Verfahren zur Herstellung von Impfstoffkonzentraten
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffkonzentraten des Stammes 19 von Brucella-abortus-Organismen und verbesserte stabilisierte Impfstoffe.
Impfstoffe, die den Stamm 19 der Brucella-abortus-Organismen enthalten, werden für die Immunisierung von Vieh gegen den Angriff von virulenten Brucella-Infektionen verwendet. Um eine angemessene Immunisierung zu erhalten, müssen grosse Anzahlen der lebendigen Stamm-19-Organismen injiziert werden.
Bei der Herstellung derartiger Impfstoffe ist die Anwesenheit von erheblichen Anzahlen toter oder dissoziierter Brucella-Organismen äusserst unerwünscht. Es ist auch erforderlich, derartige Kulturbedingungen aufrechtzuerhalten, dass sowohl virulente als auch nicht immunogene Varianten der gewünschten Stamm-19-Organismen vermieden werden. Die Dissoziation hat bei früheren Versuchen, Brucella abortus in flüssigen Medien zu kultivieren, ein spezielles Problem gebildet.
In der Vergangenheit sind Impfstoffe des Stammes 19 von Brucella abortus erzeugt worden, indem die Organismen in einem Behälter, wie z. B. einem Roux-Kolben oder einer Povitsky-Flasche, auf einem herkömmlichen festen Kartoffel-Glycerin-Agarmedium kultiviert wurde. Bei solchen Kulturen war es, um die erforderliche Ausbeute an undissoziierten Organismen zu erhalten, wesentlich, die Berührung von Flüssigkeiten, wie z. B. des Kondensats, das sich ge wöhnlich in solchen Flaschen bildet, mit den wachsenden Bakterienkolonien zu vermeiden. Die Herstellung von Impfstoff in einer derartigen bereits bekannten Weise erfordert das Sammeln der Waschflüssigkeiten von Agarmedium in einer grossen Anzahl derartiger Flaschen, was von der Gefahr einer Verunreinigung begleitet ist, die auf der Anzahl der erforderlichen Operationen beruht.
Neuerdings wurde die Kultur von Brucella abortus in einem flüssigen Medium zur Erzeugung von Impfstoff berichtet, aber es hat sich nicht als möglich erwiesen, die gewünschten hohen Ausbeuten an undissoziierten Organismen durch Kultur des Stammes 19 von Brucella abortus in flüssigen Medien mittels der berichteten Verfahrensweisen zu erzeugen. Ferner erforderten derartige Kulturverfahren unerwünscht lange Zeiträume zur Erzeugung grosser Anzahlen der Organismen.
Es wurde nun ein Verfahren zur Erzeugung von Impfstoffkonzentraten vom Stamm 19 von Brucella abortus gefunden ; dieses Verfahren gestattet das kräftige Wachstum oder die schnelle Reproduktion der Organismen. Die mittels des neu gefundenen Verfahrens erzeugten Impfstoffkonzentrate haben vorteilhafterweise eine hohe Potenz. Darüber hinaus führt das erfindungsgemässe Verfahren die abzulehnende Dissoziation der Organismen auf ein Mindestmass zurück.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dal3 ein Impfstoff vom Stamm 19 von Brucella-abortus-Organismen in eine belüftete, sterile, wässrige Lösung oder ein flüssiges Medium, das Glukose, Hefeextrakt, Natriumchlorid, Thiaminhydrochlorid, ein Antischaummittel und ein proteinisches Material enthält, eingeführt und anschliessend, vorzugsweise nahe Körpertemperatur, das heisst nahe 37 C, kultiviert wird.
Um die besonderen Vorteile der Erfindung zu erhalten, ist es wesentlich, dass das verwendete proteinische Material ein Pancreasenzymhydrolysat von Kasein ist, die Belüftung durch Einleiten von steriler Luft unter der Oberfläche der Flüssigkeit, vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit von mindestens 0, 7 Volumen pro Minute je Volumen des flüssigen Mediums bewirkt wird und die Rührung des flüssigen Mediums während der Kultur aufrechterhalten wird.
