ES2249648T3 - Virus mva recombinante, y el uso del mismo. - Google Patents
Virus mva recombinante, y el uso del mismo.Info
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Abstract
Un virus MVA recombinante que contiene y es capaz de expresar un antígeno de tirosinasa humana (hTyr). La presente invención comprende por tanto, inter alia, lo siguiente, solo o en combinación: un virus MVA recombinante que contiene y es capaz de expresar un antígeno de tirosinasa humana (hTyr); el virus MVA recombinante como se ha indicado anteriormente en el cual el gen hTyr se encuentra bajo control de transcripción del promotor temprano/tardío del virus vaccinia P7.5; el virus MVA recombinante como se ha indicado anteriormente, esencialmente exento de virus que sean capaces de replicarse en células humanas; una célula eucariota infectada in vitro o ex vivo con un virus MVA recombinante como se ha indicado anteriormente; uso del virus MVA recombinante como se ha indicado anteriormente para la producción in vitro de la proteína hTyr recombinante; una vacuna que contiene un virus MVA recombinante como se ha indicado anteriormente en un vehículo fisiológicamente aceptable; el uso del virusMVA recombinante como se ha indicado anteriormente para la preparación de una vacuna; el virus MVA recombinante como se ha indicado anteriormente y/o la vacuna como se ha indicado anteriormente para la inmunización de un cuerpo vivo animal, con inclusión de un humano; el virus MVA recombinante y/o la vacuna como se ha indicado anteriormente para la prevención o el tratamiento de melanomas. El término ¿gen¿ significa cualquier secuencia de DNA que codifica una proteína o péptido. El término ¿gen extraño¿ significa un gen infectado de una secuencia de DNA en al cual no se encuentra natural-mente el mismo.
Description
Virus MVA recombinante, y el uso del mismo.
La presente invención se refiere a virus
vaccinia recombinantes derivados del virus vaccinia
Ankara modificado (MVA) y que contienen y son capaces de expresar
genes extraños que se insertan en el sitio de una deleción existente
naturalmente en el genoma del MVA, y al uso de tales virus MVA
recombinantes para la producción de polipéptidos, v.g. antígenos o
agentes terapéuticos, o vectores víricos para terapia génica, y al
uso como vacunas de tales virus MVA recombinantes que codifican
antígenos.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar un virus MVA recombinante que puede servir como vector
de expresión eficiente y excepcionalmente seguro.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un método simple, eficiente y seguro para la
producción de polipéptidos, v.g. antígenos o agentes terapéuticos,
virus recombinantes para vacunas y vectores víricos para terapia
génica.
Otro objeto adicional de la presente invención es
proporcionar un sistema de expresión basado en un virus MVA
recombinante que expresa tirosinasa humana, y métodos para la
producción de polipéptidos, v.g. antígenos o agentes terapéuticos, o
para generación de vectores víricos para terapia génica o vacunas,
basados en este sistema de expresión.
El virus vaccinia, un miembro del género
Ortopoxvirus en la familia de Poxviridae, se utilizó
como vacuna viva para inmunizar contra la enfermedad de la viruela
humana. La vacunación mundial con éxito con el virus vaccinia
culminó con la erradicación del virus variola, el agente causante
de la viruela (La erradicación global de la viruela. Informe final
de la comisión global para la certificación de la erradicación de la
viruela. History of Public Health, No. 4, Ginebra: Organización
Mundial de la Salud, 1980). Desde dicha declaración de la WHO, la
vacunación se ha interrumpido universalmente excepto para las
personas que se encuentran en riesgo elevado de infecciones por
poxvirus (v.g. las personas que trabajan en los laboratorios).
Más recientemente, se han utilizado también virus
vaccinia para modificar por ingeniería genética vectores
víricos para expresión de genes recombinantes y para el uso
potencial como vacunas vivas recombinantes (Mackett, M., Smith, G.L.
y Moss, B. [1982] P.N.A.S. USA 79, 7415-7419;
Smith, G.L., Mackett, M. y Moss, B. [1984] Biotechnology and Genetic
Engineering Reviews 2, 383-407). Esto implica
secuencias de DNA (genes) que codifican antígenos extraños que se
introducen, con la ayuda de técnicas de recombinación de DNA, en el
genoma de los virus vaccinia. Si el gen se integra en un
sitio en el DNA vírico que no es esencial para el ciclo vital del
virus, es posible que el nuevo virus vaccinia recombinante
recién producido sea infeccioso, es decir capaz de infectar células
extrañas y expresar así la secuencia de DNA integrada (Solicitudes
de Patente EP No. 83.286 y No. 110.385). Los virus vaccinia
recombinantes preparados de este modo pueden utilizarse, por una
parte, como vacunas vivas para la profilaxis de enfermedades
infecciosas, y por otra parte, para la preparación de proteínas
heterólogas en células eucariotas.
Los virus vaccinia recombinantes que
expresan el gen RNA-polimerasa del bacteriófago T7
permitieron el establecimiento de sistemas de expresión ampliamente
aplicables para la síntesis de proteínas recombinantes en células de
mamífero (Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T.,
Alexander, W.A., y Fuerst, T.R. [1990] Nature 348,
91-92.). En todos los protocolos, la expresión de
genes recombinantes está basada en la síntesis de la
RNA-polimerasa T7 en el citoplasma de células
eucariotas. Se ha hecho muy popular un protocolo para expresión
transitoria (Fuerst, T.R., Niles, E.G., Studier, F.W. y Moss, B.
[1986] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 y
Solicitud de Patente U.S. 7.648.971). En primer lugar, se inserta un
gen extraño de interés en un plásmido bajo el control del promotor
de RNA-polimerasa T7. A continuación, se introduce
este plásmido en el citoplasma de células infectadas con un virus
vaccinia recombinante productor de
RNA-polimerasa T7 utilizando procedimientos estándar
de transfección.
Este protocolo de transfección es simple debido a
que no es necesario fabricar ningún virus recombinante nuevo, y es
muy eficiente, expresando más del 80% de las células el gen de
interés (Elroy-Stein, O. y Moss, B. [1990] Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87, 6743-6747). La ventaja del
sistema híbrido virus vaccinia/RNA-polimerasa
T7 sobre otros sistemas de expresión transitoria es muy
probablemente su independencia del transporte de plásmidos al
núcleo celular. En el pasado, este sistema ha sido extremadamente
útil para propósitos analíticos en virología y biología celular
(Buonocuore, L. y Rose, J.K. [1990] Nature 345,
625-628, Pattnaik, A.K. y Wertz, G.W. [1991] Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88, 1379-1383, Karschin, A.,
Aiyar, G., Gouin, A., Davidson, N. y Lester, H.A. [1991] FEBS Lett.
278, 229-233, Ho, B.Y., Karschin, A., Raymond, J.,
Branchek, T., Lester, H.A. y Davidson, N. [1992] FEBS Lett. 301,
303-306, Buchholz, C.J., Retzler, C., Homann, H.E.,
y Neubert, W.J. [1994] Virology 204, 770-776). Sin
embargo, aplicaciones futuras importantes del sistema híbrido virus
vaccinia/RNA-polimerasa T7, a fin de v.g.
generar proteínas recombinantes o partículas víricas recombinantes
para nuevos métodos terapéuticos o profilácticos en humanos,
podrían verse impedidas por la replicación productiva del vector
vaccinia recombinante.
