KR20060109873A - 변형된 백시니아 바이러스 앙카라에서의 발현을 위한프로모터 - Google Patents

변형된 백시니아 바이러스 앙카라에서의 발현을 위한프로모터 Download PDF

Info

Publication number
KR20060109873A
KR20060109873A KR1020067007781A KR20067007781A KR20060109873A KR 20060109873 A KR20060109873 A KR 20060109873A KR 1020067007781 A KR1020067007781 A KR 1020067007781A KR 20067007781 A KR20067007781 A KR 20067007781A KR 20060109873 A KR20060109873 A KR 20060109873A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
promoter
vaccinia virus
mva
vector
expression cassette
Prior art date
Application number
KR1020067007781A
Other languages
English (en)
Inventor
손자 라이러
Original Assignee
버베리안 노딕 에이/에스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 버베리안 노딕 에이/에스 filed Critical 버베리안 노딕 에이/에스
Publication of KR20060109873A publication Critical patent/KR20060109873A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A61K39/285—Vaccinia virus or variola virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 프로모터, 특히 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA) 와 같은 백시니아 바이러스에서 코딩 서열 및/또는 유전자의 발현을 위한 프로모터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 프로모터를 포함하는 발현 카세트, 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터 뿐만 아니라 약학적 조성물 및 백신에 관한 것이다.

