、および株Ｅｌｓｔｒｅｅである。
【００１８】
本発明による調合物内のポックスウイルスは、好ましくは、ワクチン接種すべき動物または対象内で、十分病原性ではないポックスウイルスである。この目的のために、弱毒化ウイルス株を使用するか、またはワクチン接種されるべき種からは異なる宿主種で、本来複製し、異種宿主内では病原性ではないポックスウイルスを使用するか、いずれかが好ましい。
【００１９】
「弱毒化ウイルス（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）」は、病原性ウイルスから由来するが、宿主生物の感染に際して、非弱毒化親ウイルスにくらべてより低い死亡率および／または疾病率を導くウイルスである。弱毒化ポックスウイルスの例は、当業者に公知である。もっとも好ましいのは、修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）である。典型的なＭＶＡ株は、それぞれ寄託番号第ＥＣＡＣＣ Ｖ００１２０７０７号および第ＥＣＡＣＣ Ｖ９４０１２７０７号にて、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された、ＭＶＡ５７５およびＮＶＡ５７２である。もっとも好ましいのは、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体であり、国際特許第ＷＯ０２／４２４８０号（ＰＣＴ／ＥＰ０１／１３６２８）にて記述された。この明細書の内容は、本明細書に、参考文献にて含まれている。ＭＶＡ−ＢＮは、寄託番号第ＥＣＡＣＣ Ｖ０００８３００８号にて、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓにて寄託された。
【００２０】
ヒトが異種宿主であり、ヒトにおいて病原性ではないポックスウイルスの例は、ホウルポックスウイルスまたはカナリポックスウイルスである。
【００２１】
用語「組換え体ウイルス（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓ）」は、ウイルスゲノム内に、ウイルスゲノムのもとからある部分ではない異種の遺伝子が挿入されている任意のウイルスを意味する。異種遺伝子は、治療的遺伝子、免疫応答を誘導するための、少なくとも１つのエピトープを含むペプチドをコードしている遺伝子、アンチセンス発現カセット、またはリボザイム遺伝子でありうる。組換え体ウイルスを構築するための方法は、当業者に公知である。もっとも好ましいポックスウイルスベクターはＭＶＡであり、特にＭＶＡ５７５およびＭＶＡ−ＢＮである（上記を参照のこと）。
【００２２】
ポックスウイルスがどのようにして複製し、感染細胞培養から回収されうるかは当業者に公知である。一般的に、第一段階で、真核細胞に、本発明による調合物の部分であることを意図するポックスウイルスを感染させる。前記真核細胞は、それぞれのポックスウイルスに感染しやすく、感染ウイルスの複製および産出を可能にする細胞である。そのような細胞は、すべてのポックスウイルスに関する技術分野の当業者に公知である。ＭＶＡに関して、この種類の細胞に関する例は、ニワトリ胎児繊維芽細胞（ＣＥＦ）（Ｄｒｅｘｌｅｒ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８），７９，３４７−３５２）である。ＣＥＦ細胞は、当業者に公知の条件下で培養可能である。好ましくは、ＣＥＦ細胞を、血清フリーの培地内で培養する。インキュベーション時間は、好ましくは３７℃±２℃で、４８〜９６時間である。感染のために、ポックスウイルスを、０．０５〜１ ＴＣＩＤ_５０（ＴＣＩＤ＝組織培養感染用量）の感染多重度（ＭＯＩ）にて使用し、インキュベーションを、同じ温度にて４８〜７２時間実施する。
【００２３】
感染の進展は、細胞変性効果（ＣＰＥ）、典型的には感染細胞の有意な円形化を見ることによって観察可能である。
【００２４】
ポックスウイルスに、２つの異なる形態、感染細胞の細胞質内で、細胞膜に接着するポックスウイルス（細胞内成熟ビリオン（ＩＭＶ））、および外在したウイルス（細胞外エンベロープビリオン（ＥＥＶ））が存在することが知られている（Ｖａｎｄｅｒｐｌａｓｓｃｈｅｎ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７９，８７７−８８７）。両方のウイルス形態が、本発明による調合物内で使用可能である。ＥＥＶは、遠心分離によって、上清みから簡単に得ることができ、またジサッカライドおよび薬学的に許容可能なポリマーを含む水性調合物中に直接懸濁しうる。しかしながら、ウイルス含有画分は、細胞残留物および他の混入物を含みうる。特にヒトのワクチン接種のために、ウイルスが本発明の調合物に含まれる前に、さらに精製されることが好ましい。ポックスウイルスの精製のための方法は、当業者に公知である。精製段階は、例えばバッチ式遠心分離（例えばスクロースクッションを使用する）、または連続フロー超遠心（スクロース勾配）、限外ろ過（例えば５００ｋＤａより大きいが０．１μｍ以下の孔径を持つ膜を用いるクロス−フロー濾過）、カラムクロマトグラフィー（例えばイオン交換、疎水性相互作用、サイズ排除または組み合わせ）、または上記のいくつかまたはすべての組み合わせでありうる（Ｍａｓｕｄａ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９８１）１４７，１０９５−１１０４）。
【００２５】
ＩＭＶｓを得るために、細胞を、第一段階で回収し、第二段階で破砕しなければならない。感染細胞が、懸濁培養液中で培養できる場合、感染細胞は、遠心によって簡単に回収可能である。感染細胞が、ほぼ無傷な接着細胞の場合、細胞を破砕段階にかける前に、細胞を回収、すなわち培養バイアルより細胞を除去することが可能である。回収方法は、当業者に公知である。有用な技術は、機械的な方法（例えばゴム製細胞スクレーパーを使用することによる）、物理的方法（例えば１５℃以下に凍結し、培養容器を＋１５℃以上で融解する）、または生化学的方法（細胞を培養容器から脱離させるために、例えばトリプシンのような酵素で処理する）である。酵素をこの目的のために使用する場合、酵素がまた、長期間のインキュベーション時間の後に、ウイルスに障害を与える可能性があるので、インキュベーション時間を制御すべきである。
【００２６】
細胞の破砕のための方法がまた、当業者に公知である。前述した凍結−融解方法により、すでに部分的な細胞の破砕ができている。細胞の破砕のための他の方法には、超音波の使用が含まれる。細胞の超音波処理により、ウイルス含有ホモジネートができる。
【００２７】
