<Desc/Clms Page number 1>
Verfahren zur Herstellung von BCG-Vaccinen
Gegenstand der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von BCG-Vaccinen.
BCG (Bac. Calmette-Guerin) wird als Lebendvaccine zur Immunisierung gegen Tuberculose verwendet. Die Vaccine wird aus BCG-Lebendkulturen, vorzugsweise durch Lyophilisierung, hergestellt.
Eine gute Vaccine soll einen möglichst hohen Gehalt an lebenden Zellen im Verhältnis zur Gesamtzahl der Keime aufweisen. Auch ist erforderlich, dass die Keime längere Zeit lebensfähig bleiben (Lagerungsfähigkeit der Vaccine) und sich gut resuspendieren lassen. Die Erfüllung dieser Anforderungen bereitet grosse Schwierigkeiten, da BCG wenig temperaturbeständig, insbesondere auch empfindlich gegenüber den Bedingungen, wie sie bei der Gefriertrocknung und Lagerung der Vaccine auftreten, ist.
Um die Stabilität der lyophilisierten Vaccine zu erhöhen, werden der BCG-Suspension vor der Lyophilisierung verschiedene Schutzsubstanzen zugesetzt, deren Wirkungsweise aber noch nicht restlos abgeklärt ist. Nach Greaves (Ann. N. Y. Acad. Sci. 85 [1960], 723-28) suspendiert man das BCG - Sediment in einem "Trocknungsmedium", das ein Trägermaterial, z. B. Dextran, zur Erzielung eines schwammigen Kuchens, eine "Puffersubstanz" zur Regulierung des Wassergehaltes der getrockneten Keime, z. B.
Sucrose oder Natriumglutamat, und ein"Neutralisierungsmittel"für Carbonylgruppen, z. B. Natriumglutamat, enthält.
Auch die Einfriertemperatur, die Geschwindigkeit der Einfrierung und die Trocknungstemperatur haben einen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der lyophilisierten Zellen.
Es wurde auch vorgeschlagen (vgl. deutsche Patentschrift Nr. 1148 038), zwecks Erhöhung der Stabilität der lyophilisierten Vaccine BCG in einem Nährmedium zu züchten, das keine carbonylgruppenhaltigen oder durch BCG in carbonylgruppenhaltige Verbindungen überführbare Substanzen enthält, insbesondere in einem Medium, das frei ist von Glycerin, Monosacchariden, Zuckeralkoholen und Polysacchariden. Das Verfahren hat jedoch den Nachteil, dass BCG in den anzuwendenden Nährmedien weniger gut wächst und dass die Züchtung nicht in technischem Massstab in den bei der technischen Kultivierung von Mikroorganismen sonst üblichen Fermentern durchgeführt werden kann.
Es wurde nun gefunden, dass man auch unabhängig von der Art des Nährmediums die Stabilität von BCG im Hinblick auf Lyophilisierung und Lagerungsfähigkeit der Vaccine wesentlich verbessern kann und dass man daher auch Nährmedien verwenden kann, die sich für die Herstellung von BCG-Lebendkulturen in Fermentern besonders gut eignen.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsmaterial für die Herstellung von auf Vaccine zu verarbeitenden BCG-Lebendkulturen eine BCG-Selektion verwendet, die dadurch erhalten wird, dass man eine BCG-Kultur den Bedingungen der Herstellung und Lagerung der Vaccine unterwirft und die unter diesen Bedingungen am besten beständigen Einzell-Kulturen selektioniert.
Bei der Herstellung lyophilisierter BCG-Vaccine geht man beispielsweise so vor, dass man eine
EMI1.1
<Desc/Clms Page number 2>
mehrt, die so erhaltenen Einzell-Kulturen in gleicherWeise wie vorher lyophilisiert (zirka 10 - 20 Am- pullen zu 1 mg/ml pro Einzell-Kultur), zur Feststellung der Überlebensrate auf feste Nährböden aussät, die Einzell-Kulturen mit 80-100% Überlebensrate auswählt und als Ausgangsmaterial für die Herstel- lung der Lebendkulturen verwendet.
Es hat sich gezeigt, dass zirka 10 - 100 Einzell-Kolonien zur Auslese von thermostabilen Einzell- - Kulturen erforderlich sind. Einen erhaltenen thermostabilen Stamm mit guten immunisierenden Eigen- schaften kann man so lange für die Gewinnung von BCG-Kulturen bzw. Vaccinen verwenden, bis sich eine Verschlechterung der Eigenschaften bemerkbar macht.
