EA012846B1

EA012846B1 - Промотор для экспрессии генов в вирусах осповакцины и/или в клетках, инфицированных вирусом осповакцины, и способы его применения

Info

Publication number: EA012846B1
Application number: EA200601043A
Authority: EA
Inventors: Соня Лейрер
Original assignee: Бавариан Нордик А/С
Priority date: 2003-11-24
Filing date: 2004-10-27
Publication date: 2009-12-30
Also published as: EP1845164A2; IL199128A; EP1956094B1; WO2005054484A1; ATE420191T1; US20110014242A1; CN1898390A; EP1956094A1; DK1845164T3; JP2007512009A; KR20060109873A; IL199126A; EA200601043A1; NZ547405A; BRPI0416916A; DE602004027767D1; EP1845164B1; EP1689872A1; DE602004009743D1; EP1536015A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к промоторам для экспрессии генов в вирусах осповакцины и/или в клетках, инфицированных вирусом осповакцины, а также к способам его применения.

Description

Настоящее изобретение относится к промоторам, в частности промоторам для экспрессии генов и/или кодирующих последовательностей в вирусах осповакцины, таких как модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара (МУЛ). Кроме того, настоящее изобретение относится к экспрессионным кассетам, содержащим указанный промотор, к векторам, содержащим указанные экспрессионные кассеты, а также к фармацевтическим композициям и вакцинам.

Известный уровень техники

Рекомбинантные поксвирусы широко используются для экспрессии чужеродных антигенов в инфицированных клетках. Более того, рекомбинантные поксивирусы постоянно исследуют в качестве необычайно перспективных вакцин для индукции иммунного ответа на чужеродный антиген, экспрессируемый в соответствующем поксвирусном векторе. Наиболее известными являются, с одной стороны, авипоксвирусы (вирусы оспы птиц) и, с другой стороны, вирусы осповакцины, в частности модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара (МУА). МУА близок вирусу осповакцины, представителю рода ортопоксвирусов семейства поксвирусов (Рохутбае). МУА был получен в результате серии из 516 пассажей штамма Анкара вируса осповакцины (СУА) в эмбриональных фибробластах цыпленка (см. обзор Мауг А., е! а1., 1п1ес!юп 3, 6-14 [1975]). В результате столь длительных пассажей в полученном МУА вирусе произошла делеция около 31 тыс. оснований геномной последовательности, и, следовательно, он был описан как высокоблагоприятный хозяин, ограниченный клетками птиц (Меуег Н. е! а1., I. Оеп. Уйо1, 72, 1031-1038 [1991]). На различных животных моделях, которые получали МУА, было показано, что он является практически авирулентным (Мауг А. & Наппег К. [1978] Эеу. Вю1. 8!апб. 41:225-34). Кроме того, данный штамм МУА проходил клиническую проверку в качестве вакцины для иммунизации против оспы человека (Мауг е! а1., ΖΜ. Вак1. Нуд. I, АЫ. Огд. В 167, 375-390 [1987], 8йск1 и е! а1., П1бсй. шеб. \Унс11г. 99, 2386-2392 [1974]).

В патентах США № 5736368 и 6051410 раскрыт рекомбинантный штамм вируса осповакцины \уе!й, который экспрессирует антигены и белки ВИЧ. В патенте США № 5747324 раскрыт рекомбинантный штамм вируса осповакцины ЫУСВН, экспрессирующий гены лентивируса. В патенте ЕР О 243029 раскрыт рекомбинантный штамм вируса осповакцины \ез!егп Кезегуе, экспрессирующий гены ретровируса человека. В патенте \ О 02/42480 раскрыты, в частности, безопасные и аттенуированные штаммы МУА. Рекомбинантный МУА раскрыт, в частности, в патентах \О 98/13500 и \О 03/048184.

Для экспрессии гетерологичных генов в поксвирусах специалистам в данной области известны лишь несколько промоторов, такие как промоторы 30К и 40К (см., например, патент США № 5747324), сильный синтетический ранний/поздний промотор (см., например, 8и!!ег е! а1., Уассте (1994) 12, 103240), промотор Р7.5 (см., например, Епбо е! а1., I. С~еп. У1го1. (1991) 72, 699-703), а также промотор, полученный из гена А-типа инклюзии (АТ1) (Εΐ е! а1., I. С~еп. У1го1. (1998) 79, 613). Все эти промоторы используют в рекомбинантных вирусах осповакцины для экспрессии гетерологичных генов и, как было показано, для экспрессии указанных генов, что приводит к продукции белка, кодируемого гетерологичными генами. Поскольку для экспрессии генов в экспрессионных системах вируса осповакцины доступны лишь немногие промоторы, существует общая необходимость в других промоторах для вирусов осповакцины. Кроме того, все известные до сих пор промоторы представляют собой достаточно сильные поздние промоторы, т. е. промоторы, которые можно применять для экспрессии генов после репликации вектора вируса осповакцины. В некоторых случаях желательно иметь промоторы, делающие возможной экспрессию генов сразу же после инфицирования ими клетки, т.е. существует необходимость в ранних промоторах вируса осповакцины.

Кроме того, как указано выше, из-за улучшенной безопасности МУА является весьма перспективным вирусом для экспрессии гетерологичных генов. Вместе с тем, все известные до сих пор промоторы для экспрессии гетерологичных генов в МУА были получены из других вирусов осповакцины либо представляют собой синтетические промоторы для экспрессии в других вирусах осповакцины. Следовательно, существует также необходимость в промоторах, оптимизированных для экспрессии в МУА.

Подробное описание настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к промоторам, полученным из генома модифицированного (штамма Анкара) вируса коровьей оспы (МУА). МУА-промоторы не известны в данной области.

В частности, настоящее изобретение относится к промоторам, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей:

(ΐ) любую нуклеотидную последовательность из нижеприведенных 8ЕО II) ΝΟ: 1-6

ЗЧСТССААТАТТСТТАТССТААТТОСАААААТАСТСТТССАСТСАСПОСАТТАТ СТОАСТАТТССАТТСТАТАТТТТАТТТТАТАТТТТАТАТТТТСТАСТААСААТАСАА ТССТААТСТСААСТТТАТТСС ААТАС АТСТСТТАТТАААА ААСАТАТ АТААТ АААТ А АСА 3'(8Εζ) Ю N0:1)

- 1 012846

5'САТАААААТТТАААСТСТАААТАТААСТАТТАТТТТАТАСТТСТ ААТ АААААСССА ААТТТСАТТСТАТАСТТТСССТТСТТТААААСАААСТСАСТТСАТАААА 3' (2Е0

N0: 2) 'ССАТТТС АТСТТТСТССААТАСТААТТСАААТТСТТАА АТАААТААТ С С АТ АСТ А ТАААТАСТТАТТАСТСАТААААТАСТАААААТААТТАТТАСААТААСАСТСТАСТАТ САТАСАТААСТСТСТТСТАТАААА 3' (8Ες Ю N0: 3)

5'ОАТСТАТАААССТАОАССТААТССТСТСССАТСАССАТАТАТТТАТТТТСАСТТТ ТАТТАТАСССАТАААТАСТААААААТАТСТТАССТТТАСАААА 3' (5Е(^ Ю N0: 4) б'ССТАААСЛТААСАСАТСТСТСТТАТАСТААСАТССТТСССТТАТТССАТАСТА ССТТСТССААТТТАТАААСТТАТСАТА6ТААААСТАСТАСССААТАТСТАААСАТС АААААСТАААТТАСТАТТААСССССТСССТАТТССТТСАТССАТТСАСТТ 3'(8Е<2

Ю N0: 5)

5'АТТТСТСССТАССАСАТСАААТСАТСТТАССАСТТТТСТТАССАТССТТААСТТС АСТ АА АТ АТТС АТ ААСТ ААТТТТТ АТТААТСАТ АС АААА АСС АААТ ААААСТ СС АТ А ТТАТАСАСТССТТААСССССТТАТАСССТСТААССАТТТТСААС- 3' (5Е0 Ю N0; 6) (и) субпоследовательности любой последовательности 8Ε^ ГО N0: 1-6;

(ίίί) последовательности с одной или несколькими нуклеотидными заменами, делециями и/или вставками в последовательностях, определенных в (1) или (ίί).

