ES2199294T3 - Virus mva recombinante, y el uso del mismo. - Google Patents

Virus mva recombinante, y el uso del mismo.

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Abstract

VIRUS AVM RECOMBINANTES QUE CONTIENEN Y SON CAPACES DE EXPRESAR GENES EXTRAÑOS QUE SE INTRODUCEN EN EL LUGAR DONDE SE PRODUCE UNA DELECION DE FORMA NATURAL DENTRO DEL GENOMA AVM, Y USO DE DICHOS GENES AVM RECOMBINANTES PARA LA PRODUCCION DE POLIPEPTIDOS, COMO ANTIGENOS O AGENTES TERAPEUTICOS, Y PARA LA PRODUCCION DE VIRUS RECOMBINANTES PARA VACUNAS O VECTORES VIRICOS PARA TERAPIA GENICA.

Description

Virus MVA recombinante, y el uso del mismo.
La presente invención se refiere a virus vaccinia recombinantes derivados del virus vaccinia modificado Ankara (MVA) y que contienen y son capaces de expresar genes extraños que se insertan en el sitio de una deleción existente naturalmente en el genoma del MVA, y al uso de tales virus MVA recombinantes para la producción de polipéptidos, v.g. antígenos o agentes terapéuticos, o vectores víricos para terapia génica, y al uso de tales virus MVA recombinantes que codifican antígenos como vacunas.
Objetos de la Invención
Es el objeto de la presente invención proporcionar un virus MVA recombinante que puede servir como vector de expresión eficiente y excepcionalmente seguro.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método simple, eficiente y seguro para la producción de polipéptidos, v.g. antígenos o agentes terapéuticos, virus recombinantes para vacunas y vectores víricos para terapia génica.
Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar un sistema de expresión basado en un virus MVA recombinante que expresa RNA-polimerasa T7, y métodos para la producción de polipéptidos, v.g. antígenos o agentes terapéuticos, o para generar vectores víricos para terapia génica o vacunas, basados en este sistema de expresión.
Antecedentes de la invención
El virus vaccinia, un miembro del género Ortopox-virus en la familia Poxviridae, se utilizó como vacuna viva para inmunizar contra la enfermedad de la viruela humana. La vacunación mundial eficaz con el virus vaccinia culminó en la erradicación del virus variola, el agente causante de la viruela (La erradicación global de la viruela. Informe final de la comisión global para la certificación de la erradicación de la viruela. Historia de la Salud Pública, Nº 4, Ginebra: Organización Mundial de la Salud, 1980). Desde dicha declaración de la WHO, la vacunación se ha suspendido universalmente excepto para las personas con alto riesgo de infecciones de poxvirus (v.g. las personas que trabajan en los laboratorios).
Más recientemente, se han utilizado también los virus vaccinia para diseñar vectores víricos para expresión de genes recombinantes y para el uso potencial como vacunas recombinantes vivas (Mackett, M., Smith, G.L. y Moss, B. [1982] P.N.A.S. USA 79, 7415-7419; Smith, G.L., Mackett, M. y Moss, B. [1984] Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383-407). Esto implica secuencias de DNA (genes) que codifican antígenos extraños que se introducen, con ayuda de las técnicas de recombinación de DNA, en el genoma de los virus vaccinia. Si el gen se integra en un sitio en el DNA vírico que no es esencial para el ciclo vital del virus, es posible que el virus vaccinia recombinante recién producido sea infeccioso, es decir capaz de infectar células extrañas y expresar así la secuencia de DNA integrada (Solicitudes de Patente EP Nº 83.286 y Nº 110.385). Los virus vaccinia recombinantes preparados de este modo pueden utilizarse, por una parte, como vacunas vivas para la profilaxis de enfermedades infecciosas, y por otra parte, para la preparación de proteínas heterólogas en células eucariotas.
El virus vaccinia recombinante que expresa el gen de la RNA-polimerasa del bacteriófago T7 permitió el establecimiento de sistemas de expresión de aplicación general para la síntesis de proteínas recombinantes en células de mamífero (Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W.A., y Fuerst T.R. [1990] Nature 348, 91-92.). En todos los protocolos, la expresión de los genes recombinantes está basada en la síntesis de la RNA-polimerasa T7 en el citoplasma de células eucariotas. Alcanzó mucha popularidad un protocolo para expresión transitoria (Fuerst, T.R., Niles, E.G., Studier, F.W. y Moss, B. [1986] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 y solicitud de patente US 7.648.971). Primeramente, se inserta un gen extraño de interés en un plásmido bajo el control del promotor de la RNA-polimerasa T7. A continuación, este plásmido se introduce en el citoplasma de células infectadas con un virus vaccinia recombinante que produce RNA-polimerasa T7 utilizando procedimientos de transfección estándar.
Este protocolo de transfección es simple, debido a que no se requiere la preparación de ningún virus recombinante nuevo, y es muy eficiente, dado que más del 80% de las células expresan el gen de interés (Elroy-Stein, O. Y Moss, B. [1990] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6743-6747). La ventaja del sistema híbrido virus vaccinia/RNA-polimerasa T7 sobre otros sistemas de ex presión transitoria es muy probablemente su independencia de transporte de plásmidos al núcleo celular. En el pasado, el sistema ha sido extremadamente útil para propósitos analíticos en virología y biología celular (Buonocore, L. y Rose, J.K. [1990] Nature 345, 625-628, Pattnaik, A.K. y Wertz, G.W. [1991] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1379-1383, Kars-chin, A., Aiyar, J., Gouin, A., Davidson, N. y Lester, H.A. [1991] FEBS Lett. 278, 229-233, Ho, B.Y., Karschin, A., Raymond, J., Branchek, T., Lester, H.A. y Davidson, N. [1992] FEBS Lett. 301, 303-306, Buchholz, C.J., Retzler C., Homann, H.E., y Neubert, W.J. [1994] Virology 204, 770-776). Sin embargo, aplicaciones futuras importantes del sistema híbrido virus vaccinia/RNA-polimerasa T7, como v.g. para generar proteínas recombinantes o partículas víricas recombinantes para nuevos enfoques terapéuticos o profilácticos en humanos, podrían verse impedidas por la replicación productiva del vector vaccinia recombinante.
El virus vaccinia es infeccioso para los humanos y, en la vacunación durante la campaña de erradicación de la viruela se observaron en ocasiones complicaciones graves. La mejor visión de conjunto acerca de la incidencia de complicaciones ha sido dada en un estudio nacional en los Estados Unidos en el que se observó la vacunación de aproximadamente 12 millones de personas con una vacuna basada en la cepa del virus vaccinia de la Junta de Sanidad de la Ciudad de Nueva York (Lane, J., Ruben, F., Neff, J. y Millar, J. [1969] New Engl. J. Med. 281, 1201-1208). Por esta razón, la posibilidad más excitante de utilización del virus vaccinia como vector para el desarrollo de vacunas vivas recombinantes se ha visto afectada por problemas y normas de seguridad. Adicionalmente, la mayoría de los virus vaccinia recombinantes descritos en la bibliografía están basados en la cepa de la Reserva Occidental del virus de vacuna. Por otra parte, es sabido que esta cepa tiene una neurovirulencia elevada y es por consiguiente poco adecuada para el uso en humanos y animales (Morita et al., Vaccine 5, 65-70 [1987]).
