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Verfahren zur Herstellung von Impfstoffkonzentraten von Brucella abortus
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffkonzentraten des
Stammes 19 von Brucella abortus.
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Impfstoffe, die Organismen vom Stamm 19 von Brucella abortus enthalten,
werden zur Immunisierung von Rindvieh gegen Infektionen mit virulenten Brucella-Stämmen
verwendet. Zur Erzielung einer angemessenen Immunisierung müssen große Mengen lebender
Organismen des Stammes 19 injiziert werden. Bei der Herstellung solcher Impfstoffe
ist die Gegenwart einer beträchtlichen Anzahl von toten oder abartigen (englisch:
dissociated) Brucella-Organismen höchst unerwünscht. Außerdem ist es erforderlich,
die Kulturbedingungen so zu halten, daß sowohl die Entstehung virulenter als auch
die Entstehung nicht immunisierend wirkender Varianten des gewünschten Stammes 19
vermieden wird. Die Entstehung abartiger Organismen bot bei früheren Versuchen zur
Kultivierung von Brucella abortus in flüssigen Medien ein besonderes Problem.
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In der Vergangenheit wurden die Brucella-abortus-Stamm-19-Impfstoffe
durch Kultivierung der Organismen in Behältern, wie Roux-Kolben oder Povitsky-Flaschen,
auf einem üblichen festen Kartoffel-Glycerin-Agar-Medium hergestellt. Zur Erzielung
der gewünschten Ausbeute an nicht abartigen Organismen war es bei solchen Kulturen
wesentlich, eine Berührung der wachsenden Bakterienkolonien mit Flüssigkeiten, wie
dem sich in solchen Flaschen normalerweise bildenden Kondensat, zu vermeiden.
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Die Herstellung des Impfstoffes nach diesem bekannten Verfahren erfordert
die Aufbewahrung der Waschflüssigkeiten des Agarmediums in einer großen Anzahl von
Flaschen, wobei wegen der großen Zahl der Arbeitsvorgänge die Gefahr einer Verunreinigung
gegeben ist.
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Kürzlich wurde berichtet, daß die Kultivierung von Brucella abortus
zur Herstellung von Impfstoff in flüssigem Medium durchgeführt worden ist. Es war
jedoch nicht möglich, nach den beschriebenen Verfahren durch Kultivierung des Stammes
19 von Brucella abortus in flüssigen Medien wünschenswert hohe Ausbeuten an nicht
abartigen Organismen zu erhalten. Weiterhin waren bei diesen Kultivierungsverfahren
zur Herstellung großer Mengen von Organismen unerwünscht lange Zeiten erforderlich.
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Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von Konzentraten des Stammes
19 von Brucella abortus gefunden, das ein starkes Wachstum bzw. eine rasche Reproduktion
der Organismen gestattet. Die nach dem neuen Verfahren hergestellten Impfstoffkonzentrate
haben ferner den Vorteil, hochwirksam zu sein.
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Erfindungsgemäß wird weiterhin die unerwünschte Bildung von abartigen
Organismen auf ein Minimum herabgesetzt.
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Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß man eine belüftete,
sterile wäßrige Lösung, die Glucose, Hefeextrakt, Natriumchlorid, Thiaminhydrochlorid,
ein Antischaummittel und ein Pankreasenzym-Hydrolysat von Casein enthält, mit Organismen
vom Stamm 19 von Brucella abortus animpft und anschließend vorzugsweise bei etwa
370C kultiviert. Zur Erzielung der besonderen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist es wesentlich, daß die Belüftung durch Einführung steriler Luft unterhalb der
Flüssigkeitsoberfläche - vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit von mindestens 0,7
Volumeinheiten je Minute je Volumeinheit des flüssigen Mediums - geschieht und daß
das flüssige Medium während der Kultivierung-gerührt wird.