El virus vaccinia es infeccioso para los
humanos y, después de la vacunación durante la campaña de
erradicación de la viruela se observaron complicaciones ocasionales
graves. La revisión más completa acerca de la incidencia de
complicaciones ha sido proporcionada por una inspección nacional en
los Estados Unidos monitorizando la vacunación de aproximadamente 12
millones de personas con una vacuna basada en la cepa del virus
vaccinia de la Junta de Salud de la Ciudad de Nueva York
(Lane, J., Ruben, F., Neff, J. y Millar, J. [1969] New Engl. J.
Med. 281, 1201-1208). Por consiguiente, la
posibilidad más excitante de utilización del virus vaccinia
como vector para el desarrollo de vacunas recombinantes vivas se ha
visto afectada por problemas y disposiciones de seguridad.
Adicionalmente, la mayor parte de los virus vaccinia
recombinantes descritos en la bibliografía están basados en la cepa
Western Reserve de virus vaccinia. Por otra parte, es sabido
que esta cepa tiene una neurovirulencia alta y es por tanto poco
adecuada para uso en humanos y animales (Morita et al.,
Vaccine 5, 65-70 [1987]).
Para aplicaciones de vectores los riesgos
sanitarios podrían aminorarse por el uso de una cepa muy atenuada
del virus vaccinia. Se han desarrollado especialmente varias
cepas de virus vaccinia de este tipo a fin de evitar efectos
secundarios no deseados de la vacunación contra la viruela. Así, se
ha generado el virus vaccinia Ankara modificado (MVA) por
pasos en serie de larga duración de la cepa Ankara del virus
vaccinia (CVA) sobre fibroblastos de embrión de pollo (para
revisión, véase Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. y
Stickl, H. [1975] Infection 3, 6-14; Patente Suiza
No. 568.392). El virus MVA se depositó en cumplimiento de los
requisitos del Tratado de Budapest en la CNCM (Instituto Pasteur,
Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, 25, Rue du
Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) el 15 de diciembre de 1987 bajo
el Depósito No. I-721. El MVA se distingue por su
gran atenuación, es decir por una virulencia o infectividad
disminuida al tiempo que mantiene una inmunogenicidad
satisfactoria. El virus MVA ha sido analizado para determinar
alteraciones en el genoma con relación a la cepa CVA de tipo
salvaje. Se han identificado seis deleciones principales del DNA
genómico (deleción I, II, III, IV, V y VI) que totalizan 31.000
pares de bases (Meyer, H., Suter, G. y Mayr, A. [1991] J. Gen.
Virol. 72, 1031-1038). El virus MVA resultante
estaba fuertemente restringido en cuanto a células hospedadoras a
células de ave.
Adicionalmente, el MVA se caracteriza por su
extremada atenuación. Cuando se ensayó en una diversidad de modelos
animales, se demostró que el MVA era avirulento incluso en animales
inmunodeficientes. Y lo que es más importante, las excelentes
propiedades de la cepa MVA se han demostrado en pruebas clínicas
extensas (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167,
375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med.
Wschr. 99, 2386-2392 [1974]). Durante estos
estudios en más de 120.000 humanos, con inclusión de pacientes de
alto riesgo, no se asoció efecto secundario alguno con el uso de la
vacuna MVA.
Se ha encontrado que la replicación de MVA en
células humanas está bloqueada tardíamente en la infección, lo que
impide el ensamblaje a viriones infecciosos maduros. Sin embargo,
el MVA era capaz de expresar genes víricos y recombinantes a niveles
altos incluso en células no permisivas, y fue propuesto para servir
como vector de expresión génico eficiente y excepcionalmente seguro
(Suter, G. y Moss, B. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,
10847-10851). Recientemente, se establecieron nuevos
sistemas vectores de vaccinia sobre la base del MVA, que
tienen secuencias de DNA extrañas insertadas en el sitio de la
deleción III dentro del genoma de MVA o dentro del gen TK (Suter,
G. y Moss, B. [1995] Dev. Biol. Stand. Basel, Karger 84,
195-200 y Patente US 5.585.146).
Para aprovechar adicionalmente el uso de MVA, se
ha investigado una nueva vía posible para introducir genes extraños
por recombinación de DNA en la cepa MVA del virus vaccinia.
Dado que la intención era no alterar el genoma del virus MVA, fue
necesario utilizar un método que cumpliera con este requisito. De
acuerdo con la presente invención, se recombinó una secuencia de DNA
extraño en el DNA vírico precisamente en el sitio de una deleción
existente naturalmente en el genoma de MVA.
La presente invención comprende por tanto,
inter alia, lo siguiente, solo o en combinación:
un virus MVA recombinante que contiene y es capaz
de expresar un antígeno de tirosinasa humana (hTyr);
el virus MVA recombinante como se ha indicado
anteriormente en el cual el gen hTyr se encuentra bajo control de
transcripción del promotor temprano/tardío del virus
vaccinia P7.5;
el virus MVA recombinante como se ha indicado
anteriormente, esencialmente exento de virus que sean capaces de
replicarse en células humanas;
una célula eucariota infectada in vitro o
ex vivo con un virus MVA recombinante como se ha indicado
anteriormente;
uso del virus MVA recombinante como se ha
indicado anteriormente para la producción in vitro de la
proteína hTyr recombinante;
una vacuna que contiene un virus MVA recombinante
como se ha indicado anteriormente en un vehículo fisiológicamente
aceptable;
el uso del virus MVA recombinante como se ha
indicado anteriormente para la preparación de una vacuna;
el virus MVA recombinante como se ha indicado
anteriormente y/o la vacuna como se ha indicado anteriormente para
la inmunización de un cuerpo vivo animal, con inclusión de un
humano;
el virus MVA recombinante y/o la vacuna como se
ha indicado anteriormente para la prevención o el tratamiento de
melanomas.
El término "gen" significa cualquier
secuencia de DNA que codifica una proteína o péptido.
El término "gen extraño" significa un gen
infectado de una secuencia de DNA en al cual no se encuentra
naturalmente el mismo.
El virus vaccinia Ankara modificado (MVA),
una cepa de virus vaccinia de gama hospedadora restringida y
altamente atenuada, es incapaz de amplificarse en las líneas de
células humanas y de la mayoría de otros mamíferos ensayadas. Ahora
bien, dado que la expresión de genes víricos está deteriorada en
células no permisivas, los virus MVA recombinantes de acuerdo con la
invención pueden utilizarse como vectores de expresión
excepcionalmente seguros y eficientes.
La presente invención se refiere a virus
vaccinia MVA recombinantes que contienen un gen que codifica
un antígeno extraño, preferiblemente de un agente patógeno, y
vacunas que contienen un virus de este tipo en forma
fisiológicamente aceptable. La invención se refiere también a
métodos para la preparación de tales virus vaccinia o vacunas
MVA recombinantes, y al uso de estas vacunas para la profilaxis de
infecciones causadas por tales agentes patógenos.
Como ejemplo comparativo, el gen extraño
insertado en el virus MVA es un gen que codifica nef de HIV.