Последовательности 8Ε^ ГО N0: 1-6 представляют собой природную часть генома МУЛ и расположены в направлении 3’-5’ от рамок считывания А42К, 46К, Е6К, Ι2Κ, С7Е и В9К соответственно.

Промоторы по настоящему изобретению являются предпочтительно активными в качестве промоторов вируса осповакцины или же активными в качестве промоторов в инфицированных вирусом осповакцины клетках. Используемый вирус осповакцины предпочтительно представляет собой МУА, в частности один из штаммов МУА, как указано ниже. Активный в качестве промотора вируса осповакцины означает, что промотор способен направлять экспрессию гена, к которому он функционально присоединяется в вирусе осповакцины после инфицирования клеток указанным вирусом. Клетки представляют собой предпочтительно клетки, которые обеспечивают позднюю и/или раннюю экспрессию вируса осповакцины. Промотор, активный в клетках, инфицированных вирусом осповакцины включает также ситуацию, когда промотор не является частью генома вируса осповакцины, а, например, является частью плазмиды или вирусного генома, не принадлежащего вирусу осповакцины; в такой ситуации промотор по настоящему изобретению будет активен в том случае, если клетка, содержащая промотор, также содержит геном вируса осповакцины, например, если клетка инфицирована вирусом осповакцины. В этих обстоятельствах РНК-полимераза вируса узнает промотор по настоящему изобретению, и активируется экспрессия гена/кодирующей последовательности, который(ая) присоединена к промотору.

В соответствии с настоящим изобретением также возможно использовать любой промотор, определенный как последовательность 8Ε^ ГО N0: 1-6. Промотор, который обычно используют для направления экспрессии гена/кодирующей последовательности, может состоять из любой последовательности 8Ε^ ГО N0: 1-6, либо обычно используемым промотором может быть большая структура, которая содержит любую последовательность 8Ε^ ГО N0: 1-6. Также в рамках настоящего изобретения находится применение производного этих промоторов, которое может представлять собой субпоследовательность любой последовательности 8Ε^ ГО N0: 1-6. Термин субпоследовательность любой последовательности 8Ε^ ГО N0: 1-6 относится к более коротким фрагментам любой последовательности 8Ε^ ГО N0: 1-6, которые также активны в качестве промотора, в частности в качестве промотора вируса осповакцины, либо в инфицированных вирусом осповакцины клетках. Снова, вирус осповакцины предпочтительно представляет собой МУА, такой как один из указанных ниже штаммов. Характерная субпоследовательность любой последовательности 8Ε^ ГО N0: 1-6 имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 20 нуклеотидов, еще более предпочтительно по меньшей мере 25 нуклеотидов, наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 нуклеотидов любой последовательности 8Ш ГО N0: 1-6.

Предпочтительной субпоследовательностью 8Ε^ ГО N0: 1 является 8Ε^ ГО N0: 7. Предпочтительной субпоследовательностью 8Ε^ ГО N0: 2 является 8Ε^ ГО N0: 8. Предпочтительными субпоследовательностями и/или производными указанных субпоследовательностей 8Ε^ ГО N0: 3 являются 8Ε^ ГО N0: 9 и 8Ε^ ГО N0: 10. Предпочтительными субпоследовательностями 8Ε^ ГО N0: 4 являются 8Ε^ ГО

- 2 012846

N0: 11 и 8Е0 ΙΌ N0: 12. Последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 6-12 представлены в разделе Примеры.

Производное промотора, содержащего или состоящее из нуклеотидной последовательности любой 8Е0 ΙΌ N0: 1-6 или их субпоследовательностей, в частности производное нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 7-12, также может быть последовательностью с одной или несколькими нуклеотидными заменами, делециями и/или вставками в любой последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1-6 или в их субпоследовательностях, в особенности в нуклеотидных последовательностях из числа 8Е0 ΙΌ N0: 7-12. Производные по настоящему изобретению также активны в качестве промотора, в частности в качестве промотора вируса осповакцины, или в инфицированных вирусом осповакцины клетках, более предпочтительно в качестве МУЛ промотора МУЛ или в инфицированных МУЛ клетках. Последовательность с одной или несколькими нуклеотидными заменами представляет собой последовательность, в которой один или несколько нуклеотидов любой последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1-6 или их субпоследовательностей, таких как любая субпоследовательность 8Е0 ΙΌ N0: 7-12, заменены другими нуклеотидами.

Последовательность с одной или несколькими нуклеотидными вставками представляет собой последовательность, в которой один или несколько нуклеотидов встроены в одну или несколько областей любой 8Е0 ΙΌ N0: 1-6 или их субпоследовательностей, в частности нуклеотидных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 7-12. Последовательность с одной или несколькими нуклеотидными делециями представляет собой последовательность, в которой делетирован один или несколько нуклеотидов любой последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1-6 или их субпоследовательностей, в частности нуклеотидных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 7-12. В производных по настоящему изобретению делеции, замены или вставки могут быть объединены в одной последовательности.

Примером производной субпоследовательности по настоящему изобретению является 8Е0 ΙΌ N0: 10, которая представляет собой субпоследовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3 с одной дополнительной нуклеотидной заменой по сравнению с соответствующей нуклеотидной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3.

Предпочтительно производное по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% гомологично любой последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1-6 или их субпоследовательностям, в частности любой последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 7-12. В соответствии с наиболее предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения в любой последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 7-12 заменены, удалены и/или встроены не более 10 нуклеотидов, еще более предпочтительно не более 5 нуклеотидов.

Документы уже известного уровня техники позволяют специалистам в данной области прогнозировать, какие производные или субпоследовательности любой 8Е0 ΙΌ N0: 1-12 будут обладать биологической активностью, будучи активными в качестве промотора вируса коровьей оспы, в частности, в качестве активного промотора МУА. В этой связи можно сделать ссылку на СйактагЬагй с1 а1., Вю1сс1шк|ис5 (1997) 23, 1094-1097, апб Όηνίχοη апб Мохх. 1. Мо1. Βίο1. (1989) 210, 771-784. Кроме того, специалист в данной области легко оценит, будет ли фрагмент активным в качестве промотора вируса коровьей оспы, в частности в качестве промотора МУА. В частности, производное последовательности можно клонировать в плазмидную конструкцию в направлении 3'-5' от репортерного гена. Такая конструкция может быть трансфецирована в клеточную линию или в эукариотическую клетку, такую как клетки СЕТ или ΒΗΚ, которые инфицированы МУА. Определяют экспрессию репортерного гена и сравнивают с экспрессией репортерного гена, находящегося под контролем промотора любой 8Е0 ΙΌ N0: 1-6. Производное по настоящему изобретению представляет собой производное с промоторной активностью в указанной тест-системе, которая составляет по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% активности промоторной последовательности любой 8Е0 ΙΌ N0: 1-6. Также в рамках настоящего изобретения находятся производные любой последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1-12 с большей промоторной активностью.

Промоторы по настоящему изобретению особенно подходят для экспрессии кодирующих последовательностей в МУА.

Промотор, основанный на 8Е0 ΙΌ N0: 1, обладает очень высокой активностью, особенно в качестве позднего промотора, хотя его также можно использовать и в качестве раннего промотора. Такие же соображения применимы в отношении соответствующих субпоследовательностей, таких как последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 7, которая, однако, особенно подходит в качестве позднего промотора.

Промотор, основанный на 8Е0 ΙΌ N0: 2, также обладает весьма сильной активностью, особенно в качестве позднего промотора. Также его можно использовать в качестве раннего промотора. Такие же соображения применимы в отношении соответствующих субпоследовательностей, как последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 8, которая, однако, особенно подходит в качестве позднего промотора.

Промотор, основанный на 8Е0 ΙΌ N0: 3, особенно подходит в качестве раннего промотора и из всех проверенных промоторов обладает наибольшей активностью раннего промотора. Однако его также можно использовать в качестве позднего промотора. Те же соображения применимы в отношении соответствующих субпоследовательностей, таким как последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 9 и 10, соответственно. Из этих субпоследовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 9 особенно подходит в качестве раннего промотора, а

- 3 012846

8ЕО Ш N0: 10 особенно подходит в качестве позднего промотора.