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Es kann jedes übliche Antischaummittel verwendet werden, das eine
Schaumbildung während der Kultivierung wirksam verhütet, wie Maisöl, ein handelsübliches
Silicon-Antischaummittel oder ein Polyoxydäthylenderivat der Ricinolsäure. Die Bildungsgeschwindigkeit
und die Ausbeute der Organismen können jedoch erfindungsgemäß erhöht werden, wenn
als Antischaummittel ein Polypropylen-
glykol verwendet wird. Die
bevorzugten Polypropylenglykole weisen Molekulargewichte von 1500 bis 3000, vorteilhaft
von etwa 2000 auf.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können an den Organismen hochkonzentrierte
Präparate in einer Zeit von nur 20 Stunden erhalten werden, während bei den bisherigen
Verfahren mindestens etwa 70 Stunden erforderlich waren, was von großer wirtschaftlicher
Bedeutung ist.
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Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren zur Herstellung von Brucella-abortus-Impfstoffen
mit verbesserter Beständigkeit vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
man die erhaltenen Impfstoffkonzentrate in dem flüssigen Kulturmedium mit einem
Stabilisierungsmittel vermischt, das im wesentlichen aus einer wäßrigen Lösung besteht,
die Kaliumcitratmonohydrat, Natriumcitrat, Dikaliumhydrogenphosphat, Calciumchlorid,
Magnesiumchloridhexahydrat, Kaliumcarbonatsesquihydrat und Lactose, vorzugsweise
in Mengen von 0,135, 0,245, 0,061, 0,133, 0,06, 0,1 bzw. 17,25 Gewichtsprozent,
enthält, wobei der Rest aus Wasser besteht.
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Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das
flüssige Kulturmedium durch Auflösen eines Pankreasenzym-Hydrolysates von Casein
zusammen mit Glucose, Hefeexrakt, Natriumchlorid, Thiaminhydrochlorid und einem
Antischaummittel - vorzugsweise einem Polypropylenglykol - in Wasser hergestellt.
Dieses Medium wird - vorzugsweise durch Filtrieren - sterilisiert und mit einem
Impfmaterial angeimpft, das durch Waschen von gleichmäßigen Kolonien des Stammes
19 von Brucella abortus, die in üblicher Weise auf einem festen Kartoffel-Glycerin-Agar-Medium
gezüchtet worden sind, erhalten worden ist. Die Züchtung des Organismus wird in
einem geeigneten Behälter, wie einem aus Glas bestehenden, mit Glas ausgekleideten
oder aus rostfreiem Stahl gefertigten Fermentationstank, durchgeführt, der mit einem
mit hoher Umdrehungszahl laufenden Rührer und einer Einleitungsvorrichtung für sterile
Luft versehen ist.
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Die Züchtung des Organismus wird unter starkem Rühren bei einer Temperatur
von 36 bis 380 C durchgeführt, während sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von
mindestens 7 Volumeinheiten je Minute je 10 Volumeinheiten des flüssigen Kulturmediums
eingeführt wird. Die Kultivierung des Organismus wird unter den vorstehenden Bedingungen
bei einfachem Ansatz etwa 20 Stunden oder - wenn, wie im folgenden beschrieben,
weiteres flüssiges Medium nachgegeben wird - bis zu etwa 40 Stunden fortgesetzt.
In jedem Falle wird die Züchtung so lange fortgesetzt, bis ein optimales Wachstum
von lebensfähigen Organismen erzielt ist, wonach das erhaltene Impfstoffkonzentrat
aus dem Fermentationstank unter Druck in einen sterilisierten Vorratsbehälter aus
rostfreiem Stahl oder in sterile Gasflaschen abgezogen wird. Die so erhaltene Menge
an Impfstoffkonzentrat kann danach mit gepufferter physiologischer Kochsalzlösung
oder einem anderen geeigneten Verdünnungsmittel vermischt werden, um ein injizierfähiges,
flüssiges Impfmaterial herzustellen. Das Konzentrat kann auch mit einem Stabilisierungsmittel
kombiniert und in üblicher Weise gefriergetrocknet werden, um ein getrocknetes Produkt
herzustellen, das später mit physiologischer Kochsalzlösung zu einem injizierfähigen
Impfmaterial verdünnt werden kann.
