UA75410C2 - Recombinant virus mva and use thereof - Google Patents
Recombinant virus mva and use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- UA75410C2 UA75410C2 UA20031212890A UA20031212890A UA75410C2 UA 75410 C2 UA75410 C2 UA 75410C2 UA 20031212890 A UA20031212890 A UA 20031212890A UA 20031212890 A UA20031212890 A UA 20031212890A UA 75410 C2 UA75410 C2 UA 75410C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- mma
- virus
- recombinant
- gene
- dna
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 130
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 29
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 22
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 90
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 claims description 16
- 101000606090 Homo sapiens Tyrosinase Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 8
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 8
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 7
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 abstract description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 abstract description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 101800003332 Metamorphosin A Proteins 0.000 description 123
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 67
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 35
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 34
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 27
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 26
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 18
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 10
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 8
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 8
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 8
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 8
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 7
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 6
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 4
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 241000721701 Lynx Species 0.000 description 3
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 3
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- -1 for example Proteins 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- LJQDDVJEZIEHNY-YIMUCPRWSA-N (4r)-4-[(5r,8r,9s,10s,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-n,n-dimethylpentan-1-amine Chemical compound C([C@@H]1CC2)CCC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCCN(C)C)C)[C@@]2(C)CC1 LJQDDVJEZIEHNY-YIMUCPRWSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241001435321 Staphylococcus virus 77 Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000001466 metabolic labeling Methods 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 101150016096 17 gene Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYNLGDBUJLVSMA-UHFFFAOYSA-N 4,5-diacetyloxy-9,10-dioxo-2-anthracenecarboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(O)=O)=CC(OC(C)=O)=C2C(=O)C2=C1C=CC=C2OC(=O)C TYNLGDBUJLVSMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150046633 77 gene Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010040864 CERE Proteins 0.000 description 1
- 101100366936 Caenorhabditis elegans sto-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 101000701902 Homo sapiens Serpin B4 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 101150004367 Il4i1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 241001406422 Leucaena retusa Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000700629 Orthopoxvirus Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 208000005585 Poxviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 241001068263 Replication competent viruses Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100030326 Serpin B4 Human genes 0.000 description 1
- 101150015964 Strn gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Chemical group 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- HDRXZJPWHTXQRI-BHDTVMLSSA-N diltiazem hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(OC)=CC=C1[C@H]1[C@@H](OC(C)=O)C(=O)N(CC[NH+](C)C)C2=CC=CC=C2S1 HDRXZJPWHTXQRI-BHDTVMLSSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940115256 melanoma vaccine Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
- C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
- C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Опис винаходу
Даний винахід відноситься до рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи, що походить від модифікованого 2 вірусу коров'ячої віспи Анкара (ММА), а також містить та здатний експресувати сторонні гени, що вбудовані до сайту природної делеції у геномі ММА; до використання таких рекомбінантних вірусів ММА для продукування поліпептидів, наприклад, антигенів або терапевтичних агентів, або вірусних векторів для генної терапії; та до використання вказаних рекомбінантних вірусів ММА, що кодують антигени, у якості вакцин.
Метою даного винаходу є отримання рекомбінантного вірусу ММА, який може бути використаний у якості 70 ефективного та абсолютно безпечного експресійного вектору.
Іншою метою даного винаходу є розробка простого, ефективного та безпечного способу продукування поліпептидів, наприклад, антигенів або терапевтичних агентів, а також отримання рекомбінантних вірусів для виготовлення вакцин, та вірусних векторів для використання у генній терапії.
Ще однією метою даного винаходу є отримання експресійної системи на основі рекомбінантного вірусу ММА, 72 Що експресує людську тирозиназу; та розробка способів продукування поліпептидів, наприклад, антигенів або терапевтичних агентів, або генерування вірусних векторів для використання у генній терапії, або виготовлення вакцин на основі вказаної експресійної системи.
Вірус коров'ячої віспи, що належить до роду Ортопоксвірусів родини Поксвірусів, був використаний у якості живої вакцини для імунізації людини у цілях продукування в нього імунітету проти натуральної віспи. Успішна всесвітня вакцинація вірусом віспи завершилася викорененням вірусу віспи, який є агентом, що спричинює віспу (пе сдіора! егадісайоп ої втаїйрох. Ріпа! герогі ої Ше діора! соттіввіоп їТог (Ше сепійісайоп ої зтаїрох егадісайноп. Нівіогу ої Рибріїс Неакй, Мо4, Сепема: УМопа Неак Огодапігайоп, 1980) З часу підписання декларації ВОЗ (Всесвітня організація охорони здоров'я, М/ІНО) загальна вакцинація була зупинена, за с виключенням людей з високим ризиком зараження поксовірусом (наприклад, лаборантів). Ге)
Пізніше віруси коров'ячої віспи були також використані для конструювання вірусних векторів, що були призначені для експресії рекомбінантних генів та для можливого їх застосування в якості живих вакцин
ІМасКек, М., тій, О.ЇГ., Мозв, В., 1982, Р.М.А.5., ОБА 79, 7415-7419; Зтій, о.Ї., Маскеї, М. Мозгв, В., 1984,
ВіоФесппоіїоду 5 Сепеїйїіс Епдіпеегіпуд Кемієемув, 2, 383-407). Це дає можливість отримати ДНК-послідовності о (гени), що кодують чужорідні антигени та вбудовані, за допомогою техніки рекомбінантних ДНК, до геному вірусу -" че коров'ячої віспи. Якщо ген інтегрується в сайт вірусної ДНК, що не має вирішального значення для життєвого циклу вірусу, тоді знову рекомбінантний вірус коров'ячої віспи, що продукується, може бути інфекційним, тобто З він може інфікувати чужорідні клітини, в результаті чого буде експресуватися інтегрована ДНК-послідовність ою
ІЄвропейські патентні заявки МоМо83286 та 110385). Отримані таким чином рекомбінантні віруси коров'ячої віспи 3о можуть бути використані, з однієї сторони, в якості живих вакцин для профілактики інфекційних захворювань, в та, з іншої сторони, в якості матеріалу для продукування гетерологічних білків в еукаріотичних клітинах.
Продукування рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи, що експресує ген РНК-полімерази бактеріофагу 17, дозволяє отримати експресійну систему, яка може широко використовуватися для синтезу рекомбінантних білків «4, у клітинах ссавців (Мовзв, В., ЕІгоу-біеіп, О., Мігикаті, Т., АІехападег, МУ.А., Ецегві, Т.К., 1990, Маїшге 348, З 50 91-92. Всі методи експресії рекомбінантного гену передбачають синтез РНК-полімерази 77 у цитоплазмі с еукаріотичних клітин. При цьому, найбільш часто використовується схема тимчасової експресії (Рцегві, Т.К.,
Із» Міез, Е.б., зіцаїег, Б.МУ. 5 Мовв, В., (1986) Ргос.Майн.Асайд.5сі. ОБА, 83, 8122-8126, та заявка на патент США
Мо7648971|. Спочатку потрібний чужорідний ген вбудовують до плазміди під контроль промотору гену
РНК-полімерази 17. Потім, використовуючи стандартну техніку трансфекції, цю плазміду вводять до цитоплазми клітин, інфікованих рекомбінантним вірусом коров'ячої віспи, що продукує РНК-полімеразу 17. і Ця схема трансфекції є досить простою, оскільки вона не потребує створення нових рекомбінантних вірусів, 4! та до того ж є дуже ефективною, оскільки вона дозволяє отримати більше 8095 клітин, що експресують потрібний ген ІЕіІгоу-5іеіп, О. 5 Мозвз, В. (1990) Ргос.Май.Асайд.Зсі. ОБА, 87, 6743-6747)Ї. Перевагу "вірус коров'ячої шк віспи//7-РНК-полімераза" - гібридної системи, у порівнянні з іншими системами з тимчасовою експресією, - 70 полягає, вірогідно, в її незалежності від транспорту плазмід до ядра клітини. Раніше цю систему використовували виключно в аналітичних цілях у вірусології та мікробіології |І Внопосоге, Ї. 5: Козе, У.К. (1990) мк Майте 345, 625-628, РайцпаїК, А.К. апа УУегіг, С.МУ. (1991) Ргос.Ман.Асайд.бЗсі. ОБА, 88, 1379-1383, Каїепіп,
А., Аїуаг, 9У., Соціп, А., Юамідзоп, М. апа Іевіег, Н.А. (1991) РЕВ5 Гей, 278, 229-233, Но, В.У., КаїезпПіп,
А., Каутопа, ., Вгапспек, Т., І евіег, Н.А. апа ЮОаміазоп, М. (1992) РЕВБ І ей., 301, 303-306, Висппої2, С.., 22 Веїлег С, Нотапп, Н.Е. апа Мешбегі, МУ.) (1994) Мігоіоду, 204, 770-776). Однак у майбутньому можливі важливі
ГФ) зміни гібридної системи "вірус коров'ячої віспи/3РНК-полімераза 17", наприклад для продукування рекомбінантних білків або рекомбінантних вірусних частинок у цілях розробки нових терапевтичних або профілактичних методів о у медицині, можуть зіштовхнутись з певними труднощами, що зумовлені продуктивною реплікацією рекомбінантного вектору, отриманого на основі вірусу коров'ячої віспи. 60 Вірус коров'ячої віспи є інфекційним для людини, та іноді, після вакцинації, що проводилась у якості профілактичної міри по боротьбі з натуральною віспою, у вакцинованих людей спостерігались серйозні ускладнення. Найбільш повний опис випадків ускладнень після вакцинації людей приводиться у Національному звіті США, що висвітлює спостереження за вакцинацією близько 12 мільйонів людей, що була проведена з використанням вакцини, отриманої на основі штаму Нью-Йоркського місцевого департаменту охорони здоров'я бо (Мем ЖМогк Спйу Воага ої Неакй) вірусу коров'ячої віспи (апе, 9)., Киреп, Р., Мей, У. апа МіМПаг, 9. (1969)
Мем Епа!/.).Меа., 281, 1201-1208). Тому, багатообіцяюча можливість використання вірусу коров'ячої віспи в якості вектору для виготовлення живих вакцин зіштовхується з проблемою безпеки та регламентації застосування цього вірусу. Окрім того, більшість рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи, що описані у літературі були отримані на основі штаму УУезіегп Кезегме вірусу коров'ячої віспи. З іншої сторони, відомо, що цей штам має високий ступінь нейровірулентності, а тому він є малопридатним для введення людині та тваринам |Могійа еї аі., Массіпе 5, 65-70 (1987).
Ризик для здоров'я людини або тварин, пов'язаний із застосуванням вказаного вірусу в якості вектору, може бути знижений шляхом використання у високому ступені атенуйованого (послабленого) штаму вірусу коров'ячої 7/0 Віспи. Декілька таких штамів вірусу коров'ячої віспи були спеціально розроблені для знищення небажаних побічних ефектів, що з'являлись у результаті вакцинації проти віспи. Так, наприклад, модифікований вірус коров'ячої віспи Анкара (ММА) був отриманий шляхом тривалого серійного пасування штаму Анкара вірусу коров'ячої віспи (СМА) на фібробластах куриних ембріонів |див. огляд Мауг, А., Носпвіеіп-Міпігеї, М. апа
ЗІСКІ, Н.(1975) Іптесіоп 3, 6-14; патент Швейцарії Мо5683921. Вірус ММА був депонований, у відповідності з 7/5 Вимогами Будапештського договору, в СМСМ (Інститут Пастера, Національна колекція мікроорганізмів, 25 ге ам
ВБосіециг Коих, 75724 Рагіз Седех 15, 15 грудня 1987р. під номером допуску Мо1-721)|. Модифікований вірус ММА відрізняється своїм високим ступенем послабленості, тобто він має знижену вірулентність або інфекційність, зберігаючи при цьому гарну імуногенність. Вірус ММА був проаналізований для того, щоб визначити, які саме зміни є в його геномі у порівнянні з вірусом дикого типу СМА. В результаті цього аналізу були ідентифіковані шість головних делецій у генній ДНК (делеції !, І, Ш, ІМ, М та МІ), всього 31000 пар основ |Меуег, Н.,
ЗцЧег, б. апа Мауг А. (1991) у).Сзеп. МігоіЇ., 72, 1031-1038). У своєму колі хазяїв вірус, що був отриманий, чітко обмежений лише клітинами птахів. Окрім того, ММА відрізняється своєю крайньою послабленістю.
