TWI245075B

TWI245075B - Recombinant MVA virus, and the use thereof

Info

Publication number: TWI245075B
Application number: TW092116681A
Authority: TW
Inventors: Gerd Sutter; Marion Ohlmann; Volker Erfle
Original assignee: Gsf Forschungszentrum Umwelt
Priority date: 1995-07-04
Filing date: 1996-12-31
Publication date: 2005-12-11
Also published as: US20100291139A1; PL186857B1; EP1312678A1; CA2225278A1; JP4312260B2; SI0836648T1; CZ292460B6; PT836648E; TW200305646A; JP2007244382A; US6440422B1; SI1312678T1; DK1312678T3; ES2249648T3; BR9609303A; MX9800025A; RU2198217C2; PL324347A1; EP1312678B1; BR9609303B1

Description

1245075 玖、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係有關重組型牛痘病毒，其係衍生自經修飾的牛痘病毒安哥拉株（MVA)並包含且能表現被插入在MVA基 5 因組之一天然發生的刪除位置内的外來基因，以及有關此類MVA重組型病毒用於生成多肽（例如抗原或治療劑）或供基因治療用的病毒載體的用途，以及此類編碼抗原的M VA 重組型病毒作為疫苗的用途。發明之目的 10 本發明之一目的係提供一 MVA重組型病毒，其可當作為一有效且異常地安全的表現載體。本發明之另一目的係提供一簡單、有效及安全之方法來供製造多肽（例如抗原或治療劑）、疫苗用之重組型病毒以及基因治療用之病毒載體。 15 本發明之再一目的係提供一種以一會表現Τ7 RNA聚合酶的M VA重組型病毒為主的表現系統，以及根據此表現系統來製造多胜肽（例如抗原或治療劑）或生產基因治療或疫苗用的病毒載體之方法。【先前技術】 20 發明之背景牛痘病毒（vaccinia virus)[痘病毒科（Poxviridae)的正疫病毒屬（Orthoposvirus)之一成員]被使用作為活疫苗以針對人類天花疾病而行免疫。利用牛痘病毒之成功的全世界牛痘接種終致達到天花病毒（variola virus)[引起天花的病源] 1245075 的根除（The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication. History of Public Health, No.4, Geneva: World Health Organization，1980)。在那份 WHO 聲明之後，除了 5 處在痘病毒感染之高危險性下的人群（例如實驗室工作者）之外，牛痘接種已被普遍地休止。更近期地，牛痘病毒亦被使用來設計病毒載體以供用於重組基因表現以及供作為重組型活疫苗之可能性使用 (Mackett，M·，Smith，G.L· and Moss，B (1982)，P.N.A.S. USA， 10 79:7415-7419; Smith，G.L.，Mackett，Μ· and Moss，B (1984)，

Biotechology and Genetic Engineering Reviews 2:383-407) o 這需要編碼外來基因的DNA序列（基因），在DNA重組技術的幫助下，被導入致牛痘病毒之基因組中。若基因被整合至病毒DNA之一個對於病毒的生活史而言非為必須的位置處 15 ，有可能使新生成的重組型牛痘病毒成為具傳染性的，亦即可感染外來細胞而因此可表現被整合的DNA序列（EP專利申請案第83,286及110,385號）。以此方法被製備之重組型牛痘病毒一方面可被使用作為用於感染疾病的預防之活疫苗，另一方面可被使用於製備真核細胞之異源性蛋白質。 20 表現噬菌體T7 RNA聚合酶基因之重組型牛痘病毒容許建立可廣泛應用的表現系統來供在哺乳動物細胞内合成重組型蛋白質（Moss，B·，Elroy-Stein，0·，Mizukmi，T·，Alexander， W.A·，and Fuerst，T.R. (1990)，Nature 348, 91-92)。在所有操作程序中，重組基因表現仰賴T7 RNA聚合酶在真核細胞之 1245075 細胞質内的合成。最普遍者成為一用於暫時表現（transient expression)的操作程序（Fuerst，T.R·，Niles，E.G·，Studier， F.W. and Moss, B. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126以及美國專利申請案7.648.971)。 5 首先，一感興趣之外來基因被插入至一在T7 RNA聚合酶啟動子控制下之質體内。接下來，此質體利用一標準轉染程序被導入至被會生產T7 RNA聚合酶的重組型牛痘病毒所感染的細胞之細胞質中。此轉染程序是簡單的，因為沒有新的重組型病毒需要 10 被製造出，且是非常有效的（有高於80%的細胞會表現該感興趣的基因）（Elroy-Stein，0· and Moss，B· (1990)，Proc. Natl. Acad· Sci. USA, 87:6743-6747)。該牛痘病毒/T7 RNA 聚合酶雜交物系統相較於其他暫時表現系統之優點極有可能是在於它不需要將質體轉送到細胞核内。在過去，該系統對於病 15 毒學與細胞生物學上的分析目的而言是極為有用的 (Buonocore, L. and Rose, J.K. (1990), Nature, 345: 625-628; Pattnaik, A. K and Wertz5 G. W. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88:1379-1383; Karschin，A·，Aiyar，J·，Gouin，A.， Davidson, N. and Lester, Η·Α· (1991)，FEBS Lett· 278: 229-20 233; Ho，B.Y·，Karschin，A·，Raymond，J·，Branchek，T·，

Lester, H.A. and Davidson, N. (1992), FEBS Lett., 301:303-306; Buchholz，C.J·，Rekzler，C·，Homann，H.E. and Neubert， W.J. (1994)，Virology，204:770-776)。但是，該牛痘病毒/T7 RNA聚合酶雜交物系統之重要的未來應用，例如像是要生 1245075 成供人類的治療或預防方法用的重組型蛋白質或重組型病毒粒子，可能會為該重組型牛痘載體之生產性複製（productive replication)所阻礙。 5 10 15 牛痘病毒對於人類而言是具傳染性的，且在天花根除活動期間的之時觀察到有偶發性嚴重併發症。有關併發症的發生之最佳回顧係由美國之一國内性觀察所提供，該觀察監

測了接受一以牛痘病毒之紐約健康局株（New York Board of Health strain)為主的疫苗之大約一千兩百萬人的牛痘接種 (Lane，J·，Ruben，F·，Neff，J· and Millar，J· (1969)，New Engl· J· Med·，281:1201-1208)。因此，要使用牛痘病毒來作為用於發展重組型活疫苗的載體之最令人興奮的可能性曾受到安全性考量以及法規規定所影響。再者，被描述於文獻中的大多數重組型牛痘病毒係以牛痘病毒之Western Reserve株為主。另一方面，已知道此病毒株具有一高神經毒性而因此很難被適用在人類以及動物身上[Morita et al·，Vaccine，5:65-70 (1987)]。對於載體應用而言，健康危險性可藉由使用一經高度馨減毒的病毒株而被減輕。數種此類的牛瘦病毒株被特別地發展出以避免天花的牛痘接種之非所欲副作用。因此，經修飾的牛痘病毒安哥拉株（MVA)已藉由牛痘病毒之安哥拉株 (CVA)在雞胚纖維母細胞上的長期連續傳代（l〇ng_term serial passages)而被產生（關於回顧，參見Mayr，A·，Hochstein-Mintzel，V. and Stickl，Η· (1975)，Infection，3:6-14;瑞士專利第568,392號）。MVA病毒有遵照布達佩斯條約之要求在 20 1245075 1987 年 12 月 15 日被寄存在 CNCM (Institut Pasteur， Collection Nationale de Cultures Microorganisms, 25? rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15)，寄存編號為 1-721。 MVA以其高減毒性（亦即被減低的毒性或傳染性而同時維持 5 著良好的免疫原性）而被分辨。MVA病毒曾被分析以定出在基因組中相對於野生型CVA株之改變。總共為3 1，000個鹼基對之基因組DNA的六個主要刪除位置（刪除位置I、II、 III、IV、V 及 VI)已被鑑定出（Meyer，H·，Sutter，G. and Mayr，A. (1991)，J. Gen. Virol. 72，1031-1038)。所形成的 10 MVA病毒變成宿主細胞被嚴格地限制為禽類細胞。再者，M VA之特徵在於其極度的減毒性。當在不同的動物模型中予以測試時，MVA被證實即令是在免疫受抑制的動物體内亦是無毒性的。更重要地，M VA株的優良特性已在大量的臨床試驗中得到證實[Mayr et al·，Zbl. Baakt· 15 Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 (1987); Stickl et al.5 Dtsch.