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Das besondere Proteinmaterial, das sich als Bestandteil des verwendeten
Nährmediums zur Erzielung hoher Ausbeuten von Brucella-abortus-Organismen als wesentlich
erwiesen hat, ist einPankreasenzym-Hydrolysat von Casein, das - in Form eines Gemisches
von Aminosäuren und Peptiden - sämtliche Aminosäuren aufweist, die im Casein ursprünglich
enthalten sind. Da das Casein normalerweise natürlichen Ursprungs ist, enthält das
Gemisch außerdem beträchtliche Mengen von Vitaminen, die für ein angemessenes Wachstum
der Brucella-Organismen erforderlich sind. Das zur erfindungsgemäßen Verwendung
geeignete Pankreasenzym - Hydrolysat von Casein ist im Handel erhältlich. Im folgenden
wird eine Analyse eines solchen Produktes angegeben: Gesamtstickstoff . . . . .
. . . . 12,80in Aminogruppenstickstoff .... .. 6,8 °/o % Aminostickstoff pro Gesamtstickstoff
.. . . 53,0 0/o Feuchtigkeit 3,1 °/o Lactose, maximal . . 1,5 o/o Asche .... . .
. . . .... °i(, pH-Wert (20/oige Lösung in Wasser bei 250 C) . . 6,6 % Aminosäuregehalt
(bezogen auf feuchtigkeitsfreie Substanz) Lysin . 7.6 % Isoleucin . . 6,4 % Leucin
....................... 10,5% Valin . 7,0% Arginin . 3,3 ovo Threonin .. 4,00/0
Methionin . : 2,5 % Cystin ... . 0,3% Phenylalanin . 4,50/0 Histidin . . 2,4 ovo
Tryptophan . . 0,90/0 Glutaminsäure . . 20,40/a Vitamingehalt Riboflavin . 4,25
llglg Thiamin . .......... 0,11 µg/g Nicotinsäure (Niacin) . 4,50 Fg/g Pantothensäure
. 2,19 rg/g Biotin . . 0,51 llglg Pyridoxin . 1,29 g/g Ein optimales Wachstum der
Brucella-Organismen wurde im allgemeinen unter Verwendung eines Mediums erzielt,
das im wesentlichen die folgende Zusammensetzung aufweist: Bestandteile Gewichtsprozent
Pankreashydrolysat von Casein 3 Glucose 2 Thiaminhydrochlorid . 0,0005 Hefeextrakt
1 Natriumchlorid. 0,5 Propylenglykol (Molgewicht: 2000) .. ..... .. 0,0116 Entsalztes
Wasser aufgefüllt auf 100,00 Gegebenenfalls kann das als Antischaummittel verwendete
Prolylenglykol der zum Animpfen verwendeten Suspension zugesetzt werden, und zwar
in
einer Menge, die beim Vermischen der Impfsuspension mit dem flüssigen
Nährmedium - dem in diesem Fall kein Polypropylenglykol zugesetzt worden ist - die
obengenannte Konzentration ergibt.
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Bei den obengenannten Mengenverhältnissen der Bestandteile wird ein
Nährmedium mit einem p-Wert von etwa 6,3 bis 6,4 erhalten. Während der Bebrütung
der Brucella-Organismen in dem Medium steigt der pH-Wert normalerweise auf einen
Wert von 8,1 bis 8,3 an. Im allgemeinen wird das Kulturmedium ohne weitere Zusätze
in diesem gewünschten Bereich gehalten. Steigt jedoch der pn-Wert vor Bildung der
gewünschten Menge an Organismen auf einen Wert oberhalb des im vorstehenden genannten
Grenzwertes an, so können zur Aufrechterhaltung des pu-Wertes im gewünschten Bereich
geringe Mengen steriler wäßriger 500/oiger Glucoselösung zugegeben werden.
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Es wurde ferner gefunden, daß es für das gewünschte rasche Wachstum
der Organismen nicht ausreicht, die Belüftung des Kulturmediums während der Züchtung
der Brucella-Organismen so durchzuführen, daß man Luft in den oberen Teil des Fermentationsbehälters
einleitet und sich zur Einführung der Luft in das Medium auf die Mischwirkung des
Rührers verläßt. Dementsprechend hat es sich als wesentlich herausgestellt, die
sterile Luft in den unteren Teil des Fermentationsbehälters unterhalb der Oberfläche
des Nährgemisches einzuführen, und zwar mit Hilfe eines Fritten- bzw. Düseneinleitungsrohres
(englisch: sparger) oder einer anderen geeigneten Verteilungsvorrichtung sowie mit
einer Geschwindigkeit von mindestens etwa 7 Volumteilen Luft je Minute je 10 Volumteile
Kulturmedium.