Промотор, основанный на 8Е0 Ш N0: 4, является особенно подходящим, если он предназначен для ранней и поздней экспрессии присоединенной кодирующей последовательности, так как этот промотор обладает весьма высокой активностью в раннем, а также в позднем состоянии. Те же соображения применимы в отношении соответствующих субпоследовательностей, таких как последовательности 8Е0 Ш N0: 11 и 12 соответственно. Из этих субпоследовательностей 8Е0 Ш N0: 11 особенно подходит в качестве раннего промотора, а 8Е0 Ш N0: 12 особенно подходит в качестве позднего промотора.

Промоторы, основанные на 8Е0 Ш N0: 5 и 6, являются особенно эффективными, если они предназначены для экспрессии присоединенных кодирующих последовательностей в относительно небольших малых количествах. Это иногда желательно, если присоединяемая кодирующая последовательность гена кодирует продукт токсичного гена и/или если промоторы предназначены для индукции иммунного ответа с высоким уровнем авидности.

Термин ранний промотор относится к промоторам, которые активны в вирусе осповакцины или же в клетках, инфицированных вирусом осповакцины, перед репликацией вирусной ДНК. Специалистам в данной области известны способы проверки, является ли тот или иной промотор ранним промотором. В частности, интересующий промотор можно встроить в направлении 3'-5' от репортерного гена. Конструкцию, содержащую промотор и репортерный ген, вводят в клетки, инфицированные вирусом осповакцины. Для определения его активности в качестве раннего промотора клетки инкубируют вместе с веществом, которое ингибирует репликацию ДНК, таким как АгаС. Репликация ДНК необходима как предварительное условие для активности позднего промотора. Таким образом, любая промоторная активность, измеряемая в этой системе исследования, должна быть обусловлена элементами, активными в качестве раннего промотора.

Следовательно, термин поздний промотор относится к любому промотору, который проявляет свою активность после репликации ДНК. Позднюю активность также можно измерить способами, известными специалистам в данной области. Для простоты термин поздний промотор, как он используется в настоящем изобретении, относится к активности промотора, которая определяется в отсутствие добавления вещества, которое блокирует репликацию ДНК.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к экспрессионной кассете, содержащей промотор по настоящему изобретению и кодирующую последовательность, где экспрессия кодирующей последовательности находится под контролем указанного промотора. Экспрессионная кассета предпочтительно не является природной экспрессионной кассетой генома вируса осповакцины. Таким образом, если промотор по настоящему изобретению представляет собой природный промотор генома вируса осповакцины, то последовательность, к которой указанный промотор присоединен, предпочтительно отличается от последовательности, к которой обычно присоединен промотор в геноме вируса осповакцины. Другими словами, если промотор по настоящему изобретению идентичен природному промотору, то кодирующая последовательность, экспрессия которой находится под контролем промотора, и/или последовательности, расположенные между промотором и кодирующей последовательностью, отличаются от соответствующих последовательностей, к которым обычно присоединен указанный промотор. Термин отличается в контексте настоящего описания относится к последовательностям, которые отличаются по меньшей мере по одному нуклеотиду в указанной последовательности. Предпочтительно последовательность представляет собой кодирующую последовательность, которая отличается по меньшей мере по одному нуклеотиду. В соответствии с другими вариантами гомология между кодирующей последовательностью в экспрессионной кассете и последовательностью, к которой обычно присоединен промотор, составляет менее 90, менее 80, менее 70, менее 60, менее 50, менее 40 или даже менее 20%. Наиболее предпочтительно, когда кодирующая последовательность, которая находится под контролем промотора, по настоящему изобретению кодирует пептид/белок, отличающийся по меньшей мере по одной аминокислоте от природного белка, кодируемого указанной кодирующей последовательностью. В качестве примера экспрессионная кассета не является экспрессионной кассетой, содержащей природный промотор С7Ь вируса осповакцины, направляющий экспрессию природного С7Ь-гена, например, экспрессионная кассета не является экспрессионной кассетой, описанной в \У0 2004/015118, содержащей промотор С7Ь и кодирующую последовательность С7Ь.

С другой стороны, если последовательность, которая должна экспрессироваться, является природной последовательностью вируса осповакцины, то промотор, который используется для экспрессии указанной последовательности, отличается от промотора, который направляет экспрессию этой кодирующей последовательности в природной ситуации. В соответствии с этим вариантом нуклеотидная последовательность промотора отличается по меньшей мере одним нуклеотидом от природной последовательности промотора вируса осповакцины. В соответствии с еще одним вариантом гомология между промотором по настоящему изобретению, который контролирует экспрессию последовательности вируса осповакцины и природным промотором, присоединенным к последовательности вируса осповакцины, составляет менее 90, менее 80, менее 70, менее 60, менее 50 или даже менее 40%.

Предпочтительно кодирующая последовательность может кодировать по меньшей мере один антигенный эпитоп или антиген, терапевтические пептиды или белки, антисмысловую РНК или рибозимы.

- 4 012846

Если кодирующая последовательность кодирует антигенный эпитоп или антиген, то экспрессионную кассету можно использовать для экспрессии указанного антигена после введения указанной экспрессионной кассеты в клетки организма, например в клетки животного, в том числе в клетки человека. Презентация указанного антигена/эпитопа может вызывать иммунный ответ организма, что может приводить к вакцинации организма против агента, из которого получен этот антиген/эпитоп. Более конкретно, эпитоп/антиген может быть частью большой аминокислотной последовательности, такой как полипептид, пептид или белок. Предпочтительно, кодирующая последовательность кодирует по меньшей мере один антигенный эпитоп или антиген, терапевтические пептиды или белки, антисмысловую РНК или рибозимы, которые не кодируются в геноме вируса осповакцины.

Примерами таких полиэпитопов, пептидов или белков могут быть полиэпитопы, пептиды и белки, полученные (ί) из вирусов, в частности из вирусов, отличных от вирусов осповакцины, таких как ВИЧ, НТЬУ, герпесвирус, вирус Денге, полиовирус, вирус кори, вирус свинки, вирус краснухи, вирус гепатита и т.д., (й) из бактерий, (ш) из грибов, (ίν) из полипептидов/белков злокачественных опухолей, таких как антигены злокачественных опухолей.

Кроме того, кодирующая последовательность может кодировать терапевтическое соединение, такое как интерлейкины, интерфероны, рибозимы или ферменты.

В общих чертах, настоящее изобретение относится к любой последовательности нуклеиновых кислот, содержащей промотор по настоящему изобретению и/или экспрессионную кассету по настоящему изобретению. Нуклеиновая кислота может представлять собой РНК, например, если промотор является частью ретровирусного генома. Более предпочтительно нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. Такая ДНК может быть ДНК любого типа, например линейной, кольцевой, одноцепочечной или двухцепочечной ДНК.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения промотор и/или экспрессионная кассета по настоящему изобретению может быть частью вектора. Термин вектор относится к любому вектору, известному специалистам в данной области. Вектор может быть плазмидным вектором, таким как рВК.322 или вектором серии рИС. Более предпочтительно вектор представляет собой вирусный вектор. В контексте настоящего изобретения термин вирусный вектор или вектор на основе вируса относится к инфекционному вирусу, содержащему вирусный геном. В этом случае ДНК по настоящему изобретению является частью вирусного генома соответствующего вирусного вектора. Рекомбинантный вирусный геном является упакованным, и полученные рекомбинантные векторы можно использовать для инфицирования клеток и клеточных линий, в частности, для инфицирования животных, включая человека. Обычные векторы на основе вирусов, которые могут использоваться по настоящему изобретению, представляют собой аденовирусные векторы, ретровирусные векторы или векторы на основе аденоассоциированного вируса 2 (ЛЛУ2). Наиболее предпочтительными являются поксвирусные векторы. Поксвирус может быть предпочтительно поксвирусом канареек, поксвирусом домашней птицы или вирусом осповакцины.

Более предпочтительным является модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара (МУА) (8ибег О. е! а1., [1994], Уассше 12:1032-40; Ап!оше О. е! а1., [1998], УпЫоду 244:365-396). Термин МУА, используемый в настоящем изобретении, относится к любому штамму МУА, известному в данной области. Примером штамма МУА является депонированный штамм УК-1508, депонированный в Ашепсаи Туре Си1!иге сойесбоп (АТСС), Мапазза, УА 20108, США. Другими примерами вирусных штаммов МУА, используемых по настоящему изобретению, являются штаммы МУА 572 и 575, задепонированные в Еигореап Со11есбоп о! Ашша1 Се11 Сийитез (ЕСАСС), ЗайзЬшу (ИК) с депозитными номерами ЕСАСС У94012707 и ЕХАСС У00120707, соответственно и МУА-ΒΝ с депозитным номером ЕСАСС У00083008.