Med. Wschr. 99，2386-2392 (1974)]。在這些涵蓋超過 120,000個人（包括高危險性病人在内）的研究期間，無一副作用是與MVA疫苗的使用有關聯。 M VA在人類細胞中之複製被發現於感染後期會被阻斷 20 而遏止組合成成熟的具感染性病毒粒子。然而，MVA即使是在非許可的細胞内亦可以高位準來表現病毒基因與重組基因，並被建議可作為一有效且格外地安全的基因表現載體 [Sutter G. and Moss, B. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89，10847-10851]。最近，新牛痘載體系統已根據MVA而被 1245075 建立，具有外來DNA序列被插入在MVA病毒基因組内的刪除位置 III 處或 TK 基因内[Sutter，G· and Moss, B. (1995)， Dev. Biol. Stand· Basel，Karger 84，195-200 以及美國專利第 5，185，146 號]。 5 為了進一步開發MVA之用途，一藉由DNA重組技術來將外來基因引入至牛痘病毒之MVA株内的新穎可能方法曾被尋找。由於本發明不是要改變MVA病毒的基因組，不需要使用一會符合此需求之方法。依據本發明，一外來基因序列被重組至病毒DNA内準確地位在MVA基因組之一個 10 天然發生的刪除位置處。【發明内容】發明概要本發明因此特別地包含下列，單獨地或是組合地：一 MVA重組型病毒，其包含並可表現至少一個被插在MVA 15 基因組内之一個天然發生的刪除位置處之外來基因；一如上述之M VA重組型病毒，其包含並可表現至少一個被插入在MVA基因組之刪除位置II處的外來基因；一如上述之M VA重組型病毒，其中該外來基因編碼一標記、一治療基因或一抗原決定位； 20 一如上述之MVA重組型病毒，其中該外來基因編碼一源自下列之抗原決定位：病源性病毒、細菌或其他微生物，寄生蟲或腫瘤細胞。一如上述之M VA重組型病毒，其中該外來基因編碼一源自下列之抗原決定位··惡性癔原蟲（Plasmodium falciparum)、 10 1245075 分枝桿菌（Mycobacteria)、危療病毒（Herpes virus)、流感病毒（influenza virus)、肝炎病毒（hepatitis virus)或人類免疫不全病毒（human immunodeficiency virus); 一如上述之MVA重組型病毒，其中該抗原決定位是HIV 5 nef或人類絡胺酸酶；一如上述之MVA重組型病毒，其為MVA-LAInef或MVA-hTYR ；一如上述之MVA重組型病毒，其中該外來基因編碼T7 RNA聚合酶； 10 一如上述之MVA重組型病毒，其為MVA-T7 pol ; 一如上述之MVA重組型病毒，其中該外來基因係在牛痘病毒的早期/晚期啟動子P7.5的轉錄控制下；如上述之MVA重組型病毒，其基本上不含有可在人類細胞内複製之病毒； 15 一如上述之MVA重組型病毒用於在一 T7 RNA聚合酶啟動子P7.5之轉錄控制下來作DNA序列轉錄之用途；一為上述任一種M VA重組型病毒所感染的真核細胞；一為一如上述之M VA重組型病毒所感染之細胞，其中該外來基因編碼Τ7 RNA聚合酶； 20 一為一如上述之MVA重組型病毒所感染之細胞，其中該外來基因編碼Τ7 RNA聚合酶，並額外地包含一或多個帶有一或多個在一 Τ7 RNA聚合酶啟動子的轉錄控制下之外來基因的表現載體；如上述之細胞用於生產被該外來基因所編碼之多胜肽的用途 11 1245075 ，包含： a) 在適當條件下培養該等細胞，以及 )刀離出為该外來基因所編碼之多胜版。為一如上述之MVA重組型病毒所感染之細胞，其中該外來基因編碼T7 RN A聚合酶，並額外地包含帶有病毒基因的表現載體和/或一編碼一在T7 RNA聚合酶啟動子的轉錄控制下之病毒載體的基因組之病毒建構物；如上述之細胞用於生產病毒粒子之用途，包含·· a) 在適當條件下培養該等細胞，以及 b) 为離出病毒粒子；一為一如上述之MVA重組型病毒所感染之細胞，其中該外來基因編碼T7 RNA聚合酶，並額外地包含： a) 一表現載體，其帶有一反轉病毒載體建構物，該反轉病毒載體建構物可感染並於標的細胞内指引一或多個為該反轉病毒載體建構物所攜帶的外來基因之表現，以及 b) 一或多個帶有編碼多胜肽之基因的表現載體，該等多胜肽係為該反轉病毒載體建構物的基因組要在一 T7 RNA聚合酶啟動子的轉錄控制下被包裝時所需要者；上述細胞用於生產反轉病毒粒子之用途，包含 a) 在適當條件下培養該等細胞，以及 b) 分離反轉病毒粒子；一種疫苗，其包含一如上述之MVA重組型病毒，其令該外來基因編碼一位於一生理上可接受的載體内的抗原決定位；一如上述之MVA重組型病毒用於製備一疫苗之用途，其中 12 1245075 該外來基因編碼一抗原決定位；一如上述之疫苗用於免疫一活動物體（包括人類）之用途；一如上述之包含MVA-LAInef之疫苗用於預防或治療HIV 感染或AIDS的用途； 5 10 15 20 一如上述之包含MVA-hTYR之疫苗用於預防或治療黑色瘤的用途；一種疫苗’其包含有··作為一第一組份之一如上述之M VA 重組型病毒’其中該外來基因編碼位於一生理上可接受的載體内的Τ7 RNA聚合酶，以及作為一第二組份之一 DNA序列，該DNA序列攜帶一抗原決定處於一位在一生理上可接叉的載體内的T7 RNA聚合酶啟動子之轉錄控制下，該二組份被包含在一起或是分開的；一如上述之疫苗用於免疫一活動物體（包括人類）之用途，包含同時地或有一時間間隔下以該疫苗之第一及第二組份利用相同的接種位址而接種至該活動物體（包括人類广以及土口」此4代表任一種編碼一蛋白質或胜肽之Dna 序列。卜來基因」此詞代表一被插入在一 DNA序列内之| 因其中5亥基因通常是不會於該DNA序列内被發現的。料來基因，舉例而言，可為—標記基因、—治療邊 =編喝-抗原決定位之基因，或一病毒基因。此等基区係為本技藝中所熟知的。圖式簡單說明第一圖：MVA的其、土口、、且以及用於藉由同源性重組來插入外 13 1245075 來DNA的質體之示意圖··位於MVA的基因組内之Hindlll 限制位址被標示於上方。與位於M VA基因組内的刪除位置 II之鄰接處相重疊的900-bp Hindlll-Hindlll Ν片段被顯示出。與刪除位置II鄰接的MVA DNA序列（側翼1及側翼2) 5 藉由PCR被擴增並用於構築插入質體pUC II LZ。第二圖··用於插入至含有Pll-LacZ表現卡匣以及牛痘病毒早期/晚期啟動子P7.5之刪除位置II内之pUC II LZ P7.5 : MVA載體質體，俾以表現可被殖入至該質體的Smal位址内之感興趣的基因。 10 第三圖：用於在MVA基因組内的刪除位置II處插入外來基因的pUC II LZdel P7.5 : MVA載體質體，其含有一個自我刪除的Pll-LacZ表現卡匣以及牛痘病毒早期/晚期啟動子 P7.5，俾以表現可被殖入至該質體的Smal/Notl殖入位址内之感興趣的基因。 15 第四圖：重組型病毒MVA-T7pol之構築：MVA基因組 (Hindlll限制内切酶位址）以及載體質體pUC II LZ T7pol之示意圖，這容許位在刪除位置II處的Τ7 RNA聚合酶基因插入至MVA基因組之Hindlll Ν片段内。第五圖：MVA-T7pol病毒DNA之南方墨點轉印分析。