動物のワクチン接種のために、ポックスウイルス含有ホモジネートを、本発明による調合物で使用可能である。しかしながら、少なくとも部分的に精製されたポックスウイルスを使用することが、さらに好ましい。以上で概略したような精製方法は、当業者に公知である。
【００２８】
ポックスウイルスは、１０^４〜１０^９ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの濃度範囲、好ましくは例えば１０^５〜５×１０^８ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの濃度範囲、もっとも好ましくは１０^６〜１０^８ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの濃度範囲で、調合物、特に水性調合物 中に含まれる。実際の濃度は、ヒトまたは動物に対して投与すべきウイルスの量に依存し、言い換えれば投与すべきウイルスの種類に依存する。ワクシニアウイルス株Ｅｌｓｔｒｅｅに関して、ヒトに対する典型的なワクチン接種用量は、２．５×１０^５ ＴＣＩＤ_５０を含む。ワクシニアウイルスＭＶＡ−ＢＮに関しては、ヒトに対する典型的なワクチン接種用量は、１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０を含む。
【００２９】
以上で指摘したように、本発明の調合物による調合物中のポックスウイルスは、好ましくは精製された、または少なくとも部分的に精製したウイルスである。用語「精製された、または少なくとも部分的に精製されたウイルス」は、本発明による調合物中で使用したウイルスが、（米国特許第３，５７７，５２６号にて開示されたような）天然痘の撲滅まで使用されたワクチンで使用したような、未精製ウイルス（「丸ウイルス（ｇｒｏｕｎｄ ｖｉｒｕｓ）」のものよりも高い純度を持つことを意味する。そのようなより高い純度は、例えば１つ以上の以下の方法、（例えばスクロースクッションを用いる）バッチ式遠心または連続−フロー超遠心（スクロース勾配）、限外ろ過（例えば５００ｋＤａより大きいが０．１μｍ以下の孔径を持つ膜を用いるクロス−フロー濾過）、カラムクロマトグラフィー（例えばイオン交換、疎水性相互作用、サイズ排除または組み合わせ）によって得ることが可能である。とりわけ好ましいのは、限外ろ過および／またはスクロースクッションを用いることによるバッチ遠心である。より一般的な用語にて、用語「精製された、または少なくとも部分的に精製されたウイルス」は、総タンパク質ｍｇあたり少なくとも１０^６、好ましくは少なくとも１０^７、より好ましくは少なくとも１０^８、さらにより好ましくは５×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のタイターを持つ、（ＭＶＡまたはＥｌｓｔｒｅｅを含む調製品のような）ウイルス調製品を意味する。株Ｅｌｓｔｒｅｅの典型的な調製品は、総タンパク質ｍｇあたり８×１０^８ ＴＣＩＤ_５０のタイターを持つ。ポックスウイルス含有調製品のタイターを決定する方法は、当業者に公知であり、これらの方法の１つを、実施例項にて概略する。総タンパク質含量は、好ましくはＫｊｅｌｄａｈｌ（Ｌｙｎｃｈ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｂａｒｂａｎｏ，Ｄ．Ｍ．，「日用品におけるタンパク質決定のための参照方法としての、Ｋｊｅｌｄａｈｌ窒素解析（Ｋｊｅｌｄａｈｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｓ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｄａｉｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．）」Ｊ ＡＯＡＣ Ｉｎｔ．１９９９ Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；８２（６）：１３８９−９８、概略）の方法にしたがって決定される。総タンパク質含量は、ウイルスタンパク質および細胞タンパク質の合計であることを注意すべきである。
【００３０】
未精製ウイルス調製品内の多量の非ウイルスタンパク質が、先行技術調合物の安定性に寄与していたと考えられたので、精製した、または部分的に精製したウイルス、ジサッカライドおよび薬学的に活性なポリマーを含む調合物が安定であることは思いがけないことであった。
【００３１】
本発明による調合物、特に水性調合物 は、ジサッカライドを含む。凍結乾燥の間、良好な生物保護性を与えるが、低い崩壊温度を持ち、しばしば崩壊をともなって凍結乾燥される、グルコースのようなモノサッカライドと比較して、ジサッカライドは、モノサッカライドに比べてより高い崩壊温度を示している、効果的な凍結乾燥保護材であることが示されてきた。
【００３２】
本発明による調合物に含まれるジサッカライドは、約−２５℃〜−３５℃の範囲の崩壊温度（Ｔｃ）を持つ、薬学的に許容可能なジサッカライドである。典型的な崩壊温度は、スクロースに関して−３１℃、トレハロースに関して−２８．５℃、およびラクトースに関して−３０．５℃である。本発明による全調合物に関する典型的な崩壊温度は、好ましくは、−５０℃〜−２０℃の範囲である。好ましい副範囲は、例えば３７℃〜−３０℃、−３６℃〜−３１℃、または−３５．７℃〜−３１．２℃である。
【００３３】
好ましいジサッカライドは、トレハロース、ラクトースおよびスクロースからなる群より選択される。もっとも好ましいのはスクロースである。ジサッカライド、好ましくはスクロースが、好ましくは１０〜１００ｇ／ｌの範囲、より好ましくは２０〜８０ｇ／ｌの範囲、もっとも好ましくは２５〜６０ｇ／ｌの範囲で、本発明による調合物、特に水性調合物 中に含まれる。スクロースに関して、典型的な濃度は、４５ｇ／ｌである。
【００３４】