Los autores de la invención han construido virus
MVA recombinantes que permiten la expresión del gen nef de
HIV-1 bajo el control del promotor precoz/tardío del
virus vaccinia P7.5. La proteína Nef reguladora de
lentivirus de primate se sintetiza tempranamente en el ciclo de
replicación vírico y se ha demostrado que es esencial para la
replicación del virus con título elevado y la inducción de
enfermedad in vivo. Esto sugiere que Nef de HIV podría jugar
un papel crucial en la patogénesis del SIDA. El o los mecanismos
moleculares por los cuales Nef contribuye a la infectividad vírica
incrementada y a la patogenicidad de HIV precisan ser esclarecidos
adicionalmente. Sin embargo, Nef es inmunógena y un antígeno
específico de Nef puede utilizarse como vacuna contra la infección
por HIV y el SIDA.
En este contexto, el virus MVA recombinante que
expresa el gen nef de HIV puede utilizarse para inmunización de
seres humanos, por una parte, como vacuna profiláctica contra el
HIV humano, y por otra parte, para inmunoterapia de pacientes
infectados por HIV o pacientes de SIDA. Adicionalmente, el virus MVA
recombinante que expresa el gen nef de HIV puede utilizarse para la
producción de proteína Nef recombinante de HIV.
En una realización de la invención, el gen
extraño insertado en el virus MVA es un gen que codifica
tirosinasa humana.
Se han construido virus MVA recombinantes que
permiten la expresión del gen de tirosinasa humano bajo el control
del promotor precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia.
Recientemente, se ha identificado la tirosinasa humano como un
antígeno de tumores específico de melanoma que permite la generación
de linfocitos T citolíticos antitumorales. (Brichard, V., et
al. [1993] J. Exp. Med. 178, 489-495). Dado que
entre las células normales, únicamente los melanocitos parecen
expresar el gen de tirosinasa, la tirosinasa es un antígeno diana
útil para inmunoterapia de los melanomas. Por esta razón, el virus
MVA recombinante que expresa el gen de tirosinasa humano puede ser
utilizado en pacientes de melanoma para inducir respuestas
inmunológicas que provocan el rechazo del tumor o previenen su
metástasis. El virus MVA recombinante que expresa el gen de
tirosinasa humano puede ser utilizado directamente como una vacuna
anti-melanoma, o bien se puede utilizar el virus
para preparar vacunas anti-melanoma. En un ejemplo,
el virus MVA recombinante que expresa el gen de tirosinasa humano
puede utilizarse para la producción de proteína tirosinasa humano
recombinante que se utiliza como antígeno en preparaciones de
vacunas. En otro ejemplo, utilizando el virus MVA recombinante que
expresa el gen de tirosinasa humano como vector de expresión, pueden
modificarse in vitro células derivadas de un paciente con
tumor para expresar tirosinasa y transferirse luego nuevamente al
paciente para inducir respuestas inmunológicas
anti-tumorales. Una vacuna preparada sobre la base
de MVA recombinante que expresa el gen de tirosinasa humano puede
utilizarse sea por vía parenteral o local en el sitio del tumor,
para prevenir la metástasis del tumor o cambiar fenotípicamente el
tumor, v.g. en tamaño, forma, consistencia, vascularización u otras
características. Una vacuna preparada sobre la base de MVA
recombinante que expresa el gen de tirosinasa humano puede
utilizarse antes, durante, o después de la extirpación quirúrgica
del tumor.
Para la preparación de vacunas, los virus
vaccinia MVA de acuerdo con la invención se convierten en una
forma fisiológicamente aceptable. Esto puede hacerse sobre la base
de la experiencia en la preparación de vacunas MVA utilizadas para
vacunación contra la viruela (como ha sido descrito por Stickl, H.
et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99,
2386-2392). Por regla general, aproximadamente
10^{6}-10^{8} partículas del MVA recombinante se
liofilizan en 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS)
en presencia de peptona al 2% y albúmina humana al 1% en una
ampolla, preferiblemente una ampolla de vidrio. El liofilizado puede
contener extendedores (tales como manitol, dextrano, azúcar,
glicina, lactosa o polivinilpirrolidona) u otros adyuvantes (tales
como antioxidantes, estabilizadores, etc.) adecuados para
administración parenteral. La ampolla de vidrio se sella luego y
puede guardarse, preferiblemente a temperaturas inferiores a -20ºC,
durante varios meses.
Para vacunación o terapia, el liofilizado puede
disolverse en 0,1 a 0,5 ml de una solución acuosa, preferiblemente
solución salina fisiológica, y administrarse por vía parenteral, por
ejemplo por inoculación intramuscular o localmente, por ejemplo por
inoculación en un tumor o en el sitio de un tumor. Las vacunas o
agentes terapéuticos de acuerdo con la invención se inyectan
preferiblemente por vía intramuscular (Mayr, A. et al. [1978]
Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. B 167, 375-390). El
modo de administración, la dosis y el número de administraciones
pueden ser optimizados por los expertos en la técnica de manera
conocida. En caso apropiado, es conveniente administrar la vacuna
varias veces durante un periodo prolongado a fin de obtener
respuestas inmunológicas apropiadas contra el antígeno extraño.
Los virus vaccinia MVA recombinantes de
acuerdo con la invención pueden utilizarse también para preparar
polipéptidos heterólogos en células eucariotas. Esto implica que las
células se infecten con los virus vaccinia recombinantes. El
gen que codifica el polipéptido extraño se expresa en las células, y
se aísla el polipéptido heterólogo expresado. Los métodos a utilizar
para la producción de tales polipéptidos heterólogos son conocidos
en general por los expertos en la técnica (documentos
EP-A-206.920 y
EP-A-205.939). Los polipéptidos
producidos con ayuda de los virus MVA recombinantes son, por razón
de las especiales propiedades de los virus MVA, más adecuados para
uso como medicamentos en humanos y animales.
Se han construido adicionalmente virus MVA
recombinantes que permiten la expresión del gen de
RNA-polimerasa del bacteriófago T7 bajo el control
del promotor precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia. La
utilidad de los virus recombinantes MVA-T7pol como
sistema de expresión ha sido comprobada en ensayos de transfección
transitoria para inducir la expresión de genes recombinantes bajo el
control de un promotor de RNA-polimerasa T7.
Utilizando el gen de cloranfenicol-acetiltransferasa
(CAT) de E. coli como gen informador, se encontró que
MVA-T7pol inducía la expresión del gen CAT tan
eficazmente como un virus recombinante vaccinia/T7pol
derivado de la cepa WR competente en replicación del virus
vaccinia.
El sistema híbrido MVA/polimerasa T7 de acuerdo
con la invención puede utilizarse por consiguiente como sistema de
expresión simple, eficiente y seguro en mamíferos para producción de
polipéptidos en ausencia de replicación productiva del virus
vaccinia.
Este sistema de expresión puede utilizarse
también para generar partículas víricas recombinantes para
vacunación o terapia génica por transformación de líneas de células
infectadas con MVA recombinante que expresa
RNA-polimerasa T7, con constructos de DNA que
contienen todos o algunos de los genes, y el genoma o genoma
recombinante necesario para generación de partículas víricas, v.g.
partículas de MVA o partículas retrovíricas, bajo control de
transcripción de un promotor de RNA-polimerasa
T7.
Los sistemas vectores retrovíricos están
constituidos por dos componentes:
1) el vector retrovírico propiamente dicho es un
retrovirus modificado (plásmido vector) en el cual los genes que
codifican las proteínas víricas han sido reemplazados por genes
terapéuticos y genes marcadores a transferir a la célula diana. Dado
que el reemplazamiento de los genes que codifican las proteínas
víricas inutiliza prácticamente el virus, el mismo tiene que ser
restablecido por el segundo componente del sistema, que proporciona
las proteínas víricas ausentes al retrovirus modificado.