Para aplicaciones de vectores, los riesgos sanitarios podrían verse reducidos por el uso de una cepa del virus vaccinia muy atenuada. Varias cepas de este tipo del virus vaccinia se desarrollaron especialmente para evitar efectos secundarios indeseables de la vacunación contra la viruela. Así, el virus vaccinia modificado Ankara (MVA) ha sido generado por pasos en serie de larga duración de la cepa Ankara del virus vaccinia (CVA) en fibroblastos de embrión de pollo (para revisión, véase Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. y Stickl, H. [1975] Infection 3, 6-14; Patente Suiza Nº 568.392). El virus MVA fue depositado en cumplimiento de los requisitos de Tratado de Budapest en CNCM (Instituto Pasteur, Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, 25, calle del Doctor Roux, 75724 París Cedex 15) el 15 de diciembre de 1987 bajo la Depositaría Nº I-721. El MVA se distingue por su gran atenuación, es decir por una virulencia o infectividad disminuida en tanto que mantiene una inmunogenicidad satisfactoria. El virus MVA ha sido analizado para determinar alteraciones en el genoma con relación a la cepa CVA de tipo salvaje. Se han identificado seis deleciones principales del DNA genómico (deleción I, II, III, IV, V y VI) que totalizan 31.000 pares de bases (Meyer, H., Sutter, G. y Mayr A. [1991] J. Gem. Virol. 72, 1031-1038). El virus MVA resultante resultó severamente restringido en células huésped a las células aviares.
Adicionalmente, el MVA se caracteriza por su extremada atenuación. Cuando se ensayó en una diversidad de modelos animales, se demostró que el MVA carecía de virulencia incluso en animales con inmunosupresión. Y lo que es más importante, las excelentes propiedades de la cepa MVA se han demostrado en pruebas clínicas extensas (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]). Durante estos estudios realizados en más de 120.000 humanos, con inclusión de pacientes de alto riesgo, no se asoció efecto secundario alguno con el uso de la vacuna MVA.
Se encontró que la replicación de MVA en células humanas se bloqueaba últimamente en la infección, impidiendo que el ensamblaje madurara viriones infecciosos. Sin embargo, MVA era capaz de expresar genes víricos y recombinantes a niveles altos incluso en células no permisivas y fue propuesto para servir como vector de expresión génica eficiente y excepcionalmente seguro (Sutter, G. y Moss, B. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851). Recientemente, se han establecido nuevos sistemas del vector vaccinia sobre la base de MVA, los cuales tienen secuencias extrañas de DNA insertadas en el sitio de la deleción III dentro del genoma de MVA o dentro del gen TK (Sutter, G. y Moss, B. [1995] Dev. Biol. Stand. Basel, Karger 84, 195-200 y Patente US 5.185.146). Se preparó un virus MVA recombinante que expresa los genes HA y NP del virus de la influenza a partir del promotor P7.5 del virus vaccinia e insertado en el sitio de la deleción III existente naturalmente dentro del genoma de MVA (Sutter, G., Wyatt, L.S., Foley P.L., Bennink J.R. y Moss, B. [1994] Vaccine Vol. 12, Nº 11, p. 1032-1040).
Para aprovechar adicionalmente el uso de MVA, se ha buscado una nueva vía posible para introducir genes extraños por recombinación de DNA en la cepa MVA del virus vaccinia. Dado que la intención era no alterar el genoma del virus MVA, fue necesario utilizar un método que cumpliera con este requisito. De acuerdo con la presente invención, se recombinó una secuencia de DNA extraño en el DNA vírico precisamente en el sitio de una deleción existente naturalmente en el genoma de MVA.
Sumario de la invención
Así pues, la presente invención comprende entre otras cosas lo siguiente, aisladamente o en combinación:
un virus MVA recombinante que contiene y es capaz de expresar al menos un gen extraño insertado en el sitio de una deleción existente naturalmente dentro del genoma de MVA;
un virus MVA recombinante como anteriormente que contiene y es capaz de expresar al menos un gen extraño insertado en el sitio de la deleción II dentro del genoma de MVA;
un virus MVA recombinante como anteriormente, en el cual el gen extraño codifica un marcador, un gen terapéutico o un determinante antigénico;
un virus MVA recombinante como anteriormente en el cual el gen extraño codifica un determinante antigénico de un virus patógeno, una bacteria, u otro microorganismo, o de un parásito, o una célula tumoral;
un virus MVA recombinante como anteriormente en el cual el gen extraño codifica un determinante antigénico de Plasmodium Falciparum, Micobacterias, Herpesvirus, virus de la influenza, virus de la hepatitis, o virus de la inmunodeficiencia humana;
un virus MVA recombinante como anteriormente en el cual el determinante antigénico es HIV nef o tirosinasa humana;
un virus MVA recombinante como anteriormente que es MVA-LAInef o MVA-hTYR;
un virus MVA recombinante como anteriormente en el cual el gen extraño codifica RNA-polimerasa T7;
un virus MVA recombinante como anteriormente que es MVA-T7 pol;
un virus MVA recombinante como anteriormente en el cual el gen extraño se encuentra bajo control de transcripción del promotor precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia;
virus MVA recombinantes como anteriormente que están esencialmente exentos de virus que sean capaces de replicarse en células humanas;
el uso de un virus MVA recombinante como anteriormente para la transcripción de secuencias de DNA bajo control de transcripción de un promotor de RNA-polimerasa T7;
una célula eucariota infectada por un virus recombinante de MVA como cualquiera de los anteriores;
una célula infectada por un virus MVA recombinante como anteriormente en la cual el gen extraño codifica RNA-polimerasa T7;
una célula infectada por un virus MVA recombinante como anteriormente, en la cual el gen extraño codifica RNA-polimerasa T7, que contiene adicionalmente uno o más vectores de expresión que transportan uno o más genes extraños bajo control de transcripción de un promotor de RNA-polimerasa T7;
el uso de células como anteriormente para la producción de los polipéptidos codificados por dichos genes extraños, que comprende:
a)
cultivar dichas células en condiciones adecuadas, y
b)
aislar los polipéptidos codificados por dichos genes extraños;
una célula infectada por un virus MVA recombinante como anteriormente en la cual el gen extraño codifica RNA-polimerasa T7, que contiene adicionalmente vectores de expresión que transportan genes víricos, y/o un constructo de vector vírico que codifica el genoma de un vector vírico bajo control de transcripción de un promotor de RNA-polimerasa T7;
el uso de una célula como anteriormente para la producción de partículas víricas que comprende:
a)
cultivar dichas células en condiciones adecuadas, y
b)
aislar las partículas víricas;
una célula infectada por un virus MVA recombinante como anteriormente, en la cual el gen extraño codifica RNA-polimerasa T7, que contiene adicionalmente
a)
un vector de expresión que transporta un constructo de vector retrovírico capaz de infectar y dirigir la expresión en células diana de uno o más genes extraños transportados por dicho constructo de vector retrovírico, y
b)
uno o más vectores de expresión que transportan los genes que codifican los polipéptidos requeridos para el genoma de dicho constructo de vector retrovírico para empaquetamiento bajo control de transcripción de un promotor de RNA-polimerasa T7;
el uso de células como anteriormente para la producción de partículas retrovíricas que comprende
a)
cultivar dichas células en condiciones adecuadas, y
b)
aislar las partículas retrovíricas;
una vacuna que contiene un virus MVA recombinante como anteriormente en la cual el gen extraño codifica un determinante antigénico en un vehículo fisiológicamente aceptable;
el uso de un virus MVA recombinante como anteriormente en el cual el gen extraño codifica una preparación de determinante antigénico de una vacuna;
el uso de una vacuna como anteriormente, para la inmunización de un cuerpo animal vivo, con inclusión de un humano;
el uso de una vacuna como anteriormente, que contiene MVA-LAInef para la prevención o el tratamiento de la infección por HIV o el SIDA;
el uso de una vacuna como anteriormente, que contiene MVA-hTYR para la prevención o el tratamiento de melanomas;
una vacuna que comprende, como primer componente, un virus MVA recombinante como anteriormente en el cual el gen extraño codifica RNA-polimerasa T7 en un vehículo fisiológicamente aceptable y, como segundo componente, una secuencia de DNA que transporta un determinante antigénico bajo control de transcripción de un promotor de RNA-polimerasa T7 en un vehículo fisiológicamente aceptable, estando contenidos los dos componentes juntos o separados;
el uso de una vacuna como anteriormente para la inmunización de un cuerpo animal vivo, con inclusión de un humano.
El término ``gen'' significa cualquier secuencia de DNA que codifica una proteína o un péptido.
El término ``gen extraño'' significa un gen insertado en una secuencia de DNA en la cual el mismo no se encuentra normalmente.