Das Lyophilisieren der BCG-Kultur wird in einem geeigneten"Trocknungsmedium", vorzugsweise einer wässerigen Lösung von Dextran, Glutamat und einem Zucker, z. B. Saccharose, oder einer na- türlichen Hexose. wie Glucose, Lactose oder Fructose, vorgenommen. Man verwendet etwa 1 g Bakte- rientrockengewicht pro Liter "Trocknungsmedium", Als bestes Trocknungsmedium erwies sich eine Lö- sung von 51o Dextran, 5% Natriumglutamat und 5% Saccharose in dest. Wasser, fast gleich gut ist eine
EMI2.1
Wasser. In der folgendenist die Überlebensrate (Verhältnis der Anzahl lebender Keime pro ml nach der Lyophilisierung zur An- zahl lebender Keime pro ml vor der Lyophilisierung) in Prozenten, bezogen auf Medium 1 = 100%, an- gegeben.
Tabelle 1
EMI2.2
<tb>
<tb> Trocknungsmedium <SEP> % <SEP> relative <SEP> Überlebensrate
<tb> 1 <SEP> 100
<tb> 2 <SEP> 92
<tb> 3 <SEP> 58
<tb> 4 <SEP> 1
<tb> 5 <SEP> 15
<tb> 6 <SEP> 0
<tb>
EMI2.3
Dextran. 5% Natriumglutamat, 5% Saccharose, aq. dest. ad 1000 ml3=3% Dextran, 2% Natriumglutamat, 3% Lactose, aq. dest. ad 1000 ml 21o Glucose 21o Fructose 4 = 3% Dextran, 3% Natriumglutamat, 00/0
5 = 0% 2% Natriumglutamat, 8% Saccharose, aq. dest. ad 1000 ml 5% Albumin
Frakt. V
6=0%0%3%Glycerin, aq.dest.ad1000ml 5% Albumin
Frakt. V
Die zu lyophilisierende Bakteriensuspension wird bei etwa-50 C möglichst schnell (Temperaturabfall 1 - 3 C/min) tiefgefroren.
Die Trocknungstemperatur beträgt vorzugsweise -15 bis -200 C (bei 0,02 mm Hg). In diesem Temperaturbereich ist die Überlebensrate zirka 100mal grösser als bei -300 C.
Das Lyophilisat wird bei 0,02 mm Hg über Silikagel nachgetrocknet. Der Endwassergehalt der getrockneten BCG beträgt 1-2%.
Das getrocknete Bakteriengut wird unter den schärfsten Bedingungen, die für die Lagerung der Vaccine in Betracht kommen, beispielsweise bei einer Temperatur von 30 bis 400 C, längere Zeit, beispielsweise 6 Monate, oder kürzere Zeit bei maximal 500 C gelagert.
<Desc/Clms Page number 3>
Um aus dem so erhaltenen Bakteriengut die lyophilisierungs-und lagerungsbeständigsten Mutanten auszulesen, resuspendiert man es, beispielsweise in einer 0, 25%0igen Lösung von"Bovin Albumin Frac- tion V" (Hersteller Pentex Inc., Kankakee, Illinois), und sät es auf feste Nährböden, beispielsweise
Löwenstein-Jensen-Agar, aus. Die Konzentration der zur Aussaat verwendeten Suspension wird so gewählt, dass die Kolonien getrennt wachsen. Die Platten werden wie üblich bei 370 C inkubiert. Von den gewachsenen Einzell-Kolonien überträgt man eine Anzahl (beispielsweise 10 - 20) getrennt in ein flüs- siges Nährmedium in Schüttelkolben und inkubiert bei 370 C, bis die Kulturen gut gewachsen sind (opt.
EMI3.1
Zelltrockengewicht von 0,25 bis 0,4 g pro Liter Kulturlösung).
Zur Gewinnung einer homogenen Kultur überimpft man dann in neue Schüttelkolben mit der glei- chen Nährlösung (5 Vol. -0/0 Kultur pro neue Schüttelkultur) und lässt bis zu einem Zelltrockengewicht von 0,5 bis 0,75 g pro Liter Kulturlösung (optische Dichte 1, 0 - 1, 5) wachsen. Dann zentrifugiert man ab, wäscht das Sediment, beispielsweise mit einer 0, 05% gen Lösung von Albumin Fraktion V. suspen- diert die verschiedenen Einzell-Kultursedimente in dem vorher verwendeten Trocknungsmedium und sät je einen Teil der Suspension auf ein festes Nährmedium (Löwenstein-Jensen-Agar) aus, während man einen andern Teil unter den gleichen Bedingungen wie vorher lyophilisiert, resuspendiert und eine ver- gleichbare Menge der Suspension auf das feste Nährmedium aussät.
