HU229261B1 - Recombinant mva-virus comprising a gene encoding a hiv net antigen ar an antigen determinant and use thereof - Google Patents

Recombinant mva-virus comprising a gene encoding a hiv net antigen ar an antigen determinant and use thereof Download PDF

Info

Publication number
HU229261B1
HU229261B1 HU0402350A HUP0402350A HU229261B1 HU 229261 B1 HU229261 B1 HU 229261B1 HU 0402350 A HU0402350 A HU 0402350A HU P0402350 A HUP0402350 A HU P0402350A HU 229261 B1 HU229261 B1 HU 229261B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
recombinant
mva
virus
gene
hiv
Prior art date
Application number
HU0402350A
Other languages
English (en)
Inventor
Volker Erfle
Marion Ohlmann
Gerd Sutter
Original Assignee
Gsf Forschungszentrum Umwelt
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8097499&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU229261(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Gsf Forschungszentrum Umwelt filed Critical Gsf Forschungszentrum Umwelt
Publication of HU0402350D0 publication Critical patent/HU0402350D0/hu
Publication of HU229261B1 publication Critical patent/HU229261B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

A találmány tárgyát olyan rekombináns vnccmfe vírusok képezik, melyek a módosított
Ankara wdHÍa (MVA) vírusból származnak, az MVA-genomba mszeriált HÍV nef antigént vagy antigén-determinánst kódoló gént hordoznak, és azt expresszálni képesek.
A találmány tárgyát képezi továbbá a rekombináns MVA-vímsok alkalmazása polipeptídek - például antigének vagy terápiás hatóanyagok - vagy génterápiában alkalmazható vírusé10 redetű vektorok előállítására, valamint az antigéneket kódoló rekombináns MVA-virusok alkalmazása oltóanyagként,
A találmány szerinti rekombináns MVA-virusok hatékony és különlegesen biztonságos expressziós vektorként alkalmazhatok.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy egyszerű, hatékony és biztonságos eljárás poiipeptidek, mint például antigének vagy terápiás hatóanyagok, oltóanyagként alkalmazható rekombínáns vírusok és génterápiában alkalmazható víruseredetö. vektorok előállítására.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy T7 RNS-poli;merázt expresszálő rekombináns MVA-vi'ruson alapuló expressziős rendszer Is, valamint egy eljárás poiipeptidek, például antigének vagy terápiás hatóanyagok előállítására, vagy az ezen az expressziós rendszeren alapuló 20 víruseredetű vektorok előállítása génterápiára vagy oltóanyagként történő alkalmazásra.
Vaccmta vírust, a Poxviridae család Orth&p&xvirus nemzetségének egyik tagját, alkalmazták élő oltóanyagként emberi: himlő elleni hnmunizációban. A vaecinía vírussal történő világszerte sikeres Immunizálás a variul a vírus, a himlő kórokozója kiirtásában tetőzött [The global eradicatlott of smallpox. Pina! report of the gíohal eomission tor the certincation of 25 smallpox eradieation. Hístory of Public Health, No, 4, Genfi World Health Organizaiion, (1980)1. Az Egészségügyi Világszervezet e kijelentése óta az immunizációt világszerte megszüntették, kivéve a nagy kockázatú himlő vírus fertőzésének kitett emberek esetében (mint például laboratóriumi dolgozók).
Újabban vacctnia vírusok is alkalmazásra kerültek rekombináns génexpresszíóra szol30 gáló víruseredetű vektorok kialakításához, és azok potenciális alkalmazására, mint élő rekombináns oltóanyagok (Macketí és mtsai.; Proc. Natí. Acad. Sci. USA 79 7415 (1982); Smith és mtsai,; Bioteehnology and Génébe Engíneeríng Reviews 2 383 (1984)1 Ez együtt jár
X azzal, hogy Idegen antigéneket kódoló DNS-szekvenciákat (géneket) juttatunk be DNS rekombinációs technikák segítségével a vaeaeiti vírusok genomjába. Abban az esetben, ha a gén olyan helyen integrálódik a víruseredeiú DNS-be, amely nem létfontosságú a vírus életciklusához, az újonnan előállított rekombináns vaccínía vírus lehet fertőző, azaz képes idegen sejteket megfertőzni és így az integrált DNS-szekvenciál expresszáini [83,2.86 és 110,385 szárún EP Szabadalmi Bejelentések]. Áz így előállított rekombináns vneeőun vírusok egyrészről alkalmazhatóak, mint élő oltóanyagok fertőző betegségek megelőzésére és másrészről alkalmazhatóak heterolőg fehérjék előállítására eukarióta sejtekben.
.A T7~bakteriotág RNS-polimeráz gént expresszáló rekombináns «rónia vírus lehetővé lö tette széles körben alkalmazható expresszíos rendszerek létrehozatalát rekombináns fehérjék szintézisére emlős sejtekben [Moss és mtsai,; Natúré 348 91 (1990)]. Minden ilyen eljárásban rekombináns génexpresszíó az eukarióta sejtek ertoplazmájában történő T7 RNS-polimeráz szintézisére támaszkodik. Á legnépszerűbb egy tranziens-expresszió eljárás lett [Peerst és mtsai,; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 8122 (1986); és a 7.648.971 számú amerikai szabadak mi bejelentés]. Ennek során először a számunkra érdekes idegen gént inszertáijuk egy plazmádba, a T? RNS-polixneráz promőter szabályozása alatt, A következőkben ezt a piazmidoí standard transzfekciós eljárásokat alkalmazva T7 RNS-polhnerází termelő rekombináns vacci/tie vírussal fertőzött sejtek ehoplazmájába juttatjuk be.
Ez a transzfekciós eljárás egyszerű, mert egyetlen új rekombináns vírust sem kell elöál20 Irtani és nagyon hatékony, mivei a sejtek több, mint nyolcvan százaléka expresszálja a számunkra fontos géni [Elroy-Stein és Moss; Proc. Natl. Acad, Seb USA 87 6743 (1990)1- A vacctnia virus/r? RNS-polimeráz hibrid rendszer előnyének legvalószínűbb oka más tranziens expresszlós rendszerek felett a függetlensége a plazmidok sejtmagba történő transzportjától. Korábbiakban a rendszert nagyon jő eredménnyel alkalmazták analitikai célokra a víro25 lógiában és a sejtbiológiában [Buonocore és Rose: Natúré 345 625 (1990); Paitnaik és Wertz; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 1379 (1991); Karsehin és mtsai.; FESS Lett. 278 229 (1991); Ho és mtsaí.: FE8S Lett. 301 303 (1992); Buchholz és mtsai.; Virology 204 77Θ (1994)], Azonban, a vrów viros/T? RNS-polimeráz hibrid rendszer jövőbeli fontos alkalmazásait, mint például alkalmazását rekombináns gének vagy rekombináns vímseredető részecskék termelésére emberekben alkalmazható új terápiás és megelőző eljárásokhoz, akadályozhatja a rekombináns vaecmia vektor produktív rephkáeiója.
A voccűbo vírus emberek számára fertőző, és a fekete himlő kiirtást kampány során alkalmazott oltásokkal kapcsolatban esetenként súlyos szövődményeket Egyeltek meg. A sző,* «* A
- 3 vődmények előfordulásának legjobb összefoglalását adja 12 millió ember a New York City Board of Health vütcemia vírus törzsével történő Immumzációjának Egyesült Államokbeli nemzeti felmérése adja [Lánc és mtsai.: New Engl J. Med. 281. 1201 (I9ő9)j. Esnék következtében a vöoobjfo vírus legfontosabb alkalmazási lehetőségeit vektorként való alkalmazása5 ra rekombináns élő oltóanyag kifejlesztésében biztonságát illető aggodalmak és szabályozások befolyásolják. Továbbá, a legtöbb irodalomban leül rekombináns vaccima vírus a Western Reserve vaccima vírus törzsön alapul, Másrészről ismert, hogy ennek a törzsnek magas a neum-virulencíája és -ennek következtében csak kismértékben felel meg emberekben és állatokban történő alkalmazásra [Mórba és mtsai.: Vaccine 5 65 (198?)].
lö Vektorként történő alkalmazásánál az egészségi kockázatokat csökkenteni lehetne nagymértékben legyengíteti virulenciájú vaccmia vírus törzs alkalmazásával Számos ilyen vöaw vírus törzset kifejezetten a himlő védőoltás során fellépő nem kívánt mellékhatások elkerülésére fejlesztettek ki. így például a módosított Ankara wc?»m vírust (MVA) a vacctntd vírus Ankara törzsének (CVA) csirke embrió fibroblasztnn történő bosszú távú sorolt 5 zatos ámításával állították elő [az összefoglalót iásd: Mayr és mtsai.: Infeeílon. 3 6 (1975) és az 568,392 számú svájci szabadalom]. Az MVA-virus 1987. december 15-én a. Budapesti Egyezménynek megfelelően letétbe került az alábbi intézménynél: Institut Pasteur, Colleetlon Nationale de Cnltnres de Miéroorgaöism-s (CNCM, 25, me dn Doctenr Roux. 75724 Parts Cedex 15) ahol az 1-721 leltári számot kapta. Áz MYA-vírusta kiemelkedően jellemző vlm~ lenciájának nagy mértékű gyengítése, azaz csökkentett vlrulenoiája vagy másképpen fertőzőképessége mellett fenntartott jó immunogenitása, Az MVA-vírust analizáltuk, hogy meghatározzuk a genomjába® létrejött változásokat a vad-típusú CVA törzzsel összehasonlítva. .A genom! eredem DNS-ben hat jelentősebb deléclőt azonosítottunk, (k, IL, lil. IV., V. és Ví. delécíók), amelyek összesen 31.9ÖÖ házispár nagyságot jelentenek [Msyer és mtsai: J, Gén.
Viwl 72 1031 (1991).1- Az ennek eredményeként kapott MVA-virus gazdasejtjeit tekintve szigorúan madár eredetű sejtekre korlátozódik.
Az MVA-ra továbbá jellemző vírulenciájának különlegesen nagy esökkentettsége, Több állat modellben történő tesztelés során az MVA fertőzésre képtelennek bizonyult, még immunszupresszáli állatokban is. Fontosabb azonban, hogy az MVA-torzs kiváló tulajdonsává gait széles körű klinikai vizsgálatokban is kimutatták [Mayr és- mtsai,: Zbl. Baki. Hyg. 1, Abt. Org,. B 167 375 (1987); Stickl és mtsai: Dtsch, med. Wscbr., 99 2386 (1974)].. Az ezen tanulmányok során i 2Ö.0t)ö emberben, közöttük még fokozottan veszélyeztetett betegekben is történő vizsgálatokban., egyetlen mellékhatás sem társult az .MV.A-oltóanyag alkalmazásához.
. 4 .
Megállapították, hogy az MVA replikaciója a humán -sejtekben a fertőzés -során később gátlődik, így megakadályozva a kifejlett fertőző vtrionok kialakulását. Ennek ellenére, az MVA képe-s- volt vírusereáetü és .rekomhínáns géneket magas szinten expresszálni még nonpermisszív sejtekben is, és javaslat született az MVA hatékony és különösen biztonságos génexpressziós vektorként való alkalmazására f Suttőr és Moss: Proc. Nati, Acad, Sri, USA S9 10847 (1992)]. Újabban az MVA-ra alapozva eredeti vaceinia vektor rendszereket hoztak létre. amelyekben, az MVA-genomján beiül, vagy a TK génen beiül elhelyezkedő Hl delécíós helynél idegen DNS-szekvenciák leitek inszertálva [Sütter és Moss: Dev.. Biok Stand. Basel, Karger 84 195 (1995) és az 5.185.14ő számú US szabadalom}.
Az MVA alkalmazhatóságának további kihasználására új eljárást kerestek idegen gének DNS rekombinációval történő bejuttatásának módjára a vnecmfe vírus MVA-lörzséhe, Mivel nem szándékoztak az MVA-virus genomját megváltoztatni, olyan eljárás alkalmazására volt szükség, amely ezt a feltételt kielégíti. A találmány szerint idegen DNS-sze;kvenciát rekombmáltunk a vlruscredetü DNS-be, pontosan az MVA-genom jában egy természetes körülmények között előforduló deiéció -helyénél.
Tehát a találmány tárgyát képezik többek között, az alábbiak, önmagukban vagy egymással kombinációban:
Rekomhínáns MVA-virus, amely legalább egy, az MVA-genomon belül sgy természetes körülmények között előforduló deiéció helyére inszertáll idegen gént tartalmaz és azt expresszálui képes;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-virus, amely legalább egy, az. MVA-genomon belül a természetes körülmények között előferduló H. deiéció helyére msze-rtált idegen gént tartalmaz és azt expresszábti képes;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-víras, amelyben -az idegen gén egy markért, egy terápiás gént vagy egy antigén determinánst kódok a fentiek szerinti rekombináns MVA-virus, amelyben az idegen gén patogén vírusból, baktériumból, vagy más mikroorganizmusból, vagy parazitából, vagy daganat sejtből származó antigén determinánst kódol;
a fentiek, szerinti rekombináns MVA-virus, amelyben az idegen gén Pázmíodfen?
/kfeipm'íunfeól, AAunmcmmmból, ífows vírusból, influenza vírusból, hepatitisz: vagy humán immundeficíencia vírusokból származó antigén determinánst kódok a fentiek szerinti rekombináns MVA-virus, amelyben az antigén. determináns HÍV nef;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-virus, amely MVA-LAInef;