20 第六圖：使用[35S]甲硫胺酸的蛋白質之代謝性標示。SDS PAGE分析。第1行：MVA T7po卜第2行：MVA，第3行 :CV-1細胞。第七圖：CAT分析：被含有在Τ7 RNA聚合酶啟動子的控制下之CAT基因的質體所穿染以及被MVA-T/pol或WR- 14 1245075 T7pol所感染的CV-1細胞。溶胞產物就CAT活性被測試。 C代表氯黴素，而1-AcC與3-AcC代表單-及三-乙醯化形式之氯黴素。CAT活性被表示為在60分鐘内被形成的乙醯化 · 產物之百分比。 * 5 第八圖：MVA-LAInef之構築：MVA基因組（Hindlll限制内切酶位址）以及容許HIV-1 LAI之nef基因插入至MVA基因組之Hindlll N片段内的刪除位置II處的載體質體pUC II LZdel P7.5-LAInef 之示意圖。第九圖：MVA-hTYR之構築：MVA基因組（Hindlll限制核 f 10 酸内切酶位址）以及容許人類酪胺酸酶基因插入至MVA基因組之Hindlll N片段内的刪除位置II處的載體質體pUC II Lzdel P7.5-TYR 之示意圖。發明的詳細說明經修飾的牛痘病毒安哥拉株（MVA)，一種宿主範圍受限 15 制且被高度減毒之牛痘病毒株，無法在被測試的人類以及大多數其他哺乳動物細胞株中複製。但由於病毒的基因表現在非許可的細胞内未受損害，依據本發明之MVA重組型病毒 φ 可被用來作為格外安全且有效率之表現載體。編碼一抗原決定位之MVA重組型病毒 20 在一具體例中，本發明係有關於含有一編碼一外來抗原（較 . 佳地是來自一致病原者）之基因的MVA重組型牛痘病毒，以 . 及包含呈一生理上可接受形式之該一病毒的疫苗。本發明亦有關用於製備該MVA重組型牛痘病毒或疫苗之方法，以及有關這些疫苗用於預防由該等致病原所引起的感染之用途。 15 1245075 在本發明之一較佳具體例中，被插入於MVA病毒内之外來基因係為一個編碼HIV nef之基因。 ίο 15 20 吾等已構建MVA重組型病毒，其容許HIV-1 nef基因在牛痘病毒早期/晚期啟動子P7.5之控制下的表現。靈長類慢病毒（primate lentiviruses)之調控性Nef蛋白質是在病毒複製週期的早期被合成出，且已被顯示對於活體内的高效價病毒複製以及疾病誘發而言是為必須的。這暗示HIV nef可能在AIDS發病機理上扮演一重要角色。會使Nef去助長增高的病毒感染力以及HIV致病性之分子機制需要被進一步地闡明。然而，Nef係為免疫原性，且Nef-專一性抗原可被用來作為一對抗HIV感染及AIDS之疫苗。關於此點，會表現HIV nef基因之MVA重組型病毒可被使用於人類之免疫，一方面是作為對抗人類HIV之預防性疫苗，而另一方面是用於被HIV感染的或AIDS病人之免疫治療。再者，會表現HIV nef基因之MVA重組型病毒可被應用於重組型HIV nef蛋白質之生產。在本發明之另一較佳具體例中，被插入至MVA病毒内之外來基因係為一個編碼人類酪胺酸酶之基因。吾等已構築MVA重組型病毒，其容許人類酪胺酸酶基因在牛痘病毒早期/晚期啟動子P7.5之控制下的表現。最近，人類酪胺酸酶已被鑑定是為一種容許抗腫瘤溶胞性T-淋巴細胞之產生的黑色瘤-專一性腫瘤抗原（Brichard，V. et al. [1993] J. Exp. Med. 178, 489-495)。由於在正常細胞中，似乎只有黑色素細胞會表現酪胺酸酶基因，酪胺酸酶係為有關 16 1245075 黑色瘤的免疫治療之一有用的標的抗原。因此，會表現人類赂胺酸酶基因之M VA重組型病毒可被使用於黑色瘤病人身上以誘發會刺激腫瘤排斥或防止轉移之免疫反應。會表現人類酪胺酸酶基因之MVA重組型病毒可被直接地使用作為一 5 抗-黑色瘤疫苗，或該病毒可被使用於製備抗-黑色瘤疫苗。在一個實例中，會表現人類酪胺酸酶基因之MVA重組型病毒可被用於重組型酪胺酸酶蛋白質之生產，該蛋白質被應用作為疫苗製品中之一抗原。在另一實例中，使用會表現人類酪胺酸酶基因之M VA重組型病毒來作為表現載體，衍生自 10 一腫瘤病人之細胞可在活體外被修飾成會表現酪胺酸酶，並接而將該細胞移回至病人體内以誘發抗-腫瘤免疫反應。一根據會表現人類酪胺酸酶基因之MVA重組型病毒而被製備之疫苗可被非經腸道地應用或是在腫瘤之位置處被局部地應用。為了防止腫瘤轉移或是在表型上改變腫瘤[例如，在大 15 小、形狀、稠度（consistency)、血管化或其他特徵上]，一根據會表現人類酪胺酸酶基因之M VA重組型病毒而被製備之疫苗可在腫瘤的外科手術摘除之前、期間當中或之後被使用〇為了疫苗之製備，依據本發明之MVA牛痘病毒被轉換 20 成一生理上可接受形式。此可根據在製備被使用於對抗天花的疫苗接種之MVA疫苗上之經驗（如Stickl，H et al. [1974] Dtsch· Med. Wschr· 99，2386-2392 所述者）來達成。典型地，大約106-108個MVA重組型粒子在存在有2%蛋白腺與1% 人類白蛋白之100 ml的磷酸鹽緩衝液（PBS)内被冷凍乾燥於 17 1245075 =瓶（較佳為-玻璃安覩）中。冷康乾燥物可包含適用於非經腸道的投藥之增充劑[諸如甘露醇、葡聚糖（dextran)、糖甘胺I、乳醣或聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrolidone)]或-其他佐劑（諸如抗氧化劑、安定劑等）。該安瓶接而被密封並· 5 可被儲存（較佳地是在低於_2(TC之溫度下）歷時數個月。為供疫苗接種或治療，冷凍乾燥物可被溶解於〇1至〇·5 ml之一水性溶液（較佳為生理食鹽水）中並且予以非經腸道地投藥（例如，藉由肌肉内接種）或局部地投藥（例如，接種至一腫瘤内或在腫瘤之位置處）。依據本發明之疫苗或0 0 治療劑以肌肉内注射為較佳（Mayr，Α· et al. [1978] zbl.如匕

Hyg· I· Abt· Odg· B 167 375_39〇)。投藥之模式投藥之劑置及次數可為熟習此項技藝之人士以一已知之方式而加以最適化。若適合的話，可方便地採行將該疫苗於一個漫長時段内投藥數次，俾以得到對抗外來抗原之適當免疫反應。 5 MVA重組型病毒用於生產異種多胜肽之用途依據本發明之MVA重組型牛痘病毒亦可被使用於在真核細胞中製備異種多胜肽。這需要有被該重組型牛痘病毒所感染的細胞。編碼外來多胜肽之基因於該等細胞中被表現，而被表現之異種多胜肽被分離出。要被用於生產該等異種多 ) 胜版之方法係為熟習此項技藝之人士一般所知曉的（ΕΡ_Α· · 206,920及ΕΡ-Α-205,939)。藉由該等MVA重組型病毒之助而被產生之多胜肽，由於該等M VA病毒之特殊性質，是更適合於供使用作為人類及動物之醫藥。編碼Τ7 RNA聚合酶之MVA重組型病毒及其用於表現在一 18 1245075 T7 RNA聚合酶啟動子之轉錄控制下的DNA序列之用途在本發明之進一步較佳具體例中，吾等已構築出MVA 重組型病毒，其容許噬菌體T7 RNA聚合酶基因在牛痘病毒 -早期/晚期啟動子P7.5之控制下的表現。MVA-T7pol重組型 · 5 病毒作為表現系統之有用性已於暫時轉染分析中被測試，俾以誘發重組型基因在一 T7 RNA聚合酶啟動子之控制下的表現。利用大腸桿菌氯黴素乙醯基轉移酶（CAT)基因作為一報告基因（reporter gene)，吾等發現MVA-T7pol會誘發出跟一源自於牛痘病毒之可行複製的WR株之牛痘/T7pol重組型病0 10 毒同樣有效的CAT基因表現。依據本發明之MVA/T7 RNA聚合酶雜交物系統可因此被使用作為一用於在沒有生產性牛痘病毒複製下來生產多胜肽之簡單、有效且安全之哺乳動物表現系統。此表現系統亦可被使用於產生供用於疫苗接種或基因 15 治療之重組型病毒粒子，這係藉由以含有全部或某些該等基因之DNA-建建物來轉形被感染以會表現T7 RNA聚合酶之 M VA重組型病毒的細胞株，而為要產生病毒粒子（例如 MVA粒子或反轉病毒粒子）所需之基因組或重組型基因組係在一 T7 RNA聚合酶啟動子之轉錄控制下。 20 反轉病毒載體系統係由二個組份所組成： . 1)反轉病毒載體本身係為一經修飾之反轉病毒（載體質體）， _ 其中編碼病毒蛋白質之基因已為要被轉移至標的細胞内之治療基因及標幟基因所取代。由於編碼病毒蛋白質的基因之取代會有效地損害到病毒，該病毒必須藉由該系統中能提供所 19 1245075 遺失的蛋白質給經修飾之病毒之第二組份來予以拯救。第二組份為： 2) 一細胞株，其會產生大量的病毒蛋白質但缺乏能產生可行複製的病毒之能力。此細胞株被知之為包裝細胞株且係 5 由一被一或多個帶有能使該經修飾之反轉病毒載體被包裝之基因（編碼gag、pol及env多胜肽之基因）的質體所穿染之細胞株所構成。為了產生經包裝之載體，載體質體被穿染至包裝細胞株内。在這些情況下，含有被插入之治療基因及標記基因之 10 經修飾的反轉病毒基因組從該載體質體被轉錄出並被包裝入經修飾之反轉病毒粒子（重組型病毒粒子）中。此重組型病毒接而被用來感染標的細胞，其中該載體基因組及任何被攜帶之標記或治療基因變成被整合入標的細胞之DNA中。一被該一重組型病毒粒子所感染之細胞無法製造新載體病毒，因 15 為無病毒蛋白質存在於此等細胞中。然而，帶有治療基因或標記基因的載體之DNA被整合至細胞之DNA中，而接著可在被感染之細胞中被表現。依據本發明之可表現T7 RNA聚合酶之MVA重組型病毒可被用來生產在包裝反轉病毒載體上所需要之蛋白質。為 20 了做到此點，一反轉病毒[例如鼠科動物白血病毒（MLV)]之 gag、pol及env基因被置於一位在一或多個表現載體（例如質體）内之T7 RNA聚合酶啟動子的轉錄控制下。該等表現載體接而連同一帶有一反轉病毒載體建構物（可能係在一 T7 RNA聚合酶啟動子之轉錄控制下）之表現載 20 1245075 體被導入至被感染以會表現T7 RNA聚合酶的MVA重組型病毒之細胞内。 WO 94/29437、WO 89/11539 及 WO 96/07748 描述了不同型式之反轉病毒載體建構物，其等可使用上述之包裝系統 5 而加以包裝。會表現T7 RNA聚合酶之MVA重組型病毒之一進一步用途係為產生用於疫苗或治療劑之生產的重組型蛋白質、非感染性病毒粒子或感染性突變病毒粒子（Buchholz et al.， Virology，204，770-776 (1994)以及 EP-B1-356695)。為了做 10 到此點，病毒基因（例如IHV_1之gag-pol及env基因）被置於位在一表現載體（例如質體或另一個MVA重組型病毒）内之T7 RNA聚合酶啟動子的轉錄控制下。此建構物接而被導入至被感染以會表現T7 RNA聚合酶之MVA重組型病毒的細胞内。該等重組型病毒基因以高效率被轉錄，重組型蛋白 15 質以高量被生成且可被純化出。另外，被表現之重組型病毒蛋白質（例如HIV-1 env、gag)可組合成病毒偽粒子，該等病毒偽粒子自細胞出芽並可自組織培養基中被分離出。在另一具體例中，由MVA-T7 pol系統所表現出之病毒蛋白質（源自於例如HIV、SIV、痲疹病毒）可拯救一被額外地導入之突 20 變病毒（源自於例如HIV、SIV、痲疹病毒），這係藉由克服一在附著與感染、去外套、核酸複製、病毒基因表現、組裝、出芽或在病毒複製中之另一個步驟上之缺陷，俾以容許所提及之突變病毒之生產與純化。 MVA-T7 pol亦可連同帶有一感興趣之抗原的基因（例如 21 1245075 HIV之基因，nef、tat、gag、pol或env或其他）之DNA序列被使用於免疫。首先，一選定抗原（例如HIV、HCV、 HPV、HSV、痲疹病毒、流感病毒或其他）之一編碼序列較 · 佳地在一 T7 RNA聚合酶啟動子之控制下被選殖至一質體載 . 5 體中，而所形成之DNA建構物利用標準實驗室方法被擴增與純化。其次，載體DNA連同MVA-T7pol同時地或是在合適之時間差下被接種。於接種之位置處，感興趣之重組型基因於含有該載體DNA以及MVA-T7 pol兩者之細胞中被暫時性地表現，而對應之抗原被呈現給宿主免疫系統來刺激一 0 10 抗原-專一性免疫反應。對於容許一給定的抗原之有效暫時性表現但避免構成性基因表現之潛在風險的核酸疫苗接種而言，此利用非複製牛痘載體MVA-T7pol之操作方法代表一有希望的新方法。 M VA重組型牛痘病毒可如下面所述來製備：

