DE69628011T2 - Rekombinanter mva virus und seine verwendung - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Vacciniaviren, die sich von dem modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) herleiten und an der Stelle einer natürlich vorkommenden Deletion im MVA-Genom inserierte Fremdgene enthalten bzw. diese exprimieren können, sowie die Verwendung solcher rekombinanter MVA-Viren für die Produktion von Polypeptiden, z. B. Antigenen oder Therapeutika, oder Virusvektoren zur Gentherapie, und die Verwendung solcher rekombinanter MVA-Viren, die Antigene als Impfstoffe kultivieren.
  • Aufgaben der Erfindung
  • Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein rekombinantes MVA-Virus bereitzustellen, das als effizienter und außergewöhnlich sicherer Expressionsvektor dienen kann.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines einfachen, effizienten und sicheren Verfahrens zur Herstellung von Polypeptiden, z. B. Antigenen oder Therapeutika, von rekombinanten Viren für Impfstoffe und Virusvektoren zur Gentherapie.
  • Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Expressionssystems auf der Grundlage eines T7-RNA-Polymerase exprimierenden rekombinanten MVA-Virus sowie Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden, z. B. Antigenen oder Therapeutika, oder zur Erzeugung von Virusvektoren zur Gentherapie oder Impfstoffen auf der Grundlage dieses Expressionssystems.
  • Stand der Technik
  • Vacciniavirus, ein Mitglied der Gattung Orthopoxvirus in der Familie Poxviridae, wurde als Lebendimpfstoff zur Immunisierung gegen die Pockenkrankheit bei Menschen verwendet. Die erfolgreiche weltweite Impfung mit Vacciniavirus kulminierte in der Ausrottung des Variolavirus, dem Verursacher der Pocken (The Global Eradication of Smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox Eradication. History of Public Health, Nr. 4, Genf: Weltgesundheitsorganisation, 1980). Seit dieser Erklärung durch die WHO wurde die Impfung allgemein eingestellt, mit Ausnahme der Impfung von Personen mit einem hohen Pockenvirusinfektionsrisiko (z. B. Laborpersonal).
  • In jüngerer Zeit wurden Vacciniaviren auch zur Konstruktion von Virusvektoren zur rekombinanten Genexpression und für die mögliche Verwendung als rekombinante Lebendviren eingesetzt (Mackett, M., Smith, G. L. und Moss, B. [1982] P.N.A.S. USA 79, 7415-7419; Smith G. L., Mackett, M. und Moss, B. [1984] Biotechnology and Genetics Engineering Reviews 2, 383-407). Dazu gehört die Einführung von DNA-Sequenzen (Genen), die für Fremdantigene codieren, in das Genom der Vacciniaviren mit Hilfe von DNA-Rekombinationstechniken. Wird das Gen an einer Stelle in der Virus-DNA integriert, die für den Lebenszyklus des Virus nicht essentiell ist, besteht die Möglichkeit, daß das neu hergestellte rekombinante Vacciniavirus infektiös ist, d. h. Fremdzellen infizieren und somit die integrierte DNA-Sequenz exprimieren kann (EP-Patentanmeldungen Nr. 83, 286 und Nr. 110, 385). Die auf diese Weise hergestellten rekombinanten Vacciniaviren lassen sich einerseits als Lebendimpfstoffe zur Vorbeugung gegen Infektionskrankheiten und andererseits zur Herstellung heterologer Proteine in eukaryontischen Zellen einsetzen.
  • Durch rekombinante Vacciniaviren, die das Gen für T7-RNA-Polymerase aus Bakteriophagen exprimieren, wurde die Etablierung breit anwendbarer Expressionssysteme für die Synthese rekombinanter Proteine in Säugerzellen ermöglicht (Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. und Fuerst T. R. [1990] Nature 348, 91-92.). In allen Vorschriften beruht die rekombinante Genexpression auf der Synthese der T7-RNA-Polymerase im Zytoplasma eukaryontischer Zellen. Am beliebtesten bewies sich eine Vorschrift zur transienten Expression (Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W. und Moss, B. [1986] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122–8126 und US-Patentanmeldung 7,648,971). Dabei wird zunächst ein gewünschtes Fremdgen unter der Kontrolle des T7-RNA-Polymerasepromotors in ein Plasmid inseriert. Danach wird dieses Plasmid in das Zytoplasma von mit einem T7-RNA-Polymerase produzierenden rekombinanten Vacciniavirus infizierten Zellen unter Verwendung von Standard-Transfektionsverfahren eingeführt.
  • Es handelt sich hierbei um eine einfache Transfektionsvorschrift, da keine neuen rekombinanten Viren hergestellt werden müssen, sowie um eine sehr effiziente Vorschrift, wobei mehr als 80% der Zellen das gewünschte Gen exprimieren (Elroy-Stein, O. und Moss, B. [1990] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6743-6747). Der Vorteil des Vacciniavirus/T7-RNA-Polymerase-Hybridsystems gegenüber anderen transienten Expressionssystemen besteht höchstwahrscheinlich in seiner Unabhängigkeit vom Plasmidtransport zum Zellkern. In der Vergangenheit erwies sich dieses System als äußerst geeignet für analytische Zwecke in der Virologie und Zellbiologie (Buonocore, L. und Rose, J. K. [1990] Nature 345, 625–628, Pattnaik, A. K. und Wertz, G. W. [1991] Proc Natl. Acad. Sci USA 88, 1379-1383, Karschin, A., Aiyar, J., Gouin, A., Davidson, N. und Lester, H. A. [1991] FEBS Lett. 278, 229–233, Ho, B. Y., Karschin, A., Raymond, J., Brancheck, T., Lester, H. A. und Davidson, N. [1992] FEBS Lett. 301, 303–306, Buchholz, C. J., Retzler C., Homann, H. E. und Neubert, W. J. [1994] Virology 204, 770-776]. Jedoch könnten wichtige zukünftige Anwendungen des Vacciniavirus/T7-RNA-Polymerase-Hybridsystems, z. B. zur Erzeugung rekombinanter Proteine oder rekombinanter Viruspartikel für neue therapeutische oder prophylaktische Ansätze beim Menschen, durch die produktive Replikation des rekombinanten Vacciniavektors behindert werden.
  • Vacciniavirus ist für Menschen ansteckend, und während der Ausrottungskampagne gegen Pocken wurden gelegentlich ernste Komplikationen beobachtet. Den besten Überblick über das Auftreten von Komplikationen liefert eine landesweite Untersuchung in den Vereinigten Staaten, in denen die Impfung von etwa 12 Millionen Menschen mit einem auf dem Vacciniavirusstamm des New York City Board of Health basierenden Impfstoff beobachtet wurde (Lane, J., Ruben, F., Neff, J. und Millar, J. [1969] New Engl. J. Med. 281, 1201-1208). Daher wurde die größtes Interesse hervorrufende Möglichkeit der Verwendung von Vacciniavirus als Vektor bei der Entwicklung rekombinanter Lebendimpfstoffe von Sicherheitsbedenken und -bestimmungen beeinträchtigt. Weiterhin beruhen die meisten der in der Literatur beschriebenen rekombinanten Vacciniaviren auf dem Western Reserve-Vacciniavirusstamm. Andererseits ist bekannt, daß dieser Stamm eine hohe Neurovirulenz besitzt und daher für die Verwendung im Menschen und in Tieren schlecht geeignet ist (Morita et al., Vaccine 5, 65-70 [1987]).
  • Die Gesundheitsrisiken bei Vektorapplikationen würden durch Verwendung eines stark abgeschwächten Vacciniavirusstamms verringert werden. Mehrere solcher Vacciniavirusstämme wurden speziell zur Vermeidung unerwünschter Nebenwirkungen bei der Pockenimpfung entwickelt. Somit wurde das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) durch serielle Langzeitpassagierungen des Ankara-Vacciniavirusstamms (CVA) in Fibroblasten aus Hühnerembryos erzeugt (für eine Übersicht, siehe Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. und Stickl, H. [1975] Infection 3, 6–14; schweizer Patent-Nr. 568,392). Das MVA-Virus wurde gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei der CNCM (Institut Pasteur, Collection Nationale de Cultures de Microorganisms, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) am 15. Dez. 1987 unter der Hinterlegungs-Nr. I-721 hinterlegt. MVA zeichnet sich dadurch aus, daß es stark abgeschwächt ist, d. h. seine Virulenz bzw. Ansteckungsfähigkeit unter Beibehaltung guter Immunogenität vermindert ist. Das MVA-Virus wurde hinsichtlich der Bestimmung von Veränderungen im Genom relativ zum CVA-Wildtypstamm analysiert. Davon wurden sechs größere Deletionen genomischer DNA (Deletionen I, II, III, IV, V und VI) mit insgesamt 31000 Basenpaaren identifiziert (Meyer, H., Sutter, G. und Mayr A. [1991] J. Gen. Virol. 72, 1031–1038). Das erhaltene MVA-Virus war stark eingeschränkt hinsichtlich der Wirtszellen, die sich auf Vogelzellen beschränken.
