ES2312918T3 - Poxvirus con especificidad de infeccion dirigida. - Google Patents

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Abstract

Partícula poxvírica EEV que presenta especificidad de infección dirigida hacia las células diana en la que dicha partícula infecta preferentemente dichas células diana y en la que dicha especificidad está proporcionada por lo menos por un resto de ligando heterólogo que está situado en la superficie de dicha partícula poxvírica y que puede unirse a una molécula antiligando localizada en la superficie de dichas células diana, en la que dicho resto de ligando heterólogo es un polipéptido y forma parte de una proteína híbrida que incluye dicho resto de ligando heterólogo y un polipéptido poxvírico seleccionado de entre los productos de expresión de los genes B5R o A34R, con la condición de que cuando dicha partícula poxvírica sea una partícula de virus de vacuna EEV dicho ligando no sea un anticuerpo dirigido contra ErbB-2.

Description

Poxvirus con especificidad de infección dirigida.
La presente invención se refiere a una partícula poxvírica con especificidad de infección dirigida conferida por un resto de ligando heterólogo presente en la superficie de dicha partícula poxvírica y que puede reconocer y unirse específicamente a una molécula de antiligando localizada en la superficie de las células diana. La presente invención se refiere además a un vector que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido híbrido que incluye dicho resto de ligando heterólogo y todo o parte de un polipéptido de superficie poxvírico natural. La presente invención se refiere además a composiciones que comprenden dicha partícula poxvírica o dicho vector así como a su utilización con fines terapéuticos y profilácticos. La invención es de interés muy especial en aplicaciones de terapia génica, en particular para prevenir o tratar cánceres en mamíferos.
La terapia génica puede definirse como la transferencia del material genético dentro de una célula o un organismo. La posibilidad de tratar trastornos humanos por terapia génica ha cambiado en pocos años desde la etapa de las consideraciones teóricas a las de las aplicaciones clínicas. El primer protocolo aplicado al hombre se inició en Estados Unidos en septiembre de 1990 en un paciente que padecía insuficiencia de adenina desaminasa (ADA). Este primer experimento estimulante ha sido seguido de numerosas aplicaciones nuevas y pruebas clínicas prometedoras basadas en la terapia génica están actualmente en marcha (véase por ejemplo las pruebas clínicas listadas en http://cnetdb.nci.nih.gov/trialsrch.shtml o http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/).
El éxito en terapia génica depende principalmente del aporte de eficacia de un gen terapéutico de interés para hacer su expresión posible en las células de un organismo vivo. Los genes terapéuticos pueden transferirse al interior de las células utilizando una amplia variedad de vectores que dan como resultado la expresión transitoria (transfección) o la transformación permanente del genoma del hospedador. Durante la pasada década, un gran número de vectores víricos, así como no víricos, se ha desarrollado para la transferencia génica (véase por ejemplo Robbins et al., 1998, Tibtech 16, 35-40 y Rolland, 1998, Therapeutic Drug Carrier Systems 15, 143-198 para estudios).
Los vectores víricos utilizados más ampliamente se obtienen a partir de retrovirus y adenovirus (para estudios, véase Miller, 1997, Human Gene Therapy 8, 803-815). Sin embargo, otros vectores víricos tales como los vectores obtenidos del virus Sindbis o los vectores obtenidos del poxvirus, están emergiendo como candidatos prometedores para la transferencia génica in vivo.
