DE19918619A1 - Verfahren zum Gewinnen von rekombinantem HBsAg - Google Patents
Verfahren zum Gewinnen von rekombinantem HBsAgInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gewinnen von rekombinanten HBsAg, bei dem zur Expression von HBsAg fähige rekombinante methylotrophe Hefezellen unter Verwendung eines Hochdruckhomogenisators aufgeschlossen werden und das HBsAg aus den erhaltenen Zelltrümmern gewonnen wird. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch eine hohe Produktausbeute pro Zelltrockengewicht aus und stellt daher eine erhebliche Verbesserung gegenüber den bislang bekannten Verfahren zur Gewinnung von HBsAg aus Mikroorganismen dar.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gewinnen von rekombinantem
HBsAg aus HBsAg exprimierenden Hefezellen.
Die Zerstörung der Mikroorganismenzellwand - der Zellaufschluß - ist der erste Verfah
rensschritt bei der Gewinnung intrazellulärer, biologisch aktiver Proteine. Im Produkti
onsmaßstab haben sich in den letzten Jahren hierfür besonders mechanische Auf
schlußverfahren wie die Naßvermahlung in Rührwerkskugelmühlen bewährt.
Die schnellaufenden Rührwerkskugelmühlen geschlossener Bauart haben sich auf
grund der stetig gesteigerten Zerkleinerungs- und Dispergieranforderungen aus den
konventionellen Kugelmühlen der Pigmentverarbeitung entwickelt. Sie bestehen aus
einem um eine vertikale oder horizontale Achse rotierenden Hohlzylinder, der mit Glas-
oder Zirkonium-Mischoxidkugeln bis zu einem Füllgrad von 80% befüllt ist. Dabei kann
die Drehzahl zur Erhöhung der Prall-Druckzerkleinerung nicht beliebig erhöht werden,
da die Zentrifugalkräfte die Mahlwirkung aufheben. Des weiteren treten bei höheren
Drehzahlen oder Füllgraden thermische Probleme auf, die das zu gewinnende Produkt
schädigen können. Die kontinuierliche Mahlgut-Mahlkörper-Separierung erfolgt mit einer
Siebpatrone, einem rotierenden Siebspalt oder mit einem im Lagergehäuse integrierten
koaxialen Ringspalt. Die Kühlung des Mahlgutes erfolgt über einen Doppelmantel um
den Mahlbehälter, teilweise kann die rotierende Achse ebenfalls gekühlt werden. Das
Aufschlußprinzip der Naßvemahlung ist die Übertragung der Bewegungsenergie vom
Rührwerk auf die Mahlkörper. Dies geschieht vorwiegend durch Adhäsionskräfte in
Verbindung mit Verdrängungskräften, die auf die Anordnung und Ausführung der Rühr
elemente zurückzuführen sind. Hierdurch und durch Kohäsionskräfte wird der Mahlraum
aktiviert. Durch die Beschleunigung der Mahlkörper in radialer Richtung kommt es zur
Ausbildung einer Schichtenströmung. Die differentiellen Geschwindigkeitsprofile zwi
schen den Mahlkörperschichten bewirken dabei je nach Absolutgeschwindigkeit und
Größe der bewegten Mahlkörper hohe Scherkräfte, die neben Kollisionsereignissen
hauptverantwortlich für die Zerstörung der Mikroorganismenzellwand sind.
Zellwände lassen sich auch durch Hochdruckhomogenisatoren mechanisch aufbrechen.
Ein solches Gerät besteht im wesentlichen aus einer Hochdruck-Kolbenpumpe und ei
ner Homogenisierungseinheit. Ein Homogenisierventil öffnet, wenn der eingestellte
Druck erreicht wird, wobei dann die Zellsuspension mit sehr hoher Geschwindigkeit
durch die Ventileinheit gedrückt wird. Die Zellsuspension erwärmt sich dabei um ca.