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Bei der praktischen Durchführung des Verfahrens wird durch das Rühren
der Nährflüssigkeit und das rasche Wachstum der Organismen während der Inkubationsperiode
so viel Wärme erzeugt, daß gewöhnlich zumindest während des stärksten Wachstums
eine Kühlung erforderlich ist, um die Temperatur nahe 370 C zu halten.
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Es ist im allgemeinen erwünscht, die Vermehrung der Organismen in
zwei oder mehr Stufen durchzuführen. Zum Beispiel wird das mit phosphatgepufferter
physiologischer Kochsalzlösung aus derKartoffel-Glycerin-Agar-Kultur extrahierte
Animpfmaterial vor dem Gebrauch untersucht und auf seine Reinheit geprüft. Das Animpfmaterial
wird dann in ein bestimmtes Volumen der wie oben zusammengesetzten sterilen Nährflüssigkeit
eingeführt, und zwar in einem Mengenverhältnis von etwa 1 Volumteil Impfmaterial
auf mindestens etwa 14 Volumteile des Mediums, und das erhaltene Gemisch wird unter
den oben beschriebenen Bedingungen vorläufig etwa 20 Stunden bebrütet, um eine für
Groß ansätze geeignete Impfkultur zu erhalten. Bei einer solchen Arbeitsweise wird
die Zahl der mit Impfmaterial gefüllten und gelagerten Flaschen so gewählt, daß
die Konzentration der Brucella-Organismen in dem Impfmaterial ausreicht, in dem
erhaltenen Gemisch eine anfängliche Konzentration von 0,6 100 bis 1,5 100 Organismen
pro Kubikzentimeter zu erhalten. Nach Ablauf der besagten Vorkultivierungsperiode
wird - während in der so vorliegenden Arbeits-Impfkultur noch eine starke Vermehrung
der Brucella-Organismen stattfindetfrisches steriles flüssiges Nährmedium in einer
Menge, die mindestens das gleiche bis zum zweifachen des Volumens der Arbeits-Impfkultur
ausmacht,
in den Fermentationsbehälter gegeben, worauf die Züchtung des Organismus unter den
gleichen Bedingungen weitere etwa 15 bis 20 Stunden fortgesetzt wird, um die Herstellung
des gewünschten Impfstoffkonzentrats zu vervollständigen.
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Beispiel 1 Brucella-abortus-Organismen vom Stamm 19 wurden auf Kartoffel-Glycerin-Agar-Nährböden
geimpft, die sich in Povitsky-Flaschen befanden, und in üblicher Weise bebrütet.
Nach 48stündiger Bebrütung bei 36 bis 380 C wurden die Organismen aus fünfzehn bis
zwanzig solchen Flaschen durch Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung, die einen
Phosphatpuffer zur Aufrechterhaltung eines pII-Wertes von 6,4 enthielt, gewonnen
und die Waschflüssigkeiten in Vorratsbehälter gegeben und auf ihre Reinheit geprüft.
Die Zahl der Flaschen, deren Inhalt mit der Waschflüssigkeit behandelt wurde, und
das Volumen der Waschflüssigkeiten wurden so gewählt, daß die Impfvorratslösung
mindestens etwa 75 1011 lebensfähige Brucella-Organismen enthielt. Inzwischen wurde
ein flüssiges Medium mit den folgenden Bestandteilen hergestellt: Pankreashydrolysat
von Casein * 30/0 Glucose ................ 2% Thiaminhydrochlorid ..... 0,0005%
0,00050/0 Hefeextrakt . 1 O/o NaCl ......:........ 0,5 0/o Polylgykol P 2000** .
0,0116 0/o Wasser . . 93,4 0/o * »NZ-Amin«, Typ A (Sheffield Chemical Co.).
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** Ein Polypropylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 2000.
