AT205172B - Verfahren zur biologischen Synthese von Polysacchariden, insbesondere Dextran mit klinischen Eigenschaften - Google Patents

Description

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  Verfahren zur biologischen Synthese von Polysacchariden, insbesondere Dextran mit klinischen Eigenschaften 
Die Erfindung hat die Herstellung von Polysacchariden von gewünschtem Molekulargewicht, insbesondere Dextran für klinische Verwendung, durch mikrobiologische Synthese zum Ziel. 



   Neben der allgemein bekannten Bedeutung der Blutkonserven gewinnen künstlich hergestellte Lösungen, deren osmotische und/oder physiologische Eigenschaften so geartet sind, dass sie im Zusammenhang mit der noch   vorhandenen Kreislaufflüssigkeit   keine physiologischen Schäden anrichten, zunehmendes Interesse. Derartige Plasma-Expander, insbesondere isotonische Lösungen des Polyvinylpyrrolidons und des Dextrans, werden heute vielfach verwendet. 



   Besonders bei der Herstellung des Dextrans, welches durch Einwirkung der Dextransucrase aus Saccharose entsteht, ergibt sich dieses bekanntermassen in polymolekularem Zustand, wobei das Molekularverteilungsverhältnis solche Formen   aufweist, dass   nur ein geringer Anteil desselben klinisch verwendet werden könnte. Bekannt sind verschiedene Vorschläge, um durch hydrolytische Depolymerisation im sauren oder alkalischen Medium bzw. durch mechanische Einwirkungen (Ultraschall) u.   a.   Einflussnahmen den klinisch verwendbaren Anteil zu erhöhen. Allen Vorschlägen gemeinsam ist eine unbefriedigende Ausbeute in Bezug auf die klinisch verwendbaren Anteile und eine schwierige und aufwendige Verfahrensweise. 



   Neuerdings versuchte man, diese Mängel dadurch zu beseitigen, dass von geeignetenMikroorganismen in vitro eine möglichst reine Dextransucrase gewonnen wird, die als Katalysator in einer mit niedrigmolekularem Dextran als Starterreagens gelenkten Polymerisation eine Saccharoselösung unter geeigneten Bedingungen umwandelt. Zwar konnte gegenüber den älteren Arbeitsweisen eine Ausbeuteverbesserung erzielt werden, jedoch ist die Herstellung einer als Katalysator für die Polymerisation einwandfrei verwendungsfähigen Dextransucraselösung eine bedeutende Erschwerung. 



   Die technologischen Schwierigkeiten zur Gewinnung aktiver Dextransucraselösungen versuchte man dadurch zu umgehen, dass eine Lenkung der Synthese direkt in der Kulturlösung vorgenommen wird. Die durch die normalen saccharosehaltigen Impflösungen eingeschleusten hochmolekularen Dextrane stören jedoch die Wirkung der künstlich angesetzten Starter so empfindlich, dass nur ein Teil des gebildeten Dextrans in dem gewünschten Molekularbereich liegt. 



   Die vorliegende Erfindung vermeidet alle bisher erwähnten Nachteile und erzielt hohe Ausbeuten an klinisch direkt verwendbarem Dextran dadurch, dass Impfkulturen verwendet werden, deren Kohlenstoffquelle aus organischen Verbindungen besteht, die eine hohe Virulenz und ein optimales Dextranbildungsvermögen der Bakterien gewährleisten, ohne selbst als Starter für die Dextransynthese zu dienen oder unter dem Einfluss des Fermentsystems Starter zu bilden. 



   Als für die Entwicklung des Leuconostoc mesenteroides notwendige Kohlenstoffquellen   können or-   ganische Kohlenstoffquellen verwendet werden, die sich nicht toxisch auf die Bakterien auswirken und die auch nach mehrmaligen Passagen der Bakterien über derartige Kulturböden oder Lösungen die Bereitschaft für die Bildung des Enzyms Dextransucrase erhalten.