Beim Inkubieren zeigt sich, dass die Überlebensrate der verschiedenen Einzell-Kulturen sehr verschieden ist (vgl. Tabelle 2).
Tabelle 2
EMI3.2
<tb>
<tb> Einzel-Kultur <SEP> Anzahl <SEP> Kolonien <SEP> pro <SEP> ml <SEP> Anzahl <SEP> Kolonien <SEP> pro <SEP> ml <SEP> Überlebensrate
<tb> Nr. <SEP> vor <SEP> Lyophilisierung <SEP> nach <SEP> Lyophilisierung <SEP> in <SEP> 0/0 <SEP>
<tb> 1 <SEP> 1, <SEP> 03. <SEP> 108 <SEP> 1,04. <SEP> 108 <SEP> 100
<tb> 2 <SEP> 9, <SEP> 0. <SEP> 107 <SEP> 3, <SEP> 24. <SEP> 107 <SEP> 40 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 7, <SEP> 8. <SEP> 107 <SEP> 7, <SEP> 0. <SEP> 106 <SEP> 8
<tb> 4 <SEP> 8, <SEP> 6. <SEP> 107 <SEP> 5, <SEP> 44. <SEP> 107 <SEP> 52
<tb> 5 <SEP> 4, <SEP> 8. <SEP> 107 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> 1, <SEP> 47. <SEP> 108 <SEP> 1, <SEP> 46. <SEP> 108 <SEP> 100
<tb> 7 <SEP> 1, <SEP> 07. <SEP> 108 <SEP> 1, <SEP> 06. <SEP> 108 <SEP> 99
<tb> 8 <SEP> 1, <SEP> 03. <SEP> 108 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 9 <SEP> 1, <SEP> 16. <SEP> 108 <SEP> 1, <SEP> 50.
<SEP> 106 <SEP> 1
<tb>
Bei den Einzell-Kulturen mit grosser Überlebensrate handelt es sich um Kulturen, die aus einer genotypisch thermostabilen Mutante des BCG-Stammes hervorgegangen sind. Solche Kulturen ergeben bei der Züchtung in hohem Masse lyophilisierungs-und lagerungsbeständige Lebendkulturen, die zur Herstellung von lyophilisierten Vaccinen besonders geeignet sind. Die selektionierten Kulturen zeigen im Tierversuch die volle immunisierende Wirkung im Vergleich zu nicht lyophilisierten, frischen Lebendkulturen.
Die selektionierten Kulturen können zur Züchtung von BCG nach den bekannten Methoden verwendet werden. Ein besonderer Vorteil ist, dass man sie auch bei der technischen Züchtung von BCG in Fermentern nach einem noch nicht veröffentlichten Verfahren als Ausgangsmaterial einsetzen kann. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung in einem Fermenter unter Verwendung einer Nährlösung, die Glycerin als Kohlenstoff- und Energiequelle sowie Netzmittel vom Tween-Typ, z. B. Tween 80, enthält, durchführt. Glycerin wird in Konzentrationen von 20 bis 100 g/l Nährlösung, das Netzmittel in solchen von 1 bis 20 g/l gebraucht. Die übrigen Nährlösungsbestandteile, Stickstoffquellen, Salze, Spurenelemente, entsprechen den in der Literatur für die Züchtung von BCG angegebenen Medien.
Das Verfahren zeichnet sich durch hohe Ausbeuten bei der Durchführung in technischen Massstab (50- oder 500-Liter-Fermenter) aus.
<Desc/Clms Page number 4>
Im folgenden Beispiel wird die Erfindung beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
EMI4.1
BCG-Trockengewicht pro Liter) suspendiert. Das Trocknungsmedium stellt man her, indem man 50 g Dextran, 50 g Natriumglutamat und 50 g Saccharose mit dest. Wasser auf 11 auffüllt, auf 900 erhitzt bis zur vollständigen Lösung und nach dem Abkühlen auf zirka 300 seitzfiltriert. Die Suspension wird in Ampullen abgefüllt (Inhalt der Ampullen z.
B. 1 mg BCG-Trockengewicht), in einer Kühltruhe mit Umlufteinrichtung mit einer Geschwindigkeit von 1 bis 30/min auf-500 abgekühlt, dann in den Gefriertrockner gebracht und bei 0. 02 mm Hg und -15 bis -200 getrocknet. In einem mit einer Diffusionspumpe evakuierten Exsikkator mit Silikagel wird das Lyophilisat bei 0,02 mm Hg nachgetrocknet und mit chemisch reinem. wasserfreiem Stickstoff begast. Schliesslich schmilzt man die Ampullen zu. Nachdem man sie 6 Monate bei 370 gelagert hat, suspendiert man den Inhalt der Ampullen in einer 0. 25% gen Lösung von Albumin Fraktion V und giesst die Suspension auf Löwenstein-Jensen-Platten in Petrischalen aus, so dass pro Petrischale nicht mehr als 100 Kolonien wachsen. Die Platten werden wie üblich 4 bis 6 Wochen bei 370 inkubiert.