» ** ,ΦΦφ Χ*«* *Φ ♦ * φ y ΦΦν φφφ
X Φ ·« » « φ* »«Φ »*
Α,
- 5 a fentiek szerimi rekombináns MVA-vírus, amelyben, az idegen gén T7 RNS-polimerázt kódok a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírus, amely MVA-T7 pol; a fentiek szerinti rekombináns- MVA-vírus, amelyben, az idegen gén a ww»ő vírus ke.5 rai/késöí P7,5 promóterének transzkripciós -szabályozása alatt áll;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírusok, amelyek lényegében nem tartalmaznak humán sejtekben repiikálódni képes vírusokat;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírus alkalmazása a T7 RNS-polimeráz promóterének transzkripciós szabályozása alatt álló DNS-szekvenclák transzkripciójára;
1Ö eukaríóta sejt, amely a fentebb felsorol bármelyik rekombináns MVA-virussal fertőzött;
sejt, amely a fentiek szerinti rekombináns MVÁ-vírnssal fertőzött, amelyben az idegen gén T? RNS-poliraerázt. kódol;
sejt, amely a fentiek szerinti rekombináns MVA-virussal fertőzött, amelyben az idegen gén T? RNS-poliraerázt kódol és ezenkívül tartalmaz, még- egy vagy több expresszíós vektort, amelyek a T? RNS-polimeráz promóterének transzkripciós szabályozása alatt álló egy vagy több idegen gént hordoznak;
a fentiek szerinti sejtek .alkalmazása a2 idegen gének által kódolt polipeptídek előállítására a következők -szerint;' (í) a sejteket megfelelő körülmények között tenyésztjük, és 20 (ii) az idegen gének, által kódolt polipepíideket izoláljuk;
a fentiek szerinti rekombináns MVA-vírussaí fertőzött sejt, amelyben az idegen gén Τ7 RNS-polímerázt kódol, ezenkívül tartalmaz még víruseredetü géneket hordozó expresszíós vektorokat, és/vagy egy vírus vektor konstrukciót, amely T7 RNS~polimeráz promóterének transzkripciós szabályozása alatt vírus- vektor genornját kódolja;
2.5 a fentiek szerinti sejtek alkalmazása víruseredetü részecskék előállítására, a következők szerint:
(i) a sejteket megfelelő körülmények kozott tenyésztjük, és (ii) a víruseredetü részecskéket izoláljuk;
a fentiek szerinti rekombináns MVA.-virussal fertőzöd sejt, amelyben az idegen gén 17
3-0 RNS-poIíraerází kódol, ezenkívül tartalmaz még:
(a) expresszíós vektort, amely retrovíras vektor konstrukciót hordoz, amely konstrukció képes célsejteket megfertőzni és képes a retrnvírus vektor konstrukció által hordozott egy vagy több idegen gén expresszióját a célsejtekben irányítani, és
ΦΦΧ
-ί.
- 6 (b) egy vagy több expresszíós vektort, amely hordozza a retrovírus· vektor konstrukció genom számára szükséges polipeptideket kódoló géneket a T7 RNS-polímeráz promóter transzkripciós szabályozása alatt történő vektor konstrukció pakoláshoz;
a fentiek szerinti .sejtek alkalmazása .retrovírus részecskék előállítására, a következők szerint:
(i) a sejteket megfelelő körülmények között tenyésztjük, és (ii) a retrovírus részecskéket Izoláljuk;
oltóanyag, amely a fentiek szerinti rekombínáns MVA-vímt tartalmazza, amelyben az idegen gén egy fiziológiailag elfogadható hordozón belül elhelyezkedő· antigén determinánst kódol;
a fentiek szerinti rekombínáns MVA-vírus alkalmazása, amelyben az idegen gén egy oltóanyag antigén determináns preparátumát kódolja;
a fentiek szerinti oltóanyag alkalmazása élő állati test. immunizálására, beleértve· .az emberi testet is;
a fentiek szerinti oltóanyag alkalmazása HÍV fertőzés vagy AIDS megelőzésére vagy kezelésére, amely oltóanyag MVA-tAInef részletet tartalmaz;
oltóanyag, amely első komponensként a fentiek szerinti rekombínáns MVÁ-virust tartalmaz, amelyben az idegen gén fiziológiailag elfogadható hordozón belül elhelyezkedő T7 RNS-pollmerázt kódol, és második komponensként antigén determinánst hordozó DNSszekveneiát tartalmaz, amely fiziológiailag elfogadható hordozón belül elhelyezkedő DNSszekvencía a T7 RNS-polimeráz promóter transzkripciós szabályozása alatt áll, és az oltóanyag a két komponenst együtt vagy külön-külön Is tartalmazhatja;
a fentiek szerinti oltóanyag alkalmazása élő állati test, beleértve az emberi test mnnnnizáeiöjára, amely magába, foglalja az élő állati test, beleértve az emberi test beoltását az oltóanyag első és második komponensével akár egyidejűleg, akár időben eltolva ugyanazon oltási hely igénybevételével; és a fentiek, szerinti rekombínáns MVA-víms alkalmazása találmány szerinti oltóanyagok előállítására.
A „gén” kifejezés alatt bármely olyan DM S-szekvenciát értünk,, amely szekvencia fehérjét vagy pepiidet kódol.
Az „idegen gén” kifejezés alatt olyan DMS-szekvenciába ínszertált gént értünk, amely
DMS-szekvenciában a gén természetes· körülmények között nem található meg.
* Φχ
- 7 ..
Az idegen gén lehet például marker gén, terápiás gén, antigén determinánst kódoló gén vagy víruseredem gén. A technika állása szerint az ilyen gének jól ismertek.
A módosított Ankara (MVA) veectnia vírus, atnelvnek gazdaszervezet tartománya korlátozott és viruleneiája erősen gyengített nem képes humán és a legtöbb más vizsgált emlős sejtvonalban szaporodni. Azonban mivel a non-pennissxív sejtekben a vírusgén expresszié nincs gátlás alatt, a találmány szerinti rekombináns MVA-virusok különösen biztonságos és hatékony expressziős vektorként alkalmazhatóak.
Antigén determinánst kódoló rekombináns MVA-vírusok.
A találmány tárgyát képezik rekombináns MVA vaccinia vírusok, amelyek idegen arái10 gént, előnyösen patogén anyag eredetű antigént, kódoló gént tartalmaznak, és a találmány tárgyút képezik ilyen vírust fiziológiailag elfogadható formában tartalmazó oltóanyagok is, A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások is ilyen rekombináns MVA vacciftfá vírusok, vagy oltóanyagok előállítására, és ezen oltóanyagok. alkalmazása a patogén anyagok által okozott fertőzések megelőzésére.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint úgy járunk el, hogy az MVAvirusha HÍV nef fehérjét kódoló gént. inszertálunk.
Olyan rekombináns MVA-vírusokat szerkesztettünk, amelyek lehetővé teszik a vace/nfa vírus korai/késői F7.5 promőter szabályozása alatt a HíV-1 nef gén expresszióját A főemlős lentivírusök szabályozó Nef fehérjéje a vírus replíkációs ciklus korai szakaszában szintetízá20 lódik és kimutatták, hogy nélkülözhetetlen a magasabb titerö vírus replikádéhoz és az: m vsv& betegség Indukcióhoz. Ebből arra lehet következtetni, hogy a HÍV Nef feltételezhetően, döntő szerepet játszik az AIDS pategenezlséhen. A molekuláris mechanizmusokat, amelyeken keresztül a HÍV Nef hozzájárul a vírus megnövekedett fertőzőképességéhez és a HÍV paíogeneziséhez, célszerű lenne további vizsgálatoknak alávetni. Azonban, a Nef Immunogén, és Nef25 specifikus antigén alkalmazható oltóanyagként HÍV fertőzés és AIDS ellen..
Ebben az összefüggésben a HÍV nef gént expresszáló rekombináns MVA-vírus alkalmazható emberek immnnizációjára egyrészről megelőző oltóanyagként emberi HÍV ellen, és másrészről Immunterápiám. HlV-fertőzőtt vagy AIDS-es betegek esetében.. Továbbá a .HÍV nef gént expresszáló rekombináns MVA-virus: alkalmazható rekombináns HÍV Nef fehérje előál30 lírására..
Olyan rekombináns MVA-vírusokat szerkesztettünk, amelyek lehetővé teszik a vuvdn/u vírus korai/késői P7,5 promőter szabályozása alatt a humán tirozíuáz gén expresszióját. Újab«**♦ φ4*” φ ·*♦*
- 8 bán a humán fitozínází melanóma-speciííkus tumor antigénként azonosították, amely antigén lehetővé teszí daganatellenes citolltikus T-límióeiták termelését [Brichard és mtsai.: I Exp. Med 178 489 (1993)}. Mivel ügy tűnik, hogy normális sejtekben csak a melanodíák expresszálják a üroztnáz gént, a tírozínáz hasznos cél-antigén lehet melanómák imnsunterápi5 ájában. Ennek következtében a rekombináns MVA-vírus, amely expresszálja a humán tírozínáz géni, alkalmazható melanóma betegekben olyan immunválaszok kiváltására, amelyek daganat kilökődést hoznak létre, vagy megakadályozzák a metasztázíst. Rekombináns MVA-vírusok, amelyek expresszálják a humán tírozínáz gént, közvetlenül alkalmazhatóak, mint melanóma-ellenes oltóanyag, vagy a vírus alkalmazható melanőma-ellenes oltóanyagok előállításában. Egy példa szerint a humán tírozínáz -gént expresszaló rekombináns MVA-vírus alkalmazható rekombináns tírozínáz fehérje előállítására, amely fehérjét antigénként alkalmazhatjuk oltóanyag előállításához. Egy másik példa szerint a humán tírozínáz gént expresszálö rekomblnáns M'VA-vírust expressziós vektorként alkalmazva, daganatos betegből származó sejteket tó vttóo módosíthatjuk ügy, hogy azok expresszáfják a tirozinázt, majd eze15 két vissza lehet juttatni a betegbe daganatellenes immnnreakcíó -kiváltására. A humán tírozínáz gént expresszaló rekombináns MVA-vírus alapján előállított oltóanyag alkalmazható parenterálisan vagy lokálisan a daganat helyén a daganat metasztázis megelőzésére vagy a daganat fenotípusának megváltoztatására, mint például méret, alak, konzisztencia, vaszkularízáció vagy más jellegzetességének megváltoztatására. A humán tírozínáz gént expresszálö rekombináns MVA-vírus alapján előállított oltóanyag alkalmazható a daganat műtéti eltávolítását megelőzően, az alatt vagy azt követően.
Oltóanyagok előállításához a találmány szerinti MVA vaeeima vírusokat fiziológiailag elfogadható .tonnába alakítjuk át. Ezt a fekete himlő elleni immunizációra alkalmazott MYAoltóanyagok előállításában szerzett tapasztalat alapján végezhetők el (lásd: Síiekl és mtsai.:
Dtseh. med. Wschr. 99 2386 (1974)], Általában körülbelül 19f,~I0s rekombináns MVArészecskét 199 ml foszlát-pufferolt fiziológiai sóoldatban (PBS) 2 % pepton és 1 % humán aibumin jelenlétében ampullában, előnyösen üvegampuliában, íiorilizálunk. A liofilizáium tartalmazhat töltőanyagokat is (mint például manníloit, dextránt, cukrot, glicínt, laktozt vagy polivíníl-pítrolídom) vagy más segédanyagokat (mint például antíoxidánsokat, stafeilizálőkat, stb.), amelyek elfogadhatóak a parenterális bejuttatásban. Az üvegampullát ezt kővetően lezárjuk és több hónapig tarolható, előnyösen -20 °C alatti hőmérsékleten.
hnmmúzáeiőhoz vagy terápiához a itofilizátumoí 0,1-9,5 ml vizes oldatban, előnyösen fiziológiás sóoldaíban, feloldjuk, és vagy parenterálisan, például Íntramuszkuláris injekcióban *··*
4.
íi . 9 vagy lokálisan, például -a. daganatba vagy a daganat helyénél történő injekcióval beadjak. A. találmány szerinti oltóanyagokat vagy terápiás anyagokat előnyösen intramnszkelárisan injektáljuk [Mayr és mtsai: Zbk Bakt. Hyg,, I Abt. Őrig. B. .1.67 375 (1978)]. A beadás módját, a dózist és az oltások számát a szakember az ismeri eljárások segítségével optimalizálhatja. Amennyiben lehetséges, elvárható, hogy az oltóanyag mennyiséget egy hosszabb időtartam során többször adjuk be, hogy a megfelelő immunreakcíőt váltsuk ki az idegen antigénekkel szemben.
Rekombináns MVA-vírusok alkalmazása heterológ polípeptidek előállítására.
A találmány szerinti rekombináns MVA vnccima vírusok alkalmazhatóak heterológ polípeptidek előállítására is eukarióta sejtekben. Ez magába foglalja a sejtek megfertőzését a rekombináns vaccwia vírusokkal. Áz idegen polípeptidet kódoló gén a sejtekben expresszálődík, és az expresszált heterológ polípeptidet izoláljuk. Ilyen heterológ polípeptidek termelésére alkalmazható eljárások a szakember számára általánosságban ismertek |'EF-A206,920 és EP-A-2Ö5,939J. A rekombináns MVA-vírusok segítségével előállított polipeptidek, az MVA-vírusok különleges tulajdonságai következtében alkalmasabbak gyógyszerként való alkalmazásra állatokban és emberekben.
RNS-polimerázt kódoló rekombináns MVA-vírusok és alkalmazásuk 17 RNSpolimeráz promóter transzkripciós szabályozása alatt álló DNS-szekvenelák expressziójára,
