JP2007512009A - 改変ワクシニアウイルスアンカラにおける発現用プロモーター - Google Patents
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Abstract
Description
(i) 以下のSEQ ID NO: 1〜6のいずれか1つのヌクレオチド配列:
5’TCTGCAATATTGTTATCGTAATTGGAAAAATAGTGTTCGAGTGAGTTGGATTATGTGAGTATTGGATTGTATATTTTATTTTATATTTTATATTTTGTAGTAAGAATAGAATGCTAATGTCAAGTTTATTCCAATAGATGTCTTATTAAAAAACATATATAATAAATAACA 3’(SEQ ID NO:1)
5’GATAAAAATTTAAAGTGTAAATATAACTATTATTTTATAGTTGTAATAAAAAGGGAAATTTGATTGTATACTTTCGGTTCTTTAAAAGAAACTGACTTGATAAAA 3’ (SEQ ID NO: 2)
5’GCATTTCATCTTTCTCCAATACTAATTCAAATTGTTAAATAAATAATGGATAGTATAAATAGTTATTAGTGATAAAATAGTAAAAATAATTATTAGAATAAGAGTGTAGTATCATAGATAACTCTCTTCTATAAAA 3’(SEQ ID NO: 3)
5’GATCTATAAAGGTAGACCTAATCGTCTCGGATGACCATATATTTATTTTCAGTTTTATTATACGCATAAATAGTAAAAAATATGTTAGGTTTACAAAA 3’ (SEQ ID NO: 4)
5’GGTAAACTTTAAGACATGTGTGTTATACTAAGATGGTTGGCTTATTCCATAGTAGCTTGTGGAATTTATAAACTTATGATAGTAAAACTAGTACCCAATATGTAAAGATGAAAAAGTAAATTACTATTAACGCCGTCGGTATTCGTTCATCCATTCAGTT 3’(SEQ ID NO: 5)
5’ATTTCTCGGTAGCACATCAAATGATGTTACCACTTTTCTTAGCATGCTTAACTTGACTAAATATTCATAACTAATTTTTATTAATGATACAAAAACGAAATAAAACTGCATATTATACACTGGTTAACGCCCTTATAGGCTCTAACCATTTTCAAG 3’ (SEQ ID NO: 6)
(ii) SEQ ID: No. 1〜6のいずれか1つに記載の配列のサブ配列
(iii) (i)または(ii)で定義される配列に対して1つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、欠失および/または挿入を有する配列、
を含む群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなるかまたは該ヌクレオチド配列からなるプロモーターに関する。
図1:異なるプロモーターによる発現後のGUS活性
細胞にMVA-BN を感染させ、適当なプラスミドでトランスフェクトした。48時間後に細胞を抽出し、黄色を発色する酵素反応後の415 nmにおける吸光度を測定することによりGUS活性を間接的に測定した。Zex = ネガティブコントロール(MVA-BN感染細胞)。
細胞にMVA-BN を感染させ、適当なプラスミドでトランスフェクトした。24時間後に細胞を抽出し、黄色を発色する酵素反応後の415 nmにおける吸光度を測定することによりGUS活性を間接的に測定した。Zex = ネガティブコントロール(MVA-BN感染細胞)。酵素反応に関して、呈色反応を得るために、AraCなしのサンプル(初期+後期発現)は5時間インキュベートしなければならず、AraCを添加したサンプル(初期発現)は一晩インキュベートしなければならない。
細胞にMVA-BN を感染させ、適当なプラスミドでトランスフェクトした。24時間後に細胞を抽出し、黄色を発色する酵素反応後の415 nmにおける吸光度を測定することによりGUS活性を間接的に測定した。コントロール=ネガティブコントロール(MVA-BN感染細胞)。
1.1 実験の目的