Ein beliebiges herkömmliches Antischaummittel, wie z. B. Maisöl, ein handelsübliches Silikonantischaummittel oder ein Polyoxyäthylenderivat der Rizinolsäure, das zur Verhinderung von Schaum wäh- rend der Kultur wirksam ist, kann verwendet werden.
Jedoch kann die Geschwindigkeit der Erzeugung und die Ausbeute an den Organismen gemäss der vorliegenden Erfindung erhöht werden, wenn das verwendete Antischaummittel ein Polypropylenglykol ist. Die bevorzugten Polypropylenglykole haben ein Molekulargewicht von 1500 bis 3000, vorteilhafterweise etwa 2000.
Hohe Titer der Organismen können mittels des erfindungsgemässen Verfahrens schon in 20 Std. erhalten werden, wogegen frühere Verfahren mindestens 70 Std. erforderten ; dies stellt eine Verbesserung mit grosser kommerzieller Bedeutung dar.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Erzeugung von Brucella-abortus-Impfstoffen mit verbesserter Stabilität, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die in dem flüssigen Kulturmedium erhaltenen Impfstoffkonzentrate mit einem Stabilisator-gemischt werden, der praktisch aus einer wässrigen Lösung besteht, die Kaliumcitratmonohydrat, Natriumcitrat, Di kaliumhydrogenphosphat, Calciumchlorid, Magnesiumchloridhexahydrat, Kaliumcarbonatsesquihydrat und Laktose vorzugsweise in einer Menge von 0, 135, 0, 245, 0, 061, 0, I33, 0, 06, 0, 1 bzw. 17, 25 Gew. % enthält, wobei der Rest Wasser ist.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird das flüssige Kulturmedium hergestellt, indem ein Pancreasenzymhydrolysat von Kasein in Wasser zusammen mit Glukose, Hefeextrakt, Na triumchlorid, Thiaminhydrochlorid und einem Antischaummittel, vorzugsweise einem Polypropylenglykol, gelöst wird. Dieses Medium wird, vorzugsweise durch Filtration, sterilisiert und dann mit einem Impfstoff beimpft, der durch Waschen von glatten Kolonien von Brucella abortus, Stamm 19, die in herkömmlicher Weise auf festem Kartoffel-Glycerin Agarmedium fortgepflanzt wurden, erhalten wurde.
Die Bebrütung der Organismen wird in einem geeigneten Gefäss ausgeführt, wie z. B. in einem Fermentiertank, der aus Glas oder rostfreiem Stahl besteht oder mit Glas ausgekleidet ist, der mit einem Rührer mit hoher Geschwindigkeit und einer Verteilungsvorrichtung zur Einleitung von steriler Luft versehen ist.
Die Bebrütung der Organismen wird unter kräftiger Rührung bei einer Temperatur von 36 bis 38 C vorgenommen, während sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von mindestens 7 Volumen Luft pro Minute je 10 Volumen des flüssigen Kulturmediums eingeleitet wird. Die Kultur der Organismen unter den vorstehenden Bedingungen wird während eines Zeitraumes von etwa 20 Std. für eine einzige Stufe oder bis zu 40 Std., wenn zusätzliches flüssiges Medium zugeführt wird, wie im folgenden beschrieben wird, fortgesetzt.
In jedem Fall wird die Bebrütung während eines ausreichenden Zeitraumes fortgesetzt, um ein optimales Wachstum von lebensfähigen Organismen zu erhalten, und das entstandene Impfstoffkonzentrat wird danach geerntet, indem es aus dem Fermentiergefäss unter Druck in einen sterilisierten Tankbehälter aus rostfreiem Stahl oder in sterile Glasflaschen abgefüllt wird.
Die Hauptmenge Impfstoffkonzentrat kann danach mit gepufferter physiologischer Salzlösung oder einem anderen geeigneten Verdünnungs- mittel gemischt werden, um ein injizierbares flüssiges Impfstoffprodukt herzustellen, oder das Konzentrat kann mit einem Stabilisator vereinigt und durch Gefriertrocknung in herkömmlicher Weise getrocknet werden, um ein getrocknetes Produkt herzustellen, das für die anschliessende Rekonstitution mit physiologischer Salzlösung unter Erzeugung eines injizierbaren Impfstoffes geeignet ist.