El gen extraño puede ser un gen marcador, un gen terapéutico, un gen que codifica un determinante antigénico, o un gen vírico, por ejemplo. Tales genes son bien conocidos en la técnica.
La Presente Invención
El virus vaccinia modificado Ankara (MVA), una cepa de virus vaccinia restringida en gama de hospedantes y altamente atenuada, es incapaz de multiplicarse en las líneas de células humanas y en la mayor parte de las líneas de células de otros mamíferos ensayadas. Pero, dado que la expresión del gen vírico está intacta en las células no permisivas, los virus MVA recombinantes de acuerdo con la invención pueden ser utilizados como vectores de expresión excepcionalmente seguros y eficientes.
Virus MVA recombinantes que codifican un determinante antigénico
En una realización, la presente invención se refiere a virus vaccinia MVA recombinantes que contienen un gen que codifica un antígeno extraño, preferiblemente de un agente patógeno, y vacunas que contienen un virus de este tipo en una forma fisiológicamente aceptable. La invención se refiere también a métodos para la preparación de tales virus vaccinia o vacunas MVA recombinantes, y al uso de estas vacunas para la profilaxis de infecciones causadas por tales agentes patógenos.
En una realización preferida de la invención, el gen extraño insertado en el virus MVA es un gen que codifica HIV nef.
Los autores de la presente invención han construido virus MVA recombinantes que permiten la expresión del gen HIV-1 nef bajo el control del promotor precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia. La proteína reguladora Nef de lentivirus de primate se sintetiza precozmente en el ciclo de replicación vírico, y se ha demostrado que es esencial para la replicación del virus con título elevado y la inducción de enfermedad in vivo. Esto sugiere que HIV Nef podría desempeñar un papel crucial en la patogénesis del SIDA. El o los mecanismos moleculares por los cuales Nef contribuye a una infectividad vírica incrementada y a la patogenicidad del HIV precisa(n) ser esclarecido(s) todavía. Sin embargo, la proteína Nef es inmunógena y el antígeno específico de Nef puede ser utilizado como una vacuna contra la infección por HIV y el SIDA.
En este contexto, el virus MVA recombinante que expresa el gen HIV nef puede ser utilizado para inmunización de seres humanos, por una parte, como una vacuna profiláctica contra el HIV humano y, por otra parte, para inmunoterapia de pacientes infectados por HIV o SIDA. Adicionalmente, el virus MVA recombinante que expresa el gen HIV nef puede ser utilizado para la producción de una proteína Nef recombinante de HIV.
En otra realización preferida de la invención, el gen extraño insertado en el virus MVA es un gen que codifica tirosinasa humana.
Se han construido virus MVA recombinantes que permiten la expresión del gen de tirosinasa humano bajo el control del promotor precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia. Recientemente, se ha identificado la tirosinasa humana como un antígeno de tumores específico de melanoma que permite la generación de linfocitos T citolíticos antitumorales (Brichard, V., et al. [1993] J. Exp. Med. 178, 489-495). Dado que entre las células normales únicamente los melanocitos parecen expresar el gen de tirosinasa, la tirosinasa es un antígeno diana útil para inmunoterapia de los melanomas. Por esta razón, el virus MVA recombinante que expresa el gen de tirosinasa humano puede ser utilizado en pacientes de melanoma para inducir respuestas inmunes que provoquen el rechazo del tumor o que prevengan su metástasis. El virus MVA recombinante que expresa el gen de tirosinasa humano puede ser utilizado directamente como una vacuna anti-melanoma, o bien se puede utilizar el virus para preparar vacunas anti-melanoma. En un ejemplo, el virus MVA recombinante que expresa el gen de tirosinasa humano puede utilizarse para la producción de proteína tirosinasa humana recombinante que se utiliza como antígeno en preparaciones de vacunas. En otro ejemplo, utilizando el virus MVA recombinante que expresa el gen de tirosinasa humano como vector de expresión, pueden modificarse in vitro células derivadas de un paciente con tumor para expresar tirosinasa y transferirse luego nuevamente al paciente para inducir respuestas inmunes anti-tumorales. Una vacuna preparada sobre la base de MVA recombinante que expresa el gen de tirosinasa humano puede utilizarse sea por vía parenteral o local en el sitio del tumor, para prevenir la metástasis del tumor o cambiar fenotípicamente el tumor, v.g. en tamaño, forma, consistencia, vascularización u otras características. Una vacuna preparada sobre la base de MVA recombinante que expresa el gen de tirosinasa humano puede utilizarse antes, durante, o después de la extirpación quirúrgica del tumor.
Para la preparación de vacunas, los virus vacunales MVA de acuerdo con la invención se convierten en una forma fisiológicamente aceptable. Esto puede hacerse sobre la base de la experiencia en la preparación de vacunas MVA utilizadas para vacunación contra la viruela (como ha sido descrito por Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). Por regla general, aproximadamente 10^{6}-10^{8} partículas del MVA recombinante se liofilizan en 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en presencia de peptona al 2% y albúmina humana al 1% en una ampolla, preferiblemente una ampolla de vidrio. El liofilizado puede contener extendedores (tales como manitol, dextrano, azúcar, glicina, lactosa o polivinilpirrolidona) u otros adyuvantes (tales como antioxidantes, estabilizadores, etc.) adecuados para administración parenteral. La ampolla de vidrio se sella luego y puede guardarse, preferiblemente a temperaturas inferiores a -20ºC, durante varios meses.
Para vacunación o terapia, el liofilizado puede disolverse en 0,1 a 0,5 ml de una solución acuosa, preferiblemente solución salina fisiológica, y administrarse por vía parenteral, por ejemplo por inoculación intramuscular o localmente, por ejemplo por inoculación en un tumor o en el sitio de un tumor. Las vacunas o agentes terapéuticos de acuerdo con la invención se inyectan preferiblemente por vía intramuscular (Mayr, A. et al. [1978] Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. B 167, 375-390). El modo de administración, la dosis y el número de administraciones pueden ser optimizados por los expertos en la técnica de manera conocida. En caso apropiado, es conveniente administrar la vacuna varias veces durante un periodo prolongado a fin de obtener respuestas inmunes apropiadas contra el antígeno extraño.
El uso de virus MVA recombinantes para la producción de polipéptidos heterólogos
Los virus vaccinia MVA recombinantes de acuerdo con la invención pueden utilizarse también para preparar polipéptidos heterólogos en células eucariotas. Esto implica que las células se infectan con los virus vaccinia recombinantes. El gen que codifica el polipéptido extraño se expresa en las células, y se aísla el polipéptido heterólogo expresado. Los métodos a utilizar para la producción de tales polipéptidos heterólogos son conocidos en general por los expertos en la técnica (documentos EP-A-206.920 y EP-A-205.939). Los polipéptidos producidos con ayuda de los virus MVA recombinantes son, por razón de las especiales propiedades de los virus MVA, más adecuados para uso como medicamentos en humanos y animales.
Virus MVA recombinantes que codifican RNA-polimerasa T7 y el uso de los mismos para la expresión de secuencias de DNA bajo control de transcripción de un promotor de RNA-polimerasa T7
En una realización adicional de la presente invención, se han construido virus MVA recombinantes que permiten la expresión del gen de RNA-polimerasa del bacteriófago T7 bajo el control del promotor precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia. La utilidad del virus MVA recombinante-T7pol como sistema de expresión ha sido comprobada en ensayos de transfección transitoria para inducir la expresión de genes recombinantes bajo el control de un promotor de RNA-polimerasa T7. Utilizando el gen de cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT) de E. coli como gen informador, se encontró que MVA-T7pol inducía la expresión del gen CAT tan eficazmente como un virus recombinante vaccinia/T7pol derivado de la cepa WR competente en replicación del virus vaccinia.
El sistema híbrido MVA/polimerasa T7 de acuerdo con la invención puede utilizarse por consiguiente como sistema de expresión simple, eficiente y seguro en mamíferos para producción de polipéptidos en ausencia de replicación productiva del virus vaccinia.