Description

변형된 백시니아 바이러스 앙카라에서의 발현을 위한 프로모터{PROMOTERS FOR EXPRESSION IN MODIFIED VACCINIA VIRUS ANKARA}
본 발명은 프로모터, 특히 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (Modified vaccinia virus Ankara, MVA) 와 같은 백시니아 바이러스에서의 코딩 서열 및/또는 유전자의 발현을 위한 프로모터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 프로모터를 포함하는 발현 카세트 (cassette), 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터 뿐만 아니라 약학적 조성물 및 백신에 관한 것이다.
재조합 폭스바이러스는 감염된 세포에서 외래 항원을 발현하는데 널리 사용된다. 또한, 재조합 폭스바이러스는 최근에 폭스바이러스 벡터로부터 발현되는 외래 항원에 대해 면역 반응을 유도하기 위한 매우 유망한 백신으로서 시험되고 있다. 가장 유명한 것의 하나로는 애비폭스바이러스 (avipoxvirus), 및 다른 하나로는 백시니아 바이러스, 특히 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA) 가 있다. MVA 는 폭스바이러스과의 오르토폭스바이러스속의 일원인 백시니아 바이러스에 관련된 것이다. MVA 는 백시니아 바이러스 앙카라 균주를 닭 태아 섬유아세포 (CVA) 상에서 516 회 연속 계대함으로써 생성되었다 (Mayr, A. 등, Infection 3, 6~14 [1975] 를 개론으로 참조). 이러한 장기간 계대의 결과, 생성 MVA 바이러스에서는 그 게놈 서열의 약 31 킬로베이스가 결실되었으며, 이에 따라 조류 세포에 매우 제한된 숙주 세포 특이성을 갖는 것으로 설명되었다 (Meyer, H 등, J. Gen. Virol. 72, 1031~1038 [1991]). 여러 동물 모델에서, 생성 MVA 는 유의미하게 비병원성인 것으로 나타났다 (Mayr, A. & Danner, K. [1978] Dev. Biol. Stand. 41: 225~34). 나아가, 상기 MVA 균주는 인간 천연두 질병에 대해 면역화시키기 위한 백신으로서 임상 시험되고 있다 (Mayr 등, Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375~390 [1987], Stick 등, Dtsch. med. Wschr. 99, 2386~2392 [1974]).
US 5,736,368 및 US 6,051,410 에는 HIV 항원 및 단백질을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 균주 Wyeth 가 개시되어 있다. US 5,747,324 에는 렌티바이러스 유전자를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 균주 NYCBH 가 개시되어 있다. EP 0 243 029 에는 인간 레트로바이러스 유전자를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 균주 Western Reserve 가 개시되어 있다. WO 02/42480 에는 특히 안전하고 약독화된 MVA 균주가 개시되어 있다. 재조합 MVA 는 특히 WO 98/13500 및 WO 03/048184 에 개시되어 있다.
폭스바이러스에서의 이종성 유전자의 발현을 위해서는 30K 및 40K 프로모터 (예컨대 US 5,747,324 참고), 강력한 합성 초기/후기 프로모터 (예컨대 Sutter 등, Vaccine (1994) 12, 1032~40 참고), P7.5 프로모터 (예컨대 Endo 등, J. Gen. Virol. (1991) 72, 699~703 참고) 및 우두 바이러스 A-형 봉입체 (A-type inclusion, ATI) 유전자에서 유래한 프로모터 (Li 등, J. Gen. Virol. (1998) 79, 613) 와 같이 단지 소수의 프로모터만이 당업자에게 알려져 있다. 이들 프로모터 는 모두 재조합 백시니아 바이러스에서 이종성 유전자를 발현하는데 사용되고 있으며, 상기 유전자를 발현하여 이종성 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 생성하는 것으로 나타났다. 매우 적은 프로모터만이 백시니아 바이러스 발현 시스템에서의 유전자 발현에 이용가능하므로, 백시니아 바이러스에서의 대안적 프로모터에 대한 일반적 요구가 존재한다. 또한, 현재까지 공지된 모든 프로모터는 다소 강력한 후기 프로모터, 즉 백시니아 바이러스 벡터의 복제가 일어난 후의 유전자 발현에 유용한 것이다. 다른 적용을 위해서는, 세포 감염 직후에 유전자 발현을 가능케하는 프로모터가 요망된다, 즉 백시니아 바이러스 초기 프로모터에 대한 요구가 존재한다.
또한 상기 지적된 바와 같이, MVA 는 그 개선된 안정성 프로필로 인해 이종성 유전자의 발현을 위해 매우 유망한 바이러스이다. 그러나 MVA 에서 이종성 유전자의 발현을 위해 현재까지 공지된 모든 프로모터는 다른 백시니아 바이러스에서 유래했거나 다른 백시니아 바이러스에서의 발현을 위한 합성 프로모터이다. 따라서, MVA 에서의 발현을 위해 최적화된 프로모터에 대한 요구가 또한 존재한다.
본 발명은 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA) 의 게놈에서 유래한 프로모터에 관한 것이다. MVA 프로모터는 당분야에 아직까지 공지되지 않았다.
특히 본 발명은 하기를 포함하는 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 프로모터에 관한 것이다:
(i) 하기 서열 번호 1 내지 6 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열:
Figure 112006028030137-PCT00001
Figure 112006028030137-PCT00002
Figure 112006028030137-PCT00003
Figure 112006028030137-PCT00004
Figure 112006028030137-PCT00005
Figure 112006028030137-PCT00006
(ii) 서열 번호 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 서열의 서브서열 (subsequence).
(iii) (i) 또는 (ii) 에 정의된 서열에 대해 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 서열.
서열 번호 1 내지 6 은 자연적으로는 MVA 게놈의 일부이며, 각각 해독틀 (reading frame) A42R, J6R, F6R, I2R, C7L 및 B9R 의 상류에 위치한다.
본 발명에 따른 프로모터는 바람직하게는 백시니아 바이러스 프로모터로서 활성을 갖거나 백시니아 바이러스 감염 세포에서 프로모터로서 활성을 갖는다. 백시니아 바이러스는 바람직하게는 MVA, 특히 하기에 특정되는 바와 같은 MVA 균주 중 하나이다. "백시니아 바이러스 프로모터로서 활성을 갖는" 이란 상기 프로모터가 백시니아 바이러스로의 세포 감염 후 상기 바이러스에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 일으킬 수 있음을 의미한다. 상기 세포는 바람직하게는 백시니아 바이러스의 후기 및/또는 초기 발현을 허용하는 세포이다. "백시니아 바이러스 감염 세포에서 활성을 갖는 프로모터" 에는 또한 상기 프로모터가 백시니아 바이러스 게놈의 일부가 아닌, 예컨대 플라스미드 또는 비백시니아 바이러스의 바이러스 게놈의 일부인 경우가 포함된다; 이러한 경우, 본 발명에 따른 프로모터는 상기 프로모터를 포함하는 세포가 또한 백시니아 바이러스 게놈을 포함하는 경우, 예컨대 세포가 백시니아 바이러스로 감염된 경우에 활성을 갖는다. 이러한 상황 하에서, 바이러스의 RNA 폴리머라아제가 본 발명에 따른 프로모터를 인지하여, 상기 프로모터에 연결된 유전자/코딩 서열의 발현이 활성화된다.
본 발명에 따르면, 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 에 특정된 바와 같은 프로모터 중 어느 하나를 사용할 수 있다. 유전자/코딩 서열의 발현을 일으키는데 실제로 사용되는 프로모터는 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 하나로 구성될 수 있고, 또는 실제로 사용되는 프로모터는 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 하나를 포함하는 더 큰 구조일 수 있다. 대안적으로, 서열 번호 1 내지 6 중 어느 하나에 정의된 서열의 서브서열일 수 있는 상기 프로모터의 유도체를 사용하는 것도 본 발명의 범위 내에 속한다. "서열 번호 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 서열의 서브서열" 이란 용어는 프로모터로서, 특히 백시니아 바이러스에서 또는 백시니아 바이러스 감염 세포에서 프로모터로서 여전히 활성을 갖는, 서열 번호 1 내지 6 중 어느 하나의 더 짧은 단편을 나타낸다. 또한, 백시니아 바이러스는 바람직하게는 하기 특정되는 균주 중 하나와 같은 MVA 이다. 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 하나의 전형적인 서브서열은 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 중 어느 하나의 서열의 15 개 이상 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 20 개 이상 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 25 개 이상 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 30 개 이상 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
서열 번호 1 의 바람직한 서브서열은 서열 번호 7 이다. 서열 번호 2 의 바람직한 서브서열은 서열 번호 8 이다. 서열 번호 3 의 바람직한 서브서열 및/또는 상기 서브서열의 유도체는 서열 번호 9 및 서열 번호 10 이다. 서열 번호 4 의 바람직한 서브서열은 서열 번호 11 및 서열 번호 12 이다. 서열 번호 6 내지 12 의 서열은 실시예 부분에 주어진다.
서열 번호 1 내지 6 또는 이들의 서브서열 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 프로모터의 유도체, 특히 서열 번호 7 내지 서열 번호 12 의 뉴클레오티드 서열의 유도체는 또한 서열 번호 1 내지 6 의 서열 또는 이들의 서브서열 중 어느 하나, 특히 서열 번호 7 내지 서열 번호 12 의 뉴클레오티드 서열에 대해 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 서열일 수 있다. 본 발명에 따른 유도체는 프로모터로서, 특히 백시니아 바이러스에서 또는 백시니아 바이러스 감염 세포에서 백시니아 바이러스 프로모터로서, 보다 바람직하게는 MVA 에서 또는 MVA 감염 세포에서 MVA 프로모터로서 여전히 활성을 갖는다. 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 갖는 서열은 서열 번호 1 내지 6 중 어느 하나 또는 서열 번호 7 내지 12 중 어느 하나에 따른 서열과 같은 이들의 서브서열에 따른 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된 서열이다. 하나 이상의 뉴클레오티드 삽입을 갖는 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드가 서열 번호 1 내지 6 또는 이들의 서브서열 중 어느 하나, 특히 서열 번호 7 내지 서열 번호 12 의 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 위치에 삽입된 서열이다. 하나 이상의 뉴클레오티드 결실을 갖는 서열은 서열 번호 1 내지 6 또는 이들의 서브서열 중 어느 하나에 따른 서열, 특히 서열 번호 7 내지 서열 번호 12 의 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실된 서열이다. 본 발명에 따른 유도체에 있어서, 결실, 치환 및 삽입이 하나의 서열에 조합될 수 있다.