A találmány egy további megvalósítási módja szerint olyan rekombináns MVAvírusokat szerkesztettünk, amelyek lehetővé teszik a 17 bakteriofág RNS-polimeráz gén expresszióját a vöecfofo vírus korai/későí P7.5 promőterének szabály ozása alatt. Az MVAT7poi rekombináns vírusok expressziös rendszerként történő alkalmazhatóságát megvizsgáltuk tranziens íranszfefceiós vizsgálati eljárásokban rekombináns gének expressziójának indukálására a T7 RNS-polimeráz promóter szabályozása alatt. Az £. coli fclóramfenikolacetiltranszferáz (CAT) gént reposríer génként alkalmazva megfigyeltük, hogy az MVA--T7pol ugyanakkora hatékonysággal indukálta a CA Γ-gén expressziót, mint egy repükáció kompetens WR wccirna vírus törzsből származó vn<xvmV/T7poi rekombináns vírus,
A találmány szerinti MVA/T7-polimetáz hibrid rendszer tgy tehát alkalmazható egyszerű, hatékony és biztonságos emlős expressziös rendszerként polípeptidek termelésére produktív Vööcfok? vírus replikáeíó nélkül.
Ez az expressziös rendszer úgyszintén alkalmazható rekombináns vírus részecskék előállítására is immnmzáció vagy génterápia, céljából, T7 RNS-poihnerází expresszáló rekombináns MVA-vírussaf történő fertőzéssel transzformált sejivosálak útján, olyan DNS-konsí- Π) rukcíók segítségével, amelyek a gének egynéhányat vagy az összest, valamint a vírusrésseeskék létrehozásához szükséges genormt, vagy rekombináns gexiomot tartalmazzák, mint például MVA-részecskék vagy retrovíms-részeeskék, és egy T7 RNS-po-limeráz promőter transzkripciós szabályozása alatt állnak.
A retrovírus vektor rendszerek, két komponensből tevődnek össze:
1) A retrovírus vektor önmaga egy módosított retrovírus (vektor plazmld), amelyben a vírus fehérjéket kódoló .géneket a célsejtbe transzferálandó terápiás génekre és. marker génekre cseréltük ki. Annak kövefeeAében, hogy a vírus Fehérjéket kódoló gének kicserélése hatékonyan bénítja a vírust, azt a rendszerben található második komponenssel meg kell menteni, amely komponens biztosítja a hiányzó vírus fehérjéket a módosított retrovírus számára.
A második komponens;
2) Egy, a vírus fehérjéket nagy mennyiségben termelő- sejtvonal, amelyből azonban hiányzik n képesség replikádé kompetens vírusok létrehozására. Ez. a sejtvonal a pakoló sejtvonalként ismeretes és egy olyan sejtvonaiat képez, amely egy vagy több, a módosított retrovírus vektor pakolását lehetővé tevő gént (a gag, pol. és env polipeptideket kódoló gének) hordozó plazmidokkal lett transzfekíáiva,
A pakolt vektor létrehozásához a vektor plazmidot a pakoló sejivonalba transzfektáljuk. Ilyen körülmények között a módosított retrovírus genom, amely az inszertált terápiás és marker géneket tartalmazza, transzkripcióra kerül a vektor plazmádból, és a módosított retrovírus részecskékbe pakoiódik (rekombináns vírus részecskék). Ezt követően ezt a. rekombináns vírust alkalmazzuk célsejtek megfertőzésére, amelyekben a vektor genom és bármely hordozott markor vagy terápiás gén a célsejt DNS-ebe integrálódik. Egy sejt, amelyet ilyen rekombínáns vírus részecskével megfertőztünk, képtelen új vektor vírus létrehozására, hiszen ezekben a sejtekben nincsenek jelen vírus fehérjék. Azonban a terápiás és marker géneket hordozó vektor DNS integrálódik a sejt DNS-ébe és így expresszálni lehet a fertőzött sejtben.
A. találmány szerinti T7 RNS-polimerázt expresszáiő rekombináns MVA-vírus alkalmazható a retrovírus vektorok pakolásához szükséges fehérjék előállítására. Ennek érdekében egy retrovírus (például az egér eredetű leukémia vírus (Murine Leukémia Vírus, MLV)) gag, pol és env génjeit a T? RNS-polimeráz promőter transzkripciós szabályozása alá helyezzük, egy vagy több expressziós vektorban (például plazmidokhan). Ezt követően az. expresszios. vektorokat T7 RNS-polimerází expresszáiő rekombináns MYA-vímssal fertőzött sejtekbe juttatjuk, egy retrovírus vektor konstrukciót hordozó expressziős vektorral együtt, elképzelhetően egy T7 RNS-pohmeráz promőter transzkripciós szabályozása alatt.
«»* «
- π A WO 94/29437, a. WO 89/11539 és a WO 96/07748 szabadalmi leírások különböző típusú retroviras konstrukciókat ismertetnek, amelyek a fent leírt pakoló rendszer segítségével pakolhatok,
A T7 RNS-polímerézx expresszáló rekombináns MVA-vfrus -egy további alkalmazása lehet, rekombináns fehérjék, nem-fertőző vírus- részecskék, vagy fertőző mutáns vírus részecskék előállítása oltóanyagok vagy terápiás anyagok termeléséhez (Buehhobs és mtsai,: Vírology 204 770 (1994) és EP-Bl-356695 számú szabadalmi leírás]. Ennek érdekében víruseredetű géneket (mint példád a PfiV-1 gag-pol és env génjei) helyezünk a T7 prornóter transzkripciós szabályozása alá egy expressziós vektorban (mint például plazmid, vagy más rekombináns MVA-vírus).. Ezt követően ezt a konstrukciói a T7 RNS-pohmerázt expresszáló rekombináns MVA-vírossal fertőzött sejtekbe juttatjuk. A rekombináns víruseredetű gének nagy hatásfokkal átíródnak, nagy mennyiségben termelődnek és rekombináns fehérjék tisztíthatóak, Ezenkívül az expressxáit rekombináns vírus fehérjék (mint például HIV-1 env, gag febétjék) vírus pszeudo-részecskékké rendeződhetnek, amelyek a sejtekből sarjadzás révén kiszabadulhatnák és a szővetíenyészet táptalajából tzoláihatóak. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint, az MVA--T7pol rendszer által expresszit vírus fehérjék (mint példád. HÍV, SÍV vagy kanyaró vírusból származó fehérjék) segítségévei megmenthetünk egy, a fentieken túl bejuttatott mutáns vírust (amely származhat például HíV-ből, SiV-böl vagy kanyaró vírusból) oly módon, hogy a kapcsolódásban és fertőzésben, burokvesztésben, nukíeinsav replíkácíóban, vírusgén expresszié bán , összerendezódésben, sarjadzásban vagy más vírus-szaporodási lépésben létrejött hibát ezzel kijavítjuk, és ezzel a mutáns vírus termelését és tisztítását lehetővé tesszük.
Az MVA-T7pol alkalmazbató számunkra fontos antigén génjét (például a HIV, nef, tat, gag, pof vagy env vagy mások génjei) hordozó DNS-szekvencíákkal együtt is- immunizáeiőra. Először egy tetszés szerint kiválasztott antigén (mint például HÍV, HCV, HPV, HSV, kanyaró vírus, influenza vírus vagy más vírus) kódoló szekvenciáját egy T7 RNS-poliroeráz promőter szabályozása alatt klónozzuk, előnyösen plazmid vektorban, és az eredményként létrehozott DNS konstrukciót standard' laboratóriumi eljárások alkalmazásával amplillkáljak és tisztítjuk Ezt követően a vektor DNS-t MVA-T7pol-íal együtt, egyidöben, vagy megfelelő fázis eltolódással oltással beadjuk. Az. -oltás helyen a számunkra fontos rekombináns .gén átmenetileg expresszálódik az olyan sejtekben, amelyek mind a vektor DNS-t és az MVA-T7-et tartalmazzák és a megfelelő antigén kapcsolatba kerül a gazdaszervezet, immunrendszerével, antigén-specifikus immnnreakeiót kiváltva. Ez az eljárás a nem-replikálódó vaccinid MVA--T7pol vektor
- 12 alkalmazásával egy ígéretes új megközelítést képvisel nukleinsav inununízáeióban adott antigén hatékony átmeneti expressziőját lehetővé téve, de kiküszöbölve a konstitutív génexpteszsziő potenciális, kockázatát
A. rekombináns MVA vactida vírusokat a kővetkezőkben megadott eljárás szerint .állít5 hatjuk elő.
Természetes körülmények. között előforduló deléció, például az MVA-genomon belüli II, deléció, mellett elhelyezkedő MVA DNS-szekveuciák által közrefogott, idegen polipeptldet kódoló DNS-szekveneiát tartalmazó DNS konstrukciót juttattunk he MVAfertözött sejtekbe homológ rekombináció létrehozására.
Amint a DNS konstrukciót bejuttattuk az eukarióta sejtbe és az idegen DNS rekombinálódott a viruseredető DNS-sel, izolálni lehet a kívánt rekombináns vaccwfa vírust önmagában ismert módon, előnyösen markét gén segítségével [vesd össze: Nákano és mtsai.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 1593 (1982); Franké és mtsai,: Mól. Célt Biot 1918 (1985); Chakrabarti és mtsai.: Mot Cell. Bioi. 1403 (1985); Fathi és mtsai.; Virology 97 (1986)].
Az inszertálásra kerülő DNS konstókciő lehet lineáris vagy gyűrűbe zárt is. Előnyösen gyűrű alakú DNS-t alkalmazunk, mint például egv plazmidot. A DNS konstrukció tartalmazhat egy természetes körülmények között előforduló delécíőt, például az..MVA-genomon belüli H. deléció hal és jobb oldalát közrefogó szekvenciákat (Áltenburger és .mtsai.: Areh. Vinil. 105 15 (1989)]. Az idegen DNS-szekvenciát a természetes körülmények között előforduló deíéciót közrefogó szekvenciák közé inszettáljuk. Az idegen DNS-szekvencla lehet egy gén, amely terápiás polipeptldet, mint például t-PA-t vagy interferont kódol, vagy lehet egy patogén ágensből szánnazó antigén determinánst kódoló gén. A patogén ágensek lehetnek betegséget okozó vírusok, baktériumok és paraziták, valamint egy élőlényben korlátlanul szaporodó tumorsejtek, amelyek így patológiás növekedésekhez vezethetnek. Ilyen patogén ágen25 sefcre szolgáló példákat írt le Davis [Davis és mtsai.: Microbfology, 3. kiadás, Harper International' Editton], A patogén ágensek előnyösen alkalmazható antigénjei lehetnek a humán immmun-defieiencia vírusok (például HIV-Í és HÍV-2), a tuberkulózist okozó mikobaktérmmok, a parazita, és a meianőma sejtek antigénjei.
DNS-szekveneía vagy gén. exprcsszícjához nélkölözheíetien, hogy a gén transzkripció3Ö iához szükséges szabályozó szekvenciák a DNS-ben legyenek jelen,, ilyen szabályozó szekvenciák (úgynevezett promóterek) a szakember számára ismertek és magúkba foglalnak példád olyanokat, mint a vördmo 11 kDa nagyságú gént az EP-A-198,328 szabadalmi leírás szerint, valamint a 7,5 kDa nagyságú gént is [EP-A-119,385j.
* X φ
** φ
A DNS konstrukció bejuttatható az MVA-fertőzött sejtekbe trauszlékciőval, például kaldom-foszfát predpitáciő segítségével [Graham és mtsai.: Virol. 52 456 (1973); Wigler és mtsai.: Cell 777 (1979)]; elektroporádó segítségével [Neumann -és mtsai.: BMBO 3. i 841 (1982)]; mikroinjekció· segítségével [(haessmann és mtsai.: Methods m Enzymology 1Q1482 (1983)1; liposzómák alkalmazásával [Síranbínger és mtsai,: Methods in Enzymology 101 512 (1983)]; szíéroplasztók segítségével [Schaffner: Proc. Nátl, Aead. Sel. USA 77 21-63 (1980)]; vagy más, a szakember számára ismert eljárásokkal. Előnyösen a transzfekdót kalciumfoszfát predpitáció segítségével hajtjuk végre,.
Felhívjuk a figyelmet arra, hogy az alábbiakban ismertetésre kerülő részletes példák 1.0 csupán a találmány jobb megérthetőségét szolgálják és nem korlátozó értelemben kerülnek bemutatásra. Számos más, a fentiekkel egyenértékű módosítás illetve változtatás hajtható végre, és az. Ilyen módosítások nem térnek el a találmányi gondolattól és a csatolt szabadalmi igénypontok által meghatározott igényelt oltalmi körön belülinek tekintendők.
1. ábra:
Az 1. ábra az MVA genom és a homológ rekombinációval történő idegen DNS loszcrtálásra szolgáló plazmid sematikus térképe: az MVA génomon belüli Z/mdEI restrikciós helyeket az ábra felső részén tüntettük fel. Bemutatjuk a. 900 házaspár nagyságú /-//«410Aduídll N-fragmenst, amely átfedi az. M VA genomon belül a II, deléciő csatlakozási helyét.
Áz MVA DNS-.szekvendákat, amelyek közvetlenül a 11 delédó mellett helyezkednek el (Sankl és fiank2), PCR segítségével amplifikáftuk és a pUCII ÍZ· inszerdós plazmid megszerkesztésében alkalmaztuk.
2. ábra:
pUCíí LZ P7.5: A 2. ábra a II. deléeioba történő inszertáláshoz alkalmazott MVA vektor plazmldot. mutatja he, amely tartalmazza a Pl í~Lac2 expressziós kazettát és a vaec&n'a vírus korai/késöí P7.5 promotert, hogy a számunkra fontos, a plazmid Smí helyébe klónozható gének expresszióját létrehozzok.
3. ábra :
pUClí LZdel P7.5: A 3, ábra egy MVA vektor plazmid, amely idegen géneknek az
MVA genomban található H. deléciő helyére történő beillesztésére szolgál, amely vektor plazmid tartalmaz egy őn-deléciós Pl 1-iacZ expressziős kazettái és a vaceíma vírus korai/késői P7..5 promotert, a számunkra fontos, a plazmid Sóító/Nötf klónozó helyébe klónozható, gének expressziójának megvalósítására.
- 14 4. ábra:
MVA-T7pol. rekombináns vírus- megszerkesztése: A 4. ábra bemutatja az MVA genom (EWin restrikciós endonukleáz helyek) és a pVCH LZ T7pol vektor plazmid vázlatos térképét, amely tehetővé teszi a Ί7 RNS-polimeráz gén inszeríálását az MVA genom /A/rdlll Nfragmensén belüli 11, deléeíö helyére,.