Наиболее предпочтительным МУА-штаммом является штамм МУА-ΒΝ или его производное. Характерные признаки МУА-ΒΝ, описание биологических анализов, позволяющих установить, является ли МУА-штамм штаммом МУА-ΒΝ или его производным, а также способы получения МУА-ΒΝ или его производное, раскрыты в \7О 02/42480. Содержание этой заявки приведено в настоящем изобретении в качестве ссылки. В частности, ссылка сделана для определения свойств вируса осповакцины по настоящему изобретению, как описано в \7О 02/42480, таких как свойства МУА, а также свойства и определение производных МУА-ΒΝ. Кроме того, в указанной ссылке раскрыто, каким образом МУА и другие вирусы осповакцины могут размножаться. Вкратце, эукариотические клетки инфицируют вирусом. Эти эукариотические клетки представляют собой клетки, которые восприимчивы к инфицированию соответствующим поксвирусом, а также у которых возможна репликация и продукция инфекционного вируса. Для МУА примером такого типа клеток являются фибробласты эмбриона цыпленка (СЕЕ) и ΒΗΕ-клетки (Эгех1ег I., Не11ег К., ХУайгеп В., ЕтПе У. аиб 8ибет О. НщЫу абепиа!еб шобШеб νасс^η^а Апкага герйсШез ίη ЬаЬу йатз!ет к1бпеу се11з, а ро!епба1 йоз! Гог хзгиз рторадабоп, ЬиГ по! ίη х'апоиз йишаи (гапзГогтеб апб рптагу се11з 1. Оеп. У1го1. (1998), 79, 347-352). СЕЕ-клетки можно культивировать в условиях, известных специалисту в данной области.

Предпочтительно, клетки СЕЕ культивируют в бессывороточной среде в неподвижных колбах или во вращающихся бутылях. Инкубирование предпочтительно осуществляют в течение 48-96 ч при

- 5 012846

37±2°С. Для инфицирования МУЛ предпочтительно используют множественность заражения (ΜΟΙ) со значением от 0,05 до 1 ТСГО₅₀, и инкубирование предпочтительно осуществляют 48-72 ч при 37±2°С.

Специалистам в данной области известны способы введения в вирусный геном экспрессионную кассету или промотор по настоящему изобретению, в частности в геном вируса осповакцины, наиболее предпочтительно в геном МУА. В качестве примера экспрессионную кассету, или промотор, или его производное по настоящему изобретению можно встроить в геном МУА путем гомологичной рекомбинации. С этой целью пермиссивную клеточную линию, такую как, например, как СЕР или ВНК-клетки, трансфицируют нуклеиновой кислотой, где нуклеиновая кислота содержит экспрессионную кассету или промотор, или его производное по настоящему изобретению, фланкированные нуклеотидными участками, которые гомологичны области генома МУА, в которую необходимо встроить экспрессионную кассету или промотор, или его производное по настоящему изобретению. Клетки инфицируют МУА, и в инфицированных клетках происходит гомологичная рекомбинация между нуклеиновой кислотой и вирусным геномом. В другом варианте, также возможно вначале инфицировать клетки МУА, а затем трансфицировать инфицированные клетки нуклеиновой кислотой. И опять в клетках происходит рекомбинация. Затем способами, известными в данной области, отбирают рекомбинантный МУА. Конструирование рекомбинантного МУА не ограничивается этим конкретным способом. Кроме него, для этой цели можно использовать любой подходящий способ, известный специалистам в данной области.

Экспрессионную кассету или промотор по настоящему изобретению можно вводить в любую подходящую часть вектора, в частности в вирусный геном. В случае вирусов осповакцины встраивание можно осуществлять в несущественные участки вирусного генома или в межгенную область генома вируса. Термин межгенная область относится предпочтительно к тем участкам вирусного генома, которые располагаются между двумя соседними генами, которые не содержат кодирующих последовательностей. Если вектор представляет собой МУА, то встраивание можно также осуществлять в природный делеционный сайт вирусного генома. Термин природный делеционный сайт относится к тем частям вирусного генома, которые делетированы по сравнению с геномом штамма Сореийадеи вируса осповакцины. Однако сайты встраивания не ограничиваются этими предпочтительными инсерционными сайтами в геноме вируса осповакцины и в геноме МУА, поскольку в рамках настоящего изобретения экспрессионная кассета может быть встроена в любом месте вирусного генома при условии, что возможно получить рекомбинанты, которые можно амплифицировать и размножить по меньшей мере в одной системе клеточной культуры, такой как фибробласты эмбрионы цыпленка (клетки СЕР).

Промотор по настоящему изобретению можно использовать для экспрессии гена, который уже является частью вектора, например геном МУА. Такой ген может представлять собой природный ген вирусного генома или чужеродный ген, который встроен в вектор. В этих случаях промотор по настоящему изобретению встраивают в направлении 3'-5' от гена в векторе, экспрессия которого должна находиться под контролем этого промотора. МУА-вектор, содержащий экспрессионную кассету по настоящему изобретению, можно также создать путем замены любой открытой рамки считывания А42В, 16В, Р6В, Ι2Ρ. С7Ь и В9В на кодирующую последовательность, экспрессия которой должна находится под контролем промотора, которая является природным промотором экспрессии указанной открытой рамки считывания. Так, в качестве примера, кодирующую последовательность А42В или ее части можно заменить кодирующей последовательностью, которую необходимо экспрессировать. В полученной конструкции указанная кодирующая последовательность находится под контролем промотора по настоящему изобретению, а именно под контролем промоторной последовательности 8ЕД ΙΌ N0: 1 и 8ЕД ΙΌ N0: 7. Эти экспрессионные кассеты также входят в состав настоящего изобретения.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к вектору, используемому в соответствии с настоящим изобретением в качестве вакцины или лекарственного средства. В общем смысле, изобретение относится к вакцине или к фармацевтической композиции, содержащей экспрессионную кассету, ДНК или вектор по настоящему изобретению. Специалистам в данной области известны способы введения в организм животного или человека вакцины или фармацевтической композиции. В случае ДНК и плазмидных векторов, ДНК и вектор можно просто вводить путем инъекции. Если вектор представляет собой вирусный вектор, такой как вектор вируса осповакцины, в частности МУА-вектор, то его также можно вводить в организм животного или человека на основании знаний специалиста в данной области, например, путем внутривенного, внутримышечного, интраназального, интрадермального или подкожного введения. Дополнительные подробности о количестве вводимого вируса даны ниже.

Фармацевтическая композиция или вакцина может обычно содержать кроме промотора, экспрессионной кассеты или вектора по настоящему изобретению один или несколько фармацевтически приемлемых и/или одобренных носителей, добавок, антибиотиков, консервантов, адъювантов, разбавителей и/или стабилизаторов. Такими вспомогательными веществами могут быть вода, физиологический раствор, глицерин, этанол, увлажняющие или эмульгирующие средства, изменяющие рН вещества или тому подобное. Подходящими носителями, как правило, являются большие, медленно метаболизируемые молекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры, липидные комплексы и т.п.

- 6 012846

Для получения фармацевтических композиций или вакцин, ДНК, экспрессионную кассету или вектор по настоящему изобретению, в частности рекомбинантный вирус осповакцины, такой как рекомбинантный МУЛ, преобразуют в физиологически приемлемую форму. В случае вирусов осповакцины, в частности МУА, это можно осуществить на основе опыта получения поксвирусных вакцин, используемых для вакцинации против вируса натуральной оспы (как описано у 8у1ск1 Н. е1 а1. [1974] Όΐδοί. шеб. Αδοίπ. 99, 2386-2392). Например, очищенный вирус хранят при -80°С с титром 5х10⁸ ТСШ₅₀/мл препарата в около 10 мМ Тп8, 140 мМ ЫаС1 рН 7,4. Для получения доз вакцины, к примеру, 10¹ -10⁹ частиц рекомбинантного вируса по настоящему изобретению, лиофилизуют в фосфатно-солевом буферном растворе (РВ8) в присутствии 2% пептона и 1% альбумина человека в ампуле, предпочтительно в стеклянной ампуле. В другом варианте дозы вакцин можно получать постадийным высушиванием замораживанием препарата вируса. Такой препарат может содержать дополнительные добавки, такие как маннит, декстран, сахар, глицин, лактозу или поливинилпирролидон, или любые добавки, такие как антиоксиданты или инертный газ, стабилизаторы или рекомбинантные белки (например, альбумин сыворотки крови человека), подходящие для введения ίη νίνο. Типичная композиция, содержащая вирус, подходящая для высушивания замораживанием, содержит 10 мМ Ττίδ-буфер, 140 мМ ЫаС1, 18,9 г/л декстрана (МА 36000-40000), 45 г/л сахарозы, 0,108 г/л моногидрата монокалиевой соли Ь-глутаминовой кислоты, рН

7,4. Стеклянную ампулу затем герметизируют и хранят в течение нескольких месяцев при температуре в диапазоне от 4°С до комнатной температуры. Однако при отсутствии необходимости в ампулах препарат хранят предпочтительно при температурах ниже -20°С.