El segundo componente es:
2) una línea de células que produce grandes
cantidades de las proteínas víricas, pero que carece de la capacidad
para producir virus competente en replicación. Esta línea de células
se conoce como la línea de células de empaquetamiento y se compone
de una línea de células transfectada con uno o más plásmidos que
transportan los genes (genes que codifican los polipéptidos gag, pol
y env) que permiten el empaquetamiento del vector retrovírico
modificado.
Para generar el vector empaquetado, el plásmido
vector se transfecta en la línea de células de empaquetamiento. En
estas condiciones, el genoma retrovírico modificado que incluye los
genes terapéuticos y marcadores insertados se transcribe desde el
plásmido vector y se empaqueta en las partículas retrovíricas
modificadas (partículas víricas recombinantes). Este virus
recombinante se utiliza luego para infectar células diana en las
cuales el genoma vector y cualesquiera genes marcadores o
terapéuticos transportados llegan a integrarse en el DNA de la
célula diana. Una célula infectada con una partícula vírica
recombinante de este tipo no puede producir nuevo virus vector, dado
que en estas células no están presentes en absoluto proteínas
víricas. Sin embargo, el DNA del vector que transporta los genes
terapéuticos y marcadores se integra en el DNA de la célula y puede
expresarse ahora en la célula infectada.
El virus MVA recombinante que expresa
RNA-polimerasa T7 puede utilizarse para producir las
proteínas requeridas para el empaquetamiento de vectores
retrovíricos. Para hacer esto, los genes gag, pol y env de un
retrovirus (v.g. el Virus de la Leucemia Murina (MLV)) se ponen bajo
control de transcripción de un promotor de
RNA-polimerasa T7 en uno o más vectores de expresión
(v.g. plásmidos). Los vectores de expresión se introducen luego en
células infectadas con el virus MVA recombinante que expresa
RNA-polimerasa T7, junto con un vector de expresión
que transporta un constructo del vector retrovírico, posiblemente
bajo control de transcripción de un promotor de
RNA-polimerasa T7.
Los documentos WO 94/29437, WO 89/11539 y WO
96/07748 describen diferentes tipos de constructos de vectores
retrovíricos que pueden empaquetarse utilizando el sistema de
empaquetamiento descrito anteriormente.
Un uso adicional del virus MVA recombinante que
expresa RNA-polimerasa T7 es la generación de
proteínas recombinantes, partículas de virus no infecciosas, o
partículas de virus infecciosas mutantes para la producción de
vacunas o agentes terapéuticos (Buchholz et al., Virology,
204, 770-776 (1994) y documento
EP-B1-356695). Para hacer esto, los
genes víricos (v.g. los genes gag-pol y env de
HIV-1) se ponen bajo control de transcripción del
promotor T7 en un vector de expresión (v.g. plásmido u otro virus
MVA recombinante). Este constructo se introduce luego en células
infectadas con el virus MVA recombinante que expresan
RNA-polimerasa T7. Los genes víricos recombinantes
se transcriben con alta eficiencia, con lo que se producen y pueden
purificarse proteínas recombinantes en grandes cantidades.
Adicionalmente, las proteínas víricas recombinantes expresadas (v.g.
HIV-1 env, gag) pueden ensamblarse a
pseudo-partículas víricas que son producidas por las
células por gemación y pueden aislarse del medio de cultivo de
tejidos. Proteínas víricas (procedentes v.g. de HIV, SIV, y virus
del sarampión) expresadas por el sistema MVA-T7 pol
pueden restablecer un virus mutante introducido adicionalmente
(derivado v.g. de HIV, SIV, virus del sarampión) por resolución de
un defecto en la fijación e infección, falta de recubrimiento,
replicación de ácido nucleico, expresión de genes víricos,
ensamblaje, gemación u otro paso en la amplificación vírica para
permitir la producción y purificación del virus mutante
mencionado.
También se puede utilizar
MVA-T7pol junto con secuencias de DNA que llevan el
gen de un antígeno de interés (v.g. el gen de HIV, nef, tat, gag,
pol, o env u otros) para inmunización. Primeramente, una secuencia
codificante de un antígeno dado (v.g. HIV, HCV, HPV, HSV, virus del
sarampión, virus de la gripe u otro) se somete a clonación bajo
control de un promotor de RNA-polimerasa T7,
preferiblemente en un vector de plásmido, y el constructo de DNA
resultante se amplifica y purifica utilizando procedimientos
estándar de laboratorio. En segundo lugar, el DNA vector se inocula
simultáneamente o con retardos apropiados junto con
MVA-T7pol. En el sitio de inoculación, el gen
recombinante de interés se expresa transitoriamente en células que
contienen tanto el DNA vector como MVA-T7pol, y el
antígeno correspondiente se presenta al sistema inmunitario del
hospedador estimulando una respuesta inmunológica específica del
antígeno. Este protocolo que utiliza el vector vaccinia
MVA-T7pol no replicante representa un nuevo enfoque
prometedor para vacunación con ácido nucleico que permite la
expresión transitoria eficiente de un antígeno dado, pero que evita
el riesgo potencial de la expresión de genes constitutivos.
Los virus vaccinia MVA recombinantes se
pueden preparar como se expone a continuación.
Un constructo de DNA que contiene una secuencia
de DNA que codifica un polipéptido extraño flanqueado por secuencias
de DNA de MVA adyacentes a una deleción existente naturalmente, v.g.
la deleción II, dentro del genoma de MVA, se introduce en células
infectadas con MVA, para permitir recombinación homóloga.
Una vez que se ha introducido el constructo de
DNA en la célula eucariota y que el DNA extraño se ha recombinado
con el DNA vírico, es posible aislar el virus vaccinia
recombinante deseado de una manera conocida per se,
preferiblemente con ayuda de un marcador (compárese Nakano et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1593-1596
[1982], Franke et al, Mol. Cell. Biol.
1918-1924 [1985], Chakrabarti et al, Mol.
Cell. Biol. 3403-3409 [1985], Fathi et al,
Virology 97-105 [1986]).
El constructo de DNA a insertar puede ser lineal
o circular. Se prefiere un DNA circular, especialmente un plásmido.
El constructo de DNA contiene secuencias que flanquean el lado
izquierdo y el lado derecho de una deleción existente naturalmente,
v.g. la deleción II, dentro del genoma de MVA (Altenburger, W.,
Suter, C.B. y Altenburger J. (1989) Arch. Virol. 105,
15-27). La secuencia de DNA extraño se inserta entre
las secuencias que flanquean la deleción existente naturalmente. La
secuencia de DNA extraña puede ser un gen codificante de un
polipéptido terapéutico, v.g. t-PA o interferón, o
un determinante antigénico de un agente patógeno. Los agentes
patógenos pueden ser virus, bacterias y parásitos que pueden causar
una enfermedad, así como células tumorales que se amplifican sin
limitación en un organismo y pueden conducir por consiguiente a
crecimientos patológicos. Ejemplos de tales agentes patógenos se
describen en Davis, B.D. et al, (Microbiology, 3ª edición,
Harper International Edition). Antígenos preferidos de agentes
patógenos son los de los virus de la inmunodeficiencia humana (v.g.