Дослідження на різних тваринах показали, що вірус ММА є авірулентним навіть у тварин з послабленим імунітетом. Та ще важливіше, що штам ММА має чудові властивості, які були продемонстровані у сч широкомасштабних клінічних іспитах (Мауг еї аї., 7БІ.ВаккНуада.Ї, АрСОго., В 167, 375-390 (1987), СК! еї аІ.,, Оівсп. тей. МУзснг., 99, 2386-2392 (1974)). Обстеження вище 120000 чоловік, вакцинованих вірусом ММА, і) показали, що у цих пацієнтів, включаючи пацієнтів з підвищеним ризиком зараження, були відсутні будь-які побічні ефекти.
Було винайдено, що реплікація ММА у клітинах людини блокується на пізній стадії інфікування, що сприяє о зо попередженню зборки зрілих інфекційних віріонів. Однак ММА здатний експресувати вірусні та рекомбінантні гени на високому рівні навіть у непермесивних клітинах, в результаті чого було запропоновано, що вірус ММА (7 може служити в якості ефективного та безпечного вектору експресії генів (ЗиНег, с. апа Мозв, В. (1992) «г
Ргос.Май.Асайд.Зсі. О5А, 89, 10847-10851). Нещодавно були розроблені нові системи векторів на основі вірусу
ММА, що має чужорідні ДНК-послідовності, які вбудовані до сайту делеції І в геномі ММА або в гені ТК Щео,
ІзиНег, 0. та Мозз, В (1995) Юеу.Віо!. (апа.Вазе!, Кагдег, 84, 195-200 та патент США Мо51851461. М
Для подальшого більш перспективного використання ММА, були проведені дослідження для розробки нових можливих шляхів введення чужорідних генів до штаму ММА вірусу коров'ячої віспи з використанням техніки рекомбінантних ДНК. Оскільки зміна геному вірусу ММА не була метою цих досліджень, то необхідно було використати цей метод, який відповідав би цим цілям. У відповідності з даним винаходом, була здійснена « рекомбінація шляхом вбудовування чужорідної ДНК-послідовності до вірусної ДНК точно в сайт натуральної з с делеції, що є в геномі ММА.
Даний винахід включає, іпіег аа, до свого об'єму (окремо або в комбінації): ;» рекомбінантний вірус ММА, що містить та здатний експресувати антиген людської тирозинази (НТУг); вищевказаний рекомбінантний вірус ММА, в якому НТуг ген знаходиться під транскрипційним контролем раннього/пізнього промотору р7.5 вірусу коров'ячої віспи; -І вищевказаний рекомбінантний вірус ММА, не здатний реплікуватися у клітинах людини; еукаріотична клітина, інфікована іп міго або ех мімо вищевказаним рекомбінантним вірусом ММА; о використання вищевказаного рекомбінантного вірусу ММА для продукування іп мімо рекомбінантного пТуг їх протеїну; вакцина, що містить вищевказаний рекомбінантний вірус ММА у фізіологічно прийнятному носії; - використання вищевказаного рекомбінантного вірусу ММА для приготування вакцини; о вищевказаний рекомбінантний вірус ММА або вищевказана вакцина для імунізації живого організму тварини, включаючи людину; вищевказаний рекомбінантний вірус ММА або вакцина для попередження або лікування меланоми.
Термін "ген" означає ДНК-послідовність, яка кодує білок або пептид.
Термін "сторонній ген" означає ген, вбудований до ДНК-послідовності, в якій цей ген звичайно відсутній.
Ф) Модифікований вірус коров'ячої віспи Анкара (ММА), що має обмежене коло хазяїв та є у вищому ступені ка атенуйованим штамом вірусу коров'ячої віспи, не здатний розмножуватись у клітинах людини та в досліджених клітинних лініях більшості інших ссавців. Однак, оскільки експресія вірусного гену не порушується в бо непермесивних клітинах, то у відповідності з даним винаходом, рекомбінантні віруси ММА можуть бути використані в якості абсолютно безпечних та ефективних експресійних векторів.
Рекомбінантні віруси ММА, що кодують антигенну детермінанту
В одному з варіантів здійснення даний винахід відноситься до рекомбінантного вірусу ММА коров'ячої віспи, що містить ген, який кодує чужорідний антиген, переважно патогенний агент; та до вакцин, що містять вказаний 65 вірус у фізіологічно прийнятній формі. Даний винахід також відноситься до способів отримання вказаного рекомбінантного вірусу коров'ячої віспи ММА або вакцин на основі цього вірусу та до використання цих вакцин для профілактики інфекційних захворювань, викликаних вказаними патогенними агентами.
У переважному варіанті даного винаходу, чужорідним геном, що вбудований до вірусу ММА, є ген, що кодує пеї ВІЛ.
Авторами даної заявки були сконструйовані рекомбінантні віруси ММА, які дозволяють здійснити експресію гену пеї ВІЛ-1 під контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи. Регуляторний білок Меї лентивірусів приматів синтезується на ранній стадії реплікативного циклу вірусу; при цьому було показано, що цей білок грає важливу роль в реплікації вірусу з високим титром та індукуванні захворювань іп мімо. Це дозволяє передбачити, що пеї ВІЛ може грати вирішальну роль у патогенезі СНІДу. Молекулярні механізми, /о завдяки яким пеї сприяє збільшенню інфекційності та патогенності вірусу ВІЛ, потребують додаткового дослідження. Однак очевидно, що пеї є імуногенним, та пеї-специфічний антиген може бути використаний у якості вакцини проти ВІЛ-інфекції та СНІДУ.
У відповідності з цим очевидно, що, з однієї сторони, рекомбінантний вірус ММА, що експресує ген пеї ВІЛ, може бути використаний у якості профілактичної вакцини проти ВІЛ для імунізації людини, а з іншої сторони, /5 Він може бути використаний для імунотерапії ВІЛ-інфікованих пацієнтів або хворих на СНІД. Окрім того, рекомбінантний вірус ММА, що експресує ген пеї ВІЛ, може бути використаний для продукування рекомбінантного білка ВІЛ.
В іншому переважному варіанті здійснення даного винаходу чужорідним геном, вбудованим до вірусу ММА, є ген, що кодує тирозиназу людини.
Авторами даної заявки були сконструйовані рекомбінантні віруси ММА, які дозволяють здійснити експресію гену тирозинази людини під контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи. Нещодавно тирозиназа людини була ідентифікована як меланомо-специфічний пухлинний антиген, який сприяє генеруванню протипухлинних цитолітичних Т-лімфоцитів (|Вгіснага, М., еї аї., (1993) 9О.Ехр.Мед., 178, 489-495). Оскільки серед нормальних клітин, вірогідно, лише меланоцити експресують ген тирозинази, то очевидно, що тирозиназа с ов є цінним антигеном-мішенню для імунотерапії меланоми. Тому рекомбінантний вірус ММА, що експресує ген тирозинази людини, може бути використаний для продукування у пацієнтів, що страждають меланомою, імунної і) відповіді, яка стимулює відторгнення пухлини або попереджуючої появи метастазів. Рекомбінантний вірус ММА, що експресує ген тирозинази людини, може бути використаний безпосередньо в якості вакцини проти меланоми, чи цей вірус може бути використаний для продукування рекомбінантного білка тирозинази, який може служити в. су
Зо якості антигену у вакцинних препаратах. В іншому прикладі, клітини, що взяті з пухлини пацієнта, можуть бути модифіковані іп мійго з використанням у якості вектору рекомбінантного вірусу ММА, що експресує ген -- тирозинази людини, а потім модифіковані клітини, що експресують тирозиназу, переносять зворотно в організм /-«ф пацієнта для індукування у нього протипухлинної імунної відповіді. Вакцина, отримана на основі рекомбінантного ММА, що експресує ген тирозинази людини, може бути використана або парентерально, або о з5 Місцеве шляхом введення безпосередньо в область пухлини. Для попередження появи метастазів або для ча фенотипічної зміни пухлини, наприклад зміни її розмірів, форми, консистенції, васкуляризації або інших ознак, вакцина, отримана на основі рекомбінантного вірусу ММА, що експресує ген тирозинази людини, може бути введена до, під час або після хірургічного видалення пухлини.
Для виготовлення вакцин у відповідності з даним винаходом віруси коров'ячої віспи ММА готують у « відповідній фізіологічне прийнятній формі. Це може бути зроблено, виходячи з досвіду отримання ММА-вакцин, з с призначених для противіспяної вакцинації (як описано їсКІ, Н. еї аї., (1974) Оівсп.теа.М/вспг., 99, ц 2386-2392). Для цього близько 105-108 частинок рекомбінантного ММА ліофілізують у 100мл забуференого "» фосфатом фізіологічного розчину (РВ5З) у присутності 295 пептону та 195 альбуміну людини в ампулі, переважно у скляній ампулі. Ліофілізат може містити наповнювачі (такі як маніт, декстран, цукор, гліцин, лактоза або полівінілпіролідон) або інші добавки (такі як антиоксиданти, стабілізатори т.ін.), які підходять для -І парентерального введення. Потім скляну ампулу герметично запаюють, та ця ампула може бути залишена на зберігання протягом декількох місяців при температурі переважно -20296. і-й Для вакцинації або терапії ліофілізат може бути розчинений у 0,1-0,5мл водного розчину, переважно г» фізіологічного розчину, та введений або парентерально, наприклад шляхом внутрішньом'язової інокуляції або цу бо локально, наприклад шляхом інокуляції у саму пухлину або в область локалізації пухлини. Вакцини або терапевтичні засоби даного винаходу переважно вводять шляхом внутрішньом'язової ін'єкції (Мауг, А. ейаї., 2 (1978) 2БІ.ВакуНуа., ІАБіОгід. В, 167, 375-390). Спосіб, доза та схема введення можуть бути оптимізовані власне фахівцем відомими способами. Для того щоб отримати відповідну імунну відповідь проти чужорідного антигену, бажано вводити вакцину декілька разів протягом тривалого періоду часу.
У відповідності з даним винаходом рекомбінантні віруси коров'ячої віспи ММА можуть бути також використані для продукування гетерологічних поліпептидів в еукаріотичних клітинах. Для цього клітини інфікують
ІФ) рекомбінантними вірусами коров'ячої віспи. В інфікованих клітинах експресуються гени, що кодують чужорідний ко поліпептид, в результаті чого продукується гетерологічний поліпептид, який потім виділяють. Методи, що використовуються для продукування таких гетерологічних поліпептидів, добре відомі фахівцям (ЕР-А-206920 та 60 ЕР-А-205939). Поліпептиди, продуковані за допомогою рекомбінантних вірусів ММА, більше підходять, виходячи з конкретних властивостей вірусів ММА, для використання у якості лікарських засобів для введення людині та тваринам.
В іншому варіанті здійснення даного винаходу авторами винаходу були сконструйовані рекомбінантні віруси
ММА, що дозволяють експресувати ген РНК-полімерази бактеріофага Т7 під контролем раннього/пізнього 65 промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи. Ефективність рекомбінантних вірусів ММА-рої! 17 у якості експресуючих систем оцінювали за допомогою аналізу методом короткочасної трансфекції для індукування експресії рекомбінантних генів під контролем промотору РНК-полімерази 17. Використовуючи в якості гена-репортера ген хлорамфеніколацетилтрансферази (САТ) Е.соїї, автори винайшли, що ММА-рої! Т7-індукована експресія гену САТ є такою ж ефективною, як і експресія, індукована вірусом коров'ячої віспи/рої Т7/, що походить від
Компетентного по відношенню до реплікації штаму МУК вірусу коров'ячої віспи.