5. ábra:
Az 5, ábra az MVÁ-T7pol vírus DNS Southem-blot analízisét mutatja be.
6. ábra:
A ő. ábra fehérjék metabo likas jelölését mutatja be {'3’Sjmefionin alkalmazásával, SOSPAGB analízis: 1, sáv: MVA T7pol, 2. sáv: MVA, 3, sáv; CV-1 sejtek,
7. ábra:
A 7, ábra egy CAT vizsgálati -eljárást mutat be: A CV-1 sejteket a T7 .RNS-po-lhneráz promóter szabályozása alatt álló CAT .gént tartalmazó plazmiddal íranszfektáltuk és MVAT7pollal vagy WR-17pol-ial fertőztük, A lizátumokat CAT-akrivItásra vizsgáltuk. A C kiéramfemköit jelöl és az ”l-AeC” illetve a 3-AcC'’ a klóramfenikol mono- illetve triacetitezett változatait jelöli. A €,AT~aktívítást a 60 perces időtartam alatt keletkezeit acetilezett termék százalékos értekével jellemeztük.
8. ábra;
A 8. ábra. az MVA-LAlnef megszerkesztését mutatja be: Bemutatjuk az MVA genom (7/tedHI restrikciós endonukleáz hasító helyek) és a pOCH LZdel P7.5- LAlnef vektor plazmid vázlatos térképét, amely plazmid lehetővé teszi a HlY-l LA! nef génjének az MVA genom /Audöí N-fragmensén belől! '11 deléeiös helyen történő inszerfálását
9. ábra:
A 9, ábra -az MVA-hTYR megszerkesztését mutatja be: Bemutatjuk az MVA genom (AmcSII restrikciós endonukleáz hasító helyek) és a pUCH LZdel F7.5-TYR vektor plazmid vázlatos térképét, amely plazmid lehetővé teszi a humán tirozináz gén az MVA genom /Audin N-fragmensén. belüli IL deléciös helyén történő ínszertálását.
/. pé/dd
Vírusok tenyésztése és tisztítása
1,1 Az MVA vírus tenyésztése.
Az MVA-virus egy erősen legyengített vaeeááa vírus, amelyet az- Ankara vac&bria vírus törzsből (CVA) primer erírkeembrtó fibmblaszt (CEF) tenyészeteken történő hosszú távú. so- 15 rozatos passzálással hozunk létre. Az előállítás történetének általános áttekintésére, a tulajdonságok és az MVA. törzs alkalmazására, utalni kívánunk az alábbi összefoglaló munkára (Mayr és mtsai.: Infection 3 6 (1975)0 A CEF tenyészetben történő gyengítésnek köszönhetően. az MYA-vírus magas literrel replikálódik ebben a madár eredetű gazdasejtben. Emlős sej5 tekben azonban, az MVA növekedése erősen korlátozott és a vírusnak betudható tipikus tarfolt képződés nem észlelhető. Ezen okból az MVA-vírust CEE-sejteken tenyésztettük. A CE-Fsejtek előállításához 11 napos embriókat izoláltunk az inknbált csirke tojásokból, a végtag kezdeményeket eltávolítottak és az -embrió-kát összeaprítottuk, majd 9,25 % trípszínt tartalmazó oldatban 37 ®C-on 20 percig disszociá-ituk. A kapott sejtsznszpenziót leszűrtük és a sejteket
Sorvall RC-3B centrifugában, szobahőmérsékleten 2000 ford/perc mellett· történő- 5 perces centrifugálással ülepítettük, ezt köveiden űjraszoszpendálínk lO-szeres térfogatú „A”: táptalajban (MÉM Eagie, beszerezhető példánk Life Technologies GmbH, Eggehsteín, Németország), és Sorvall RC-3B centrifugában, szobahőmérsékleten, 2000 ford/perc mellett történő 5 perces eemtrífugálással újra leülepítettfik. A sejtes üledéket lö % totális borjúsavót (FCS), penicillint.
000 egység/ml), streptomícint (100 mg/ml) és 2 mM glutamint tartalmazó· ,,Á” táptalajban felvettük, úgy, hogy a sejíszuszpenziőí 500,000 sejrfml koncentrációra állítsunk be. Az így kapott CEE-sejteket sejttenyészíő edénybe széfesziettük. A sejteket ,,A* táptalajban, CCb inkubátorban 37 °C~on a kívánt sejtkoncentrácio eléréséig 1-2 napig tenyésztettük, és ezt követően kőzvetteü-1, vagy egy további sejt passzálást követően fertőzésre alkalmaztuk. A primer te20 nyeszetek előállításának részletes leírását megtalálhatjuk az alábbi kiadványban: (Ereshney: “Culture of Animál CelF 11. fejezet, 99. oldal et seq., Alán R. Liss Verlag, New York (1983)1.
MVA-vírusokat a következők szerint alkalmaztunk fertőzésre: CEF-sejteket tenyésztettünk 175 cm2 felületű sejtknltúra palackokban. 90-100 %-os összeérésnél a táptalajt eltávoli25 tettük, és a sejteket „A” táptalajban, egy órán keresztül iaknhálíuk MYA-vírus szuszpenzióval (0,() 1 fertőző egység (RJ) sejtenként, -0,02 ml/cnri). Ezután további „Á” táptalajt adtunk hozzá. (0,2 ral/enk) és a palackokat 37 *C-ön 2-3 napon, keresztül inkubálíuk (addig, amíg a sejtek körülbelül 90 %-a mutat chopatogén hatásokat). Nyers vírus törzsállományokat ügy állítottunk elő, hogy a sejt monorétegeket a táptalajban lekapartuk és a sejtes anyagot Sorvad RC-3B centrifugában, 3000 ford/perc mellett 5- perces centrifugálással 4 °C~o.n ülepítettük. A nyers víruspreparátumot további feldolgozásig (mim példád vírus tisztítás) -20 °C-on tároltuk.
1.2 A vírusok tisztítása.
A lehető legtisztább és a gazdasejtre specifikus komponens .mentes viruspreparátum előállításához a joklík által leírtakhoz hasonló tisztítási lépéseket vettünk igénybe [Joklík: Virol ogy 18 9 (196,2)]. A -20 °C~on tárolt nyers vírus törzsállományokat .felengedtük és felszuszpendáltuk PBS-ben (az üledék térfogatának 10-2ö~szotns mennyiségében), majd a szuszpenziót a fontiek szerint centrifugáltuk.. Az új üledéket 10-szeres mennyiségű 1, számú Trísz-pnfferben (10 mM Trisz-HCl pH 9,0) szuszpeudáltuk, majd a szuszpenziót rövid ideig ultrahanggal kezeltük (Labsonie t, B.Bnum Biotech fetematíonaí, Melsnngen, Németország; 2x10 másodperc szobahőmérsékleten 6Ö watt teljesítmény mellett) annak érdekében, hogy a 1.0 sejtíörmelékei tovább roncsoljuk, és így a sejtes anyagok közöl kiszabadítsuk a vírus részecskéket. A sejtmagokat és a nagyobb méretű sejtíörmeléket a szuszpeuzió ezt követő rövid centrifugálása során, eltávolítottak (Sorvall GSA rotor, DuPónt Co., ΣΜ353 Bad Nauhéim, Németország; 3 percig 3000 ford/perc, 1 ö *C-on), Az üledéket mégegyszer az 1. számú íriszpufferben szuszpendálíuk, ultrahanggal kezeltük és cenüifogáltuk a fentiek, szerint A szabad 15 vírus részecskéket tartalmazó összegyűjtött felülúszókat összeöntöttük, és 10 ml, 10 mM Trisz-HCl-be® (pH 9,0) készített, 36 % cukrot tartalmazó oldatra rétegeztük, majd Beckman SW 27/SW 2.8 rotorban centrifugáltuk í&ö perc 4 ®C-on, 13.500 ford/pere). A feiülúszőí eldobtuk és a vírus részecskéket tartalmazó üledékei lö mi 1 mM Trísz-HCl-ben (pH 9,0) felvettük, rövid idejű ultrahangos kezeléssel homogenizáltuk (a fenti, készülékkel, szobahŐmér20 sékleten 2x10 másodperc) és 2.0-40 %-o-s cukor gradiensre (a cukrot 1 mM Trisz-HCI-ben (pH 9,0) oldottuk fel) rétegeztük további tisztítás céljából. A gradienst Beckmann SW 41 rotorban centrifugáltuk (50 perc, 4 ’C-ön, 13.500 ford/perc), Á eentrifugálást kővetően a vírus részecskéket tartalmazó elkülönülő sávokat a sáv fölötti térfogat leszívása után· pipettázással begyűjtöttük. Az így kapott cakoroldatot háromszoros térfogatú PBS-sel felhígítottuk és a vírus ré2.5 szecskékei centrí.fugái ássál isméi leülepitettük ÍBecknwm SW 27/28 rotor, 68 perc 4 cC-on, 13.500 fed/perc). Az üledéket, amely ekkor már nagyrészt tiszta vírus részecskékből állt, újra szoszpendállok PBS-ben és ekvilibráltuk, hogy átlagban 1-5 x lö9 lU/ml vírus koncentrációt érjünk el A tisztított vírus törzsállományt -80 °C-on tároltuk és a további kísérletekhez közvetlenül vagy PBS-sel történő hígítás után alkalmaztuk,
1.3 MVA-vírus klónozása.
Homogén vírus törzsállomány preparátumok előállításához Anion Mayr professzortól kapott MVA-vírusi klónoztunk a határhígítás módszerével, 96~lyukas szövettenyésztő lapban tenyésztett CHF-kuitórában, három egymást követő passzálás során. Az F6 MVA-klónt vá**SR iasztottuk' ki, és CEF-tenyészetben amplifíkáltuk, hogy kísérleti vírus törzsállományokat hozzunk létre, amelyek kiinduló anyagként szolgáltak a találmány szerinti rekombináns MVAvírusok előállítása és a már korábban leírt rekombináns MVA-vírusok előállítása során [Sutter és Moss: Proe.. Nati. Acad, Sei, USA 89 19847 (1992); Sutter és mtsai.: Vaceíne 12 103-2 (1994); Hirsch és mtsai.: I Virol. 79 3741 (1996)}.
2. példa
- 17 10
2,1 Vektor plazmidok szerkesztése·.
Annak érdekében, hogy rekombináns MVA-vírusok előállítását lehetővé tegyük, áj vektor piazmidőkat szerkesztettünk. Az idegen gének inszertálását az MVA genomba pontosan az MVA. genomban természetes körülmények között előforduló II. deléeiő helyére irányítóitok. Az MVA genom MB N-fragmsnsében található 2500 bázispár nagyságú deíéció helyét, közrefogó MVA DNS-szekvendákai j'Áltenbnrger és mtsai.: J. Arch. Virol. ,105 15
1.5 (1989)] PCR segítségével amplínkúltok, és a pUClS: plazmád többszörös klónozási helyére klónoztuk. A bal oldali 600 bázispár nagyságú közrefogó DHS-hez a. kővetkező printereket alkalmaztok: 5*-CAG CAG GGT ACC CTC ATC GTA CAG GAC GTT €103' és 5M2AG CAG CCC GGG TAT TCÖ ATG ATT ATT TIT AAC AAA ATA AC.A-3' (a és Smal restrikciós enzimek .hasítási helyeit aláhúzással jelöltök), A jobb oldali 550 bázispár nagyságú közrefogó DNS-hez a következő prímereket alkalmaztuk: 5'-€AG CAG CTG CAG GAA TCA TCC ATT CCA CTG AAT AGC-3' és 5'-CAG CAG GCA TGC CGA CGA ACA AGG ÁAC TGT AGC AGA-V (a Túl és Sbűí restrikciós enzimek hasítási helyeit aláhúzással jelöltök), É két pUC!8-plazmidha ioszeriáli közrefogó MVA. DMS-darab közé illesztettük be az .FscAeAete? coll lacZ gént a vaccinia vírus késői P11 promóter szabályozása alatt [a promotert plll LZ-plazmidböl. restrikciós emésztéssel állítottuk elő. Suttér és Moss: Proo. MatL Acád. Sei, USA 89 10847 (1992)], a ZGmHl hasítóhely alkalmazásával,, hogy előállítsuk a pUCH LZ MVA mszerdós vektort (1. ábra). Ezt követően, egy 289 bázispár nagyságú íragmenst, amely együttesen tartalmazza a vocemm vírus korai/késoi P7.5 promotert és egy klónozásra alkalmas óúml hasítóhelyet fezt a pSCU-plazmid vektorból kiindulva, ECoRl-gyel és AGú-gyel történő restrikciós emésztéssel állitottuk. elő, Chakrabatti és mtsai..: Moleeuíar and. Céilular Bíology 5 3403 (1985)} inszeríáltuk a pCCH ÍZ SAnsí hasítóhelyére., hogy megkapjuk az MVA pUCH LZ P7.5~vektort (2, ábra). Olyan vektor pbzmíd megszerkesztéséhez, amely lehetővé teszi rekombináns MVA-vírusok izolálását a β-galaktozídáz reporter enzim tranziens szintézisének
- 18 útján, egy, .az .£. coli LacZ nyílt leolvasási fázis 3'-végéről származó 330 bázispár nagyságú DNS-fmgmeost PCR segítségévei amplifíkáltunk (a primerek a kővetkezők voltak: 5’-CAG CAG GTC GAC CCC GAC CGC CTF ACT GCC GCC-o' és 5'~GGG GGG CTG CAG ATG GTA GCG ACC GGC GCT CAÖ~3'}, és a. p'UCS LZ F7.5 plazmld M és M hasítást he5 iveibe klónoztok, hogy előállítsuk. az MVA pUCIí LZdel P7.5 vektort (3. ábra). Az Swd hasítási hely segítségével, ezt a vektor plazmidot al.kalmazb.atjnk idegen gént kódoló DNSszekvencíák beillesztésére az MVA gettómba, a. mcem/zt vírus P7.5-promőter transzkripciós szabályozása alatt, A kívánt rekombináns. vírus izolálását követően, amelyet a β-galaktozidáz aktivitás sxpresszálása alapján történő szkríneléssel valósítottunk meg, a rekombináns vírus további tenyésztése az űjmszerkesztett Pl 1-LacZ expressziós kazetta homológ rekombinációval történő őn-ddéclójához vezet.
2,2 Rekombináns MVA T7pol vírus szerkesztése és jellemzése.
Egy 3,1 kdobázíspár nagyságú DNS-fragmenst vágtunk ki /ícoRl segítségével a pTF?-3 plazmádból (Fuersí és mtsai.: Pwc. Natl. Acad, Sei USA 83 8122 (1986)], amely fragmens 15 tartalmazza a teljes T7-bakteriofág RNS-polimeráz gént a vaccima vírus koral/késöi P7.5 promóter szabályozása alatt, majd ezt. Kleúow DNS-polhnerázzal történő inkubációval módosítottuk, hogy tompa végeket állítsunk elő, és a pUCII LZ plazmld egy egyedülálló Smal restrikciós hasítási helyére klónoztuk, hogy ezzel létrehozzuk, a pUCH LZ, T?poí plazmld transzfer vektort (4. ábra). A T? RNS-polirnetáz gén expressziójának transzkripciós szabályozására.
2.0 a vaccínía vírus koral/késöi P7..5 promótert választottuk. Áz erősebb vaccíaía vírus késői promőterekkel szemben (mint például Pll), ez a promóter rendszer lehetővé teszi rekombináns gének expresszióját, közvetlenül a célsejtek megfertőzését követően. A pUCII EZTYpol plazmidot - amely az idegen gének inszercióját irányítja az MVA-genom 11. deléciós helyébe - alkalmaztuk a rekombináns MVA T7pol vírus előállítására.