本発明による調合物、特に水性調合物 はさらに、薬学的に許容可能なポリマーを含む。ポリマーは、好ましくは、デキストランおよびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）からなる群より選択される。使用するポリマーは、本発明による調合物内で可溶性であるべきである。デキストランを使用する場合、その分子量は、好ましくは２０，０００〜１００，０００の範囲、より好ましくは３０，０００〜７０，０００の範囲、もっとも好ましくは３６，０００〜４４，０００の範囲である。もっとも好ましいデキストランは、平均分子量４０，０００である。デキストランの濃度は、１〜５０ｇ／ｌの範囲、好ましくは２〜４０ｇ／ｌまたは３〜３０ｇ／ｌの範囲である。好ましいよい結果が、５〜５０ｇ／ｌ、５〜４０ｇ／ｌ、または５〜３０ｇ／ｌの範囲で観察された。またより好ましくは、８〜３０ｇ／ｌの範囲である。もっとも好ましい範囲は、１０〜２７ｇ／ｌである。好ましい濃度に関する例は、１８．９ｇ／ｌである。以上で示したようなデキストランの好ましい濃度および濃度範囲、とりわけ５〜５０ｇ／ｌの範囲および相当する副範囲は、調合物の崩壊温度が、比較的高いという特定の利点を持ち、工業規模で工程を実施することを可能にする。ＰＶＰを使用する場合、その分子量は、好ましくは、５０，０００〜４００，０００の範囲、より好ましくは７０，０００〜３６０，０００の範囲である。ＰＶＰの濃度は、５〜２００ｇ／ｌの範囲、より好ましくは５〜１００ｇ／ｌの範囲、もっとも好ましくは１０〜４０ｇ／ｌの範囲である。
【００３５】
本発明による調合物、特に水性調合物は、さらに緩衝液を含みうる。以上で指摘したように、ポックスウイルスが凝集せず、乾燥に際して沈殿が起きない水性ポックスウイルス含有調合物を提供することが本発明の目的の１つであった。予期せず、そのような望まない効果が、水性調合物内のリン酸を含む緩衝液の存在と相関することが示されてきた。リン酸含有緩衝液の例は、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）およびリン酸緩衝液である。結果として、本発明の特定の目的は、リン酸緩衝液を含まない凍結乾燥のための水性調合物によって解決される。したがって、本発明による調合物内に含まれる緩衝液は、好ましくは、ＴＲＩＳ、ＴＢＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳおよび（重）炭酸緩衝液からなる群より選択される。もっとも好ましい緩衝液は、ＴＲＩＳおよびＴＢＳである。
【００３６】
緩衝液は、必要な緩衝能を与えるのに十分である濃度で使用する。ＴＲＩＳ緩衝液に関して、好ましい濃度範囲は、１〜５０ｍＭであり、もっとも好ましい濃度は１０ｍＭである。ｐＨは好ましくは、一方でヒトまたは動物における投与のために薬学的に許容可能であり、他方で、ウイルスに対して有害ではない値に調節する。したがって、ｐＨは、６．０〜９．０の範囲、より好ましくは７．２〜７．８の範囲であるべきである。もっとも好ましいｐＨは７．４である。
【００３７】
リン酸を含まない緩衝液を用いることによる、予期せぬ良好な結果が、調合物内のウイルスが未精製、精製または部分的に精製されたウイルスであるかどうかにかかわらず得られた。精製または部分的に精製したウイルスが好ましい。
【００３８】
本発明による調合物、特に水性調合物 は、ＮａＣｌのような塩を含みうる。ＮａＣｌに対する典型的な濃度は、１０〜２００ｍＭの範囲である。好ましいＮａＣｌ濃度に関する例は、１４０ｍＭである。
【００３９】
本発明による調合物、特に水性調合物 はさらに、Ｌ−グルタミン酸塩を含みうる。塩は、好ましくは一カリウム塩または一ナトリウム塩である。Ｌ−グルタミン酸塩の濃度は、好ましくは０．０５〜０．５ｇ／ｌの範囲、より好ましくは０．１〜０．１５ｇ／ｌの範囲である。
【００４０】
本発明によるいくつかの特に好ましい水性調合物を、以下の表１で列記する。表１で列記したすべての調合物 において、緩衝液は、１０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ ＮａＣｌである。
【００４１】
【表１】
【００４２】
本発明による水性調合物は、凍結乾燥に好適である。投与のために、凍結乾燥品は、適切な溶媒によって再構成されなければならない。１つの実施様態にしたがって、化合物を水溶液に移すために、無菌水を凍結乾燥品に加える。好ましくは、加える水の量は、凍結乾燥の間に除去される水量とほぼ一致する。したがって、本実施様態にしたがって、再構成生成物の組成は、初期水性調合物とほぼ一致する。したがって、本発明による水性調合物 をワクチンとして使用することが、本発明の範囲内である。他の実施様態にしたがって、凍結乾燥品はまた、適切な量で使用しうる、任意の他の薬学的に許容可能な希釈液中で再構成しうる。本例の方法によって、希釈液は、フェノール、グリセロールおよび緩衝液から選択した１つ以上の化合物を含む水であり得る。再構成生成物中のフェノールの濃度は、例えば０．５％である。以上で指摘したように、緩衝液は好ましくは、リン酸緩衝液ではない。
【００４３】
まとめると、本発明の本観点はとりわけ、以下の特に好ましい実施様態に関する。（Ｉ）オルトポックスウイルス、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルスおよびスイポックスウイルスからなる群より選択した、精製した、または部分的に精製したポックスウイルス、ジサッカライド、薬学的に許容可能なポリマーおよび任意に緩衝液を含むか、またはからなる、調合物、特に水性調合物であり、この際 緩衝液は、好ましくはリン酸緩衝液ではない。好ましくは前記ポリマーは、好ましくは以上で特定したような量での、デキストランである。（ＩＩ）オルトポックスウイルス、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルスおよびスイポックスウイルスからなる群より選択したポックスウイルス、ジサッカライド、薬学的に許容可能なポリマーおよび任意に緩衝液を含むか、またはからなる、調合物、特に水性調合物であり、この際 緩衝液は、好ましくはリン酸緩衝液でなく、ポックスウイルスが好ましくは精製した、または部分的に精製したウイルスである。好ましくは前記ポリマーは、好ましくは以上で特定したような量での、デキストランである。（ＩＩＩ）オルトポックスウイルス、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルスおよびスイポックスウイルスからなる群より選択したポックスウイルス、ジサッカライド、薬学的に許容可能なポリマーおよび任意に緩衝液を含むか、またはからなる、調合物、特に水性調合物であり、この際 ポリマーは、以上で特定したような、例としては好ましくは５〜４０ｇ／ｌの範囲である量でのデキストランである。好ましくは緩衝液はリン酸緩衝液ではない。好ましくは、ポックスウイルスは精製された、または部分的に精製されたウイルスである。
【００４４】