Таким чином, гібридна система ММА-роЇ! Т7 даного винаходу може бути використана в якості простої, ефективної та безпечної експресійної системи для продукування поліпептидів у клітинах ссавців при відсутності вірусу коров'ячої віспи.
Ця експресійна система може бути також використана в цілях генерування рекомбінантних вірусних частинок 7/0 для вакцинації або генної терапії шляхом трансформації клітинних ліній, які інфіковані рекомбінантним вірусом
ММА, що експресує РНК-полімеразу 17, тобто інфікованих ДНК-конструкцією, що містить усі або деякі гени, та геном або рекомбінантний геном, які необхідні для генерування вірусних частинок, наприклад, ММА-частинок або ретровірусних частинок під транскрипційним контролем промотору РНК-полімерази 17.
Векторні системи на основі ретровірусів складаються з двох компонентів: 1) першим компонентом є власне ретровірусний вектор, що представляє собою модифікований ретровірус (векторну плазміду), в якому гени, що кодують вірусні білки, були замінені терапевтичними генами та маркерними генами, які необхідні для введення у клітину-мішень, оскільки така заміна генів, що кодують вірусні білки, приводить до значного пошкодження вірусу, то цей вірус може бути "врятований" за допомогою другого компоненту в системі, який доповнює відсутність вірусних білків у модифікованому ретровірусі; 2) другим компонентом є клітинна лінія, яка продукує великі кількості вірусних білків, але при цьому не має здатності продукувати компетентний по реплікації вірус. Така клітинна лінія відома як лінія клітин з дефектом упаковки та представляє собою клітинну лінію, трансфіковану однією або декількома плазмідами, що несуть гени (гени дад, роЇ та епу, що кодують поліпептиди), які забезпечують упаковку модифікованого ретровірусного вектора. с
Для генерування запакованого вектору, векторну плазміду трансфікують у лінію клітин з дефектом упаковки.
В цих умовах модифікований ретровірусний геном, що включає вбудовані терапевтичні та маркерні гени, і) транскрибується з векторної плазміди та упаковується в модифіковані ретровірусні частинки (рекомбінантні вірусні частинки). Потім цей рекомбінантний вірус використовують для інфікування клітин-мішеней, у ДНК яких можуть інтегруватися геном вектора та будь-які присутні в ньому маркерні або терапевтичні гени. Клітина, що о зо інфікована такою рекомбінантною вірусною частинкою, не може продукувати новий векторний вірус, оскільки в цих клітинах відсутні вірусні білки. Однак ДНК вектор, що несе терапевтичні та маркерні гени, інтегрується в --
ДНК клітини, та може експресуватися в інфікованих клітинах. «г
У відповідності з даним винаходом, рекомбінантний вірус ММА, що експресує РНК-полімеразу 17, може бути використаний для продукування білків, які необхідні для упаковки ретровірусних векторів. Для цього гени дад, о рої, епм ретровірусу (наприклад, вірус лейкоза мишей (МІ М)) вміщують в один або декілька експресійних ї- векторів (наприклад, плазмід) під транскрипційний контроль промотору РНК-полімерази Т7, разом з експресійним вектором, що несе ретровірусну векторну конструкцію, можливо під транскрипційним контролем промотору РНК-полімерази 17.
ІВ УМО 94/29437, МО 89/11539 та МО 96/07748)| описані різні типи ретровірусних векторних конструкцій, які « 70 Можуть бути упаковані з використанням системи для упаковки, яка описана вище. в с Окрім того, рекомбінантний вірус ММА, що експресує РНК-полімеразу Т7, може бути використаний для . продукування рекомбінантних білків, неінфікованих вірусних частинок, або інфекційних мутантних вірусних и?» частинок у цілях виготовлення вакцин або терапевтичних засобів |Висної еї аї., Мігоїоду, 204, 770-776 (1994) та ЕР-В 1-356695). Для цього вірусні гени (наприклад, гени дад-роЇ та епм вірусу ВІЛ-1) вміщували під транскрипційний контроль промотору 17 в експресійний вектор (наприклад, у плазміду або інший рекомбінантний -І вірус ММА). Потім цю конструкцію вводили до клітин, що інфіковані рекомбінантним вірусом ММА, який експресує
РНК-полімеразу 17. о Гени рекомбінантного вірусу транскрибуються з високим ступенем ефективності, в результаті чого можуть їх бути отримані та очищені білки у великих кількостях. Окрім того, експресовані рекомбінантні вірусні білки 5р (наприклад, епу, дад ВІЛ-1) можуть збиратися у вірусні псевдочастинки, які реплікуються та відділяються від - клітини, після чого вони можуть бути виділені з середовища з тканинною культурою. В іншому варіанті о здійснення винаходу, вірусні білки (наприклад, вірусів ВІЛ, 5ІМ та вірусу кору), що експресуються ММА-рої! Т7 системою, можуть спасати додатково введений мутантний вірус (який походить, наприклад від ВІЛ, ЗІМ, вірусу кору) шляхом подолання дефекту інтеграції; а також інфікування, декапсидація, реплікація нуклеїнової кислоти, ов експресія вірусного гена, збирання, баддінг або інша стадія розмноження вірусу дозволяють виконувати продукування і очищення вищезгаданого мутантного вірусу.
Ф) Вірус ММА-рої! Т7 може бути також використано разом з ДНК-послідовностями, що несуть ген потрібного ка антигена (наприклад, ген ВІЛ, пеї, Фаї, рої, дад, епм або інші гени), необхідний для імунізації. Спочатку кодуючу послідовність даного антигена (наприклад ВІЛ, НСМ, НРМ, НОМ, вірусу кору, вірусу грипу або ін.) бо Клонують під контролем промотора РНК-полімерази Т7 переважно в плазмідний вектор, а отриману
ДНК-конструкцію ампліфікують та очищують з використанням стандартних лабораторних процедур. Потім векторну ДНК інокулюють одночасно або з деяким інтервалом часу разом з ММА-рої 77. В місці інокуляції потрібний рекомбінантний ген піддається тимчасовій експресії в клітинах, які містять векторну ДНК і ММА-рої
Т7, і відповідний антиген презентується імунній системі хазяїна, стимулюючи антиген-специфічну імунну 65 відповідь. Ця схема, що передбачає використання вектора ММА-рої! 17, що не реплікується, на основі вірусу коров'ячої віспи, є багатообіцяючим новим способом вакцинації нуклеїновою кислотою, що забезпечує ефективну часову експресію даного антигена, але при цьому дозволяє уникнути потенціального ризику конститутивної експресії гена.
Рекомбінантні віруси ММА, що походять від вірусу коров'ячої віспи, можуть бути отримані, як описано нижче.
ДНК-конструкцію, яка містить ДНК-послідовність, що кодує чужорідний поліпептид, ірланковану ММА-ДНК послідовностями, суміжними з природною делецією, наприклад делецією ІІ в геномі ММА, вводять в клітини, інфіковані вірусом ММА, в результаті чого відбувається гомологічна рекомбінація.
Після введення ДНК-конструкції в еукаріотичні клітини і після рекомбінації із заміною вірусної ДНК на чужорідну ДНК, рекомбінантний вірус коров'ячої віспи може бути виділено відомими способами, переважно за 7/0 допомогою маркера (|пор. МаКапо сеї аїЇ., Ргос.МаЧЦ.Асад.Зс. ОЗА.79, 1593-1596 (1982), Ргапке еї аї).,
Мої.СНІ.Віої, 1918-1924 (1985), Спакгабвагії еї аї., Мої.СКІ.Віо!, 3403-3409 (1985), Раі еї аї. Мігоїоді 97-105 (1986)).
ДНК-конструкція, що вводиться, може бути лінійною або кільцевою. Більш бажаною є кільцева ДНК, зокрема - плазміда. ДНК-конструкція містить послідовності що фланкують лівий і правий краї природної делеції, наприклад делеції І в геномі ММА |АМепригдег УУ., Зщег С.Р., АМКепригдег 9. (1989) Агсп.Мігої, 105,15-27). 7/5 Чужорідну ДНК-послідовність вбудовують між послідовностями, що фланкують природну делецію. Такою чужорідною ДНК-послідовністю може бути ген, що кодує терапевтичний поліпептид, наприклад, ЕРА або інтерферон, або антигенну детермінанту патогенного агенту. Такими патогенними агентами можуть бути віруси, бактерії і паразити, які можуть викликати захворювання, а також пухлинні клітини, які безконтрольно розмножуються в організмі і можуть приводити до утворення і зростання пухлини. Приклади таких патогенних го агентів (описані Оаміз В.О. еї аЇ., Місгоріоюду, Зга ей., Нагрег Іпіегпайопа! Едйоп). Більш бажаними антигенами патогенних агентів є віруси імунодефіциту людини (наприклад, ВІЛ-1 і ВІЛ-2), мікобактерії, що викликають туберкульоз, паразит Ріазтоадаіцт ТаЇІсірагит і клітини меланоми.
Для експресії ДНК-прослідовності або гена потрібна присутність регуляторних послідовностей, які необхідні для транскрипції генів, що присутні на ДНК-послідовності. Такі регуляторні послідовності (що називаються сч г промоторами) добре відомі спеціалістам, та прикладом таких послідовностей може служити промотор гену вірусу коров'ячої віспи, що кодує поліпептид 11кДа (описано в ЕР-А-1983281), і промотор гена, що кодує 7,5кДа і) (описано в ЕРА-110385).
ДНК-конструкцію може бути введено в ММА-інфіковані клітини шляхом трансфекції, наприклад шляхом преципітації фосфатом кальцію |бгапат еї аї. Мігої., 52,456-467 (1973); МУідіег еї аї.,Сеї,777-785 (1979); «є зр шляхом електропорації |Меитапп еї аі., ЕМВО У., 1, 841-845, (1982)); шляхом мікроїін'єкції |Сгаєзтапп еї а).,
Мей. Еплутоїіоду, 101, 482-492 (1983); шляхом використання ліпосом |Зігашріпдег еї аї.,, Меїйодавз іп --
Еплутоїоду, 101, 512-527 (1983), за допомогою сферопластів |Зспапнпег, Ргос.МакнН.Асай.Зсі. О5А, 77, «г 2163-2167 (1980)), або якимось іншими відомими методами. При цьому більш бажаним методом трансфекції є осаджування фосфатом кальцію. о
Для кращого розуміння суті цього винаходу нижче наводяться докладні приклади його втілення. Однак ці ї- приклади не повинні розглядатися як деяке обмеження об'єму винаходу.
Фіг1: Схематична карта генома ММА і плазміди для інсерції чужорідної ДНК шляхом гомологічної рекомбінації: НіпаПІ-рестрикційні сайти в геномі ММА вказані зверху. Вказана також НіпапП-Ніпані
М-фрагмент (900п.0.), який перекриває область делеції ІІ в геномі ММА. ДНК-послідовності ММА, що примикають « до делеції І! (край 1 (Папк 1)) та край 2 (Папк 2)) були ампліфіковані за допомогою полімеразної ланцюгової пт») с реакції (РОК) та використані для конструювання інсерційної плазміди рос ПІ 7. . Фіг2: рус І 17 Р7.5: плазмідний вектор ММА, що призначений для інсерції в делецію ІІ та містить и?» експресуючий Р111-І ас/-кластер та ранній/пізній промотор Р7.5 вірусу коров'ячої віспи, для експресії потрібних генів, які можуть бути клоновані у Зтаї!-сайт плазміди.