Los poxvirus son un grupo de virus complejos desarrollados a los que se distingue principalmente su morfología poco frecuente, su gran genoma del ADN y su zona citoplásmica de replicación. El genoma de varios miembros de poxviridae, incluyendo la cepa del virus de la vacuna de Copenhague (VV) (Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266 y 517-563; Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381-401) y la cepa Ankara del virus de la vacuna modificada (MVA) (Antoine et al., 1998, Virol. 244, 365-396), han sido cartografiadas y secuenciadas. El VV tiene un genoma de ADN bicatenario de aproximadamente 192 kb que codifica aproximadamente 200 proteínas de las que aproximadamente 100 están implicadas en el montaje del virus. La MVA es una cepa de virus de vacuna muy atenuada generada por más de 500 atenuaciones en serie de la cepa Ankara del virus de la vacuna (CVA) en fibroblastos de embriones de pollo (Mayr et al., 1975, Infection 3, 6-16). El virus de MVA se depositó ante la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) bajo el nº I-721 de depósito. La determinación de la secuencia completa del genoma de MVA y la comparación con el genoma de VV de Copenhague permite la identificación precisa de las alteraciones que se produjeron en el genoma vírico y la definición de siete deleciones (I a VII) y numerosas mutaciones que conducen a los ORF fragmentados (Marco de Lectura Abierto) (Antoine et al., 1998, Virology 244, 365-396).
La vía natural para la absorción intracelular de los virus desarrollados implica una serie de etapas que incluyen la fijación de un polipéptido vírico expuesto en la superficie del virus a un receptor celular y a un mecanismo de fusión entre las membranas víricas y celulares que da como resultado la liberación del genoma vírico en el citoplasma de la célula infectada.
Sin embargo, en el caso especial del poxvirus, el análisis de la vía de administración exacta se complica por la existencia de dos formas morfológicamente distintas de virus infeccioso, denominadas virus intracelular maduro (IMV) y virus extracelular con envoltura (EEV). La forma IMV está caracterizada, entre otras particularidades, porque presenta una envoltura monolipídica que rodea el núcleo vírico (Figura 1) y está localizada principalmente en el citoplasma de las células infectadas, aunque puede liberarse extracelularmente tras la lisis de las células infectadas. Se han identificado muchos de los polipéptidos naturales expuestos en la superficie de la envoltura del lípido IMV, tal como por ejemplo las proteínas p14 kDa y p21 kDa, codificadas respectivamente por el gen A27L (Rodríguez et al., 1985, J. Virol. 56, 482-488; Rodríguez y Esteban, 1987, J. Virol. 61, 3550-3554) y el gen A17L, así como las proteínas codificadas por L1R, A14L, D8L, A9L (Yeh et al., 2000, J. Virol. 74, 9701-9711), E10R (Senkevich et al., 2000, Virol. 5, 244-252) y los genes H3L. Comparada con el IMV, la forma EEV presenta una envoltura de la membrana de lípido externa adicional (capa de lípido doble) adquirida en las cisternas de la red trans-Golgi. Corresponde a la forma vírica liberada fuera de las células infectadas. La envoltura de la membrana de la superficie del EEV presenta aproximadamente 10 proteínas que están ausentes de la superficie del IMV, tal como por ejemplo los productos génicos B5R, A34R y hemaglutinina (HA) codificados (Figura 1). La coexistencia de dichas formas IMV y EEV ha sido descrita para la mayoría de las cepas de vacunas (por ejemplo cepas de Copenhague y de MVA) así como para otros poxvirus tales como los poxvirus aviar (Boulanger et al., 2000, J. Gen. Virol. 81, 675-687).
Las diferentes morfologías de IMV y EEV sugieren la aparición de diferentes mecanismos para la penetración de estas formas poxvíricas en las células hospedadoras. Se ha propuesto recientemente que la vía de administración de EEV está mediada por la endocitosis y la vía de fusión de la membrana dependiente del pH subsiguiente, mientras que la forma IMV se fusiona directamente con la membrana celular de manera independiente del pH (Vanderplasschen et al., 1998, J. Gen. Virol. 79, 877-887). Dos receptores celulares que median la fijación de IMV y la absorción intracelular se han identificado recientemente: el sulfato de heparán que es una cadena lateral de glucosaminoglucano (GAG) de los proteoglucanos de la superficie celular (Chung et al., 1998, J. Virol. 72, 1577-1585) y otro componente de GAG, el sulfato de condroitina (Hsiao et al., 1999, J. Virol. 73, 8750-8761). Ambos receptores interactúan con un polipéptido de la superficie de IMV diferente, respectivamente el producto génico p14 (que se une al sulfato de heparán) y D8L (que se une al sulfato de condroitina), lo que sugiere un tipo diferente de interacciones virus-GAG.