Sejtenként 0,05 TCIDso mennyiségű MVA-val fertőzött CEF-sejíeket pUCII LZ T7pol plazmld DNS-sel transzfekíáltuk a korábban leírtak szerint (Sutter és mtsai,: Vaeeine j2 1032 Π994)}. A T? RN'S-polimerázt, és a β-D-galaktozidázt együttesen expresszáló rekombináns MVA-vírusí (MVA P7.5-T7pol) választottunk ki őt egymást követő plakk tisztítási fordulóval, 5-brőtn~4-klór-3-ináoli.l β-D-galaktoziddal (3 00 ug/ml) festett C'BF-sejtekben. Ezt köve30 tőén a rekombináns vírusokat CEF' monorétegek fertőzésével ampbftkáltnk, és a DNS-t PCR.
segítségével analizáltuk a vírus törzsállomány genetikai homogenitásának megerősítésére. Az «« * ♦ ·»*
- 19 ··
MVA~T7pol víruseredetű DNS Soutliem-blot analízise kimutatta a rekombínáns gének stabil, beépülését az MVA genomon belül található íí. deléeiós helynél (5.ábra).
A rekombínáns MVA T7pol létrehozta T7 RNS-pohmeráz expressziójának folyamatos megfigyeléséhez [3*SjmetÍ0ninnal jelölt polipeptideket analizáltunk a vírussal fertőzött sző5' vettenyészetbők A CV-1 majom vese sejtvonal monorétegeit 12-lyukas -sejítenyésztő lapokon növesztettük, és sejtenként 20 TCIDss vírasmenuyiséggel megfertőztük. A fertőzés után. 3-5 órával a táptalajt eltávolítottuk, és a. tenyészeteket 1.-1 ml metíonin mentes táptalajjal egyszer mostuk. Minden lyukba 0,2 ml metíonin mentes, 50 gCi (^S'jmetiomnnal kiegészített táptalajt adtunk, és 30 percig 37 nC~on inkubáltuk. Előállítottuk a fertőzött sejtek ciíoplazma kivonatalö it, minden lyukat 0,2 ml 0,5 % Nemidet F~40-et tartalmazó lízis pufíerrel, 37 °C-on, 10 percig ínkubálva, majd ezt követően a mintákat SDS P'AGE segítségével analizáltuk. A CV-1 sejtek metabolikus· jelölése MVÁ T7pol~lal két további polipeptid szintézisét fedte fel: (a) egy körülbelül 116.000 Da moleku-latőmeg-ö fehérje, amely az K. eo// β-galaktozídáznak felel meg, amelyet együíí-sxpresszatónk, hogy lehetővé tegyük a rekombínáns vírusokra történő szkrínelést; és (b) egy 98.000 Da molekuíatömegű fehérje, amely megfelel a T7-bakteriofág .RNS-politneráz várt molekulatömegének (6. ábra). Megjegyzésre érdemes az MVÁ TVpol által termelt nagy .mennyiségű β-galaktozidáz. Az m vrw jelölési kísérletek eredményei a Pl 1LaeZ gén konstrukció nagyon, erős expressziójáí mutatják, amikor a IL deledé- helyén inszertáljuk az MVA genomba, ezzel jelezve, hogy MVÁ-vektor vírusokban a -rekombínáns gének hatékonyabban expresszálható-ak, amennyiben a genonmak erre a helyére insmiáljuk. azokat.
.Megvizsgáltuk a rekombínáns MVAVDpol vírusok expresszié® rendszerként való alkalmazhatóságát a .rekombínáns WR~T7pol vTF7-3 vírussal szemben fFuerst és mtsai: 1986] ógy, hogy pTM.l-bői [Moss és mtsai.: Natúré 348 91 (1990)} származó plazmád vektor DNS·25 sel együtt transzferáltuk, amely vektor T7 RNS-polímeráz promőter (Pl?) szabályozása alatt álló A eoA klőramfenlkol-aeetiltranszferáz (CAT) gént tartalmaz (a CAT-gént a pTMl többszörös klónozó helyének Adui és FamHl helyeibe klónozva). A transzfektált és fertőzött CV-1 sejteket 0,2 ml 0,25 M Trisz-BCl-ben (pH 7,5) szuszpendáítuk. Három fagyasztás-felengedés ciklust követően a lizátumokat centrifugátással derítettük, meghatároztok a ielülószók fehérje tartalmát, és 9,5, 0,25, 0,1 gg összes fehérjét tartalmazó mintákat vizsgáltunk enzim aktivitásra a Mackett és munkatársai által leírt eljárás szerint [Mackett és mtsal,; J. Virol 49 857 (1984)], Autoradiográfíát követően, a jelöli foltokat mennyiségileg meghatároztuk a Fuji leképező analízis rendszer alkalmazásával. Az eredmények azt mutatják, hogy erősen iegyengí·♦·» * X * Φ Φ
Φ*φ ΦΦΦ * V Φ *·φ φ»
- 20 tett MVA. vaccinia vektor alkalmazásával ugyanolyan hatékonysággal lehet a vacei/tia vírus17 RNS-poümeráz rendszert alkalmazni, mint egy teljes mértékben teplikádó-kompeíens vnectom vírus rekombínáns esetében (7. ábra).
2.3 Rekombiaáns MVA LAÍnef vírus szerkesztése és jellemzése.
Egy 648 bázíspár nagyságú DNS-feagmenst állítottunk elő PCR. segítségével plazmid DNS~böl [M.-P.. Kieny (Tmnsgene S.A., Strasbonrg) által rendelkezésünkre bocsátott pTGl lóó-pbzmitk a PCR-primerek a következők voltak: 5-CAG CAG GGA TCC ATG GGT GGC AAG TGG KI A AAA AGT AGT-3' és 5M3AG CAG GGA TCC ATG TCA
GCA. GTT GTT GAA GTA CTG CGG-V), amely fragmens a. H1V-1. LAÍ teljes séf génjét tartalmazta, ezt megemésztettük .SoíuHI restrikciós endonukfeázzak Kleaow DNSpe&íterázzal történő inkubációval módosítottuk, hogy tompa végeket kapjunk, és a pUCU LZdel P7.5 plazmid ,fenni hasítási helyébe klónoztuk, hogy létrehozzak a pGCJI LZdel P7.5LAIneí vektort (8. ábra). Ezt a plazmidot alkalmazni tudtok olyan MVA rekombínáns vírus megszerkesztésére, amely expresszálju a HÍV-1 LA1 nef gént a vaccáuo vírus korai/késol P7.5 promóter szabályozása altot.
Sej tenként 0,05 T€íD$o mennyiségű MVA-váí fertőzött CEF sejteket transzFeMtetk a pUCE LZdel P?.5~LAínéf plazmádból származó DNS-sel a korábban leírt eljárás szerint [Sutter és mtsai. : Vaeeine 12 1032 (1994)). A nef gént tartalmazó, és az E. coli LacZ marker gént átmenetileg együíí-expresszáló rekombínáns MVA-vírusokat szelektáltunk ptokk-tísziftás egymást követő fordulóival 5-bróíu-4-klőr-3-índolil jbD-galakloziddal (300 pg/ml) megfestett CEF-sejtekben. Ezt követően a nef gént tartalmazó rekombínáns MVA-vírusokat izoláltunk, amelyekben a LacZ marker gén deléeiója megtörtént, három további egymást követő plakktisztítási fordulóval CEF-sejtekből, az 5-bróm-4-klór-3-indolil p-D-gaiaktozid (309 ggónl) jelenlétében nem-festodő víruseredetű gócpontokra szkrúieive. Ezt követően a rekombínáns vírusokat CEF monorétegek fertőzésével amplltikáituk és az MVA-LAInef vírus DNS-t PCR segítségével analizáltuk a vírus törzsállomány genetikai homogenitásának Igazolására, A vírus DNS Söuthern-bloí analízise igazolta az MVA-LAInef genetikai stabilitását és pontosan megmutatta a nef gén beépülését és az E coli LaeZ marker gén delécióját a vírus genomban található II deléeiós helyen..
A rekombínáns Nef fehérje hatékony expresszióját az MVA-LAhtef vektorral fertőzött CEF-sejtekböi kapott fehérje Íizáíumok Westero-blot analízisével igazoltuk, HÍV-1 Nef ellen irányított monoklonális egér antitesteket alkalmazva [K. Khron bocsátotta rendelkezésünkre »* V <>
*-»·
- 21 az. antitesteket és az Óvod és munkatársai által leírt módon .alkalmaztok; Óvod és mtsai.; AIDS 6 25 (1992)].
2,4 Rekombináns MV A-hTYR vírus szerkesztése és jellemzése.
Egy 1,9 kilobázispár nagyságú DNS-feagmenst, amely a teljes humán tirozinázt kódoló gént tartalmazza (SK29 azonosítóid beteg (AV) SK29-MEL melanőma sejívonaibői izolált tirozlnáz cDNS Í23.B2 klón, GenBank leltári szám: UO1873; Brichard és mtsai,; I Exp. Med. 178 489 (1993)] állítottunk elő a pcDNAl/Amp-Tyr plazmidból [Wölfel és mtsai.; Búr.
3. Immunot 24 759 (1994)] EcoRI restrikciós endonukleázzai emésztve, Klenöw DNSpoíímerázzal történő inkubációval módosítva, hogy tompa végeket kapjunk, és a pUCÖ LZdel
P7.5 piazmíd Srnal hasítási helyébe klónoztok, hogy létrehozzuk a pUCIl LZdel P7.S-TYR vektort (9. ábra). Ezt a plazmidot alkalmazni tudtuk olyan MVA rekombináns vírus megszerkesztésére, amely expresszátja a humán tirozmáz gént a vaccmta vírus korai/késói P7.5 proraóter szabályozása alatt.
Sejtenként 0,05 TCID'so mennyiségű MVA-vaf fertőzött CEF sejteket transzfekíálhmk a pUCIl LZdel P7.5-TVR plazmidból származó DNS-sel a korábban leírt eljárás szerint [Sutter és mtsai.; Vaccine 12 1032 (1994)]. A humán íirozináz gént stabilan expresszálő, és az E. co/i LaeZ gént átmenetileg együtt-expresszáló rekombináns MVA-vfest szelektáltunk plakktisziítás egymást követő fordulóival 5-bróm~4-klór-3~índolíl p-D-galaktozíddal (300 p.gZml)· megfestett CEF-sejfekben. Ezt követően a humán tirozínázl kódoló gént expresszálő rekombináns NáVA-vírosí - amelyben a LacZ marker gén deléeiója megtörtént ~ izoláltunk, három további egymást kővető piakk-íiszdíási .fordulóval CEF-sejfekből, az 5-bróm-4-klór-3 indolil β-D-gaiaktozid (309 pg/ml) jelenlétében nem-festödö víruseredetü gócpontokra szkrinelve. Ezt követően a rekombináns· vírusokat CEF monorétegek fertőzésével ampliIlkáitok és az MVA-hTYR. vírus DNS-t PCR. segítségével analizáltuk a vírus törzsálio25 mány genetikai homogenitásának igazolására. A vírus' DNS Soöíhem-hlot analízise igazolta az MV A-hTYR genetikai stabilitását és pontosan megmutatta a rekombináns íirozináz gén beépülését és az £. voE LacZ marker gén deléeióját a vírus genomban található H. delécíos helyen.
A rekombináns humán tírozináz hatékony expresszióját az MV A-hTYR vektorral íertő30 zöh CEF sejtekből kapott fehérje lizátumok. Western-blot analízisével igazoltuk, íirozináz ellen irányított nyúl eredetű políkionális antitesteket alkalmazva (V. Hearing bocsátotta rendelkezésünkre az antitesteket és a Jimenez és munkatársai által leírt módon alkalmaztuk; Jimenez és mtsaí.: Proc. Kati. Acad. Sci. USA 85 .3-830 (1988)], vagy egér eredetű monoklonális anti«... ..*» *, ..
* Φ φ Λ- φ * β\,4
*. * .„* * Α Φ ** X**· Φ* testeket alkalmaztunk (L. Old bocsátotta rendelkezésünkre az antitesteket és a Chen és munkatársai által leírt módon alkalmaztuk; Chen es mtsai.: Proc. Nntl. Acad. Sei. USA 92 8125 (1995)1SZBKVENCIÁLISTA *** ·* ·»» »» «ί*
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA .JELLEMZŐI:
HOSSZA: 3.3 bázispár TÍPUSA; nukleinsav HÁNY SZÁLÚ; egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKÜLATÍPUS; egyéb nukleinsav ] ö (A) LEÍRÁSA; /desc - DNS-pÉmer”
ÁZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;
€AGCAOGGTA CCCTCATCGT ACAGGACGT CTC 33
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 42 bázNpár TÍPU S A: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ; egy TOPOLÓGIÁJA.: lineáris
MOLEKULATÍPUS; egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA: /desc - úTNS-primer A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGCAGCCCG GGTATTCGAT GATTATTTTT AACAAAATAA CA 42
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;
HOSSZA; 36 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb mktónsav (A) LEÍRÁSA; Aiesc ~ “DNS-primer
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
- 24 CAGCAGCTGC AGGAATC ATC .CAITCCACTG A AT AGC 36
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI;
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;
HOSSZA: 36 bázispár TÍPUSA; .nukleinsav HÁNY SZÁLÚ; egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKU1.ÁTÍPL1S: egyéb nukleinsav (A) LEÍRÁSA; Mese ~ DNS-primer
A. 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;
CAGCAGGCAT GCCGACGAAC AAGGAACTGT AGGAGA 36
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA; 33 házíspár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOEEKÜLATÍPUS: egyéb nnkfemsav (A) LEÍRÁSA: Mese - DNS-primer'’
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMI) SZEKVENCIA LEÍRÁSA.:
CA.GCAGGTCG ACCCCGACCG CCTTACTGCC GCC 33
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁM Ú SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 33 bázispár TÍPUS A: nukleinsav HÁN Y SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav (A.) LEÍRÁSA: Mese ~ DNS-primer
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;
GGGGGGCTGC AGATGGTAGC GACCGGCGCT CAG 33
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 39 bázispár TÍPUSA: nukieinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOEEKULATÍPUS; egyéb nukieinsav (A) LEÍRÁSA; Zdesc DNS-prímer'
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
€-AGCAGOÖ AT CC ATGGGTGO CAAGTGGTCA AAAAGTAGT 3 9
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 39 bázispár TÍPUSA;, nukieinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKÜLATÍPUS; egyéb mádeínsav (A) LEÍRÁSA: Mese - DNS-primeC
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGCAGGGAT CCATGTCAGC AGTTCTTÖAA GTACTGCGG 39