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125 1 der wie vorstehend bereiteten Flüssigkeit wurden durch ein
Seitz-Bakterienfilter in einen sterilisierten Fermentationsbehälter aus rostfreiem
Stahl gefüllt, der mit einem Fritten- bzw. Düsengaseinleitungsrohr und einem motorgetriebenen
Rührer versehen war, und auf eine Temperatur von etwa 370 C eingestellt. Zu dem
flüssigen Medium wurde dann unter Rühren die wie oben beschrieben gewonnene Impfflüssigkeit
in einer Menge gegeben, daß eine anfängliche Konzentration von etwa 0,6- 109 bis
1,5 109 Organismen je Kubikzentimeter vorlag. Das erhaltene Gemisch wurde bei einer
Temperatur von 36 bis 380 C und einer Rührergeschwindigkeit von 240 bis 250 Umdr./Min.
etwa 20 Stunden bebrütet.
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Während dieser Bebrütungsperiode wurde in den unteren Teil des Mediums
sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von etwa 7,1 imin. je 10 1 Medium eingedüst
und die Temperatur - je nachdem durch Erhitzen oder Kühlen - in dem obengenannten
Bereich gehalten. Nach Beendigung der Bebrütung dieses Arbeits-Impfansatzes wurden
weitere 175 1 des obengenannten flüssigen Mediums durch Filtrieren sterilisiert
und in den Fermentationsbehälter gegeben. Die Bebrütung wurde sodann unter den vorgenannten
Bedingungen weitere etwa 18 Stunden fortgesetzt, wonach das erhaltene Impfstoffkonzentrat
in einen sterilisierten Aufbewahrungsbehälter aus rostfreiem Stahl abgezogen und
durch Kühlung auf eine Temperatur von 50 C konserviert. Aliquote Anteile dieses
Konzentrats wurden serienmäßig mit steriler wäßriger Io/oiger Peptonlösung verdünnt
und die in geeigneter Weise verdünnten Lösungen in
Petrischalen
auf einen sterilen Kartoffel-Agar-Nährboden gebracht, der Pferdeserum enthielt,
und 120 Stunden bei 36 bis 380 C bebrütet. Die Auszählung der auf den Platten befindlichen
Organismen zeigte, daß der Ansatz des Impfstoffkonzentrats etwa 200 109 lebensfähige
Brucella-abortus-Organismen je Kubikzentimeter enthielt. Andere serienmäßig hergestellte
Verdünnungen wurden auf sterile Kartoffel-Agar-Böden gebracht, die kein Pferdeserum
enthielten, bebrütet und nach dem Verfahren von Minute und Manthei, American Journal
of Veterinary Research, 2, (3), S. 181 bis 190 (1941), auf die Bildung abartiger
Organismen untersucht. Es wurde gefunden, daß das Impfstoffkonzentrat von abartigen
Formen praktisch frei war. Weitere, nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellte
Ansätze von Impfstoffkonzentrat lieferten übereinstimmende Ausbeuten von 150 109
bis 220 109 Brucella-abortus-Organismen je Kubikzentimeter.
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Sowohl flüssige als auch getrocknete Impfstoffpräparate, die aus
den nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellten Impfstoffkonzentraten gewonnen
worden waren, zeigten bei der Lagerung eine ausgezeichnete Beständigkeit und wurden
routinemäßig für eine Anzahl von Monaten zur Immunisierung von Kälbern verwendet,
wobei kein späterer Verlust der Immunität berichtet wurde.
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Wird eine Konservierung des Impfstoffes durch Eintrocknen gewünscht,
wird dem Impfstoffkonzentrat vor der Gefriertrocknung vorzugsweise ein Stabilisierungsmittel,
wie sterile Magermilch oder wieder aufgelöstes Trockenmagermilchpulver, zugesetzt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde gefunden,
daß eine in unerwarteter Weise erhöhte Beständigkeit erzielt werden kann, wenn an
Stelle von Milch ein Stabilisierungsmittel der folgenden Zusammensetzung verwendet:
Bestandteile Gewichtsprozent Kaliumcitratmonohydrat . 0,135 Natriumcitrat . ........
. 0,245 Dikaliumhydrogenphosphat . 0,061 Calciumchlorid 0,133 Magnesiumchloridhexahydrat
. 0,06 Kaliumcarbonatsesquihydrat . 0,1 Lactose . . 17,25 Wasser . . aufgefüllt
auf 100,00 Der pH-Wert der vorstehenden Lösung, im folgenden als Citrat-Lactose-Stabilisierungsmittel
bezeichnet, wurde mit Milchsäure auf 7 eingestellt und die Lösung vor dem Gebrauch
durch Filtrieren sterilisiert.