2,5°C pro 100 bar. Nach dem Verlassen der Aufschlußventileinheit wird die Zellsuspen
sion über einen Wärmeaustauscher gekühlt. Anders als bei der Naßvermahlung tritt hier
also eine kurzzeitige Erwärmung des Aufschlußgutes auf. Beim Passieren der Homo
genisiereinheit wird die Zellsuspension sehr hohen Turbulenzen, Kavitation und Scher
kräften ausgesetzt. Das Aufschlußprinzip eines Hochdruckhomogenisators ist der plötz
liche Abbau der Energiedichte in der Zellsuspension in extrem kurzer Zeit, d. h. die hohe
Druckdifferenz bzw. der schnelle Druckabfall kann als Hauptfaktor für den Aufschluß
grad angesehen werden.
Beide mechanische Aufschlußverfahren werden für verschiedene Mikroorganismen an
gewendet. Die Auswahl des jeweiligen Verfahrens hängt von der Art des Mikroorganis
mus, insbesondere von seiner Struktur ab. So werden beispielsweise in Pittroff, M. et al.,
DECHEMA-Biotechnol. Conf.; (1990), 4, Pt.B, 1055-60 beide Zelltrümmerungsverfahren
für verschiedene Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae, Micrococcus luteus
und Escherichia coli, getestet, wobei geschlußfolgert werden konnte, daß morphologi
sche Unterschiede der Mikroorganismen die Trümmerleistung der beiden Verfahren
beeinflussen.
So verweisen Pittroff, M. et al., DECHEMA-Biotechnol. Conf.; (1992), 5, Pt.B,
687-91 und Pittroff, M. et al., Chem. Ing. Tech.; (1992), 64, 10, 950-53 darauf, daß für
bestimmte Mikroorganismen, wie stabförmige Bakterien, bevorzugt das Hochdruckauf
schlußverfahren durchgeführt wird. Dagegen wird für Kokken, die eine runde Struktur
aufweisen, vorzugsweise das Rührwerkskugelmühlen-Verfahren eingesetzt. Bei einem
Aufschluß von Hefezellen der Spezies Saccharomyces cerevisiae wird für beide Verfah
ren der gleiche Desintegrationsgrad beobachtet.
Weiterhin beschreiben Luther, H. et al., Acta - Biotechnol.; (1992), 12, 4, 281-91 einen
weiteren Vergleich der Rührwerkskugelmühlen- und der Hochdruckhomogenisatoren
zur Reinigung von Protein aus Saccharomyces cerevisiae oder Escherichia coli. Es wird
bestätigt, daß sowohl Hefe- als auch Bakterienzellen mit Rührwerkskugelmühlen und
mit Hochdruckhomogenisatoren aufgeschlossen werden können. Als ein Nachteil der
Hochdruckhomogenisatoren wird herausgestellt, daß schleimbildende Mikroorganismen
oder mechanische Kontaminationen sehr leicht zu Okklusionen führen. In bezug auf
Hefezellen wird festgestellt, daß der Hochdruckhomogenisator weniger Zellen zerstört.
Obwohl dies nicht ausdrücklich erwähnt worden ist, muß daher von einer geringeren
Ausbeute mittels Hochdruckhomogenisator ausgegangen werden.
In Schütte, H., Biol. Recombinant-Microorg. Anim. Cells; (1991) Oholo 34 Meet., 293-305
wird ebenfalls bekräftigt, daß Hochdruckhomogenisatoren einen wirksamen Zellauf
schluß bei Hefe- und Bakterienzellen bewirken, jedoch für Mycel-bildende Organismen
nicht geeignet sind.
in Baldwin, C., Biotechnol. Tech.; (1990), 96, 4, 329-34 wurde der Aufschluß von
Saccharomyces cerevisiae mit einem Hochdruckhomogenisator untersucht. Dabei wur
de herausgefunden, daß das Aufbrechen der Zellen mittels Hochdruckhomogenisator
im allgemeinen nur zu niedrigen Zertrümmerungsausbeuten führt (40% in 5 Passagen).
