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"Verfahren zur Herstellung von vergorenem Futter"
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Beanspruchte Priorität der japanischen Patentanmeldung 51-103 382
vom 28. August 1976.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von vergorenem
Futter.
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In Forschung und Entwicklung wurde bisher für die Massenproduktion
von Hefe unter Verwendung von n-Paraffinen, Athanol oder Methanol viel Arbeit aufgewendet.
Es wurden jedoch nur sehr wenige Versuche unternommen, die in Zuchtfarmen anfallenden
verschiedenen Abfallstoffe, wie z.B. den an Harnsäure reichen Geflügelmist, nutzbringend
zu verwerten. Zu diesem Zweck
hätten Mikroorganismen selektiv kultiviert
werden müssen, die in der Lage sind, die in derartigen Abfallstoffen enthaltene
Harnsäure wirksam zu verwerten, um auf diese Weise Futter zu erzeugen. Tatsächlich
sind aber die bisherigen Resultate nicht sehr wertvoll.
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Es ist deshalb das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
zu schaffen, das es ermöglicht, auch bisher für wertlos gehaltene Abfallstoffe,
wie Geflügelmist, nutzbringend zu verwerten.
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Dieses Ziel wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß Geflügelmist
mit einer Harnsäure verwertenden Hefeart geimpft und zur Gewinnung einer proteinreichen
Kulturhefe in Gegenwart mindestens einer Kohlenstoffverbindung unter aeroben Bedingungen
kultiviert wird.
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Es gibt nicht wenige Hefen, die Harnsäure zu verwerten vermögen. Unter
diesen wurden für die Zwecke der Erfindung diejenigen ausgewählt, die in der Lage
sind, Harnsäure als einzige Stickstoffquelle zu verwerten, schnell zu wachsen und
selbst eine große Menge Hefe hervorzubringen. Aus diesen wurden erfindungsgemäß
als ganz besonders wirksam die folgenden Zuchtstämme ausgewählt: Pichia-Arten, wie
Pichia membranaefaciens PRL 162300, Pichia miso ATCC 20210 oder Pichia farinosa
ATCC 20218; Hansenula-Arten, wie Hansenula anomala NRRL Y 366, Hansenula subpelliculosa
NRRL Y 1683 oder Hansenula petersonii NRRL Y 3808, und Schizosaccharomyces octosporus
PRL F 2.
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Die erwähnten Hefen werden von öffentlichen Organisationen zur Konservierung
von Hefestämmen ("public strain preservation organizations"), wie ATCC, NRRL und
PRL (Prairie Regional Laboratory, National Research Council, Saskatoon, Saskatchewan,
Kanada), bereitgehalten.
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Die erfindungsgemäß ausgewählten Hefen sind in der Lage, Harnsäure
sehr wirkungsvoll zu zersetzen und zu verwerten, wachsen schnell und blühend und
erreichen innerhalb relativ kurzer Zeiten, nämlich innerhalb von ein oder zwei Tagen,
maximale Ausbeuten.
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Beim erfindungsgemäßen Verfahren vermehren sich diese Hefen unter
Verarbeitung von Harnsäure sogar dann äußerst wirksam, wenn sie, obwohl beinahe
unlöslich in Wasser, dem Kulturmedium in Form eines festen Pulvers zugesetzt werden.
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Gemäß einer besonderen Ausbildung des Erfindungsgedankens wird das
Wachstum der Hefen noch durch kleine Zugaben von Glucose, Äthanol und/oder Methanol
als Kohlenstoffnahrung gefördert.
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Gemäß einer weiteren Ausbildung des Erfindungsgedankens wird das erfindungsgemäße
Kulturverfahren unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Es kann dabei entweder in
flüssiger Phase oder in fester Phase ablaufen. Im ersteren Fall werden einem flüssigen
Medium von frischem Geflügelmist,getrocknetem Geflügelmist und/oder Extrakten von
Geflügelmist als Stickstoffnahrung Glucose, Äthanol und/oder Methanol als Kohlenstoffnahrung
zugefügt. Im letzteren Fall werden einem festen Medium von getrocknetem Geflügelmist
Glucose, Äthanol, Methanol, Reisstroh, Reiskleie, Sägemehl und/oder eine Brühe aus
eingeweichtem Getreide zugefügt. In beiden Fällen werden durch eine höchst wirksame
Zersetzung und Verwertung der Harnsäure im Kulturmedium große Mengen von Hefe erzeugt,
die reich an Proteinen ist.
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Durch das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich also unter Verwertung
von Geflügelmist rasch und wirtschaftlich vergorenes Futter hoher Qualität gewinnen.
Infolgedessen ist das Verfahren
der vorliegenden Erfindung hervorragend
zur Behandlung von auf Geflügelfarmen anfallenden Abfallstoffen geeignet.
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Unter Berücksichtigung der Annahme, daß sich der Anfall an Geflügelmist
allein in Japan im Jahr auf etwa 5 Millionen Tonnen beläuft, stellt die vorliegende
Erfindung ein ausgezeichnetes Mittel dar, um der Verschmutzung der Umwelt entgegenzuwirken.