15 一個包含有一編碼一外來多胜肽且有鄰接一位在MVA 基因組内之天然發生的刪除位置（例如刪除位置Π)之MVA DNA序列夾於兩側之DNA序列的DNA建構物被導入至被響 M VA感染之細胞内，俾以容許同源性重組。一旦該DNA建構物已被導入至真核細胞内，且該外來 20 DNA已與病毒DNA重組，有可能以一本身為已知的方法來分離所欲的重組型牛痘病毒，較佳地是在一標記之輔助下（比較Nakanoetal·，Proc·Natl·Acad·Sci·USA，7951593-1596 [982]; Franke et al.? Mol. Cell. Biol.,1918-1924 [1985]; Chakrabarfi et al·，Mol. Cell· Biol·，3403-3409 [1985]; Fathi 22 1245075 et al., Virology 97-105 [1986]). 要被插入的DNA建構物可以是線形或圓形。一圓形 DNA是較佳的，特別是一質體。DNA建構物包含有位在 MVA基因組内之一個天然發生的刪除位置（例如刪除位置 5 II)之左側與右側的侧翼序列（Altenburger，W·，Suter，C_P· and

Altenburger J· (1989) Arch. Virol· 105，15-27)。該外來 DNA 序列被插入在位於該天然發生的刪除位置之側翼的序列之間。該外來DNA序列可為一編碼一治療性多胜肽（例如t-PA 或干擾素）或一源自於致病原之抗原決定位之基因。該致病 10 原可為能引起一疾病之病毒、細菌及寄生蟲，以及會在一生物體内無限制地複製而因此可導致病理生長之腫瘤細胞。此類致病原之實例為Davis，B.D·等人所描述（Microbiology， 3rd，Harper International Edition)。較佳之致病原抗原係為那些為人類免疫不全病毒（例如HIV-1及HIV-2)、造成結核 15 病之分枝桿菌（Mycobacteria)、寄生蟲惡性瘧原蟲 (Plasmodium falciparum)以及黑色瘤細胞所具之抗原。為了表現一 DNA序列或基因，在DNA上必須要存在有為該基因之轉錄所需的調節序列。該等調節序列（被稱為啟動子）係為熟習此項技藝者所知的，並且包含，例如，如 20 EP-A-198,328中所述的那些為牛痘11 kDa基因所具者，以及那些為7.5 kDa基因所具者（EP-A-1 10,385)。 DNA建構物可藉由穿染而被導入至經MVA感染之細胞内，例如藉由填酸約沈殿法（〇以11&1116{&1.，\^〇1.52，456-467 [1973]; Wigler et al·，Cell 777-785 [1979])、藉由電穿孔 23 1245075 法（Neumann et al·，EMBO J· 1，841-845 [1982])、藉由微注射法[Graessmann et al·，Meth. Enzymology 101,482-492 (1982)]、藉由微脂粒法[Straubingeretal·，Proc·Natl·Acad· Sci· USA 77, 2163-2167 (1980)]或藉由熟習此項技藝者所知 5 之其他方法。藉由磷酸鈣沈澱法之穿染是為較佳的。以下之詳細實施例係意欲幫助對本發明有一更佳暸解。但是，並無意圖給予「本發明被限定於該等實施例中的標的」之印象。【實施方式】 10 實施例 1·病毒之生長及純化 1·1 MVA病毒之生長 MVA病毒是一經高度減毒之牛痘病毒，其係源自於牛痘病毒安哥拉株（CVA)並藉由在原始雞胚纖維母細胞（CEF) 15 培養物上作長期連續繼代而得。有關MVA株之生產、性質及用途之歷史的整體性回顧，可參見Mayer等人在

Infection 3,6-14 [1975]中所發表之總結報告。由於在CEF内之減毒，M VA病毒在此禽類宿主細胞中複製至高效價。然而，在哺乳類細胞中，MVA生長受到嚴重限制，且由該病 20 毒所形成之典型菌斑是偵測不到的。因此，MVA病毒是於 CEF細胞上生長。為了製備CEF細胞，自被孵化之雞蛋中分離出11天大之胚胎’除去端點（extremities)，而胚胎被剁碎並在37°C於一 0.25%胰蛋白酶溶液中予以解離歷時2〇分鐘。將所形成之細胞懸浮液過濾，而細胞藉由於室溫下在一 24 1245075

Sorvall RC-3B離心機内以2000 rpm予以離心歷時5分鐘而被沉降，將之再懸浮於10倍體積之培養基A (MEM Eagle，例如可得自於 Life Technologies GmbH，Eggenstein，德國）中，再次藉由於室溫下在一 Sorvall RC-3B離心機内以2000 5 rpm予以離心歷時5分鐘而將細胞沉降。細胞沉塊被再重建於含有10%胎牛血清（FCS)、盤尼西林（100單位/毫升）、鏈黴素（100單位/毫升）以及2 mM麩胺酸之培養基A中而得到一含有500000個細胞/毫升之細胞懸浮液。以此方法所得之 CEF細胞被塗佈於細胞培養皿上。視所需的細胞密度而定 10 ，它們被留在培養基A中，並在37°C下於一 C02培養箱中生長歷時1-2天，並被直接地或是於再一次的細胞繼代後被用於感染。原始培養物的製備之一詳細描述可見於R.I. Freshney 所著之教科書 “Culture of animal cell”，Alan R. Liss Verlag，New York [1983] Chapter 11，page 11 et seq·。 15 MVA病毒係如下述而被用於感染。CEF細胞被培養在175 cm2之細胞培養瓶中。在90-100%群集（confluence)下，培養基被移除，而細胞以一配於培養基A中之MVA病毒懸浮液（0.01感染單位（IU)/細胞，0.02 ml/cm2)予以培育歷時1小時。然後加入更多的培養基A (0·2 ml/cm2)，而培養瓶在37 20 °C下被培育歷時2-3天[直到大約90%之細胞顯示出細胞病變效應]。藉由將細胞單層刮入培養基内並藉由在4°C下於一 Sorvall RC-3B離心機内以3000 rpm予以離心歷時5分鐘來沉澱細胞物質而得到粗病毒貯液。粗病毒製品在作進一步處理（例如病毒純化）之前被儲藏於-20°C下。 25 1245075 1 · 2病毒之純化為得到一越純越好且不含對宿主細胞具專一性的成份之病毒製品而被採用之純化步驟係類似於那些為Jokik所述者（Virology 18, 9-18 [1962])。已被儲藏於-20°C下之粗病毒 5 製品被解凍並予以懸浮於PBS (10-20倍之沈澱體積）内一次，且懸浮液依據上述予以離心。新沈澱物被懸浮於10倍體積之THs緩衝溶液1 (10 mM Tris-HCl ρΗ9·0)中，且懸浮液以超音波（Labsonic L，B. Braun Biotech International, Melsungen，德國；在60瓦特及室溫下，2x 10秒）予以短暫 10 處理，俾以進一步分解細胞碎片並自細胞物質中釋出病毒粒子。細胞核及較大細胞碎片在隨後的懸浮液之短暫離心（可得自於 DuPont Co.，D-6353 Bad Nauheim，FRG 之 Sorvall GSA離心轉子；在300 rpm及10°C下歷時3分鐘）中被去除。沈澱物如上所述被再次地懸浮於Tris緩衝溶液1中、以 15 超音波予以處理並予以離心。所收集的包含自由病毒粒子之上清液被合併並層放於一由10 ml之配於10 mM Tris-HCl， pH 9.0中之36%蔗糖所構成之緩衝物上，並在4°C下於一 Beckman SW 27/SW 28離心轉子内以13,500 rpm予以離心歷時80分鐘。丟棄上清液，而包含病毒粒子之沈殿物被帶 20 到10 ml之1 mM Tris-HCl，ρΗ9·0中，藉由使用超音波（在室溫下2χ 10秒，儀器如上所述）之短暫處理予以均質化，並將之施用至一個20_40%蔗糖梯度（配於1 mM Tris-HCl， pH 9.0内的蔗糖）中以達進一步之純化。該梯度在4°C下於 Backmann SW41離心轉子内以13,000 rpm予以離心歷時50 26 1245075 5 10 15 分鐘。離心後，包含病毒粒子之區帶（discrete bands)係藉由抽除掉位在該區帶上方之容積後再作吸取而被收集。所得之蔗糖溶液以3倍容積之PBS加以稀釋，而病毒粒子再次地藉由離心（Beckmann SW 27/28，在 13,500 rpm 與 4°C 下歷時 60分鐘）而被沈澱。將現在大部分係由純病毒粒子所組成之沈澱丸再懸浮於PBS中，並予以調整至相當於平均1-5x109 IU/ml之病毒濃度。經純化之病毒貯液被儲存於-80°C下，並直接地或是以PBS稀釋而被應用於隨後的實驗。 1.3 MVA病毒之選殖為了產生均勻之病毒貯液製備物，得自於Anton Mayr 教授之MVA病毒，藉由在被培養在96井組織培養盤上之 CEF的三次連續繼代期間當中進行限制稀釋處理而被選殖出。MVA純株F6被選出並於CEF内被擴增以得到病毒之工作貯液，其可當作起始材料來供生成於本案中所描述之 MVA重組型病毒以及供用於生成先前所描述之M VA重組型病毒（Sutter，G. and Moss，Β. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89，10847-10851; Sutter，G. Wyatt, L·，Foley，P·， Bennink，J. and Moss, B. [1994] Vaccine 12，1032-1040;