Ein völliger Aufschluß der Hefezellen im Hochdruckhomogenisator konnte nur beobach
tet werden, wenn vorher eine Enzymbehandlung mit Zymolase aus Oerskovia
xanthineolytica durchgeführt worden war.
Äus den umfangreichen Untersuchungen, die bisher durchgeführt wurden, ist weiterhin
ersichtlich, daß die Art des zu reinigenden Proteins von einer entscheidenden Bedeu
tung für die Auswahl des jeweiligen Aufschlußverfahrens ist. Insbesondere ist dabei der
Zellaufschluß von Hepatitis B Oberflächen-Antigen (HBsAg) exprimierenden Zeilen von
Interesse.
In Choo, K. B. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.; (1985), 131, 1, 160-66 wird der
Einsatz von Rührwerkskugelmühlen für den Aufschluß von Saccharomyces cerevisiae-
Zellen zur Gewinnung von HBsAg untersucht. Es konnte jedoch nur eine geringe Menge
an HBsAg in partikulärer Form erhalten werden.
Fenton, D. M. et al., Abstr. Ann. Med. Am. Soc. Microbiol.; (1984), 84 Meet. 193 be
schreiben die Freisetzung von rekombinantem HBsAg aus Saccharomyces cerevisiae
mittels Zellaufschluß in einem Hochdruckhomogenisator. In dieser Literaturstelle wird
darauf hingewiesen, daß die Solubilisierung von HBsAg in aktiver, d. h. antigener Form
im großen Maßstab problematisch ist. Ein ausreichender Zellaufschluß und zufrieden
stellende Proteinfreisetzung wurden in einem Hochdruckhomogenisator erst nach
10 Passagen beobachtet, und eine maximale HBsAg-Freisetzung konnte sogar erst
nach 15 Passagen erhalten werden. Die Autoren schlossen daraus, daß die Freisetzung
von antigenem HBsAg die Zertrümmerung subzellulärer Strukturen erfordert.
Demzufolge konnten bisher mit den beiden Aufschlußverfahren noch keine geeigneten
Systeme zur optimalen Herstellung von HBsAg durch Zellaufschluß zur Verfügung ge
stellt werden.
Es ist deshalb die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zu entwickeln, mit
dem rekombinantes HBsAg in hoher Ausbeute aus rekombinanten Mikroorganismen
gewonnen werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Gewinnen von A
rekombinantem HBsAg, bei dem zur Expression von HBsAg fähige rekombinante me
thylotrophe Hefezellen unter Verwendung eines Hochdruckhomogenisators aufge
schlossen werden, und das HBsAg aus den erhaltenen Zelltrümmern gewonnen wird.
Es wurde überraschend gefunden, daß beim Zellaufschluß von HBsAg exprimierenden
Hansenula polymorpha-Zellen in einem Hochdruckhomogenisator eine bedeutend
höhere Produktausbeute pro g Zelltrockengewicht erreicht werden konnte als mit den
herkömmlichen Verfahren, insbesondere dem Zellaufschluß aus Saccharomyces cere
visiae mittels Hochdruckhomogenisator oder Glaskugelmühlen. Das erfindungsgemäße
Verfahren stellt daher eine erhebliche Verbesserung gegenüber den bisherig bekannten
Verfahren zur Gewinnung von HBsAg aus Mikroorganismen dar.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird rekombinantes HBsAg aus rekombinanten
methylotrophen Hefezellen gewonnen, die zur Expression von HBsAg in der Lage sind.