   Als derartige Kohlenstoffquellen eignen sich besonders solche organische Verbindungen, die dem Stoffwechsel des gewählten Bakterienstammes nahestehen, wie organische Säuren-hier sind besonders die des Zitronensäurezyklusses und die    erstenglie-   der der flüchtigen Fettsäuren zu nennen-und die niederen Alkohole, wie Äthanol, Propanol und ButanoL
Als Kohlenstoffquellen, die in der Impflösung nicht vorkommen dürfen, sind solche zu verstehen, 

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 die entweder selbst als Starter wirken   können, wie   besonders die Zucker der   Maltose- und Isomaltosereihe   und solche, die unter dem Einfluss des Fermentsystems starterwirksame Verbindungen bilden können, wie besonders Saccharose. 



   Zucker mit geringer Starterwirkung, wie Glucose und besonders Fructose. können die Virulenz der Bakterienstämme beträchtlich heben. Um einen merkbaren Einfluss auf die Dextransynthese hinsichtlich eines gewünschten Molekulargewichtes zu vermeiden, muss ihre Konzentration jedoch gering gehalten werden (nicht grösser als 0, 5 %). 



   Damit die   Impflös. mg   tatsächlich frei von Substanzen mit direkter oder indirekter Starterwirkung ist, müssen einige oder mehrere Passagen über Nährböden mit geeigneter, oben näher angeführter Kohlenstoffquelle gemacht werden. 



   Somit erfüllt also eine solche Impflösung drei wesentliche Bedingungen : Sie ist starterfrei und ermöglicht eine virulente Bakterienpopulation bei ungeschwächten   Dextranbildungsvermögen.   Uberimpft man derartige Impflösungen auf die eigentliche, üblich zusammengesetzte Syntheselösung, der eine bestimmte, vorher berechnete Menge Starter zugesetzt wird, so wird eine störungsfrei verlaufende gelenkte Synthese des Dextrans erreicht, die überraschenderweise einer enzymatischen gelenkten Synthese hinsichtlich der Ausbeuten des gewünschten Produktes beträchtlich überlegen ist. Zudem ist das Verfahren robust und einfach und ermöglicht eine technologische Anwendung mit einfachen Mitteln. 



    Ausführungsbeispiele :    
I. Herstellung starterfreier, ein virulentes Bakterienwachstum ermöglichender und das Dextranbil-   dungsvermögen   erhaltender   Impf- und   Passagelösungen. 



   1. Von einem mit Leuconostoc mesenteroides bewachsenen Agarnährboden (5 %   Saccharose : 0, 50/0   
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 fugiert. Danach wird dekantiert und die Zellen werden wieder mit physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Prozedur des Waschens wird so lange wiederholt, bis in der Zellsuspension kein Dextran mehr ausfällbar ist. Allgemein genügen 2 Waschungen. 



   Die Zellsuspension wird dann einer Impflösung folgender Zusammensetzung zugeimpft :
Impflösung :$%Zitronensäure
0, 5 %   NaHPO. IZH O     0, 1 % KC1   
0, 1 % Pepton
1, 0 % Hefeautolysat
PH 7
Aqua   dest.   auf 100. 



   Nach Erreichen der maximalen Trübung wird diese Impflösung im Verhältnis 1 : 10 einer Syntheselösung folgender Zusammensetzung zugeimpft :   Syntheselösung :   10 % Saccharose
2   %   PrimerdextranMG 20000 
 EMI2.2 
   50, 1 % Pepton   
1, 0 % Hefeautolysat   Pa 7   
Aqua   dest.   auf 100
Nach Absinken des PH-Wertes auf 3,9 ist die Synthese beendet. 



   Nach bekannten Methoden wird   da ? Dextran   aufgearbeitet. 



   2. Eine Öse Schleim von einer L. mesenteroides- oder L. dextranicus-Kultur wird auf einen Nährboden. der auf den Boden eines Standkolbens ausgegossen ist und folgende Zusammensetzung besitzt, ausgestrichen :   Nährboden :   3 % Agar   0, 5 % Fructose    
 EMI2.3 
 
50, 1 % Pepton 1,0 % Hefeautolysat
PH 7
Aqua   dest.   auf 100 

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Nach kräftiger Entwicklung der   Kclonien   wird mit einer Nährlösung folgender Zusammensetzung aufgefüllt :
Nährlösung   (Impflösung) 0,5 % Propanol    
 EMI3.1 
    5 < 0,1 %   Pepton
1, 0 % Hefeautolysat
PH 7
Aqua   dest.   auf 100. 