20

Hirsch，V·，Fuerst，T·，Sutter，G·，Carroll, M·，Yang，L·， Goldstein，S·，Piatak，M·，Elkins，W·，Alvord，G·，Montefiori， D·，Moss，B. and Lifson，J. [1996] J· Virol· 70, 3741_3752)。 2· MVA重組型病毒之構築及特性判定 2· 1載體質體之構築為了容許MVA重組型病毒之產生，新質體載體被建構 27 1245075 。外來基因至M VA基因組内之插入被精確地對準至位在 MVA基因組内之天然發生的刪除位置II之位址。位在MVA 基因組之Hindlll N片段中之一個2500 bp刪除位置的側翼之 MVA DNA 序歹’J (Altenburger，W·，Sutter, C.P. and 5 Altenburger，J. [1989]，J. Arch. Virol· 105，15-27)以 PCR 予以擴增並被選殖至質體pUC18之多重選殖位址内。有關左端600 bp DNA側翼之引子係為5’ -CAG CAG GGT ACC CTC ATC GTA CAG GAC GTT CTC-3’ 及 5’ -CAG CAG CCC GGG TAT TCG ATG ATT ATT TTT AAC AAA ΑΤΑ 10 ACA-3’（有關於限制酶Kpnl及Smal之位址被劃底線表示）。有關右端550 bp DNA側翼之引子係為5’ -CAG CAG CTG CAG GAA TCA TCC ATT CCA CTG AAT AGC-3’ 及 5 ’ -CAG CAG GCA TGC CGA CGA ACA AGG AAC TGT AGC AGA-3’（有關於限制酶PstI及SphI之位址被劃底線 15 表示）。在被插入至pUC 18内之此等側翼MVA DNA之間，處在牛痘病毒晚期啟動子P11之控制下之大腸桿菌lacZ基因（藉由限制消化而從pill LZ被製得，Sutter，G. and Moss， Β· [1992] PNAS USA 89, 10847-10851)，使用 BamHI 位址，而被插入以產生MVA插入載體pUCII LZ (第一圖）。接下來 20 ，一個包含牛痘病毒早期-晚期啟動子P7.5之289 bp片段連同一用於選殖之Smal位址（藉由使用EcoRI及Xbal之限制消化而從質體載體pSCll被製得[Chakrabartiet al. 1985, Molecular and Cellular Biology 5，3403-3409])被插入至 pUC II LZ之Smal位址内以生成MVA載體pUC II LZ Ρ7·5 (第二 28 1245075

圖）。為了構築一容許經由報告酵素/5 -半乳糖苷酶之暫時合成來作MVA重組型病毒之分離的載體質體，一源自於大腸桿菌LacZ開放解讀框架（open reading frame)之3’端之330 bp DNA片段以PCR予以擴增（引子為5’ -CAG CAG GTC 5 GAC CCC GAC CGC CTT ACT GCC GCC-3’ 及 5’ -GGG GGG CTG CAG AATG GTA GCG ACC GGC GCT CAG-3’ ) ，並將之選殖入pUC II LZ P7.5之Sail及PstI位址内而得到MVA載體pUC II Lzdel Ρ7·5 (第三圖）。利用Smal位址，此載體質體可被用於將編碼一處在牛痘病毒啟動子P7.5 10 之轉錄控制下的外來基因之DNA序列插入至MVA基因組中。在所欲之重組型病毒已藉由篩選卢-半乳糖苷酶活性之表現而被分離出後，該重組型病毒之進一步繁殖導致被再處理之Pll-LacZ表現卡匣藉由同源性重組的自我刪除。 2.2重組型病毒MVA T7pol之構築及特性判定 15 一個包含處在牛痘病毒早期/晚期啟動子Ρ7.5之控制下的噬菌體Τ7 RNA聚合酶之全部基因的3.1 kbp DNA片段藉由 EcoRI 而自質體 pTF7_3 被切出（Furest，T.R·，Niles, E.G·， Studier，F.W. and Moss，B·，1986，P.N.A.S. USA 83，8122-8126)，藉由使用Klenow DNA聚合酶之培育來予以修飾以 20 生成鈍端，並將之選殖入pUCII LZ之一個獨特的Smal限制位址内，以形成質體轉移載體pUCIILZT7pol(第四圖）。作為有關於T7 RNA聚合酶基因的表現之轉錄控制子，牛痘病毒早期/晚期啟動子P7.5被選用。相對於較強之牛痘病毒晚期啟動子（例如P11)，此啟動子系統如容許重組型基因緊 29 1245075 接在目標細胞的感染後之表現。會引導外來基因插入至MVA基因組之删除位置II之位址處的質體pUCII LZ T7pol被用於產生重組型病毒MVA T7pol。被MVA以每個細胞為 0.05 TCID5G之增殖率 5 (multiplicity)所感染的CEF細胞被穿染以如前所述之質體 pUCII LZ T7pol 之 DNA (Sutter，G，Wyatt, L·，Foley，P·， Bennink，J. and Moss，Β·(1994) Vaccine 12，1032-1040) 〇會表現T7 RNA聚合酶並且共同表現/3-D-半乳糖苷酶之 MVA重組型病毒（MVA Ρ7·5-Τ7ρο1)藉由為5-溴-4-氣-3-吲哚 10 基召-D-半乳糖苷（300 mg/ml)所染色之CEF細胞的5次連續的菌斑純化處理而被選出。接著，重組型病毒藉由感染 CEF單層而被擴增，且DNA藉由PCR予以分析以確認病毒貯液之基因均一性。MVA-T7pol病毒DNA之南方墨點轉印分析證實重組型基因在MVA基因組内的刪除位置II之位址 15 處的安定整合（第五圖）。為了監測由重組型MVA-T7pol之T7 RNA聚合酶表現，得自於被病毒感染之組織培養物的[35S]甲硫胺酸-標記的多胜肽被分析。被養在12井培養盤内之猴腎細胞株CV-1 之單層被病毒以每個細胞20 TCID50之增殖率所感染。在 20 感染3至5小時後，將培養基移除並以1 ml不含甲硫胺酸之培養基來清洗培養物一次。對每一個井，予以加入〇 · 2 ml 之補充有50 mCi的[35S]曱硫胺酸之不含甲硫胺酸之培養基，並將之培育於37°C下歷時30分鐘。被感染的細胞之細胞質萃取物係藉由在37°C下將每個井培育在0.2 ml之0.5% 30 1245075 ίο 15 20

Nonidet P-40溶胞緩衝液中歷時10分鐘而被製得，並以 SDS-PAGE來分析樣品。帶有MVA T7pol的CV_1細胞之代謝物標示顯示出兩個額外之多胜肽的合成：（i) 一為大約 116,000 Da之蛋白質，其代表被共同表現以容許重組型病毒之篩選的大腸桿菌/3-半乳糖苷酶，以及（ii)一為98,000 Da 之蛋白質，其帶有所預期之噬菌體T7 RNA聚合酶的大小（第六圖）。由MVA T7pol所製出之大量/3-半乳糖苷酶相當可觀。源自於活體内標示試驗之結果證實：Pll-LacZ基因建構物體當被插入至MVA基因組内位在刪除位置II之位址# 處時有一非常強之表現，這出示位在M VA載體病毒内之重組型基因，當被插入至MVA基因組之此個位置内時，可被更有效地表現。