Vorzugsweise wird ein HBsAg exprimierender Stamm der Gattung Hansenula verwen
det, besonders bevorzugt Hansenula polymorpha. Methylotrophe Hefen der Gattungen
Pichia, Candida und Torulopis können ebenfalls verwendet werden. Während der Fer
mentation werden die üblichen Parameter, wie pH, Belüftung und Temperatur kontrol
liert. Als Substrat für die Hefezellen sind Glycerin, Methanol und Glucose, vorzugsweise
Glycerin, geeignet. Das Substrat wird der Fermenterkultur zugeführt, bis die Hefezellen
eine gewünschte Zelldichte von mindestens 80, vorzugsweise mindestens 90 g.l-1 Zell
trockengewicht erreicht haben. Wenn diese Zelldichte erreicht wird, wird die Expression
des HBsAg in der Hefekultur induziert.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Expression des HBsAg in der methylotro
phen Hefe durch einen Promotor kontrolliert, der einem in den Methanolmetabolismus
involviertem Gen entstammt. Gut beschriebene Promotoren sind der MOX-Promotor,
der DAS- und der FMD-Promotor (Ledeboer, A. M. et al., Nucl. Acids Res. (1985), 13, 9,
3063-3082; Janowicz, Z. A. et al., Nucl. Acids Res. (1995), 13, 9, 2043-3062,
EP 299 108). Um eine optimale Expression unter der Kontrolle dieser Promotoren zu
erzielen, werden die Hefezellen zunächst in vollsynthetischem Nährmedium kultiviert.
Zur Induktion wird Methanol zugefügt, so daß die Zellsuspension ca. 1%-ig an Methanol
ist. Genaue Angaben für die Kultivierung von methylotrophen Hefen und die Induktions
bedingungen für die drei genannten Promotoren können z. B. in Gelissen, G. in
Murooka/lmanaka (eds.) Recombinant microbes for industrial and agricultural
applications, Marcel Dekker, NY 1993, 787-796 und Weydemann, U. et al.,
Appl. Microbiol. Biotechnol. (1995), 44, 377-385 gefunden werden.
Nach Beendigung der Fermentation werden die Zellen von den Medienbestandteilen
über Tangentialfluß-Filtration separiert. Durch geeignete Verdünnung mit einem Auf
schlußpuffer wird eine gewünschte Zelldichte eingestellt.
Zum Aufschluß werden die Hefezeilen vorzugsweise bei einer Zelldichte von 50 bis
150 g.l-1 Zelltrockengewicht verwendet. Die genaue Zelldichte ist abhängig von der je
weiligen rekombinanten methylotrophen Hefezellengattung. Insbesondere ist eine Zell
dichte von 70 bis 120 g.l-1 Zelltrockengewicht bevorzugt. Wird die Zelldichte der erfin
dungsgemäß einzusetzenden rekombinanten methylotrophen Hefezellen zu niedrig ge
wählt, wird das Verfahren zu Zeitaufwendung und unökonomisch. Bei einer zu hohen
Zelldichte der Hefezellen wird der Aufschluß zunehmend ineffizienter, und es steigen die
Anforderungen an die Kühlleistung.
Bei dem erfindungsgemäß verwendeten Hochdruckhomogenisator handelt es sich um
einen, wie in der Einleitung beschriebenen, herkömmlichen Hochdruckhomogenisator,
der zum Zellaufschluß verwendet werden kann. Es ist besonders bevorzugt, daß ein
Hochdruckhomogenisator vom Typ Nanojet LAB30 PL oder ein vergleichbares Modell
verwendet wird. Während des Zellaufschlusses beträgt der Druck in der Homogeni
siereinheit 1000 bis 2000 bar. Ein Druck von 1200-1600 bar ist bevorzugt. Besonders
bevorzugt ist ein Druck von 1500-1600 bar.
Die Ausgangstemperatur der Hefezellen beträgt vorzugsweise 2 bis 15°C, insbesondere
bevorzugt 4 bis 8°C. Die Hefezellen, die üblicherweise in Form einer Zellsuspension
vorliegen, können unter Rühren auf die gewünschte Temperatur gekühlt werden. Der
Hochdruckhomogenisator wird vorzugsweise gekühlt, so daß sich am Produktauslaß
eine niedrige Auslaßtemperatur von beispielsweise 2 bis 15°C, vorzugsweise 3 bis
13°C, besonders bevorzugt 5 bis 10°C, eingestellt.