Este sistema de expresión puede utilizarse también para generar partículas víricas recombinantes para vacunación o terapia génica por transformación de líneas de células infectadas con MVA recombinante que expresa RNA-polimerasa T7, con constructos de DNA que contienen todos o algunos de los genes, y el genoma o genoma recombinante necesario para generación de partículas víricas, v.g. partículas de MVA o partículas retrovíricas, bajo control de transcripción de un promotor de RNA-polimerasa T7.
Los sistemas vectores retrovíricos están constituidos por dos componentes:
1) el vector retrovírico propiamente dicho es un retrovirus modificado (plásmido vector) en el cual los genes que codifican las proteínas víricas han sido reemplazados por genes terapéuticos y genes marcadores a transferir a la célula diana. Dado que el reemplazamiento de los genes que codifican las proteínas víricas inutiliza prácticamente el virus, el mismo tiene que ser rescatado por el segundo componente del sistema, que proporciona las proteínas víricas ausentes al retrovirus modificado.
El segundo componente es:
2) una línea de células que produce grandes cantidades de las proteínas víricas, pero que carece de la capacidad para producir virus competente en replicación. Esta línea de células se conoce como la línea de células de empaquetamiento y se compone de una línea de células transfectada con uno o más plásmidos que transportan de los genes (genes que codifican los polipéptidos gag, pol y env) que permiten el empaquetamiento del vector retrovírico modificado.
Para generar el vector empaquetado, el plásmido vector se transfecta en la línea de células de empaquetamiento. En estas condiciones, el genoma retrovírico modificado que incluye los genes terapéuticos y marcadores insertados se transcribe desde el plásmido vector y se empaqueta en las partículas retrovíricas modificadas (partículas víricas recombinantes). Este virus recombinante se utiliza luego para infectar células diana en las cuales el genoma vector y cualesquiera genes marcadores o terapéuticos transportados llegan a integrarse en el DNA de la célula diana. Una célula infectada con una partícula vírica recombinante de este tipo no puede producir nuevo virus vector, dado que no están presentes en absoluto proteínas víricas en estas células. Sin embargo, el DNA del vector que transporta los genes terapéuticos y marcadores se integra en el DNA de la célula y puede expresarse ahora en la célula infectada.
El virus MVA recombinante de acuerdo con la invención que expresa RNA-polimerasa T7 puede utilizarse para producir las proteínas requeridas para el empaquetamiento de vectores retrovíricos. Para hacer esto, los genes gag, pol y env de un retrovirus (v.g. el Virus de la Leucemia Murina (MLV)) se ponen bajo control de transcripción de un promotor de RNA-polimerasa T7 en uno o más vectores de expresión (v.g. plásmidos). Los vectores de expresión se introducen luego en células infectadas con el virus MVA recombinante que expresa RNA-polimerasa T7, junto con un vector de expresión que transporta un constructo de vector retrovírico, posiblemente bajo control de transcripción de un promotor de RNA-polimerasa T7.
Los documentos WO 94/29437, WO 89/11539 y WO 96/07748 describen diferentes tipos de constructos de vectores retrovíricos que pueden empaquetarse utilizando el sistema de empaquetamiento descrito anteriormente.
Un uso adicional del virus MVA recombinante que expresa RNA-polimerasa T7 es la generación de proteínas recombinantes, partículas de virus no infecciosas, o partículas de virus infecciosas mutantes para la producción de vacunas o agentes terapéuticos (Buchholz et al., Virology, 204, 770-776 (1994) y documento EP-B1-356695). Para hacer esto, los genes víricos (v.g. los genes gag-pol y env de HIV-1) se ponen bajo control de transcripción del promotor T7 en un vector de expresión (v.g. plásmido u otro virus MVA recombinante). Este constructo se introduce luego en células infectadas con el virus MVA recombinante que expresan RNA-polimerasa T7. Los genes víricos recombinantes se transcriben con alta eficiencia, con lo que se producen y pueden purificarse proteínas recombinantes en cantidades altas. Adicionalmente, las proteínas víricas recombinantes expresadas (v.g. HIV-1 env, gag) pueden ensamblarse a pseudo-partículas víricas que son producidas por gemación por las células y pueden aislarse del medio de cultivo de tejidos. En otra realización, proteínas víricas (procedentes v.g. de HIV, SIV, y virus del sarampión) expresadas por el sistema MVA-T7 pol pueden rescatar un virus mutante introducido adicionalmente (derivado de v.g. HIV, SIV, virus del sarampión) por resolución de un defecto en la fijación e infección, falta de recubrimiento, replicación de ácido nucleico, expresión de genes víricos, ensamblaje, gemación u otro paso en la multiplicación vírica para permitir la producción y purificación del virus mutante mencionado.
También se puede utilizar MVA-T7pol junto con secuencias de DNA que transportan el gen de un antígeno de interés (v.g. el gen de HIV, nef, tat, gag, pol, o env u otros) para inmunización. Primeramente, una secuencia codificante de un antígeno dado (v.g. HIV, HCV, HPV, HSV, virus del sarampión, virus de la influenza u otro) se somete a clonación bajo control de un promotor de RNA-polimerasa T7, preferiblemente en un vector de plásmido, y el constructo de DNA resultante se multiplica y purifica utilizando procedimientos estándar de laboratorio. En segundo lugar, el DNA vector se inocula simultáneamente o con retardos apropiados junto con MVA-T7pol. En el sitio de inoculación, el gen recombinante de interés se expresa transitoriamente en células que contienen tanto el DNA vector como MVA-T7 pol, y el antígeno correspondiente se presenta al sistema inmune del huésped estimulando una respuesta inmune específica del antígeno. Este protocolo que utiliza el vector vaccinia MVA-T7 pol no replicante representa un nuevo enfoque prometedor para vacunación con ácido nucleico que permite la expresión transitoria eficiente de un antígeno dado, pero que evita el riesgo potencial de la expresión de genes constitutivos.
Los virus vaccinia MVA recombinantes de pueden preparar como se expone más adelante en esta memoria.
Un constructo de DNA que contiene una secuencia de DNA que codifica un polipéptido extraño flanqueado por secuencias de DNA MVA adyacentes a una deleción existente naturalmente, v.g. la deleción II, dentro del genoma de MVA, se introduce en células infectadas con MVA, para permitir la recombinación homóloga.
Una vez que se ha introducido el constructo de DNA en la célula eucariota y que el DNA extraño se ha recombinado con el DNA vírico, es posible aislar el virus vaccinia recombinante deseado de una manera conocida per se, preferiblemente con ayuda de un marcador (compárese Nakano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1593-1596 [1982], Franke et al., Mol. Cell. Biol. 1918-1924 [1985], Chakrabarti et al., Mol. Cell. Biol. 3403-3409 [1985], Fathi et al., Virology 97-105 [1986]).
El constructo de DNA a insertar puede ser lineal o circular. Se prefiere un DNA circular, especialmente un plásmido. El constructo de DNA contiene secuencias que flanquean el lado izquierdo y el lado derecho de una deleción existente naturalmente, v.g. la deleción II, dentro del genoma de MVA (Altenburger, W., Suter, C.P. y Altenburger J. (1989) Arch. Virol. 105, 15-27). La secuencia de DNA extraño se inserta entre las secuencias que flanquean la deleción existente naturalmente. La secuencia de DNA extraña puede ser un gen codificante de un polipéptido terapéutico, v.g. t-PA o interferón, o un determinante antigénico de un agente patógeno. Los agentes patógenos pueden ser virus, bacterias y parásitos que pueden causar una enfermedad, así como células tumorales que se multiplican sin limitación en un organismo y pueden conducir por consiguiente a crecimientos patológicos. Ejemplos de tales agentes patógenos se describen en Davis, B.D. et al., (Microbiology, 3ª edición, Harper International Edition). Antígenos preferidos de agentes patógenos son los de los virus de la inmunodeficiencia humana (v.g. HIV-1 y HIV-2), de micobacterias causantes de tuberculosis, del parásito Plasmodium falciparum, y de células de melanoma.