MVA-T7pol重組型病毒相較於WR-T7pol重組型病毒 vTF7-3 (Fuerst等人，1986)在作為表現系統上之有用性，係藉由與一質體載體之DNA的共穿染來測試，該質體載體係衍生自 pTMl (Moss，B·，Elroy-Stein，01，Mizukami，T·， Alexander，W.A· and Fuerst T.R.(1990) Nature 348，91-92)且包含處在一 T7 RNA聚合酶啟動子（PT7)的控制下之大腸桿菌氯黴素乙醯基轉移酶（CAT)基因（被選殖入pTMl多選殖位址之Ncol及BamHI位址内）。被穿染與感染之CV-1細胞被懸浮於0.2 ml之0·25 M Tris_HCl (ρΗ7·5)中。在三次冷凍-解凍循環後，溶胞液以離心加以澄清，上清液之蛋白質含量被測定，而含有0.5、0.25、0.1 mg總蛋白質之樣品係如 Macket, M., Smith, G.L. and Moss, B. (1984) J. Virol. 49, 31 1245075 857-864所述來就酵素活性作分析。在自動放射顯相後，被標示之點利用富士影像分析系統加以定量。結果證實：藉由使用經高度減毒之牛痘載體MVA，有可能開發出跟使用一完全可複製之牛痘病毒重組體同樣有效率之牛痘病毒-T7 RNA聚合酶系統（第七圖）。 2.3重組病毒MVA-LAInef之構築及特性判定 ίο 15 20

一個包含HIV-1 LAI之整個nef基因之648 bp DNA片段係藉由PCR而從質體DNA (pTG1166係由M,_P. Kieny， Transgene S.A·，Strasbourg 慷慨提供；PCR 引子係為 5’ -參 CAG CAG GGA TCC ATG GGT GGC AAG TGG TCA AAA AGT AGT-3’ 及 5’ _CAG CAG GGA TCC ATG TCA GCA

GTT CTT GAA GTA CTC CGG-3’ ）而被製備，以限制内切酶BamHI予以消化，利用Klenow DNA聚合酶培育予以修飾而生成鈍端，並將之選殖入pUC II LZdel P7.5之Smal位址内，以製造出載體pUC II LZdel P7.5_LAInef (第八圖）。此質體可被用於構築會在牛痘病毒早期/晚期啟動子Ρ7·5之控制下來表現nef基因之MVA重組型病毒。被MVA以每個細胞0.05 TCID50之增殖率所感染之CEF細胞被穿染以如前所述之質體 pUCII LZdel P7.5-LAInef 之 DNA (Sutter，G， Wyatt，L·，Foley，P·，Bennink，J. and Moss，Β·(1994) Vaccine 12，1032-1040)。包含nef基因且會暫時共同表現大腸桿菌 LacZ標記基因之MVA重組型病毒藉由為5-溴-4-氣-3-吲哚基卢-D-半乳糖苷（300 mg/ml)所染色之CEF細胞的連續的菌斑純化處理而被選出。接著，包含nef基因且已刪除掉 32 1245075

LacZ標記基因之MVA重組型病毒藉由在5-溴-4-氯-3-吲哚基/3 -半乳糖苷（300 mg/ml)之存在下，就CEF細胞中未染色之病毒點作三次額外之連續的菌斑純化處理而被分離出。接著，重組型病毒藉由CEF單層的感染而被擴增，而MVA- LAInef病毒DNA藉由PCR被分析以確認病毒貯液之基因均一性。病毒DNA之南方墨點轉印分析確認了 MVA-LAInef乏基因安定性並準確地證實在病毒基因組内的刪除位置II之位址處有nef基因之併入以及大腸桿菌LacZ標記基因之刪除。 ίο 15 20

重組型Nef蛋白質之有效表現係藉由得自於被MVA-LAInef所感染之CEF細胞的蛋白質溶胞液，利用針對HIV-1 Nef之小白鼠單株抗體（腎由K· Krohn慷慨提供，且如 Ovod，V·，Lagerstedt，A·，Ranki，A·，Gombert，F·，Spohn，R·， Tahtinen，M. Jung，G·，and Krohn，D. [1992] AIDS 6，25-34 所述被使用）的西方墨點轉印分析而被確認。

2.4重組型病毒MVA-hTYR之構築及特性判定一個包含編碼人類酪胺酸酶的整個基因之1.9 kb DNA 片段（分離自病人SK29 (AV)之黑色瘤細胞株SK29-MEL的酿胺酸酶 c-DNA 純株 123.B2，Gen Bank Acc· No. U01873 ;

Brichard，V·，Van Pel，A·，W0lfel，T·，W0lfel，C.，De Plaen， E·，Leth6，B” Coulie，P· and Boon，B. (1993)，J. Exp. Med· 178，489-495)係從質體 pcDNAI/Amp-Tyr (W0lfel，T·，Van Pel, A.，Brichard，V·，Schneider, J” Seliger，B.，Meyer zum Buschenfelde，K· nad Boon，T. (1994) Eur. J. Immunol 24, 33 1245075 759-764)被製備出，以ecori予以消化，利用Klenow DNA ♦合酶培月予以修飾而生成純端’並將之選殖入pUC II LZdel Ρ7·5之smal位址内，以製造出載體pUC II LZdel P7.5-TYR (第九圖）。此質體可被用於構築能在牛痘病毒早期/晚期啟動子Ρ7β5之控制下來表現人類酪胺酸酶基因之 MVA重組型病毒。被MVA以每個細胞為〇·〇5 TCID5〇之增殖率 (multiplicity)所感染的CEF細胞被穿染以如前所述之質體 pUCII LZdel P7.5-TYR 之 DNA (Sutter，G，Wyatt，L·，Foley, ίο 15 20

P·，Bennink，J· and Moss，Β·(1994) Vaccine 12，1032-1040) 〇安定地表現人類酪胺酸酶基因且暫時地共同表現大腸桿菌 LacZ標記基因之MVA重組型病毒藉由為5-溴-4-氣-3-吲哚基冷-D-半乳糖苷（3〇〇 mg/ml)所染色之CEF細胞的連續的菌斑純化處理而被選出。接著，會表現編碼人類酪胺酸酶之基因且已刪除掉LacZ標記基因之MVA重組型病毒藉由在5-溴-4-氣-3-吲哚基冷-半乳糖苷（300 mg/ml)之存在下，就CEF 細胞中未染色之病毒點作三次額外之連續的菌斑純化處理而被分離出。接著，重組型病毒藉由CEF單層的感染而被擴增，而MVA-hTYR病毒DNA藉由PCR被分析以確認病毒貯液之基因均一性。病毒DNA之南方墨點轉印分析確認了 MVA-hTYR之基因安定性並準確地證實在病毒基因組内的删除位置II之位址處有重組型酪胺酸酶基因之併入以及大腸桿菌LacZ標記基因之刪除。重組型人類酪胺酸酶之有效表現係藉由得自於被MVA- 34 1245075 hTYR所感染之CEF細胞的蛋白質溶胞液，利用針對酪胺酸酶之兔多株抗體（腎由V· Hearing慷慨提供，且如Jimenez， 5 10 15 20 M., Kameyama, K.? Maloy, L.? Tomita, Y. and Hearing, V. [1988] P.N.A.S· USA 85, 3830-3834所述被使用）或小白鼠單株抗體（腎由L· Old慷慨提供，且如Chen，Y·，Stockert，E·， Tsang，S·，Coplan，K and Old，L. [1995] P.N.A.S. USA 92， 8125-8129所述被使用）的西方墨點轉印分析而被確認。【圖式簡單說明】第一圖：MVA的基因組以及用於藉由同源性重組來插0 入外來DNA的質體之示意圖：位於MVA的基因組内之 Hindlll限制位址被標示於上方。與位於MVA基因組内的刪除位置II之鄰接處相重疊的900-bp Hindlll-Hindlll N片段被顯示出。與刪除位置Π鄰接的MVA DNA序列（側翼1及側翼2)藉由PCR被擴增並用於構築插入質體pUC II LZ。第二圖：用於插入至含有Pll-LacZ表現卡匣以及牛痘

病毒早期/晚期啟動子P7.5之刪除位置Π内之pUC II LZ Ρ7·5 : MVA載體質體，俾以表現可被殖入至該質體的Smal 位址内之感興趣的基因。第三圖：用於在MVA基因組内的刪除位置II處插入外來基因的pUC II LZdel P7.5 : MVA載體質體，其含有一個自我刪除的Pll-LacZ表現卡匣以及牛痘病毒早期/晚期啟動子P7.5,俾以表現可被殖入至該質體的Smal/Notl殖入位址内之感興趣的基因。第四圖：重組型病毒MVA-T7pol之構築：MVA基因組 35 1245075 (Hindlll限制内切酶位址）以及載體質體pUC II LZ T7pol之示意圖，這容許位在刪除位置II處的Τ7 RNA聚合酶基因插入至MVA基因組之Hindlll N片段内。第五圖：MVA-T7pol病毒DNA之南方墨點轉印分析。 5 第六圖：使用[35S]甲硫胺酸的蛋白質之代謝性標示。 SDS PAGE分析。第1行：MVA T7po卜第2行：MVA，第 3行：CV-1細胞。 10 15 20 第七圖：CAT分析：被含有在Τ7 RNA聚合酶啟動子的控制下之CAT基因的質體所穿染以及被MVA-T/pol或WR-T7pol所感染的CV-1細胞。溶胞產物就CAT活性被測試。 C代表氣黴素，而1-AcC與3_AcC代表單-及三-乙醯化形式之氣黴素。CAT活性被表示為在60分鐘内被形成的乙醯化產物之百分比。第八圖：MVA-LAInef之構築：MVA基因組（Hindlll限制内切酶位址）以及容許HIV-1 LAI之nef基因插入至MVA 基因組之Hindlll N片段内的刪除位置II處的載體質體pUC IILZdelP7.5-LAInef 之示意圖。第九圖：MVA_hTYR之構築：MVA基因組（Hindlll限制核酸内切酶位址）以及容許人類酪胺酸酶基因插入至MVA 基因組之Hindlll N片段内的刪除位置II處的載體質體pUC II Lzdel P7.5-TYR 之示意圖。【圊式之主要元件代表符號說明】