Im Hochdruckhomogenisator werden die Zellen üblicherweise in mehreren Zyklen
(Passagen) aufgeschlossen. Es hat sich gezeigt, daß insgesamt 3 bis 8 Zyklen
(Passagen) für eine optimalen Produktausbeute ausreichend sind. Bevorzugt werden 3
bis 6, besonders bevorzugt 4 Zyklen (Passagen) für den Zellaufschluß zum Gewinnen
von rekombinantem HBsAg verwendet.
Nach Beendigung des Zellaufschlusses wird die so erzeugte Präparation vorzugsweise
weiteren Separations- und Reinigungsschritten unterzogen. Diese zusätzlichen Pro
zeßschritte sind herkömmliche Verfahren, die eine weitere Reinigung und Anreicherung
von rekombinantem HBsAg im Extrakt bewirken. So können einer oder mehrere der
folgenden Separations- und Aufreinigungsschritte, beispielsweise in der angegebenen
Reihenfolge, durchgeführt werden:
Fällung der Zelltrümmer mit Polyethylenglycol, Separation des PEG-Überstandes,
Adsorption an eine Silika-Matrix, Separation der Silika-Matrix, Desorption des Produkts
von der Silika-Matrix, Separation des Überstandes der Silika-Matrix, Ionenaus
tauschchromatographie, Konzentrierung des Ionentauscher-Pools mit Hilfe einer Ultrafil
tration, Dichtegradiententrennung in Cäsiumchlorid, Größenausschlußchromatographie
und Sterilfiltration (Final Aqueous Bulk).
Das nachstehende Beispiel erläutert die Erfindung.
Für das Hochdruckaufschlußverfahren wurde ein Gerät folgender Spezifikationen ver
wendet:
Nanojet Lab30 PL:
Aufschlußprinzip: Hochdruck
Volumenstrom: (100 ± 20) ml.min.-1, nicht regulierbar
Eingangsdruck Kolbenpumpe: 4-7 bar
Druck Homogenisiereinheit: 1200-1600 bar
Homogenisierventil: Wolfram-Carbid
Kühlung: Rohrbündel-Wärmetauscher
Zelltrockengewicht: 70 g.l-1
Dichtungen: EPDM
Hochdruckdichtung: Buna N
Material: 1-45-71 Stahl
Nanojet Lab30 PL:
Aufschlußprinzip: Hochdruck
Volumenstrom: (100 ± 20) ml.min.-1, nicht regulierbar
Eingangsdruck Kolbenpumpe: 4-7 bar
Druck Homogenisiereinheit: 1200-1600 bar
Homogenisierventil: Wolfram-Carbid
Kühlung: Rohrbündel-Wärmetauscher
Zelltrockengewicht: 70 g.l-1
Dichtungen: EPDM
Hochdruckdichtung: Buna N
Material: 1-45-71 Stahl
Ein HBsAg exprimierender Hansenula polymorpha Stamm, z. B. der in Janowicz et al.,
Yeast, 7 : 431-443, 1991 beschriebene Stamm wird in einem vollsynthetischen Nährme
dium kultiviert. Während der Fermentation werden pH, Belüftung und Temperatur kon
trolliert. Der Fermenterkultur wird während der Fermentation in Abhängigkeit von der
Konzentration an gelöstem Sauerstoff absatzweise Glycerin als Substrat bis zu einer
Zelldichte von ca. 90 g.l-1 Zelltrockengewicht zugeführt. Ab einer Zelldichte von ca. 90
g.l-1 Zelltrockengewicht und einer Fermentationszeit von ca. 46 Stunden wird die Ex
pression des HBsAg in der Hansenula polymorpha Kultur durch die einmalige Zugabe
von Methanol innerhalb von 18 bis 26 Stunden induziert. Das Zelltrockengewicht wird
aus einem Kulturaliquot bestimmt, indem auf einer Trockengewichtswaage bis zur Ge
wichtskonstanz eingedampft wird. Nach der letzten Zugabe wird die Kultur für weitere 2
bis 9 Stunden kultiviert. Anschließend werden die Zellen durch Cross-Flow-Filtration
weitgehend von Fermentationsmedienbestandteilen befreit. Vor Aufschluß werden die
Zellen umgepuffert. Die Umpufferung findet dabei mit 20 mM Phosphatpuffer sowie 2
mM Na2-Ethyleniamintetraessigsäure.2H2O (Titriplex III) statt. Der finalen Zellsuspension
werden 75 mg Detergens Tween 20 pro g Zelltrockengewicht zugeführt. Zum Aufschluß
wurden Hansenula polymorpha Fermenterkulturbrühen mit einer Zelldichte von ca. 70
g.l-1 Zelltrockengewicht verwendet.