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Die Erfindung sei nunmehr anhand einiger Versuche und Ausführungsbeispiele
noch näher erläutert.
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Versuch 1: Hefestämme wurden bei 3o0C unter aeroben Bedingungen in
einem Harnsäuremedium, dessen Zusammensetzung im nachstehenden angegeben wird, kultiviert.
Nach ein oder zwei Tagen war die maximale Ausbeute erreicht. Die Harnsäure war,
wie in Tabelle 1 gezeigt, zu nicht weniger als 95 % zersetzt und verschwunden.
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Zusammensetzung des Mediums: Difco*)-Hefe auf Kohlenstoffbasis 1,17
% Glucose 1 % Harnsäure 0,1 %.
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*) Difco ist ein Warenzeichen der Difco-Laboratories, Detroit, Michigan,
USA, unter dem bakteriologische Nährböden verschiedenartiger Zusammensetzung vertrieben
werden.
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Die Harnsäure war in o,o25 n-Natronlauge gelöst und mit Kaliummonophosphat
bis zur Einstellung eines pH-Wertes zwischen 6,6 und 6,8 neutralisiert.
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Tabelle 1
| Hefestamm Wachstumsrate Zersetzungsrat |
| (OD 660) der Harnsäure |
| (%) |
| nach nach |
| 1 Tag 2 Tagen 1 Tag 2 Tage |
| Pichia membranaefaciens o,78o o,9oo 94,4 97,2 |
| Pichia miso o,87o o,95o 98,o 98,o |
| Pichia farinosa o,87o o,95o 97,o 97,o |
| Hansenula anomala o,72o 0,960 95,4 97,7 |
| Hansenula subpelliculosa 0,800 0,920 97,0 99,0 |
| Hansenula petersonii o,755 o,9oo 95,4 97,1 |
| Schizosaccharmoyces 0,830 0,870 82,2 87,0 |
| octosporus |
Diese Wachstumsraten sind genauso ausgezeichnet wie jene, die sich unter Verwendung
von Aminosäurestickstoff oder Ammoniakstickstoff als einziger Stickstoffquelle ergeben,
und beweisen, daß die Harnsäure eine sehr wirksame Stickstoffquelle für eine vermehrende
Kultivierung der eingesetzten Hefen ist.
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Versuch 2: Bei diesem Versuch wurde der Einfluß der Harnsäurekonzentration
untersucht. Einem Basismedium von 1,17%iger Difco-Hefe auf Kohlenstoffbasis mit
5 % Glucose wurden o,o1 bis 1,o % Harnsäure zugefügt. Im Konzentrationibereich von
0,01 bis o,1 % wurde die Harnsäure in Form einer alkalischen Lösung
neutralisiert
mit Kaliummonophosphat verwendet. Im Konzentrationsbereich von o,2 bis 1,o % wurde
die Harnsäure dem Basismedium als Feststoff zugegeben. Die Kultivierung wurde dann
bei 3o0C unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wonach das Wachstum nephelometrisch
und die Harnsäure analytisch bestimmt wurden, nachdem die restliche Harnsäure durch
eine geringfügige Alkalizugabe gelöst worden war.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Wie aus dieser Tabelle
ersichtlich, war die Wachstumsrate im Falle einer o,o1%igen Harnsäure durch eine
ungenügende Menge an Stickstoff nicht besonders gut. Bei einer Harnsäurekonzentration
von o,1 % oder darüber gediehen jedoch die Hefen ausreichend gut. Weiterhin wurde
festgestellt, daß, auch wenn die Harnsäure in Form eines festen Pulvers zugesetzt
wurde, die Hefe die Harnsäure wirksam verwertete und dementsprechend gut wuchs,
was darauf hindeutet, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung gleichermaßen
in flüssiger wie in fester Phase angewendet werden kann.
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-Tabelle 2
| Pichia membranaefaciens Hansenula anomala |
| Harnstoffkonzentration Wachstumsrate Harnsäurezer- Wachstumrate
Härnsäurezer- |
| im Medium (OD 660) setzungsrate (OD 660) setzungsrate |
| (%) (%) (%) |
| nach nach nach nach |
| 1 Tag 2 Tagen 1 Tag 2 Tagen 1 Tag 2 Tagen 1 Tag 2 Tagen |
| 0,01 0,170 0,245 97,5 97,5 0,255 0,380 97,2 97,5 |
| 0,05 0,760 0,880 98,4 98,5 0,780 0,950 98,2 98,2 |
| 0,1 0,800 0,940 97,5 97,5 0,825 0,950 97,9 98,0 |
| 0,2 0,950 0,950 52,3 70,7 0,860 0,900 44,0 75,0 |
| 0,5 0,940 0,940 24,0 24,6 0,870 0,880 15,2 30,0 |
| 1,0 0,900 0,900 15,9 20,3 0,850 0,860 14,7 27,2 |
Versuch 3: Bei diesem Versuch wurde harnsäurereicher Geflügelmist
anstelle der Harnsäure in den Versuchen 1 und 2 als Stickstoffnahrung verwendet.