본 발명에 따른 서브서열의 유도체의 예로는 서열 번호 3 의 해당 뉴클레오티드 서열에 대해 하나의 뉴클레오티드 교환을 더 갖는 서열 번호 3 의 서브서열인 서열 번호 10 을 들 수 있다.
바람직하게는 상기 유도체는 서열 번호 1 내지 서열 번호 6 또는 이들의 서브서열 중 어느 하나, 특히 서열 번호 7 내지 서열 번호 12 중 어느 하나에 따른 서열과 비교할 때, 40% 이상, 보다 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는다. 가장 바람직한 구현예에 따르면, 서열 번호 7 내지 서열 번호 12 중 어느 하나의 서열에서 10 개 이하의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 5 개 이하의 뉴클레오티드가 치환, 결실 및/또는 삽입된다.
여러 종래 기술의 문헌을 통해 당업자는 서열 번호 1 내지 12 중 어느 하나의 유도체 또는 서브서열이 여전히 백시니아 바이러스 프로모터로서 활성을 갖는, 특히 MVA 에서 활성을 갖는 프로모터로서 활성을 갖는, 생물학적 활성을 갖는 것을 예측할 수 있다. 이와 관련하여, [Chakrarbarti 등, Biotechniques (1997) 23, 1094~1097 및 Davison and Moss, J. Mol. Biol. (1989) 210, 771~784] 를 참조한다. 또한, 절편이 백시니아 바이러스 프로모터로서, 특히 MVA 프로모터로서 여전히 활성을 갖는지의 여부는 당업자가 쉽게 평가할 수 있다. 특히 서열 유도체를 플라스미드 구축물에서 리포터 유전자의 상류에 클로닝할 수 있다. 상기 구축물은 MVA 로 감염된 CEF 또는 BHK 세포와 같은 진핵 세포 또는 세포주에 전달감염 (transfection) 될 수 있다. 리포터 유전자의 발현은 서열 번호 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 프로모터에 의해 조절되는 리포터 유전자의 발현과 비교하여 결정된다. 본 발명에 따른 유도체는 상기 시험 시스템에서 서열 번호 1 내지 6 중 어느 하나의 프로모터 서열의 활성과 비교하여 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상의 프로모터 활성을 갖는 유도체이다. 또한 더 높은 프로모터 활성을 갖는 서열 번호 1 내지 12 중 어느 하나의 상기 유도체도 본 발명의 범위 내에 속한다.
본 발명에 따른 프로모터는 MVA 에서의 코딩 서열의 발현을 위해 특히 적합하다.
서열 번호 1 에 따른 프로모터는 초기 프로모터로 사용될 수도 있지만, 특히 후기 프로모터로서 매우 강력한 활성을 갖는다. 이와 같은 점은 서열 번호 7 의 서열과 같은 대응 서브서열에도 적용되지만, 서열 번호 7 의 서열은 특히 후기 프로모터로서 유용하다.
서열 번호 2 에 따른 프로모터는 특히 후기 프로모터로서 다소 강력한 활성을 갖는다. 이는 또한 초기 프로모터로도 사용될 수 있다. 이와 같은 점은 서열 번호 8 의 서열과 같은 대응 서브서열에도 적용되지만, 서열 번호 8 의 서열은 특히 후기 프로모터로서 유용하다.
서열 번호 3 에 따른 프로모터는 특히 초기 프로모터로서 유용하며, 시험된 모든 프로모터 중 가장 높은 초기 프로모터 활성을 갖는다. 그러나, 이는 또한 후기 프로모터로도 사용될 수 있다. 이와 같은 점은 서열 번호 9 및 10 의 서열과 같은 대응 서브서열에도 각각 적용된다. 이들 서브서열 중, 서열 번호 9 는 초기 프로모터로서 특히 유용하며, 서열 번호 10 은 후기 프로모터로서 특히 유용하다.
서열 번호 4 에 따른 프로모터는 상기 프로모터가 초기 뿐만 아니라 후기 조건 하에서도 다소 높은 활성을 갖기 때문에, 연결된 코딩 서열을 초기 및 후기에 발현시키려는 경우 특히 유용하다. 이와 같은 점은 서열 번호 11 및 12 의 서열과 같은 대응 서브서열에도 각각 적용된다. 이들 서브서열 중, 서열 번호 11 은 초기 프로모터로서 특히 유용하며, 서열 번호 12 는 후기 프로모터로서 특히 유용하다.
서열 번호 5 및 6 에 따른 프로모터는 연결된 코딩 서열을 다소 소량 발현시키려는 경우 특히 유용하다. 이는 연결된 코딩 서열이 독성 유전자 산물을 코딩하고/하거나 고결합성 (high avidity) 면역 반응을 유도하려는 경우에 때때로 요망된다.
"초기 프로모터" 라는 용어는 바이러스 DNA 복제가 일어나기 전에 백시니아 바이러스 또는 백시니아 바이러스 감염 세포에서 활성을 갖는 프로모터를 나타낸다. 프로모터가 초기 프로모터인지 여부를 확인할 수 있는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 특히, 관심 프로모터를 리포터 유전자의 상류에 삽입할 수 있다. 프로모터 및 리포터 유전자를 포함하는 구축물을 백시니아 바이러스로 감염된 세포 내로 도입한다. 초기 프로모터로서의 활성을 평가하기 위해, 세포를 AraC 와 같은 DNA 복제를 저해하는 물질과 함께 인큐베이션한다. DNA 복제는 후기 프로모터 활성을 위해 필요하다. 이에 따라, 상기 분석 시스템에서 측정되는 모든 프로모터 활성은 초기 프로모터로서 활성을 갖는 요소로 인한 것이다. 따라서, "후기 프로모터" 라는 용어는 DNA 복제가 일어난 후 활성을 갖는 모든 프로모터를 나타낸다. 후기 활성은 또한 당업자에게 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 간단히 하기 위해, 본 출원에서 사용되는 "후기 프로모터" 라는 용어는 DNA 복제를 차단하는 물질이 첨가되지 않은 경우 측정되는 프로모터의 활성을 나타낸다.
추가 구현예에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 프로모터 및 코딩 서열을 포함하고, 상기 코딩 서열의 발현이 상기 프로모터에 의해 조절되는 발현 카세트에 관한 것이다. 상기 발현 카세트는 바람직하게는 백시니아 바이러스의 게놈에서 자연적으로 생성되는 발현 카세트가 아니다. 즉, 본 발명에 따른 프로모터가 백시니아 바이러스의 게놈에서 자연적으로 생성되는 프로모터인 경우, 프로모터가 연결된 서열은 바람직하게는 프로모터가 백시니아 바이러스 게놈에서 자연적으로 연결된 서열과 상이하다. 다시 말하면, 본 발명에 따른 프로모터가 자연적으로 생성되는 프로모터와 동일한 경우, 상기 프로모터에 의해 그 발현이 조절되는 코딩 서열 및/또는 상기 프로모터와 코딩 서열 사이에 위치하는 서열은 상기 프로모터가 자연적으로 연결된 대응 서열과 상이하다. 본 명세서에서 "상이한" 이라는 용어는 상기 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드 차이를 보이는 서열을 나타낸다. 바람직하게는 이는 하나 이상의 뉴클레오티드 차이를 갖는 코딩 서열이다. 다른 대안에 따르면, 발현 카세트 내의 코딩 서열 및 프로모터가 자연적으로 연결된 서열 사이의 상동성은 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만 또는 심지어 20% 미만이다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 프로모터에 의해 조절되는 코딩 서열은 상기 코딩 서열에 의해 코딩되는 자연적으로 생성되는 단백질과 비교하여 하나 이상의 아미노산 차이를 갖는 펩티드/단백질을 코딩한다. 예로서, 발현 카세트는 자연적으로 생성되는 C7L 유전자의 발현을 일으키는 자연적으로 생성되는 백시니아 바이러스 C7L 프로모터를 포함하는 발현 카세트가 아니다, 예컨대 상기 발현 카세트는 C7L 프로모터 및 C7L 코딩 서열을 포함하는 WO 2004/015118 에 개시된 발현 카세트가 아니다.
반면, 발현되어야 하는 서열이 자연적으로 생성되는 백시니아 바이러스 서열인 경우, 상기 서열을 발현하는데 사용되는 프로모터는 자연적 환경에서 코딩 서열의 발현을 일으키는 프로모터와 상이하다. 상기 대안에 따르면, 상기 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 자연적으로 생성되는 백시니아 바이러스 프로모터의 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 상이하다. 다른 대안에 따르면, 백시니아 바이러스 서열의 발현을 조절하는 본 발명에 따른 프로모터 및 백시니아 바이러스 서열에 연결된 자연적으로 생성되는 프로모터 사이의 상동성은 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만 또는 심지어 40% 미만이다.
바람직하게는, 상기 코딩 서열은 하나 이상의 항원성 에피토프 (epitope) 또는 항원, 치료 펩티드 또는 단백질, 안티센스 RNA 또는 리보자임을 코딩할 수 있다. 코딩 서열이 항원성 에피토프 또는 항원을 코딩하는 경우, 발현 카세트는 유기체, 예컨대 인간을 포함하는 포유류 동물의 세포에 상기 발현 카세트를 도입한 후 상기 항원을 발현하는데 사용될 수 있다. 상기 항원/에피토프의 제시는 상기 항원/에피토프가 유래한 제제에 대한 유기체의 예방접종을 일으킬 수 있는, 유기체 내의 면역 반응을 야기할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 에피토프/항원은 폴리에피토프, 펩티드 또는 단백질과 같은 더 큰 아미노산 서열의 일부일 수 있다. 바람직하게는 상기 코딩 서열은 백시니아 바이러스 게놈에 의해 코딩되지 않는 하나 이상의 항원성 에피토프 또는 항원, 치료 펩티드 또는 단백질, 안티센스 RNA 또는 리보자임을 코딩한다.
상기 폴리에피토프, 펩티드 또는 단백질의 예로는 (i) 바이러스, 특히 HIV, HTLV, 대상포진 (Herpes) 바이러스, 뎅기 (Dengue) 바이러스, 폴리오 (Polio) 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 풍진 바이러스, 간염 바이러스 등과 같은 백시니아 바이러스 이외의 바이러스, (ii) 박테리아, (iii) 진균, (iv) 종양 관련 항원과 같은 종양 관련 폴리펩티드/단백질에서 유래한 폴리에피토프, 펩티드 또는 단백질을 들 수 있다.
대안적으로, 코딩 서열은 인터류킨, 인터페론, 리보자임 또는 효소와 같은 치료 화합물을 코딩할 수 있다.
보다 일반적으로, 본 발명은 본 발명에 따른 프로모터 및/또는 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 임의의 핵산 서열에 관한 것이다. 예컨대 상기 프로모터가 레트로바이러스 게놈의 일부인 경우, 핵산은 RNA 일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 핵산은 DNA 이다. 상기 DNA 는 선형, 원형, 단일쇄 또는 이중쇄 DNA 와 같은 임의 유형의 DNA 일 수 있다.
추가 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 프로모터 및/또는 발현 카세트는 벡터의 일부일 수 있다. "벡터" 라는 용어는 당업자에게 공지된 임의 벡터를 나타낸다. 벡터는 pBR322 와 같은 플라스미드 벡터 또는 pUC 시리즈의 벡터일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 벡터는 바이러스 벡터이다. 본 발명의 명세서에 있어서, "바이러스 (viral 또는 virus) 벡터" 라는 용어는 바이러스 게놈을 포함하는 감염성 바이러스를 나타낸다. 이 경우, 본 발명의 DNA 는 해당 바이러스 벡터의 바이러스 게놈의 일부이다. 재조합 바이러스 게놈이 패키징되고 (packaged), 수득된 재조합 벡터가 세포 및 세포주의 감염을 위해, 특히 인간을 포함하는 살아있는 동물의 감염을 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 전형적인 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 2 (adeno associated virus 2, AAV2) 에 근거한 벡터이다. 폭스바이러스 벡터가 가장 바람직하다. 폭스바이러스는 바람직하게는 카나리폭스 (canarypox) 바이러스, 조류폭스 (fowlpox) 바이러스 또는 백시니아 바이러스일 수 있다.