Фіг.3: рус І 1 7де! Р7.5: ММА-плазмідний вектор для інсерції чужорідних генів в сайт делеції ІІ у геномі -І ММА, що містить експресійний Р111-Ї ас7-кластер, що самоделетуючий, та ранній/пізній промотор Р7.5 вірусу коров'ячої віспи для експресії потрібних генів, які можуть бути клоновані в Зта1/Мой1-сайт клонування плазміди. о Фіг.4: Конструювання рекомбінантного вірусу ММА-ро! Т7: схематичні карти геному ММА (рестрикційні їх Ніпапі-сайти ендонуклеази) та векторна плазміда рус ІІ 17 Т7рої, за допомогою якої здійснюють інсерцію ген 5р о /РНЕ-полімерази 17 в сайт делеції ІІ в НіпаПП-фрагменті М геному ММА. - Фіг.5: Саузерн-блот-аналіз ДНК вірусу ММА-рої 17. о Фіг.6: Метаболічне мічення білків з використанням | 2551 метіоніну. Аналіз за допомогою електрофорезу в
ПААГ з ДСН. Смуга 1: ММА-рої!Т7; смуга 2: ММА; смуга З: клітини СМ-1.
Фіг.7: САТ-аналіз: клітини СМ-1 трансфікували плазмідою, що містить ген САТ під контролем промотору
РНК-полімерази 776 та інфікували вірусом ММА-Т/роЇ або МУК-роІ17. Лізати тестували на САТ-активність "С" означає хлорамфенікол, та 1-АсС та 3-АсС означають моно- та триацетильовані форми хлорамфеніколу.
Ф, САТ-активність виражали як процент ацетильованого продукта, утвореного за 60 хвилин. ко Фіг.8: Конструювання ММА-Г АїІпе/: схематичні карти геному ММА (рестрикційні НіпапППІ-сайти ендонуклеази) та векторної плазміди рис І І 7аеї р7.5-І АІпеї, за допомогою якої здійснюють інсерцію гену пеї ВІЛ-1 І АЇ в сайт бо делеції ІІ в Ніпапйі - фрагмент М геному ММА.
Фіг.9: Конструювання ММА-пТУК: схематичні карти геному ММА (рестрикційні НіпапПІ-сайти ендонуклеази) та векторної плазміди рос ІІ І 7ае! Р7.5-ТУК, за допомогою якої здійснюють інсерцію гену тирозинкінази в сайт делеції ІІ в Ніпай -фрагметі М геному ММА.
Приклади 65 1. Культивування та очистка вірусів 1.1. Культивування вірусів ММА
Вірус ММА є у високому ступені ослабленим вірусом коров'ячої віспи, отриманим від штаму вірусу коров'ячої віспи Анкара (СМА) в результаті довготривалого серійного ласування на культурі первинних фібробластів курячого ембріону (СЕР). Із загальним оглядом історії продукування, властивостей та використання штаму ММА можна ознайомитись у коротких |публікаціях Мауг еї аї., іп Іптесіоп, 3, 6-14 (1975)). Завдяки атенуації в
СЕР, в цій пташиній клітині-хазяїні вірус ММА реплікується з високим титром. Однак у клітинах ссавця ріст ММА сильно обмежений, та звичайне утворення бляшек під дією вірусу не виявляється. Тому вірус ММА був культивований на клітинах СЕР. У цілях отримання клітин СЕРЕ 11-денні ембріони виділяли з інкубованих курячих яєць, кінцівки видаляли, та ембріони подрібнювали та дисоціювали в розчині, що містить 0,2595 трипсину, за 7/0 температури 372С протягом 20 хвилин.
Отриману клітинну суспензію фільтрували та клітини осаджували шляхом центрифугування при 2000об./хв. у центрифузі Зогмаі! КС-3ЗВ за кімнатної температури протягом 5 хвилин, а потім ресуспендували в 10 об'ємах середовища А (середовище Ігла (ОМЕМ), що отримується, наприклад, від І Ше Тесппоіодіез стрН, Еддепвіевїп,
Септапу), після чого знову осаджували шляхом центрифугування при 2000 об/хв. у центрифузі Зогмаї! КС-З3В за 7/5 кімнатної температури протягом 5 хвилин. Після центрифугування клітинний осад переносили в середовище А, що містить 1095 фетальну сироватку теляти (ЕС), пеніцилін (10бодиниць/мл), стрептоміцин (1ООмг/мл) та 2М0М глутамін, у результаті чого отримували клітинну суспензію, що містить 500000 клітин/мл. Клітини СЕК, отримані у такий самий спосіб, наносили шляхом розпилення на чашки для культивування клітин. Ці клітини культивували в середовищі А в інкубаторі з СО» за 372С протягом 1-2 днів залежно від потрібної щільності клітин та використовували для інфікування або відразу, або після одного клітинного пересіву. Детальний опис отримання первинних культур може бути знайдено |в роботі К.І.Ргезппеу, "СиМйиге ої апіта! сеї", Аіап К. І ізв Мепад
Мем Хогк 1983. Спаріег ІІ, стор. 99).
Віруси ММА інфікували наступним чином. Клітини СЕРЕ культивували в 175см флаконах для культивування клітин. При 90-10095 суцільності середовище видаляли, та клітини інкубували протягом однієї години з Га ор; суспензією вірусу ММА (0,01 одиниць інфекції (МЕ) на клітину, О,02мл/см) в середовищі А. Потім додавали додатково кількість середовища А (0,2мл/см) та флакони інкубували за температури 372С протягом 2-3 днів і) (доки 90905 клітин не починали проявляти цитопатогенний ефект). Неочищений вірусний вихідний матеріал був отриманий шляхом зскрібання клітинних моношарів у середовищі та осадження клітинного матеріалу шляхом центрифугування при ЗО0О0боб./хв. у центрифузі Зогма! КОС-3ЗВ за температури 49С протягом п'яти хвилин. (ав) Неочищений вірусний препарат зберігали за температури -209С перед подальшою обробкою (наприклад, - очисткою вірусу). 1.2. Очистка вірусів «
Для того щоб отримати по можливості чистий вірусний препарат, який не містить компонентів, специфічних ю для цієї хазяйської клітини, проводили стадії очистки способом, аналогічним (описаному ЧокКіїкК Мігоіоду, 18, 9-18 (1962)). Неочищений вірусний вихідний матеріал витримували за температури -202С, а потім відтаювали та ї- один раз суспендували в РВ5 (10-20-кратний об'єм осаду), після чого суспензію центрифугували, як описано вище. Щойно отриманий осад суспендували в десяти об'ємах буферу Трис 1 (10мМ Трис-НСІ, рН-9,0), та суспензію швидко обробляли ультразвуком (І арзопіс І.., В.Вгашп Віоїесі Іпіегпайопаї!, МеіІзипдеп, Септапу; 2х10 « секунд при бОВат та при кімнатній температурі) в цілях подальшого дезінтегрування клітинного дебрису та вивільнення вірусних часток з клітинного матеріалу. Ядра клітин та більшу частину клітинного дебрісу видаляли З с шляхом швидкого центрифугування суспензії (роторна центрифуга Зогмаї! С5А від ЮиРопі Со., ЮО-6353 Вай "з Мам/івїт, ЕКО; З хвилини при З00Ооб./хв. та температурі 1022). Осад знову один раз суспендували в буфері Трис " 1, обробляли ультразвуком та центрифугували, як описано вище. Зібрані супернатанти, що містять вільні вірусні частки, об'єднували та покривали градієнтом 1Омл 3695 сахарози в 10мМ Трис-НСІ з рН-9,0, а потім центрифугували в центрифузі Весктап ЗМУ 27/5МУ 28 при 13500о06./хв. протягом 80 хвилин за температури 426. і Потім супернатант відкидали, а осад, що містить вірусні частки, розчиняли в ТОмл їмММ Трис-НСІ з рН-9,0, с гомогенізували шляхом швидкої обробки ультразвуком (2 х10 секунд за кімнатної температури з використанням ї» пристрою, описаного вище) та наносили на градієнт 20-4095 сахарози (сахароза в їмл Трис-НСІ, рН-9,0) для подальшої очистки. Градієнт центрифугували в роторній центрифузі Весктапп ЗМУ41 при 13000о6./хв. протягом - 70 50 хвилин за температури 42С. Після центрифугування дискретні смуги, що містять вірусні частки, збирали о шляхом піпетування після зменшення об'єму вищевказаної смуги. Отриманий розчин сахарози розводили трьома об'ємами РВ5 та вірусні частки знову осаджували шляхом центрифугування (Весктапп ЗМУ27/28, 60 хвилин при 13500об./хв., температура 42С). Осад, який складався головним чином з чистих вірусних часток, ов ресуспендували в РВЗ та врівноважували до середніх концентрацій вірусу, що складає в середньому 1-5Х109МЕ/мл. Розчин очищеного вірусного вихідного матеріалу зберігали при -809С та використовували або і) відразу, або розводили фосфатно-буферним фізіологічним розчином для проведення подальших експериментів. ко 1.3. Клонування вірусу ММА
Для генерування гомогенних вихідних вірусних препаратів вірус ММА, отриманий від Ргої. Апіоп Мауг, 60 клонували шляхом лімітуючого розведення протягом трьох подальших пересівів у клітини СЕРЕ, культивовані на 9б-лункових планшетах для культивування тканини. Клон б ММА відбирали та ампліфікували в СЕЕ з отриманням маточних розчинів вірусу, які служать у якості вихідного матеріалу для генерування рекомбінантних вірусів ММА, описаних у даній патентній заявці, а також для генерування рекомбінантних вірусів ММА, описаних раніше І(ЗиЩег, б. та Мозе, В., (1992) Ргос. Май.Асайд.5сі БА 89, 10847-10851; ЗиуНег, б., МУуацй, ї, Еоіеу, 65 Р., ВеппіпК, У. та Мовв, В., (1994), Массіпе 12, 1032-1040; Нігесп, М., Ецегві, Т., ЗщЦег, с., Саїтої|Ї, М,.,
Мапа, Г., Соідвівіп, 5., Ріайак, М., ЕїКіпв, МУ., АїЇмога, б., Мопіейогі, О., Мовзв, В. апа і йвоп, ., (1986)
У. Мігої., 70 3741-3752). 2. Конструювання та характеристика рекомбінантних вірусів ММА 2.1. Конструювання векторних плазмід
У цілях генерування рекомбінантих вірусів ММА були сконструйовані нові векторні плазміди. Вбудовування чужорідних генів у геном ММА здійснювали точно в сайт природної делеції І в геномі ММА. Послідовності
ММА-ДНК, фланкуючи сайт 2500п.о.-делеції у НіпапП-фрагменті М геномі ММА |АМКепригдег, МУ. Зціег, СР. та
АКМепригдег, 9У.(1989), 9У.Агсп. МігоІ.,, 105, 15-27), були ампліфіковані за допомогою полімеразної ланцюгової реакції та клоновані в сайт множинного клонування плазміди рОС18. Праймерами для лівого б00п.о.-ДНК-краю є: /0 З-САС САС СТ АСС СТО АТС СТА САС АС ТТ СТО-3 та 5-САС САС ССС соб ТАТ ТО АТО АТТ АТТ
ТТТ ААС ААА АТА АСА-3' (сайти для рестриктуючих ферментів Крпі та Зтаї! підкреслені). Праймерами для правого 550 п.о.--ДНК-краю є: 5-САС САС СТО САС БАА ТСА ТСС АТТ ССА СТО ААТ АОС-3 та 5-САО
САС ОСА ТОС СОА СОА АСА ДОС ААС ТОТ АОС АСА-3' (сайти для рестриктуючих ферментів Рай! та р! підкреслені). Між цими краями ММА ДНК, вставленій в руС18, вбудовували ген Іас/ ЕзспПегіспіа соїї під 7/5 Контролем пізнього промотору Р11 вірусу коров'ячої віспи (отриманого шляхом гідролізу ферментом рії! 17,
ІзиЧег, С. апа Мозз, В. (1992) РМАБЗ ЗА 89, 10847-10851)) з використанням ВатнНі-сайта, в результаті чого отримували інсерційний ММА-вектор рисі! 17 (Фіг.1). Після цього 289п.о.-фрагмент, що містить ранній/пізній промотор Р7.5 вірусу коров'ячої віспи разом з ЗтаІ-сайтом для клонування (отриманим шляхом рестрикції ферментами ЕсокіІ та Хваї з плазмідного вектору ресС11 |СнакКгабагії та ін., 1985, МоІесціаг та СеїІшаг Віоіоду