  • Weiterhin ist das MVA durch seine extreme Abschwächung gekennzeichnet. Beim Testen in verschiedenen Tiermodellen erwies sich das MVA selbst in immunsupprimierten Tieren als avirulent. Was noch wichtiger ist, die ausgezeichneten Eigenschaften des MVA-Stamms konnten in ausgedehnten klinischen Studien gezeigt werden (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375–390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386–2392 [1974]). Während dieser Untersuchungen an mehr als 120000 Menschen, einschließlich Patienten mit hohem Risiko, wurden keine Nebenwirkungen mit der Verwendung des MVA-Impfstoffs in Zusammenhang gebracht.
  • Es wurde festgestellt, daß die MVA-Replikation in menschlichen Zellen in einem späten Infektionsstadium blockiert wird, wodurch der Zusammenbau zu reifen infektiösen Virionen verhindert wird. Das MVA war trotzdem dazu in der Lage, virale und rekombinante Gene auf hohem Niveau selbst in nicht permissiven Zellen zu exprimieren, und wurde daher zur Verwendung als ein effizienter und außergewöhnlich sicherer Genexpressionsvektor vorgeschlagen (Sutter, G. und Moss, B. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851). Kürzlich wurden neue Vacciniavektorsysteme auf der Grundlage des MVA etabliert, bei denen Fremd-DNA-Sequenzen an der Stelle der Deletion III innerhalb des MVA-Genoms bzw. innerhalb des TK-Gens inseriert wurden (Sutter, G. und Moss, B. [1995] Dev. Biol. Stand. Basel, Karger 84, 195–200 und US-Patentschrift 5,185,146). Es wurde ein rekombinantes MVA-Virus hergestellt, das die an der Stelle der natürlich vorkommenden Deletion III innerhalb des MVA-Genoms inserierten HA- und NP-Gene des Influenzavirus vom Vacciniaviruspromotor P7.5 exprimiert (Sutter, G., Wyatt, L. S. Foley P. L., Bennink J. R. und Moss, B. [1994], Vaccine Bd. 12, Nr. 11, S. 1032–1040).
  • Zur weiteren Nutzung des MVA wurde nach einer neuen Möglichkeit zur Einführung von Fremdgenen durch Rekombination von DNA in den MVA-Vacciniavirusstamm gesucht. Da hierbei das Genom des MVA-Virus nicht verändert werden sollte, war es notwendig, ein diese Forderung erfüllendes Verfahren zu verwenden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde eine Fremd-DNA-Sequenz genau an der Stelle einer natürlich vorkommenden Deletion im MVA-Genom in die Virus-DNA rekombiniert.
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt somit unter anderem die folgenden, entweder alleinstehenden oder kombinierten Punkte:
    rekombinantes MVA-Virus, welches wenigstens ein an der Position einer natürlich vorkommenden Deletion im MVA-Genom inseriertes Fremdgen enthält und exprimieren kann;
    rekombinantes MVA-Virus wie oben, welches wenigstens ein an der Position der Deletion II im MVA-Genom inseriertes Fremdgen enthält und exprimieren kann;
    rekombinantes MVA-Virus wie oben, wobei das Fremdgen für einen Marker, ein therapeutisches Gen oder eine antigene Determinante codiert;
    rekombinantes MVA-Virus wie oben, wobei das Fremdgen für eine antigene Determinante aus einem pathogenen Virus, einem Bakterium oder einem anderen Mikroorganismus oder aus einem Parasiten oder einer Tumorzelle codiert;
    rekombinantes MVA-Virus wie oben, wobei das Fremdgen für eine antigene Determinante aus Plasmodium falciparum, Mycobakterien, Herpesvirus, Influenzavirus, Hepatitisviren oder menschlichen Immunschwächeviren codiert.
  • Rekombinantes MVA-Virus wie oben, wobei es sich bei der antigenen Determinante um HIV-nef oder menschliche Tyrosinase handelt;
    rekombinantes MVA-Virus wie oben, bei dem es sich um MVA-LAInef oder MVA-hTYR handelt;
    rekombinantes MVA-Virus wie oben, wobei das Fremdgen für T7-RNA-Polymerase codiert;
    rekombinantes MVA-Virus wie oben, bei dem es sich um MVA-T7-pol handelt;
    rekombinantes MVA-Virus wie oben, wobei das Fremdgen unter der Transkriptionskontrolle des frühen/späten Vacciniavirus-Promotors P7.5 steht;
    rekombinante MVA-Viren wie oben, die im wesentlichen frei von zur Replikation in menschlichen Zellen fähigen Viren sind;
  • Verwendung des rekombinanten MVA-Virus wie oben zur Transkription von DNA-Sequenzen unter der Transkriptionskontrolle eines T7-RNA-Polymerasepromotors;
    eukaryontische Zelle, infiziert mit einem rekombinanten MVA-Virus wie oben;
    mit einem rekombinanten MVA-Virus wie oben, wobei das Fremdgen für T7-RNA-Polymerase codiert, infizierte Zelle;
    mit einem rekombinanten MVA-Virus wie oben, wobei das Fremdgen für T7-RNA-Polymerase codiert, infizierte Zelle zusätzlich enthaltend einen oder mehrere Expressionsvektoren, der bzw. die ein oder mehrere Fremdgene unter der Transkriptionskontrolle eines T7-RNA-Polymerase-RNA-Polymerasepromotors trägt bzw. tragen;
  • Verwendung von Zellen wie oben zur Herstellung der durch die Fremdgene codierten Polypeptide, umfassend:
    • a) Kultivieren der Zellen unter geeigneten Bedingungen sowie
    • b) Isolieren der durch die Fremdgene codierten Polypeptide.
  • Mit einem rekombinanten MVA-Virus wie oben, wobei das Fremdgen für T7-RNA-Polymerase codiert, infizierte Zelle, zusätzlich enthaltend Expressionsvektoren, die Virusgene tragen, und/oder ein Virusvektorkonstrukt, das das Genom eines Virusvektors unter der Transkriptionskontrolle eines T7-RNA-Polymerasepromotors codiert; Verwendung einer Zelle wie oben zur Herstellung von Viruspartikeln, umfassend:
    • a) Kultivieren der Zellen unter geeigneten Bedingungen sowie
    • b) Isolieren der Viruspartikel; mit einem rekombinanten MVA-Virus wie oben, wobei das Fremdgen für T7-RNA-Polymerase codiert, infizierte Zelle, zusätzlich enthaltend
    • a) einen ein Retrovirusvektorkonstrukt, das Zielzellen infizieren und ein oder mehrere von dem Retrovirusvektorkonstrukt getragene Fremdgene darin exprimieren kann, tragenden Expressionsvektor sowie
    • b) einen oder mehrere, die die zur Verpackung des Genoms des Retrovirusvektorkonstrukts benötigten Polypeptide codierenden Gene unter der Transkriptionskontrolle eines T7-RNA-Polymerasepromotors tragende Expressionsvektoren;
  • Verwendung von Zellen wie oben zur Herstellung von Retroviruspartikeln, umfassend:
    • a) Kultivieren der Zellen unter geeigneten Bedingungen sowie
    • b) Isolieren der Retroviruspartikel;
  • Impfstoff, enthaltend ein rekombinantes MVA-Virus wie oben, wobei das Fremdgen für eine antigene Determinante codiert, in einem physiologisch unbedenklichen Trägerstoff;
  • Verwendung des rekombinanten MVA-Virus wie oben, wobei das Fremdgen für eine antigene Determinante codiert, zur Herstellung eines Impfstoffs;
  • Verwendung eines Impfstoffs wie oben zur Immunisierung eines lebenden tierischen Organismus, einschließlich eines Menschen;
  • Verwendung eines Impfstoffs wie oben, enthaltend das MVA-LAInef, zur Vorbeugung gegen oder Behandlung von HIV-Infektion oder AIDS;
  • Verwendung eines Impfstoffs wie oben, enthaltend das MVA-hTYR, zur Vorbeugung gegen oder Behandlung von Melanomen;
  • Impfstoff, enthaltend als ersten Bestandteil ein rekombinantes MVA-Virus wie oben, wobei das Fremdgen für T7-RNA-Polymerase codiert, in einem physiologisch unbedenklichen Trägerstoff und als zweiten Bestandteil eine eine antigene Determinante unter der Transkriptionskontrolle eines T7-RNA-Polymerasepromotors tragende DNA-Sequenz in einem physiologisch unbedenklichen Trägerstoff, wobei die beiden Bestandteile zusammen oder einzeln enthalten sind;
  • Verwendung eines Impfstoffs wie oben zur Immunisierung eines lebenden tierischen Organismus, einschließlich eines Menschen.
  • Unter dem Ausdruck „Gen" wird eine beliebige DNA-Sequenz, die für ein Protein oder Peptid codiert, verstanden.
  • Unter dem Ausdruck „Fremdgen" wird ein Gen verstanden, das in einer DNA-Sequenz, in der es normalerweise nicht vorkommt, inseriert ist.