Die umgepufferten Zellen werden unter Rühren auf 4-8°C gekühlt. Die Ausgangstem
peratur am Aufschlußgerät wird auf 8 ± 5°C eingestellt. Der Zellextrakt wird in einem
separaten gekühlten Rührbehälter aufgefangen.
Der Volumenstrom beim Hochdruckhomogenisator wird durch das Kolbenhubvolumen
sowie der Anzahl der Hübe pro Minute bestimmt und kann nicht individuell eingestellt
werden. In der Regel wird bei bei einer Flußrate von 100 ml Zellsuspension pro Minute
aufgeschlossen. Die Zellen werden in insgesamt vier Zyklen aufgeschlossen. Nach be
endetem Zyklus 4 wird mit 80 mM PMSF-Stammlösung auf 2 mM Endkonzentration ein
gestellt.
Nach dem Zellaufschluß kann das Produkt durch folgende Separations- und Aufreini
gungsschritte in der genannten oder einer anderen Reihenfolge gereinigt werden:
- - Fällung der Zelltrümmer mit Polyethylenglycol
- - Separation des PEG-Überstandes
- - Adsorption an eine Silika-Matrix
- - Separation der Silika-Matrix
- - Desorption des Produkts von der Silika-Matrix
- - Separation des Überstandes der Silika-Matrix
- - Ionenaustauschchromatographie
- - Konzentrierung des Ionentauscher-Pools mit Hilfe einer Ultrafiltration
- - Dichtegradiententrennung in Cäsiumchlorid
- - Größenausschlußchromatographie
- - Sterilfiltration (Final Aqueous Bulk)
Um die Effizienz des Hochdruckaufschlusses zu untersuchen, wird der Gesamtprotein
gehalt mit Hilfe der Lowry-Methode, sowie die Konzentration an HBsAg mit einem im
munologischen Verfahren ("ELISA") in den Zellextrakten ermittelt.
Im Nanojet Hochdruckaufschluß wurde im 10 l-Fermentationsmaßstab gearbeitet. Um
Vergleichbarkeit zu gewährleisten, wird die Ausbeute an HBsAg auf die jeweilige Zell
masse vor dem Zellaufschluß bezogen.
Stamm: Hansenula polymorpha K3/8-1
Ausgangsmaterial: 10 Liter Femienterkultur RL-98/17
Ziel: Festlegung der notwendigen Anzahl der Aufschlußzyklen
Ausgangsmaterial: 10 Liter Femienterkultur RL-98/17
Ziel: Festlegung der notwendigen Anzahl der Aufschlußzyklen
Ab der vierten Passage konnte kein signifikanter Zuwachs an Protein und Produkt
(HBsAg) mehr festgestellt werden. Für die weiteren Versuche wurde daher eine Passa
genzahl von vier festgelegt.
Der "Final Aqueous Bufk" ist das Präparat, das nach der Durchführung der vorstehend
genannten Separations- und Aufbereitungsschritte erhalten wird.
Stamm: Hansenula polymorpha K3/8-1
Ausgangsmaterial: 10 Liter Fermenterkultur NJ-4() RL-98/19), NJ-6, -7
Stamm: Hansenula polymorpha K3/8-1
Ausgangsmaterial: 10 Liter Fermenterkultur NJ-4() RL-98/19), NJ-6, -7
Für das Naßvermahlungsverfahren wurden Geräte folgender Spezifikationen verwen
det.