변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA) (Sutter, G. 등, [1994], Vaccine 12: 1032~40; Antoine, G. 등, [1998], Virology 244: 365~396) 가 보다 바람직하다. 본 출원에서 사용되는 "MVA" 라는 용어는 종래 기술에 공지된 임의의 MVA 균주를 나타낸다. MVA 균주의 예로는 미국 세포주 은행 (American Type Culture collection (ATCC), Manassas, VA 20108, USA) 에 기탁된 기탁번호 VR-1508 을 들 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 MVA 바이러스 균주의 추가예로는 유럽 세포주 은행 (European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (UK)) 에 각각 기탁번호 ECACC V94012707 및 ECACC V00120707 로 기탁된 균주 MVA 572 및 575, 기탁번호 ECACC V00083008 의 MVA-BN 을 들 수 있다.
가장 바람직한 MVA-균주는 MVA-BN 또는 이들의 유도체이다. MVA-BN 의 특징, MVA 균주가 MVA-BN 인지 또는 이들의 유도체인지 여부를 평가할 수 있는 생물학적 분석법의 설명 및 MVA-BN 또는 이들의 유도체를 수득할 수 있는 방법은 WO 02/42480 에 개시되어 있다. 상기 출원의 내용은 본 출원에 참조로 포함된다. 특히, 본 발명에 따른 백시니아 바이러스의 특성에 대한 정의는 MVA 의 특성 및 MVA-BN 유도체의 특성 및 정의와 같은 WO 02/42480 에 기재된 바를 참조한다. 상기 참조문헌은 또한 MVA 및 다른 백시니아 바이러스가 어떻게 증식될 수 있는지를 개시하고 있다. 간단히, 진핵 세포를 상기 바이러스로 감염시킨다. 진핵 세포는 해당 폭스바이러스로 감염되기 쉽고, 감염성 바이러스의 복제 및 생성을 허용하는 세포이다. MVA 에 있어서, 상기 유형의 세포의 예로는 닭 태아 섬유아세포 (CEF) 및 BHK 세포를 들 수 있다 (Drexler I., Heller K., Wahren B., Erfle V. 및 Sutter G., "Highly attenuated modified vaccinia Ankara replicates in baby hamster kidney cells, a potential host for viral propagation, but not in various human transformed and primary cells", J. Gen. Virol. (1998), 79, 347~352). CEF 세포는 당업자에게 공지된 조건 하에 배양할 수 있다. 바람직하게는 CEF 세포는 고정 플라스크 또는 회전병에서 무혈청 배지 중에 배양한다. 인큐베이션은 바람직하게는 37℃±2℃ 에서 48 내지 96 시간 동안 수행한다. 감염을 위해, MVA 는 바람직하게는 감염다중도 (multiplicity of infection, MOI) 0.05 내지 1 의 TCID50 으로 사용하며, 인큐베이션은 바람직하게는 37℃±2℃ 에서 48 내지 72 시간 동안 수행한다.
본 발명에 따른 발현 카세트 또는 프로모터를 바이러스 게놈 내로, 특히 백시니아 바이러스의 게놈 내로, 가장 바람직하게는 MVA 의 게놈 내로 삽입할 수 있는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예로서, 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 프로모터 또는 이들의 유도체를 동종 재조합에 의해 MVA 의 게놈 내로 삽입할 수 있다. 상기 목적을 위해 핵산을 CEF 또는 BHK 세포와 같은 허용 세포주 내로 전달감염시키며, 여기서 상기 핵산은 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 프로모터 또는 이들의 유도체가 삽입될 MVA 게놈 영역에 상동성을 갖는 뉴클레오티드 신장기가 측부인접한 (flanked) 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 프로모터 또는 이들의 유도체를 포함한다. 상기 세포를 MVA 로 감염시키면, 감염된 세포에서는 핵산 및 바이러스 게놈 사이에 상동성 재조합이 일어난다. 대안적으로, 먼저 세포를 MVA 로 감염시킨 후, 핵산을 상기 감염된 세포 내로 전달감염시키는 것도 가능하다. 또 다시 세포에서는 재조합이 일어난다. 이어서, 재조합 MVA 를 당분야에 공지된 방법으로 선택한다. 재조합 MVA 의 구축은 상기 특정 방법에 제한되지는 않는다. 대신, 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법을 상기 목적을 위해 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 발현 카세트 또는 프로모터를 벡터의 적합한 임의 부분 내로, 특히 바이러스 게놈 내로 도입할 수 있다. 백시니아 바이러스의 경우, 상기 삽입은 바이러스 게놈의 비필수 부분 내로, 또는 바이러스 게놈의 유전자 사이 (intergenic) 영역 내로 수행할 수 있다. "유전자 사이 영역" 이라는 용어는 바람직하게는 코딩 서열을 포함하지 않는, 두 인접 유전자 사이에 위치한 바이러스 게놈 부분을 나타낸다. 상기 벡터가 MVA 인 경우, 삽입은 또한 바이러스 게놈의 자연적으로 생성되는 결실 부위 내로 수행될 수 있다. "자연적으로 생성되는 결실 부위" 라는 용어는 백시니아 바이러스 코펜하겐 (Copenhagen) 균주의 게놈에 대해 결실된 바이러스 게놈 부분을 나타낸다. 그러나, 닭 태아 섬유아세포 (CEF 세포) 와 같은 하나 이상의 세포 배양 시스템에서 증폭 및 증식할 수 있는 재조합체를 수득할 수 있는 한, 발현 카세트는 바이러스 게놈의 임의 위치에 삽입될 수 있다는 본 발명의 범위 내에 속하므로, 상기 삽입 부위가 백시니아 바이러스 게놈 및 MVA 게놈 내의 상기 바람직한 삽입 부위에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 프로모터는 이미 벡터의 일부인 유전자, 예컨대 MVA 의 게놈인 유전자를 발현하는데 사용될 수 있다. 상기 유전자는 바이러스 게놈의 자연적 일부인 유전자 또는 이미 벡터 내로 삽입된 외래 유전자일 수 있다. 이러한 경우, 본 발명에 따른 프로모터는 그 발현이 상기 프로모터에 의해 조절될 벡터 내 유전자의 상류에 삽입된다. 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 MVA 벡터는 또한 개방 해독틀 A42R, J6R, F6R, I2R, C7L 및 B9R 중 어느 하나를 그 발현이 상기 개방 해독틀 중 어느 하나의 발현을 자연적으로 조절하는 프로모터에 의해 조절될 코딩 서열로 대체하여 수행할 수 있다. 따라서, 예로서 A42R 코딩 서열 또는 이들의 일부를 발현될 코딩 서열로 대체할 수 있다. 생성 구축물에 있어서, 상기 코딩 서열은 본 발명에 따른 프로모터, 즉 서열 번호 1 및 서열 번호 7 에 따른 프로모터 서열에 의해 조절된다. 상기 발현 카세트는 또한 본 발명의 범위 내에 속한다.
추가 구현예에 따르면, 본 발명은 백신 또는 약제로서의 본 발명에 따른 벡터에 관한 것이다. 보다 일반적으로, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 카세트, DNA 또는 벡터를 포함하는 백신 또는 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 백신 또는 약학적 조성물을 동물 또는 인간 신체로 투여할 수 있는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. DNA 및 플라스미드 벡터의 경우, 상기 DNA 및 벡터는 주사에 의해 간단히 투여할 수 있다. 상기 벡터가 백시니아 바이러스 벡터, 특히 MVA 벡터와 같은 바이러스 벡터인 경우, 이는 또한 당업자에 지식에 따라, 예컨대 정맥내, 근육내, 비강내, 피내 또는 피하 투여에 의해 동물 또는 인간 신체로 투여할 수 있다. 바이러스의 투여량에 대한 추가적 구체사항은 하기에 주어진다.
약학적 조성물 또는 백신은 일반적으로 본 발명에 따른 프로모터, 발현 카세트 또는 벡터에 부가하여 하나 이상의 약학적으로 허용가능하고/하거나 허가된 담체, 첨가제, 항생제, 방부제, 항원보강제, 희석제 및/또는 안정화제를 포함할 수 있다. 상기 보조 물질은 물, 식염수, 글리세롤, 에탄올, 수화제 또는 유화제, pH 완충 물질 등일 수 있다. 적합한 담체는 전형적으로 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체 등과 같이 크고 느리게 대사되는 분자이다.
약학적 조성물 또는 백신의 제조를 위해, 본 발명에 따른 DNA, 발현 카세트 또는 벡터, 특히 재조합 MVA 와 같은 재조합 백시니아 바이러스를 생리학적으로 허용가능한 형태로 전환시킨다. 백시니아 바이러스, 특히 MVA 에 있어서, 이는 천연두에 대한 예방접종을 위해 사용되는 폭스바이러스 백신의 제조 시 경험에 근거하여 수행될 수 있다 (Stickl, H. 등, [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386~2392 에 기재된 바와 같음). 예를 들어, 정제된 바이러스는 약 10 mM 트리스, 140 mM NaCl (pH 7.4) 중에서 제형화하여 역가 5×108 TCID50/㎖ 로 -80℃ 에서 보관한다. 백신 접종물 (shot) 의 제조를 위해, 예컨대 본 발명에 따른 재조합 바이러스 101~109 개 입자를 앰플, 바람직하게는 유리 앰플 내에 2% 펩톤 및 1% 인간 알부민의 존재 하에 인산염 완충 식염수 (PBS) 중에 동결건조한다. 대안적으로, 백신 접종물은 제형물 중 바이러스의 단계적 냉동-건조에 의해 제조할 수 있다. 상기 제형물은 만니톨, 덱스트란, 설탕, 글리신, 락토오스 또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 부가적 첨가제, 또는 항산화제 또는 불활성 기체, 안정화제 또는 재조합 단백질 (예컨대 인간 혈청 알부민) 과 같은 생체 내 투여에 적합한 다른 첨가제를 포함할 수 있다. 냉동-건조에 적합한 전형적인 바이러스 함유 제형물은 10 mM 트리스-완충액, 140 mM NaCl, 18.9 g/ℓ 덱스트란 (MW 36000~40000), 45 g/ℓ 수크로오스, 0.108 g/ℓ L-글루탐산 모노 칼륨염 1 수화물 (pH 7.4) 을 포함한다. 이어서, 상기 유리 앰플을 밀봉하여, 수 개월 동안 4℃ 내지 실온에서 보관할 수 있다. 그러나, 필요하지 않은 경우에는, 상기 앰플은 바람직하게는 -20℃ 미만 온도에서 보관한다.
예방접종 또는 치료를 위해서는, 동결건조물 또는 냉동-건조 산물을 0.1 내지 0.5 ㎖ 의 수용액, 바람직하게는 물, 생리 식염수 또는 트리스 완충액 중에 용해하고, 비경구, 근육내 또는 당업자에게 공지된 임의의 기타 투여 경로에 의해 전신 또는 국소 투여할 수 있다. 투여 방식, 투여 용량 및 횟수는 공지된 방식으로 당업자가 최적화할 수 있다.
즉, 관련 구현예에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 카세트, DNA, 벡터, 약학적 조성물 또는 백신을 치료할 동물 또는 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 포함하는 동물의 생체 내에서 면역 반응에 영향을 미치는 방법, 바람직하게는 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기 백신이 백시니아 바이러스, 특히 MVA 인 경우, 인간에 대한 전형적인 백신 접종물은 102 이상, 바람직하게는 104 이상, 보다 바람직하게는 106 이상, 더욱 바람직하게는 107 또는 108 TCID50 (조직 배양 감염량) 바이러스를 포함한다.