以上の選択肢（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の文中で使用するところの用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」は、上述した化合物のみからなる調合物、およびさらに１つ以上の塩を含む調合物 に関する。以上で定義した化合物からなる調合物（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）に添加しうる塩の例は、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、グルタミン酸ナトリウムである。したがって、以上で定義した調合物（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の定義中の用語「からなる」は、１つ以上の塩を含む可能性を除外しない。
【００４５】
例として、本発明の特定の実施様態は、オルトポックスウイルス、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルスおよびスイポックスウイルスからなる群より選択した、精製した、または部分的に精製したポックスウイルス、ジサッカライド、薬学的に許容可能なポリマーおよび緩衝液を含む水性調合物を含み、そこでジサッカライドは、以上で特定した量でのスクロースであり、前記ポリマーは、以上で定義した量のデキストランであり、前記緩衝液はリン酸緩衝液ではない。例として、本発明の他の特定の実施様態は、オルトポックスウイルス、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルスおよびスイポックスウイルスからなる群より選択したポックスウイルス、ジサッカライド、薬学的に許容可能なポリマーおよび任意に緩衝液を含む水性調合物を含む。ポックスウイルスは好ましくは精製された、または部分的に精製されたポックスウイルスである。ジサッカライド、ポリマーおよび緩衝液の好ましい量および例は、以上で概略している。
【００４６】
ポックスウイルスを含むそのような調合物、特に水性調合物 をどのように投与可能か、どのような量のウイルスをワクチン接種に使用するかは、当業者の技術の範囲内である。以上で指摘したように、ワクチンは、とりわけ弱毒化または非病原性、非組換え体ポックスウイルスを使用する場合に、ポックスウイルス自体に対する免疫応答を誘導するために使用しうる。ポックスウイルスが組換え体ポックスウイルスである場合、免疫応答が、ポックスウイルスベクターによって発現された組換え体タンパク質／ペプチドに対して、さらに発生する。
【００４７】
以上で使用したような用語「調合物（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」は、他に言及しない限り、液体調合物、好ましくは水性調合物を意味する。濃度または濃度範囲は、「ｍＭ」、「ｇ／ｌ」で定義され、そこで、これは、それぞれの調合物が液体または水性調合物 であることの示唆である。用語「水性調合物」は、希釈液が水であるような調合物を意味する。しかしながら、本発明の目的はまた、液体を除去することによって、本発明の液体または水性調合物から得ることが可能な乾燥調合物 もカバーしており、前記除去のために使用した方法には関わらない。したがって、本発明は、凍結乾燥以外の方法によって得る乾燥調合物をカバーする。
【００４８】
とりわけ、本発明はさらに、本発明の調合物、特に水性調合物 を凍結乾燥することを特徴とする、安定な、ポックスウイルス含有調製物を調製するための方法に関する。本発明の明細書にて、用語「安定な、ポックスウイルス含有調製物（ｓｔａｂｌｅ，ｐｏｘｖｉｒｕｓ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」および「凍結乾燥ポックスウイルス含有調製物（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ ｐｏｘｖｉｒｕｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、他に言及しない限り、相互互換的に使用される。用語「安定な、ポックスウイルス含有調製物」は、２８日間の間、３７℃でのインキュベーション温度でのウイルスタイターの総欠損が、０．５ログ以下、好ましくは０．４ログ以下である、ポックスウイルス含有調製物を定義するために使用する。ウイルスタイターを測定するための詳細なプロトコール、したがって、ウイルスタイターの総欠損を実施例項で示す。しかしながら、ウイルスタイターを決定するための任意の他のプロトコールも使用可能である。
【００４９】
凍結乾燥の方法は、一般的に当業者に公知である（Ｄａｙ，Ｊ．ａｎｄ ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，（１９９５）ｖｏｌ．３８）。
【００５０】
凍結乾燥工程は通常、以下の段階からなり、さらに詳細に以下で説明する。
１．ワクチン調製
２．試料凍結
３．第一乾燥（昇華）
４．第二乾燥（脱離）
５．生成物密封および移動（removal）
６．ワクチン保存
７．再構成
ワクチン調製：ワクチンとして使用すべきポックスウイルスの産出および増幅は、以上で詳細に説明してきた。ポックスウイルスは任意に精製される。本発明による調合物は、以上で定義したジサッカライド、ポリマーおよび任意に緩衝液、Ｌ−グルタミン酸および任意にさらなる添加物を、ポックスウイルス調製品に加えることによって得る。
【００５１】
試料凍結：
試料の凍結は、溶液中で成分を固定化し、それによって、圧力を低下させた時の生成物の発泡を予防する。凍結は、水をまず核とし、続いて氷結晶が発達し、結果として氷と溶質濃縮物の混合物となる、二段階工程である。温度を減少させ、冷却した懸濁液を撹拌することによって氷核化が促進される。核化と対照的に、温度を上昇させ、それによって懸濁液粘度を減少させることによって、氷の発達が促進される。正確な凍結パターンにかかわらず、培地全体での氷の増殖により、結果として、溶質濃度が増加する。溶液中または懸濁液中のバイオポリマー類は、これらの溶質の濃度の増加への曝露によってダメージを受けるか、不活性化する。急速な冷却によって、生物生成物の濃縮物への曝露が最小化される。臨界温度（ガラス転移温度）以上で、重量粘度が、ガラスが軟化および歪曲するのに十分な程減少しうる。これを乾燥させ、バイアル内で、無型の粘着性残余物が形成される。歪曲化の温度は、崩壊温度と言われる。より特別には、崩壊温度は、マトリックスの間質領域中の水の移動度が顕著になる温度として定義される。歪曲化をさけるために、凍結温度は、水性調合物の崩壊温度より低くなるべきである。崩壊温度は、例えば異なる温度解析によってのような、当業者に公知の方法によって決定可能である（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｔ．Ａ．，「凍結乾燥、紹介と基本的原理（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．）」Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ，ＵＳ，１９９９，ＩＳＢＮ １−５７４９１−０８１−７、ページ１３２−１３４）。