Для вакцинации или лечения лиофилизат или высушенный замораживанием продукт можно растворить в 0,1-0,5 мл водного раствора, предпочтительно в воде, физиологическим растворе или Ττίδбуфере, и вводить либо системно, либо местно, т. е. парентерально, внутримышечно или любым другим путем введения, известным практикующему специалисту. Специалист в данной области может подобрать режим введения, дозу и число введений известным способом.

Таким образом, в соответствии с сопутствующим вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к способу воздействия, предпочтительно, к индукции иммунного ответа в организме животного, в том числе человека, предусматривающему введение экспрессионной кассеты, ДНК, вектора, фармацевтической композиции или вакцины по настоящему изобретению для лечения животного или человека. Если вакцина представляет собой вирус осповакцины, в частности МУА, то обычная доза вакцины для человека содержит по меньшей мере 10², предпочтительно по меньшей мере 10⁴, более предпочтительно по меньшей мере 10⁶, еще более предпочтительно 10⁷ или 10⁸ ТСШ₅₀ (инфекционная доза для тканевой культуры) вируса.

Если вакцина представляет собой рекомбинантный МУА, в частности рекомбинантный МУА-ΒΝ, и его производные, то вирус можно использовать для первичной иммунизации. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу, в котором вектор представляет собой МУА, в частности МУАΒΝ, и его производные, и в котором указанный вектор, или композицию, или вакцину, содержащую указанный вектор, вводят животному, в том числе человеку, при необходимости такого введения в терапевтически эффективных количествах для первой иммунизации (первичная вакцинация) и для второй иммунизации (ревакцинация).

Настоящее изобретение также относится к способу введения кодирующей последовательности в мишеневую клетку, предусматривающему введение вектора, экспрессионной кассеты или ДНК по настоящему изобретению в мишеневую клетку. Если вектор представляет собой вирус осповакцины, в частности МУА, такой как МУА-ΒΝ, то мишеневая клетка может представлять собой клетку, в которой вирус способен реплицироваться, такую как клетки СЕЕ или ВНК, или клетку, которую можно инфицировать МУА, но в которой вирус не может реплицироваться (такую, например, как все типы клеток человека, инфицируемые штаммом МУА-ΒΝ).

Настоящее изобретение также относится к способу получения пептида, белка и/или вируса, предусматривающему инфицирование клетки-хозяина вирусным вектором по настоящему изобретению, с последующим культивированием инфицированной клетки-хозяина в подходящих условиях, а также с последующим выделением и/или обогащением пептида, и/или белка, и/или вирусов, продуцируемых указанной клеткой-хозяином. Если предполагается получение, т. е. амплификация вируса по настоящему изобретению, то клетка должна представлять собой клетку, в которой вирус способен реплицироваться. В случае вирусов осповакцины, в частности МУА, подходящими клетками являются клетки СЕЕ или ВНК. Если предполагается получение пептида/белка, кодируемого вирусным вектором по настоящему изобретению, то клетка может быть любой клеткой, которую можно инфицировать вирусным вектором, и в которой возможна экспрессия белков/пептидов, кодируемых вирусом.

Настоящее изобретение также относится к способу получения пептида, белка и/или вируса, предусматривающему трансфекцию клетки с экспрессионной кассетой, ДНК или плазмидным вектором по настоящему изобретению, с последующим инфицированием клетки вирусом осповакцины. Инфицированную клетку-хозяин культивируют в подходящих условиях. Дополнительная стадия предусматривает выделение и/или обогащение пептида, и/или белка, и/или вирусов, продуцируемых клеткой-хозяином.

- 7 012846

Стадию инфицирования клетки-хозяина с помощью вируса осповакцины осуществляют до или после стадии трансфекции клеток.

Настоящее изобретение также относится к клеткам, содержащим промотор, ДНК, экспрессионную кассету или вектор по настоящему изобретению. В частности, настоящее изобретение относится к клеткам, инфицированным вирусным вектором по настоящему изобретению.

Краткое описание фигур

Фиг. 1: активность СИ8 после экспрессии под контролем разных промоторов.

Клетки инфицировали ΜνΑ-ΒΝ и трансфецировали соответствующими плазмидами. Через 48 ч клетки экстрагировали и определяли активность СИ8 непосредственно путем измерения экстинкции при 415 нм после ферментативной реакции, которая вызывает развитие желтой окраски. Ζοχ=негативный контроль (клетки, инфицированные ΜνΑ-ΒΝ).

Фиг. 2: активность СИ8 после ранней и ранней/поздней экспрессии.

Клетки инфицировали ΜνΑ-ΒΝ и трансфицировали соответствующими плазмидами. Через 24 ч клетки экстрагировали и активность СИ8 непосредственно определяли путем измерения экстинкции при 415 нм после ферментативной реакции, которая вызывает развитие желтой окраски. Ζеx=негативный контроль (клетки, инфицированные ΜνΑ-ΒΝ). Что касается этой ферментативной реакции, то образцы без ЛгаС (ранняя+поздняя) экспрессии должны быть инкубированы в течение 5 ч, а образцы с ЛгаС (ранняя экспрессия) должны быть инкубированы в течение ночи для получения цветной реакции.

Фиг. 3: активность СИ8 после экспрессии под контролем различных промоторов.

Клетки инфицировали с помощью ΜνΑ-ΒΝ и трансфецировали соответствующими плазмидами. Через 24 ч клетки экстрагировали и активность СИ8 непосредственно определяли путем измерения экстинкции при 415 нм после ферментативной реакции, которая вызывает развитие цветной реакции. Контроль=негативный контроль (клетки, инфицированные ΜνΑ-ΒΝ).

Примеры

Нижеследующий(е) пример(ы) дополнительно иллюстрирует(ют) настоящее изобретение. Специалистам в данной области очевидно, что представленный(е) пример(ы) ни в коей мере не могут быть интерпретированы так, что ограничивают применимость способа по настоящему изобретению этим(и) примером(ами).

Пример 1. Анализ промоторов для экспрессии кодирующих последовательностей в геноме ΜνΑΒΝ.

1.1. Цель эксперимента.

Целью приведенного здесь анализа является идентификация промоторов, подходящих для экспрессии кодирующих последовательностей в геноме ΜνΑ, предпочтительно кодирующих последовательностей, которые гетерологичны природному геному ΜνΑ. В частности, встраивание двух или большего числа генов в единственный сайт встраивания является преимуществом применения различных промоторов для экспрессии единичных генов для снижения риска рекомбинационных событий, которые могут привести к делеции одного из чужеродных генов. Кроме того, желательно иметь промоторы разной силы для возможности экспрессировать чужеродные гены, встроенные в рекомбинантный штамм ΜνΑ-ΒΝ в разном количестве, в зависимости от силы данного промотора. Всего было выделено 11 вероятных промоторов. Эти вероятные промоторные последовательности клонируют в плазмидную конструкцию (ρΒ8Κ8+). Для того чтобы проанализировать возможную активность промоторов, их сливают с репортерным геном СИ8 (β-глюкуронидаза Е. сой). Клетки ΒΗΚ (почки хомячка) инфицируют ΜνΑ-ΒΝ и трансфецируют плазмидами, содержащими вероятные промоторы, слитые с геном СИ8. Если промотор функционален, то СИ8 экспрессируется и может быть количественно определен путем ферментативной реакции с СИ8. В качестве положительного контроля и в качестве эталона используют известные и охарактеризованные промоторы р7.5 и Р§ вируса осповакцины, которые сливают с СИ8 и параллельно анализируют. Измеряя экспрессию СИ8 вероятные промоторы скринируют на активность, силу и/или раннюю/позднюю экспрессию. Раннюю/позднюю экспрессию проверяют путем добавления в культуральную среду Απ-ιί.' (арабинозид-цитозин). Функционально активные промоторы, а именно Р§, р7.5, 7.5Ь и ΑΤΙ-промотор, которые были известны из уровня техники, а также идентифицированные промоторные последовательности, которые обычно участвуют в контроле экспрессии открытых рамок считывания ΜνΑ, Α42Ε, Β9Β, С7Ь, Е6В, Ι2Β, 16В, предпочтительно могут использоваться для экспрессии чужеродных генов в рекомбинантных ΜνΑ-конструкциях (^есΜVΑ-ΒN).