この解析の目的は、MVAゲノムにおけるコード配列、好ましくは天然のMVAゲノムとは異種のコード配列を発現するのに適したプロモーターを同定することである。特に、1つの挿入部位に2つまたはそれ以上の遺伝子を挿入するためには、外来遺伝子の1つの欠失を生じる組換えイベント(recombination events)のリスクを減少するために、各遺伝子の発現のために異なるプロモーターを使用することが有利である。さらに、組換えMVA-BNに挿入された外来遺伝子をプロモーターの強さに依存する可変の量で発現する可能性を有するためには、異なる強さのプロモーターを有することが望ましい。全体で11個の推定プロモーターが単離された。これらの推定プロモーター配列をプラスミド骨格(pBSKS+)にクローニングした。これらの潜在的な活性を解析するために、該プロモーターをGUS(大腸菌β-グルクロニダーゼ)レポーター遺伝子と融合させた。BHK(ベビーハムスター腎臓)細胞にMVA-BNを感染させ、GUS遺伝子と融合させた推定プロモーターを含むプラスミドでトランスフェクションを行った。プロモーターが機能する場合にはGUSが発現し、GUSの酵素反応により定量化することができる。ポジティブコントロールとしておよび標準として、よく特性が明らかにされているワクシニアウイルスプロモーターp7.5およびPsをGUSと融合させ同時に解析した。GUS発現の測定により、推定プロモーターについて活性、強さおよび初期/後期発現に関してスクリーニングを行った。該初期/後期発現はAraC(シトシンアラビノシド)を培地に添加することにより確認した。機能することが示されているプロモーター、すなわち当業者に公知のPs、p7.5、7.5LおよびATIプロモーター、ならびにMVA ORF’sの発現制御に天然において関与する新しく同定されたプロモーター配列、A42L、B9R、C7L、F6R、I2R、J6Rは、好ましくは組換えMVAコンストラクト(recMVA-BN)中の外来遺伝子の発現に使用することができる。
細胞:BHK細胞
ウイルス:MVA-BNの標準的な粗製ストック(7.5 x 107 TCID50)
DNA:pAB-GUS (Psプロモーター+ GUS)
pBNX71 (pBluescript + ワクシニアウイルスpr7.5 +GUS)
pBNX73 (pBluescript + 牛痘ウイルスATIプロモーター+ GUS)
pBN81 (pBluescript + 改変H5Rプロモーター+ GUS1)
pBN61 (pBluescript + MVA B1Rプロモーター+ GUS)
pBN62 (pBluescript + MVA B2Rプロモーター+ GUS)
pBN63 (pBluescript + MVA B3Rプロモーター+ GUS)
pBN60 (pBluescript + MVA A30Rプロモーター+ GUS)
pBN82 (pBluescript + ワクシニアウイルス7.5 Lプロモーター+ GUS)
pBN83 (pBluescript + MVA C7Lプロモーター(SEQ ID NO: 5 + GUS)
pBNX49 (pBluescript + MVA A42Rプロモーター(SEQ ID NO: 1) + GUS)
pBNX69 (pBluescript + MVA I2Rプロモーター(SEQ ID NO: 4)+ GUS)
pBNX72 (pBluescript + MVA K5Lプロモーター+ GUS)
pBNX83 (pBluescript + MVA F6Rプロモーター(SEQ ID NO: 3) + GUS)
pBNX84 (pBluescript + MVA B9Rプロモーター(SEQ ID NO: 6 + GUS)
pBNX85 (pBluescript + MVA J6Rプロモーター(SEQ ID NO:2) + GUS)
トランスフェクションキット:Effecteneトランスフェクションキット(Qiagen社)
培地および添加物質:10% FCS (Gibco BRL社)を添加したDMEM (Gibco BRL社)
試薬および緩衝液:溶解緩衝液(PBS + 0.1 % Triton + 1 mMのプロテアーゼ阻害剤)
AraC (Sigma社、カタログ番号C1768)
GUS基質 1mM (p-ニトロフェニル-ベータ-(D)-グルクロニド; Sigma社、カタログ番号N1627)