  • Bei dem Fremdgen kann es sich beispielsweise um ein Markergen, ein therapeutisches Gen, ein eine antigene Determinante codierendes Gen oder ein Virusgen handeln. Solche Gene sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
  • Die vorliegende Erfindung
  • Das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA), ein in der Wirtsbreite beschränkter und stark abgeschwächter Vacciniavirusstamm, kann sich in menschlichen und den meisten anderen untersuchten Säugerzellinien nicht vermehren. Da jedoch die virale Genexpression in nicht permissiven Zellen nicht beeinträchtigt ist, können die erfindungsgemäßen rekombinanten MVA-Viren als außergewöhnlich sichere und effiziente Expressionsvektoren verwendet werden.
  • Eine antigene Determinante codierende rekombinante MVA-Viren
  • In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung rekombinante MVA-Vacciniaviren, die ein Gen enthalten, das für ein Fremdantigen, vorzugsweise eines Pathogens, codiert sowie Impfstoffe, die ein solches Virus in einer physiologisch unbedenklichen Form enthalten. Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Herstellung solcher rekombinanter MVA-Vacciniaviren bzw. Impfstoffe sowie die Verwendung dieser Impfstoffe zur Vorbeugung gegen durch solche Pathogene verursachten Infektionen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem im MVA-Virus inserierten Fremdgen um ein HIV-nef codierendes Gen.
  • Es wurden rekombinante MVA-Viren konstruiert, die die Expression des HIV-1-nef-Gens unter der Kontrolle des frühen/späten Vacciniavirus-Promotors P7.5 gestatten. Das regulatorische Nef-Protein von primaten-Lentiviren wird früh im viralen Replikationszyklus synthetisiert und erwies sich als essentiell für die Virusreplikation mit hohem Titer und die Krankheitsauslösung in vivo. Dies läßt darauf schließen, daß HIV-nef eine entscheidende Rolle bei der AIDS-Pahogenese spielt. Der molekulare Mechanismus bzw. die molekularen Mechanismen, über den bzw. die Nef zur erhöhten Virusinfektivität und zur HIV-Pathogenität beiträgt, bedarf bzw. bedürfen der weiteren Aufklärung. Doch ist Nef immunogen, und Nef-spezifisches Antigen läßt sich als Impfstoff gegen HIV-Infektion und AIDS einsetzen.
  • Dabei kann das das HIV-nef-Gen exprimierende rekombinante MVA-Virus zur Immunisierung von Menschen als ein prophylaktischer Impfstoff gegen menschliches HIV einerseits und zur Immuntherapie von mit HIV infizierten oder AIDS-Patienten andererseits verwendet werden. Weiterhin läßt sich das das HIV-nef-Gen exprimierende rekombinante MVA-Virus zur Herstellung von rekombinantem HIV-Nef-Protein verwenden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem im MVA-Virus inserierten Fremdgen um ein Gen, das menschliche Tyrosinase codiert.
  • Es wurden rekombinante MVA-Viren konstruiert, die die Expression des menschlichen Tyrosinasegens unter der Kontrolle des frühen/späten Vacciniavirus-Promotors P7.5 gestatten. Kürzlich wurde menschliche Tyrosinase als Melanom-spezifisches Tumorantigen identifiziert, das die Erzeugung zytolytischer Anti-Tumor-T-Lymphozyten ermöglicht (Brichard, V., et al. [1993] J. Exp. Med. 178, 489–495). Da unter den normalen Zellen nur Melanozyten das Tyrosinasegen zu exprimieren scheinen, ist die Tyrosinase ein geeignetes Zielantigen zur Immuntherapie von Melanomen. Daher läßt sich das das menschliche Tyrosinasegen exprimierende rekombinante MVA-Virus in Melanompatienten einsetzen, um die Immunantworten zu induzieren, die eine Tumorabstoßung hervorrufen bzw. die Metastasierung verhindern. Das das menschliche Tyrosinasegen exprimierende rekombinante MVA-Virus läßt sich direkt als Antimelanomimpfstoff einsetzen, oder das Virus kann zur Herstellung von Antimelanomimpfstoffen verwendet werden. In einem Beispiel läßt sich das das menschliche Tyrosinasegen exprimierende rekombinante MVA-Virus zur Herstellung von rekombinantem Tyrosinaseprotein, das als Antigen in Impfstoffpräparationen verwendet wird, einsetzen. In einem weiteren Beispiel können unter Verwendung des das menschliche Tyrosinasegen exprimierenden rekombinanten MVA-Virus als Expressionsvektor aus einem Tumorpatienten stammende Zellen in vitro so modifiziert werden, daß sie Tyrosinase exprimieren, und dann wieder in den Patienten eingeführt werden, um Antitumor-Immunantworten zu induzieren. Ein auf der Grundlage des das menschliche Tyrosinasegen exprimierenden rekombinanten MVA hergestellter Impfstoff kann entweder parenteral oder lokalisiert am Ort des Tumors eingesetzt werden, um Tumormetastasierung zu verhindern oder den Tumor phänotypisch zu verändern, z. B. hinsichtlich Größe, Form, Zusammensetzung, Vaskularisierung oder anderer Eigenschaften. Ein auf der Grundlage des das menschliche Tyrosinasegen exprimierenden rekombinanten MVA hergestellter Impfstoff kann vor, während oder nach der operativen Entfernung des Tumors eingesetzt werden.
  • Zur Herstellung von Impfstoffen werden die erfindungsgemäßen MVA-Vacciniaviren in eine physiologisch unbedenkliche Form überführt. Dies läßt sich auf Grundlage der Erfahrung bei der Herstellung von zur Impfung gegen, Pocken verwendeten MVA-Impfstoffen bewerkstelligen (wie von Stick, H. et al. [1974 Dtsch. med. Wschr. 99, 2386–2392) beschrieben. Typischerweise werden etwa 106–108 Partikel des rekombinanten MVA in 100 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Phospate-Buffered Saline, PBS) in Gegenwart von 2% Pepton und 1% menschlichem Albumin in einer Ampulle, vorzugsweise einer Glasampulle, gefriergetrocknet. Das Lyophylisat kann Streckmittel (wie z. B. Mannit, Dextran, Zucker, Glycin, Laktose oder Polyvinylpyrrolidon) oder andere für die parenterale Verabreichung geeignete Hilfsstoffe (z. B. Antioxidantien, Stabilisatoren, usw.) enthalten. Die Glasampulle wird dann verschlossen und kann vorzugsweise bei Temperaturen unterhalb –20°C mehrere Monate gelagert werden.
  • Für die Impfung oder Therapie kann das Lyopilisat in 0,1 bis 0,5 ml einer wäßrigen Lösung, vorzugsweise physiologischer Kochsalzlösung, gelöst und dann entweder parenteral, z. B. durch intramuskuläre Inokulation, oder lokal, z. B. durch Inokulation in einen Tumor oder am Ort eines Tumors verabreicht werden. Erfindungsgemäße Impfstoffe oder Therapeutika werden vorzugsweise intramuskulär injiziert (Mayr, A. et al. [1978] Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. B 167, 375–390). Die Art der Verabreichung, die Dosierung sowie die Anzahl an Verabreichungen können vom Fachmann in bekannter Weise optimiert werden. Gegebenenfalls ist es zweckmäßig, den Impfstoff mehrere Male über einen längeren Zeitraum zu verabreichen, um angemessene Immunantworten gegen das Fremdgen zu erhalten.
  • Verwendung rekombinanter MVA-Viren zur Herstellung heterologer Polypeptide
  • Die erfindungsgemäßen rekombinanten MVA-Vacciniaviren können ebenfalls zur Herstellung heterologer Polypeptide in eukaryontischen Zellen verwendet werden. Dazu müssen die Zellen mit den rekombinanten Vacciniaviren infiziert werden. Das für das Fremdpolypeptid codierende Gen wird in den Zellen exprimiert und das exprimierte heterologe Polypeptid dann isoliert. Die für die Produktion solcher heterologer Polypeptide verwendbaren Verfahren sind dem Fachmann allgemein bekannt (EP-A-206,920 und EP-A-205,939). Die mit Hilfe der rekombinanten MVA-Viren produzierten Polypeptide sind aufgrund der speziellen Eigenschaften der MVA-Viren für die Verwendung als Medikamente in Menschen und Tieren besser geeignet.
  • T7-RNA-Polymerase codierende rekombinante MVA-Viren und deren Verwendung zur Expression von DNA-Sequenzen unter der Transkriptionskontrolle eines T7-RNA-Polymerasepromotors
  • In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wurden rekombinante MVA-Viren konstruiert, die die Expression des bakteriophagen T7-RNA-Polymerasegens unter der Kontrolle des frühen/späten Vacciniavirus-Promotorss P7.5 gestatten. Die Nützlichkeit rekombinanter MVA-T7pol-Viren als Expressionssystem wurde in transienten Transfektionsassays zur Induktion der Expression rekombinanter Gene unter der Kontrolle eines T7-RNA-Polymerasepromotors getestet. Unter Verwendung des Chloramphenicol-Acetyltransferase(CAT-)gens als Reportergen wurde festgestellt, daß MVA-T7pol die CAT-Genexpression ebenso wirkungsvoll wie ein von dem Replikations-kompetenten WR-Vacciniavirusstamm abgeleitetes rekombinantes Vaccinia/T7pol-Virus induzierte.