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Das Citrat-Lactose-Stabilisierungsmittel hat sich auch zur Stabilisierung
von flüssigen Impfstoffpräparaten als bemerkenswert wirksam erwiesen. In den Mengen,
wie das Stabilisierungsmittel in normalen Dosierungen des Impfstoffes zur Anwendung
kommt, ist auch seine Injizierung bei Rindern unbedenklich.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Verbesserung der Beständigkeit
von flüssigem Impfstoff, wie sie durch den oben beschriebenen Citrat-Lactose-Stabilisator
erzielt wird, sowie die erhöhte Beständigkeit der erfindungsgemäß hergestellten
Impfstoffpräparate im Vergleich zu Impfstoffpräparaten, die durch Kultivierung der
Organismen auf Kartoffel-Glycerin-Agar-Nährböden unter Verwendung von
Magermilchtrockenpulver
als Stabilisierungsmittel hergestellt wurden.
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Beispiel 2 Ein nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellter Ansatz
von Impfstoffkonzentrat wurde in zwei Teile geteilt und jeder Teil genügend verdünnt,
um einen injizierfähigen, eine geeignete Konzentration an Brucella-Organismen aufweisenden
Impfstoff zu erhalten. Der eine dieser Teile wurde in üblicher Weise mit steriler,
phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung von PH= 6,4 verdünnt. Der andere
Ansatz wurde mit dem oben beschriebenen sterilen Citrat-Lactose-Stabilisierungsmittel
verdünnt.
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Proben eines jeden Teiles wurden serienmäßig verdünnt und zur Bestimmung
der Konzentration an lebensfähigen Brucella-Organismen in üblicher Weise auf Nährplatten
aufgebracht. Die beiden Ansätze wurden dann 6 Monate in geschlossenen Behältern
bei einer Temperatur von 50 C aufbewahrt und wiederum wie vorstehend geprüft. Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt, in der die Zahl der Organismen
in Milliarden (109) je Kubikzentimeter angegeben ist.
| Lebensfähige Brucella- |
| Verwendetes abortus-Organismen |
| Verdünnungsmittel je Kubikzentimeter ( 109) |
| Nach der Nach |
| Herstellung 6 Monaten |
| Phosphatgepufferte Koch- |
| salzlösung . . 12,9 6,2 |
| Citrat-Lactose- |
| Stabilisierungsmittel . 14,5 13,9 |
Es ist also festzustellen, daß der in üblicher Weise mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung
hergestellte Impfstoff während der Lagerung über 50°/o der anfangs vorhandenen lebensfähigen
Organismen verliert, während die Konzentration des erfindungsgemäß stabilisierten
Impfstoffes lediglich um etwa 4 ovo absinkt.
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Zu Vergleichszwecken wurden Brucella-abortus-Organismen vom Stamm
19 aus einer kräftigen Stammkultur auf ein übliches Kartoffel-Glycerin-Agarmedium
geimpft, bebrütet und zur Herstellung eines Impfstoffkonzentrats nach dem bekannten
Standardverfahren durch Waschen mit gepufferter Kochsalzlösung gewonnen. Zwei Ansätze
des so hergestellten Impfstoffkonzentrats wurden mit gelöstem Magermilchtrockenpulver
(einem verbreitet angewendeten Stabilisierungsmittel) und physiologischer Kochsalzlösung
in den folgenden Anteilen verdünnt: Bestandteile Gewichtsprozent Impfstoffkonzentrat
.. . 40 Kochsalzlösung . 16 Milchlösung * . 44 * Eine sterile Lösung, die 92,6 g
Magertrockenmilchpulver je Liter enthielt.
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Nach dem Verfahren von Beispiel 1 wurden in flüssigem Medium weitere
Ansätze von Impfstoffkonzentrat hergestellt. Zwei Ansätze solcher Konzentrate wurden
mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und genau wie die aus dem festen Medium
gewonenen Konzentrate mit physiologischer Kochsalzlösung und aufgelöstem Magertrockenmilchpulver
verdünnt.