HIV-1 y HIV-2), de micobacterias
causantes de la tuberculosis, del parásito Plasmodium
falciparum, y de células de melanoma.
Para la expresión de una secuencia de DNA o gen,
es necesario que estén presentes en el DNA secuencias reguladoras,
que se requieren para la transcripción del gen. Tales secuencias
reguladoras (denominadas promotores) son conocidas por los expertos
en la técnica, e incluyen por ejemplo las del gen vaccinia de
11 kDa como se describen en el documento
EP-A-198.328, y las del gen de 7,5
kDa (documento EP-A-110.385).
El constructo de DNA puede introducirse en las
células infectadas de MVA por transfección, por ejemplo por medio de
precipitación con fosfato de calcio (Graham et al., Virol.
52, 456-467 [1973]; Wigler et al., Cell
777-785 [1979] por medio de electroporación (Neumann
et al., EMBO J. 1, 841-845 [1982]), por
microinyección (Graessmann et al., Meth. Enzymology 101,
482-492 (1983)), por medio de liposomas (Straubinger
et al., Methods in Enzymology 101, 512-527
(1983)), por medio de esferoplastos (Schaffner, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 77, 2163-2167 (1980)) o por otros métodos
conocidos por los expertos en la técnica. Se prefiere la
transfección mediante precipitación con fosfato de calcio.
Los ejemplos detallados que siguen tienen por
objeto contribuir a una mejor comprensión de la presente invención.
Sin embargo, no se pretende dar la impresión de que la invención
esté limitada al contenido de los ejemplos.
Figura 1: Mapa esquemático del genoma de MVA y
plásmido para inserción de DNA extraño por recombinación homóloga:
los sitios de restricción HindIII dentro del genoma de MVA
se indican en la parte superior. Se muestra el fragmento N
HindIII-HindIII de 900 pares de bases (pb)
que solapa la unión de la deleción II dentro del genoma de MVA. Las
secuencias de DNA de MVA adyacentes a la deleción II (flanco 1 y
flanco 2) se amplificaron por PCR y se utilizaron para la
construcción del plásmido de inserción pUC II LZ.
Figura 2: pUC II LZ P7.5: Plásmido vector de MVA
para inserción en la casete de expresión P11-LacZ
que contiene la deleción II y el promotor precoz/tardío P7.5 del
virus vaccinia para expresar genes de interés que pueden
clonarse en el sitio SmaI del plásmido.
Figura 3: pUC II LZdel P7.5: Plásmido vector de
MVA para inserción de genes extraños en el sitio de la deleción II
en el genoma de MVA, que contiene una casete de expresión
auto-delecionante P11-LacZ y el
promotor precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia para expresar
genes de interés que pueden clonarse en el sitio de clonación
Sma1/Not1 del plásmido.
Figura 4: Construcción del virus recombinante
MVA-T7pol: mapas esquemáticos del genoma de MVA
(sitios de la endonucleasa de restricción HindIII) y el
plásmido vector pUC II LZ T7pol que permite la inserción del gen de
RNA-polimerasa T7 en el sitio de la deleción II
dentro del fragmento N HindIII del genoma de MVA.
Figura 5: Análisis por transferencia Southern del
DNA vírico de MVA-T7pol.
Figura 6: Marcación metabólica de proteínas
utilizando [^{35}S]metionina. Análisis por SDS PAGE. Pista
1: MVA T7pol, pista 2: MVA, pista 3: células
CV-1.
Figura 7: Ensayo CAT: Células
CV-1 se transfectaron con plásmido que contenía el
gen CAT bajo control del promotor de RNA-polimerasa
T7 y se infectaron con MVA-T/pol o
WR-T7pol. Los lisados se ensayaron en cuanto a
actividad de CAT. C significa cloranfenicol, y 1-AcC
y 3-AcC significa formas mono- y
tri-acetiladas de cloranfenicol. La actividad de CAT
se expresa como porcentaje de producto acetilado formado en 60
min.
Figura 8: Construcción de
MVA-LAInef: mapas esquemáticos del genoma de MVA
(sitios de la endonucleasa de restricción HindIII) y el
plásmido vector pUC II LZdel P7.5-LAInef que permite
la inserción del gen nef de HIV-1 LAI en el
sitio de la deleción II dentro del fragmento N HindIII del
genoma de MVA.
Figura 9: Construcción de
MVA-hTYR: mapas esquemáticos del genoma de MVA
(sitios de la endonucleasa de restricción HindIII) y el
plásmido vector pUC II LZdel P7.5-TYR que permite la
inserción del gen de tirosinasa humano en el sitio de la deleción II
dentro del fragmento N HindIII del genoma de MVA.
El virus MVA es un virus vaccinia muy
atenuado derivado de la cepa Ankara del virus vaccinia (CVA)
por pasos en serie de larga duración en cultivos de fibroblastos de
embrión de pollo (CEF) primarios. Para una revisión general de la
historia de la producción, las propiedades y el uso de la cepa MVA,
puede hacerse referencia al sumario publicado por Mayr et al.
en Infection 3, 6-14 [1975]. Debido a la atenuación
en CEF, el virus MVA se replica con títulos elevados en esta célula
hospedadora aviar. En cambio, en las células de mamífero el MVA está
severamente restringido en crecimiento, y no es detectable la
formación típica de placas por el virus. Por esta razón, el virus
MVA se dejó crecer en células CEF. Para preparar las células CEF, se
aislaron embriones de 11 días a partir de huevos de pollo incubados,
se extirpan las extremidades, y los embriones se desmenuzan y se
disocian en una solución compuesta de tripsina al 0,25% a 37ºC
durante 20 minutos. La suspensión de células resultante se filtró y
las células se redujeron a un sedimento por centrifugación a 2000
rpm en una centrífuga Sorvall RC-3B a la temperatura
ambiente durante 5 minutos, se suspendieron de nuevo en 10 volúmenes
de medio A (MEM Eagle, que puede obtenerse por ejemplo de Life
Technologies GmbH, Eggenstein, Alemania), y se redujeron nuevamente
a un sedimento por centrifugación a 2000 rpm en una centrífuga
Sorvall RC-3B a la temperatura ambiente durante 5
minutos. El sedimento de células se reconstituyó en medio A que
contenía 10% de suero de ternero fetal (FCS), penicilina (100
unidades/ml), estreptomicina (100 mg/ml) y glutamina 2 mM para
obtener una suspensión de células que contenía 500.000 células/ml.
Las células CEF obtenidas de este modo se extendieron en cápsulas de
cultivo de células. Se dejaron crecer en medio A en una incubadora
de CO_{2} a 37ºC durante 1-2 días, dependiendo de
la densidad de células deseada, y se utilizaron para infección, bien
directamente o después de un paso adicional de las células. Una
descripción detallada de la preparación de cultivos primarios puede
encontrarse en el libro publicado por R.I. Freshney, "Culture of
animal cell", Alan R. Liss Verlag, Nueva York [1983], capítulo
11, página 99 y siguientes.