停止溶液2.5 M (2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール; Sigma社、カタログ番号A 9754)。
細胞の播種
6ウェルプレートのウェルにおけるトランスフェクション反応あたり5 x 105個のBHK細胞を播種し、37°Cおよび5% CO2におけるDMEM/10%FCS中で一晩維持した。
1ウェルあたり0.5 mlのDMEM/10% FCSにおいて、細胞にMVA-BN (moi 0.1) を感染させ、室温下、振とう器において1時間インキュベートした。トランスフェクションを製造者のプロトコールに記載されるとおりに実施した。2μgのプラスミドを緩衝液EB(100μlの全容量)に希釈した。3.2μlのエンハンサー溶液の添加後、該溶液を混合し室温で5分間インキュベートした。その後、10μlのEffectene試薬を添加し、懸濁液を混合して室温で10分間インキュベートした。ウイルス懸濁液を細胞から除去し、1.6 ml のDMEM/10%FCSを添加した。0.6 ml のDMEM/10%FCS をDNA Effectene混合物に添加し、培養プレートを回転させながら細胞に滴下した。その後、細胞を解析によって7、24または48時間インキュベートした。初期/後期発現の解析のために、感染およびトランスフェクションの間にAraCを培地に添加した(40μg/ml)。
培地を細胞から除去し、0.5 mlの溶解緩衝液を添加した。室温で15分間振とうした後、細胞を溶解緩衝液中で破砕し、1.5 mlの反応チューブに移して、激しく撹拌した。溶解した細胞につき4℃、500 rcfで1分間遠心分離を行い、透明な上清を新しいバイアルに移して使用するまで−20°Cで保存した。
10μlの細胞抽出液(=2 x 104個の細胞からのタンパク質)を1 mlの予め温めた基質溶液(37℃)に添加し、黄色が呈色するまで37℃でインキュベートした。サンプルをその後直ちに氷上に置き、0.4 mlの停止溶液を添加した。415 nmの吸光度を測定し、GUS活性を直線範囲にある0.05〜2.0の吸光度の値として扱った。基質溶液を基準として使用し、MVA-BN感染細胞の細胞抽出液をネガティブコントロールとして使用した。
実施例1:推定プロモーターの機能の測定
第一の実験において、GUS遺伝子と融合した推定MVAプロモーター、またはよく特性が確認されているプロモーターを含む全てのプラスミドを解析した。細胞にMVA−BN(moi 0.1)を感染させ、対応するプラスミドでトランスフェクションを行った。48時間後に細胞を回収し、溶解させてGUS活性を測定した。この実施例は、各プロモーターが機能的であるかどうかを測定するために実施した。結果を図1に示す。
実施例1において活性を示したプロモーターを、それらの発現パターンに関して特性を明らかにした。前記の目的のために、MVA-BNを感染させ、対応するプラスミドでトランスフェクションを行った細胞をAraCとともにインキュベートした。AraCは、MVAの複製サイクル間での遺伝子の後期発現のために必須な必要条件であるDNA複製を阻害する。同時に、同一の実験をAraCの添加なしで実施した。感染させた、およびトランスフェクションを行った細胞を24時間後に回収し、GUS活性の測定を三重に行った。図2は、各サンプルの平均吸光度を示す。
異なる強さのプロモーターを得ることができ、インキュベーション時間およびMVA-BNの複製可能性に依存して異なる発現パターンを示す多種多様な異なるプロモーターを利用できることが明確に示された。初期+後期発現が好ましい場合には、プロモーターA42R、I2RおよびF6Rを使用するのが好ましい。初期発現を避けなければならない場合(例えば、初期発現に対する終結シグナルTTTTTNTを含む外来遺伝子)には、プロモーターB9R、J6RまたはC7Lを使用するのが好ましい。