【００５２】
温度が低すぎる場合、ウイルスからの水拡散が阻害され得、細胞内氷による損害が起こりうる。結果として、当業者は、水性調合物の崩壊温度以下であるいくつかの凍結温度を実験的に試験し、感染性ポックスウイルスの最も高いタイターを持つ、凍結乾燥生成物を導く温度を試験する。
第一乾燥（昇華）：
第一乾燥は、溶媒（氷）の凍結マトリックスからの昇華を促進する凍結乾燥工程の部分である。第一乾燥工程は、凍結乾燥器が、必要なコンデンサー温度およびチャンバー圧に達した後に開始する。チャンバー内の圧力は通常１ｍｂａｒより低く、好ましくは０．２ｍｂａｒより低い。典型的に、圧力は、０．０４〜０．１２ｍｂａｒの範囲である。本明細書において、これらの条件は時折、「低圧（ｌｏｗ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）」と呼ばれる。
【００５３】
棚温度は、生成物マトリックス中の氷の昇華が起こるように増加し、生成物温度が、全第一乾燥工程を通して、完全にマトリックスが凍結されることを確実にし、崩壊なしの凍結乾燥を確実とするために、調合物の崩壊温度より有意に低い温度である。温度は、全第一乾燥工程の間、一定の間、そのままでありうる。あるいは、棚温度は、第一乾燥の間、一定に増加しうる。しかしながら、生成物の温度は、全第一乾燥工程の間、崩壊温度以下でなければならない。第一乾燥の終わりで、乾燥生成物は、まだ、５％以上の湿度（ｗ／ｗ）を含みうる。生物学的増殖または化学反応をもはやサポートしない湿度を持つ生成物を得るために、第二乾燥段階を実施する必要がある。
第二乾燥（脱離）：
第二乾燥の間、水蒸気を、第二乾燥の間に形成したケーキの表面より脱離させる。これは、水がケーキ表面より脱離するように、チャンバーがまだ定圧であるまま、温度をあげることによって達成される。
【００５４】
第二乾燥のための棚温度は、生成物の安定性によって決定され、０℃〜＋３０℃の範囲であり得る。生成物温度は通常、−５℃〜３０℃である。より好ましくは、温度は、５℃〜２０℃である。第二乾燥は２段階で行いうる。第一段階で、生成物温度は、−５℃〜＋１５℃であり、好ましくは０℃〜＋１０℃の範囲であり、より好ましくは２℃〜＋７℃の範囲である。第二段階は、第一段階の第二乾燥よりも高い温度で行う。温度は、０℃〜３０℃の範囲、好ましくは＋５℃〜＋２０℃の範囲である。また、調合物の残存する湿度は、生成物の必要性に依存する。最適な生成物安定性を達成するために、いくつかの生成物はより高い、いくつかの生成物はより低い湿度を必要とする。最適な残存する湿度ならびにそれに達する温度は、実験的に決定されるべきである。
【００５５】
第二乾燥工程は、望む湿度が達成されるまで継続する。生成物の湿度を決定するための方法は当業者に公知である。特に、電量Ｋａｒｌ−Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定を使用可能である（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｔ．Ａ．，「凍結乾燥、紹介と基本的原理（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．）」Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ，ＵＳ，１９９９，ＩＳＢＮ １−５７４９１−０８１−７、４１５−４１８頁）。残存する湿度は好ましくは、５％以下、より好ましくは０．５〜４％の範囲、より好ましくは１〜３％の範囲である。
生成物密封および移動：
全ての生成物含有バイアルを、当業者に公知の方法にしたがって密封する。バイアルを非常に低圧（例えば０．０４〜２．５６ｍｂａｒ）にて、直接凍結乾燥器内で密封可能である。また、窒素またはヘリウムのような化学的に不活性な気体を使用することで、ほぼ通常の圧力でバイアルを密封することも可能である。典型的には、バイアルを、９００ｍｂａｒの圧力で、窒素大気下で密封してよい。バイアルを、好ましくはブチルゴムストッパーを用いてしめる。いったん生成物を密封したならば、系を大気圧に戻すことが可能であり、棚を開放可能である。その後、バイアルをさらに長期間の保存のために、アルミニウムキャップで密封してよい。
ワクチン保存：
凍結乾燥生成物を、室温（２５℃）にて保存可能であり、少なくとも１８週間、好ましくは少なくとも２０週間以上、好ましくは少なくとも２２週間、この温度で安定性を維持する。「特定の時間の間、特定の温度で安定である（ｓｔａｂｌｅ ａｔ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ｔｉｍｅ）」は、この時間の間、この温度でのウイルスタイターの欠損が０．５ログ以下であることを意味する。しかしながら、冷却が可能である場合、凍結乾燥生成物を４℃のようなより低温で保存することが好ましい。好ましくは、生成物を暗所で保存する。不可能な場合、保存のために、着色ガラスまたは任意の他のバイアルを使用することが好ましく、これにより光への不利益な曝露を避ける。
再構成：
凍結乾燥生成物の再構成のために、適切な量の溶媒を、凍結乾燥生成物に加え、結果として、薬学的に許容な調合物を、ヒトまたは動物に投与可能にする。溶媒は好ましくは水である。通常、溶媒を、凍結乾燥工程の間における溶媒欠損量に十分に相当する量で、調合物に加える。
【００５６】
本発明はまた、本発明による工程によって得られる凍結乾燥生成物に関する。
【００５７】
したがって、本発明による凍結乾燥生成物は、（ｉ）ポックスウイルス、好ましくはオルトポックスウイルス属またはアビポックスウイルス属、（ｉｉ）ジサッカライド、（ｉｉｉ）薬学的に許容可能なポリマー、および任意に（ｉｖ）緩衝液を含み、前記ポックスウイルス、前記ジサッカライド、前記ポリマーおよび前記緩衝液は、以上で定義している。
【００５８】
凍結乾燥生成物中の典型的な組成を、以下の表２で示す。表２で示した全ての調合物で、ウイルスの量は５×１０^８ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌである。
【００５９】
【表１】
【００６０】
本発明による凍結乾燥生成物を、ワクチンの調製のために使用する。この目的のために、凍結乾燥生成物を、上述したように再溶解／再構成し、当業者に公知の方法にしたがって、ヒトまたは動物に投与する。
【００６１】
図面の簡単な説明