1.2. Материал.

Клетки: ВНК-клетки

Вирус: стандартный исходный штамм ΜΥΑ-ΒΝ (7,5х10⁷ ТСШ₅₀)

ДНК: ρΑΒ-Ουδ (Р5-промотор+СИ8) ρΒΝΧ71 (ρΒ1ие5С^^ρΐ+вирус коровьей оспы рг 7.5+0υδ) ρΒΝΧ73 (ρΒ1ие5С^^ρΐ+ΑΤI-промотор вируса коровьей оспы+θυδ) ρΒΝΧ81 (ρΒ1ие8С^^ρΐ+модифицированный Н5Р-промотор+СШ1) ρΒΝΧ61 (ρΒ1ие8С^^ρΐ+Β1Κ-промотор ΜνΑ+Ουδ)

- 8 012846 ρΒΝΧ62 (рВ1ие8спр1+В2К-иромотор МУА+СИЗ) ρΒΝΧ63 (рВ1ие8спр1+В3К-иромотор МУА+СИЗ) ρΒΝΧ60 (рВ1ие8спр1+А30В-иромотор МУА+СИЗ) ρΒΝΧ82 (рВ1ие8спр1+7.5Ь-иромотор вируса коровьей осиы+СИЗ) ρΒΝΧ83 (рВ1ие8сг1р1+МУА-С7Ь-иромотор (ЗЕО ГО N0: 5+СИЗ) ρΒΝΧ49 (рВ1ие8спр1+МУА-А42К-иромотор (ЗЕО ГО N0: 1+СИЗ) ρΒΝΧ69 (рВ1ие8сг1р1+МУА-1-иромотор (ЗЕО ГО Ν0: 4+СИЗ) ρΒΝΧ72 (рВ1ие8сг1р1+К5Е-иромотор МУА+СИЗ) ρΒΝΧ83 (рВ1ие8спр1+МУА-Р6К-иромотор (ЗЕО ГО Ν0: 3+СИЗ) ρΒΝΧ84 (рВ1ие8сг1р1+МУА-В9В-иромотор (ЗЕО ГО Ν0: 6+СИЗ) ρΒΝΧ85 (рВ1ие8сг1р1+МУА-16В-иромотор (ЗЕО ГО Ν0: 2+СИЗ) Набор для трансфекции: ЕГГес(епе (гапНесЕоп кй (О|адеи) Среда и добавки: ЭМЕМ (С1Ьсо ВВИ) и 10% РСЗ

Химические реагенты и буферы: Буфер для лизиса (РВЗ+0,1% тритона+1 мМ протеазного ингибитора)

АгаС (З1дта, СаЕ Νο. С1768)

Субстрат СИЗ: 1 мМ (иара-нитрофенил-бета-(И)-глюкуронид; З1дта, СаЕ Νο. Ν1627) Стои-раствор: 2,5 М (2-амино-2-метил-1,3-ироиандиол; З1дта, СаЕ Νο. А9754)

1.3. Методы.

Посев клеток.

В лунку 6-луночного иланшета высевают 5х10⁵ клеток ВНК для реакции трансфекции и иоддерживают их в ИМЕМ/10%РСЗ в течение ночи ири 37°С и 5% С0₂.

Инфицирование/трансфецирование.

Клетки инфицируют МУА-ΒΝ (то1 0,1) в 0,5 мл ИМЕМ/10%РСЗ на лунку и инкубируют в течение 1 ч ири комнатной темиературе на шейкере. Трансфекцию осуществляют, как оиисано в иротоколе ироизводителей. В буфере ЕВ (общий объем 100 мкл) разбавляют 2 мкг илазмиды. После добавления 3,2 мкл энхансерного раствора раствор иеремешивают и инкубируют в течение 5 мин ири комнатной темиературе. Затем добавляют 10 мкл реактива ЕГГес(епе. сусиензию иеремешивают и инкубируют в течение 10 мин ири комнатной темиературе. Сусиензию вируса отделяют от клеток и добавляют 1,6 мл ЭМЕМ/10%ЕСЗ. К ДНК-ЕЕГес1еие-смеси добавляют 0,6 мл ИМЕМ/10%РСЗ и ио каилям добавляют на клетки ири вращении культурального иланшета. Затем клетки инкубируют 7, 24 или 48 ч в зависимости от анализа. Для анализа ранней/иоздней эксирессии в культуральную среду во время инфицирования и трансфекции добавляют АгаС (40 мкг/мл).

Сбор культивированных клеток.

Среду отделяют от клеток и добавляют 0,5 мл буфера для лизиса. После встряхивания в течение 15 мин ири комнатной темиературе клетки соскабливают в литический буфер, иереносят их 1,5-мл реакционную иробирку и энергично встряхивают. Лизированные клетки центрифугируют в течение 1 мин ири 500 об/мин и ирозрачный суиернатант с темиературой 4°С иереносят в чистую иробирку и хранят ири -20°С иеред исиользованием.

Оиределение СИЗ-активности.

В 1 мл иредварительно нагретого раствора субстрата (37°С) добавляют 10 мкл клеточного экстракта (=белку из 2х10⁴ клеток) и инкубируют ири 37°С до иоявления желтой окраски. Затем образцы сразу иомещают на лед и добавляют 0,4 мл стои-раствора. Оиределяют экстинкцию ири 415 нм и сравнивают с активностью СИЗ, как экстинкцию, значение находит линейный ряд от 0,05 до 2,0. Раствор субстрата исиользуют в качестве стандарта, а клеточный экстракт из клеток, инфицированных МУА-ΒΝ, исиользуют в качестве негативного контроля.

1.4. Эксиерименты и результаты.

Эксиеримент 1. Оиределение функции условных иромоторов.

В иервом эксиерименте анализируют все илазмиды, которые содержат вероятный МУА-иромотор или охарактеризованный иромотор слитый с геном СИЗ. Клетки инфицируют МУА-ΒΝ (то1 0.1) и трансфецируют соответствующей илазмидой. Через 48 ч клетки собирают, лизируют и оиределяют активность СИЗ. Эксиеримент осуществляют для оиределения, какие иромоторы являются функциональными. Результаты иредставлены на фиг. 1. Негативный контроль (экстракт клеток, инфицированных МУА-ΒΝ) ясно свидетельствует об отсутствии активности СИЗ (Уех; экстинкция 0,001). Показано, что известный сильный синтетический иромотор Р§ весьма эффективен (Р§; экстинкция 0,87), иоскольку через 48 ч эксирессии оиределяется высокий уровень СИЗ. Кроме того, известный ириродный иромотор рг 7.5 вируса коровьей осиы также ироявляет весьма высокую активность (р7.5; экстинкция 0,41). Поздняя часть рг 7.5 (7.5Ь; экстинкция 0,25) тоже демонстрирует четко оиределяемую активность. АТ1-иромотор вируса осиовакцины ясно демонстрирует весьма эффективную эксирессию чужеродных генов иод МУАΒΝ (АТ1; экстинкция 0,76). Что касается областей вероятных иромоторов генома МУА-ΒΝ, было иоказано, что А42В (А42; экстинкция 0,48), В9В (В9; экстинкция 0,06), С7Ь (С7; экстинкция 0,055), Р6В (Р6;

- 9 012846 экстинкция 0,208), Ι2Β (12; экстинкция 0,130) и 16В (16; экстинкция 0,290) представляют собой функциональные промоторы. Промоторы, которые четко проявляют активность (экстинкция > 0,05) в первом предварительном эксперименте, затем были охарактеризованы более подробно (эксперимент 2).

Эксперимент 2. Характеристика экспрессии промоторов.