Para la expresión de una secuencia de DNA o gen, es necesario que estén presentes en el DNA secuencias reguladoras, que se requieren para la transcripción del gen. Tales secuencias reguladoras (denominadas promotores) son conocidas por los expertos en la técnica, e incluyen por ejemplo las del gen vaccinia de 11 kDa como se describen en el documento EP-A-198.328, y las del gen de 7,5 kDa (documento EP-A-110.385).
El constructo de DNA puede introducirse en las células infectadas de MVA por transfección, por ejemplo por medio de precipitación con fosfato de calcio (Graham et al., Virol. 52, 456-467 [1973]; Wigler et al., Cell 777-785 [1979]) por medio de electroporación (Neumann et al., EMBO J. 1, 841-845 [1982]), por microinyección (Graessmann et al., Meth. Enzymology 101, 482-492 (1983)), por medio de liposomas (Straubinger et al., Methods in Enzymology 101, 512-527 (1983)), por medio de esferoplastos (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2163-2167 (1980)) o por otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se prefiere la transfección mediante precipitación con fosfato de calcio.
Los ejemplos detallados que siguen tienen por objeto contribuir a una mejor comprensión de la presente invención. Sin embargo, no se pretende dar la impresión de que la invención esté limitada al contenido de los ejemplos.
Los dibujos
Figura 1: Mapa esquemático del genoma de MVA y plásmido para inserción de DNA extraño por recombinación homóloga: los sitios de restricción HindIII dentro del genoma de MVA se indican en la parte superior. Se muestra el fragmento N HindIII-HindIII de 900 pares de bases (pb) que solapa la unión de la deleción II dentro del genoma de MVA. Las secuencias de DNA MVA adyacentes a la deleción II (flanco 1 y flanco 2) se multiplicaron por PCR y se utilizaron para la construcción del plásmido de inserción pUC II LZ.
Figura 2: pUC II LZ P7.5: Plásmido vector de MVA para inserción en la casete de expresión P11-LacZ que contiene la deleción II y el promotor precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia para expresar genes de interés que pueden clonarse en el sitio SmaI del plásmido.
Figura 3: pUCII LZdel P7.5: Plásmido vector de MVA para inserción de genes extraños en el sitio de deleción II en el genoma de MVA, que contiene una casete de expresión auto-delecionante P11-LacZ y el promotor precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia para expresar genes de interés que pueden clonarse en el sitio de clonación Sma1/Not1 del plásmido.
Figura 4: Construcción del virus recombinante MVA-T7pol: Mapas esquemáticos del genoma de MVA (sitios de la endonucleasa de restricción HindIII) y el plásmido vector pUC II LZ T7pol que permite la inserción del gen de RNA-polimerasa T7 en el sitio de la deleción II dentro del fragmento N HindIII del genoma de MVA.
Figura 5: Análisis por transferencia Southern del DNA vírico de MVA-T7pol.
Figura 6: Marcación metabólica de proteínas utilizando [^{35}S]metionina. Análisis por SDS PAGE. Pista 1: MVA T7pol, pista 2: MVA, pista 3: células CV-1.
Figura 7: Ensayo CAT: Células CV-1 transfectadas con plásmido que contenía el gen CAT bajo control del promotor de RNA-polimerasa T7 e infectadas con MVA-T/pol o WR-T7pol. Los lisados se ensayaron en cuanto a actividad de CAT. C significa cloranfenicol, y 1-AcC y 3-AcC significa formas mono- y tri-acetiladas de cloranfenicol. La actividad de Cat se expresa como porcentaje de producto acetilado formado en 60 min.
Figura 8: Construcción de MVA-LAInef: Mapas esquemáticos del genoma de MVA (sitios de la endonucleasa de restricción HinddIII) y el plásmido vector pUC II LZdel P7.5-LAInef que permite la inserción del gen nef de HIV-1 LAI en el sitio de deleción II dentro del fragmento N HinddIII del genoma de MVA.
Figura 9: Construcción de MVA-hTYR: Mapas esquemáticos del genoma de MVA (sitios de la endonucleasa de restricción HindIII) y el plásmido vector pUC II LZdel P7.5-TYR que permite la inserción del gen de tirosinasa humana en el sitio de la deleción II dentro del fragmento N HindIII del genoma de MVA.
Ejemplos 1. Cultivo y purificación de los virus 1.1 Cultivo del virus MVA
El virus MVA es un virus vaccinia muy atenuado derivado de la cepa del virus vaccinia Ankara (CVA) por pasos en serie de larga duración en cultivos de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) primarios. Para una revisión general de la historia de la producción, las propiedades y el uso de la cepa MVA, puede hacerse referencia al sumario publicado por Mayr et al. en Infection 3, 6-14 [1975]. Debido a la atenuación en CEF, el virus MVA se replica con títulos elevados en esta célula huésped aviar. En las células de mamífero, sin embargo, el MVA está severamente restringido en crecimiento, y no es detectable la formación típica de placas por el virus. Por esta razón, el virus MVA se cultivó en células CEF. Para preparar las células CEF, se aislaron embriones de 11 días de vida a partir de huevos de pollo incubados, se extirpan las extremidades, y los embriones se desmenuzan y se disocian en una solución compuesta de tripsina al 0,25% a 37ºC durante 20 minutos. La suspensión de células resultante se filtró y las células se redujeron a un sedimento por centrifugación a 2000 rpm en una centrífuga Sorvall RC-3B a la temperatura ambiente durante 5 minutos, se suspendieron de nuevo en 10 volúmenes de medio A (MEM Eagle, que puede obtenerse por ejemplo de Life Technologies GmbH, Eggenstein, Alemania), y se redujeron nuevamente a un sedimento por centrifugación a 2000 rpm en una centrífuga Sorvall RC-3B a la temperatura ambiente durante 5 minutos. El sedimento de células se reconstituyó en medio A que contenía 10% de suero de ternero fetal (FCS), penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (100 mg/ml) y glutamina 2 mM para obtener una suspensión de células que contenía 500.000 células/ml. Las células CEF obtenidas de este modo se extendieron en cápsulas de cultivo de células. Se dejaron crecer en medio A en una incubadora de CO_{2} a 37ºC durante 1-2 días, dependiendo de la densidad de células deseada, y se utilizaron para infección, bien directamente o después de un paso adicional de las células. Una descripción detallada de la preparación de cultivos primarios puede encontrarse en el libro publicado por R.I. Freshney, ``Culture of animal cell'', Alan R. Liss Verlag, Nueva York [1983], capítulo 11, página 99 y siguientes.