実施例1では、MVAゲノムにおいて外来遺伝子を発現するのに特に適している配列がいくつか同定された。さらに短い断片が同一の目的を満たすかどうかを確認するために、さらに実験を実施した。SEQ ID NO 1〜4 のさらに短い断片をPCRにより単離し、プラスミド骨格(pBSKS+)にクローニングした。全部で6個の推定最小プロモーターについて試験を行った。これらの活性の可能性を解析するために、該プロモーターをGUSレポーター遺伝子に融合させた。BHK細胞にMVA-BNを感染させ、GUS遺伝子に融合させた推定最小プロモーターを含むプラスミドでトランスフェクションを行った。GUSの発現を測定することにより、活性および発現の強さに関して、推定プロモーターのスクリーニングを行った(実施例1参照)。ポジティブコントロールとしておよび参照として、よく特性が明らかにされているワクシニアウイルスプロモーターPsをGUSと融合させ同時に解析した。約30 bpの最小プロモーターエレメントは、元々の相同的な配列と追加的にクローニングしたプロモーターとの間の相同組換えの危険性なしに、組換えMVAコンストラクト(recMVA-BN)中の外来遺伝子の発現に使用することができる。
特に言及しない限り、実施例2において用いる材料および方法は実施例1における方法と一致する。PCRは標準的方法により実施した。
PCRによるプロモーターのGUSへの融合
PCR反応により以下の最小プロモーター配列をGUS遺伝子へ融合させた:
SEQ ID NO: 7 (「A42ショートレート(A42 short late)」)TCTTATTAAAAAACATATATAATAAATAACA
SEQ ID NO: 8 (「J6Rショートレート」)GATAAAAATTTAAAGTGTAAATATAACTAT
SEQ ID NO: 9 (「F6Rショートアーリー(F6R short early)」)AGAGTGTAGTATCATAGATAACTCTCTTCTATAAAAT
SEQ ID NO: 10 (「F6Rショートレート」)ATTGTTAAATAAATAATGGATAGTATAAAT
SEQ ID NO: 11 (「I2Rショートアーリー」)AGTAAAAAATATGTTAGGTTTACAAAA
SEQ ID NO: 12 (「I2Rショートレート」) ATTTATTTTCAGTTTTATTATACGCATAAAT。
推定最小プロモーターエレメントの機能性を解析するために、BHK細胞にMVA-BN (moi 1.0)を感染させ、対応するプラスミドでトランスフェクションを行った。24時間後に細胞を回収し、溶解して、GUS活性を測定した(図3)。
異なる強さのプロモーターを単離することができ、多種多様な異なるプロモーターを利用できることが明確に示された。初期発現が好ましい場合には、最小プロモーターF6RショートアーリーまたはI2Rショートアーリーを使用するのが好ましい。後期発現が好ましい場合および初期発現を避けなければならない場合(例えば、初期発現に対する終結シグナルTTTTTNTを含む外来遺伝子)には、最小プロモーターエレメントF6Rショートレート、I2Rショートレート、J6RショートレートおよびA42Rショートレートを使用するのが好ましい。
Claims (22)
- (i) SEQ ID NO: 1〜6のいずれか1つのヌクレオチド配列、
(ii) SEQ ID: No. 1〜6のいずれか1つに記載の配列のサブ配列、および
(iii) (i)または(ii)で定義される配列に対して1つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、欠失および/または挿入を有する配列、
を含む群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたは該ヌクレオチド配列からなるプロモーターであって、ワクシニアウイルスプロモーターとして活性であり、および/またはワクシニアウイルス感染細胞において活性である、前記プロモーター。 - サブ配列がSEQ ID: 7〜12を含む群から選択される、請求項1記載のプロモーター。
- 請求項1または2のいずれか1つに記載のプロモーターおよびコード配列を含む発現カセットであって、コード配列の発現が前記プロモーターにより制御され、そしてこの発現カセットがワクシニアウイルスのゲノム中に天然に存在する発現カセットではない、前記発現カセット。
- コード配列が治療用タンパク質またはペプチド、抗原、抗原エピトープ、アンチセンスRNAまたはリボザイムをコードする、請求項3記載の発現カセット。
- 請求項1または2のいずれか1つに記載のプロモーターまたは請求項3または4のいずれか1つに記載の発現カセットを含むDNA。