상기 백신이 재조합 MVA, 특히 재조합 MVA-BN 및 그 유도체인 경우, 상기 바이러스는 초회-추가 (prime-boost) 투여에 사용될 수 있다. 즉, 본 발명은 또한 상기 벡터가 MVA, 특히 MVA-BN 및 그 유도체이고, 상기 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 조성물 또는 백신이 이를 필요로 하는 인간을 포함하는 동물에게 1 차 접종 ("초회용량 접종") 및 2 차 접종 ("추가용량 접종") 시 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 벡터, 발현 카세트 또는 DNA 를 표적 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 표적 세포 내로 코딩 서열을 도입하는 방법에 관한 것이다. 상기 벡터가 백시니아 바이러스, 특히 MVA-BN 과 같은 MVA 인 경우, 표적 세포는 CEF 또는 BHK 세포와 같이 바이러스가 내부에서 복제될 수 있는 세포, 또는 MVA 에 의해 감염될 수 있지만 바이러스가 내부에서 복제되지 않는 세포 (예컨대 MVA-BN 에 대한 모든 유형의 인간 세포) 일 수 있다.
본 발명은 또한 숙주 세포를 본 발명에 따른 바이러스 벡터로 감염시키는 단계, 이어서 감염된 숙주 세포를 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 이후 상기 숙주 세포에 의해 생성된 펩티드 및/또는 단백질 및/또는 바이러스를 단리 및/또는 농축하는 단계를 포함하는 펩티드, 단백질 및/또는 바이러스의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바이러스를 제조하려는 경우, 즉 증폭하려는 경우, 상기 세포는 바이러스가 내부에서 복제될 수 있는 세포여야 한다. 백시니아 바이러스, 특히 MVA 에 있어서, 적합한 세포는 CEF 또는 BHK 세포이다. 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 의해 코딩되는 펩티드/단백질을 제조하려는 경우, 상기 세포는 바이러스 벡터에 의해 감염될 수 있고, 바이러스에 의해 코딩된 단백질/펩티드의 발현을 허용하는 임의 세포일 수 있다.
본 발명은 또한 세포를 본 발명에 따른 발현 카세트, DNA 또는 플라스미드 벡터로 전달감염시키는 단계, 이어서 세포를 백시니아 바이러스로 감염시키는 단계를 포함하는 펩티드, 단백질 및/또는 바이러스의 제조 방법에 관한 것이다. 감염된 숙주 세포는 적합한 조건 하에 배양한다. 추가 단계는 상기 숙주 세포에 의해 제조된 펩티드 및/또는 단백질 및/또는 바이러스를 단리 및/또는 농축하는 단계를 포함한다. 세포를 백시니아 바이러스로 감염시키는 단계는 세포의 전달감염 단계 이전 또는 이후에 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 프로모터, DNA, 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다. 특히 본 발명은 본 발명에 따른 바이러스 벡터로 감염된 세포에 관한 것이다.
도 1: 상이한 프로모터에 의한 발현 후 GUS 활성
세포를 MVA-BN 으로 감염시키고, 적절한 플라스미드로 전달감염시켰다. 48 시간 후, 세포를 추출하고, 황색 발색을 일으키는 효소 반응 후 415 nm 에서의 감 광도를 측정하여, GUS 활성을 간접적으로 결정하였다. Zex = 음성 대조군 (MVA-BN 감염 세포).
도 2: 초기 및 초기/후기 발현 후 GUS 활성
세포를 MVA-BN 으로 감염시키고, 적절한 플라스미드로 전달감염시켰다. 24 시간 후, 세포를 추출하고, 황색 발색을 일으키는 효소 반응 후 415 nm 에서의 감광도를 측정하여, GUS 활성을 간접적으로 결정하였다. Zex = 음성 대조군 (MVA-BN 감염 세포). 상기 효소 반응에 있어서, 발색 반응을 수득하기 위해, AraC 가 없는 샘플 (초기 + 후기 발현) 은 5 시간 동안 인큐베이션해야 했고, AraC 가 있는 샘플 (초기 발현) 은 하룻밤 동안 인큐베이션해야 했다.
도 3: 상이한 프로모터에 의한 발현 후 GUS 활성
세포를 MVA-BN 으로 감염시키고, 적절한 플라스미드로 전달감염시켰다. 24 시간 후, 세포를 추출하고, 황색 발색을 일으키는 효소 반응 후 415 nm 에서의 감광도를 측정하여, GUS 활성을 간접적으로 결정하였다. Control = 음성 대조군 (MVA-BN 감염 세포).
하기 실시예(들)은 본 발명을 더욱 예시할 것이다. 당업자라면 제시되는 실시예(들)이 본 발명에 의해 제시되는 기술의 적용가능성을 이들 실시예(들)에 제한하는 방식으로 해석될 수 없음을 잘 이해할 것이다
실시예 1: MVA - BN 게놈에서 코딩 서열을 발현하기 위한 프로모터의 분석
1.1 실험의 목적:
본 분석의 목적은 MVA 게놈 내 코딩 서열, 바람직하게는 자연적 MVA 게놈에 이종성인 코딩 서열을 발현하는데 적합한 프로모터를 동정하는 것이었다. 특히 단일 삽입 부위에 두 개 이상의 유전자의 삽입을 위해서는, 외래 유전자 중 하나의 결실을 일으킬 수 있는 재조합 사건의 위험성을 감소시키기 위해 각각의 유전자의 발현을 위해 상이한 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 프로모터의 강도에 따라, 재조합 MVA-BN 에 삽입된 외래 유전자를 다양한 양으로 발현할 가능성을 갖도록 하기 위해, 상이한 강도의 프로모터를 갖는 것이 바람직하다. 총 11 개의 후보 프로모터를 단리하였다. 이들 후보 프로모터 서열을 플라스미드 골격 (pBSKS+) 내에 클로닝하였다. 이들의 잠재 활성을 분석하기 위해, 상기 프로모터를 GUS (대장균 β-글루쿠로니다아제) 리포터 유전자에 융합하였다. BHK (baby hamster kidney, 베이비 햄스터 신장) 세포를 MVA-BN 으로 감염시키고, GUS 유전자에 융합된 후보 프로모터를 포함하는 플라스미드로 전달감염시켰다. 프로모터가 기능을 갖는 경우, GUS 가 발현되고 GUS 의 효소 반응에 의해 정량화할 수 있었다. 양성 대조군 및 참조물로서, 특징이 잘 밝혀진 백시니아 바이러스 프로모터 p7.5 및 Ps 를 GUS 에 융합하여 나란히 분석하였다. GUS 발현의 측정을 통해, 후보 프로모터를 활성, 강도 및 초기/후기 발현에 대해 스크리닝하였다. 초기/후기 발현은 배양 배지에 AraC (아라비노시드 시토신) 를 첨가하여 확인하였다. 기능을 갖는 것으로 나타난 프로모터, 즉 종래 기술에 공지된 Ps, p7.5, 7.5L 및 ATI 프로모터 뿐만 아니라 MVA ORF 들의 발현 조절에 자연적으로 관여하는 새로이 동정된 프로모터 서열 A42L, B9R, C7L, F6R, I2R, J6R 은 바람직하게는 재조합 MVA 구축물 (recMVA-BN) 에서 외래 유전자의 발현을 위해 사용할 수 있다.
1. 2 재료
세포: BHK 세포
바이러스: MVA-BN 표준 조정제 (crude) 스톡 (7.5×107 TCID50)
DNA: pAB-GUS (Ps 프로모터 + GUS)
pBNX71 (pBluescript + 백시니아 바이러스 pr7.5 + GUS)
pBNX73 (pBluescript + 우두 바이러스 ATI 프로모터 + GUS)
pBN81 (pBluescript + 변형된 H5R 프로모터 + GUS1)
pBN61 (pBluescript + MVA B1R 프로모터 + GUS)
pBN62 (pBluescript + MVA B2R 프로모터 + GUS)
pBN63 (pBluescript + MVA B3R 프로모터 + GUS)
pBN60 (pBluescript + MVA A30R 프로모터 + GUS)
pBN82 (pBluescript + 백시니아 바이러스 7.5L 프로모터 + GUS)
pBN83 (pBluescript + MVA C7L 프로모터 (서열 번호 5) + GUS)
pBNX49 (pBluescript + MVA A42R 프로모터 (서열 번호 1) + GUS)
pBNX69 (pBluescript + MVA I2R 프로모터 (서열 번호 4) + GUS)
pBNX72 (pBluescript + MVA K5L 프로모터 + GUS)
pBNX83 (pBluescript + MVA F6R 프로모터 (서열 번호 3) + GUS)
pBNX84 (pBluescript + MVA B9R 프로모터 (서열 번호 6) + GUS)
pBNX85 (pBluescript + MVA J6R 프로모터 (서열 번호 2) + GUS)
전달감염 키트: Effectene 전달감염 키트 (Qiagen)
배지 및 보충 물질: DMEM (Gibco BRL) + 10% FCS (Gibco BRL)
화학 물질 및 완충액: 용해 완충액 (PBS + 0.1% 트리톤 + 1 mM 프로테아제 저해제)
AraC (Sigma, Cat. No. C1768)
GUS 기질 1 mM (p-니트로페닐-베타-(D)-글루쿠로니드; Sigma, Cat. No. N1627)
정지 용액 2.5 M (2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올; Sigma, Cat. No. A9754)
1.3 방법
세포의 접종
5×105 BHK 세포를 6-웰 플레이트의 웰에 전달감염 반응을 위해 접종하고, 37℃ 및 5% CO2 하에 하룻밤 동안 DMEM/10% FCS 중에 유지했다.
감염/ 전달감염
세포를 1 웰 당 0.5 ㎖ DMEM/10% FCS 중 MVA-BN (moi 0.1) 으로 감염시키고, 진탕기 상 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 제조자의 프로토콜에 기재된 대로 전달감염을 수행하였다. 2 ㎍ 의 플라스미드를 완충액 EB (총 부피 100 ㎕) 중에 희석하였다. 3.2 ㎕ 의 인핸서 (enhancer) 용액을 첨가한 후, 용액을 혼합하 고 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 10 ㎕ 의 Effectene 시약을 첨가하고, 현탁액을 혼합하여 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 바이러스-현탁액을 세포로부터 제거하고, 1.6 ㎖ DMEM/10% FCS 를 첨가하였다. 0.6 ㎖ DMEM/10% FCS 를 DNA Effectene 혼합물에 첨가하고, 배양 플레이트를 회전시키면서 세포에 적하하였다. 이어서 세포를 분석에 따라 7, 24 또는 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 초기/후기 발현의 분석을 위해, 감염 및 전달감염 도중에 AraC 를 첨가하였다 (40 ㎍/㎖).
세포의 수집
세포로부터 배지를 제거하고 0.5 ㎖ 의 용해 완충액을 첨가하였다. 실온에서 15 분 동안 진탕한 후, 세포를 용해 완충액 중에서 찰과시키고 (scraped), 1.5 ㎖ 반응관으로 옮겨 강력히 와동교반 (vortex) 하였다. 용해된 세포를 500 rcf 및 4℃ 에서 1 분 동안 원심분리하고, 투명한 상청액을 새 바이알에 옮겨 사용시까지 -20℃ 에서 보관하였다.
GUS 활성 결정
10 ㎕ 의 세포 추출물 (= 2×104 개 세포에서 얻은 단백질) 을 1 ㎖ 의 예비 가온한 기질 용액 (37℃) 에 첨가하고, 황색 발색이 일어날 때까지 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 이어서 샘플을 즉시 얼음 위에 놓고, 0.4 ㎖ 의 정지 용액을 첨가하였다. 415 nm 에서의 감광도를 결정하고, 0.05 내지 2.0 사이의 감광도값을 선형 범위로 하여 GUS 활성으로 표시했다. 기질 용액을 참조물로 사용하고, MVA-BN 감염 세포의 세포 추출물을 음성 대조군으로 사용하였다.
1.4 실험 및 결과
실험 1: 후보 프로모터의 기능 결정