図１は３１℃の温度での、ＭＶＡ含有凍結乾燥調合物の安定性を示している。試験した調合物はＧＴ２３（実施例項および表６を参照のこと）である。本発明による水性調合物におけるウイルスタイターを、凍結乾燥前に測定する。凍結乾燥は、ＧＴ２３に関して記述したように作製した（実施例および表６を参照のこと）。凍結乾燥後、調合物を３１℃にて保存した。示した時間点で、凍結乾燥調合物 を再構成し、ウイルスタイターを再び測定した。
【００６２】
図２及び３はインキュベーション温度が、図２において３７℃、図３において４５℃であったことを除いて、図１の文中で記述したのと同様の実験の結果を示している。
[実施例]
【００６３】
以下の実施例で、本発明をさらに詳述する。しかしながら、これらの実施例は本発明を何ら限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００６４】
修飾ワクシニアウイルス株アンカラ（ＭＶＡ）を含む調合物の凍結乾燥
本実施例において、ＭＶＡを含む本発明による調合物を、異なる条件下で凍結乾燥した。凍結乾燥生成物を、異なる温度で保存した。調製におけるＭＶＡの安定性を、凍結乾燥品の再構成の後にＭＶＡのタイターを測定し、凍結乾燥前のＭＶＡタイターと比較することによって解析した。ウイルスタイターにおける異なる保存時間の影響を決定した。ＭＶＡ含有調合物のタイターの決定のためのプロトコールを実施例２で示す。
１．実験設定：
ワクチン調製／調合物
本発明による凍結乾燥工程を試験するために、いくつかのＭＶＡ調製品を使用した。凍結乾燥実験（表６中、ＧＴ１〜４、６〜１０、および１３〜１５の行）のために、修飾ワクシニアウイルス株アンカラ（ＭＶＡ）を使用した。ウイルスを、３６％および４０％スクロースクッション遠心、続いてｐＨ９での１ｍＭ Ｔｒｉｓ−緩衝液中の再懸濁によって精製した。
【００６５】
凍結乾燥実験ＧＴ１〜４（表６）において、添加物は使用しなかった。使用した緩衝液系は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋ｐＨ７．４での１４０ｍＭ ＮａＣｌであった。ＧＴ６（表６）での凍結乾燥開始に際して、異なる添加物を、緩衝液を変えること無しに使用した。
【００６６】
異なる添加物を含む２つの異なる調合物を選択した。希釈緩衝液を加えることによって、添加物をウイルス含有溶液に加えた。使用した希釈緩衝液の組成は、以下の表３および４で示している。希釈緩衝液１（ＤＳＧ）の添加により、本発明の水性調合物が得られる。希釈緩衝液２（ＤＧＧ）の使用により、比較解析のために使用した調合物 が得られる。
【００６７】
【表３】
【００６８】
【表２】
【００６９】
これらの希釈緩衝液を、最終調合物にて異なる濃度で使用した。希釈緩衝液１（ＤＳＧ）を、１６．７％、２３％、３０％および４０％（ｖ／ｖ）で使用し、希釈緩衝液２は２０％（ｖ／ｖ）で使用した。最終調合物のＴＣＩＤ_５０／ｍｌを、生理学的Ｔｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−緩衝液、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で、５×１０^８ＴＣＩＤ_５０／ｍｌに調整した。
試料凍結
試料を、凍結乾燥器（クリスト（Ｃｈｒｉｓｔ）凍結乾燥器、アルファ２〜４型）内で凍結させた。スクロース（ＤＳＧ）を含む調合物に関しては、異なる凍結温度（−３０℃〜−４５℃）の比較により、完全なケーキ構造を得るために、懸濁液を、本調合物 の崩壊温度以下である、−４０℃まで凍結させなければならないことが示された。凍結乾燥器内で凍結する場合、約３．５〜４．５時間以内に−４０℃に達した（約２０℃から開始）。
第一乾燥
スクロース（ＤＳＧ）を含む調合物に関し、約−３０℃〜−３７℃の崩壊温度は、スクロースの崩壊温度（−３１℃）を考慮に入れて仮定された。したがって、生成物温度を、−３７℃〜−４１℃の範囲の値に調整し、完全な凍結マトリックスを確かにした。０．０４〜０．１２ｍｂａｒの圧力（水相ダイアグラム中、−５０℃および−４０℃）を使用した。
【００７０】
第一乾燥の間の昇華の原動力は、その温度差によって作り出される、生成物と凍結乾燥器のコンデンサーの間の圧力差である。自然の法則としては、水の温度が減少するときに、水上の圧力も減少するということである。特定の水温はいつも特定の圧力に関係している。コンデンサーを、−８３℃〜−８９℃の範囲に設定した。チャンバー内の圧力および棚温度は、生成物温度を調節する。このことは、コンデンサーの温度が固定されているので、第一乾燥の長さは、とりわけ簡単には短くできないことを示している。生成物温度の上昇に関して、調合物のＴｃが制限因子である。
第二乾燥
第二乾燥のための温度を、生成物の安定性によって決定した。また、調合物の残存する湿度は、生成物の要求に依存する。最適な生成物安定性を得るために、時折より高い湿度、また時折低い湿度が必要である。最適な残存する湿度ならびにそれに達するまでの時間は、実験的に測定しなければならない。第二乾燥を、生成物が０℃以上の温度に達した時に開始するので、第二乾燥は２段階で実施した。第一段階において、棚温度を、生成物温度が０℃以上（４〜６℃の範囲）である様式で、数時間（４〜７時間の範囲）調節した。そのような様式で、第一乾燥の後に残っている、すべての可能性のある存在する氷が融解した。第二乾燥を開始するために、そのような穏やかな条件を使用することによって、生成物に対するダメージが最小化されうる。その後、第二段階を、生成物温度を、２０〜３０時間、１８〜２１℃の範囲の値まで上昇させることによって開始した。第二段階のための時間は、凍結乾燥生成物の必要とする残存する湿度に非常に依存する。異なる残存する湿度を得るために、異なる時間を使用した。凍結乾燥物質の残存する湿度を測定するためのアッセイとして、電量分析Ｋａｒｌ−Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定を使用した（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｔ．Ａ．，「凍結乾燥、紹介と基本的原理Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．）」Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ，ＵＳ，１９９９，ＩＳＢＮ １−５７４９１−０８１−７、４１５−４１８頁）。
生成物密封および移動
処理が進行する間に産出されたすべての生成物を、凍結乾燥器内で直接、非常に低圧（０．０４〜２．５６ｍｂａｒ）下で密封した。バイアルを、ブチルゴムストッパーを用いて閉じた。いったん生成物を密封し、系を室温に戻し、棚を開放した。その後、バイアルを、長期間保存のために、アルミニウムキャップで密封した。