  • Das erfindungsgemäße MVA/T7-Polymerase-Hybridsystem läßt sich somit als einfaches, effizientes und sicheres Säugerexpressionssystem zur Produktion von Polypeptiden bei Abwesenheit produktiver Vacciniavirusreplikation verwenden.
  • Dieses Expressionssystem kann ebenfalls zur Erzeugung rekombinanter Viruspartikel für die Impfung oder Gentherapie eingesetzt werden, indem mit T7-RNA-Polymerase exprimierendem rekombinantem MVA infizierte Zellinien mit DNA-Konstrukten, die alle oder einige der Gene sowie das zur Erzeugung von Viruspartikeln, z. B. MVA-Partikeln oder Retroviruspartikeln, notwendige Genom oder rekombinante Genom unter der Transkriptionskontrolle eines T7-RNA-Polymerasepromotors enthalten, transformiert werden.
  • Retrovirusvektorsysteme bestehen aus zwei Bestandteilen:
    • 1) Bei dem Retrovirusvektor selbst handelt es sich um ein modifiziertes Retrovirus (Vektorplasmid), in dem die für die Virusproteine codierenden Gene durch in die Zielzelle zu übertragende therapeutische Gene und Markergene ersetzt wurden. Da der Austausch der für die Virusproteine codierenden Gene das Virus praktisch inaktiviert, muß dieses durch den zweiten Bestandteil in dem System, durch den die fehlenden Virusproteine an das modifizierte Retrovirus geliefert werden, gerettet werden.
  • Bei dem zweiten Bestandteil handelt es sich um:
    • 2) eine Zellinie, die große Mengen der Virusproteine produziert, jedoch nicht in der Lage ist, replikationskompetentes Virus zu produzieren. Diese Zellinie wird als Verpackungszellinie bezeichnet und besteht aus einer Zellinie, die mit einem oder mehreren Plasmiden, die die die Verpackung des modifizierten Retrovirusvektors ermöglichenden Gene (die gag-, pol- und env-Polypeptide codierenden Gene) tragen, transfiziert ist.
  • Zur Erzeugung des verpackten Vektors wird das Vektorplasmid in die Verpackungszellinie transfiziert. Unter diesen Bedingungen wird das modifizierte Retrovirusgenom, einschließlich der inserierten therapeutischen und Markergene, vom Vektorplasmid transkribiert und in die modifizierten Retroviruspartikel verpackt (rekombinante Viruspartikel). Dieses rekombinante Virus wird dann zur Infektion von Zielzellen verwendet, in denen das Vektorgenom sowie alle darin enthaltenen Marker- bzw. therapeutischen Gene in die DNA der Zielzelle integriert werden. Eine mit einem solchen rekombinanten Viruspartikel infizierte Zelle kann keinen neuen Vektor produzieren, da in diesen Zellen keine Virusproteine vorhanden sind. Im Gegensatz dazu wird die DNA des die therapeutischen und Markergene tragenden Vektors in die DNA der Zelle integriert und kann nun in der infizierten Zelle exprimiert werden.
  • Das erfindungsgemäße, T7-RNA-Polymerase exprimierende rekombinante MVA-Virus kann zur Produktion der für die Verpackung von Retrovirusvektoren benötigten Proteine verwendet werden. Dazu werden die gag-, pol- und env-Gene eines Retrovirus, z. B. des Murine Leukemia Virus (MV) unter die Transkriptionskontrolle eines T7-RNA-Polymerasepromotors in einem oder mehreren Expressionsvektoren (z. B. Plasmiden) gestellt. Die Expressionsvektoren werden dann zusammen mit einem ein Retrovirusvektorkonstrukt, gegebenenfalls unter der Transkriptionskontrolle eines T7-RNA-Polymerasepromotors, tragenden Expressionsvektor in mit dem T7-RNA-Polymerase exprimierenden rekombinanten MVA-Virus infizierte Zellen eingeführt.
  • In WO 94/29437, WO 89/11539 und WO 96/07748 werden unterschiedliche Arten von Retrovirusvektorkonstrukten beschrieben, die mit dem oben beschriebenen Verpackungssystem verpackt werden können.
  • Eine weitere Verwendung der des T7-RNA-Polymerase exprimierenden rekombinanten MVA-Virus besteht in der Erzeugung rekombinanter Proteine, nicht infektiöser Viruspartikel oder infektiöser Virusmutantenpartikel zur Herstellung von Impfstoffen oder Therapeutika (Buchholz et al., Virology, 204, 770–776 (1994) und EP-B1-356695). Dazu werden Virusgene (z. B. die gag-pol- und env-Gene von HIV-1) in einen Expressionsvektor (z. B. Plasmid oder anderes rekombinantes MVA-Virus) unter die Transkriptionskontrolle des T7-Promotors gestellt. Dieses Konstrukt wird dann in mit dem T7-RNA-Polymerase exprimierendem rekombinantem MVA-Virus infizierte Zellen eingeführt. Die rekombinanten Virusgene werden mit hoher Effizienz transkribiert, und die rekombinanten Proteine werden in großen Mengen hergestellt und können dann gereinigt werden. Darüber hinaus können exprimierte rekombinante Virusproteine (z. B. HIV-1 env, gag) zu viralen Pseudopartikeln zusammengebaut werden, die sich von den Zellen abknospen und aus dem Gewebekulturmedium isoliert werden können. In einer weiteren Ausführungsform können Virusproteine (z. B. von HIV, SIV, Masernvirus), die von dem MVA-T7 pol-System exprimiert werden, eine zusätzlich eingeführte Virusmutante (z. B. abgeleitet von HIV, SIV, Masernvirus) retten, indem ein Defekt bei der Anhaftung und Infektion, dem Entpacken, der Nukleinsäurereplikation, der viralen Genexpression, dem Zusammenbau, dem Abknospen oder einem anderen Schritt bei der Virusvermehrung überwunden wird, so daß die Produktion und Reinigung der erwähnten Virusmutante ermöglicht wird.
  • MVA-T7pol läßt sich auch zusammen mit DNA-Sequenzen verwenden, die das Gen eines gewünschten Antigens (z. B. das Gen von HIV, nef, tat, gag, pol oder env oder anderen) zur Immunisierung tragen. Zunächst wird eine codierende Sequenz eines gegebenen Antigens (z. B. HIV, HCV, HPV, HSV, Masernvirus, Influenzavirus oder anderen) unter der Kontrolle eines T7-RNA-Polymerasepromotors vorzugsweise in einem Plasmidvektor cloniert und das erhaltene DNA-Konstrukt amplifiziert und unter Verwendung von Standard-Laborvorschriften gereinigt. Zweitens wird die Vektor-DNA gleichzeitig oder mit entsprechender Zeitverzögerung zusammen mit MVA-T7pol inokuliert. An der Inokulationsstelle wird das gewünschte rekombinante Gen in Zellen, die sowohl die Vektor-DNA als auch MVA-T7pol enthalten, transient exprimiert, wobei das entsprechende Antigen dem Wirtsimmunsystem präsentiert wird, und eine Antigenspezifische Immunantwort stimuliert. Diese Vorschrift unter Verwendung des nicht replizierenden Vacciniavektors MVA-T7pol stellt einen vielversprechenden neuen Ansatz zur Impfung mit Nukleinsäuren dar, wodurch eine effiziente transiente Expression eines gegebenen Antigen ermöglicht, doch das potentielle Risiko einer konstitutiven Genexpression vermieden wird.
  • Die rekombinanten MVA-Vacciniaviren lassen sich wie im folgenden dargelegt herstellen.
  • Ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz, die für ein von direkt neben einer natürlich vorkommenden Deletion, z. B. Deletion II, im MVA-Genom liegenden MVA-DNA-Sequenzen flankiertes Fremdpolypeptid codiert, enthält, wird in mit MVA infizierte Zellen eingeführt, um eine homologe Rekombination zu gestatten.
  • Nach Einführung des DNA-Konstrukts in die eukaryontische Zelle und Rekombination der Fremd-DNA mit der Virus-DNA kann das gewünschte rekombinante Vacciniavirus in an sich bekannter Weise, vorzugsweise mit Hilfe eines Markers, isoliert werden (vergleiche Nakano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1593–1596 [1982], Franke et al., Mol. Cell. Biol. 1918–1924 [1985], Chakrabarti et al., Mol. Cell. Biol. 3403–3409 [1985], Fathi et al., Virology 97-105 [1986]).
  • Das zu inserierende DNA-Konstrukt kann linear oder zirkulär sein. Eine zirkuläre DNA ist bevorzugt, insbesondere ein Plasmid. Das DNA-Konstrukt enthält Sequenzen, die die linke und die rechte Seite einer natürlich vorkommenden Deletion, z. B. Deletion II, im MVA-Genom flankieren (Altenburger, W., Suter, C. P. und Altenburger J. (1989) Arch. Virol. 105, 15–27). Die Fremd-DNA-Sequenz wird zwischen die die natürlich vorkommende Deletion flankierenden Sequenzen inseriert. Bei der Fremd-DNA-Sequenz kann es sich um ein für ein therapeutisches Polypeptid, z. B. t-PA oder Interferon, oder um eine antigene Determinante aus einem Pathogen handeln. Pathogene können Viren, Bakterien und Parasiten, die eine Erkrankung hervorrufen, ebenso wie Tumorzellen, die sich in einem Organismus ungehindert vermehren und somit zu pathologischen Wucherungen führen können, sein. Derartige Pathogene sind beispielsweise in Davis, B. D. et al., (Microbiology, 3. Aufl., Harper International Edition) beschrieben. Bei den Antigenen der Pathogene handelt es sich bevorzugt um die von menschlichen Immunschwächeviren (z. B. HIV-1 und HIV-2), von Tuberkulose verursachenden Mycybakterien, den Parasiten Plasmodium falciparum sowie von Melanomzellen.