첫번째 실험을 위해, GUS 유전자에 융합된 후보 MVA 프로모터 또는 특징이 잘 분석되어 있는 프로모터를 포함하는 모든 플라스미드를 분석하였다. 세포를 MVA-BN (moi 0.1) 으로 감염시키고, 해당 플라스미드로 전달감염시켰다. 세포를 48 시간 후에 수집하고, 용해하여, GUS 활성을 결정하였다. 상기 실험은 어느 프로모터가 기능을 갖는지를 결정하기 위해 수행하였다. 결과를 도 1 에 나타낸다. 음성 대조군 (MVA-BN 감염 세포로부터의 추출물) 은 확실히 GUS 활성을 나타내지 않았다 (Zex; 감광도 0.001). 특징이 잘 분석되어 있는 강력한 합성 Ps 프로모터는 발현 48 시간 후 검출가능한 다량의 GUS 가 존재하였으므로, 매우 효율적으로 나타났다 (Ps; 감광도 0.87). 또한 널리 공지된 자연적으로 생성되는 백시니아 바이러스 pr7.5 프로모터도 상당히 높은 활성을 나타냈다 (p7.5; 감광도 0.41). 또한 pr7.5 의 후기부 (7.5L; 감광도 0.25) 는 확실히 검출가능한 활성을 나타냈다. 우두 ATI 프로모터는 MVA-BN 에 의한 외래 유전자의 발현을 위해 매우 효율적인 것으로 확실히 나타났다 (ATI; 감광도 0.76). MVA-BN 게놈의 후보 프로모터 영역에 대해서는, A42R (A42; 감광도 0.48), B9R (B9; 감광도 0.06), C7L (C7; 감광도 0.055), F6R (F6; 감광도 0.208), I2R (I2 ; 감광도 0.130) 및 J6R (J6; 감광도 0.290) 이 기능을 갖는 프로모터로 나타났다. 첫번째 예비 실험에서 확실히 활성을 갖는 것으로 나타난 프로모터 (감광도 > 0.05) 를 보다 자세히 특징 분석하였다 (실험 2).
실험 2: 프로모터 발현의 특징 분석
실험 1 에서 활성을 나타낸 프로모터를 이들의 발현 패턴에 대해 특징 분석하였다. 상기 목적을 위해, MVA-BN 으로 감염되고 해당 플라스미드로 전달감염된 세포를 AraC 와 함께 인큐베이션하였다. AraC 는 MVA 복제 주기 도중 유전자의 후기 발현에 필수적인 요건인 DNA 복제를 저해한다. 더불어, 동일한 실험을 AraC 를 첨가하지 않고 수행하였다. 감염되고 전달감염된 세포를 24 시간 후에 수집하여, GUS 활성을 3 회씩 결정하였다. 도 2 는 각 샘플의 평균 감광도를 나타낸다.
24 시간 동안 AraC 없이 인큐베이션한 후 (-AraC), 총 GUS 발현 (초기 + 후기) 은 모든 프로모터에 대해 확실히 검출가능하였다 (도 2: 우측 칼럼). 새로 동정된 프로모터의 강도를 큰 순서부터 연속으로 나타내면 다음과 같다: I2R (I2) > A42R (A42) > F6R (F6) > J6R (J6) > B9R (B9) = C7L (C7).
프로모터 B9, C7 및 J6 은 후기 발현을 저해하는 AraC 와의 인큐베이션 시 (+AraC), 음성 대조군 (Zex) 에 비견될만한 GUS 발현 수준을 일으켰으므로, MVA 의 생체 주기 도중 후기 발현에 주로 관여하는 것으로 나타났다. C7L 프로모터는 다소 약한 여러 반응이 존재하는 것으로 나타났지만, 초기 발현 동안 중요한 역할을 수행한다.
프로모터 A42R, I2R 및 F6R 은 매우 효율적인 초기 발현을 확실히 나타낸다. 초기 발현의 결정을 위해, 검출가능한 발색 반응을 얻기 위해 샘플을 하룻밤 동안 인큐베이션해야 했다. 상기 결과는 이들이 5 시간 동안만 인큐베이션되었으므로, 초기 + 후기 발현값과 직접적으로 비교할 수는 없다 (도 2: -AraC). 초기 발현을 나타낸 프로모터를 발현 7 시간 후 다시 분석하여, 24 시간 후의 결과를 확인할 수 있었다 (데이타는 나타내지 않았음).
1.5 결론
상이한 강도의 프로모터를 수득할 수 있으며, 인큐베이션 기간 및 MVA-BN 의 복제 가능성에 따라 상이한 발현 패턴을 보이는, 상이한 여러 프로모터가 이용가능한 것이 확실히 나타났다. 초기 + 후기 발현이 바람직한 경우, 프로모터 A42R, I2R 및 F6R 이 바람직하게 사용된다. 초기 발현이 회피되어야 하는 경우 (예컨대, 초기 발현에 대해 정지 신호 TTTTTNT 를 포함하는 외래 유전자에 있어서), 프로모터 B9R, J6R 또는 C7L 이 바람직하게 사용된다.
실시예 2: 서열 번호 1 내지 4 에서 유래한 최소 프로모터 요소의 분석
실시예 1 에서는 MVA 게놈에서 외래 유전자를 발현하기 위해 특히 적합한 여러 서열이 동정되었다. 더 짧은 단편이 동일한 목적을 충족시킬 수 있는지를 확인하기 위해, 추가 실험을 수행하였다. 서열 번호 1 내지 4 의 더 짧은 단편을 PCR 로 단리하고, 플라스미드 골격 (pBSKS+) 에 클로닝하였다. 총 6 개의 후보 최소 프로모터를 시험하였다. 이들의 잠재 활성을 분석하기 위해, 프로모터를 GUS 리포터 유전자에 융합하였다. BHK 세포를 MVA-BN 으로 감염시키고, GUS 유전자에 융합된 후보 최소 프로모터를 포함하는 플라스미드로 전달감염시켰다. GUS 발현을 측정함으로써, 후보 프로모터를 활성 및 발현 강도에 대해 스크리닝하였다 (실시예 1 참고). 양성 대조군 및 참조물로서, 특징이 잘 분석되어 있는 백시니아 바이러스 후기 프로모터 Ps 를 GUS 에 융합하고, 나란히 분석하였다. 약 30 bp 의 최소 프로모터 요소는 원래의 프로모터 및 추가로 클로닝된 프로모터의 상동 서열 간 상동성 재조합의 위험성 없이 재조합 MVA 구축물 (recMVA-BN) 에서 외래 유전자를 발현하기 위해 사용할 수 있다.
2.1 재료 및 방법
달리 나타내지 않았다면, 실시예 2 에서 사용되는 재료 및 방법은 실시예 1 에서의 방법에 대응한다. PCR 은 표준 기법에 따라 수행했다.
2.2 실험 및 결과
PCR 에 의한 프로모터의 GUS 유전자로의 융합
PCR 반응으로 하기 최소 프로모터 서열을 GUS 유전자에 융합했다:
Figure 112006028030137-PCT00007
GUS 유전자에 융합된 모든 후보 최소 프로모터를 pBSKS+ 에 클로닝하고 서열분석했다.
후보 최소 프로모터의 기능 결정
후보 최소 프로모터 요소의 기능성을 분석하기 위해, BHK 세포를 MVA-BN (moi 1.0) 으로 감염시키고, 대응 플라스미드로 전달감염시켰다. 24 시간 후 세포를 수집하여 용해하고, GUS 활성을 결정하였다 (도 3).
음성 대조군 (MVA-BN 감염 세포로부터의 추출물) 은 확실히 GUS 활성을 나타내지 않았다 (대조군; 평균 감광도 0.00167). 발현 24 시간 후 다량의 GUS 가 검출가능하였으므로, 특징이 잘 분석되어 있는 강력한 합성 Ps 프로모터는 매우 효율적인 것으로 나타났다 (Ps; 평균 감광도 2.05267). MVA-BN 게놈의 후보 최소 프로모터 요소에 있어서는 모든 F6R short early, F6R short late, I2R short early, I2R short late, A42R short late 및 J6R short late 가 기능을 갖는 프로모터인 것으로 나타났다.
총 6 개의 기능을 갖는 최소 프로모터 요소를 단리하였다. 2 개는 더 약한 초기 전사에 적합하고 (I2R short early: 평균 감광도 0.06933; F6R short early: 평균 감광도 0.189), 4 개는 상이한 수준의 후기 발현에 적합하다 (F6R short late: 평균 감광도 0.09833; I2R short late: 평균 감광도 0.391; J6R short late: 평균 감광도 0.80167 및 A42R short late: 평균 감광도 2.07).
2.3 결론
상이한 강도의 프로모터를 단리할 수 있으며, 이제 상이한 여러 프로모터가 이용가능한 것이 확실히 나타났다. 초기 발현이 바람직한 경우, 최소 프로모터 F6R short early 또는 I2R short early 가 바람직하게 사용된다. 후기 발현이 바람직하고 초기 발현은 회피되어야 하는 경우 (예컨대, 초기 발현에 대해 정지 신호 TTTTTNT 를 포함하는 외래 유전자에 있어서), 최소 프로모터 요소 F6R short late, I2R short late, J6R short late 및 A42R short late 가 바람직하게 사용된다.
<110> Bavarian Nordic A/S <120> Promoters for Expression in Modified Vaccinia Virus Ankara <130> 2006-FPA-1777 <150> DK PA200301730 <151> 2003-11-24 <150> EP04000943.3 <151> 2004-01-17 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 171 <212> DNA <213> Modified Vaccinia Virus Ankara <400> 1 tctgcaatat tgttatcgta attggaaaaa tagtgttcga gtgagttgga ttatgtgagt 60 attggattgt atattttatt ttatatttta tattttgtag taagaataga atgctaatgt 120 caagtttatt ccaatagatg tcttattaaa aaacatatat aataaataac a 171 <210> 2 <211> 105 <212> DNA <213> Modified Vaccinia Virus Ankara <400> 2 gataaaaatt taaagtgtaa atataactat tattttatag ttgtaataaa aagggaaatt 60 tgattgtata ctttcggttc tttaaaagaa actgacttga taaaa 105 <210> 3 <211> 136 <212> DNA <213> Modified Vaccinia Virus Ankara <400> 3 gcatttcatc tttctccaat actaattcaa attgttaaat aaataatgga tagtataaat 60 agttattagt gataaaatag taaaaataat tattagaata agagtgtagt atcatagata 120 actctcttct ataaaa 136 <210> 4 <211> 98 <212> DNA <213> Modified Vaccinia Virus Ankara <400> 4 gatctataaa ggtagaccta atcgtctcgg atgaccatat atttattttc agttttatta 60 tacgcataaa tagtaaaaaa tatgttaggt ttacaaaa 98 <210> 5 <211> 160 <212> DNA <213> Modified Vaccinia Virus Ankara <400> 5 ggtaaacttt aagacatgtg tgttatacta agatggttgg cttattccat agtagcttgt 60 ggaatttata aacttatgat agtaaaacta gtacccaata tgtaaagatg aaaaagtaaa 120 ttactattaa cgccgtcggt attcgttcat ccattcagtt 160 <210> 6 <211> 156 <212> DNA <213> Modified Vaccinia Virus Ankara <400> 6 atttctcggt agcacatcaa atgatgttac cacttttctt agcatgctta acttgactaa 60 atattcataa ctaattttta ttaatgatac aaaaacgaaa taaaactgca tattatacac 120 tggttaacgc ccttataggc tctaaccatt ttcaag 156 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Modified Vaccinia Virus Ankara <400> 7 tcttattaaa aaacatatat aataaataac a 31 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Modified Vaccinia Virus Ankara <400> 8 gataaaaatt taaagtgtaa atataactat 30 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Modified Vaccinia Virus Ankara <400> 9 agagtgtagt atcatagata actctcttct ataaaat 37 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Modified Vaccinia Virus Ankara <400> 10 attgttaaat aaataatgga tagtataaat 30 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Modified Vaccinia Virus Ankara <400> 11 agtaaaaaat atgttaggtt tacaaaa 27 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Modified Vaccinia Virus Ankara <400> 12 atttattttc agttttatta tacgcataaa t 31