Neun der gebildeten Einzell-Kolonien impft man in 500 ml-Erlenmeyerkolben mit je 100 ml Nährlösung ab. Die Nährlösung hat folgende Zusammensetzung :
EMI4.2
<tb>
<tb> Glycerin <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> Tween <SEP> 80 <SEP> 15, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumacetat <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> L-Asparagin <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> Bacto <SEP> Casiton <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> Hefeextrakt <SEP> Difco <SEP> 3,0 <SEP> g
<tb> Kaliumphosphat, <SEP> prim.
<SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Natriumphosphat, <SEP> sek., <SEP> 12 <SEP> H <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Ferriammoniumcitrat <SEP> 10 <SEP> mg
<tb> Magnesiumsulfat, <SEP> 7 <SEP> HO <SEP> 10 <SEP> mg
<tb> Calciumchlorid, <SEP> 6 <SEP> H <SEP> 20 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> mg
<tb> Zinksulfat, <SEP> 7 <SEP> H <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> Kupfersulfat, <SEP> 5 <SEP> Hz <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> deionisiertes <SEP> Wasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Die Lösung wird 20 min bei 1200 und 1, 2 atü autoklaviert.
Die 9 Erlenmeyerkolben werden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 120 Umdr/min bei 370 inkubiert, bis die optische Dichte bei 655 miL 0, 5-0, 8 beträgt. Dann überträgt man je 5 Vol.-% der Kulturen in 9 neue Schüttelkolben mit der gleichen Nährlösung, lässt bis zum Erreichen einer optischen Dichte von 1, 0 bis l, 5 wachsen, zentrifugiert ab und wäscht das Sediment jeweils mit 0, 05%iger Albumin-Fraktion V-Lösung. Dann suspendiert man die Sedimente in dem oben genannten"Trocknungs- medium". Je 0, 5 ml der Suspension giesst man auf Löwenstein-Jensen-Platten aus, der Rest wird ampulliert, tiefgefroren und lyophilisiert, wie oben beschrieben.
Danach resuspendiert man das Lyophilisat in adäquaten Mengen sterilem dest. Wasser und giesst je 0,5 ml auf Löwenstein-Jeiisen-Platten aus.
Die Platten werden bei 370 inkubiert. Nach 4 - 6 Wochen zählt man die Kolonien der Vergleichsplatten mit nicht lyophilisierten und mit lyophilisierten Kulturen. Das Verhältnis der letzten zu den ersten gibt die Überlebensrate, vgl. Tabelle 2.
Die Isolationen Nr. l, 6 und 7 zeigen eine praktisch 100%ige Überlebensrate. Sie werden als Ausgangsmaterial für die Züchtung von BCG in Fermenter- bzw. Schüttelkolben verwendet.
Die Züchtung wird wie folgt durchgeführt :
Der Inhalt der Ampulle Nr. l wird auf Löwenstein-Jensen-Platten ausgesät, bei 370 inkubiert und
<Desc/Clms Page number 5>
die so erhaltene Kultur mit einer 0, 25% eigen Lösung von Albumin Fraktion V aufgeschwemmt. Die Suspension wird zur Beimpfung von 500 ml-Erlenmeyerkolben mit je 100 ml der obigen Nährlösung verwendet. Die Impfmenge beträgt 1 Vol.-%. Auf diese Weise stellt man auf einer rotierenden Schüttelmaschine 1, 5 l einer 9 Tage alten Kultur her, die eine optische Dichte von 0,5 bis 0,6 (bei 655 mil) aufweist.
Mit diesen 1, 5 I beimpft man einen 50-Liter-Fermenter (der in der Antibiotika-Produktion üblichen Bauweise) mit Luftverteiler, Rührer und Temperaturregulator, der 30 I der obigen Nährlösung enthält. Die Züchtung erfolgt bei 370, bei einem Luftumsatz von 0,25 Vol/Vol Nährlösung/min und unter Rühren mit einem 6-blättrigen Turbinenrührer mit 50 Umdr/min. Nach 10 Tagen weist die Kulturlösung eine optische Dichte von 4,40 (bei 655 mu), d. h. ein Zelltrockengewicht von zirka 2,2 g/l Kulturlösung, auf.