Промоторы, которые проявили активность в эксперименте 1, были охарактеризованы в отношении параметров их экспрессии. С этой целью клетки, инфицированные с помощью ΜνΑ-ΒΝ и трансфецированные соответствующей плазмидой, инкубируют с АгаС. АгаС ингибирует репликацию ДНК, что является существенной предпосылкой для поздней экспрессии генов в течение репликационного цикла ΜνΑ. Параллельно такой же эксперимент осуществляют без добавления АгаС. Инфицированные и трансфецированные клетки собирают через 24 ч и активность СИ8 определяют в трех повторениях. На фиг. 2 показана средняя экстинкция каждого образца.

После инкубирования без АгаС (-АгаС) в течение 24 ч для всех промоторов четко определяется суммарная экспрессия СИ8 (ранняя+поздняя) (фиг. 2: правые колонки). Активность идентифицированных промоторов образует непрерывный снижающийся ряд: Ι2Β (Ι2) > А42В (А42) > Р6В (Р6) > 16В (16) > В9В (В9) = С7Ь (С7). Показано, что промоторы В9, С7 и 16 участвуют, в основном, в поздней экспрессии на протяжении жизненного цикла ΜVΑ, в то время как инкубация с АгаС (+АгаС), который подавляет позднюю экспрессию, приводит к уровню экспрессии СИ8, сравнимому с уровнем экспрессии в негативном контроле (Ζοχ). Хотя промотор С7Ь, по-видимому, проявляет относительно слабую активность и признаки того, что он играет существенную роль во время ранней экспрессии.

Промоторы А42В, Ι2Β и Р6В четко демонстрируют очень эффективную раннюю экспрессию. Что касается определения ранней экспрессии, то образцы инкубируют в течение ночи для получения визуализируемой цветной реакции. Данные результаты не могут быть напрямую сравнены с величинами ранней+поздней экспрессии (фиг. 2: -АгаС), поскольку инкубацию проводили лишь в течение 5 ч. Промоторы, которые не показали ранней экспрессии, вновь анализируют через 7 ч экспрессии, и результаты, полученные через 24 ч, могут подтвердиться (данные не представлены).

1.5. Заключение.

Было ясно показано, что можно получать промоторы разной силы, и что в настоящее время имеется спектр доступных промоторов, которые демонстрируют примеры различных параметров экспрессии в зависимости от продолжительности инкубации и возможности репликации ΜVΑ-ΒN. Когда ранняя+поздняя экспрессия является предпочтительной, тогда, предпочтительно, используют промоторы А42В, Ι2Β и Р6В. Если раннюю экспрессию необходимо исключить (например, для чужеродных генов, которые содержат стоп-сигнал ΤΤΤΤΤΝΤ для ранней экспрессии), предпочтительно, использовать промоторы В9В, 16В или С7Ь.

Пример 2. Анализ минимальных промоторных элементов, получаемых из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1-4.

В примере 1 идентифицировано несколько последовательностей, которые, в частности, могут использоваться для экспрессии чужеродных генов в ΜVΑ-геноме. Чтобы проверить, удовлетворяют ли более короткие фрагменты этой же цели, осуществляют дополнительные эксперименты. Более короткие фрагменты 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1-4 выделяют с помощью ПЦР и клонируют в плазмидную конструкцию (рВ8К8+). Всего протестировано 6 вероятных минимальных промоторов. Для анализа их возможной активности, данные промоторы сливают с репортерным геном СИ8. ВНК-клетки инфицируют ΜVΑ-ΒN и трансфецируют плазмидами, содержащими вероятные минимальные промоторы, слитые с геном СИ8. Измеряя экспрессию СИ8 условные промоторы скринируют на активность и силу экспрессии (см. пример 1). В качестве положительного контроля и в качестве стандарта известный как поздний промотор Р§ вируса осповакцины сливают с СИ8 и анализируют параллельно. Минимальные промоторные элементы размером около 30 п.н. можно использовать для экспрессии чужеродных генов в рекомбинантных ΜVΑконструкциях (^есΜVΑ-ΒN) без риска гомологичной рекомбинации между гомологичными последовательностями основного и дополнительного клонируемого промотора.

2.1. Материал и метод.

Материалы и методы, используемые в примере 2, соответствуют методам из примера 1, если не указано иначе. ПЦР осуществляют в соответствии со стандартными методами.

2.2. Эксперименты и результаты.

Слияние промоторов с геном СИ8 с помощью ПЦР.

Методы ПЦР позволяют сливать нижеследующие минимальные промоторные последовательности с Ουδ-геном:

- 10 012846

ЗЕО Ю N0:7

ТСТТАТТААААААСАТАТАТААТАААТААСА

САТАААААТТТАААСТСТАААТАТААСТАТ

ЗЕО Ю N0:9

АСАСТСТАСТАТСАТАСАТААСТСТСТТСТАТААААТ

ЗЕО Ю N0:10

АТТСТТАААТАААТААТССАТАСТАТАААТ

ЗЕО Ю N0:11

АСТААААААТАТСТТАООТТТАСАААА

ЗЕО Ю N0:12

короткий	поздний)
короткий	поздний)
короткий	ранний)
короткий	поздний)
короткий	ранний)
короткий	поздний)

АТТТАТТТТСАСТТТТАТТАТАСССАТАААТ

Все условные минимальные промоторы, слитые с геном ОИ8, клонируют в рВ8К8+ и секвенируют. Определяют функцию данных условных минимальных промоторов.

Для того чтобы проанализировать активность условных минимальных промоторных элементов, клетки ВНК инфицируют МУЛ-ΒΝ (то1 1.0) и трансфецируют соответствующей плазмидой. Через 24 ч клетки собирают, лизируют и определяют ОИ8-активность (фиг. 3).

Негативный контроль (экстракт из клеток, инфицированных МУЛ-ΒΝ) ясно свидетельствует об отсутствии активности ОИ8 (контроль; средняя экстинкция 0,00167). Показано, что известный как сильный синтетический промотор Рз весьма эффективен (Рз; средняя экстинкция 2,05267), поскольку через 24 ч определяется большое количество ОИ8. Что касается минимальных промоторных элементов условного промотора ΜνΑ-ΒΝ-генома, то было показано, что короткий ранний Е6В, короткий поздний Е6В, короткий ранний Ι2Β, короткий поздний Ι2Ρ, короткий поздний Α42Β и короткий поздний .16И - все они являются функциональными промоторами.

Всего было выделено шесть функциональных минимальных промоторных элементов. Два подходящих для более слабой ранней транскрипции (короткий ранний Ι2Κ средняя экстинкция 0,06933; короткий ранний Р6В: средняя экстинкция 0,189), а четыре пригодны для поздней экспрессии разного уровня (короткий поздний Р6В: средняя экстинкция 0,09833; короткий поздний Ι2Β: средняя экстинкция 0,391; короткий поздний Ι6Β: средняя экстинкция 0,80167, и короткий поздний Α42Β: средняя экстинкция 2,07).

2.3. Заключение.

Четко показано, что можно выделять промоторы разной силы и что в настоящее время доступны самые разнообразные промоторы. Если предпочтительной является ранняя экспрессия, то предпочтительно использовать минимальный промотор короткий ранний Е6В или короткий ранний Ι2Κ Если же предпочтителен поздний промотор, а раннюю экспрессию следует исключить (например, для чужеродных генов, которые содержат стоп-сигнал ΤΤΤΤΤΝΤ для ранней экспрессии), то предпочтительно использовать минимальные промоторные элементы, короткий поздний Е6В, короткий поздний Ι6Β и короткий поздний Α42Κ

- 11 012846

Список последовательностей <110>

Вауагтап Νοτάίο Ά/8 <120>

Промоторы экспрессии модифицированного вируса штамма Анкара коровьей оспы

<130>	ВЫ54РСТ
<150>	БК РА200301730
<151>	2003-11-24
<150>	ЕР04000943.3
<151>	2004-01-17
<160>	12
<170>	Ра6еп61п уегзтоп 3.2
<210>	1
<211>	171
<212>	ДНК
<213>	Модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара
<400>	1
бсбдсаабаб бдббабсдба аббддааааа	бадбдббсда	дбдадббдда	ббабдбдадб	60
аббддаббдб 31:361:1:113611 ббабабббба	баббббдбад	баадаабада	абдсбаабдб	120
саадбббабб ссаабадабд бсббаббааа	ааасабабаб	аабааабаас	а	171