Claims (22)

  1. (i) 서열 번호 1 내지 6 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열,
    (ii) 서열 번호 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 서열의 서브서열, 및
    (iii) (i) 또는 (ii) 에 정의된 서열에 대해 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 프로모터로서, 상기 프로모터가 백시니아 바이러스 프로모터로서 활성을 갖고/갖거나 백시니아 바이러스 감염 세포에서 활성을 갖는 프로모터.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 서브서열이 서열 번호 7 내지 12 를 포함하는 군으로부터 선택되는 프로모터.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 프로모터 및 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트로서, 상기 코딩 서열의 발현이 상기 프로모터에 의해 조절되며, 상기 발현 카세트가 백시니아 바이러스의 게놈에서 자연적으로 생성되는 발현 카세트가 아닌 발현 카세트.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 코딩 서열이 치료 단백질 또는 펩티드, 항원, 항원성 에피토프, 안티센스 RNA 또는 리보자임을 코딩하는 발현 카세트.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 프로모터 또는 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 발현 카세트를 포함하는 DNA.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 프로모터 또는 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  7. 제 6 항에 있어서,
    플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터로부터 선택되는 벡터.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터가 백시니아 바이러스인 벡터.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스가 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA), 바람직하게는 유럽 세포주 은행 (European Collection of Cell Cultures (ECACC)) 에 기탁번호 V00083008 로 기탁된 균주 MVA-BN 또는 그 유도체, ECACC 에 기탁번호 VA94012707 로 기탁된 균주 MVA 572 또는 ECACC 에 기탁번호 V00120707 로 기탁된 균주 MVA 575 인 벡터.
  10. 제 9 항에 있어서,
    제 1 항 또는 제 2 항에 따른 프로모터 또는 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 발현 카세트가 MVA 게놈의 자연적으로 일어나는 결실 부위에 삽입되는 벡터.
  11. 제 9 항에 있어서,
    제 1 항 또는 제 2 항에 따른 프로모터 또는 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 발현 카세트가 바이러스 게놈의 비필수 부분 내로 또는 바이러스 게놈의 유전자 사이 영역 내로 삽입되는 벡터.
  12. 제 6 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    백신 또는 약제인 벡터.
  13. 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 발현 카세트, 제 5 항에 따른 DNA 또는 제 6 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 백신 또는 약학적 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터를 102 TCID50 (조직 배양 감염량) 이상 포함하는 백신 또는 약학적 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터가 1 차 접종 ("초회용량 접종") 및 2 차 접종 ("추가용량 접종") 시 치료 유효량으로 투여되는 백신 또는 약학적 조성물.
  16. 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 발현 카세트, 제 5 항에 따른 DNA 또는 제 6 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 벡터의 백신 또는 약제 제조를 위한 용도.
  17. 제 6 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 발현 카세트, 또는 제 5 항에 따른 DNA 를 표적 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 표적 세포 내로의 코딩 서열의 도입 방법.
  18. 숙주 세포를 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터로 감염시키는 단계, 감염된 숙주 세포를 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 상기 숙주 세포에 의해 제조된 펩티드 및/또는 단백질 및/또는 바이러스를 단리 및/또는 농축하는 단계를 포함하는 펩티드, 단백질 및/또는 바이러스의 제조 방법.
  19. 세포를 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 발현 카세트, 제 5 항에 따른 DNA 또는 제 7 항에 따른 플라스미드 벡터로 전달감염시키는 단계, 세포를 백시니아 바이러스로 감염시키는 단계, 감염된 숙주 세포를 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 상기 숙주 세포에 의해 제조된 펩티드 및/또는 단백질 및/또는 바이러스를 단리 및/또는 농축하는 단계를 포함하는 펩티드, 단백질 및/또는 바이러스의 제조 방법으로서, 세포를 백시니아 바이러스로 감염시키는 단계가 세포의 전달감염 단계 이전 또는 이후에 수행될 수 있는 제조 방법.
  20. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 프로모터, 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 발현 카세트, 제 5 항에 따른 DNA 또는 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터를 포함하는 세포.
  21. 코딩 서열을 발현시키기 위한 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 프로모터의 용도로서, 상기 코딩 서열이 백시니아 바이러스에서 프로모터에 자연적으로 연결된 서열이 아닌 용도.
  22. 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 발현 카세트를 벡터 게놈 내로 삽입하는 단계를 포함하는, 제 6 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 벡터의 제조 방법.
KR1020067007781A 2003-11-24 2004-10-27 변형된 백시니아 바이러스 앙카라에서의 발현을 위한프로모터 KR20060109873A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200301730 2003-11-24
DKPA200301730 2003-11-24
EP04000943A EP1536015B1 (en) 2003-11-24 2004-01-17 Promoters for expression in modified vaccinia virus ankara
EP04000943.3 2004-01-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20060109873A true KR20060109873A (ko) 2006-10-23