ワクチン保存
調合物実施の重要な観点は、棚安定なワクチンを産出することである。安定性に影響を与える因子には、残存する湿度、密封環境組成、および温度、湿度および光を含む保存条件が含まれる。
【００７１】
処理が進行する間に産出された異なるバッチを、すべて４℃および室温で保存した。さらに、いくつかのバッチをまた、３１℃、３７℃および４５℃で保存した。
【００７２】
すべての試料を暗所で保存した。
再構成
凍結乾燥試料を、オートクレーブＭｉｌｌｉ−Ｑ水にて再構成した。より特別には、水（１．２ｍｌ）を、シリンジを用いて試料に添加した。懸濁液を、穏やかに撹拌して混合した。再構成はただ数秒間だけかかった。再構成生成物のウイルスタイターを測定し、凍結乾燥前のウイルスタイターと比較した。
加速安定性試験（加速された安定性試験）
調合物ＧＴ２３（表６を参照のこと）の安定性を、３１℃、３７℃および４５℃で査定した。ウイルスタイターを、定期的にモニタした。結果を図１〜３に示している。
２．結果と結論：
ＭＶＡを、異なる添加物を使用するか、使用せずに凍結乾燥した。添加物無しの調合物は、不安定であるということが示された（表６を参照のこと）。この文中において、試料は、タイターが０．５ログ以上落ちなかった場合に安定であると考えられる。したがって、用語「特定の時間間隔で、特定の温度において安定（ｓｔａｂｌｅ ａｔ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ｔｉｍｅ）」は、この温度でのウイルスタイターの欠損が、この時間間隔で、０．５ログ以下であることを意味している。示唆した温度での示唆した時間間隔の、ウイルスタイターの欠損が０．５ログ以上である場合に、調合物は「不合格である（ｆａｉｌ）」。デキストランおよびグルコースを含む調合物は、室温で、非常に低い安定性を示した。異なる濃度のスクロースおよびデキストランを含む、本発明による調合物が安定であることが証明された。本発明による調合物内のＭＶＡの安定性は、４℃および室温にて少なくとも２５週間である。
それぞれの実験に関する詳細な情報は、表６に記載されている。
【００７３】
表６で、添加物を含まない調合物の安定性（表６、ＧＴ１〜４）は非常に小さかった。数週間後に、その本来の開始タイターの０．５ログを欠損し、これは許容可能ではない。
【００７４】
２０％（ｖ／ｖ）ＤＧＧを含む調合物は、凍結乾燥工程の間、物質が崩壊するので、許容可能ではない（データは示していない）。この崩壊は、グルコースの低いＴｃによって説明可能であり、高いＴｃ（−１１℃）を持つデキストランの使用によって、明白に増強はしなかった。第一乾燥に関して、凍結乾燥設備のもっとも低い可能な温度（−４５℃）を使用した。したがって、グルコースのＴｃ以下の温度に低下させることは不可能であった。３０％（ｖ／ｖ）ＤＧＧを含む調合物は崩壊しなかった。この現象は、おそらく、第一乾燥に関して使用した温度より高い値まで、Ｔｃを増加させる、デキストランのより大きな総量による。
【００７５】
物質は崩壊しなかったが、とりわけ室温での安定性は、満足するものではなく、これは、グルコースの低固体状態Ｔｃによる可能性がある（表６、ＧＴ１０）。
【００７６】
希釈緩衝液１（ＤＳＧ）を、ほとんどの実験で使用した。この添加物での安定性は非常に良好である。スクロースの高いＴｃ（−３１℃）のために、本調合物において、崩壊は問題ではなかった。凍結乾燥物質の安定性は、常に良好であった（表６）。調合物 中の１６．７％、２０％、２３％、２８．６％、３０％および４０％（ｖ／ｖ）ＤＳＧの使用の間に大きな差はなかった。４℃および室温での安定性が、すべての６調合物に関して証明された。３０％および４０％ＤＳＧでの凍結乾燥生成物は、わずかにより安定性を持った。
【００７７】
調合物の１つ（処理ＧＴ２３、表６を参照のこと）を、加速された安定性試験にて、詳細に解析した。結果を図１〜３に示し、以下の表５にて要約している。
【００７８】
【表３】
【００７９】
３１℃にて、ワクチンを約１ヶ月保存したが、まだ規格に適合した（ウイルスタイターの欠損が０．５ログ以下）。ただし高い温度においてさえ、１ヶ月以上ワクチンを保存可能である可能性があり、これは、亜熱帯領域でとりわけ興味深いものであり得る。
【００８０】
古い天然痘ワクチンに関して、ＷＨＯは、安定性の見積もりのための方法を推奨した。ワクチンが３７℃にて４週間以内に１ログ以下欠損した場合、４℃で保存した時に、少なくとも１年間安定であると仮定された（古いワクチンの使用に関する採用基準は、１ログ以下の欠損であった）。示したように、本発明による式ＧＴ２３はこの基準を充たしている。
【実施例２】
【００８１】
修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）の滴定
修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）の滴定を９６ウェルフォーマットで、１０倍希釈を使用する、ＴＣＩＤ_５０に基づくアッセイで実施する。アッセイのエンドポイントにて、感染細胞を、抗ワクシニアウイルス抗体および適切な染色溶液を用いて視覚化する。
【００８２】
２〜３日齢初代ＣＥＦ（ニワトリ胎児繊維芽）細胞を、７％ ＲＰＭＩ中で、１×１０^５細胞／ｍｌまで希釈した。１０倍希釈を、希釈あたり８複製で実施する。希釈に続いて、１００μｌを、９６ウェルプレートのウェルあたりでまく。ついで細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２にて、一晩インキュベートする。
【００８３】
ウイルス含有溶液の希釈を、胎児ウシ血清無しのＲＰＭＩを用いて、１０倍ステップ（適切なように１０^−１〜１０^−１２）で実施する。ついで、それぞれのウイルス試料１００μｌを、細胞含有ウェルに加える。９６ウェルプレートを、５％ ＣＯ_２とともに、３７℃にて５日間インキュベートして、感染およびウイルス複製を可能にする。
【００８４】
細胞を、ワクシニアウイルス特異的抗体で、感染の５日後に染色する。特異的抗体の検出のために、セイヨウワサビ ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体を使用する。ＭＶＡ特異的抗体は、抗ワクシニアウイルス抗体、ウサギポリクローナル、ＩｇＧ画分（カルテット（Ｑｕａｒｔｅｔｔ）、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ ＃９５０３−２０５７）である。二次抗体は、抗ウサギＩｇＧ抗体、ＨＲＰ標識ヤギポリクローナル（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、＃Ｗ４０１１）である。呈色（着色）反応は、公知の技術にしたがって実施する。