<210> 2 ' <211>105 <212> ДНК <213> Модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара <400>2 дабааааабб бааадбдбаа абабаЗсбаб баббббабад ббдбаабаЭа аадддааабб60 бдаббдбаба сбббсддббс бббаааадаа асбдасббда баааа .105

- 12 012846 <210>3 <211>136 <212> ДНК <213> Модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара <400>3 дсаДЕЕсабс ЕЕЕсЕссааЕ асЕааЬЕсаа аЕЕдЬЕаааЬ ааабааЬдда ЕадЬабаааЕ60 адЕЬаЕЕадЬ даЪаааабад ЕаааааЕааЪ ЕаЕЕадааРа ададЕдОадб аЕсаЕадаЪа 120 асЕсЕсЕЕсЕ абаааа136 <210>4 <211>98 <212> ДНК <213> Модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара <400>4 даЕсЕабааа ддбадассЕа абсдЕсЕсдд аРдассаЕаб аЬЕЕаЕЕЕЕс адЕЕЕЕаЕЕа60

ЕасдсаЕааа Еадбаааааа ЕаЕдЕЕаддЕ ЕЕасаааа98 <210>5 <211> 160 <212> ДНК <213> Модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара <400>5

ддЕааасЕЕЕ	аадасаЬдбд	ЕдЕЕаЕасЕа	адабддЕЕдд	сЕЬаЕЕссаЕ	адЕадсЕЕдЕ	60
ддааЕЕЕаРа	аасЕЕаЕдаЕ	адбаааасЕа	дЕасссааРа	ЕдбааадаЬд	ааааадЕааа	120
ЕЕасЕаЕЕаа	сдссдЕсддб	аЕЕсдРЕсаЕ	ссаЕЕсадЕЕ			160

<210> 6 <211>156 <212> ДНК <213> Модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара <400>6

- 13 012846 аккксксддк адсасаксаа акдакдккас сасккккскк адсакдскка асккдаскаа акакксакаа скааккккка ккаакдакас ааааасдааа кааааскдса каккакасас кддккаасдс ссккакаддс кскаассакк кксаад

120

156 <210>7 <211>31 <212> ДНК <213> Модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара <400>7 ксккаккааа ааасакакак аакааакаас а31 <210> 8 <211>30 <212> ДНК <213> Модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара <400>

дакааааакк кааадкдкаа акакааскак <210>9 <211>37 <212> ДНК <213> Модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара <400>9 ададкдкадк аксакадака асксксккск акаааак37 <210> 10 <211>30 <212> ДНК <213> Модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара <4 00>

аккдккааак ааакаакдда кадкакааак

- 14 012846 <210> 11 <211>27 <212> ДНК <213> Модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара <400>11 адГаааааак акдккаддкк касаааа <210> 12 <211>31 <212> ДНК <213> Модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара <400>12 аШаУИс адккккаТка Гасдсакааа 1

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Промотор, состоящий из нуклеотидной последовательности или содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей:

(1) любую нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО N0: 2-4, 6 и 8-12, (и) нуклеотидную последовательность длиной по меньшей мере 15 нуклеотидов любой последовательности 8Е0 ГО N0: 2-4 и 6 и (ίίί) производные любой последовательности 8Е0 ГО N0: 8-12, причем в производном не более 10 нуклеотидов являются замененными, делетированными и/или встроенными по сравнению с любой соответствующей последовательностью 8Е0 ГО N0: 8-12, причем промотор является активным в качестве промотора вирусов осповакцины и/или активен в клетках, инфицированных вирусом осповакцины.
2. Экспрессионная кассета, содержащая промотор по п.1, а также кодирующую последовательность, где экспрессия кодирующей последовательности находится под контролем указанного промотора.
3. Экспрессионная кассета по п.2, в которой кодирующая последовательность кодирует терапевтические белки или пептиды, антигены, антигенные эпитопы, антисмысловую РНК или рибозимы.
4. ДНК, содержащая промотор по п.1 или экспрессионную кассету по любому из пп.2 или 3.
5. Вектор, содержащий промотор по п.1 или экспрессионную кассету по любому из пп.2 или 3.
6. Вектор по п.5, выбранный из плазмидных векторов и вирусных векторов.
7. Вектор по п.6, где вирусный вектор представляет собой вирус осповакцины.
8. Вектор по п.7, где вирус осповакцины представляет собой модифицированный вирус осповакцины штамма Анкара (МУА), предпочтительно штамм МУА-Б^ депонированный в Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС) под номером У00083008, или его производное, штамм МУА 572, депонированный в ЕСАСС под номером УА94012707, или штамм МУА 575, депонированный в ЕСАСС под номером У00120707.
9. Вектор по п.8, в котором промотор по п.1 или экспрессионная кассета по любому из пп.2 или 3 встроены в природный делеционный сайт генома МУА.
10. Вектор по п.9, в котором промотор по п.1 или экспрессионная кассета по любому из пп.2 или 3 встроены либо в несущественную часть вирусного генома, либо в межгенную область вирусного генома.
11. Применение вектора по любому из пп.5-10 в качестве вакцины или лекарственного средства для индукции иммунного ответа против чужеродного антигена.
12. Вакцина или лекарственное средство для индукции иммунного ответа против чужеродного антигена, содержащая экспрессионную кассету по любому из пп.2 или 3, ДНК по п.4 или вектор по любому из пп.5-10.
13. Вакцина или лекарственное средство по п.12, содержащая по меньшей мере 10² ТСГО₅₀ (инфекционная доза для тканевой культуры) вирусного вектора по любому из пп.7-10.
14. Способ вакцинации, включающий введение вакцины по п.12 или 13 при первой иммунизации (первичная вакцинация) и при второй иммунизации (ревакцинация).
15. Фармацевтическая композиция, содержащая экспрессионную кассету по любому из пп.2 или 3, ДНК по п.4 или вектор по любому из пп.5-10.

- 15 012846
16. Фармацевтическая композиция по п.15, содержащая по меньшей мере 10² ТСГО₅₀ (инфекционная доза для тканевой культуры) вирусного вектора по любому из пп.7-10.
17. Способ индукции иммунного ответа против чужеродного антигена, включающий введение фармацевтической композиции по п.15 или 16, где фармацевтическую композицию вводят в терапевтически эффективном количестве при первой иммунизации (первичная вакцинация) и при второй иммунизации (ревакцинация).
18. Применение экспрессионной кассеты по любому из пп.2 или 3 для получения вакцины или лекарственного средства индукции иммунного ответа против чужеродного антигена.
19. Применение ДНК по п.4 для получения вакцины или лекарственного средства для индукции иммунного ответа против чужеродного антигена.
20. Применение вектора по любому из пп.5-10 для получения вакцины или лекарственного средства для индукции иммунного ответа против чужеродного антигена.
21. Способ введения кодирующей последовательности в клетку-мишень, предусматривающий введение вектора по любому из пп.5-10, экспрессионной кассеты по любому из пп.2 или 3 или ДНК по п.4 в клетку-мишень.
22. Способ получения пептида, белка и/или вируса, предусматривающий инфицирование клеткихозяина вирусным вектором по любому из пп.6-10, культивирование инфицированной клетки-хозяина в подходящих условиях, и выделение и/или обогащение пептида, и/или белка, и/или вируса, продуцированного указанной клеткой-хозяином.
23. Способ получения пептида, белка и/или вируса, предусматривающий трансфекцию клеток экспрессионной кассетой по любому из пп.2 или 3, ДНК по п.4 или плазмидным вектором по п.6 и инфицирование указанных клеток вирусом осповакцины, культивирование инфицированных клеток в подходящих условиях и выделение и/или обогащение пептида, и/или белка, и/или вирусов, продуцированных указанными клетками, где стадию инфицирования клеток вирусом осповакцины можно осуществлять до или после стадии трансфекции.
24. Клетка, содержащая экспрессионную кассету по любому из пп.2 или 3 или вирусный вектор по любому из пп.6-10.
25. Применение промотора по п.1 для экспрессии кодирующей последовательности, где кодирующая последовательность не является последовательностью, которая обычно присоединена к промотору в вирусе осповакцины.
26. Способ получения вектора по любому из пп.5-10, предусматривающий стадию встраивания экспрессионной кассеты по любому из пп.2 или 3 в векторный геном.