DE2207482A1 - Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen - Google Patents
Verfahren zur Züchtung von MikroorganismenInfo
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Description
Beschreibung
zu der Patentanmeldung
zu der Patentanmeldung
SHELL INTERNATIOMLE RESEARCH MAATSCHÄPPIJ N.Y.,
Carel Van Bylandtlaan 30, Den Haag, Holland.
betreffend:
"Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen"
"Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen"
Die üblichen Fermentationsverfahren zur Züchtung von Mikroorganismen werden entweder chargenweise oder kontinuierlich
durchgeführt. Im ersten Fall beimpft man ein gewöhnlich
flüssiges Wachstumsmedium in einem Fermentationsgefäß mit dem betreffenden Mikroorganismus und läßt diesen sich
dann vermehren. Wenn das Wachstum abgeschlossen ist, d.h. wenn ein stationärer Zustand erreicht ist, zieht man das
Medium aus dem Gefäß ab und extrahiert das Produkt; Das Verfahren wird dann mit einer frischen Menge Medium wiederholt.
Bei einem kontinuierlichen Fermentationsverfahren wird das den gezüchteten Mikroorganismus enthaltende
Medium kontinuierlich aus dem Gefäß abgezogen und diesem gleichzeitig frisches Medium zugeführt.
Um die Fermentation ausreichend aseptisch durchführen zu können, muß das Wachstumsmedium vollkommen frei von anderen le~
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benden Mikroorganismen sein, die sich unter den Fermentationsbedingungen
.ebenfalls vermehren könnten. Die bevorzugte Methode zur Sterilisierung des Mediums war bisher
die Anwendung von Wärme, z.B. durch Verwendung von überhitztem
Dampf. Die Sterilisierung durch Erhitzen erhöht jedoch, insbesondere bei der kontinuierlichen Fermentation, die Anlagekosten und die Durchführungskosten des Verfahrens. Außerdem
müssen, wenn das Medium einmal sterilisiert worden ist., besondere Vorsichtsmaßregeln getroffen werden,
um eine Verunreiiigung zu vermeiden, bevor das Medium in das Fermentationsgefäß eingeführt wird. Auch dieses Problem
spielt besonders bei kontinuierlichen und halbkontinuierlichen Verfahren eine Rolle, bei denen ein großer Vorrat
an sterilem Medium gehalten werden muß.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen bereitzustellen, bei dem eine
andere Methode zur Sterilisierung des Mediums angewandt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen,
wobei ein steriles flüssiges Wachstumsmedium, das assimilierbare Stickstoffquellen und wesentliche Mineralsalze enthält,
mit einer Kultur des Mikroorganismus beimpft wird, worauf man den Mikroorganismus in Anwesenheit einer
Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und gegebenenfalls
TD 6 hl? 6 Il
einer Quelle für gasförmigen Sauerstoff sicKver/läßt und
dem beimpften Medium während des Wachstums des Mikroorganismus frisches steriles Medium zuführt, ist dadurch gekennzeichnet,
daß das frische Wachstumsmedium in sterilisierend wirkender Konzentration ein Mikrobiozid enthält, das
bei den beim Vermischen des frischen Mediums mit dem beimpften
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Medium auftretenden niedrigeren Konzentrationen durch den Stoffwechsel des sich vermehrenden Mikroorganismus
verbraucht werden kann.