   Nach Erreichen der maximalen Trübung wird im Verhältnis 1 : 10 einer Syntheselösung (Zusammensetzung "Syntheselösung I, 1") überimpft. 



   Nach Absinken des pH-Wertes auf 3,9 ist die Synthese beendet. 



   Nach bekannten Methoden wird das Dextran aufgearbeitet. 



   II. Gelenkte Synthese von Dextran. 



   Die   Impflösungen   werden nach   I,   1 und I, 2 hergestellt. 



   Die hier   genanntenkohlenstoffquellen   (Zitronensäure, Fructose, Propanol) können durch andere, geeignete ersetzt werden, wie Äthanol, Essigsäure, Weinsäure und Milchsäure. Die Impflösungen werden im Verhältnis   l : 10 überimpft.   



   1. Die Lenkung soll auf ein Molekulargewicht (MG) von 40000 erfolgen. 



     Syntheselösung :   20 % Saccharose   2, 5 %   Primerdextran (MG 10000)   0, 5 % Na HPO,. 12H20 0, 1 % KC1   
0, 1 % Pepton   1, 0   % Hefeautolysat
PH 7
Aqua   dest.   auf 100
Ausbeute der Fermentation im Durchschnitt 80% der Theorie (MG 40000). 



   2. Die Lenkung soll auf ein Molekulargewicht (MG) von 75000 erfolgen (klinisches Dextran). 



     Syntheselösung : 10 %   Saccharose
2 % Primerdextran (MG   25000)  
Weitere Zusätze wie II, 1. 



   Ausbeute der Fermentation im Durchschnitt 90 % der Theorie (MG 75000). 



   3. Die Lenkung soll auf ein Molekulargewicht (MG) von 150000 erfolgen. 



   Syntheselösung :10%Saccharose
1 % Primerdextran (MG 30000)
Weitere Zusätze wie II, 1
Ausbeute der Fermentation im Durchschnitt 85   %   der Theorie (MG 150000). 



   4. Die Lenkung soll auf ein Molekulargewicht (MG) von 300000 erfolgen. 



     Syntheselösung :   10 % Saccharose
1, 3 % Primerdextran (MG 75000)
Weitere Zusätze wie II, 1. 



   Ausbeute der Fermentation im Durchschnitt 75   %   der Theorie. (MG 300000). 



   5. Die Lenkung soll auf ein höchstmögliches Molekulargewicht erfolgen (technisches Dextran). 



   7, 5 % Saccharose keinen Primerzusatz
Weitere Zusätze wie II, 1. 



   Ausbeute der Fermentation im Durchschnitt 90   %   der Theorie.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden mit möglichst einheitlichem Molekulargewicht, insbesondere von Dextran für klinische Zwecke, durch eine gelenkte biologische Synthese, insbesondere mit aktiven Stämmen von Leuconostoc mesenteroides, dadurch gekennzeichnet, dass für die Gewinnung der Impfkulturen als Kohlenstoffquelle in der Nährlösung nur solche organische Verbindungen, wie organische Säuren und niedermolekulare Alkohole, Verwendung finden, die eine hohe Virulenz und ein optimales <Desc/Clms Page number 4> Dextranbildungsvermögen der Bakterien gewährleisten, ohne so, wie z.

   B. die Zucker der Maltose- und Isomaltosereihe oder die Saccharose, als Starter für die Dextransynthese zu dienen oder unter dem Einfluss des Fermentsystems Starter zu bilden, und dass diese Impfkultur auf saccharosehaltige Synthese-Nährlösung mit oder ohne Starterzusatz überimpft und in üblicher Weise die Lösung fermentiert und weiter aufgearbeitet wird.