Die Kulturlösung wird zentrifugiert, gewaschen und, wie oben beschrieben, zu Vaccinen verarbeitet.
Der Inhalt der Ampullen Nr. 6 und 7 wird zur Züchtung in 500-ml-Erlenmeyerkolben wie oben beschrieben verwendet. Die beiden so erhaltenen Lebendkulturen werden ebenfalls zu Vaccinen verarbeitet.
In der folgenden Tabelle 3 sind die Ergebnisse eines Vergleiches der erfindungsgemäss erhaltenen Vaccinen aus Isolationen Nr. 1 (Fermenter) und 6 und 7 (Schüttelkolben) mit Vaccinen, die ohne Selektion aus dem BCG-Ausgangsstamm erhalten werden, hinsichtlich Thermostabilität angegeben. Es wurden je 5 Ampullen mit 1 mg BCG-Trockengewicht eine Woche bei 500 gelagert. Vor und nach der Lagerung wird der Gehalt an lebensfähigen, Kolonien bildenden Zelleinheiten (viable units) bestimmt.
Die Zahlen sind Mittelwerte aus 5 Ampullen.
Tabelle 3
EMI5.1
<tb>
<tb> Anzahl <SEP> Kolonien/mg <SEP> BCG-Trockengewicht <SEP>
<tb> Überlebensrate
<tb> BCG-Stamm <SEP> vor <SEP> der <SEP> Lagerung <SEP> nach <SEP> der <SEP> Lagerung <SEP> in <SEP> 0/0 <SEP>
<tb> Selektion <SEP> 1, <SEP> 30. <SEP> 108 <SEP> I, <SEP> 62. <SEP> 106 <SEP> 1,25
<tb> Nr. <SEP> 1 <SEP> (Ferm.
<tb>
Sel. <SEP> Nr. <SEP> 6 <SEP> 3, <SEP> 98. <SEP> 10 <SEP> 6, <SEP> 92. <SEP> 10 <SEP> l, <SEP> 74
<tb> (Schüttelk.)
<tb> Sel. <SEP> Nr. <SEP> 7 <SEP> 5, <SEP> 94. <SEP> 107 <SEP> 7, <SEP> 5. <SEP> 1 <SEP> () <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 26
<tb> (Schüttelk.)
<tb> Grundstamm <SEP> 1, <SEP> 84. <SEP> 107 <SEP> 2, <SEP> 31. <SEP> 1ai <SEP> 0, <SEP> 13 <SEP>
<tb>
In Tabelle 4 ist die immunisierende Wirkung der obigen Vaccinen im Vergleich zu derjenigen einer frischen BCG-Kultur angegeben. Als Versuchstiere dienten weisse Mäuse. Der Inhalt der Ampullen mit. 1 mg BCG-Trockengewicht wurde in 3 ml destilliertem Wasser, dem 3% oTween 80 zugesetzt sind, aufgeschwemmt und die Suspension mit physiologischer Natriumchloridlösung bis zu einer Konzentration von 10 y bzw. 1 y BCG/0, 1 ml weiterverdünnt.
Je 20 Mäuse pro Versuchseinheit werden mit 1 ml einer Suspension, die l y bzw. 10 y BCG-Trockengewicht enthält, subkutan geimpft. 4 Wochen nach der Impfung werden die Tiere intravenös mit einer letalen Dosis (0, 4 ml mit 300 000 Zelleinheiten (viable units) des bovinen Tb-Stammes Ravenel geimpft. Es wird die mittlere Überlebenszeit festgestellt.
Nicht geimpfte Tiere sterben im Durchschnitt 20 Tage nach der Infektion.
<Desc/Clms Page number 6>
Tabelle 4
EMI6.1
<tb>
<tb> Mittlere <SEP> Überlebenszeit <SEP> (je <SEP> 20 <SEP> Mäuse)
<tb> Impfstoff <SEP> 1 <SEP> γBCG/Maus <SEP> 10 <SEP> γBCG/Maus
<tb> Selektion <SEP> Nr. <SEP> 1 <SEP> 24 <SEP> Tage <SEP> 43 <SEP> Tage
<tb> (Fermenter)
<tb> Selektion <SEP> Nr. <SEP> 6 <SEP> 35 <SEP> Tage <SEP> 39 <SEP> Tage
<tb> (Schüttelk.)
<tb> Selektion <SEP> Nr. <SEP> 7 <SEP> 26 <SEP> Tage <SEP> 36 <SEP> Tage
<tb> frische <SEP> BCG-Kultur
<tb> (zirka20-30yBCG <SEP> 39 <SEP> Tage
<tb> Trockengewicht) <SEP> ! <SEP>
<tb>
EMI6.2