Es sind viele Mikroorganismen bekannt, die eine organische
Verbindung mit einem einzigen Kohlenstoffatom im Molekül als einzige Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff verbrauchen
können. Die durch die Züchtung derartiger Mikroorganismen, erhältliche proteinreiche Biomasse kann unter
Umständen als Nahrungsmittelquelle für Menschen und Tiere angesehen werden. Beispiele für derartige Mikroorganismen
sind die Methan verbrauchenden Mikroorganismen, z.B. diejenigen der Species Methyloccous und der Species
Methanomonas sowie Methanol verbrauchende Mikroorganismen,
wie Pseudomonas ectorquans NCIB Nr. 9399» Protaminobacter ruber NCIB Nr. 2879 "und diejenigen der Species Hyphomicrobium,
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Züchtung dieser Typen von Mikroorganismen, da diese
wie gefunden wurde, fähig sind, die stark bakteriozide Verbindung Formaldehyd in Anwesenheit der üblicheren
Substrate Methan oder Methanol zu assimilieren. Das frische Medium, das einer kontinuierlichen oder halbkontinuierlichen
Fermentation zugeführt werden soll, kann demnach eine Konzentration an Formaldehyd, zweckmäßigerweise von
0,01 bis 10 % Gew.-/Vol., enthalten, die gegenüber Mikroorganismen eine toxische Wirkung hat. Auf diese Weise
wird das Mediumgprade bis zu dem Zeitpunkt steril gehalten,
zu dem es dem Züchtungsmedium, das die sich aktiv vermehrenden Mikroorganismen enthält, zugeführt
wird. Bei der Zugabe des formaldehydhaltigen Mediums wird die Formaldehydkonzentration durch Verdünnung so weit
verringert, daß das Gesamtmedium nicht mehr toxisch wirkt und
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auch ein Ansteigen der Formaldehydkonzentration bei
kontinuierlicher Zufuhr wird vermieden, da bei der subtoxischen Konzentration der Formaldehyd durch den
Mikroorganismus rasch umgesetzt wird. So wurde für den Mikroorganismus Ps. extorquans NGIB Nr. 9399 gefunden,
daß er sich noch in Anwesenheit von bis zu etwa C 5m_Mol/Liter Formaldehyd im Kulturmedium vermehren
kann.
Um in dem inoctiliertem Medium das Auftreten einer toxischen
Konzentration zu vermeiden, müssen in der Praxis die folgenden Vorsichtsmaßregeln getroffen werden:
(a) üeim Einsetzen der Fermentation sollte vorzugsweise
die Sterilisation des anfangs vorhandenen Volumens an Medium nicht durch Verwendung von Formaldehyd
bewirkt werden, da hierzu eine Formaldehydkonzentration notwendig wäre, die auch gegenüber den zu
züchtenden Mikroorganismen toxisch wirken würde;
(b) das Formaldehyd enthaltende Medium muß so langsam zugeführt werden, daß eine Accumulation im Kulturmedium
vermieden wird;
(c) die Sauerstoffzufuhr sollte das Wachstum der Mikroorganismen nicht einschränken, da diese sonst
nicht fähig werden, den Formaldehyd voll auszunützen und dieser sich dann ansammeln würde,
bis schließlich eine toxische Konzentration erreicht ist.
Werden die obigen Vorsichtsmaßregeln beachtet, so läßt sich
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in Anwesenheit von Formaldehyd eine erfolgreiche Fermentation durchführen, welche die folgenden Vorteile bietet^
(a) das Sterilisieren des'Mediums durch Heißdampf läßt sich weitgehend vermeiden außer bei dem
relativ kleinen Volumen an Ausgangsmedium;
(b) ein Rückgang der Vermehrung der Mikroorganismen während der Zufuhr wird vermieden;
(c) eine Verunreinigung des Mediumreservoirs und der Zufuhrleitungen wird verhindert;
(d) es kann frisches Medium zugeführt werden, ohne daß man sterile Überführungsmethoden anwenden muß.
Wenn bei der Beschreibung des erfindungsgemäßen-Verfahrens
bisher nur von der Züchtung von Mikroorganismen, die Verbindungen mit einem Kohlenstoffatom umsetzen, und in
diesem Zusammenhang von der Verwendung von Formaldehyd die Hede war, so kann das Verfahren, wie der Fachmann ohne
weiteres einsehen wird, ebenso gut zur Züchtung von Mikroorganismen angewendet werden, die andere Arten von
bakterioziden Verbindungen, z.B. Phenole, Alkohole, andere Aldehyde, Carbonsäuren oder Antibiotika assimilieren
können.
Bei den folgenden Beispielen, die zur Erläuterung der Erfindung dienen, wurde ein wäßriges Wachstums- bzw.
Vermehrungsmediuni verwendet, das mit "D2" bezeichnet ist und Je Liter Wasser die folgenden Zusätze enthält:
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Na2HP04i2H20, 3,0 g; KH2PO4, 3,0 g; (NH4)2S04, 3,Og;
MgSO^ . 7H2O1 0,1 g; zusätzlich sind dann noch je Liter
2 ml einer Lösung von Spurenelementen in Standardkonzentration vorhanden.