- 請求項1または2のいずれか1つに記載のプロモーターまたは請求項3または4のいずれか1つに記載の発現カセットを含むベクター。
- プラスミドベクターおよびウイルスベクターから選択される、請求項6記載のベクター。
- ウイルスベクターがワクシニアウイルスである、請求項7記載のベクター。
- ワクシニアウイルスが改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)、好ましくは欧州細胞カルチャーコレクション(European Collection of Cell Cultures)(ECACC)に寄託番号V00083008で寄託されているMVA−BN株またはその誘導体、ECACCに寄託番号VA94012707で寄託されているMVA572株または寄託番号V00120707で寄託されているMVA 575株である、請求項8記載のベクター。
- 請求項1または2のいずれか1つに記載のプロモーター、または請求項3または4のいずれか1つに記載の発現カセットがMVAゲノムの天然に存在する欠失部位に挿入される、請求項9記載のベクター。
- 請求項1または2のいずれか1つに記載のプロモーター、または請求項3または4のいずれか1つに記載の発現カセットが、ウイルスゲノムの非必須部分またはウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入される、請求項9記載のベクター。
- ワクチンまたは薬剤としての請求項6〜11のいずれか1つに記載のベクター。
- 請求項3または4のいずれか1つに記載の発現カセット、請求項5記載のDNAまたは請求項6〜11のいずれか1つに記載のベクターを含むワクチンまたは医薬調合物。
- 少なくとも102 TCID50 (組織培養感染量) の請求項8〜11のいずれか1つに記載のウイルスベクターを含む、請求項13記載のワクチンまたは医薬調合物。
- 第一接種(「初回免疫接種」)および第二接種(「追加免疫接種」)において、ウイルスベクターが治療的有効量で投与される、請求項14記載のワクチンまたは医薬調合物。.
- ワクチンまたは薬剤の製造のために、請求項3または4のいずれか1つに記載の発現カセット、請求項5記載のDNAまたは請求項6〜11のいずれか1つに記載のベクターを使用する方法。
- 請求項6〜11のいずれか1つに記載のベクター、請求項3または4のいずれか1つに記載の発現カセット、または請求項5記載のDNAを標的細胞へ導入することを含む、標的細胞へコード配列を導入する方法。
- 請求項7〜11のいずれか1つに記載のウイルスベクターを宿主細胞へ感染させること、感染した宿主細胞を適当な条件下において培養すること、および前記宿主細胞により産出されるペプチドおよび/またはタンパク質および/またはウイルスを単離および/または濃縮することを含む、ペプチド、タンパク質および/またはウイルスを製造する方法。
- 請求項3または4のいずれか1つに記載の発現カセット、請求項5記載のDNAまたは請求項7記載のプラスミドベクターを用いる細胞のトランスフェクション、ワクシニアウイルスの細胞への感染、適当な条件下での感染した宿主細胞の培養、および前記宿主細胞により産出されるペプチドおよび/またはタンパク質および/またはウイルスの単離および/または濃縮を含むペプチド、タンパク質および/またはウイルスの製造方法であって、細胞にワクシニアウイルスを感染させる段階が細胞のトランスフェクションの段階の前または後に行われる、前記製造方法。
- 請求項1または2のいずれか1つに記載のプロモーター、請求項3または4のいずれか1つに記載の発現カセット、請求項5記載のDNAまたは請求項7〜11のいずれか1つに記載のウイルスベクターを含む細胞。
- コード配列の発現のために請求項1または2のいずれか1つに記載のプロモーターを使用する方法であって、コード配列がワクシニアウイルスにおいて天然にプロモーターと連結している配列ではない、前記使用方法。
- 請求項3または4のいずれか1つに記載の発現カセットをベクターゲノムに挿入する段階を含む、請求項6〜11のいずれか1つに記載のベクターを製造する方法。
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