Claims (15)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    3. Rekombináns MVA-vírus, amely HÍV séf antigént vagy antigén-deíermmánsí kódoló gém tartalmaz, expresszlőra alkalmas .módon,
  2. 2. Az I. igénypont szerint! rekombináns MVA-virus, amelyben a HÍV nef gén az MVA genomban egy tennészetben is előforduló delécíó helyére van beépítve.
  3. 3. Az 1. vagy 2. Igénypont, szerinti rekombináns MVA-vírus, -amelyben a HÍV nef gén az MVA genomfean a Π. számú delécíó: helyére van beépítve.
  4. 4. Az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti rekombináns MVA-vírus, amely a vacciniavírus korai/késóí P7.5-protnöterének transzkripciós szabályozása alatt álló Hí V nef gént tartalmaz.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti rekomb-iuáús. MVA-vírus, amely barnás sejtekben replikálődní képes vírusoktól lényegében mentes.
  6. 6. Eukarióta sejt, amely az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns .MVArvírussai van fertőzve.,
  7. 7. Eljárás rekombináns HÍV Nef protein előállítására, amely eljárás tartalmazza a következő lépéseket:
    a) 6. igénypont szerinti sejt tenyésztése alkalmas tóröteéayek között, és
    b) a HÍV Nef protein izolálása.
    S. Az i-S. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns MVA-virus alkalmazása rekombináns HÍV Nef protein előállítására.
  8. 9. Eljárás az 1 -5, igénypontok bármelyike szerinti rekombináns MVA vírus előállítására, amely eljárás tartalmazza a HÍV nef gén bejuttatását egy .MVA vitás génomjába.
  9. 10. Eljárás az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti rekombinásts MVA vírus előállítására, amely eljárás tartalmazza
    6. igénypont szerinti sejt tenyésztését aSoteas körülmények között és a vlrusrészecskék begyűjtését.
  10. 11. Oltóanyag, amely az 1-5. igénypontok bármelyike szerimi rekombináns MVA-víntst és/vagy 7. igénypont szerint előállított HÍV Nef proteint tartalmaz fiziológiailag elfogadható hordozóban.
  11. 12. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns MVA-vfnts és/vagy a 7. igénypont szerint: előállítói!. HÍV Nef protein és/vagy a 11. igénypont szerinti oltóanyag, élő állat vagy ember immunizálásában történő alkalmazásra.
  12. 13..A 12. igénypont, szerinti rekombináns MVA-vírus és/vagy HÍV Nef protein és/vagy oltóanyag HíV-fertőzés vagy AIDS megelőzésében vagy kezelésében történő alkalmazásra.
  13. 14. .Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns .MVA-virus és/vagy 7. igénypont szerint előállított HÍV Nef protein alkalmazása oltóanyag előállítására,
  14. 15. A 14. igénypont szerinti alkalmazás, rekombináns MVA-vírus és/vagy az 5, igénypont szerinti oltóanyag, élő állat vagy ember immunizálására szolgáló oltóanyag előállítására.
  15. 16. A 14. igénypont szerinti alkalmazás, HíV-fertőzés vagy AIDS megelőzésére vagy kezelésére szolgáló oltóanyag előállítására.
HU0402350A 1995-07-04 1996-07-03 Recombinant mva-virus comprising a gene encoding a hiv net antigen ar an antigen determinant and use thereof HU229261B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK78295 1995-07-04
PCT/EP1996/002926 WO1997002355A1 (en) 1995-07-04 1996-07-03 Recombinant mva virus, and the use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU0402350D0 HU0402350D0 (en) 2005-01-28
HU229261B1 true HU229261B1 (en) 2013-10-28