Family

ID=34442836

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067007781A KR20060109873A (ko) 2003-11-24 2004-10-27 변형된 백시니아 바이러스 앙카라에서의 발현을 위한프로모터

Country Status (18)

Country Link
US (3) US7816508B2 (ko)
EP (4) EP1536015B1 (ko)
JP (2) JP2007512009A (ko)
KR (1) KR20060109873A (ko)
CN (1) CN1898390A (ko)
AT (4) ATE471383T1 (ko)
AU (1) AU2004295382A1 (ko)
BR (1) BRPI0416916A (ko)
CA (1) CA2546680A1 (ko)
DE (4) DE602004027767D1 (ko)
DK (3) DK1845164T3 (ko)
EA (1) EA012846B1 (ko)
IL (4) IL174653A0 (ko)
NO (1) NO20062948L (ko)
NZ (1) NZ547405A (ko)
SG (2) SG169325A1 (ko)
UA (1) UA90098C2 (ko)
WO (1) WO2005054484A1 (ko)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ524661A (en) * 2000-11-23 2005-03-24 Bavarian Nordic As Modified vaccinia ankara virus variant
EP1536015B1 (en) * 2003-11-24 2007-10-31 Bavarian Nordic A/S Promoters for expression in modified vaccinia virus ankara
EP2042604A1 (en) * 2007-09-26 2009-04-01 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) VV promoter driven overexpression of recombinant antigens
AU2009319336B2 (en) 2008-11-27 2015-03-26 Bavarian Nordic A/S Promoters for recombinant viral expression
US8394385B2 (en) * 2009-03-13 2013-03-12 Bavarian Nordic A/S Optimized early-late promoter combined with repeated vaccination favors cytotoxic T cell response against recombinant antigen in MVA vaccines
US8613936B2 (en) 2009-03-13 2013-12-24 Bavarian Nordic A/S Replication deficient recombinant viruses expressing antigens regulated by transcriptional control elements comprising multiple elements
GB201006405D0 (en) 2010-04-16 2010-06-02 Isis Innovation Poxvirus expression system
US9173933B2 (en) 2010-10-15 2015-11-03 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus Ankara influenza vaccine
EP2788021B1 (en) 2011-12-09 2017-01-18 Bavarian Nordic A/S Poxvirus vector for the expression of bacterial antigens linked to tetanus toxin fragment c
DE102013004595A1 (de) 2013-03-15 2014-09-18 Emergent Product Development Germany Gmbh RSV-Impfstoffe
FR3042121A1 (fr) 2015-10-08 2017-04-14 Jean-Marc Limacher Composition anti-tumorale
CN106754921A (zh) * 2016-12-12 2017-05-31 孙浩 哺乳动物细胞表达启动子及其制造和使用方法
WO2018209315A1 (en) * 2017-05-12 2018-11-15 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Vaccinia virus mutants useful for cancer immunotherapy

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA68327C2 (en) 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
MXPA02008873A (es) 2000-03-14 2003-02-10 Anton Mayr Cepa alterada del virus de vaccinia ankara modificado (mva).
NZ524661A (en) * 2000-11-23 2005-03-24 Bavarian Nordic As Modified vaccinia ankara virus variant
AU2002252199B2 (en) * 2001-03-08 2008-01-03 Emory University MVA expressing modified HIV envelope, GAG, and POL genes
JP2005525821A (ja) 2002-05-16 2005-09-02 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 牛痘ａｔｉプロモーターを用いた変異ワクシニアウイルスアンカラ中の遺伝子の発現
WO2004015118A1 (en) * 2002-08-07 2004-02-19 Bavarian Nordic A/S Vaccinia virus host range genes to increase the titer of avipoxviruses
EP1536015B1 (en) * 2003-11-24 2007-10-31 Bavarian Nordic A/S Promoters for expression in modified vaccinia virus ankara

Also Published As

Publication number Publication date
EP1845164A2 (en) 2007-10-17
IL199128A (en) 2011-03-31
EP1956094B1 (en) 2011-04-06
WO2005054484A1 (en) 2005-06-16
ATE420191T1 (de) 2009-01-15
US20110014242A1 (en) 2011-01-20
CN1898390A (zh) 2007-01-17
EP1956094A1 (en) 2008-08-13
DK1845164T3 (da) 2010-09-20
JP2007512009A (ja) 2007-05-17
IL199126A (en) 2010-12-30
EA200601043A1 (ru) 2006-10-27
NZ547405A (en) 2008-06-30
BRPI0416916A (pt) 2007-01-23
DE602004027767D1 (de) 2010-07-29
EP1845164B1 (en) 2010-06-16
EP1689872A1 (en) 2006-08-16
DE602004009743D1 (de) 2007-12-13
EP1536015A1 (en) 2005-06-01
SG169325A1 (en) 2011-03-30
EP1845164A3 (en) 2008-03-19
SG142300A1 (en) 2008-05-28
DK1689872T3 (da) 2009-04-27
ATE377088T1 (de) 2007-11-15
IL174653A0 (en) 2006-08-20
EP1689872B1 (en) 2009-01-07
US20080112971A1 (en) 2008-05-15
US7816508B2 (en) 2010-10-19
DE602004009743T2 (de) 2008-08-28
ATE504654T1 (de) 2011-04-15
CA2546680A1 (en) 2005-06-16
IL199127A (en) 2010-12-30
US20110008792A1 (en) 2011-01-13
JP2011067219A (ja) 2011-04-07
DE602004018975D1 (de) 2009-02-26
NO20062948L (no) 2006-08-23
EA012846B1 (ru) 2009-12-30
EP1536015B1 (en) 2007-10-31
DE602004032187D1 (de) 2011-05-19
UA90098C2 (en) 2010-04-12
ATE471383T1 (de) 2010-07-15
AU2004295382A1 (en) 2005-06-16
DK1536015T3 (da) 2008-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4895505B2 (ja) 変異ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）ゲノム中の挿入部位としての遺伝子間領域
US20110008792A1 (en) Promoters for expression in modified vaccinia virus ankara
US7300658B2 (en) Recombinant poxvirus comprising at least two compox ATI promoters
EP1404852B1 (en) Expression of genes in modified vaccinia virus ankara by using the cowpox ati promoter
JP2005534326A (ja) アビポックスウイルスの力価を増加させるためのワクシニアウイルス宿主域遺伝子
MXPA06005559A (es) Promotores para la expresion en vaccinia virus ankara modificado

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application