Das spezielle proteinische Material, das sich als Bestandteil des hier verwendeten Nährmediums zur Erzielung hoher Ausbeuten an Brucella-abortus-Organismen als wesentlich erwiesen hat, ist ein Pancreasenzymhydrolysat von Kasein, das inForm von gemischten Aminosäuren und Peptiden alle in Kasein ur sprünglich vorhandenen Aminosäuren enthält. Ist das Kasein wie gewöhnlich aus natürlichen Quellen abgeleitet, so enthält das Gemisch auch einen erheblichen Teil der für das angemessene Wachstum der Brucella-Organismen erforderlichen Vitamine. Ein Pancreasenzymhydrolysat von Kasein, das für die Verwendung gemäss der Erfindung geeignet ist, ist im Handel erhältlich.
Eine repräsentative Analyse eines derartigen Produktes ist :
Gesamtstickstoff 12, 8 %
Aminostickstoff 6, 8 % % Amino-N zu Gesamtstickstoff 53, 0%
Feuchtigkeit 3, 1 %
Laktose, Maximum 1, 5 %
Asche 5, 2 % pH (2 % ige Lösung in Wasser, 25 C) 6, 6 % (Auf Aminosäuregehalt feuchtigkeits freier Basis)
Lysin 7, 6 %
Isoleucin 6, 4 %
Leucin 10, 5 %
Valin 7, 0 %
Arginin 3, 3 %
Threonin 4, 0 %
Methionin 2, 5 %
Cystin 0, 3 %
Phenylalanin 4,
5 %
Histidin 2, 4 %
Tryptophan 0, 9 %
Glutaminsäure 20, 4 % Vitamingehalt (Mikrogramm pro Gramm)
Riboflavin 4, 25
Thiamin 0, 11
Niacin 4, 50
Pantothensäure 2, 19
Biotin 0, 51
Pyridoxin 1, 29
Im allgemeinen wurde das optimale Wachstum der Brucella-Organismen mit einem Medium von praktisch der folgenden Zusammensetzung erhalten :
Bestandteil Gew. %
Pancreashydrolysat von Kasein 3
Glukose 2
Thiaminhydrochlorid 0, 0005
Hefeextrakt 1
Natriumchlorid 0, 5
Polypropylenglykol (Molekulargewicht 2000) 0, 0116
Entmineralisiertes Wasser, Rest bis 100, 00
Gewünschtenfalls kann das Propylenglykol-Antischaummittel in die Impfsuspension in einer solchen Menge, dass die vorstehende Konzentration erhalten wird, einverleibt werden, wenn diese Impfsuspension mit dem flüssigen Nährmedium gemischt wird, aus dem das Polyglykol weggelassen worden ist.
Die vorstehenden Mengenverhältnisse der Bestandteile erzeugen ein Nährmedium mit einem pH Wert von etwa 6, 3 bis 6, 4. Während der Bebrütung der Brucella-Organismen in diesem Medium steigt der pH-Wert normalerweise auf einen Wert von 8, 1 bis 8, 3. Im allgemeinen wird das Kulturmedium ohne weitere Zusätze in diesem gewünschten Bereich gehalten. Wenn der pH-Wert des Mediums jedoch über die vorstehenden Grenzen steigt, bevor die gewünschte Menge an reproduktivem Wachstum der Organismen erzielt ist, können kleine Mengen sterile wässrige 50 % ige Glukoselösung dem Medium zugesetzt werden, um den pH-Wert im gewünschten Bereich zu halten.
Es ist ferner gefunden worden, dass Belüftung des Wachstumsmediums während der Bebrütung der Brucella-Organismen durch Einleiten von Luft in den oberen Teil des Fermentiergefässes, wobei man sich auf die mischende Wirkung des Rührers verlässt, um Luft in das Medium einzuführen, nicht das gewünschte schnelle Wachstum der Organismen liefert. Demgemäss hat es sich als wesentlich erwiesen, sterile Luft in den unteren Teil des Fermentiertanks unter der Oberfläche des Nährmediums mittels eines Sprinklers oder einer anderen Verteilungsvorrichtung mit einer Geschwindigkeit von mindestens etwa 7 Volumteilen Luft pro Minute je 10 Volumteile Kulturmedium einzuleiten.