Los virus MVA se utilizaron para infección como sigue. Se cultivaron las células CEF en frascos de cultivo de células de 175 cm^{2}. A 90-100% de confluencia, se retiró el medio y las células se incubaron durante una hora con una suspensión de virus MVA (0,01 unidades infecciosas (UI) por célula, 
\hbox{(0,02 ml/cm ^{2} )}
en medio A. Se añadió luego más cantidad de medio A (0,2 ml/cm^{2}) y se incubaron los frascos a 37ºC durante 2-3 días (hasta que aproximadamente el 90% de las células mostraban efecto citopático). Se prepararon stocks de virus brutos por raspado de las monocapas de células en el medio y reducción a un sedimento del material celular por centrifugación a 3000 rpm en una centrífuga Sorvall RC-3B a 4ºC durante 5 minutos. La preparación de virus bruto se guardó a -20ºC antes de su procesamiento ulterior (v.g. purificación del virus). 1.2 Purificación de los virus
Los pasos de purificación emprendidos para obtener una preparación de virus que fuese lo más pura posible y estuviera exenta de componentes específicos de la célula huésped fueron similares a los descritos por Joklik (Virology 18, 9-18 [1962]). Los stocks de virus brutos que se habían guardado a -20ºC se descongelaron y se suspendieron una sola vez en PBS (10-20 veces el volumen del sedimento), y la suspensión se centrifugó como anteriormente. El nuevo sedimento se suspendió en 10 veces su volumen de tampón Tris 1 (Tris-HCl 10 mM de pH 9,0), y la suspensión se trató brevemente con ultrasonidos (Labsonic L, B. Braun Biotech International, Melsungen, Alemania; 2 x 10 segundos a 60 vatios y a la temperatura ambiente) a fin de desintegrar ulteriormente los residuos celulares y liberar las partículas de virus del material celular. Los núcleos de las células y los residuos celulares mayores se eliminaron en la centrifugación breve subsiguiente de la suspensión (rotor Sorvall GSA obtenible de DuPont Co., D-6353 Bad Nauheim, FRG; 3 minutos a 3000 rpm y 10ºC.). El sedimento se suspendió una vez más en tampón Tris 1, se trató con ultrasonidos y se centrifugó, como se ha descrito anteriormente. Los sobrenadantes recogidos que contenían las partículas de virus libres se combinaron y se estratificaron sobre un cojín de 10 ml de sacarosa al 36% en Tris-HCl 10 mM, de pH 9,0, y se centrifugaron en un rotor Beckman SW 27/SW 28 durante 80 minutos con 13.500 rpm a 4ºC. Se desechó el sobrenadante, y el sedimento que contenía las partículas de virus se recogió en 10 ml de Tris-HCl 1 mM, de pH 9,0, se homogeneizó por tratamiento breve con ultrasonidos (2 x 10 segundos a la temperatura ambiente, el mismo aparato descrito anteriormente), y se aplicó a un gradiente de sacarosa 20-40% (sacarosa en Tris-HCl 1 mM, pH 9,0) para purificación ulterior. El gradiente se centrifugó en un rotor Beckmann SW41 a 13.000 rpm durante 50 minutos a 4ºC. Después de la centrifugación, se cosecharon por pipeteado las bandas discretas que contenían partículas de virus después de aspirar el volumen existente por encima de la banda. La solución de sacarosa obtenida se diluyó con 3 volúmenes de PBS y las partículas de virus se sedimentaron nuevamente por centrifugación (Beckmann SW 27/28, 60 minutos a 13.500 rpm, 4ºC.). El sedimento, que estaba constituido ahora fundamentalmente por partículas de virus puras, se resuspendió en PBS y se equilibró hasta concentraciones de virus que correspondían por término medio a 1-5 x 10^{9} UI/ml. La solución stock de virus purificada se guardó a -80ºC y se utilizó directamente o se diluyó con PBS para experimentos subsiguientes.
1.3 Clonación del virus MVA
Para generar preparaciones stock homogéneas de virus, el virus MVA obtenido del Prof. Anton Mayr se clonó por dilución limitante durante tres pasos consecutivos en CEF cultivado en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Se seleccionó el clon F6 de MVA y se multiplicó en CEF para obtener stocks de virus de trabajo que sirvieron como material de partida para la generación de los virus MVA recombinantes descritos en esta solicitud de patente así como para la generación de virus MVA recombinantes descritos previamente (Sutter, G. y Moss, B. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851; Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. y Moss, B. [1994] Vaccine 12, 1032-1040; Hirsch, V., Fuerst, T., Sutter, G., Carroll, M., Yang, L., Goldstein, S., Piatak, M., Elkins, W., Alvord, G., Montefiori, D., Moss, B. y Lifson, J. [1996] J. Virol. 70, 3741-3752).
2. Construcción y caracterización de virus MVA recombinantes 2.1. Construcción de plásmidos vectores
Para hacer posible la generación de virus MVA recombinantes se construyeron nuevos plásmidos vectores. La inserción de genes extraños en el genoma de MVA se dirigió con precisión al sitio de la deleción II existente naturalmente en el genoma de MVA. Secuencias de DNA de MVA que flanqueaban el sitio de una deleción de 2500 pb en el fragmento N HinddIII del genoma de MVA (Altenburger, W., Suter, C.P. y Altenburger, J. [1989], J. Arch. Virol. 105, 15-27) se multiplicaron por PCR y se clonaron en el sitio de clonación múltiple del plásmido pUC18. Los iniciadores para el flanco izquierdo de DNA de 600 pb fueron 5'-CAG CAG GGT ACC CTC ATC GTA CAG GAC GTT CTC-3' y 5'-CAG CAG CCC GGG TAT TCG ATG ATT ATT TTT AAC AAA ATA ACA-3' (los sitios para las enzimas de restricción KpnI y SmaI están subrayados). Los iniciadores para el flanco derecho de DNA de 550 pb fueron 5'-CAG CAG CTG CAG GAA TCA TCC ATT CCA CTG AAT AGC-3' y 5'-CAG CAG GCA TGC CGA CGA ACA AGG AAC TGT AGC AGA-3' (los sitios para las enzimas de restricción PstI y SphI están subrayados). Entre estos flancos de DNA de MVA insertados en pUC18, se insertó el gen lacZ de Escherichia coli bajo control del promotor tardío P11 del virus vaccinia (preparado por digestión mediante restricción a partir de pIII LZ, Sutter, G. y Moss, B. [1992] PNAS USA 89, 10847-10851), utilizando el sitio BamHI, para generar el vector de inserción de MVA pUCII LZ [Figura 1]. A continuación, un fragmento de 289 pb que contenía el promotor precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia junto con un sitio SmaI para clonación (preparado por digestión mediante restricción con EcoRI y XbaI a partir del vector de plásmido pSC11 [Chakrabarti et al. 1985, Molecular and Cellular Biology 5, 3403-3409]), se insertó en el sitio SmaI de pUCII LZ para dar el vector de MVA pUCII LZ P7.5 [Figura 2]. Para construir un plásmido vector que permita el aislamiento de virus MVA recombinantes por síntesis transitoria de la enzima informadora \beta-galactosidasa, un fragmento de 330 pb de DNA obtenido a partir del extremo 3' del marco de lectura abierta de E. coli LacZ se multiplicó por PCR (los iniciadores fueron 5'-CAG CAG GTC GAC CCC GAC CGC CTT ACT GCC GCC-3' y 5'-GGG GGG CTG CAG ATG GTA GCG ACC GGC GCT CAG-3') y se clonó en los sitios SalI y PstI de pUC II LZ P7.5 para obtener el vector de MVA pUC II LZdel P7.5 [Figura 3]. Utilizando el sitio Sma1, se puede utilizar este plásmido vector para insertar secuencias de DNA que codifican un gen extraño bajo control de transcripción del promotor P7.5 del virus vaccinia en el genoma de MVA. Después que se ha aislado el virus recombinante deseado por escrutinio en cuanto a expresión de actividad de \beta-galactosidasa, la propagación ulterior del virus recombinante conduce a una auto-deleción de la casete de expresión rediseñada P11-LacZ por recombinación homóloga.
2.2. Construcción y caracterización del virus recombinante MVA T7pol
Un fragmento de 3,1 kilopares de bases de DNA que contenía el gen entero de RNA-polimerasa del bacteriófago T7 bajo control del promotor precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia se escindió con EcoRI a partir del plásmido pTF7-3 (Fuerst, T.R., Niles, E.G., Studier, F.W. y Moss, B., 1986, P.N.A.S. USA 83, 8122-8126), se modificó por incubación con DNA-polimerasa Klenow para generar extremos romos, y se clonó en un sitio de restricción singular SmaI de pUCII LZ para producir el vector de transferencia del plásmido pUCII LZ T7pol [Figura 4]. Como regulador de transcripción para la expresión del gen de RNA-polimerasa T7, se seleccionó el promotor precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia. Contrariamente a los promotores tardíos del virus vaccinia más fuertes (v.g. P11) este sistema promotor permite la expresión de genes recombinantes inmediatamente después de la infección de las células diana. El plásmido pUCII LZ T7pol que dirige la inserción de los genes extraños en el sitio de deleción II del genoma de MVA se utilizó para generar el virus recombinante MVA T7pol.