Family

ID=8097499

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0402350A HU229261B1 (en) 1995-07-04 1996-07-03 Recombinant mva-virus comprising a gene encoding a hiv net antigen ar an antigen determinant and use thereof
HU9802217A HU224061B1 (hu) 1995-07-04 1996-07-03 Rekombináns MVA-vírus és alkalmazása

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9802217A HU224061B1 (hu) 1995-07-04 1996-07-03 Rekombináns MVA-vírus és alkalmazása

Country Status (27)

Country Link
US (6) US6440422B1 (hu)
EP (3) EP0836648B1 (hu)
JP (3) JP4312260B2 (hu)
KR (1) KR19990028617A (hu)
CN (3) CN1782071A (hu)
AT (3) ATE304057T1 (hu)
AU (1) AU721735B2 (hu)
BR (1) BR9609303B8 (hu)
CA (3) CA2225278C (hu)
CZ (1) CZ292460B6 (hu)
DE (3) DE69635172T2 (hu)
DK (3) DK0836648T3 (hu)
EE (3) EE05138B1 (hu)
ES (3) ES2249647T3 (hu)
HK (2) HK1009830A1 (hu)
HU (2) HU229261B1 (hu)
IL (5) IL122120A (hu)
MX (1) MX9800025A (hu)
NO (1) NO322476B1 (hu)
NZ (1) NZ313597A (hu)
PL (1) PL186857B1 (hu)
PT (1) PT836648E (hu)
RU (1) RU2198217C2 (hu)
SI (3) SI0836648T1 (hu)
TW (2) TW575664B (hu)
UA (3) UA68327C2 (hu)
WO (1) WO1997002355A1 (hu)

Families Citing this family (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA68327C2 (en) * 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
US7118754B1 (en) * 1996-07-30 2006-10-10 Transgene S.A. Pharmaceutical composition for treating papillomavirus tumors and infection
AU4556597A (en) * 1996-09-24 1998-04-17 Bavarian Nordic Research Institute A/S Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
MY119381A (en) * 1996-12-24 2005-05-31 Gsf Forschungszentrum Umwelt Recombinant mva virus, and the use thereof
US6969609B1 (en) 1998-12-09 2005-11-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Serivces Recombinant vector expressing multiple costimulatory molecules and uses thereof
FR2784997A1 (fr) * 1998-10-22 2000-04-28 Transgene Sa Materiel biologique pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement de mammiferes
US20040265324A1 (en) * 1999-03-23 2004-12-30 Cardosa Mary Jane Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
US6682742B1 (en) 1999-05-28 2004-01-27 Gsf Forschungszentrum Fur Unwelt Und Gesundheit Gmbh Vector for integration of heterologous sequences into poxviral genomes
US20150231227A1 (en) * 2000-03-02 2015-08-20 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
WO2001068820A1 (en) * 2000-03-14 2001-09-20 Anton Mayr Altered strain of the modified vaccinia virus ankara (mva)
DE10042598A1 (de) * 2000-08-30 2002-03-28 Gsf Forschungszentrum Umwelt Rekombinantes MVA mit der Fähigkeit zur Expression des HER-2/Neu-GENS
WO2002031168A2 (en) * 2000-10-10 2002-04-18 Genstar Therapeutics Minimal adenoviral vector and recombinant vaccines based thereon
US7445924B2 (en) 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
NZ524661A (en) 2000-11-23 2005-03-24 Bavarian Nordic As Modified vaccinia ankara virus variant
US7628980B2 (en) 2000-11-23 2009-12-08 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
US7740863B2 (en) 2001-04-06 2010-06-22 Merial Recombinant vaccine against West Nile Virus
DE10143490C2 (de) * 2001-09-05 2003-12-11 Gsf Forschungszentrum Umwelt Rekombinantes MVA mit der Fähigkeit zur Expression von HCV Struktur-Antigenen
DE10144664B4 (de) * 2001-09-11 2005-06-09 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Vacciniavirus MVA-E3L-Knock-Out-Mutanten und Verwendung hiervon
CA2466413C (en) 2001-12-04 2014-11-04 Bavarian Nordic A/S Flavivirus ns1 subunit vaccine
NZ533586A (en) * 2001-12-20 2005-02-25 Bavarian Nordic As Method for the recovery and purification of poxviruses from infected cells using high pressure homogenisation
EP1839672A3 (en) * 2002-04-19 2007-11-21 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus Ankara for the vaccination of neonates
US7501127B2 (en) 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
EA007811B1 (ru) 2002-05-16 2007-02-27 Бавариан Нордик А/С Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva)
EA009525B1 (ru) * 2002-05-16 2008-02-28 Бавариан Нордик А/С Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины ankara, содержащий ati-промотор вируса коровьей оспы, и способы применения вируса и промотора
KR101044538B1 (ko) 2002-09-05 2011-06-27 버베리안 노딕 에이/에스 무혈청 조건하에서 일차세포의 배양 및 바이러스의 증식방법
DE10249390A1 (de) * 2002-10-23 2004-05-13 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Rekombinante MVA-Stämme als potentielle Impfstoffe gegen P.falciparum-Malaria
PT1567653E (pt) 2002-11-25 2007-10-01 Bavarian Nordic As Poxvírus recombinante que compreende pelo menos dois promotores do vírus da varíola bovina ati
ATE403005T1 (de) * 2003-02-18 2008-08-15 Helmholtz Zentrum Muenchen Rekombinantes mva und verfahren zur erzeugung davon
JP5052893B2 (ja) 2003-02-20 2012-10-17 アメリカ合衆国 ポックスベクターにおける新規の挿入部位
US7731974B2 (en) 2003-03-27 2010-06-08 Ottawa Hospital Research Institute Mutant vesicular stomatitis viruses and uses thereof
MXPA05010260A (es) 2003-03-27 2006-03-17 Ottawa Health Research Inst Virus de estomatitis vesicular mutantes y usos de los mismos.
WO2004093905A1 (en) * 2003-04-16 2004-11-04 City Of Hope Human cytomegalovirus antigens expressed in mva and methods of use
GB2402391A (en) * 2003-06-04 2004-12-08 Oxxon Pharmaccines Ltd Fowlpox recombinant genome
ES2359473T3 (es) 2003-07-21 2011-05-23 Transgene S.A. Citoquinas multifuncionales.
WO2005017208A1 (en) * 2003-07-31 2005-02-24 George Mason Intellectual Properties, Inc. Compositions and methods for treating or preventing hiv infection
EP1518932A1 (en) 2003-09-29 2005-03-30 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Modified vaccinia virus Ankara (MVA) mutant and use thereof
DK1536015T3 (da) * 2003-11-24 2008-02-18 Bavarian Nordic As Promotorer til ekspression i modificeret vacciniavirus Ankara
JP4719855B2 (ja) 2003-12-05 2011-07-06 国立大学法人北海道大学 高度安全性痘瘡ワクチンウイルスおよびワクシニアウイルスベクター
EP1683870A1 (en) * 2005-01-24 2006-07-26 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Vaccines based on the use of MVA
WO2006113927A2 (en) * 2005-04-20 2006-10-26 University Of Washington Immunogenic vaccinia peptides and methods of using same
US20090060947A1 (en) * 2006-05-19 2009-03-05 Sanofi Pasteur, Inc. Immunological compositions
DK2029756T3 (en) * 2006-06-20 2017-02-13 Transgene Sa PROCEDURE FOR PREPARING POXVIRA AND POXVIRUS COMPOSITIONS
WO2008076157A2 (en) * 2006-09-08 2008-06-26 Duke University Modified vaccinia ankara virus vaccine
CN102026645B (zh) 2006-09-15 2016-01-27 渥太华医院研究机构 溶瘤弹状病毒
CA2665068C (en) 2006-10-06 2016-01-05 Bn Immunotherapeutics Inc. Methods for treating cancer with mva
US20080241139A1 (en) * 2006-10-31 2008-10-02 Regents Of The University Of Colorado Adjuvant combinations comprising a microbial tlr agonist, a cd40 or 4-1bb agonist, and optionally an antigen and the use thereof for inducing a synergistic enhancement in cellular immunity
CA2676129A1 (en) * 2007-01-26 2008-08-07 The Regents Of The University Of Colorado Methods of modulating immune function
EP2152736B1 (en) 2007-05-03 2017-07-05 Lysomab GmbH Complement factor h-derived short consensus repeat-antibody constructs
US8003364B2 (en) 2007-05-14 2011-08-23 Bavarian Nordic A/S Purification of vaccinia viruses using hydrophobic interaction chromatography
JP2010526546A (ja) * 2007-05-14 2010-08-05 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ ワクシニアウイルス系及び組換えワクシニアウイルス系ワクチンの精製
US8003363B2 (en) 2007-05-14 2011-08-23 Bavarian Nordic A/S Purification of vaccinia virus- and recombinant vaccinia virus-based vaccines
US20100285050A1 (en) * 2007-10-05 2010-11-11 Isis Innovation Limited Compositions and Methods
BRPI0800485B8 (pt) * 2008-01-17 2021-05-25 Univ Minas Gerais vetores virais recombinantes, composição vacinal para leishmaniose e método de vacinação para leishmaniose
CN102257134B (zh) 2008-02-12 2014-03-05 赛诺菲巴斯德有限公司 使用离子交换和凝胶过滤色谱进行痘病毒纯化的方法
US20110052627A1 (en) * 2008-06-20 2011-03-03 Paul Chaplin Recombinant modified vaccinia virus measles vaccine
US8691502B2 (en) 2008-10-31 2014-04-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
EP2424999A1 (en) 2009-04-30 2012-03-07 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Lausanne (CHUV) Modified immunization vectors
KR20120052352A (ko) * 2009-08-07 2012-05-23 트랜스진 에스.에이. Ｈｂｖ 감염을 치료하는 조성물
EP2501405A4 (en) * 2009-11-20 2013-12-04 Inviragen Inc COMPOSITION, METHOD, AND USES OF POX VIRUS ELEMENTS IN VACCINATE CONSTRUCTS
US9005632B2 (en) 2009-11-20 2015-04-14 Takeda Vaccines, Inc. Compositions, methods and uses for poxvirus elements in vaccine constructs against influenza virus subtypes or strains
EP3187585A1 (en) 2010-03-25 2017-07-05 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
GB201006405D0 (en) * 2010-04-16 2010-06-02 Isis Innovation Poxvirus expression system
US20110262965A1 (en) 2010-04-23 2011-10-27 Life Technologies Corporation Cell culture medium comprising small peptides
EP2668201A2 (en) 2011-01-28 2013-12-04 Sanofi Pasteur SA Immunological compositions comprising hiv gp41 polypeptide derivatives
WO2012151272A2 (en) 2011-05-02 2012-11-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
PL2691530T3 (pl) 2011-06-10 2019-02-28 Oregon Health & Science University Glikoproteiny i rekombinowane wektory CMV
PL2739293T3 (pl) * 2011-08-05 2020-11-16 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Sposoby i kompozycje wytwarzania wirusa krowianki
US20130189754A1 (en) 2011-09-12 2013-07-25 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
EP2761011B1 (en) * 2011-09-26 2018-05-23 Theravectys Use of non-subtype b gag proteins for lentiviral packaging
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
EP2788021B1 (en) 2011-12-09 2017-01-18 Bavarian Nordic A/S Poxvirus vector for the expression of bacterial antigens linked to tetanus toxin fragment c
EP2620446A1 (en) 2012-01-27 2013-07-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Immunogens for HIV vaccination
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
WO2014009433A1 (en) 2012-07-10 2014-01-16 Transgene Sa Mycobacterium resuscitation promoting factor for use as adjuvant
KR20150058152A (ko) 2012-07-10 2015-05-28 트랜스진 에스아이 마이코박테리아 항원 백신
WO2014043535A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions for the treatment of cancer
EP2912069B1 (en) 2012-10-23 2019-07-31 Emory University Gm-csf and il-4 conjugates, compositions, and methods related thereto
US20140286981A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Broadly reactive mosaic peptide for influenza vaccine
DE102013004595A1 (de) 2013-03-15 2014-09-18 Emergent Product Development Germany Gmbh RSV-Impfstoffe
US20150065381A1 (en) 2013-09-05 2015-03-05 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel hiv-1 immunogens
EP2873423B1 (en) 2013-10-07 2017-05-31 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3092000A1 (en) 2014-01-09 2016-11-16 Transgene SA Fusion of heterooligomeric mycobacterial antigens
GB201412494D0 (en) * 2014-07-14 2014-08-27 Ospedale San Raffaele And Fond Telethon Vector production
RS61902B1 (sr) 2014-09-26 2021-06-30 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Metodi i kompozicije za indukovanje zaštitnog imuniteta protiv infekcije virusom humane imunodeficijencije
WO2016115116A1 (en) 2015-01-12 2016-07-21 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to a hemorrhagic fever virus
WO2016131945A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Transgene Sa Combination product with autophagy modulator
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
AU2016369326B2 (en) 2015-12-15 2019-02-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Human immunodeficiency virus antigens, vectors, compositions, and methods of use thereof
EP3402802B1 (en) 2016-01-08 2023-04-12 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to a tumor associated antigen
BR112018015696A2 (pt) 2016-02-03 2018-12-26 Geovax Inc composições e métodos para gerar uma resposta imune para um flavivírus
MX2018010231A (es) * 2016-02-25 2019-06-06 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Mva recombinante o mvadele3l que expresa el flt3l humano y uso de los mismos como agentes inmunoterapéuticos contra tumores sólidos.
CA3023022A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Transgene Sa Combination therapy with cpg tlr9 ligand
US10273268B2 (en) 2016-06-16 2019-04-30 Janssen Vaccines & Prevention B.V. HIV vaccine formulation
AU2017318689A1 (en) 2016-09-02 2019-04-11 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment
HUE052008T2 (hu) 2016-09-15 2021-04-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Trimert stabilizáló HIV-burokfehérje-mutációk
US20190328869A1 (en) 2016-10-10 2019-10-31 Transgene Sa Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy
MA49397A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Bavarian Nordic As Vecteurs à poxvirus codant pour des antigènes du vih, et leurs procédés d'utilisation
EP3641803A2 (en) 2017-06-21 2020-04-29 Transgene Personalized vaccine
BR112020000867A2 (pt) 2017-07-19 2020-07-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. mutações da proteína do envelope do hiv estabilizando o trímero
US20190022212A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for safe induction of cross-clade immunity against human immunodeficiency virus infection in human
WO2019055888A1 (en) 2017-09-18 2019-03-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. METHODS OF INDUCING AN IMMUNE RESPONSE AGAINST HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS INFECTION IN SUBJECTS UNDER ANTIRETROVIRAL TREATMENT
US11311612B2 (en) 2017-09-19 2022-04-26 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria
JP7320601B2 (ja) 2018-09-11 2023-08-03 上▲海▼市公共▲衛▼生▲臨▼床中心 広域スペクトルな抗インフルエンザワクチン免疫原及びその使用
TW202110476A (zh) 2019-05-22 2021-03-16 荷蘭商傑森疫苗防護公司 於接受抗反轉錄病毒治療之個體中誘發抗人類免疫缺乏病毒感染之免疫反應的方法
KR20220082033A (ko) * 2019-10-16 2022-06-16 칼리버 임뮤노쎄라퓨틱스, 인크. 레트로바이러스의 계내 생성을 위한 생산자 바이러스
CA3161633A1 (en) 2019-11-14 2021-05-20 Aelix Therapeutics, S.L. Dosage regimens for vaccines
EP3842065A1 (en) 2019-12-23 2021-06-30 Transgene Process for designing a recombinant poxvirus for a therapeutic vaccine
WO2021260065A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens
EP3928789A1 (en) 2020-06-24 2021-12-29 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens
IL308018A (en) 2021-04-30 2023-12-01 Kalivir Immunotherapeutics Inc Oncolytic viruses for different MHC expression
WO2022269003A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas MVA-BASED VACCINE EXPRESSING A PREFUSION-STABILIZED SARS-CoV-2 S PROTEIN
EP4108257A1 (en) 2021-06-23 2022-12-28 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Mva-based vaccine against covid-19 expressing a prefusion-stabilized sars-cov-2 s protein
WO2023077147A2 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Pellis Therapeutics, Inc. T-cell vaccines for patients with reduced humoral immunity
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
WO2023213763A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Poxvirus encoding a binding agent comprising an anti- pd-l1 sdab
WO2023220283A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Pellis Therapeutics, Inc. Poxvirus adjuvant for t-cell vaccination
EP4316514A1 (en) 2022-08-03 2024-02-07 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Mva-based vectors and their use as vaccine against sars-cov-2