In der Praxis erzeugen die Rührung der Nähr- flüssigkeit und die schnellen Wachstumsprozesse der Organismen während der Bebrütungszeit Wärme, so dass während wenigstens eines Teiles der aktiven Wachstumszeit eine Kühlung der Kultur gewöhnlich erforderlich ist, um die Temperatur nahe 37 C zu halten.
Es ist im allgemeinen wünschenswert, die Vervielfachung der Organismen in zwei oder mehr Stufen auszuführen. Beispielsweise wird der von dem Kartoffel-Glycerin-Agar in phosphatgepufferte physiologische Salzlosung geerntete Impfstoff vor der Verwendung untersucht und auf Reinheit geprüft. Der Impfstoff wird dann in ein Volumen des sterilen flüs- sigen Nährmediums, wie oben dargelegt, in Mengen von etwa einem Volumen Impfstoff auf mindestens etwa 14 Volumen des Mediums eingeführt, und das entstehende Gemisch wird unter den oben beschriebenen Bedingungen während eines vorbereiteten Zeitraumes von etwa 20 Std. bebrütet, um eine wirksame Impfkultur zu erzeugen.
Bei derartigen Operationen wird die Anzahl der Flaschen Impfstoff, die geerntet und gesammelt werden, vorzugsweise so eingestellt, dass sie eine genügende Konzentration der Brucella Organismen in dem Impfstoff liefern, um eine an fängliche Konzentration von etwa 0, 6 X 109 bis 1, 5 X 109 Organismen pro cm3 des entstehenden Gemisches zu liefern.
Nach Beendigung des vorbereitenden Kulturzeitraumes und während kräftige Vervielfachung der Brucella-Organismen in der wirksamen Impfkultur noch vor sich geht, lässt man ein Volumen frisches, steriles flüssiges Nährmedium in einer Menge, die vorzugsweise mindestens gleich oder bis zu zweimal so gross wie das Volumen der wirksamen Impfkultur ist, in das Fermentiergefäss laufen, und die Bebrütung wird dann unter den gleichen Bedingungen während eines weiteren Zeitraumes von etwa 15 bis 20 Stunden fortgesetzt, um die Erzeugung des gewünschten Impfstoffkonzentrats zu beenden.
Beispiel 1
Brucella-abortus-Organismen des Stammes 19 wurden auf Kartoffel-Glycerin-Agar geimpft, der in Povitsky-Flaschen enthalten war, und in der üblichen Weise bebrütet. Nach einer Bebrütung während 48 Stunden bei 36 bis 38 C wurden die Organismen aus 15 bis 20 derartigen Flaschen geerntet, indem sie mit physiologischer Salzlösung, die ein Phosphatpuffersystem enthielt, um einen pH-Wert von 6, 4 aufrechtzuerhalten, gewaschen wurden, und die Waschflüssigkeiten wurden gesammelt, untersucht und auf Reinheit geprüft. Das Volumen der Waschflüssigkeiten und die Anzahl der geernteten Flaschen wurden so eingestellt, dass ein gesammelter Impfstoff erhalten wurde, der mindestens etwa 75 X 1011 lebensfähige Brucella Organismen enthielt.
Unterdessen wurde ein flüssiges Medium folgendermassen hergestellt :
Pancreashydrolysat von Kasein^ 3 %
Glukose 2 % Thiaminhydrochlorid 0, 0005 %
Hefeextrakt 1 %
NaCl 0, 5 % Polyglykol P 2000 "'0, 0116 %
Wasser 93, 4 % : NZ Amin, Typ A (Sheffield Chemical Co.)
Ein Polypropylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 2000.