З, З3403-3409)), вставляли Зтаї!-сайт росі! з отриманням ММА-вектора рисі! 17 Р7.5 (Фіг.2). Для конструювання векторної плазміди, яка дозволяє виділяти рекомбінантні віруси ММА шляхом часового синтезу репортерного ферменту-В-галактозидази, З3ЗОп.о.-ДНК-фрагмент від 3-кінця відкритої рамки зчитування іасл. БЕ. сої ампліфікували за допомогою РСК (праймери 5-САС САС ТС ЗАС ССС БАС СОС СТІ АСТ ОСС ОСо-3 та 5-56565 6050 СТО САС АТО СТА Со АС ОС ОСТ САО-3)) та клонували в заї| та Раі-сайти РСО 117 Р 7.5 з с дв отриманням ММА-вектору рис 1 І7аеї! Р 7.5 (Фіг.3). З використанням Зтаї!-сайту, ця векторна плазміда може бути використана для вставки ДНК-послідовностей, кодуючих чужорідний ген під транскрипційним контролем і) промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи, в геном ММА. Після цього потрібний рекомбінантний вірус виділяли шляхом скринінгу на експресію В-галактозидазної активності та подальше його культивування призводило до самоделеції знову сконструйованого РІІ-Ї ас7-експресуючого кластера в результаті гомологічної рекомбінації. о зо 2.2. Конструювання та характеристика рекомбінантного вірусу ММА-рої!17 3,1 КкЬр-ДНК-фрагмент, що містить повний ген РНК-полімерази бактеріофагу 77 під контролем "7 раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи, вирізали ферментом ЕсокіІ з плазміди рТЕ7-3 (Егиеві, «г
Т.Р., Міпез, Е.б., Біцаїег, Б.МУ. апа Мозв, В., (1986), Р».М»А»5» ИОЗА, 83, 8122-8126), модифікували шляхом інкубування ДНК-полімерази фрагментом Кленова для продукування тупих кінців та клонували в унікальний о
Зтаї!-сайт рестрикції /7 рисі з утворенням плазмідного вектору переносу рисІІ-І 7-ро! Т7 (Фіг.4). В якості ї- транскрипційного регулятору для експресії гену РНК-полімерази 77 був вибраний ранній/пізній промотор Р7.5 вірусу коров'ячої віспи, (наприклад, РІ11) ця промоторна система дозволяє експресувати рекомбінантні гени безпосередньо після інфікування клітин-мішеней. І 2-ро! Т7-плазміда рисі, яка забезпечує введення чужорідних генів у сайт делеції ІІ геному ММА, була використана для генерування вірусу ММА-ро! 17. «
Клітини СЕБЕ інфікували вірусом ММА при множинності інфекції ТОГО 500,05 на клітину та трансфікували ДНК ств) с плаз-І 2-рої Т/-плазміди рОСІІ, як описано раніше ІЗщшШег, сб., УУуац, ІЇ., РоІеу, Р., ВеппіпК, У. та Мозз, В., . (1994), Массіпе 12, 1032-1040). Рекомбінантний вірус ММА, експресуючий РНК-полімеразу 77 та сумісно и?» експресуючий Р-галактозидазу (Р7.5-роЇ! Т7 ММА), відбирали в результаті проведення п'яти послідовних циклів очистки методом бляшек у клітинах СЕРЕ, пофарбованих 5-бром-4-хлор-3-індоліл-В-О-галактозидом (ЗО0Омкг/мл).
Рекомбінантні віруси ампліфікували шляхом інфікування моношарів СЕРЕ, та ДНК аналізували за допомогою РОК -І для підтвердження генетичної однорідності вірусного штаму. Саузерн-блот-аналіз вірусної ДНК ММА-рої! Т7 продемонстрував стабільну інтеграцію рекомбінантних генів у сайт делеції І в геномі ММА (Фіг.5). Для о спостереження за експресією РНК-полімерази Т7 шляхом рекомбінантного ММА-роЇ! Т7 були проаналізовані «г» мічені (3581 метіоніном поліпептиди від вірус-інфікованої культури тканини. Моношари клітинної лінії нирок цу мавпи СМ-1, культивовані в 12-лункових планшетах, інфікували вірусом при множинності інфекції ТСГОв5о-20 на клітину. Через 3-5 годин після інфікування середовище видаляли, та культури один раз промивали Імл о середовища, що не містить метіоніну. В кожну лунку додавали 0,2мл середовища, що не містить метіоніну, разом з БомкКи (2581 метіоніном та середовище інкубували протягом 30 хвилин за 372С. Цитоплазматичні екстракти інфікованих клітин отримували шляхом інкубування кожної лунки в 0,2мл 0,595 буферу для лізису Мопідеї Р-40 протягом 10 хвилин при 372С, та зразки аналізували шляхом електрофорезу в ПААГ з ДСН. Метаболічне мічення о клітин СМ-1 вірусом ММА-рої 17 виявило синтез двох додаткових поліпептидів (ї) білку розміром біля 116000Да, що представляє собою сумісно експресовану В-галактозидазу Е.соїї, яка дозволяє проводити скринінг на ю рекомбінантний вірус; та (ії) білка з очікуваним розміром 98000Да, що відповідає РНК-полімеразі бактеріофагу 77 (Фіг.6). При цьому було відмічено, що ММА-Т7рої! продукує велику кількість В-галактозидази. Експерименти з 60 іп мімо-міченням продемонстрували дуже високий рівень експресії РІІ-Їас2-ген-вмісній конструкції, введеній у геном ММА в сайт делеції 11, що свідчить про те, що рекомбінантні гени у векторному вірусі ММА можуть бути експресовані з великою ефективністю в тому випадку, якщо вони вбудовані саме в цій локус геному ММА.
Ефективність рекомбінантних вірусів ММА-рої 77 як експресуючих систем у порівнянні з рекомбінантним
МУК-Т7рої вірусом мТЕ7-3 (Ецегві та ін., 1986) оцінювали шляхом котрасфекції ДНК плазмідного вектору, що бо походить від рРТМІ! |Мовв, В., ЕІгоу-5іеіп, О., Мігикаті, Т., АІехапдег, МУ.А., ЕРцегві Т.к. (1990) МайшШге, 348, 91-92), та містить ген (клонований у МсоІ- та ВатНІі-сайти множинного клонування ртМ'1)
хлорамфеніколацетилтрансферази (САТ) Е.соїї під контролем промотору РНК-полімерази 77 (РІ?)
Трансфіковані та інфіковані клітини СМ-1 суспендували в 0,2мл 0,25М Трис-НСІ (рН-7,5). Після трьох циклів заморожування-відтаювання лізати освітлювали шляхом центрифугування, а потім визначали вміст білка в супернатантах, та зразки, що містять 0,5; 0,25; 0, 1мкг повного білку, аналізували на ферментну активність методом, (описаним Маскей, М., Зтійй, с... Мозгз, В., (1984), 9.Мігої, 49, 857-864). Після авторадіографії кількість мічених плям оцінювали з використанням візуалізуючої аналітичної системи Еціі. Отримані результати проілюстрували, що шляхом використання у високому ступені атенуйованого вектору ММА на основі вірусу коров'ячої віспи може бути отримана система "вірус коров'ячої віспи-РНК-полімераза 17", яка являється такою ж /о ефективною, як і при використанні досить компетентного по реплікації рекомбінанта на основі вірусу коров'ячої віспи (Фіг.7). 648п.0о.-ДНК-фрагмент, що містить повний ген пеї ГАЇ ВІЛ-1, отримували за допомогою РСК з плазмідною
ДНК (рто1166, люб'язно наданою М.-Р. Кіепу, Ттапздепе 5.А., Зігазроиго; для РОК використовували наступні праймери: 5-САС САС БА ТСС АТО ОСТ ОС ААС ТО ТСА ААА АСТ АСТ-3 та 5-САО САС ОА ТСС АТО /5 ТСА СА ТТ СТІ ВАА СТА СТО Соб-3), гідролізували рестриктуючою ендонуклеазою Ватні, модифікували шляхом інкубування з ДНК-полімеразою Кленова для "затупіння кінців", та клонували в ЗтаїІ-сайт рис І І 2-ае!
Р7.5, в результаті чого отримували вектор рис ІІ І 7ае! Р7.5-І АІпеї (Фіг.8). Ця плазміда може бути використана для конструювання рекомбінантного вірусу ММА, який експресує ген пеї ВІЛ-1-ЇАЇ під контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи.
Клітини СЕРЕ, інфіковані вірусом ММА при множинності зараження ТСІОв5о-0,05 (ТСІЮ - середня цитопатогенна доза) на клітину, трансфікували ДНК плазміди рис Ії І 7аеІ-Р7.5-І АІпеї, як описано раніше (З!иЦег, б., УУуай,
Г., Боіеу, Р., Веппіпк, 9., Мовгв, В. (1994) Массіпе, 12, 1032-1040). Рекомбінантні віруси ММА, що містять ген пеї та сумісно маркерний ген І ас7 Е.соїї, що сумісно експресується з часовою регуляцією, відбирали шляхом проведення послідовних циклів очистки методом бляшек у клітинах СЕР, пофарбованих сч 5-бром-4-хлор-3-індоліл-В-О-галактозидом (З0Омкг/мл). Після цього рекомбінантні віруси, що містять ген пеї та мають делетований маркерний ген І ас7, виділяли шляхом проведення ще трьох додаткових послідовних циклів і) очистки методом бляшек, здійснюючи скринінг на непофарбовані фокуси вірусу у клітинах СЕРЕ у присутності 5-бром-4-хлор-3-індоліл-В-О-галактозида (ЗООмкг/мл). Потім рекомбінантні віруси ампліфікували шляхом інфікування моношарів, та ММА-І АІпеї-вірусну ДНК аналізували за допомогою РОК для того, щоб упевнитись у о зо генетичній гомогенності вірусного штаму. Саузерн-блот-аналіз вірусної ДНК підтвердив генетичну стабільність
ММА-І АІпеї та явно продемонстрував інтеграцію гену пеї та делецію маркерного гену ас Е. соїїЇ в сайті -- делеції 11 у вірусному геномі. «г
Ефективна експресія рекомбінантного білку Меї була підтверджена за допомогою Вестерн-блот-аналізу білок-продукуючих лізатів клітин СЕРЕ, інфікованих вірусом ММА-Г АІпеї з використанням мишачих тАВ проти Меї о
ВІЛ-1 (люб'язно наданих К.Кгопп та використаних (як описано Омод, У., І адегвіеді, А., Капкі, А., Сотрегі, Е., ї- зЗропп, К., Тапііпеп, М., Чипо, О., Кгопп, К. (1992) АІЮ5, 6, 25-34). 1,9п.о. -ДНК-фрагмент, що містить повний ген, кодуючий тирозиназу людини І(кДНК-клон тирозинази 123.82 виділяли з клітинної лінії меланоми 5К29-МЕГ. пацієнта 5К29 (АМ), СепВапк Мо допуску ОО1873; Вгіснага, М., Мап
Реї, А., МУбібеії, Т., МуУбМеі, С, Ое Ріаєп, Е., Іе(Ше, В, Соціе, Р. та Вооп, В. (1993), 9.Ехр.Медй., 178, « 489-495) отримували з плазміди рсОМАШАтр-Туг |МУбНеі, Т., Мап Реї, А., Вгіснага, М., Зсппеїдег, 5. ш-) с Зеїїдег, В., Меуег 20т Визспепіеіде, К., та Вооп, Т. (1994) Еипг.9.ІттипоЇ, 24, 759-764| шляхом гідролізу . ферментом ЕсокіІІ, а потім модифікували шляхом інкубування з ДНК-полімеразою Кленова для "затуплення и?» кінців" та клонували у ЗітаІ-самг рос Ії І 2ае! Р7.5, в результаті чого отримували вектор рус І І 7аєї Р7.5-ТУК (Фіг.9). Ця плазміда може бути використана для конструювання рекомбінантного вірусу ММА, який експресує ген Тирозинази людини під контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи. -І Клітини СЕР, інфіковані вірусом ММА при множинності зараження ТСІЮО»50-0,5 на клітину, трансфікували ДНК плазміди рОсС Ії 17аеі Р7.5-ТУК, як описано в літературі |(ЗиЧег, б., МУуай, Ї., ЕРоЇІеу, Р., ВеппіпК, 9., Мозв, о В., (1994) Массіпе 12, 1032-1040). Рекомбінантний вірус ММА, стабільно експресуючий ген тирозинази людини та їх сумісно експресуючий, з часовою регулюцією, ген І ас7 Е соїї, відбирали шляхом проведення послідовних циклів 5р методом бляшек у клітинах СЕРЕ, пофарбованих 5-бром-4-хлор-3-індоліл-В-Ю-галактозидом (ЗО0Омкг/мл). Після - цього рекомбінантні віруси, які експресують ген, що кодує тирозиназу людини та має делетований маркерний ген о Гас/, виділлли шляхом проведення ще трьох додаткових послідовних циклів очистки методом бляшек, здійснюючи скринінг на непофарбовані фокуси вірусу в клітинах СЕБЕ у присутності 5-бром-4-хлор-3-індоліл-В-О-галактозида (ЗООмкг/мл). Потім рекомбінантні віруси ампліфікували шляхом ов інфікування моношарів СЕР, та ММА-пГУкК-вірусну ДНК аналізували за допомогою РСК для того, щоб упевнитися в генетичній гомогенності вірусного штаму. Саузерн-блот-аналіз вірусної ДНК підтвердив генетичну
Ф) стабільність ММА-НЙТУК та явно продемонстрував інтеграцію рекомбінантного гену тирозинази та делецію ка маркерного гену І ас Е сої в сайт делеції ІІ у вірусному геномі.