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE787901A (fr) 1971-09-11 1972-12-18 Freistaat Bayern Represente Pa Vaccin antivariolique
AU570940B2 (en) 1982-11-30 1988-03-31 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Process for producing poxvirus recombinants for expression offoreign genes
US5679511A (en) * 1986-10-06 1997-10-21 Donald Guthrie Foundation For Medical Research, Inc. CDNA clones for a regulatory protein in the melanin-production pathway
CA1341245C (en) * 1988-01-12 2001-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant vaccinia virus mva
US5221610A (en) * 1988-05-26 1993-06-22 Institut Pasteur Diagnostic method and composition for early detection of HIV infection
CN1042564A (zh) * 1988-11-11 1990-05-30 中国科学院上海生物化学研究所 乙肝疫苗的制备方法及其制品
JPH03271233A (ja) * 1990-03-19 1991-12-03 Inst Pasteur ウイルスエンベロープ糖タンパク質及びその糖タンパク質の中和エピトープに対応するペプチドの間の相乗作用による、ウイルス性感染に対する防御の誘発
EP0613378A1 (en) * 1991-10-28 1994-09-07 Institut Pasteur Induction of protection against viral infection by synergy between viral proteins and viral peptides
ES2172287T4 (es) * 1992-12-22 2003-04-16 Ludwig Inst Cancer Res Metodos de deteccion y tratamiento de individuos con celulas anormales que expresan los antigenos peptidicos hla-a2/tirosinasa.
US5620886A (en) * 1993-03-18 1997-04-15 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2
CA2173138A1 (en) * 1993-10-19 1995-04-27 Masafumi Takiguchi Peptide capable of inducing immune response against hiv and aids preventive or remedy containing the peptide
US5676950A (en) * 1994-10-28 1997-10-14 University Of Florida Enterically administered recombinant poxvirus vaccines
UA68327C2 (en) * 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals

Also Published As

Publication number Publication date
US20100291139A1 (en) 2010-11-18
PL186857B1 (pl) 2004-03-31
EP1312678A1 (en) 2003-05-21
CA2225278A1 (en) 1997-01-23
JP4312260B2 (ja) 2009-08-12
SI0836648T1 (en) 2003-12-31
CZ292460B6 (cs) 2003-09-17
PT836648E (pt) 2003-09-30
TW200305646A (en) 2003-11-01
JP2007244382A (ja) 2007-09-27
US6440422B1 (en) 2002-08-27
SI1312678T1 (sl) 2006-02-28
DK1312678T3 (da) 2005-12-19
ES2249648T3 (es) 2006-04-01
BR9609303A (pt) 1999-05-25
MX9800025A (es) 1998-03-31
RU2198217C2 (ru) 2003-02-10
PL324347A1 (en) 1998-05-25
EP1312678B1 (en) 2005-09-07
BR9609303B1 (pt) 2014-04-08
HUP9802217A2 (hu) 1999-01-28
DK0836648T3 (da) 2003-08-25
WO1997002355A1 (en) 1997-01-23
KR19990028617A (ko) 1999-04-15
AU721735B2 (en) 2000-07-13
US8153138B2 (en) 2012-04-10
IL202448A0 (en) 2011-07-31
EP1312679B8 (en) 2005-11-23
DE69635172T2 (de) 2006-06-22
BR9609303B8 (pt) 2014-05-06
DE69635173D1 (de) 2005-10-13
IL122120A0 (en) 1998-04-05
HUP9802217A3 (en) 1999-09-28
EP0836648B1 (en) 2003-05-07
EE200300332A (et) 2003-10-15
US20070071770A1 (en) 2007-03-29
NO980026L (no) 1998-01-02
JP4764366B2 (ja) 2011-08-31
EE04199B1 (et) 2003-12-15
US7198934B2 (en) 2007-04-03
HU0402350D0 (en) 2005-01-28
NO322476B1 (no) 2006-10-09
IL122120A (en) 2005-07-25
ATE239796T1 (de) 2003-05-15
CA2596274A1 (en) 1997-01-23
TW575664B (en) 2004-02-11
AU6611096A (en) 1997-02-05
JPH11509091A (ja) 1999-08-17
ATE304057T1 (de) 2005-09-15
DE69628011D1 (de) 2003-06-12
EP0836648A1 (en) 1998-04-22
EP1312679A1 (en) 2003-05-21
CA2608864A1 (en) 1997-01-23
CA2608864C (en) 2010-09-07
DE69635173T2 (de) 2006-07-13
HK1009830A1 (en) 1999-06-11
UA68327C2 (en) 2004-08-16
UA75410C2 (en) 2006-04-17
EE9700344A (et) 1998-06-15
CA2596274C (en) 2010-09-07
SI1312679T1 (sl) 2006-02-28
DE69628011T2 (de) 2004-03-18
DK1312679T3 (da) 2006-01-09
US20100266630A1 (en) 2010-10-21
JP2007252374A (ja) 2007-10-04
ES2199294T3 (es) 2004-02-16
ES2249647T3 (es) 2006-04-01
JP4764367B2 (ja) 2011-08-31
TWI245075B (en) 2005-12-11
US8197825B2 (en) 2012-06-12
US20070071769A1 (en) 2007-03-29
CN1554764A (zh) 2004-12-15
CN1189857A (zh) 1998-08-05
CN1782071A (zh) 2006-06-07
CA2225278C (en) 2009-01-27
EE04753B1 (et) 2006-12-15
DE69635172D1 (de) 2005-10-13
CZ424197A3 (cs) 1998-03-18
EE200300331A (et) 2003-10-15
IL212933A0 (en) 2011-07-31
EE05138B1 (et) 2009-02-16
HU224061B1 (hu) 2005-05-30
CN1154742C (zh) 2004-06-23
ATE304058T1 (de) 2005-09-15
NZ313597A (en) 1999-01-28
EP1312679B1 (en) 2005-09-07
HK1068015A1 (en) 2005-04-22
NO980026D0 (no) 1998-01-02
IL164318A0 (en) 2005-12-18
IL164318A (en) 2013-08-29
CN1554764B (zh) 2012-03-21
IL219528A0 (en) 2012-06-28
UA75411C2 (en) 2006-04-17
US20030035792A1 (en) 2003-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU229261B1 (en) Recombinant mva-virus comprising a gene encoding a hiv net antigen ar an antigen determinant and use thereof
AU619235B2 (en) Recombinant vaccinia virus mva
US20030082205A1 (en) Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
JPH08224090A (ja) Ａｉｄｓの原因ウィルスの糖蛋白質をコードするウィルスベクター及び組換えｄｎａ、該ベクターにより感染された細胞培養物、並びに抗体
JPH01500962A (ja) ウィルスベクター及びエイズ原因ウィルスのｆ蛋白質をコードするｄｎａ組換え体、該ベクターにより感染された細胞培養物、上記蛋白質の製造方法、得られた蛋白質、ワクチン及び得られた抗体