Aufschlußprinzip: Naßvermahlung
Rotordurchmesser: 192 mm
effektives Mahlvolumen: 1200 ml
Befüllung mit Mahlkörpern: 70-80% des effektiven Mahlvolumens
Mahlspalt: 6,50 mm
Trennspalt: 0,05 mm
Siebspalt: 0,20 mm
Differentialspalt: 0,18 mm
Rotorumfangsgeschwindigkeit: 14 m.s-1
Rotordurchmesser: 192 mm
effektives Mahlvolumen: 1200 ml
Befüllung mit Mahlkörpern: 70-80% des effektiven Mahlvolumens
Mahlspalt: 6,50 mm
Trennspalt: 0,05 mm
Siebspalt: 0,20 mm
Differentialspalt: 0,18 mm
Rotorumfangsgeschwindigkeit: 14 m.s-1
Kühlung: Doppelmantel und Rotorkühlung
Zelltrockengewicht: 100-120 g.l-1
Zelltrockengewicht: 100-120 g.l-1
Volumenstrom: 200-300 ml.min-1
Dichtungsmaterial: Ethylen-Propylen
Aufschlußprinzip: Naßvermahlung
effektives Mahlraumvolumen: 600 ml
Rührscheiben: 4, Polyurethan
Befüllung mit Mahlkörpern: 80-85% des effektiven Mahlvolumens
Umdrehungsgeschwindigkeit: 6,8 m.s-1
effektives Mahlraumvolumen: 600 ml
Rührscheiben: 4, Polyurethan
Befüllung mit Mahlkörpern: 80-85% des effektiven Mahlvolumens
Umdrehungsgeschwindigkeit: 6,8 m.s-1
Koaxialer Ringspalt: 0,1 mm
Kühlung: Doppelmantel
Zelltrockengewicht: 70 g.l-1
Kühlung: Doppelmantel
Zelltrockengewicht: 70 g.l-1
Volumenstrom: 100 ml.min-1
Dichtungsmaterial: Viton
Zur Naßvermahlung wurden Glaskugeln mit 0,45-0,55 mm Durchmesser verwendet.
Es werden dieselben Materialien wie in Beispiel 1 werden verwendet, jedoch besitzen
die Fermenterkulturbrühen eine Zelldichte von 70 bis 120 g.l-1 Zelltrockengewicht.
Die Vor- und Nachbehandlung erfolgen wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die horizontal ausgerichtete Aufschlußkammer wird über eine Peristaltikpumpe mit ei
nem Volumenstrom von 100 ml.min.-1 Zellsuspension, die 70 g.l-1 Zellen enthält, kontinu
ierlich beschickt. Zeitgleich wird eine 80 mM PMSF-Lösung zur Proteaseinhibierung mit
1/40 des Zellsuspensionstroms an einem separaten Eingangsport der Aufschlußkam
mer zugegeben, wobei eine sofortige Vermischung erfolgt. Die Zellsuspension wird in
einem Zyklus aufgeschlossen.
Hier wird die Zellsuspension der Aufschlußkammer, die vertikal ausgerichtet ist, eben
falls mit einer Peristaltikpumpe kontinuierlich zugeführt. Jedoch beträgt die Zelldichte in
diesem Fall 100 bis 120 g.l-1, der Volumenstrom wird auf 200 bis 300 ml.min.-1 einge
stellt. Die Zugabe der Proteaseinhibitor-Stammlösung (80 mM PMSF) erfolgt im Gegen
satz zur Dyno Mill KDL Spezial erst am Kugelmühlenauslaß. Die Zellsuspension wird in
einem Zyklus aufgeschlossen. Die Endkonzentration an PMSF im finalen Zellextrakt
beträgt 2 mM.