Ефективна експресія рекомбінантної тирозинази людини була підтверджена за допомогою во Вестерн-блот-аналізу білок-продукуючих лізатів клітин СЕР, інфікованих вірусом ММА-пТУК з використанням кролячих поліклональних антитіл (люб'язно наданих М.Неагто, та використаних, (як описано, дітепе?., М.,
Катеуата, К., Масу, Ї., Тотіа, МУ., Неагіпо, М. (1988) Р.М.А.5. ОБА 85, 3830-3834 або мишачих моноклональних антитіл (люб'язно представлених І. Од та використаних, (як описано, Спеп, М., ЗіосКеп, Е.,
Твапа, 5., Соріап, К. Ой, Г. (1995) Р.М.А.5. ОБА 92, 8125-8129), направлених проти тирозинази. 65 Перелік послідовностей (1) Загальна інформація:
(І) Заявник: (А) Назва: О5Е-Рогеспипдзгепігит їшег Ютуей ипа Севипаепівї СтрНн (В) Вулиця: Іпдоівіаедег І апавіг. 1, Меипегрега (С) Місто: Орегзспіеіззпеїт (Е) Країна: Німеччина (Р) Поштовий індекс: 85764 (ї) Назва винаходу: Рекомбінантний вірус ММА та його використання (ії) Кількість послідовностей: 8 (ІМ) Тип комп'ютерного зчитування: 70 (А) Тип носія: гнучкий диск (В) Комп'ютер: РС сумісний з ІВМ (С) Операційна система: РО-ЮОБ/М5-БО5 (Ю) Програмне забезпечення: Раїепіїп КеїІеазе 41,0 Мегзіоп Ж 1,30 (ЕРО) (мі) Данні попередньої заявки: (А) Номер заявки: ОК 0782/95 (В) Дата подання: 04 липня 1995р. (2) Данні послідовності БЕО ІЮ Мо1: (Ї) Характеристика послідовності: (А) Довжина: 33 пари основ (В) Тип: нуклеіновокислотна (С) Ланцюговість: одно ланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис: /опис.- "ДНК-праймер" сч (хі) Опис послідовності БЕО ІЮ Мо1:
САССАССОТА СССТСАТСОТ АСАаОСАСОТТ СТО о (2) Данні послідовності БЗЕО ІЮО Мо2: (Ї) Характеристика послідовності: о зо (А) Довжина: 42 пари основ (В) Тип: нуклеіновокислотна - (С) Ланцюговість: одноланцюгова «Е (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота що) (А) Опис/опис.- "ДНК-праймер" ча (хі) Опис послідовності БЕО ІЮ Мо2:
САССАССССОС СОТАТІСОСАТ САТТАТІТІТ ДАСАЛДААТАА СА
(2) Данні послідовності БЗЕО ІЮ Моз: « (Ї) Характеристика послідовності: - с (А) Довжина: 36 пар основ ц (В) Тип: нуклеіновокислотна "» (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота -І (А) Опис/опис.- "ДНК-праймер" сл (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо: щ СсСАОСАОСТОС ДОСААТСАТС САТТССАСТО ААТАОС цу (2) Данні послідовності БЕО ІЮ Мод: (Ї) Характеристика послідовності: о (А) Довжина: 36 пар основ (В) Тип: нуклеіновокислотна (С) Ланцюговість: одноланцюгова (С) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота
Ф, (А) Опис/опис.- "ДНК-праймер" ко (хі) Опис послідовності БЕО ІЮ Мо4;: з САСОСАСОСАТ ОССОСАСПАДАС ААОСААСТОТ АОСАСА (2) Данні послідовності ЗЕО ІЮ Моб: (Ї) Характеристика послідовності: (А) Довжина: 33 пари основ (В) Тип: нуклеїновокислотна бо (С) Ланцюговість: одноланцюгова
(ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис.- "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності БЕО ІЮ Моб:
САССАСОТСО АССССОАССО ССТТАСТОСС ОСС
(2) Данні послідовності БЗЕО ІЮ Моб: (Ї) Характеристика послідовності: 70 (А) Довжина: 33 пари основ (В) Тип: нуклеіновокислотна (С) Ланцюговість: одноланцюгова (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис.- "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Моб:
ОСОБООСТОС АОАТОСТАОС САСССОСОСТ САС
(2) Данні послідовності БЗЕО ІЮО Мо7: (Ї) Характеристика послідовності: (А) Довжина: 39 пар основ (В) Тип: нуклеіновокислотна (С) Ланцюговість: одно ланцюгова (Ю) Топологія: лінійна с (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота о (А) Опис/опис.- "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності БЕО ІЮ Мо7:
САССАОСОСАТ ССАТОСОТОО СААДОТООТСА ААААСТАСТ о (2) Данні послідовності БЗЕО ІЮ Мов: «-- (Ї) Характеристика послідовності: « (А) Довжина: 39 пар основ (В) Тип: нуклеїновокислотна ів) (С) Ланцюговість: одноланцюгова М (О) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: інша нуклеїнова кислота (А) Опис/опис.- "ДНК-праймер" (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ Мо8: « - с
Claims (11)
1. Рекомбінантний вірус ММА, що містить та здатний до експресії антигену тирозинази (пТуг) людини.
2. Рекомбінантний вірус ММА за п. 1, який відрізняється тим, що йТуг ген знаходиться під транскрипційним - 15 контролем раннього/пізнього промотору Р7.5 вірусу коров'ячої віспи.
З. Рекомбінантний вірус ММА за пп. 1 або 2, який відрізняється тим, що по суті не включає віруси, здатні 1 до реплікації в клітинах людини. 1»
4. Еукаріотична клітина, інфікована /7 у//с або ех у//с рекомбінантним вірусом ММА за будь-яким з пп. 1-3.
5. Застосування рекомбінантного вірусу ММА за будь-яким з пп. 1-3 для одержання /7 м/с рекомбінантного - 70 протеїну НТУг.
о 6. Вакцина, що містить рекомбінантний вірус ММА за будь-яким з пп. 1-3 у фізіологічно прийнятному носії.
7. Застосування рекомбінантного вірусу ММА за будь-яким з пп. 1-3 для приготування вакцини.
8. Рекомбінантний вірус ММА за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що використовується для імунізації тварини і людини.
9. Рекомбінантний вірус ММА за п. 8, який відрізняється тим, що використовується для запобігання або ГФ) лікування меланом. 7
10. Вакцина за п. 6, яка відрізняється тим, що використовується для імунізації тварини і людини.