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Dieser Kultivierungsversuch wurde unter Verwendung von Alkaliextrakten
von getrocknetem Geflügelmist durchgeführt. Die Extrakte wurden folgendermaßen hergestellt:
1o g getrockneter Geflügelmist wurde erhitzt und mit 1 Liter o,o25 n-Natronlauge
extrahiert, wonach mit einer 10%gen Kaliummonophosphatlösung neutralisiert wurde.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben. Wie aus dieser Tabelle
ersichtlich, war das Wachstum unter alleiniger Verwendung des Basismediums nicht
allzu gut. Die Zufügung von 5 % Glucose führte jedoch zu einem sehr guten Wachstum
der Hefe, wobei die Harnsäure sehr wirksam zersetzt und verwertet wurde.
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Nach einem Kulturtag waren namentlich die Ausbeute auf Trokkenbasis
und der nach der Bürettenmethode bestimmte Gehalt an reinem Protein besonders hoch.
Das erfindungsgemäße Verfahren liefert deshalb ein ausgezeichnetes Futter. In der
nachfolgenden Tabelle 3 sind die Ergebnisse nach einer eintägigen Kultur wiedergegeben.
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Tabelle 3
| Pichia membranaefacienz Schizosaccharmoyces octosporus |
| Basismedium mit 5 % Gluco- Basismedium mit 5 % Gluco- |
| sezusatz sezusatz |
| Wachstumrate 0,148 1,270 0,288 1,100 |
| (OD 660) |
| Harnsäurezerset- 13,3 86,6 14,2 86,9 |
| zungsrate |
| (%) |
| Trockenpflanzen- - 0,51 - 0,53 |
| ausbeute |
| g/100 ml |
| Proteingehalt in - 43,9 - 32,2 |
| der Trockenpflanze |
| (%) |
Bei dieser Kultur hat es sich als notwendig erwiesen, dem allein
aus Extrakten von Geflügelmist bestehenden Basismedium Glucose als Kohlenstoffnahrung
zuzusetzen. Anstelle der Glucose hat sich auch ein Zusatz von 1 % Äthanol als wirksam
erwiesen. Ein Zusatz von 1 % Methanol ist jedoch nur im Falle von Schizosaccharomyces
octosporus ausreichend.
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Aus diesem Versuch geht hervor, daß für Vermehrungskulturen der erwähnten
Harnsäure verwertenden Hefen nicht nur die Anwesenheit eines Stickstoffnahrungsmittels,
sondern auch die eines Kohlenstoffnahrungsmittels erforderlich ist.
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Es wurde auf diese Weise festgestellt, daß die erwähnten Hefen in
Medien, die aus Harnsäure und/oder Alkaliextrakten von harnsäurereichem Hühnermist
bestehen, kultiviert werden können und daß sich anschließend sehr wirksam Hefen
produzieren lassen.
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Im folgenden sei das erfindungsgemäße Verfahren anhand zweier Beispiele
noch näher erläutert, wobei einmal ein flüssiges Medium und einmal ein festes Medium
zur Anwendung gelangen.
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Beispiel 1: In 80 ml einer 5%igen Glucoselösung mit einem zwischen
6,6 und 6,8 gehaltenen pH-Wert wurden o,8 g getrocknetes Geflügelmistpulver suspendiert.
Dieses flüssige Medium wurde in eine 500 ml Schüttelflasche gefüllt und sterilisiert.
Danach wurde dieses Medium mit o,5 ml Pichia membranaefaciens, die in demselben
Medium unter Schütteln 24 Stunden bei 3o0C kultiviert worden war, geimpft, woran
sich eine Kultivierung unter aeroben Bedingungen bei 3o0C in einer Pendel-Schüttelvorrichtung
mit 140 Schwingungen pro Minute anschloß. Nach einer 24-stündigen Kultivierung waren
70 % der Harnsäure
zersetzt und die Hefe gut gewachsen, was sich
in einer Trockenausbeute von o,75 g/loo ml und einem Anwachsen des Gehaltes an reinem
Protein um o,38 g/1oo ml zeigte. Die Kulturen wurden zum Schluß zentrifugiert, die
Hefe und andere Festsubstanzen gesammelt und getrocknet und auf diese Weise als
Futtermittel aufbereitet.
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Beispiel 2 5 g eines aus 65 % getrocknetem Geflügelmistpulver, 32
% Reiskleie, 1 % Brühe aus eingeweichtem Getreide und 2 % Glucose bestehenden Mediumswuipn
in eine 200 ml Rundflasche eingefüllt. Das Medium wurde dann mit o,5 ml Pichia membranaefaciens
geimpft, die 24 Stunden bei 3o0C in einem Medium von Alkaliextrakten von Geflügelmist
mit 5 % Glucose kultiviert worden war. Dann wurde die Hefe unter pendelndem Schütteln
mit 140 Schwingungen pro Minute kultiviert. Nach einer 30-stündigen Kultur erreichte
der Gehalt an reinem Protein 18,9 % mit 97,4 % verdaulichem Protein, woraus sich
ergibt, daß es sich bei den erfindungsgemäßen Kulturen um hochqualifiziertes Futter
handelt.