Zwei weitere Ansätze von in flüssigen Medien hergestellten Konzentraten wurden mit
dem oben beschriebenen Citrat-Lactose-Stabilisierungsmittel verdünnt.
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Sämtliche Ansätze der wie oben hergestellten stabilisierten Impfstoffe
wurden in Standard-Dosierungsvolumina geteilt, in Flaschen abgefüllt und in einer
handelsüblichen Vorrichtung gefriergetrocknet. Nach dem Eintrocknen wurden Proben
eines jeden Impfstoffansatzes wieder aufgelöst, serienmäßig verdünnt und nach dem
Standardverfahren auf Nährplatten aufgebracht, um die Konzentration an lebensfähigen
Organismen in jedem Ansatz zu bestimmen. Die auf Flaschen abgefüllten eingetrockneten
Impfstoffpräpa-
rate wurden dann in einen bei 370 C gehaltenen Brutschrank gebracht.
Solche Impfstoffe werden normalerweise bis zur Auflösung vor dem Gebrauch unter
Kühlung aufbewahrt. Wenn also - wie es hier der Fall ist - sogar ein lebender Impfstoff
bei 370 C gelagert wird, handelt es sich um eine stark beschleunigte Prüfung auf
die Beständigkeit. Nach einer Lagerung von 5, 10 und 20 Tagen werden von jedem Impfstoffansatz
aus dem Brutschrank Proben entnommen und wie vorstehend geprüft. Die Ergebnisse
sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt, in der die Zahlen Milliarden lebensfähige
Brucella-Organismen je Kubikzentimeter wieder aufgelöstem Impfstoff bedeuten.
| Lebensfähige Brucella-abortus-Organismen (Milliarden je Kubik- |
| Nährmedium Stabilisator AI zentimeter) zur angegebenen Zeit
nach der Gefriertrocknung |
| Anfangswert zu 5 Tage 1 10 Tage 1 20 Tage |
| Fest, Kartoffel-Agar . Magermilch 16,2 12,5 6,0 0,3 |
| Fest, Kartoffel-Agar ...... Magermilch 14,3 12,5 6,0 0,3 |
| Flüssig, wie im Beispiel 1 . Magermilch 16,9 14,2 10,5 6,3 |
| Flüssig, wie im Beispiel 1 . . . Magermilch 24,1 19,7 8,3 7,2 |
| Flüssig, wie im Beispiel 1 . . . Citrat-Lactose ; 19,9 16,5
14,8 9,0 |
| Flüssig, wie im Beispiel 1 . Citrat-Lactose ~ 21,6 17,8 15,3
1 12,5 |
Die »Anfangswerte« in obiger Tabelle bedeuten die Konzentrationen von Proben, die
unmittelbar nach der Gefriertrocknung wieder aufgelöst und geprüft wurden. Die Ergebnisse
zeigen nicht nur die stark erhöhte Beständigkeit der mit dem Citrat-Lactose-Stabilisierungsmittel
stabilisierten Impfstoffpräparate, sondern auch die größere Beständigkeit der nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung eines flüssigen Mediums hergestellten
Impfstoffe, was sich bei einem Vergleich des erfindungsgemäßen Produktes mit einem
nach dem bekannten, mit festen Kartoffel-Agar-Nährmedien arbeitenden Verfahren hergestellten
Produkt zeigt, wenn beide Produkte mit Magermilch stabilisiert wurden.
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Das starke Wachstum der Organismen und das Fehlen einer Bildung abartiger
Formen nach dem erfindungsgemäßen, mit dem flüssigen Nährmedium arbeitenden Verfahren
macht eine kontinuierliche bzw. halbkontinuierliche Durchführung des Verfahrens
möglich. Bei einer solchen Durchführung wird ein Teil der flüssigen Kultur aus dem
Fermentationsbehälter abgezogen, ehe die Herstellung des Impfstoffkonzentrats beendet
ist und während sich die Organismen noch stark - mit logarithmisch zunehmender Wachstumsgeschwindigkeit
- vermehren.
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Dieser Teil wird dann als Impflösung für ein weiteres frisches Volumen
an flüssigem Nährmedium verwendet und der beschriebene Vorgang beliebig oft wiederholt.