  • Zur Expression einer DNA-Sequenz oder eines Gens müssen regulatorische Sequenzen, die für die Transkription des Gens benötigt werden, auf der DNA vorhanden sein. Solche regulatorischen Sequenzen (Promotoren genannt) sind dem Fachmann bekannt und schließen beispielsweise diejenigen des Vaccinia-ll-kDa-Gens, wie in EP-A-198, 328 beschrieben, sowie diejenigen des 7,5 kDA-Gens (EP-A-110,385) ein.
  • Das DNA-Konstrukt kann in die MVA-infizierten Zellen durch Transfektion, beispielsweise mittels Calciumphosphatpräzipitation (Graham et al., Virol. 52, 456–467 [1973]; Wigler et al., Cell 777–785 [1979], mittels Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1, 841–845 [1982]), mittels Mikroinjektion (Graessmann et al., Meth. Enzymology 101, 482–492 (1983)), mittels Liposomen (Straubinger et al., Methods in Enzymology 101, 512–527 (1983)), mittels Sphäroplasten (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2163–2167 (1980)) oder mit anderen dem Fachmann bekannten Verfahren einführen. Die Transfektion mittels Calciumphosphatpräzipation ist bevorzugt.
  • Die nachfolgenden ausführlichen Beispiele sollen zu einem besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung beitragen. Dabei soll jedoch nicht der Eindruck erweckt werden, daß die Erfindung auf die Gegenstände der Beispiele beschränkt ist.
  • Zeichnungen
  • 1: Schematische Karte des MVA-Genoms und des Plasmids zur Insertion von Fremd-DNA mittels homologer Rekombination: HindIII-Restriktionsstellen innerhalb des MVA-Genoms sind oben angegeben. Das die Verbindungsstelle der Deletion II im MVA-Genom überlappende 900-bp große HindIII-HindIII-N-Fragment ist dargestellt. Direkt neben der Deletion II liegende MVA-DNA-Sequenzen (flank1 und flank2) wurden mit PCR amplifiziert und zur Konstruktion des Insertionsplasmids pUC II LZ verwendet.
  • 2: pUC II LZ P7,5: MVA-Vektorplasmid zur Insertion in die Deletion II, das die P11-LacZ-Expressionskassette und den frühen/späten Vacciniavirus-Promotor P7.5 zur Expression gewünschter Gene, die in die SmaI-Stelle des Plasmids cloniert werden können, enthält.
  • 3: pUCII LZdel P7.5: MVA-Vektorplasmid zur Insertion von Fremdgenen an der Position der Deletion II im MVA-Genom, wobei das Plasmid eine selbst-deletierende P11-LacZ-Expressionskassette und den frühen/späten Vacciniaviruspromotor P7.5 zur Expression gewünschter Gene, die in die Sma1/Not1-Clonierungsstelle des Plasmids cloniert werden können, enthält.
  • 4: Konstruktion des rekombinanten Virus MVA-T7pol: schemtische Karten des MVA-Genoms (HindIII-Restriktionsendonukleasestellen) und des Vektorplasmids pUC II LZ T7pol, das die Insertion des T7-RNA-Polymerasegens an der Position der Deletion II innerhalb des HindIII-N-Fragments des MVA-Genoms gestattet.
  • 5: Southern-Blot-Analyse von MVA-T7pol-Virus-DNA
  • 6: Metabolische Markierung von Proteinen mit 35S]-Methionin. SDS-PAGE-Analyse. Spur 1: MVA-T7pol, Spur 2: MVA, Spur 3: CV-1-Zellen.
  • 7 CAT-Assay: CV-1-Zellen, die mit einem das CAT-Gen unter der Kontrolle des T7-RNA-Polymerasepromotors enthaltenden Plasmid transfiziert und mit MVA-T7/pol oder WR-T7pol infiziert sind. Die Lysate wurden auf CAT-Aktivität getestet. C steht für Chloramphenicol, und 1-AcC bzw. 3-AcC steht für die mono- bzw. triacetylierten Formen von Chloramphenicol. Die Cat-Aktivität ist als Prozent acetyliertes Produkt, gebildet in 60 min, ausgedrückt.
  • 8 Konstruktion von MVA-LAInef: schematische Karten des MVA-Genoms (HindIII-Restriktionsendonukleasestellen) und des Vektorplasmids pUC II LZdel P7.5-LAInef, das die Insertion des nef-Gens von HIV-1- LAI an der Position der Deletion II innerhalb des HindIII-N-Fragments des MVA-Genoms gestattet.
  • 9 Konstruktion von MVA-hTYR: schematische Karten des MVA-Genoms (HindIII-Restriktionsendonukleasestellen) und des Vektorplasmids pUC II LZdel P7.5-TYR, das die Insertion des menschlichen Tyrosinasegens an der Position der Deletion II innerhalb des HindIII-N-Fragments des MVA-Genoms gestattet.
  • Beispiele
  • 1. Anzucht und Reinigung der Viren
  • 1.1 Anzucht des MVA-Virus
  • Bei dem MVA-Virus handelt es sich um ein stark abgeschwächtes Vacciniavirus, das von dem Vacciniavirusstamm Ankarta (CVA) durch serielle Langzeitpassagierungen in primären Hühnerembryo-Fibroblasten (Chicken Embryo Fibroblast, CEF)-Kulturen abgeleitet wurde. Bezüglich eines allgemeinen Überblicks über die Geschichte der Produktion, den Eigenschaften und der Verwendung des MVA-Stamms wird auf die von Mayr et al. in Infection 3, 6–14 [1975) veröffentlichte Zusammenfassung verwiesen. Aufgrund der Abschwächung in CEF repliziert das MVA-Virus mit hohen Titer in dieser Vogelwirtszelle. In Säugerzellen ist dagegen das Wachstum von MVA stark eingeschränkt, und die von dem Virus gebildeten typischen Plaques sind nicht nachweisbar. Daher wurde das MVA-Virus in CEF-Zellen angezogen. Zur Herstellung von CEF-Zellen wurden 11 Tage alte Embryos aus bebrüteten Hühnereiern isoliert, die Gliedmassen abgetrennt und die Embryos zerkleinert und in einer Lösung aus 0,25% Trypsin 20 Minuten bei 37°C dissoziiert. Die erhaltene Zellsuspension wurde filtriert und die Zellen durch 5minütige Zentrifugation bei 2000 UpM in einer Sorvall-RC-3B-Zentrifuge bei Raumtemperatur sedimentiert, in 10 Volumen Medium A (MEM Eagle, beispielsweise erhältlich von Life Technologies Gmbh; Eggenstein, Deutschland) resuspendiert und nochmals durch 5minütige Zentrifugation bei 2000 UpM in einer Sorvall-RC-3B-Zentrifuge bei Raumtemperatur sedimentiert. Das Zellpellet wurde im Medium A mit 10% fötalem Kälberserum (Fetal Calf Serum, FCS), Penicillin (100 Einheiten/ml), Streptomycin (100 mg/ml) und 2 mM Glutatmin rekonstituiert, wobei eine Zellsuspension mit 500000 Zellen/ml erhalten wurde. Die auf diese Weise erhaltenen CEF-Zellen wurden auf Zellkulturschalen verteilt. Sie wurden dann 1–2 Tage, je nach der gewünschten Zelldichte, im Medium A in einem CO2-Brutschrank bei 37°C wachsen gelassen und dann entweder direkt oder nach einer weiteren Zellpassagierung zur Infektion verwendet. Eine ausführliche Beschreibung der Herstellung von Primärkulturen findet sich in dem Buch von R. I. Freshney, „Culture of Animal Cell", Alan R. Liss Verlag, New York [1983], Kapitel 11, Seite 99 und folgende.
  • MVA-Viren wurden zur Infektion wie folgt verwendet. Die CEF-Zellen wurden in 175 cm2-fassenden Zellkulturflaschen kultiviert. Bei 90-100% Konfluenz wurde das Medium entfernt und die Zellen eine Stunde mit einer MVA-Virussuspension (0,01 infektiöse Einheiten (Infectious Units, IU) pro Zelle, 0,02 ml/cm2) im Medium A inkubiert. Danach wurde weiteres Medium A zugegeben (0,2 ml/cm2)und die Flaschen bei 37°C 2–3 Tage inkubiert (bis etwa 90% der Zellen einen zytopathogenen Effekt zeigen). Rohe Virus-Stammlösungen wurden hergestellt, indem Zellen-Monolayers durch Abschaben in das Medium überführt und das Zellmaterial durch 5minütige Zentrifugation bei 3000 UpM in einer Sorvall-RC-3B-Zentrifuge bei 4°C pellettiert wurden. Die Virus-Rohpräparation wurde vor der weiteren Verarbeitung (z. B. Virusreinigung) bei –20°C gelagert.