11. Вакцина за п. 10, яка відрізняється тим, що використовується для запобігання або лікування меланом. 60 б5
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK78295 | 1995-07-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA75410C2 true UA75410C2 (en) | 2006-04-17 |
Family
ID=8097499
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA97126424A UA68327C2 (en) | 1995-07-04 | 1996-03-07 | A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals |
| UA20031212892A UA75411C2 (en) | 1995-07-04 | 1996-07-03 | Recombinant virus of mva |
| UA20031212890A UA75410C2 (en) | 1995-07-04 | 1996-07-03 | Recombinant virus mva and use thereof |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA97126424A UA68327C2 (en) | 1995-07-04 | 1996-03-07 | A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals |
| UA20031212892A UA75411C2 (en) | 1995-07-04 | 1996-07-03 | Recombinant virus of mva |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US6440422B1 (uk) |
| EP (3) | EP0836648B1 (uk) |
| JP (3) | JP4312260B2 (uk) |
| KR (1) | KR19990028617A (uk) |
| CN (3) | CN1782071A (uk) |
| AT (3) | ATE304057T1 (uk) |
| AU (1) | AU721735B2 (uk) |
| BR (1) | BR9609303B8 (uk) |
| CA (3) | CA2225278C (uk) |
| CZ (1) | CZ292460B6 (uk) |
| DE (3) | DE69635172T2 (uk) |
| DK (3) | DK0836648T3 (uk) |
| EE (3) | EE05138B1 (uk) |
| ES (3) | ES2249647T3 (uk) |
| HK (2) | HK1009830A1 (uk) |
| HU (2) | HU229261B1 (uk) |
| IL (5) | IL122120A (uk) |
| MX (1) | MX9800025A (uk) |
| NO (1) | NO322476B1 (uk) |
| NZ (1) | NZ313597A (uk) |
| PL (1) | PL186857B1 (uk) |
| PT (1) | PT836648E (uk) |
| RU (1) | RU2198217C2 (uk) |
| SI (3) | SI0836648T1 (uk) |
| TW (2) | TW575664B (uk) |
| UA (3) | UA68327C2 (uk) |
| WO (1) | WO1997002355A1 (uk) |
Families Citing this family (118)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA68327C2 (en) * | 1995-07-04 | 2004-08-16 | Gsf Forschungszentrum Fur Unwe | A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals |
| US7118754B1 (en) * | 1996-07-30 | 2006-10-10 | Transgene S.A. | Pharmaceutical composition for treating papillomavirus tumors and infection |
| AU4556597A (en) * | 1996-09-24 | 1998-04-17 | Bavarian Nordic Research Institute A/S | Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |
| MY119381A (en) * | 1996-12-24 | 2005-05-31 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Recombinant mva virus, and the use thereof |
| US6969609B1 (en) | 1998-12-09 | 2005-11-29 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Serivces | Recombinant vector expressing multiple costimulatory molecules and uses thereof |
| FR2784997A1 (fr) * | 1998-10-22 | 2000-04-28 | Transgene Sa | Materiel biologique pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement de mammiferes |
| US20040265324A1 (en) * | 1999-03-23 | 2004-12-30 | Cardosa Mary Jane | Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |
| US6682742B1 (en) | 1999-05-28 | 2004-01-27 | Gsf Forschungszentrum Fur Unwelt Und Gesundheit Gmbh | Vector for integration of heterologous sequences into poxviral genomes |
| US20150231227A1 (en) * | 2000-03-02 | 2015-08-20 | Emory University | Compositions and methods for generating an immune response |
| WO2001068820A1 (en) * | 2000-03-14 | 2001-09-20 | Anton Mayr | Altered strain of the modified vaccinia virus ankara (mva) |
| DE10042598A1 (de) * | 2000-08-30 | 2002-03-28 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Rekombinantes MVA mit der Fähigkeit zur Expression des HER-2/Neu-GENS |
| WO2002031168A2 (en) * | 2000-10-10 | 2002-04-18 | Genstar Therapeutics | Minimal adenoviral vector and recombinant vaccines based thereon |
| US7445924B2 (en) | 2000-11-23 | 2008-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
| NZ524661A (en) | 2000-11-23 | 2005-03-24 | Bavarian Nordic As | Modified vaccinia ankara virus variant |
| US7628980B2 (en) | 2000-11-23 | 2009-12-08 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates |
| US7740863B2 (en) | 2001-04-06 | 2010-06-22 | Merial | Recombinant vaccine against West Nile Virus |
| DE10143490C2 (de) * | 2001-09-05 | 2003-12-11 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Rekombinantes MVA mit der Fähigkeit zur Expression von HCV Struktur-Antigenen |
| DE10144664B4 (de) * | 2001-09-11 | 2005-06-09 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Vacciniavirus MVA-E3L-Knock-Out-Mutanten und Verwendung hiervon |
| CA2466413C (en) | 2001-12-04 | 2014-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Flavivirus ns1 subunit vaccine |
| NZ533586A (en) * | 2001-12-20 | 2005-02-25 | Bavarian Nordic As | Method for the recovery and purification of poxviruses from infected cells using high pressure homogenisation |
| EP1839672A3 (en) * | 2002-04-19 | 2007-11-21 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia virus Ankara for the vaccination of neonates |
| US7501127B2 (en) | 2002-05-16 | 2009-03-10 | Bavarian Nordic A/S | Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara |
| EA007811B1 (ru) | 2002-05-16 | 2007-02-27 | Бавариан Нордик А/С | Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva) |
| EA009525B1 (ru) * | 2002-05-16 | 2008-02-28 | Бавариан Нордик А/С | Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины ankara, содержащий ati-промотор вируса коровьей оспы, и способы применения вируса и промотора |
| KR101044538B1 (ko) | 2002-09-05 | 2011-06-27 | 버베리안 노딕 에이/에스 | 무혈청 조건하에서 일차세포의 배양 및 바이러스의 증식방법 |
| DE10249390A1 (de) * | 2002-10-23 | 2004-05-13 | Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg | Rekombinante MVA-Stämme als potentielle Impfstoffe gegen P.falciparum-Malaria |
| PT1567653E (pt) | 2002-11-25 | 2007-10-01 | Bavarian Nordic As | Poxvírus recombinante que compreende pelo menos dois promotores do vírus da varíola bovina ati |
| ATE403005T1 (de) * | 2003-02-18 | 2008-08-15 | Helmholtz Zentrum Muenchen | Rekombinantes mva und verfahren zur erzeugung davon |
| JP5052893B2 (ja) | 2003-02-20 | 2012-10-17 | アメリカ合衆国 | ポックスベクターにおける新規の挿入部位 |
| US7731974B2 (en) | 2003-03-27 | 2010-06-08 | Ottawa Hospital Research Institute | Mutant vesicular stomatitis viruses and uses thereof |
| MXPA05010260A (es) | 2003-03-27 | 2006-03-17 | Ottawa Health Research Inst | Virus de estomatitis vesicular mutantes y usos de los mismos. |
| WO2004093905A1 (en) * | 2003-04-16 | 2004-11-04 | City Of Hope | Human cytomegalovirus antigens expressed in mva and methods of use |
| GB2402391A (en) * | 2003-06-04 | 2004-12-08 | Oxxon Pharmaccines Ltd | Fowlpox recombinant genome |
| ES2359473T3 (es) | 2003-07-21 | 2011-05-23 | Transgene S.A. | Citoquinas multifuncionales. |
| WO2005017208A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-24 | George Mason Intellectual Properties, Inc. | Compositions and methods for treating or preventing hiv infection |
| EP1518932A1 (en) | 2003-09-29 | 2005-03-30 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Modified vaccinia virus Ankara (MVA) mutant and use thereof |
| DK1536015T3 (da) * | 2003-11-24 | 2008-02-18 | Bavarian Nordic As | Promotorer til ekspression i modificeret vacciniavirus Ankara |
| JP4719855B2 (ja) | 2003-12-05 | 2011-07-06 | 国立大学法人北海道大学 | 高度安全性痘瘡ワクチンウイルスおよびワクシニアウイルスベクター |
| EP1683870A1 (en) * | 2005-01-24 | 2006-07-26 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Vaccines based on the use of MVA |
| WO2006113927A2 (en) * | 2005-04-20 | 2006-10-26 | University Of Washington | Immunogenic vaccinia peptides and methods of using same |
| US20090060947A1 (en) * | 2006-05-19 | 2009-03-05 | Sanofi Pasteur, Inc. | Immunological compositions |
| DK2029756T3 (en) * | 2006-06-20 | 2017-02-13 | Transgene Sa | PROCEDURE FOR PREPARING POXVIRA AND POXVIRUS COMPOSITIONS |
| WO2008076157A2 (en) * | 2006-09-08 | 2008-06-26 | Duke University | Modified vaccinia ankara virus vaccine |
| CN102026645B (zh) | 2006-09-15 | 2016-01-27 | 渥太华医院研究机构 | 溶瘤弹状病毒 |
| CA2665068C (en) | 2006-10-06 | 2016-01-05 | Bn Immunotherapeutics Inc. | Methods for treating cancer with mva |
| US20080241139A1 (en) * | 2006-10-31 | 2008-10-02 | Regents Of The University Of Colorado | Adjuvant combinations comprising a microbial tlr agonist, a cd40 or 4-1bb agonist, and optionally an antigen and the use thereof for inducing a synergistic enhancement in cellular immunity |
| CA2676129A1 (en) * | 2007-01-26 | 2008-08-07 | The Regents Of The University Of Colorado | Methods of modulating immune function |
| EP2152736B1 (en) | 2007-05-03 | 2017-07-05 | Lysomab GmbH | Complement factor h-derived short consensus repeat-antibody constructs |
| US8003364B2 (en) | 2007-05-14 | 2011-08-23 | Bavarian Nordic A/S | Purification of vaccinia viruses using hydrophobic interaction chromatography |
| JP2010526546A (ja) * | 2007-05-14 | 2010-08-05 | バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ | ワクシニアウイルス系及び組換えワクシニアウイルス系ワクチンの精製 |
| US8003363B2 (en) | 2007-05-14 | 2011-08-23 | Bavarian Nordic A/S | Purification of vaccinia virus- and recombinant vaccinia virus-based vaccines |
| US20100285050A1 (en) * | 2007-10-05 | 2010-11-11 | Isis Innovation Limited | Compositions and Methods |
| BRPI0800485B8 (pt) * | 2008-01-17 | 2021-05-25 | Univ Minas Gerais | vetores virais recombinantes, composição vacinal para leishmaniose e método de vacinação para leishmaniose |
| CN102257134B (zh) | 2008-02-12 | 2014-03-05 | 赛诺菲巴斯德有限公司 | 使用离子交换和凝胶过滤色谱进行痘病毒纯化的方法 |
| US20110052627A1 (en) * | 2008-06-20 | 2011-03-03 | Paul Chaplin | Recombinant modified vaccinia virus measles vaccine |
| US8691502B2 (en) | 2008-10-31 | 2014-04-08 | Tremrx, Inc. | T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption |
| EP2424999A1 (en) | 2009-04-30 | 2012-03-07 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Lausanne (CHUV) | Modified immunization vectors |
| KR20120052352A (ko) * | 2009-08-07 | 2012-05-23 | 트랜스진 에스.에이. | Ｈｂｖ 감염을 치료하는 조성물 |
| EP2501405A4 (en) * | 2009-11-20 | 2013-12-04 | Inviragen Inc | COMPOSITION, METHOD, AND USES OF POX VIRUS ELEMENTS IN VACCINATE CONSTRUCTS |
| US9005632B2 (en) | 2009-11-20 | 2015-04-14 | Takeda Vaccines, Inc. | Compositions, methods and uses for poxvirus elements in vaccine constructs against influenza virus subtypes or strains |
| EP3187585A1 (en) | 2010-03-25 | 2017-07-05 | Oregon Health&Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
| GB201006405D0 (en) * | 2010-04-16 | 2010-06-02 | Isis Innovation | Poxvirus expression system |
| US20110262965A1 (en) | 2010-04-23 | 2011-10-27 | Life Technologies Corporation | Cell culture medium comprising small peptides |
| EP2668201A2 (en) | 2011-01-28 | 2013-12-04 | Sanofi Pasteur SA | Immunological compositions comprising hiv gp41 polypeptide derivatives |
| WO2012151272A2 (en) | 2011-05-02 | 2012-11-08 | Tremrx, Inc. | T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption |
| PL2691530T3 (pl) | 2011-06-10 | 2019-02-28 | Oregon Health & Science University | Glikoproteiny i rekombinowane wektory CMV |
| PL2739293T3 (pl) * | 2011-08-05 | 2020-11-16 | Sillajen Biotherapeutics, Inc. | Sposoby i kompozycje wytwarzania wirusa krowianki |
| US20130189754A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-07-25 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
| EP2761011B1 (en) * | 2011-09-26 | 2018-05-23 | Theravectys | Use of non-subtype b gag proteins for lentiviral packaging |
| US9402894B2 (en) | 2011-10-27 | 2016-08-02 | International Aids Vaccine Initiative | Viral particles derived from an enveloped virus |
| EP2788021B1 (en) | 2011-12-09 | 2017-01-18 | Bavarian Nordic A/S | Poxvirus vector for the expression of bacterial antigens linked to tetanus toxin fragment c |
| EP2620446A1 (en) | 2012-01-27 | 2013-07-31 | Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. | Immunogens for HIV vaccination |
| ES2631608T3 (es) | 2012-06-27 | 2017-09-01 | International Aids Vaccine Initiative | Variante de la glicoproteína Env del VIH-1 |
| WO2014009433A1 (en) | 2012-07-10 | 2014-01-16 | Transgene Sa | Mycobacterium resuscitation promoting factor for use as adjuvant |
| KR20150058152A (ko) | 2012-07-10 | 2015-05-28 | 트랜스진 에스아이 | 마이코박테리아 항원 백신 |
| WO2014043535A1 (en) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Compositions for the treatment of cancer |
| EP2912069B1 (en) | 2012-10-23 | 2019-07-31 | Emory University | Gm-csf and il-4 conjugates, compositions, and methods related thereto |
| US20140286981A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Broadly reactive mosaic peptide for influenza vaccine |
| DE102013004595A1 (de) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Emergent Product Development Germany Gmbh | RSV-Impfstoffe |