Bakteriozideigenschaften von Formaldehyd»
Die Wirkung des Formaldehyds als Bakteriozid auf Methanol
umsetzende Bakterien wurde wie folgt untersucht:
In 22 Schüttelkolben von je 500 ml wurden jeweils 50 ml
D2-Medium eingefüllt, worauf Methanol, Formaldehyd und bzw. oder Glucose in den in Tabelle I angegebenen Mengen
zugegeben wurde. Getrennt davon wurde ein an Methanol umsetzenden Organismen reiches Inocolum bereitet, indem man
10 g Erde von einem Bodenstück, das vorher 3 Monate lang regelmäßig mit Methanol behandelt worden war, gemeinsam
mit 10 g Erde aus einem unbehandelten Bodenstück in 50 ml einer auf Methanol vermehrten Kultur von Pseudomonas
extorquans NCIB Nr. 9399 suspendierte, die eine Zellenkonzentration (Trockengewicht) von 3 g/l hatte. Zum Beimpfen
der einzelnen Schüttelkolben wurden jeweils 0,1 ml dieser
Suspension verwendet.
Zum Vergleich wurde einer der Kolben (Nr. 21), der 1,0 % Methanol und keinen Formaldehyd enthielt, im Autoklaven
15 min mit Dampf von 1 atü behandelt.
Dann wurden sämtliche Kolben bei 30° auf einer Schütteleinrichtung
inkubiert. Nach 3, 4 und 5 Tagen wurden die Kolben mit dem aus der Tabelle ersichtlichen Ergebnis auf Vermehrung
der Mikroorganismen untersucht. Wie ersichtlich, zeigten
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sämtliche Kolben, die Formaldehyd enthielten, keine Vermehrung
der Mikroorganismen. Formaldehyd ist daher ein Bakteriocid, das böi Konzentrationen bis herab zu
0,1 % Gewicht/Volumen wirksam ist.
Um nachzuweisen, daß die Wirkung des Formaldehyds tatsächlich bakteriocid und nicht nur bakteriostatisch ist,
wurden je 0,1 ml der Kulturen in den Gefäßen, die nach 4tägiger Inkubation keine Vermehrung zeigten, überführt
in Schüttelkolben (500ml) mit $0 ml Dp-Medium, das
1 % Methanol enthielt. Nach einer Inkubation von weiteren 5 Tagen zeigte sich keinerlei Wachstum außer bei der
Probe aus Kolben 22, die weder Glucose noch Methanol noch Formaldehyd enthielt. Die Kolben wurden dann "beimpft mit
einer Kultur von Ps. Extorquans HCIE Nr. 9399 und inkubiert,
Es trat in allen Fällen ein Wachstum auf, voraus !: .^-vorgeht,
daß der restliche Formaldehydgehalt nicht fähig war, das Wachstum zu verhindern.
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| TABELLE I | _ | Organismen | 1»° +++ ++++ ++f++ | |
| Kolben | Kolbeninhalt 50 ml D0 + Wachstum der Mikro- | Form- Glukose Tage | 0,1 1.0 - | |
| Nr. | aldehyd , ., ,- 9έ 96 |
0,5 1.0 - | ||
| Methanol | 1,0 I.0 | |||
| % | - ~ +++ ++++ ++++ | 2,5 1·° | ||
| 1 | 0,5 | - ' " + ++ +++ | 5,0 1.0 . - | |
| 2 | 1,0 | - · ~ · _ - « | (wärmesterilisiert) - _ . - | |
| 3 | .2,5 | 0,1 - | ||
| 4 | 5,0 | 0,5 - | ||
| 5 | 0,5 | 1,0 - - | ^ _ β "" ·« | |
| 6 | 0,5 | 2y5 "■ - - - | ||
| 7 | 0,5 | 5,0 * - - - | ||
| 8 | 0,5 | 0,1 - - | ||
| 9 | 0,5 | 0,5 | ||
| 10 | 1,0 | 1,0 - | ||
| 11 | - 1,0 | 2,5 | ||
| 12 | 1,0 | 5,0 | ||
| 13 | 1,0 | |||
| 14 | 1,0 | |||
| 15 . | - | |||
| 16 | — | |||
| 17 | ||||
| 18 | _ | |||
| 19 | - | |||
| 20 | - | |||
| 21 | 1,0 | |||
| (Ver | - | |||
| gleich) | ||||
| 22 | ||||
| (Ver | ||||
| gleich) |
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Beispiel 2
Einwirkung von Formaldehyd auf eine kontinuierliche Kultur
von Ps.Extorquans..