125 l der vorstehenden Mischung wurden durch ein bakteriologisches Filter vom Seitztyp in einen sterilisierten Fermentiertank aus rostfreiem Stahl geleitet, der mit einer Verteilungsvorrichtung und einem durch einen Motor angetriebenen Rührer versehen war und auf einer Temperatur von etwa 37 C gehalten wurde. Der wie oben dargelegt geerntete Impfstoff wurde dann unter Rührung zum flüssigen Medium gegeben, um eine anfängliche Charge zu liefern, die etwa 0, 6 X 109 bis 1, 5 X 109 Organismen pro cm3 enthielt, und das entstehende Gemisch wurde bei Temperaturen von 36 bis 38 C etwa 20 Stunden lang bebrütet, wobei der Rührer mit 240 bis 250 Umdrehungen pro Minute arbeitete.
Während der obigen Bebrütungszeit wurde sterile Luft in den unteren Teil des Mediums mit einer Geschwindigkeit von etwa 7, 1 1 pro Minute je 10 1 des Mediums verteilt, und die Temperatur wurde durch Erhitzen oder Küh- len, wie es erforderlich war, im obigen Bereich gehalten. Nach Beendigung der Bebrütung dieses Ansatzes von wirksamem Impfstoff wurden weitere 175 1 des oben beschriebenen flüssigen Mediums durch Filtration sterilisiert und in den Fermentiertank geleitet.
Die Bebrütung wurde dann unter den vorstehenden Bedingungen etwa weitere 18 Std. lang fortgesetzt, wonach die entstehende Hauptmenge Impfstoffkonzentrat geerntet wurde, indem sie in einen sterilisierten Tankbehälter aus rostfreiem Stahl abgezogen und durch Kühlen auf eine Temperatur von 5 C konserviert wurden. Eine Reihe von Verdünnungen eines aliquoten Teiles dieses Konzentrats wurden mit steriler wässriger 1 % iger Peptonlösung vorgenommen und geeignete Verdünnungen in Petrischalen auf sterilem Kartoffelagar, der Pferdeserum enthielt, ausgebreitet und 120 Std. lang bei 36 bis 38 C be brütet. Zählungen der Platte zeigten, dal3 die Hauptmenge Impfstoffkonzentrat etwa 200 X 109 lebens fähige Brucella-abortus-Organismen pro cm3 enthielt.
Eine andere Reihe von ähnlichen Verdünnungen wurde auf sterilem Kartoffelagar ohne Pferdeserum ausgebreitet, bebriitet und mittels des von Mingle und Manthei in American Journal of Veterinary Research, 2, (3), 181-190 (1941) beschriebenen Verfahrens auf Dissoziation beobachtet. Es zeigte sich, dass das Impfstoffkonzentrat praktisch frei von dissoziierten Formen war. Weitere Ansätze von mittels des obigen Verfahrens hergestellten Impfstoffkonzentrats gaben übereinstimmende Ausbeuten von 150 X 109 bis 220 X 109 Brucella-abortus-Organismen pro cm3.
Sowohl flüssige als auch getrocknete Impfstoffe, die aus gemäss dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellten Impfstoffkonzentraten erzeugt wurden, zeigten ausgezeichnete Beständigkeit bei der Lagerung und sind routinemässig während einer Anzahl von Monaten zur Immunisierung von Kälbern verwendet worden, wobei danach keine Unterbrechungen der Immunität berichtet wurden.
Wenn man das Impfstoffprodukt durch Trocknung zu konservieren wünscht, wird es bevorzugt, dem Impfstoffkonzentrat vor dem Gefriertrocknen einen Stabilisator, wie z. B. sterile Magermilch oder rekonstituierte nicht fette Trockenmilchfestsubstanzen, zuzusetzen. Gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurde gefunden, dass eine unerwartete er höhte Stabilität erhalten wird, wenn anstelle der Milch ein Stabilisator der folgenden Zusammensetzung verwendet wird :
Bestandteil Gew. %
Kaliumcitratmonohydrat 0, 135
Natriumcitrat 0, 245
Dikaliumhydrogenphosphat 0, 061
Calciumchlorid 0, 133 Magnesiumchloridhexahydrat 0, 06
Kaliumcarbonatsesquihydrat 0, 1
Laktose 17, 25
Wasser Rest bis 100, 00
Der pH-Wert der vorstehenden Mischung, die im folgenden als Citrat-Laktose-Stabilisator bezeichnet wird, wurde mit Milchsäure auf 7 eingestellt und die Lösung durch Filtration vor der Verwendung sterilisiert.