無 36

Claims

12側益號專利再審查案申請專利範圍修正本拾、申請專利範圍： β —vw. I V ¢--* r. 5補充丨 1. 一種用以生產一經修飾的牛疫病毒安哥拉株（MVA)重組型病毒之方法，該M VA重組型病毒包含並可表現至少一種擇自於人類酪胺酸酶抗原或其抗原決定位以及一 HIV nef 抗原或其抗原決定位的外來基因，該方法包括的步驟為 •令一 M VA病毒與一質體進行重組，於該質體中至少有一外來基因被側接以MVA-DNA序列，該等μVA-DNA序列鄰接於]VIVA基因組内之插入位置。 2·如申請專利範圍第丨項之方法，其中該重組係藉由以該質體來穿染禽類細胞並以言亥舰財來感染該等細胞而被進行其中牙染與感染係同時地或在有一合適之時間差下被進行。 3.如申’專利圍帛2項之方法，其中該禽類細胞為雞胚纖維母細胞（CEF)。 utn利範u i項之方法’其中該外來基因是在牛痘病毒的早期/晚期啟動子Ρ7·5的轉錄控制下。 5·如申=專利範圍第i項之方法，其中該形成的麵重組型病毒不含有於人類細胞内可複製的病毒。 n疫苗的m包括將藉由中請專利範 ,狄主至5項中任一項之方法來製備而形成的MVA重組型病毒與—藥學上可接受的載劑相混合。 7. 一種用以於活體外在-細胞培養物内表現一外來基因之方法’其包含下列步驟·· 項之方法所生成的MVA重 ])以一藉由申請專利範圍第1 37 1245075 修正日期：94年8月該外來基因於被感染的弟092116681號專利再審查案申請專利範圍修正本組型病毒來感染禽類細胞；以及 ϋ)培養被感染的禽類細胞，藉此，禽類細胞中被表現。 8’種用以生成—DNA建構物的方法，該DNA建構物可；成、二心飾的牛痘病毒安哥拉株（MVA)重組型病毒重、、且型病毋包含並可表現被插入於MVA的基口、'且内的個非為天然發生的刪除位置瓜之天然發生的刪除位置處之一哎一猶以μ认从十付及種以上的外來基因，該方法包含的 '為將個S有一或一種以上的外來基因的DNA序歹J插入至位在M VA基因組内的一個天然發生的刪除位置之側翼的序列之間，其中該Mva基因組之天然發生的刪除位置係選自於下列所構成的群組：MVA基因組之天然發生的刪除位置1、位置IV、位置V與位置w。列中的該外來基因編碼一標記、一治療劑 9·如申請專利範圍第8項之方法，其中被包含於該謝序抗原或 Λ — 抗原決定位士申明專利範圍帛9項之方法，纟中被包含於該議序列中的該外來基因編碼一源自下列之抗原或抗原决疋位·病源性/病毒、細菌或其他微生物，寄生蟲或腫瘤細胞。 .士。申請專利範圍帛1〇Ji之方法，其中被包含於該DNA序列中的該外來基因編碼一源自下列之抗原或抗原決定位：惡性癔眉虫r 匕尽蛛{Plasmodium Falciparum)、分枝样菌（Myco〜ck〜）、疱麥 .、、六a —主 7匕A涡毋（Herpes virus)、流感病毒 38 12领71 _____ 修正_: 94年8月 (influenza viius)、肝炎病毒（hepatitis virus)或人類免疫不全病毒（human immun〇deficiency virus)。 12· "請專利範圍第10項之方法，其中該抗原或抗原決定位是HI V nef或人類酪胺酸酶。 13· ⑹申請專利範圍帛8項之方法，其中被包含於該 DNA序列中的該外來基因係處在牛痘病毒的早期/晚期啟動子P7.5的轉錄控制下。 14· ”請專利範圍第8項之方法，其中被包含於該序列中的該外來基因編碼T7 rna聚合酶。 15' —種用以生成一載體質體的方法，該載體質體可用於生成MVA重組型病毒，該MVA重組型病毒包含並可表現被插人於MVA的基因組内的—個非為天然發生的刪除位置]Π之天然發生的刪除位置處之一或一種以上的外來基因’該方法包含的步驟為：將位在魏基因組個天然U的冊j除位置的左側與右側的MVA DNa 側翼序列選殖至一質體中，以及將一含有—或一種以上的外來基因的DNA序列插入至該質體内居於該左側及該 ^則職舰側翼序列之間，其中該左側與該右側 rDNA側翼序列係為位在請基因組之一個天然發 i ML右側的側翼DNA序列，該天然發的刪除位置係選自於下列所構成的群組：MVA基因组 16之天'然發生的刪除位置1、位㈣、位置KUVI。 • h申請專利範圍帛15項之方法，其中被包含於 A序列中的該外來基因編碼-標記、—治療劑、一 39 I24507J 81號專利再審查案申請專利範圍修正本修正日期：94年8月抗原或抗原決定位。 17· 如申請專利範圍第16項之方法，其中被包含於該DNA序列中的該外來基因編碼一源自下列之抗原或抗原決定位：病源性病毒、細菌或其他微生物，寄生蟲或腫瘤細胞。 • 如申請專利範圍第17項之方法，其中被包含於該DNA序列中的該外來基因編碼一源自下列之抗原或抗原决义位·惡性蠢原轰（plasm〇clium Falciparum)、分枝桿菌（Myokc⑽⑷、疱疹病毒（Herpes virus)、流感病毒 (influenza virus)、肝炎病毒（hepatjtis virus)或人類免疫不王病毒（human immunodeficiency virus)。 • 如申請專利範圍第17項之方法，其中該抗原或抗原決定位是HI V nef基因或人類酪胺酸酶。 . 如申請專利範圍第19項之方法，其中由此所生成的載體質體導致MVA-LAInef或MVA-hTYR的生成。 • 如申請專利範圍第15項之方法，其中被包含於忒DNA序列中的該外來基因係處在牛痘病毒的早期/晚期啟動子P7 · 5的轉錄控制下。如申凊專利範圍第15項之方法，其中被包含於忒DNA序列中的該外來基因編碼T7 rna聚合酶。 • 如申請專利範圍第22項之方法，其中由此所生成的載體質體導致MVA冴7p〇1的生成。，上種用以生成一 MVA重組型基因組/病毒的方法 4 MVA重組型病毒包含並可表現被插入於MVA的基 40 1245075 〇修正日期：94年8月之—或一種以上的發生的刪除位置係組之天然發生的刪，該方法包括下列第0 211 81就專利再審查案申請專利範圍修正本因組内的一個天然發生的刪除位置處外來基因，其中該MVA基因組之天然延自於下列所構成的群組：MVA基因除位置I、位置w、位置V與位置贝步驟： (a)以一 MVA來感染一禽類宿主細胞；的载體 ⑻以-藉由申請專利範圍第15項的方法所製備貝體來穿染該被感染的禽類宿主細胞； ⑷ 進行該載體質體與該MVA的DNA基因組之間的同源性重組；以及 ⑷分離所形成的MVA重組型基因組/病# ; ”中感木步驟⑷與穿染步驟⑻被同時地或是在有一合適之時間差下被進行。 • 如申請專利範圍第 MVA重組型基因組/病毒是 MVA-T7p〇l 〇 24項之方法，其中所形成的MVA-LAInef、MVA-hTYR 或 26·、"請專利範圍第24項之方法，其中位於所形重、’且型基因組/病毒中之該外來基因是在牛痘病毋的早期/晚期啟動子心的_控制下。 …月專利範圍第24項之方法，其中所形成的 MVA重組型基因組/病毒不含有於人類細胞内可複製的病毒。 41 27· I2i50Q^8] 號專利再審查射請專纖圍修本修正日期：94年8月 8· —種用以製備-疫苗的方法’其包括將依據申过專利範圍第24項之方法所製備的魏重組型基因^ 毒與-藥學上可接受的栽劑相混合。 29奎—種用以製備-疫苗的方法，其包括將依據申請 f利範圍第25項之方法所製備的隱重組型基因組/病毋與一藥學上可接受的载劑相混合。 3〇串〜—種用以製備-疫苗的方法，其包括將依據申請利範圍第26項之方法所製備的魏重組型基因組/病毒與一藥學上可接受的载劑相混合。 31. 一種用以在活體外於一細胞培養物中表現一外來基因的方法，其包括下列步驟： ⑴以-藉由中請專利範圍第24項之方法所生成的麵重組型基因組7病毒來感染禽類宿主細胞；及 ⑻培養被感染的禽類宿主細胞，藉此，該外來基因於該被感染的禽類宿主細胞内被表現。如申明專利範圍第3 1項之方法，其中於步驟⑴ 中所用的MVA重組型基因組/病毒是MVA丨Αΐη^、mva_ hTYR 或 MVA-T7p〇卜 •一如申請專利範圍第31項之方法，其中該等細胞員卜也㊁有或夕個表現載體攜帶有處於T7 RNA聚合酶啟動子之轉錄控制下的一或一種以上的外來基因。 • 如申請專利範圍第33項之方法，其中該等細胞被進一步培養，藉此，該一或一種以上的外來基因被表 42 124獅 '8】號專利再審請專概IS修正本 35. 現而容許分離出由該（等）外來基所編碼如申請專利範圍第31 修正日期：94年8月之多狀。額外地含有： a) 一表現載體，其帶有一反轉項之方法，其中該等細胞病毒載體建構物，該反轉病毒載體建構物可感染你細胞内指引一或多個為該反轉病毒載體建構物表現，以及所攜帶的外來基因之 b)或多個帶有編碼多胜肽之基因的表現載體，該等夕胜肽係為該反轉病毒載體建構物的基因組要在— T7 RNA聚合㈣動子的轉錄控制下被包裝時要者。 36·、、—如中請專利範圍第35項之方法，其中該等細被進一步培養，藉此，病毒粒子被生成並從該細胞培物被分離出。