Ein mit Rührwerk, Einleitungsfritte und Einrichtungen zur
Temperatur- und pH-Steuerung ausgerüstetes Fermentatioiisgefäß
von 7 Liter Fassungsvermögen wurde beschickt mit 4 Liter D2-Medium, das 0,58 % (Gew.--/Vol.) Methanol enthielt.
Das Medium wurde dann beimpft mit einer 48 Stunden im
Schüttelkolben gehaltenen Kultur von Ps.extorquans NGIB Nr.
9399» die dann weiter gezüchtet wurde. Die Temperatur im Gefäß wurde auf 3O0C und der pH-Wert auf 6,4 gehalten und
die Kultur wurde kräftig gerührt und belüftet. Das Fortschreiten der Fermentation wurde verfolgt durch regelmäßige
Analyse von der Kultur entnommenen Proben, um die Zellenkonsentration
(Trockengewicht) des Mediums zu bestimmen. Die Resultate wurden in Fig. Λ aufgetragen.
Wenn die Kultur den stationären Zustand erreicht hatte, d.h. wenn ihre optische Dichte über 4 Stunden unverändert
blieb, wurde mit der kontinuierlichen Kultur begonnen, indem weiteres D^-Medium mit 0,58 % Methanol mit einer Geschwindigkeit
von 250 ml/min dem Gefäß zugeführt wurde (Punkt A). Das Gesamtvolumen des Mediums in dem Gefäß
wurde bei 4 Liter konstant gehalten durch Abpumpen von Medium über einen Auslaß in einer bestimmten Höhe oberhalb
des Gefäßbodens.
Nach kontinuierlicher Fermentation über 4 Tage wurde das D2-Medium abgeändert, so daß es neben 0,58 -/0 Gew./Yol«,
Methanol noch 0,25 % Gew./Vol. Formaldehyd enthielt (Punkt B). Nach weiterer kontinuierlicher Fermentation über 4 Sage
wurde das Medium wieder abgeändert, so daß es dann 0,75 %
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Formaldehyd und kein Methanol mehr enthielt (Punkt C).
Aus Fig. 1 ist folgendes klar ersichtlich: Bei Einführung von zusätzlich 0,25 % Formaldehyd stieg im Medium die
Zellenkonzentration von 1,6 auf 2,16 g/l an, ein Anzeichen dafür, daß die Kultur in Anwesenheit einer geringen Konzentration
an Formaldehyd nicht nur überlebte, sondern daß sie sogar fähig ist, den Formaldehyd als Substrat zu verwenden,
so daß in dem Gefäß die Formaldehydkohzentration auf
einem Stand bleibt, bei dem noch keine Giftwirkung eintritt. Ist jedoch im Medium kein Methanol anwesend,
so wird die Kultur ausgewaschen, was bedeutet, daß sich die Mikroorganismen in Formaldehyd allein nicht vermehren
können.
Typische kontinuierliche Kultur von Ps.extorquans unter Anwendung von Formaldehydsterilisation.
4- Liter eines D2-Mediums in einem Fermentationsgefäß, das
dem in Beispiel 2 verwendeten entsprach, wurden 20 min bei 120 C sterilisiert. Nach Abkühlen des Mediums wurde
steriles Methanol zugegeben bis zu einer Konzentration von 1,0 % (Gew./Vol.). Das Medium wurde mit 20 ml einer 28 Stunden
alten Kultur von Ps.extorquans NCIB Nr. 9399 beimpft und bis zum Erreichen eines stationären Zustandes inkubiert (32
Stunden). Dann wurde das Gefäß kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 50 ml/Stunde mit Do-Medium beschickt,
das 1,0 % Gew./Vol. Methanol und 0,25 % Gew./Vol. Formaldehyd enthielt.