Células CEF infectadas con MVA a una multiplicidad de 0,05 TCID_{50} por célula se transfectaron con DNA del plásmido pUCII LZ T7pol como se ha descrito previamente (Sutter, G, Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. y Moss, B. (1994) Vaccine 12, 1032-1040). El virus MVA recombinante que expresaba la RNA-polimerasa T7 y coexpresaba \beta-D-galactosidasa (MVA P7.5-T7pol) se seleccionó por cinco tandas consecutivas de purificación en placa en células CEF teñidas con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido (300 \mug/ml). Subsiguientemente, se multiplicaron virus recombinantes por infección de monocapas CEF, y el DNA se analizó por PCR para confirmar la homogeneidad genética del stock de virus. El análisis por transferencia Southern del DNA vírico de MVA-T7pol demostró la integración estable de los genes recombinantes en el sitio de deleción II dentro del genoma de MVA [Figura 5].
Para observar la expresión de RNA-polimerasa T7 por MVA T7pol recombinante, se analizaron polipéptidos marcados con [^{35}S]metionina procedentes del cultivo de tejidos infectados con el virus. Monocapas de la línea de células de riñón de mono CV-1 cultivadas en placas de 12 pocillos se infectaron con virus a una multiplicidad de 20 TCID_{50} por célula. Al cabo de 3 a 5 horas de la infección, se retiró el medio, y los cultivos se lavaron una sola vez con 1 ml de medio exento de metionina. Se añadieron a cada pocillo 0,2 ml de medio exento de metionina complementado con 50 \muCi de [^{35}S]metionina y se incubaron durante 30 min a 37ºC. Se prepararon extractos citoplásmicos de las células infectadas por incubación de cada pocillo en 0,2 ml de tampón de lisis Nonidet P-40 al 0,5% durante 10 min a 37ºC y se analizaron muestras por SDS-PAGE. La marcación metabólica de las células CV-1 con MVA T7pol reveló la síntesis de dos polipéptidos adicionales (i) una proteína de aproximadamente 116.000 Da que representaba la \beta-galactosidasa de E. coli co-expresada para permitir el escrutinio de virus recombinante, y (ii) una proteína de 98.000 Da con el tamaño esperado de la RNA-polimerasa del bacteriófago T7 [Figura 6]. Es notable la gran cantidad de \beta-galactosidasa producida por MVA T7pol. Los resultados de los experimentos de marcación in vivo demuestran una expresión muy fuerte del constructo P11-gen LacZ cuando se insertó en el genoma de MVA en el sitio de deleción II, lo que indicaba que los genes recombinantes en los virus vectores MVA podrían expresarse más eficientemente cuando se insertaban en este locus del genoma de MVA.
La utilidad de los virus MVA recombinante-T7pol como sistema de expresión en comparación con el virus recombinante WR-T7pol vTF7-3 (Fuerst et al. 1986) se ensayó por la co-transfección de DNA de un vector de plásmido que se deriva de pTM1 (Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W.A., y Fuerst T.R. (1990) Nature 348, 91-92) y contiene (clonado en los sitios NcoI y BamHI del sitio de clonación múltiple de pTM1) el gen de la cloranfenicol-cetiltransferasa (CAT) de E. coli bajo el control de un promotor de RNA-polimerasa T7 (PT_{7}). Células CV-1 transfectadas e infectadas se suspendieron en 0,2 ml de Tris-HCl 0,25 M (pH 7,5). Después de tres ciclos de congelación-descongelación, los lisados se aclararon por centrifugación, se determinó el contenido de proteínas de los sobrenadantes, y se ensayaron muestras que contenían 0,5, 0,25 y 0,1 \mug de proteína total en cuanto a actividad enzimática como ha sido descrito por Mackett, M., Smith, G.L. y Moss, B. (1984) J. Virol. 49, 857-864. Después de autorradiografía, las manchas marcadas se cuantificaron utilizando el sistema de análisis de imágenes Fuji. Los resultados demuestran que por la utilización del vector vaccinia MVA altamente atenuado es posible aprovechar el sistema virus vaccinia-RNA-polimerasa T7 tan eficientemente como por la utilización de un virus vaccinia recombinante totalmente competente en replicación [Figura 7].
2.3. Construcción y caracterización del virus recombinante MVA-LAInef
Se preparó un fragmento de 648 pb de DNA que contenía el gen nef entero de HIV-1 LAI por PCR a partir de DNA plasmídico (pTG1166, proporcionado amablemente por M.-P. Kieny, Transgène S.A., Estrasburgo; los iniciadores de la PCR fueron 5'-CAG CAG GGA TCC ATG GGT GGC AAG TGG TCA AAA AGT AGT-3' y 5'-CAG CAG GGA TCC ATG TCA GCA GTT CTT GAA GTA CTC CGG-3'), digeridos con la endonucleasa de restricción BamHI, modificados por incubación con DNA-polimerasa Klenow para generar extremos romos, y clonados en el sitio SmaI de pUC II LZdel P7.5 para producir el vector pUC II LZdel P7.5-LAInef [Figura 8]. Este plásmido podría utilizarse para diseñar un virus recombinante de MVA que expresa el gen nef de HIV-1 LAI bajo control del promotor precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia.
Células CEF infectadas con MVA a una multiplicidad de 0,05 TCID_{50} por célula se transfectaron con DNA del plásmido pUC II LZdel P7.5-LAInef como ha sido descrito previamente (Sutter, G, Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. y Moss, B. [1994] Vaccine 12, 1032-1040). Los virus recombinantes de MVA que contenían el gen nef y que co-expresaban transitoriamente el gen marcador LacZ de E. coli se seleccionaron por tandas consecutivas de purificación en placa en células CEF teñidas con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido (300 \mug/ml). A continuación, virus recombinantes de MVA que contenían el gen nef y que tenían delecionado el gen marcador LacZ se aislaron por tres tandas consecutivas adicionales de escrutinio mediante purificación en placa para focos víricos que no se teñían en células CEF en presencia de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido (300 \mug/ml). Subsiguientemente, los virus recombinantes se multiplicaron por infección de monocapas CEF, y se analizó el DNA vírico MVA-LAInef por PCR para confirmar la homogeneidad genética del stock de virus. El análisis por transferencia Southern del DNA vírico confirmó la estabilidad genética de MVA-LAInef y demostró con precisión la integración del gen nef y la deleción del gen marcador LacZ de E. coli en el sitio de deleción II dentro del genoma vírico.
La expresión eficiente de la proteína Nef recombinante se confirmó por análisis mediante transferencia Western de lisados proteínicos de células CEF infectadas con MVA-LAInef utilizando anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos contra HIV-1 Nef (proporcionados amablemente por K. Krohn y utilizados como ha sido descrito por Ovod, V., Lagerstedt, A., Ranki, A., Gombert, F., Spohn, R., Tähtinen, M., Jung, G., y Krohn, K. [1992] AIDS 6, 25-34).
2.4. Construcción y caracterización del virus recombinante MVA-hTYR
Un fragmento de 1,9 kb de DNA que contenía el gen entero codificante de la tirosinasa humana [clon 123.B2 de c-DNA de tirosinasa, aislado de la línea de células de melanoma SK29-MEL del paciente SK29(AV), GenBank Acc. Nº UO1873; Brichard, V., Van Pel, A., Wölfel, T., Wölfel, C., De Plaen, E., Lethé, B., Coulie, P. y Boon, B. (1993), J. Exp. Med. 178, 489-495] se preparó a partir del plásmido pcDNAI/Amp-Tyr [Wölfel, T., Van Pel, A., Brichard, V., Schneider, J., Seliger, B., Meyer zum Büschenfelde, K. y Boon, T. (1994) Eur. J. Immunol 24, 759-764] por digestión con EcoRI se modificó por incubación con DNA- polimerasa Klenow para generar extremos romos, y se clonó en el sitio SmaI de pUC II LZdel P7.5 para producir el vector pUC II LZdel P7.5-TYR [Figura 9]. Este plásmido pudo utilizarse para diseñar virus MVA recombinante que expresa el gen de la tirosinasa humana bajo control del promotor precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia.