| US20150065381A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-05 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel hiv-1 immunogens |
| EP2873423B1 (en) | 2013-10-07 | 2017-05-31 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
| EP3092000A1 (en) | 2014-01-09 | 2016-11-16 | Transgene SA | Fusion of heterooligomeric mycobacterial antigens |
| GB201412494D0 (en) * | 2014-07-14 | 2014-08-27 | Ospedale San Raffaele And Fond Telethon | Vector production |
| RS61902B1 (sr) | 2014-09-26 | 2021-06-30 | Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc | Metodi i kompozicije za indukovanje zaštitnog imuniteta protiv infekcije virusom humane imunodeficijencije |
| WO2016115116A1 (en) | 2015-01-12 | 2016-07-21 | Geovax, Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to a hemorrhagic fever virus |
| WO2016131945A1 (en) | 2015-02-20 | 2016-08-25 | Transgene Sa | Combination product with autophagy modulator |
| EP3069730A3 (en) | 2015-03-20 | 2017-03-15 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
| EP3072901A1 (en) | 2015-03-23 | 2016-09-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
| AU2016369326B2 (en) | 2015-12-15 | 2019-02-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Human immunodeficiency virus antigens, vectors, compositions, and methods of use thereof |
| EP3402802B1 (en) | 2016-01-08 | 2023-04-12 | Geovax, Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to a tumor associated antigen |
| BR112018015696A2 (pt) | 2016-02-03 | 2018-12-26 | Geovax Inc | composições e métodos para gerar uma resposta imune para um flavivírus |
| MX2018010231A (es) * | 2016-02-25 | 2019-06-06 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Mva recombinante o mvadele3l que expresa el flt3l humano y uso de los mismos como agentes inmunoterapéuticos contra tumores sólidos. |
| CA3023022A1 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Transgene Sa | Combination therapy with cpg tlr9 ligand |
| US10273268B2 (en) | 2016-06-16 | 2019-04-30 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | HIV vaccine formulation |
| AU2017318689A1 (en) | 2016-09-02 | 2019-04-11 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment |
| HUE052008T2 (hu) | 2016-09-15 | 2021-04-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Trimert stabilizáló HIV-burokfehérje-mutációk |
| US20190328869A1 (en) | 2016-10-10 | 2019-10-31 | Transgene Sa | Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy |
| MA49397A (fr) | 2017-06-15 | 2020-04-22 | Bavarian Nordic As | Vecteurs à poxvirus codant pour des antigènes du vih, et leurs procédés d'utilisation |
| EP3641803A2 (en) | 2017-06-21 | 2020-04-29 | Transgene | Personalized vaccine |
| BR112020000867A2 (pt) | 2017-07-19 | 2020-07-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | mutações da proteína do envelope do hiv estabilizando o trímero |
| US20190022212A1 (en) | 2017-07-21 | 2019-01-24 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Methods for safe induction of cross-clade immunity against human immunodeficiency virus infection in human |
| WO2019055888A1 (en) | 2017-09-18 | 2019-03-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | METHODS OF INDUCING AN IMMUNE RESPONSE AGAINST HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS INFECTION IN SUBJECTS UNDER ANTIRETROVIRAL TREATMENT |
| US11311612B2 (en) | 2017-09-19 | 2022-04-26 | Geovax, Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria |
| JP7320601B2 (ja) | 2018-09-11 | 2023-08-03 | 上▲海▼市公共▲衛▼生▲臨▼床中心 | 広域スペクトルな抗インフルエンザワクチン免疫原及びその使用 |
| TW202110476A (zh) | 2019-05-22 | 2021-03-16 | 荷蘭商傑森疫苗防護公司 | 於接受抗反轉錄病毒治療之個體中誘發抗人類免疫缺乏病毒感染之免疫反應的方法 |
| KR20220082033A (ko) * | 2019-10-16 | 2022-06-16 | 칼리버 임뮤노쎄라퓨틱스, 인크. | 레트로바이러스의 계내 생성을 위한 생산자 바이러스 |
| CA3161633A1 (en) | 2019-11-14 | 2021-05-20 | Aelix Therapeutics, S.L. | Dosage regimens for vaccines |
| EP3842065A1 (en) | 2019-12-23 | 2021-06-30 | Transgene | Process for designing a recombinant poxvirus for a therapeutic vaccine |
| WO2021260065A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-30 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) | Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens |
| EP3928789A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-29 | Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) | Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens |
| IL308018A (en) | 2021-04-30 | 2023-12-01 | Kalivir Immunotherapeutics Inc | Oncolytic viruses for different MHC expression |
| WO2022269003A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-29 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | MVA-BASED VACCINE EXPRESSING A PREFUSION-STABILIZED SARS-CoV-2 S PROTEIN |
| EP4108257A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-28 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas | Mva-based vaccine against covid-19 expressing a prefusion-stabilized sars-cov-2 s protein |
| WO2023077147A2 (en) | 2021-11-01 | 2023-05-04 | Pellis Therapeutics, Inc. | T-cell vaccines for patients with reduced humoral immunity |
| WO2023213764A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Transgene | Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf |
| WO2023213763A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Transgene | Poxvirus encoding a binding agent comprising an anti- pd-l1 sdab |
| WO2023220283A1 (en) | 2022-05-12 | 2023-11-16 | Pellis Therapeutics, Inc. | Poxvirus adjuvant for t-cell vaccination |
| EP4316514A1 (en) | 2022-08-03 | 2024-02-07 | Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) | Mva-based vectors and their use as vaccine against sars-cov-2 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE787901A (fr) | 1971-09-11 | 1972-12-18 | Freistaat Bayern Represente Pa | Vaccin antivariolique |
| AU570940B2 (en) | 1982-11-30 | 1988-03-31 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Process for producing poxvirus recombinants for expression offoreign genes |
| US5679511A (en) * | 1986-10-06 | 1997-10-21 | Donald Guthrie Foundation For Medical Research, Inc. | CDNA clones for a regulatory protein in the melanin-production pathway |
| CA1341245C (en) * | 1988-01-12 | 2001-06-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Recombinant vaccinia virus mva |
| US5221610A (en) * | 1988-05-26 | 1993-06-22 | Institut Pasteur | Diagnostic method and composition for early detection of HIV infection |
| CN1042564A (zh) * | 1988-11-11 | 1990-05-30 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 乙肝疫苗的制备方法及其制品 |
| JPH03271233A (ja) * | 1990-03-19 | 1991-12-03 | Inst Pasteur | ウイルスエンベロープ糖タンパク質及びその糖タンパク質の中和エピトープに対応するペプチドの間の相乗作用による、ウイルス性感染に対する防御の誘発 |
| EP0613378A1 (en) * | 1991-10-28 | 1994-09-07 | Institut Pasteur | Induction of protection against viral infection by synergy between viral proteins and viral peptides |
| ES2172287T4 (es) * | 1992-12-22 | 2003-04-16 | Ludwig Inst Cancer Res | Metodos de deteccion y tratamiento de individuos con celulas anormales que expresan los antigenos peptidicos hla-a2/tirosinasa. |
| US5620886A (en) * | 1993-03-18 | 1997-04-15 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2 |
| CA2173138A1 (en) * | 1993-10-19 | 1995-04-27 | Masafumi Takiguchi | Peptide capable of inducing immune response against hiv and aids preventive or remedy containing the peptide |
| US5676950A (en) * | 1994-10-28 | 1997-10-14 | University Of Florida | Enterically administered recombinant poxvirus vaccines |
| UA68327C2 (en) * | 1995-07-04 | 2004-08-16 | Gsf Forschungszentrum Fur Unwe | A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals |
-
1996
- 1996-03-07 UA UA97126424A patent/UA68327C2/uk unknown
- 1996-07-03 CN CNA2005101248556A patent/CN1782071A/zh active Pending
- 1996-07-03 ES ES03001378T patent/ES2249647T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 EP EP96925654A patent/EP0836648B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 DE DE69635172T patent/DE69635172T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 PT PT96925654T patent/PT836648E/pt unknown
- 1996-07-03 CA CA002225278A patent/CA2225278C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 SI SI9630623T patent/SI0836648T1/xx unknown
- 1996-07-03 DK DK96925654T patent/DK0836648T3/da active
- 1996-07-03 CZ CZ19974241A patent/CZ292460B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-07-03 CN CNB961952547A patent/CN1154742C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 IL IL12212096A patent/IL122120A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-07-03 UA UA20031212892A patent/UA75411C2/uk unknown
- 1996-07-03 SI SI9630719T patent/SI1312679T1/sl unknown
- 1996-07-03 ES ES96925654T patent/ES2199294T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 PL PL96324347A patent/PL186857B1/pl unknown
- 1996-07-03 SI SI9630718T patent/SI1312678T1/sl unknown
- 1996-07-03 AU AU66110/96A patent/AU721735B2/en not_active Expired
- 1996-07-03 EE EEP200300331A patent/EE05138B1/xx unknown
- 1996-07-03 KR KR1019970709939A patent/KR19990028617A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-07-03 AT AT03001378T patent/ATE304057T1/de active
- 1996-07-03 DE DE69628011T patent/DE69628011T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 CN CN2004100367144A patent/CN1554764B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 WO PCT/EP1996/002926 patent/WO1997002355A1/en active Application Filing
- 1996-07-03 CA CA2596274A patent/CA2596274C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 EE EE9700344A patent/EE04199B1/xx unknown
- 1996-07-03 RU RU98101904/13A patent/RU2198217C2/ru active
- 1996-07-03 AT AT96925654T patent/ATE239796T1/de active
- 1996-07-03 HU HU0402350A patent/HU229261B1/hu unknown
- 1996-07-03 ES ES03001379T patent/ES2249648T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 BR BRPI9609303-0B8A patent/BR9609303B8/pt active IP Right Grant
- 1996-07-03 JP JP50482497A patent/JP4312260B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 HU HU9802217A patent/HU224061B1/hu active IP Right Grant
- 1996-07-03 MX MX9800025A patent/MX9800025A/es unknown
- 1996-07-03 EE EEP200300332A patent/EE04753B1/xx unknown
- 1996-07-03 EP EP03001379A patent/EP1312679B8/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 DK DK03001378T patent/DK1312678T3/da active
- 1996-07-03 DK DK03001379T patent/DK1312679T3/da active
- 1996-07-03 UA UA20031212890A patent/UA75410C2/uk unknown
- 1996-07-03 DE DE69635173T patent/DE69635173T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 CA CA2608864A patent/CA2608864C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 AT AT03001379T patent/ATE304058T1/de active
- 1996-07-03 EP EP03001378A patent/EP1312678B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-03 NZ NZ313597A patent/NZ313597A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-12-31 TW TW085116379A patent/TW575664B/zh not_active IP Right Cessation
- 1996-12-31 TW TW092116681A patent/TWI245075B/zh not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-01-02 NO NO19980026A patent/NO322476B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-01-02 US US09/002,443 patent/US6440422B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-15 HK HK98110632A patent/HK1009830A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-05-15 US US10/147,284 patent/US7198934B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-09-28 IL IL164318A patent/IL164318A/en not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-01-11 HK HK05100216.3A patent/HK1068015A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-09-19 US US11/523,004 patent/US20070071769A1/en not_active Abandoned
- 2006-09-19 US US11/523,030 patent/US20070071770A1/en not_active Abandoned
- 2006-09-19 US US11/522,889 patent/US8153138B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-03-12 JP JP2007062631A patent/JP4764367B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2007-03-12 JP JP2007062630A patent/JP4764366B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-12-01 IL IL202448A patent/IL202448A0/en unknown
-
2010
- 2010-06-14 US US12/814,602 patent/US8197825B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-05-17 IL IL212933A patent/IL212933A0/en unknown
-
2012
- 2012-05-02 IL IL219528A patent/IL219528A0/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA75410C2 (en) | Recombinant virus mva and use thereof | |
| CA1341245C (en) | Recombinant vaccinia virus mva | |
| AU2011316164B2 (en) | Recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA) influenza vaccine | |
| JP2006517795A (ja) | 組換えｍｖａおよびその生産方法 |