Los virus MVA se utilizaron para la infección
como sigue. Se cultivaron las células CEF en frascos de cultivo de
células de 175 cm^{2}. A 90-100% de la
confluencia, se retiró el medio y las células se incubaron durante
una hora con una suspensión de virus MVA (0,01 unidades infecciosas
(UI) por célula, 0,02 ml/cm^{2}) en medio A. Se añadió luego más
cantidad de medio A (0,2 ml/cm^{2}) y se incubaron los frascos a
37ºC durante 2-3 días (hasta que aproximadamente el
90% de las células mostraron efecto citopático). Se prepararon
stocks de virus brutos por rascado de las monocapas de células en el
medio y reducción a un sedimento del material celular por
centrifugación a 3000 rpm en una centrífuga Sorvall
RC-3B a 4ºC durante 5 minutos. La preparación de
virus bruto se guardó a -20ºC antes de su procesamiento ulterior
(v.g. purificación del virus).
Los pasos de purificación emprendidos para
obtener una preparación de virus que fuese lo más pura posible y
estuviera exenta de componentes específicos de la célula hospedadora
fueron similares a los descritos por Joklik (Virology 18,
9-18 [1962]). Los stocks de virus brutos que se
habían guardado a -20ºC se descongelaron y se suspendieron una sola
vez en PBS (10-20 veces el volumen del sedimento), y
la suspensión se centrifugó como se ha indicado anteriormente. El
nuevo sedimento se suspendió en 10 veces su volumen de tampón Tris 1
(Tris-HCl 10 mM de pH 9,0), y la suspensión se trató
brevemente con ultrasonidos (Labsonic L, B. Braun Biotech
International, Melsungen, Alemania; 2 x 10 segundos a 60 vatios y a
la temperatura ambiente) a fin de desintegrar ulteriormente los
residuos celulares y liberar las partículas de virus del material
celular. Los núcleos de las células y los residuos celulares mayores
se eliminaron en la centrifugación breve subsiguiente de la
suspensión (rotor Sorvall GSA obtenible de DuPont Co.,
D-6353 Bad Nauheim, FRG; 3 minutos a 3000 rpm y
10ºC.). El sedimento se suspendió una vez más en tampón Tris 1, se
trató con ultrasonidos y se centrifugó, como se ha descrito
anteriormente. Los sobrenadantes recogidos que contenían las
partículas de virus libres se combinaron y se estratificaron sobre
un cojín de 10 ml de sacarosa al 36% en Tris-HCl 10
mM, de pH 9,0, y se centrifugaron en un rotor Beckman SW27/SW28
durante 80 minutos con 13.500 rpm a 4ºC. Se desechó el sobrenadante,
y el sedimento que contenía las partículas de virus se recogió en 10
ml de Tris-HCl 1 mM, de pH 9,0, se homogeneizó por
tratamiento breve con ultrasonidos (2 x 10 segundos a la temperatura
ambiente, el mismo aparato descrito anteriormente), y se aplicó a un
gradiente de sacarosa 20-40% (sacarosa en
Tris-HCl 1 mM, pH 9,0) para purificación ulterior.
El gradiente se centrifugó en un rotor Beckman SW41 a 13.000 rpm
durante 50 minutos a 4ºC. Después de la centrifugación, se
cosecharon por pipeteado bandas discretas que contenían partículas
de virus después de aspirar el volumen existente por encima de la
banda. La solución de sacarosa obtenida se diluyó con tres volúmenes
de PBS y las partículas de virus se sedimentaron nuevamente por
centrifugación (Beckmann SW27/28, 60 minutos a 13.500 rpm, 4ºC.). El
sedimento, que estaba constituido ahora fundamentalmente por
partículas de virus puras, se resuspendió en PBS y se equilibró
hasta concentraciones de virus que correspondían por término medio a
1-5 x 10^{9} UI/ml. La solución stock de virus
purificada se guardó a -80ºC y se utilizó directamente o se diluyó
con PBS para experimentos subsiguientes.
Para generar preparaciones stock homogéneas de
virus, el virus MVS obtenido del Prof. Anton Mayr se clonó por
dilución limitante durante tres pasos consecutivos en CEF cultivado
en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Se seleccionó el
clon F6 de MVA y se multiplicó en CEF para obtener stocks de virus
de trabajo que sirvieron como material de partida para la generación
de los virus MVA recombinantes descritos en esta solicitud de
patente y para la generación de los virus MVA recombinantes
descritos previamente (Suter, G. y Moss, B. [1992] Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89, 10847-10851; Suter, G., Wyatt, L.,
Foley, P., Bennink, J. y Moss, B [1994] Vaccine 12,
1032-1040; Hirsch, V., Fuerst, T., Suter., G.,
Carroll, M., Yang, L., Goldstein, S., Piatak, M., Elkins, W.,
Alvord, G., Montefiori, D., Moss, B y Lifson, J. [1996] J. Virol.
70, 3741-3752).
Para hacer posible la generación de virus MVA
recombinantes se construyeron nuevos plásmidos vectores. La
inserción de genes extraños en el genoma de MVA se direccionó con
precisión al sitio de la deleción II existente naturalmente en el
genoma de MVA. Secuencias de DNA de MVA que flanqueaban el sitio de
una deleción de 2500 pb en el fragmento N HindIII del genoma
de MVA (Altenburger, W., Suter, C.M. y Altenburger, J. [1989], J.
Arch. Virol. 105, 15-27) se amplificaron por PCR y
se clonaron en el sitio de clonación múltiple del plásmido pUC18.
Los iniciadores para el flanco izquierdo de DNA de 600 pb fueron
5'-CAG CAG GGT ACC CTC ATC GTA CAG GAC GTT
CTC-3' y 5'-CAG CAG CCC GGG
TAT TCG ATG ATT ATT TTT AAC AAA ATA ACA-3' (los
sitios para las enzimas de restricción KpnI y SmaI
están subrayados). Los iniciadores para el flanco derecho de DNA de
550 pb fueron 5'-CAG CAG CTG CAG GAA TCA TCC
ATT CCA CTG AAT AGC-3' y 5'-CAG CAG
GCA TGC CGA CGA ACA AGG AAC TGT AGC AGA-3'
(los sitios para las enzimas de restricción PstI y
SphI están subrayados). Entre estos flancos de DNA de MVA
insertados en pUC18, se insertó el gen lacZ de Escherichia
coli bajo control del promotor tardío P11 del virus
vaccinia (preparado por digestión de restricción a partir de
pIII LZ, Suter, G. y Moss, B. [1992] PNAS USA 89,
10847-10851), utilizando el sitio BamHI, para
generar el vector de inserción de MVA pUCII LZ [Figura 1]. A
continuación, se insertó un fragmento de 289 pb que contenía el
promotor precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia junto con un
sitio SmaI para clonación (preparado por digestión mediante
restricción con EcoRI y XbaI a partir del vector de
plásmido pSC11 [Chakrabarti et al., 1985, Molecular and
Cellular Biology 5, 3403-3409]), en el sitio
SmaI de pUCII LZ para dar el vector de MVA pUCII LZ P7.5
[Figura 2]. Para construir un plásmido vector que permite el
aislamiento de virus MVA recombinantes por síntesis transitoria de
la enzima informadora \beta-galactosidasa, un
fragmento de 330 pb de DNA obtenido a partir del extremo 3' del
marco de lectura abierto de E. coli LacZ se multiplicó
por PCR (los iniciadores fueron 5'-CAG CAG GTC GAC
CCC GAC CGC CTT ACT GCC GCC-3' y
5'-GGG GGG CTG CAG ATG GTA GCG ACC GGC GCT
CAG-3') y se clonó en los sitios SalI y
PstI de pUC II LZ P7.5 para obtener el vector de MVA pUC II
LZdel P7.5 [Figura 3]. Utilizando el sitio Sma1, puede utilizarse
este plásmido vector para insertar secuencias de DNA que codifican
un gen extraño bajo control de transcripción del promotor P7.5 del
virus vaccinia en el genoma de MVA. Después que se ha aislado
el virus recombinante deseado por escrutinio en cuanto a expresión
de actividad de \beta-galactosidasa, la
propagación ulterior del virus recombinante conduce a la
auto-deleción de la casete de expresión rediseñada
P11-LacZ por recombinación homóloga.