  • 1.2 Reinigung der Viren
  • Die zur Erhaltung einer Viruspräparation, die so rein wie möglich und frei von wirtszellspezifischen Bestandteilen war, unternommenen Reinigungsschritten ähnelten den von Joklik (Virology 18, 9–18 [1962]) beschriebenen. Rohe Virus-Stammlösungen, die bei – 20°C gelagert worden waren, wurden aufgetaut und in PBS (10-20faches Volumen des Sediments) einmal suspendiert und die Suspension danach wie oben zentrifugiert. Das neue Sediment wurde im 10fachen Volumen Tris-Puffer 1 (10 mM Tris-HCl pH 9,0) suspendiert und die Suspension danach kurz mit Ultraschall behandelt (Labsonic L, B. Braun Biotech International, Melsungen, Deutschland; 2 × 10 Sekunden bei 60 Watt und Raumtemperatur), um die Zelltrümmer weiter zu zerkleinern und die Viruspartikel aus dem Zellmaterial freizusetzen. Die Zellkerne und größeren Zelltrümmer wurden in der nachfolgenden kurzen Zentrifugation der Suspension abgetrennt (Sorvall-GSA-Rotor, erhältlich von DuPont Co., D-63533 Bad Nauheim, 3 Minuten bei 3000 UpM und 10°C). Das Sediment wurde wiederum in Tris-Puffer 1 suspendiert, mit Ultraschall behandelt und wie oben beschrieben zentrifugiert. Die gesammelten Überstände, die die freien Viruspartikel enthielten, wurden vereinigt und über ein Kissen aus 10 ml 36% Saccharose in 10 mM Tris-HCl, pH 9,0 geschichtet und in einem Beckman-SW-27/SW-28-Rotor 80 Minuten bei 13500 UpM und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das die Viruspartikel enthaltende Sediment in 10 ml 1 mM Tris-HCl, pH 9,0 aufgenommen, durch kurze Ultraschallbehandlung (2 × 10 Sekunden bei Raumtemperatur, Gerät wie obn beschrieben) homogenisiert und auf einen 20–40% Saccharosegradienten (Saccharose in 1 mM Tris-HCl, pH 9,0) zur weiteren Reinigung aufgetragen. Der Gradient wurde in einem Beckmann-SW-41-Rotor 50 Minuten bei 13000 UpM und 4°C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden Viruspartikel enthaltende diskrete Banden durch Pipettieren nach Absaugen des jeweils oberhalb der Bande befindlichen Volumens geerntet. Die erhaltene Saccharoselösung wurde mit drei Volumen PBS verdünnt und die Viruspartikel wurden wiederum durch Zentrifugation sedimentiert (Beckmann-SW 27/28-Rotor 60 Minuten bei 13000 UpM und 4°C). Das Pellet welches nun weitgehend aus reinen Viruspartikeln bestand, wurde in PBS resuspendiert und auf durchschnittlich 1–5 × 109 IU/ml entsprechende Viruskonzentrationen äquilibriert. Die gereinigte Virus-Stammlösung wurde bei –80°C gelagert und entweder direkt oder mit PBS verdünnt für nachfolgende Experimente verwendet.
  • 1.3 Klonierung des MVA-Virus
  • Zur Herstellung homogener Virus-Stammpräparationen wurde das von Prof. Anton Mayr erhaltene MVA-Virus durch limitierende Verdünnung während drei aufeinanderfolgender- Passagierungen in auf 96-Well-Gewebekulturplatten kultivierten CEF-Zellen kloniert. Der MVA-Klon F6 wurde ausgewählt und in CEF-Zellen amplifiziert, so daß Arbeitsstammlösungen an Virus erhalten wurden, die als Startmaterial für die Erzeugung in dieser Patentanmeldung beschriebener rekombinanter MVA-Viren ebenso wie für die Erzeugung zuvor beschriebener rekombinanter MVA-Viren (Sutter, G. und Moss, B. [1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847–10851; Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bannink, J. und Moss, B. [1994] Vaccine 12, 1032–1040; Hirsch, V., Fuerst, T., Sutter, G., Caroll, M., Yang, L., Goldstein, S., Piatak, M., Elkins, W., Alvord, G., Montefiori, D., Moss, B. und Lifson, J. [1996] J. Virol. 70, 3741–3752) dienten.
  • 2. Konstruktion und Charakterisierung rekombinanter MVA-Viren
  • 2.1. Konstruktion der Vektorplasmide
  • Um die Erzeugung rekombinanter MVA-Viren zu ermöglichen, wurden neuartige Vektorplasmide konstruiert. Die Insertion von Fremdgenen in das MVA-Genom wurde genau auf die Position der natürlich vorkommenden Deletion II im MVA-Genom gerichtet. MVA-DNA-Sequenzen, die die Position einer 2500 bp großen Deletion im HindIII-N-Fragment des MVA-Genoms flankieren (Altenburger, W., Suter, C. P. und Altenburger, J. [1989], J. Arch. Virol. 105, 15–27) wurden mit PCR amplifiziert und in die multiple Klonierungsstelle des Plasmids pUC18 kloniert. Bei den Primern für die linke, 600 bp lange DNA-Flanke handelte es sich um 5' -CAG CRG GGT ACC CTC ATC GTA CAG GAC GTT CTC-3' und 5'-CAG CAG CCC GGG TAT TCG ATG ATT ATT TTT AAC AAA ATA ACA-3' (die Stellen für die Restriktionsenzyme KpnI und SmaI sind unterstrichen). Bei den Primern für die rechte, 550 bp große DNA-Flanke handelte es sich um 5'-CAG CAG CTG CAG GAA TCA TCC ATT CCA CTG AAT AGC-3' und 5'-CAG CAG GCA TGC CGA CGA ACA AGG AAC TGT AGC AGA-3' (die Stellen für die Restriktionsenzyme PstI und SphI sind unterstrichen). Zwischen diese in pUC18 inserierten flankierenden MVA-DNA-Sequenzen wurde das IacZ-Gen aus Escherichia coli unter der Kontrolle des späten Vacciniavirus-Promotors P11 (durch Restriktionsverdau hergestellt aus pIII LZ, Sutter, G. und Moss, B. [1992] PNAS USA 89, 10847–10851) unter Verwendung der BamHI-Stelle inseriert, so daß der MVA-Insertionsvektor pUCII LZ [1] erhalten wurde. Daraufhin wurde ein 289 bp großes Fragment, das den frühen-späten Vacciniavirus-Promotor P7.5 zusammen mit einer SmaI-Stelle zum Klonieren (durch Restriktionsverdau mit EcoRI und XbaI hergestellt aus dem Plasmidvektor pSC11 [Chakrabarti et al. 1985, Molecular and Cellular Biology 5, 3403–3409] enthielt, in die SmaI-Stelle von pUCII LZ unter Erhalt des MVA-Vektors pUC II LZ P7.5 inseriert [2]. Zur Konstruktion eines Vektorplasmids, das die Isolierung rekombinanter MVA-Viren über transiente Synthese des Reporterenzyms β-Galactosidase gestattet, wurde ein 330 bp großes DNA-Fragment vom 3'-Ende des offenen Leserasters von E. coli LacZ mit PCR amplifiziert (die Primer waren 5'-CAG CAG GTC GAC CCC GAC CGC CTT ACT GCC-3' und 5'-GGG GGG CTG CAG ATG GTA GCG ACC GGC GCT CAG-3') und in die SalI- und PstI-Stellen von pUC II LZ P7.5 unter Erhalt des MVA-Vektors pUC II LZdel P7.5 kloniert [3]. Unter Verwendung der Sma1-Stelle kann dieses Vektorplasmid zur Insertion von DNA-Sequenzen, die ein Fremdgen unter der Transkriptionskontrolle des Vacciniavirus-Promotors P7.5 codieren, in das MVA-Genom verwendet werden. Nach Isolierung des gewünschten rekombinanten Virus durch Screening auf die Expression der β-Galactosidaseaktivität führte die weitere Vermehrung des rekombinanten Virus zur Selbstdeletion der wieder konstruierten P11-LacZ-Expressionskassette durch homologe Rekombination.
  • 2.2. Konstruktion und Charakterisierung des rekombinanten Virus MVA T7pol
  • Ein 3,1 kbp großes DNA-Fragment, das das vollständige Gen der Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase unter der Kontrolle des frühen/späten Vacciniavirus-Promotors P7.5 enthielt, wurde mit EcoRI aus dem Plasmid pTF7-3 (Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W. und Moss, B., 1986, P.N.A.S. USA 83, 8122–8126) ausgeschnitten, durch Inkubation mit Klenow-DNA-Polymerase zur Erzeugung von stumpfen Ende modifiziert und in eine einzige Smal-Restriktionsstelle von pUCII LZ cloniert, so daß der Plasmid-Transfervektor PUCII LZ T7pol erhalten wurde [4j]. Als Transkriptionsregulator für die Expression des T7-RNA-Polymerasegens wurde der frühe/späte Vacciniavirus-Promotor P7.5 gewählt. Im Gegensatz zu stärkeren späteren Vacciniavirus-Promotoren (z. B. P11) gestattet dieses Promotorsystem die Expression rekombinanter Gene unmittelbar nach Infektion der Zielzellen. Das Plasmid pUCII LZ T7pol, welches die Insertion der Fremdgene in die Position der Deletion II des MVA-Genoms steuert, wurde zur Erzeugung des rekombinanten Virus MVA T7pol verwendet.