用乂生產一 MVA重組型病毒之方法，該 MVA重組型癌；| h , 届毋包含亚可表現被插入於MVA的基因組内的個非為天然發生的刪除位置m之天然發生的刪除位置處之一殊—種以上的外來基因，該方法包含的步驟為 * MVA病毒與一質體進行重組，於該質體内有一含 ^ 種以上的外來基因的DNA序列被側接以MVA-D N A序列，士方發λ | ▲ 邊寻MVA-DNA序列鄰接於MVA基因組内之 # & |於下列所構成的群組之天然發生的刪除位置： 43 修正日期：94年8月位置IV、位置V 124銳爲8"_再_ _利_正本 MVA基因级之天然發生的刪除位置與位置VI。如申凊專利範圍第3 7項之方法，其中該重組係藉由以σ亥貝體來穿染禽類細胞並以MVA病毒來感染該等細胞而被進行，其中穿染及感染係同時地或在有一合適之時間差下被進行。 9· 如申請專利範圍第38項之方法，其中該禽類細胞為雞胚纖維母細胞（Cef)。 0· 如申請專利範圍第37項之方法，其中該外來基因編碼一標記、一治療劑、一抗原或一抗原決定位。 1 · 如申請專利範圍第37項之方法，其中該外來基因編碼一源自下列之抗原或抗原決定位：病源性病毒、細菌或其他微生物，寄生蟲或腫瘤細胞。如申請專利範圍第41項之方法，其中該外來基因編碼一源自下列之抗原或抗原決定位：惡性瘧原蟲 (Plasmodium Falciparum)、分故椁菌〔Myc〇bacteria、、兔疹病毒（Herpes virus)、流感病毒（influenza virus)、肝炎病毒（hepatitis Virus)或人類免疫不全病毒（human immunodeficiency virus) ° • 如申請專利範圍第42項之方法，其中該抗原或抗原決定位是HI V nef或人類絡胺酸酶。 • 如申凊專利範圍第3 7項之方法，其中所形成的 MVA 重組型病毒是 MVA-LAInef 或 MVA-hTYR 或 MVA-T7 pol。 44 46 唬專利再審查案申請專利範圍修正本 46 唬專利再審查案申請專利範圍修正本修正日期：94年8月其中該外來基 •如申請專利範圍第37項之方法因編碼T7 RNA聚合酶。 •如申請專利範圍第37項之方法，其中該外來基糸處在牛疫病毒的早期/晚期啟動子ρ7·5的轉錄控制下〇 4?' ”請專利範圍第37項之方法，其中所形成的 MVA病重組型毒不含有於人類細胞内可複製的病毒。 48· —種用以製備-疫苗的方法，其包括將藉由申請專利範圍第37至47項中任一項之方法來製備而形成的 MVA重組型病毒與—藥學上可接受的載劑相混合。 49·、 —種MVA重組型，病毒，其包含並可表現被插入於MVA基因組内天然發生的刪除位置〗、位置η、位置 iv、位置V與位置VI之位置處的至少一外來基因。 5〇人如申請專利範圍第49項之MVA重組型病毒，其 3有並可表現被插入MVA基因組之刪除位置Η處的至少一個外來基因。 . 如申請專利範圍第49項之MVA重組型病毒，其中。亥外來基因編碼—標記…治療劑、—抗原或一抗原決定位。 • 如申請專利範圍第5 1項之M VA重組型病毒，其中違外來基因編碼一源自下列之抗原或抗原決定位··病源性病毒、細菌或其他微生物，寄生蟲或腫瘤細胞。 •如申請專利範圍第52項之MVA重組型病毒，其中4外來基因編碼—源自下列之抗原或抗原決定位：惡 45 124灘 81號專利再審查案申請專利範圍修正本修正曰期：94年8月性癔原蟲、分枝桿菌、疮療病毒、流感病毒、肝炎病毒或人類免疫不全病毒。 54. 如申請專利範圍第51項之MVA重組型病毒，其中該抗原或抗原決定位是HI V nef或人類酪胺酸酶。 55. 如申請專利範圍第54項之MVA重組型病毒，其係 MVA-LAInef 或 MVA_hTYR。 56. 如申請專利範圍第49項之MVA重組型病毒，其中該外來基因編碼T7 RNA聚合酶。 57. 如申請專利範圍第55項之MVA重組型病毒，其係 MVA-T7 po卜 58. —種MVA重組型病毒，其包含並可表現編碼人類酪胺酸酶抗原或抗原決定位的基因，該基因被插入至 MVA基因組。 59. 一種MVA重組型病毒，其包含並可表現編碼 HI V nef抗原或抗原決定位的基因，該基因被插入至M VA 基因組。 60. 如申請專利範圍第49至59項中任一項之MVA重組型病毒，其中該外來基因係處在牛痘病毒的早期/晚期啟動子Ρ7.5的轉錄控制下。 61. 如申請專利範圍第49至59項中任一項之MVA重組型病毒，其實質上不含有於人類細胞内可複製的病毒 62. 一種如申請專利範圍第56或57項之MVA重組型病毒之用途，供用於在Τ7 RNA聚合酶啟動子之轉錄控 46 修正日期：94年8月號專利再審查案申請專利範圍修正本制下作DNA序列轉錄。 63· 一種真核細胞，其係被如申請專利範圍第49至 61項中任一項之M VA重組型病毒感染。 64· 如申請專利範圍第63項之細胞，其額外地含有一或多個表現載體，該表現載體攜帶有處於T7 rna聚合酶啟動子之轉錄控制下的一或一種以上的外來基因。〇 65· 一種如申請專利範圍第63或64項之細胞之用途其係用於生產由該外來基因所編碼之多胜肽，其包含 a) 在適當條件下培養該等細胞；以及八 b) 分離出為該外來基因所編碼之多胜肽。 66. 如申請專利範圍第63或64項之細胞，其額外地含有一個帶有病毒基因的表現載體’及/或一編碼一在η RNA聚合酶啟動子的轉錄控制下之病毒載病毒建構物。種女申明專利範圍第66項之細胞之用途，其係用於生產病毒粒子，其包含 ^ 4在適當條件下培養該等細胞H b)分離出病毒粒子。 68· 如申請專利範圍筮ο + / 含有· 固弗63或64項之細胞，其額外地 a) —表現載體，其帶右一 * # ^、有—反轉病毒載體建構物，該反轉病毋载月豆建構物可咸染-rf -JbV ΙΛ；心”亚於;f示的細胞内指引一或反轉病毒載體建構物所摧· X夕個為.亥稱物所攜帶的外來基因之表現，以及 b) —或多個帶有編碼多胜肽基口的表現載體，該等多胜 47 12侧 ,81號專利再審查案申請專利範圍修正本 ^ 修正日期：94年8月肽係為錢轉病毒載體建構物的基合酶啟動子的韓样TTRNAf^ 卞的轉錄控制下被包裝時所需要者。種如申請專利範圍第68項之細胞之用於生產反轉錄病毒粒子，其包I ^、係 a) 在適當條件下培養該等細胞；以及 b) 分離出病毒粒子。種疫田，其包含有如申請專利範圍第49至61 ^中任項之MVA重組型病毒於一生理地可接受的载體 • 一種如申請專利範圍第49至61項中任一項之 MVA重組型病毒的用途，其係用以製備疫苗。 . 如申請專利範圍第49至59項中任一項之MVA重、、且型病毋，其供用以使一有生命的動物體產生免疫，該動物月且包a人類，其包含以該MVA重、组型病毒接種該有生命的動物體，該動物體包含人類。 • 如申請專利範圍第70項中之疫苗，用於免疫_活動物體（包括人類），其包含以該疫苗接種該活動物體（包括人類）。 • 如申請專利範圍第70或73項之疫苗，其包括含有HIV nef基因的MVA重組型病毒，用以預防或治療 HIV感染或AIDS。 • 如申請專利範圍第70或73項之疫苗，其包括含有人類酪胺酸酶基因的MVA重組型病毒，用以預防或治療黑色瘤。 48 第0如6681號專利再審查案申請專利範圍修正本修正日期：94年8月 ?6* 一種疫苗，其含有作為一第一組份之於一生理上可接受的載體内的如申請專利範圍第56或57項之重組型病毒’以及於一生理上可接受的载體内的作為一第二組份之一 DNA序列，該腿序列攜帶有處於T7 RNA聚合酶啟動子之轉錄控制下的抗原或抗原決定位，該二組份被包含在一起或是分開的。 11 · 如巾請專利範圍第^項中之疫苗，用於免疫一活動物體（包括人類），其包含、 S U柃地或有一時間間隔下以該疫一及第二組份利用相同的接種位址而接種至該活動物體（包括人類）。 78· 一種如申請專利範圍笫55十α 生Α 图弟55或％項之MVA重組型病毋的用途，其係用於製備 ^ ^ 戈申5月專利範圍第75或76項之疫苗。 79· 如申請專利範圍第75或76招 — _ ^ ^ 一員之疫苗，其係用以預防或治療HIV感染或AIDS。 80· 如申請專利範圍第75 口戈76诏今广+ π ΐΗτ十、λ汰前 A 76項之疫苗，其係用以預防或治療黑色瘤。 49