Un fragmento de DNA de 3,1 kilopares de bases que
contenía el gen entero de RNA-polimerasa del
bacteriófago T7 bajo control del promotor precoz/tardío P7.5 del
virus vaccinia se escindió con EcoRI a partir del plásmido
pTF7-3 (Fuerst, T.R., Niles, E.G., Studier, F.W. y
Moss, B., 1986, P.N.A.S. USA 83, 8122-8126), se
modificó por incubación con DNA-polimerasa Klenow
para generar extremos romos, y se clonó en un sitio de restricción
singular SmaI de pUCII LZ para producir el vector de
transferencia del plásmido pUCII LZ T7pol [Figura 4]. Como regulador
de transcripción para la expresión del gen de
RNA-polimerasa T7, se seleccionó el promotor
precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia. Contrariamente a los
promotores tardíos más fuertes del virus vaccinia (v.g. P11)
este sistema promotor permite la expresión de genes recombinantes
inmediatamente después de la infección de las células diana. El
plásmido pUCII LZ T7pol que dirige la inserción de los genes
extraños en el sitio de la deleción II del genoma de MVA se utilizó
para generar el virus recombinante MVA T7pol.
Células CEF infectadas con MVA a una
multiplicidad de 0,05 TCID_{50} por célula se transfectaron con
DNA del plásmido pUCII LZ T7pol como se ha descrito previamente
(Suter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. y Moss, B. (1994)
Vaccine 12, 1032-1040). El virus MVA recombinante
que expresaba la RNA-polimerasa T7 y coexpresaba
\beta-D-galactosidasa (MVA
P7.5-T7pol) se seleccionó por cinco tandas
consecutivas de purificación en placa en células CEF teñidas con
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido
(300 \mug/ml). Subsiguientemente, se amplificaron los virus
recombinantes por infección de monocapas CEF, y el DNA se analizó
por PCR para confirmar la homogeneidad genética del stock de virus.
El análisis por transferencia Southern del DNA vírico de
MVA-T7pol demostró la integración estable de los
genes recombinantes en el sitio de la deleción II dentro del genoma
de MVA
[Figura 5].
[Figura 5].
Para monitorizar la expresión de
RNA-polimerasa T7 por MVA T7pol recombinante, se
analizaron polipéptidos marcados con [^{35}S]metionina
procedentes del cultivo de tejidos infectados con el virus.
Monocapas de la línea de células CV-1 de riñón de
mono que se dejaron crecer en placas de 12 pocillos, se infectaron
con virus a una multiplicidad de 20 TCID_{50} por célula. Al cabo
de 3 a 5 horas después de la infección, se retiró el medio, y los
cultivos se lavaron una sola vez con 1 ml de medio exento de
metionina. Se añadieron a cada pocillo 0,2 ml de medio exento de
metionina complementado con 50 \muCi de [^{35}S]metionina
y se incubaron durante 30 min a 37ºC. Se prepararon extractos
citoplásmicos de las células infectadas por incubación de cada
pocillo en 0,2 ml de tampón de lisis Nonidet P-40 al
0,5% durante 10 min a 37ºC y se analizaron muestras por
SDS-PAGE. La marcación metabólica de las células
CV-1 con MVA T7pol reveló la síntesis de dos
polipéptidos adicionales (i) una proteína de aproximadamente 116.000
Da que representaba la \beta-galactosidasa de
E. coli co-expresada para permitir el
escrutinio de virus recombinante, y (ii) una proteína de 98.000 Da
con el tamaño esperado de la RNA-polimerasa del
bacteriófago T7 [Figura 6]. Es notable la gran cantidad de
\beta-galactosidasa producida por MVA T7pol. Los
resultados de los experimentos de marcación in vivo
demuestran una expresión muy fuerte del constructo
P11-gen LacZ cuando se insertó en el genoma de MVA
en el sitio de la deleción II, lo que indicaba que los genes
recombinantes en los virus vectores MVA podrían expresarse más
eficientemente cuando se insertan en este locus del genoma de
MVA.
La utilidad de los virus recombinantes
MVA-T7pol como sistema de expresión en comparación
con el virus recombinante WR-T7pol
vTF7-3 (Fuerst et al. 1986) se ensayó por la
co-transfección de DNA de un vector de plásmido que
se deriva de pTM1 (Moss, B., Elroy-Stein, O.,
Mizukami, T., Alexander, W.A., y Fuerst T.R. (1990) Nature 348,
91-92) y contiene (clonado en los sitios NcoI
y BamHI del sitio de clonación múltiple de pTM1) el gen de
cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT) de E.
coli bajo el control de un promotor de
RNA-polimerasa T7 (PT_{7}). Células
CV-1 transfectadas e infectadas se suspendieron en
0,2 ml de Tris-HCl 0,25M (pH 7,5). Después de tres
ciclos de congelación-descongelación, los lisados se
aclararon por centrifugación, se determinó el contenido de
proteínas de los sobrenadantes, y se ensayaron muestras que
contenían 0,5, 0,25 y 0,1 \mug de proteína total en cuanto a
actividad enzimática como ha sido descrito por Mackett, M., Smith,
G.L. y Moss, B. (1984) J. Virol. 49, 857-864.
Después de autorradiografía, las manchas marcadas se cuantificaron
utilizando el sistema de análisis de imágenes Fuji. Los resultados
demuestran que por la utilización del vector vaccinia MVA
muy atenuado es posible aprovechar el sistema virus
vaccinia-RNA polimerasa T7 tan eficientemente como por la
utilización de un virus vaccinia recombinante totalmente
competente en replicación [Figura 7].
Se preparó un fragmento de 648 pb de DNA que
contenía el gen nef entero de HIV-1 LAI por
PCR a partir de DNA plasmídico (pTG1166, proporcionado generosamente
por M.-P. Kieny, TransGne S.A., Estrasburgo; los iniciadores de la
PCR fueron 5'-CAG CAG GGA TCC ATG GGT GGC AAG TGG
TCA AAA AGT AGT-3' y 5'-CAG CAG GGA
TCC ATG TCA GCA GTT CTT GAA GTA CTC CGG-3'),
digeridos con la endonucleasa de restricción BamHI,
modificados por incubación con DNA-polimerasa Klenow
para generar extremos romos, y clonados en el sitio SmaI de
pUCII LZdel P7.5 para producir el vector pUC II LZdel P7.
5-LAInef [Figura 8]. Este plásmido pudo utilizarse
para diseñar un virus recombinante de MVA que expresa el gen
nef de HIV-1 LAI bajo control del promotor
precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia.