  • Mit MVA mit einer Multiplizität von 0,05 TCID50 pro Zelle infizierte CEF-Zellen wurden mit DNA des Plasmids pUCII LZ T7pol wie zuvor beschrieben transfiziert (Sutter, G, Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. und Moss, B. (1994) Vaccine 12, 1032–1040). Das die T7-RNA-Polymerase exprimierende und β-D-Galactosidase co-exprimierende rekombinante MVA-Virus (MVA P7.5-T7pol) wurde mittels fünf aufeinanderfolgender Plaquereinigungsrunden in mit 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-Dgalactosid (300 μg/ml) gefärbten CEF-Zellen selektioniert. Anschließend wurden rekombinante Viren durch Infektion von CEF-Monolagern amplifiziert und die DNA mit PCR zur Bestätigung der genetischen Homogenität der Virus-Stammlösung analysiert. Durch Southern-Blot-Analyse der MVA-T7pol-Virus-DNA wurde die stabile Integration der rekombinanten Gene an der Position der Deletion II im MVA-Genom demonstriert [5].
  • Zur Überwachung der Expression T7-RNA-Polymerase durch rekombinantes MVA-T7pol, wurden mit [35S]-Methioninmarkierte Polypeptide aus virusinfizierter Gewebekultur analysiert. In 12-Well-Platten angezogene Monolayer der Affennieren-Zellinie CV-1 wurden mit Virus mit einer Multiplizität von 20 TCIDS50 pro Zelle infiziert. 3 bis 5 Stunden nach Infektion wurde das Medium entfernt und die Kulturen einmal mit 1 ml Methioninfreiem Medium gewaschen. In jedes Well wurde jeweils 0,2 ml Methionin-freies Medium, supplementiert mit 50 μ Ci [35S]-Methionin, gegeben und 30 min bei 37°C inkubiert. Cytoplasmaextrakte infizierter Zellen wurden durch 10minütige Inkubation jedes Wells in jeweils 0,2 ml 0,5% Nonidet P-40-Lysepuffer bei 37°C hergestellt und die Proben durch SDS-PAGE analysiert. Die metabolische Markierung der CV-1-Zellen mit MVA T7pol zeigte die Synthese zweier zusätzlicher Polypeptide (i) eines Proteins von etwa 116000 Da, das die zur Ermöglichung des Screenings auf rekombinantes Virus coexprimierte E. coli-β-Galactosidase darstellt, und (ii) eines 98000 Da großen Proteins mit der erwarteten Größe der Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase [6]. Die von MVA-T7pol produzierte große Menge an β-Galactosidase ist bemerkenswert. Die Ergebnisse der in-vivo-Markierungsexperimente zeigen eine sehr starke Expression des P11-1acZ-Genkonstrukts, wenn es in das MVA-Genom an der Position der Deletion II inseriert ist, was darauf hindeutet, daß rekombinante Gene in MVA-Vektorviren effizienter exprimiert werden könnten, wenn sie in dieses Locus des MVA-Genoms inseriert würden.
  • Die Eignung der rekombinanten MVA-T7po1-Viren als Expressionssystem im Vergleich mit dem rekombinanten WR-T7pol-Virus vTF7-3 (Fuerst et al. 1986) wurde durch die Cotransfektion von DNA eines Plasmidvektors, der von pTM1 abgeleitet ist (Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W. A. und Fuerst T. R. (1990) Nature 348, 91–92) und das (in die Ncol und BamHI-Stellen der multiplen Klonierungsstelle von pTM1 klonierte) E. coli-Chlorampheniol-Acetyltransferase(CAT-)Gen unter der Kontrolle eines T7-RNA-Polymerasepromotors (PT7) enthält, getestet. Die transfizierten und infizierten CV-1-Zellen wurden in 0,2 ml 0,25 M Tris-HCl (pH 7,5) suspendiert. Nach drei Freeze-Thaw-Zyklen wurden die Lysate durch Zentrifugation geklärt, der Proteingehalt der Überstände bestimmt und Proben mit 0,5, 0,25, 0,1 μg Gesamtprotein auf Enzymaktivität, wie von Mackett, M., Smith, G. L. und Moss, B. (1984) J. Virol. 49, 857–864 beschrieben, getestet. Nach der Autoradiographie wurden die markierten Punkte unter Verwendung des Fuji-Bildanalysesystems quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, daß man durch Verwendung des stark abgeschwächten Vacciniavektors MVA das Vacciniavirus-T7-RNA-Polymerasesystem ebenso effizient nutzen kann, wie bei Verwendung eines vollreplikationskompetenten rekombinanten Vacciniavirus [7J.
  • 2.3. Konstruktion und Charakterisierung des rekombinanten Virus MVA-LAInef
  • Ein 648 bp großes DNA-Fragment, das das vollständige nef-Gen von HIV-1 LAI enthielt, wurde mittels PCR aus Plasmid-DNA (pTG1166, freundlicherweise von M. -P. Kieny, Transgene S. A., Straßburg, zur Verfügung gestellt; PCR-Primer waren 5'-CAG CAG GGA TCC ATG GGT GGC AAG TGG TCR AAA AGT AGT-3', und 5'-CAG CAG GGA TCC ATG TCA GCA GTT CTT GAA GTA CTC CGG-3') hergestellt, mit der Restriktionsendonuklease BamHI verdaut, durch Inkubation mit Klenow-DNA-Polymerase zur Erzeugung stumpfer Enden modifiziert und in die SmaI-Stelle von pUC II LZdel P7.5 kloniert, so daß der Vektor pUC II LZdel P7,5-LAInef erhalten wurde [8]. Dieses Plasmid konnte zur Konstruktion eines rekombinantn MVA-Virus verwendet werden, das das nef-Gen von HIV-1 LAI unter der Kontrolle des frühen/späten Vacciniavirus-Promotors P7.5 exprimiert.
  • Mit MVA mit einer Multiplizität von 0,05 TCID50 pro Zelle infizierte CEF-Zellen wurden mit DNA des Plasmids pUC II LZdel P7.5-LAInef wie zuvor beschrieben transfiziert (Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. und Moss, B. [1994] Vaccine 12, 1032–1040). Rekombinante MVA-Viren die das nef-Gen enthielten und das E. coli-LacZ-Markergen transient coexprimierten, wurden durch aufeinanderfolgende Plaquereinigungsrunden in mit 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-Galactosid (300 μg/ml) gefärbten CEF-Zellen selektioniert. Danach wurden rekombinante MVA-Viren, die das nef-Gen enthielten und in denen das LacZ-Markergen deletiert war, über drei zusätzliche aufeinanderfolgende Runden von Plaquereinigungsscreening auf nicht färbende virale Foci in CEF-Zellen in Gegenwart von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-Galactosid (300 μg/ml) isoliert. Rekombinante Viren wurden anschließend durch Infektion von CEF-Monolayern amplifiziert, und die MVA-LAInef-Virus-DNA wurde mittels PCR zur Bestätigung der genetischen Homogenität der Virus-Stammlösung analysiert. Durch Southern-Blot-Analyse der Virus-DNA wurde die genetische Stabilität von MVA-LAInef bestätigt und die Integration des nef-Gens und Deletion des E. coli-LacZ-Markergens an der Position der Deletion II im Virusgenom präzise gezeigt.
  • Die effiziente Expression des rekombinanten Nef-Proteins wurde durch Western-Blot-Analyse von Proteinlysaten aus mit MVA-LAInef-infizierten CEF-Zellen unter Verwendung von gegen HIV-1-nef gerichteten monoklonalen Maus-Antikörpern (freundlicherweise von K. Krohn zur Verfügung gestellt und wie von Ovod, V., Lagerstedt, A., Ranki, A., Gombert, F., Spohn, R., Tähtinen, M., Jung, G. und Krohn, K. [1992] AIDS 6, 25–34 beschrieben verwendet) bestätigt.
  • 2.4. Konstruktion und Charakterisierung des rekombinanten Virus MVA-hTYR
  • Ein 1,9 kb großes DNA-Fragment, das das vollständige, die menschliche Tyrosinase codierende Gen [Tyrosinase c-DNA-Klon 123.B2, isoliert aus der Melanom-Zellinie SK29-MEL des Patienten SK29 (AV), GenBank Acc. Nr. UO1873; Brichard, V., Van Pel, A., Wölfel, T., Wölfel, C., De Plaen, E., Lethé, B., Coulie, P. und Boon, B. (1993), J. Exp. Med. 178, 489–495] enthielt, wurde aus dem Plasmid pcDNAI/Amp-Tyr [Wölfel, T., Van Pel, A., Brichard, V., Schneider, J., Seliger, B., Meyer zum Büschenfelde, K. und Boon, T. (1994) Eur. J. Immunol 24, 759–764] durch EcoRI-Verdau präpariert, durch Inkubation mit Klenow DNA-Polymerase zur Erzeugung stumpfer Enden modifiziert und die Smal-Stelle von pUC II LZdel P7.5 kloniert, so daß der Vektor pUC II LZdel P7.5-TYR erhalten wurde [9]. Dieses Plasmid könnte zur Konstruktion eines rekombinanten MVA-Virus verwendet werden, das die das menschliche Tyrosinasegen unter der Kontrolle des frühen/späten Vacciniavirus-Promotors P7.5 exprimiert.