Der Citrat-Laktose-Stabilisator hat sich auch als bemerkenswert wirksam bei der Stabilisierung von flüssigen Impfstoffen erwiesen. Der Stabilisator ist ferner für Injektionen bei Vieh in der in normalen Dosierungen von Impfstoff verwendeten Mengen sicher.
Die folgenden Beispiele erläutern die Verbesserung der Stabilität von flüssigem Impfstoff, der mit dem oben beschriebenen Citrat-Laktose-Stabilisator erhalten wurde, und ebenso die erhöhte Stabilität von Impfstoffen, die erfindungsgemäss hergestellt wurden, im Vergleich zu Impfstoffen, die durch Kultur der Organismen auf Kartoffel-Glycerin-Agar unter Verwendung von nicht fetten Trockemnilchfestsubstan- zen als Stabilisator hergestellt wurden.
Beispiel 2
Ein Produktionsansatz von Impfstoffkonzentrat, der mittels des Verfahrens von Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde in 2 Ansätze geteilt, und jeder Ansatz wurde genügend verdünnt, um einen injizierbaren Impfstoff zu erzeugen, der eine geeignete Konzentration von Brucella-Organismen enthielt. Ein derartiger Ansatz wurde mit steriler, phosphatgepufferter, physiologischer Salzlösung beim pH-Wert 6, 4 in herkömmlicher Weise verdünnt. Die andere Probe wurde mit sterilem Citrat-Laktose-Stabilisator wie oben beschrieben verdünnt. Portionen jedes Ansatzes wurden durch Reihenverdünnung und Ausbreiten in der üblichen Weise untersucht, um die Konzentration von lebensfähigen Brucella-Organismen in jeder frisch verdünnten Probe zu bestimmen.
Die Proben wurden dann in geschlossenen Behältern 6 Monate lang bei einer Temperatur von 5 C gehalten und wieder wie vorstehend untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt, worin die Analysen in Billionen (109) Organismen pro cm3 ausgedrückt sind.
Verwendetes Verd nnungsmittel LebensfÏhige Brucella-abortus-Organismen/cm3 bei der Herstellung nach 6 Monaten
Phosphatgepufferte Salzlösung 12, 9 6, 2 Citat-Lakbosle-stakbiGslator 14, 5 13, 9
Man wird bemerken, dass der in herkömmlicher Weise mit phosphatgepufferter Salzlösung hergestellte Impfstoff während der Lagerungszeit einen Verlust von über 50 % in der Anzahl der lebensfähigen Organismen pro cm3 zeigt, während der Titer des erfindungsgemäss stabilisierten Impfstoffes nur um etwa 4 % abnahm.
Zum Zwecke des Kontrastes wurden Brucellaabortus-Organismen vom Stamm 19 von einer krÏftigen Vorratskultur auf ein herkömmliches festes Kartoffel-Glycerin-Agarmedium geimpft, bebrütet und durch Waschen mit gepufferter Salzlösung gemäss dem bekannten Standardverfahren zur Erzeugung eines Impfstoffkonzentrats geerntet. Zwei Ansätze von so hergestelltem Impfstoffkonzentrat wurden mit rekonstituierter nicht fetter Trockenmilchlösung (einem weitverbreiteten Stabilisator) und physiologischer Salz l¯sung in den folgenden Mengenverhältnissen ver dünnt :
Bestandteil Gew. %
Impfstoffkonzentrat 40
Salzlösung 16
Milchlösung* 44
Eine sterile LÏsung, die 92, 6 nicht fette Trockenmilch festsubstanzen pro Liter enthielt.
Weitere Ansätze von Impfstoffkonzentrat wurden in flüssigem Medium genau wie in Beispiel 1 hergestellt. Zwei Ansätze derartiger Konzentrate wurden mit physiologischer Salzlösung und rekonstituierter nicht fetter Trockenmilchlösung genau wie die von festem Medium oben geernteten Konzentrate ver dünnt. Zwei weitere derartige Ansätze von in flüssi- gen Medien erzeugten Konzentraten wurden mit dem oben beschriebenen Citrat-Laktose-Stabilisator ver dünnt.