【００８５】
着色反応で陽性である細胞を含むすべてのウェルを、ＴＣＩＤ_５０の計算のために、陽性であると記録した。
【００８６】
タイターを、Ｓｐｅａｒｍａｎ［１］およびＫａｅｒｂｅｒ［２］の式を用いることによって計算する。すべてのアッセイパラメータが一定に保持されるので、以下の単純化した式を使用する。
【００８７】
【００８８】
ａ＝すべての８つのウェルがポジティブである最後のカラムの希釈因子（dilution factor）。
χ_ａ＝カラムａ＋１における陽性ウェルの数
χ_ｂ＝カラムａ＋２における陽性ウェルの数
χ_ｃ＝カラムａ＋３における陽性ウェルの数
表６：異なる凍結乾燥処方中のポックスウイルスの安定性データ
【００８９】
【表４】
表6：異なる凍結乾燥処方中のポックスウイルスの安定性データ
【００９０】
【００９１】
【００９２】

【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は３１℃の温度での、ＭＶＡ含有凍結乾燥調合物の安定性を示している。
【図２】図２はインキュベーション温度が３７℃であったことを除いて、図１の文中で記述したのと同様の実験の結果を示している。
【図３】図３はインキュベーション温度が４５℃であったことを除いて、図１の文中で記述したのと同様の実験の結果を示している。

Claims (21)

1. （ｉ）総タンパク質１ｍｇあたり少なくとも１０^６ ＴＣＩＤ_５０のタイターを有するワクシニアウイルス、（ｉｉ）ジサッカライド、（ｉｉｉ）薬学的に許容可能なポリマーおよび（ｉｖ）緩衝液を含む調合物であって、前記緩衝液がリン酸緩衝液ではない前記調合物。
2. 前記ワクシニアウイルスが総タンパク質１ｍｇあたり少なくとも１０^８ ＴＣＩＤ_５０のタイターを有する、請求項１記載の調合物。
3. 前記ワクシニアウイルスが、株Ｅｌｓｔｒｅｅまたは改変（修飾）ワクシニアウイルス株アンカラ（ＭＶＡ）から選択される、請求項１または２のいずれか１つに記載の調合物。
4. 前記ワクシニアウイルスが組換え体ワクシニアウイルスであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１つに記載の調合物。
5. 前記緩衝液がＴＲＩＳ、ＴＢＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳおよび（重）炭酸緩衝液からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１つに記載の調合物。
6. 前記ジサッカライドがスクロース、ラクトースおよびトレハロースからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１つに記載の調合物。
7. 前記ジサッカライドの濃度が１０〜１００ｇ／ｌの範囲であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１つに記載の調合物。
8. 前記薬学的に許容可能なポリマーが、デキストランおよびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）から選択されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１つに記載の調合物。
9. 前記デキストランが、３０，０００〜７０，０００の範囲の分子量を有し、そして１〜５０ｇ／ｌの濃度を有することを特徴とする、請求項８記載の調合物。
10. 前記調合物がさらにグルタミン酸を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１つに記載の調合物。
11. 前記調合物の崩壊温度が−３７℃〜−３０℃の範囲であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の調合物。
12. 前記ワクシニアウイルスがＭＶＡ株または株Ｅｌｓｔｒｅｅであり、前記ジサッカライドがスクロースであり、そして前記ポリマーがデキストランであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の調合物。
13. ワクチンとしての、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の調合物。
14. ワクチンを調製するために、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の調合物を使用する方法。
15. 請求項１〜１３のいずれか１つに記載の調合物が凍結乾燥されることを特徴とする、安定なワクシニアウイルス含有調整物を調製する方法。
16. 以下の段階：
    （ｉ）凍結生成物マトリックスを得るための、請求項１〜１２のいずれか１つにおいて定義されるような調合物の、前記調合物の崩壊温度以下の温度への凍結、
    （ｉｉ）低圧下および生成物マトリックスにおける氷の昇華を可能とするような生成物温度での、凍結調合物の第一乾燥であって、前記生成物温度が調合物の崩壊温度より低い第一乾燥、
    （ｉｉｉ）生成物の残余水分が５％以下になるまでの、低圧および０℃〜３０℃の範囲における生成物温度での第二乾燥、
    を含む、請求項１５に記載の方法。
17. （ｉ）総タンパク質１ｍｇあたり少なくとも１０ ^６ ＴＣＩＤ _５０ のタイターを有するワクシニアウイルス、（ｉｉ）ジサッカライド、（ｉｉｉ）薬学的に許容可能なポリマーおよび（ｉｖ）緩衝液を含む凍結乾燥生成物であって、前記ワクシニアウイルス、ジサッカライド、ポリマーおよび緩衝液が、請求項１〜６、８および１０のいずれか１つに記載されるように定義される、前記凍結乾燥生成物。
18. 凍結乾燥に使用される調合物が、請求項７において定義されるような濃度のジサッカライド、および／または請求項９において定義されるような分子量および濃度を持つデキストランを含む、請求項１５〜１６のいずれか１つに記載の方法により得ることができる凍結乾燥生成物。
19. 残余水分含量が、１〜３％の範囲であることを特徴とする、請求項１７〜１８のいずれか１つに記載の凍結乾燥生成物。
20. ワクチンを調製するために、請求項１７〜１９のいずれか１つに記載の凍結乾燥生成物を使用する方法。
21. 前記生成物を、適切な量の薬学的に許容可能な溶媒中に溶解させることを特徴とする、請求項１７〜１９のいずれか１つに記載の凍結乾燥生成物を再構成させるための方法。