  • Mit MVA mit einer Multiplizität von 0,05 TCID50 pro Zelle infizierte CEF-Zellen wurden mit DNA des Plasmids pUC II LZdel P7.5-TYR wie zuvor beschrieben transfiziert (Sutter, G, Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. und Moss, B. (1994) Vaccine 12, 1032–1040). Rekombinantes MVA-Virus, das das Gen für menschliche Tyrosinase stabil exprimiert und das E. coli-LacZ-Gen transient coexprimiert, wurde durch aufeinanderfolgende Plaquereinigungsrunden in mit 5-Brom-4-chlor-3-indolylβ-D-galactosid (300 μg/ml) gefärbten CEF-Zellen selektioniert. Danach wurde das rekombinante MVA-Virus, das das menschliche Tyrosinase codierende Gen exprimierte und in dem das LacZ-Markergen deletiert war, mittels drei zusätzlicher aufeinanderfolgender Runden von Plaquereinigungsscreening auf nicht färbende virale Foci in CEF-Zellen in Gegenwart von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-Glactosid (300 μg/ml) isoliert. Anschließend wurden rekombinante Viren durch Infektion von CEF-Monolayern amplifiziert und die MVA-hTYR-Virus-DNA mittels PCR zur Bestätigung der genetischen Homogenität der Virus-Stammlösung analysiert. Durch Southern-Blot-Analyse der Virus-DNA wurde die genetische Stabilität von MVA-hTYR bestätigt und die Integration des rekombinanten Tyrosinasegens und Deletion des E. coli-LacZ-Markergens an der Position der Deletion II im Virusgenom präzise demonstriert.
  • Die effiziente Expression der rekombinanten menschlichen Tyrosinase wurde durch Western-Blot-Analyse von Proteinlysaten aus mit MVA-hTYR-infizierten CEF-Zellen unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern (freundlicherweise von V. Hearing zur Verfügung gestellt und wie von Jimenez, M., Kameyama, K., Maloy, L., Tomita, Y. und Hearing, V. [1988] P.N.A.S. USA 85, 3830–3834 beschrieben verwendet) oder monoklonalen Maus-Antikörpern (freundlicherweise von L. Old zur Verfügung gestellt und wie von Chen, Y., Stockert, E., Tsang, S., Coplan, K. und Old, L. [1995] P.N.A.S. USA 92, 8125–8129 beschrieben verwendet), jeweils gerichtet gegen Tyrosinase, bestätigt.
  • SEQUENZPROTOKOLL
  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001

Claims (25)

  1. Rekombinantes MVA-Virus, welches wenigstens ein an der Position einer der natürlich vorkommenden Deletionsstellen I, II, IV, V oder VI im MVA-Genom inseriertes Fremdgen enthält und exprimieren kann.
  2. Rekombinantes MVA-Virus nach Anspruch 1, welches wenigstens ein an der Position der Deletion II im MVA-Genom inseriertes Fremdgen enthält und exprimieren kann.
  3. Rekombinantes MVA-Virus nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Fremdgen für einen Marker, ein Therapeutikum, ein Antigen oder eine antigene Determinante codiert.
  4. Rekombinantes MVA-Virus nach Anspruch 3, wobei das Fremdgen für ein Antigen oder eine antigene Determinante aus einem pathogenen Virus, einem Bakterium oder einem anderen Mikroorganismus oder aus einem Parasiten oder einer Tumorzelle codiert.
  5. Rekombinantes MVA-Virus nach Anspruch 4, wobei das Fremdgen für ein Antigen oder eine antigene Determinante aus Plasmodium falciparum, Mycobakterien, Herpesvirus, Influenzavirus, Hepatitisviren oder menschlichen Immunschwächeviren codiert.
  6. Rekombinantes MVA-Virus nach Ansprüchen 3 bis 5, wobei es sich bei dem Antigen oder der antigenen Determinante um HIV-nef oder menschliche Tyrosinase handelt.
  7. Rekombinantes MVA-Virus nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Fremdgen für T7-RNA-Polymerase codiert.
  8. Rekombinantes MVA-Virus nach Ansprüchen 1 bis 7, wobei das Fremdgen unter der Transkriptionskontrolle des frühen/späten Vacciniavirus-Promotors P7.5 steht.
  9. Rekombinantes MVA-Virus nach Ansprüchen 1 bis 8, im wesentlichen frei von zur Replikation in menschlichen Zellen fähigen Viren.
  10. Verwendung des rekombinanten MVA-Virus nach Anspruch 7 zur in-vitro-Transkription von DNA-Sequenzen unter der Transkriptionskontrolle eines T7-RNA-Polymerasepromotors.
  11. Isolierte eukaryontische Zelle, infiziert mit einem rekombinanten MVA-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
  12. Eukaryontische Zelle nach Anspruch 11, zusätzlich enthaltend einen oder mehrere Expressionsvektoren, der bzw. die ein oder mehrere Fremdgene unter der Transkriptionskontrolle eines T7-RNA-Polymerasepromotors trägt bzw. tragen.
  13. Verwendung der eukaryontischen Zellen nach Anspruch 11 oder 12 zur Herstellung der durch die Fremdgene codierten Polypeptide in vitro, umfassend: a) Kultivieren der Zellen unter geeigneten Bedingungen sowie b) Isolieren der durch die Fremdgene codierten Polypeptide.
  14. Eukaryontische Zelle nach Anspruch 11 oder 12, zusätzlich enthaltend Expressionsvektoren, die Virusgene tragen, und/oder ein Virusvektorkonstrukt, das das Genom eines Virusvektors unter der Transkriptionskontrolle eines T7-RNA-Polymerasepromotors codiert.
  15. Verwendung der eukaryontischen Zellen nach Anspruch 14 zur Herstellung von Viruspartikeln in vitro, umfassend: a) Kultivieren der Zellen unter geeigneten Bedingungen sowie b) Isolieren der Viruspartikel.
  16. Eukaryontische Zelle nach Anspruch 11, 12 oder 14, zusätzlich enthaltend a) einen ein Retrovirusvektorkonstrukt, das Zielzellen infizieren und ein oder mehrere von dem Retrovirusvektorkonstrukt getragene Fremdgene darin exprimieren kann, tragenden Expressionsvektor sowie b) einen oder mehrere, die die zur Verpackung des Genoms des Retrovirusvektorkonstrukts benötigten Polypeptide codierenden Gene unter der Transkriptionskontrolle eines T7-RNA-Polymerasepromotors tragende Expressionsvektoren.
  17. Verwendung der eukaryontischen Zellen nach Anspruch 16 zur Herstellung von Retroviruspartikeln in vitro, umfassend: a) Kultivieren der Zellen unter geeigneten Bedingungen sowie b) Isolieren der Retroviruspartikel.
  18. Impfstoff, enthaltend ein rekombinantes MVA-Virus nach Ansprüchen 1 bis 9 in einem physiologisch unbedenklichen Trägerstoff.
  19. Verwendung des rekombinanten MVA-Virus nach Ansprüchen 1 bis 19 zur Herstellung eines Impfstoffs.
  20. Rekombinantes MVA-Virus nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 9 und/oder Impfstoff nach Anspruch 18 zur Immunisierung eines lebenden tierischen Organismus, einschließlich eines Menschen.
  21. Impfstoff nach Anspruch 18, enthaltend das das HIV-nef-Gen beinhaltende rekombinante MVA, zur Vorbeugung gegen oder Behandlung von HIV-Infektion oder AIDS.
  22. Impfstoff nach Anspruch 18, enthaltend das das menschliche Tyrosinasegen beinhaltende rekombinante MVA, zur Vorbeugung gegen Melanome oder Behandlung derselben.
  23. Impfstoff, enthaltend als ersten Bestandteil ein rekombinantes MVA-Virus nach Anspruch 7 in einem physiologisch unbedenklichen Trägerstoff und als zweiten Bestandteil eine ein Antigen oder eine antigene Determinante unter der Transkriptionskontrolle eines T7-RNA-Polymerasepromotors tragende DNA-Sequenz in einem physiologisch unbedenklichen Trägerstoff, wobei die beiden Bestandteile zusammen oder einzeln enthalten sind.
  24. Impfstoff nach Anspruch 23 zur Immunisierung eines lebenden tierischen Organismus, einschließlich eines Menschen.
  25. Verwendung des rekombinanten MVA-Virus nach Anspruch 7 zur Herstellung eines Impfstoffs nach Anspruch 23 oder 24.
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