Células CEF infectadas con MVA a una multiplicidad de 0,05 TCID_{50} por célula se transfectaron con DNA del plásmido pUC II LZdel P7.5-TYR como se ha descrito previamente (Sutter, G, Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. y Moss, B. (1994) Vaccine 12, 1032-1040). El virus MVA recombinante que expresaba de manera estable el gen para la tirosinasa humana y co-expresaba transitoriamente el gen LacZ de E. coli se seleccionó por tandas consecutivas de purificación en placa en células CEF teñidas con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido (300 \mug/ml). A continuación, el virus MVA recombinante que expresaba el gen codificante de la tirosinasa humana y que tenía delecionado el gen marcador LacZ se aisló por tres tandas consecutivas adicionales de purificación en placa escrutando para focos víricos sin teñir en células CEF en presencia de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido (300 \mug/ml). Subsiguientemente, los virus recombinantes se multiplicaron por infección de monocapas CEF, y el DNA vírico MVA-hTYR se analizó por PCR para confirmar la homogeneidad genética del stock de virus. El análisis por transferencia Southern del DNA vírico confirmó la estabilidad genética de MVA-hTYR y demostró con precisión la integración del gen de la tirosinasa recombinante y la deleción del gen marcador LacZ de E. coli en el sitio de deleción II dentro del genoma vírico.
La expresión eficiente de la tirosinasa humana recombinante se confirmó por análisis mediante transferencia Western de lisados proteínicos de células CEF infectadas con MVA-hTYR utilizando anticuerpos policlonales de conejo (proporcionados amablemente por V. Hearing y utilizados como ha sido descrito por Jiménez, M., Kameyama, K., Maloy, L., Tomita, Y. y Hearing, V. [1988] P.N.A.S. USA 85, 3830-3834) o anticuerpos monoclonales de ratón (proporcionados amablemente por L. Old y utilizados como ha sido descrito por Chen, Y., Stockert, E., Tsang, S., Coplan, K. y Old, L. [1995] P.N.A.S. USA 92, 8125-8129) dirigidos contra tirosinasa.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: GSF-Forschungszentrum fuer Umwelt und Gesundheit GmbH
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: Ingolstaedter Landstr. 1, Neuherberg
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Oberschleissheim
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Alemania
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 85764
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Virus MVA recombinante, y el uso del mismo
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disco flexible
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: DK 0782/95
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 04-JUL-1995
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = ``iniciador de DNA''
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CAGCAGGGTA CCCTCATCGT ACAGGACGTT CTC 
\hfill
33 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = ``iniciador de DNA''
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CAGCAGCCCG GGTATTCGAT GATTATTTTT AACAAAATAA CA 
\hfill
42 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = ``iniciador de DNA''
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CAGCAGCTGC AGGAATCATC CATTCCACTG AATAGC 
\hfill
36 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = ``iniciador de DNA''
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CAGCAGGCAT GCCGACGAAC AAGGAACTGT AGCAGA 
\hfill
36 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = ``iniciador de DNA''
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CAGCAGGTCG ACCCCGACCG CCTTACTGCC GCC 
\hfill
33 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = ``iniciador de DNA''
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GGGGGGCTGC AGATGGTAGC GACCGGCGCT CAG 
\hfill
33 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = ``iniciador de DNA''
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CAGCAGGGAT CCATGGGTGG CAAGTGGTCA AAAAGTAGT 
\hfill
39 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = ``iniciador de DNA''
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CAGCAGGGAT CCATGTCAGC AGTTCTTGAA GTACTCCGG 
\hfill
39

Claims (25)

1. Un virus MVA recombinante que contiene y es capaz de expresar al menos un gen extraño insertado en el sitio de cualquiera de los sitios de deleción I, II, IV, V o VI existentes naturalmente dentro del genoma de MVA.
2. El virus MVA recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 que contiene y es capaz de expresar al menos un gen extraño insertado en el sitio de deleción II dentro del genoma de MVA.
3. El virus MVA recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual el gen extraño codifica un marcador, un agente terapéutico, un antígeno o un determinante antigénico.
4. El virus MVA recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, en el cual el gen extraño codifica un antígeno o un determinante antigénico de un virus patógeno, una bacteria, u otro microorganismo, o de un parásito, o una célula tumoral.
5. El virus MVA recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual el gen extraño codifica un antígeno o un determinante antigénico de Plasmodium Falciparum, Micobacterias, Herpesvirus, virus de la influenza, virus de la hepatitis, o virus de la inmunodeficiencia humana.
6. El virus MVA recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 3 a 5, en el cual el antígeno o determinante antigénico es HIV nef o tirosinasa humana.
7. El virus MVA recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual el gen extraño codifica RNA-polimerasa T7.
8. El virus MVA recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en el cual el gen extraño se encuentra bajo control de transcripción del promotor precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia.
9. El virus MVA recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, esencialmente exento de virus que son capaces de replicarse en células humanas.
10. Uso del virus MVA recombinante de acuerdo con la reivindicación 7 para la transcripción in vitro de secuencias de DNA bajo control de transcripción de un promotor de RNA-polimerasa T7.
11. Una célula eucariota aislada infectada por un virus MVA recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
12. La célula eucariota de acuerdo con la reivindicación 11, que contiene adicionalmente uno o más vectores de expresión que transportan uno o más genes extraños bajo control de transcripción de un promotor de RNA-polimerasa T7.
13. Uso de las células eucariotas de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12 para la producción in vitro de los polipéptidos codificados por dichos genes extraños, que comprende:
a) cultivar dichas células en condiciones adecuadas, y
b) aislar los polipéptidos codificados por dichos genes extraños.
14. La célula eucariota de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, que contiene adicionalmente vectores de expresión que transportan genes víricos, y/o un constructo de vector vírico que codifica el genoma de un vector vírico bajo control de transcripción de un promotor de RNA-polimerasa T7.
15. Uso de las células eucariotas de acuerdo con la reivindicación 14 para la producción in vitro de partículas víricas, que comprende:
a) cultivar dichas células en condiciones adecuadas, y
b) aislar las partículas víricas.
16. La célula eucariota de acuerdo con las reivindicaciones 11, 12 ó 14, que contiene adicionalmente
a) un vector de expresión que transporta un constructo de vector retrovírico capaz de infectar y dirigir la expresión en células diana de uno o más genes extraños transportados por dicho constructo de vector retrovírico, y
b) uno o más vectores de expresión que transportan los genes codificantes de los polipéptidos requeridos para que el genoma de dicho constructo de vector retrovírico se empaquete bajo control de transcripción de un promotor de RNA-polimerasa T7.
17. Uso de las células eucariotas de acuerdo con la reivindicación 16 para la producción in vitro de partículas retrovíricas, que comprende
a) cultivar dichas células en condiciones adecuadas, y
b) aislar las partículas retrovíricas.
18. Una vacuna que contiene un virus MVA recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9 en un vehículo fisiológicamente aceptable.
19. El uso del virus MVA recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 19 para la preparación de una vacuna.
20. El virus MVA recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 anteriores, y/o la vacuna de acuerdo con la reivindicación 18 para la inmunización de un cuerpo animal vivo, con inclusión de un humano.
21. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 18, que contiene el MVA recombinante que incluye el gen nef de HIV para la prevención o el tratamiento de la infección por HIV o SIDA.
22. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 18 que contiene el MVA recombinante que incluye el gen de tirosinasa humana para la prevención o el tratamiento de melanomas.
23. Una vacuna que comprende como primer componente un virus MVA recombinante de acuerdo con la reivindicación 7 en un vehículo fisiológicamente aceptable, y como segundo componente una secuencia de DNA que transporta un antígeno o determinante antigénico bajo control de transcripción de un promotor de RNA-polimerasa T7 en un vehículo fisiológicamente aceptable, estando contenidos ambos componentes juntos o por separado.
24. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 23 para la inmunización de un cuerpo animal vivo, con inclusión de un humano.
25. Uso del virus MVA recombinante de acuerdo con la reivindicación 7 para la preparación de una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 23 ó 24
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