Alle Ansätze von stabilisierten Impfstoffen, die wie oben hergestellt wurden, wurden in Standarddosierungsvolumen geteilt und die letzteren in Flaschen abgefüllt und in einer im Handel erhältlichen Einrichtung gefriergetrocknet. Nach der Trocknung wurden repräsentative Proben jedes Impfstoffansatzes rekonstituiert, reihenmässig verdünnt und mittels Standardverfahren ausgebreitet, um die Konzentration von lebensfähigen Organismen in jedem Ansatz zu bestimmen. Diese in Flaschen gefüllten, getrockneten Impfstoffe wurden dann in einen auf 37 C gehaltenen Brutschrank gebracht. Die Impfstoffe werden gewöhn- lich unter Kühlung gehalten, bis sie für die Verwendung rekonstituiert werden.
Demgemäss bedeutet, besonders bei einem lebenden Impfstoff, wie es hier der Fall ist, Lagerung bei 37 C einen stark beschleunigten Beständigkeitstest. Repräsentative Proben jedes Impfstoffansatzes wurden nach Lagerungszeiten von 5, 10 und 20 Tagen aus dem Brutschrank entfernt und rekonstituiert und wie vorstehend beschrieben untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt, worin die Zahlen Billionen lebens fähiger Brucella-Organismen pro cm3 rekonstituierten Impfstoff bedeuten.
NÏhrmedium Stabilisator LebensfÏhige Brucella-abortus-Organismen (Billionen/cm3)
Zum angegebenen Zeitpunkt nach dem Trocknen
Zu Anfang 5 Tage 10 Tage 20 Tage Fest, KaBtofMaigar Nicht fiette Milch 16, 2 12, 5 6, 0 0, 3 Fest, Kanboffelagar Nicht fette Milch 14, 3 12, 5 6, 0 0, 3
Fl ssig, wie in Beispiel 1 Nicht fette Milch 16, 9 14, 2 10, 5 6, 3 FlüssDg,, wie in Beispiel 1 Nicht fette Milch 24, 1 19, 7 8, 3 7, 2 Flüssig, wie ib. Beispiel l Cttmt-Laiktose 19, 9 16, 5 14, 8 9, 0 Flüssig, wie iln Beispiel 1 Citnattalktose 21, 6 17, 8 15, 3 12, 5
Die Zahlen zu Anfangp in der vorstehenden Tabelle sind die Werte für die unmittelbar nach der Trocknung rekonstituierten und untersuchten Proben.
Die Ergebnisse zeigen nicht nur die stark erhöhte Sta bilität von Impfstoffen, die mit dem Citrat-Laktose Stabilisator stabilisiert sind, sondern auch die grössere Stabilität des Impfstoffes, der mittels des erfindungsgemässen Verfahrens mit dem flüssigen Medium erzeugt wurde, wenn er mit nicht fetter Milch stabilisiert wurde im Vergleich zu ähnlich stabilisiertem Impfstoff, der mittels des Verfahrens nach dem Stande der Technik der Kultur auf festem Kartoffelagar erzeugt wurde.
Das kräftige Wachstum der Organismen und das Fehlen der Dissoziation der Organismen in dem erfindungsgemässen Verfahren mit dem flüssigen Nähr- medium ermöglichen es, dieses Verfahren als kontinuierliches oder halbkontinuierliches Verfahren auszuführen. In einem derartigen Verfahren wird ein Teil der flüssigen Kultur aus dem Fermentiergefäss vor der Beendigung der Erzeugung des Impfstoffkonzentrats und während die Organismen sich mit logarithmisch zunehmender Wachstumsgeschwindigkeit kräftig vermehren, entnommen. Dieser Teil wird dann als Impfstoff in einem weiteren frischen Volumen von flüssi- gem Nährmedium verwendet, und die weitere Kultur der Organismen wird während der gewünschten Anzahl von Zyklen wie vorstehend beschrieben fortgesetzt.