Die Aufschlußversuche mit der Fryma Coball Mill MS18 wurden im 50 Liter Maßstab
durchgeführt. Bei der Naßvermahlung mit der Dyno Mill KDL Spezial wurde im 10 l-
Fermentationsmaßstab gearbeitet. Um Vergleichbarkeit zu gewährleisten, wird die Aus
beute an HBsAg auf die jeweilige Zellmasse vor dem Zellaufschluß bezogen.
Stamm: Hansenula polymorpha K3/8-1
Ausgangsmaterial: 10 Liter Fermenterkultur RL-98/19
Ausgangsmaterial: 10 Liter Fermenterkultur RL-98/19
Stamm: Hansenula polymorpha K3/8-1
Ausgangsmaterial: 50 Liter Fermenterkultur RL-98/26, /29,/35
Ausgangsmaterial: 50 Liter Fermenterkultur RL-98/26, /29,/35
Verglichen mit dem Zellaufschluß in der DynoMill Glaskugelmühle wird aus identischem
Ausgangsmaterial eine vierfach höhere Produktmenge pro Gramm Trockensubstanz
freigesetzt. Die Gesamtproteinmenge steigt gleichzeitig nur um den Faktor zwei an. Es
wird folglich mehr Produkt (HBsAg) aus dem gleichen Ausgangsmaterial freigesetzt. Die
anfängliche Produktausbeutesteigerung im Hochdruckaufschlußverfahren bleibt auch
nach allen folgenden Prozeßschritten bis hin zum Final Aqueous Bulk erhalten und die
Produktqualität entspricht der des Standardverfahrens (Naßvermahlung). Dies konnte
mittels der beschriebenen Kombination aus Lowry und ELISA gezeigt werden.
Über den Durchschnitt von jeweils drei Läufen betrachtet wird mit dem Nanojet Hoch
druck-Aufschluß eine 2,9-fach höhere Produktmenge pro Gramm Zelltrockengewicht
freigesetzt als beim Glaskugelaufschluß. Die höhere Produktmenge aus dem Zellauf
schluß führt zu einer 2,6-fach höheren Menge an aufgereinigtem Produkt im Final Aqu
eous Bulk. Die Qualität der Produkte liegt für beide Aufschlußverfahren innerhalb der
selben Spezifikationen, wie auch die folgenden Analysenzertifikate bestätigen.
Probe:
rHBsAg
Chargen-Nr NJ6 GFC
rHBsAg
Chargen-Nr NJ6 GFC
Probe:
rHBsAg
Chargen-Nr. RL98/35 Final Bulk
rHBsAg
Chargen-Nr. RL98/35 Final Bulk
Die gezeigten Untersuchungen belegen, daß entgegen der im Stand der Technik wie
dergegebenen Annahme der Hochdruckaufschluß für Hefezellen, jedenfalls für Hefezel
len methylotropher Gattungen, von erheblichem Vorteil ist. Mittels Hochdruckauf
schluß kann eine Steigerung der Ausbeute um das 2,5- bis 4-fache erreicht werden.
Claims (7)
1. Verfahren zum Gewinnen von rekombinantem HBsAg, bei dem zur Expression
von HBsAg fähige rekombinante methylotrophe Hefezellen unter Verwendung ei
nes Hochdruckhomogenisators aufgeschlossen werden und das HBsAg aus den
erhaltenen Zelltrümmern gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante
methylotrophe Hefezelle eine Hefezelle der Gattung Hansenula ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefezellen
bei einer Zelldichte von 50-150 g.l-1 Zelltrockengewicht für den Aufschluß ver
wendet werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die
Hefezellen bei einem Druck von 1000 bis 2000 bar in der Homogenisiereinheit des
Hochdruckhomogenisators aufgeschlossen werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die
Temperatur am Produktauslaß 2 bis 15°C beträgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die
Zellen in 3 bis 6 Zyklen (Passagen) aufgeschlossen werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das
rekombinante HBsAg nach dem Zellaufschluß weiteren Separations- und Reini
gungsschritten unterzogen wird.
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