Das Volumen der Kultur wurde während der ganzen Fermentation
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■1 " -,
auf 4 Liter, die Temperatur "bei 3O0G and der pH-Wert
durch. Zugabe von M-Natronlauge auf 6,4 gehalten.
Das Medium wurde mit 1 500 U/min gerührt und mit einer Geschwindigkeit von 3,5 LIter/Hinute belüftet,
Nach Erreichen eines stationären Zustandes entsprechend einer Zellenkonzentration (Trockengewicht) von 2,4 g/l
wurde dieser Zustand noch über 1 000 Stunden aufrechterhalten. Während dieser Zeit war keine Verunreinigung der
Kultur zu beobachten, ein Anzeichen dafür, daß Formaldehyd dazu benutzt werden kann, das Medium längere Zeit steril
zu halten.
Beispiel 4
Kontinuierliche Kultur von Methan verbrauchenden Mikroorganismen unter Anwendung einer Formaldehydsterilisation.
Eine kontinuierliche Kultur eines Methan verbrauchenden Mikroorganismus (Methanomonas sp.) wurde unter folgenden
Bedingungen in einem 2 Liter-Fermentationsgefäß mit angesetzt:
| Temperatur | 340C |
| Rührgeschwindigkeit | 1200 U/min |
| pH-Wert | 6,7 |
| Gaszufuhr 2 l/min 1:1 | |
| Methan-Luft-Gemisch |
Zufuhr von D2-Medium 50 ml/Std.
Die Entwicklung der Kultur wurde durch regelmäßige Messungen
der optischen Dichte, deren Resultate in Fig. 2 aufgetragen
sind, verfolgt.
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Nach einer kontinuierlichen Kultur von 4 Tagen wurde das Medium verändert; es enthielt, dann neben D~ noch
0,1 % (Gew.AoI.) formaldehyd (Punkt D); nach weiteren
2 1/2 Tagen wurde die Zufuhrgeschwindigkeit des Mediums auf 46 ml/Stunde gesteigert (Punkt E).
Aus Fig. 2 ist ersichtlich, daß die Zugabe von Formaldehyd zum Medium, das einer kontinuierlichen Kultur von Methan
verbrauchenden Mikroorganismen zugeführt wird, keinen störenden Einfluß auf die Kultur hat und daß man damit
eine brauchbare Methode zum Sterilisieren des Mediums bei derartigen Kulturen in der Hand hat.
PATENTANSPRÜCHE:
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Claims (5)
- - 13 - · 1A-4O 788Patentansprüche1- Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen, wobei ein ßteriles flüssiges Wachs tumsinediuni, das assimilierbare Stickstoffquellen und wesentliche Mineralsalze enthält, mit einer Kultur des betreffenden Mikroorganismus beimpft wird, worauf man den Mikroorganismus in Anwesenheit einer Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und gegebenenfalls einer Quelle für gasförmigen Sauerstoff sich vermehren läßt und dem beimpften Medium während der Vermehrung des Mikroorganismus frisches steriles Wachstumsmedium zuführt, dadurch gekennzeichnet , daß das frische Wachstumsmediura in sterilisierend wirkender Konzentration ein Mikrobiozid enthält, das bei den durch Vermischen des frischen Mediums mit dem beimpften Medium auftretenden niedrigeren Konzentrationen durch den Stoffwechsel des sich vermehrenden Mikroorganismus verbraucht werden kann.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus verwendet, dem als einzige Kohlenstoffquelle eine organische Verbindung mit nur einem Kohlenstoffatom genügt.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus einen Methan oder Methanol verbrauchenden Mikroorganismus, vorzugsweise Methanomonas sp. oder Pocudomonas extorquans IfGIB Fr. 9399 verwendet.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3$ dadurch gekennzeicb.net, daß man als Hikrobiozid Formaldehyd verwendet.2 0 9 B 3 fi / 0 Η 6 4
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein frisches Wachstumsmedium zuführt, in welchem die Pormaldehydkonzentration 0,01 "bis 10, vorzugsweise 0,1 bis 0,25 ^ (Gewicht/Volumen) "beträgt.86XXIV44209836/0864e.e rs e i t e
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