Células CEF infectadas con MVA a una
multiplicidad de 0,05 TCID_{50} por célula se transfectaron con
DNA del plásmido pUC II LZdel P7.5-LAInef como se ha
descrito previamente (Suter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. y
Moss, B. [1994] Vaccine 12, 1032-1040. Los virus
recombinantes de MVA que contenían el gen nef y que
co-expresaban transitoriamente el gen marcador
LacZ de E. coli se seleccionaron por tandas
consecutivas de purificación en placa en células CEF teñidas con
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido
(300 \mug/ml). A continuación, se aislaron virus MVA recombinantes
que contenían el gen nef y que tenían delecionado el gen
marcador LacZ por tres tandas consecutivas adicionales de
escrutinio mediante purificación en placas respecto a focos víricos
que no se teñían en células CEF en presencia de
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido
(300 \mug/ml). Subsiguientemente, los virus recombinantes se
amplificaron por infección de monocapas CEF, y se analizó el DNA
vírico MVA-LAInef por PCR para confirmar la
homogeneidad genética del stock de virus. El análisis por
transferencia Southern del DNA vírico confirmó la estabilidad
genética de MVA-LAInef y demostró con precisión la
integración del gen nef y la deleción del gen marcador
LacZ de E. coli en el sitio de la deleción II dentro
del genoma vírico.
La expresión eficiente de la proteína Nef
recombinante se confirmó por análisis mediante transferencia
Western de lisados proteínicos de células CEF infectadas con
MVA-LAInef utilizando anticuerpos monoclonales de
ratón dirigidos contra HIV-1 Nef (proporcionados
generosamente por K. Krohn y utilizados como ha sido descrito por
Ovod, V., Lagerstedt, A., Ranki, A., Gombert, F., Spohn, R.,
Tähtinen, M., Jung, G., y Krohn, K. [1992] AIDS 6,
25-34).
Un fragmento de DNA de 1,9 kb que contenía el gen
entero codificante de la tirosinasa humano [clon 123.B2 de
c-DNA de tirosinasa, aislado de la línea de células
de melanoma SK29-MEL del paciente SK29 (AV), GenBank
Acc. No. UO1873; Brichard, V., Van Pel, A., Wölfel, T., Wölfel, C.,
De Plaen, E., Lethé, B., Coulie, P. y Boon, B. (1993), J. Exp. Med.
178, 489-495] se preparó a partir del plásmido
pcDNAI/Amp-Tyr [Wölfel, T., Van Pel, A., Brichard,
V., Schneider, J., Seliger, B., Meyer zum Büschenfelde, K., y Boon,
T. (1994) Eur. J. Immunol. 24, 759-764] por
digestión con EcoRI, se modificó por incubación con
DNA-polimerasa Klenow para generar extremos romos,
y se clonó en el sitio SmaI de pUC II LZdel P7.5 para
producir el vector pUC II LZdel P7.5-TYR [Figura 9].
Este plásmido pudo utilizarse para diseñar virus MVA recombinante
que expresa el gen de la tirosinasa humano bajo control del
promotor precoz/tardío P7.5 del virus vaccinia.
Células CEF infectadas con MVA a una
multiplicidad de 0,05 TCID_{50} por célula se transfectaron con
DNA del plásmido pUC II LZdel P7.5-TYR como se ha
descrito previamente (Suter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J. y
Moss, B. (1994) Vaccine 12, 1032-1040). El virus
MVA recombinante que expresaba de manera estable el gen de
tirosinasa humano y co-expresaba transitoriamente el
gen LacZ de E. coli se seleccionó por tandas
consecutivas de purificación en placa en células CEF teñidas con
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido
(300 \mug/ml). A continuación, el virus MVA recombinante que
expresaba el gen codificante de la tirosinasa humano y que tenía
delecionado el gen marcador LacZ se aisló por tres tandas
consecutivas adicionales de purificación en placa escrutando para
focos víricos sin teñir en células CEF en presencia de
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido
(300 \mug/ml). Subsiguientemente, los virus recombinantes se
amplificaron por infección de monocapas CEF, y el DNA vírico
MVA-hTYR se analizó por PCR para confirmar la
homogeneidad genética del stock de virus. El análisis por
transferencia Southern del DNA vírico confirmó la estabilidad
genética de MVA-hTYR y demostró con precisión la
integración del gen de tirosinasa recombinante y la deleción del
gen marcador LacZ de E. coli en el sitio de la
deleción II dentro del genoma vírico.
La expresión eficiente de la tirosinasa humano
recombinante se confirmó por análisis mediante transferencia
Western de lisados proteínicos de células CEF infectadas con
MVA-hTYR utilizando anticuerpos policlonales de
conejo (proporcionados generosamente por V. Hearing y utilizados
como ha sido descrito por Jiménez, M., Kameyama, K., Maloy, L.,
Tomita, Y. y Hearing, V. [1988] P.N.A.S. USA 85,
3830-3834) o anticuerpos monoclonales de ratón
(proporcionados generosamente por L. Old y utilizados como ha sido
descrito por Chen, Y., Stockert, E., Tsang, S., Coplan, K. y Old.
L. [1995] P.N.A.S. USA 92, 8125-8129) dirigidos
contra tirosinasa.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Ingoldstaedter Landstr. 1, Neuhenberg
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Oberschleissheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 85764
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Virus MVA recombinante, y el uso del mismo
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO).
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: DK 0782/95
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 04-JUL-1995
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN:/desc = "iniciador de DNA"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCAGGGTA CCCTCATCGT ACGGACCGTT CTC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- DESCRIPCIÓN:/desc = "iniciador de DNA"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCAGCCCG CCTATTCGAT GATTATTTTT AACAAAATAA CA
\hfill42
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN:/desc = "iniciador de DNA"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCAGCTGC AGGAATCATC CATTCCAGTG AATAGC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN:/desc = "iniciador de DNA"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCAGGCAT GCCGACGAAC AAGGAACTGT AGCAGA
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN:/desc = "iniciador de DNA"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCAGGTCG ACCCCGACCG CCTTACTGCC GCC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN:/desc = "iniciador de DNA"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGCTGC AGATGGTAGC GACCGGCGCT CAG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN:/desc = "iniciador de DNA"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCAGGGAT CCATGGGTGG CAAGTGGTCA AAAAGTAGT
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN:/desc = "iniciador de DNA"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCAGGGAT CCATGTCAGC AGTTCTTGAA GTACTCCGG
\hfill39
Claims (9)
1. Un virus MVA recombinante que contiene y es
capaz de expresar un antígeno de tirosinasa humana (hTyr).
2. El virus MVA recombinante de acuerdo con la
reivindicación 1, en el cual el gen hTyr se encuentra bajo control
de transcripción del promotor precoz/tardío del virus
vaccinia P7.5.
3. El virus MVA recombinante de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, esencialmente exento de virus que sean capaces
de replicarse en células humanas.
4. Una célula eucariota infectada in vitro
o ex vivo por un virus MVA recombinante de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Uso del virus MVA recombinante de acuerdo con
las reivindicaciones 1 a 3 para la producción in vitro de la
proteína hTyr recombinante.
6. Una vacuna que contiene un virus MVA
recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3 en un
vehículo fisiológicamente aceptable.
7. El uso del virus MVA recombinante de acuerdo
con las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de una
vacuna.
8. El virus MVA recombinante de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 anteriores y/o la vacuna
de acuerdo con la reivindicación 6 para la inmunización de un
cuerpo vivo animal, con inclusión de un humano.
9. El virus MVA recombinante y/o la vacuna de
acuerdo con la reivindicación 8 para la prevención o el tratamiento
de melanomas.
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