La proteína (p14) de 14 kDa del virus de la vacuna desempeña una función importante en la propiedad infecciosa del virus. La proteína p14 está anclada en la envoltura de lípido del IMV por asociación con la proteína de 21 kDa (p21). La proteína p14 está implicada en la vía de administración del IMV, participando probablemente en el acoplamiento del sulfato de heparán de la superficie celular (Chung et al., 1998, J. Virol. 72, 1577-1585). Además, el proceso de fusión ha sido atribuido a dicha proteína p14. Además, como afirmación general, se ha demostrado que los polipéptidos de la superficie del IMV están íntimamente relacionados con la propiedad infecciosa del IMV y que su mutación o eliminación alteraban drásticamente la diseminación de IMV (Dallo et al., 1987, Virology 159, 423-32). La proteína p14 es necesaria también para la formación del EEV y del virus propagado fuera de las células infectadas. Recientemente, los dominios funcionales requeridos para la fijación al receptor sulfato de heparán de la superficie celular, para la fusión de la membrana del virus/célula y la liberación del virus han sido cartografiados dentro de los 43 primeros aminoácidos N-terminales del p14 (Vázquez y Esteban, 1999, J. Virol. 73, 9098-9109). Además, Vázquez et al. (1998, J. Virol. 72, 10126-10137) han demostrado que el dominio C-terminal del p14 está implicado en la fijación con la proteína p21.
Muchos vectores poxvíricos recombinantes que expresan varios genes terapéuticos se han descrito en la bibliografía. En particular, VV que expresan genes de citocina (Peplinski et al., 1995, Ann. Surg. Oncol. 2, 151-159; Whitman et al., 1994, Surgery 116, 183-188), el gen B7.1 inmunoestimulante (Hodge et al., 1994, Cancer Res. 54, 5552-5555), ICAM-1 (Uzendoski et al., 1997, Hum. Gene Ther. 8, 851-860) o genes suicidas tales como el gen de timidina cinasa del virus-1 del herpes simple (TK HSV-1) (Puhlmann et al., 1999, Hum. Gene Ther. 10, 649-657) y el gen de citosina desaminasa (Gnant et al., 1999, Cancer Res. 59, 3396-3403) han sido propuestos para la terapia del cáncer. Además, su actividad antitumoral se ha demostrado en modelos animales. Se han propuesto también vectores basados en la cepa MVA (Sutter y Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851; Carroll y Moss, 1995, BioTechniques 19, 352-355; Antoine et al., 1996, Gene 177, 43-46; Schleiflinger et al., 1996, Arch. Virol. 141, 663-669).
Sin embargo, el virus de la vacuna presenta un intervalo hospedador muy amplio y puede infectar la mayoría de las células de vertebrados. De nuevo, obsérvese que las formas IMV y EEV se diferencian con respecto a su propiedad diseminadora porque la EEV que presenta en su superficie una variedad mayor de polipéptidos que sobre la superficie de IMV, es más propensa a diseminarse ampliamente que IMV. Aunque, se considera cualquier forma, esta ausencia de selectividad de infección podría considerarse un inconveniente para las aplicaciones especiales donde es deseable limitar efectos desfavorables que podrían proceder de la expresión de genes transferidos (es decir, genes citotóxicos) en las células que no son diana. Por consiguiente, sería interesante modificar el virus con objeto de restringir su intervalo del hospedador para dirigir la infección a poblaciones de células diana.
La modificación del tropismo vírico se ha conseguido ya con determinados virus. Por ejemplo en el documento WO 93/09221, el tropismo del virus de la gripe está modificado por la inhibición del polipéptido de hemoaglutinina vírico que normalmente media la fijación del virus al receptor celular por medio de un anticuerpo monoclonal y acoplando el virus con un anticuerpo que puede interactuar con el receptor transferrina expresado en las células destinatarias.
Roux et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9079-9083) describe la infección de células humanas con un retrovirus recombinante ecótropo de ratón utilizando dos anticuerpos biotinilados dirigidos a la envoltura retrovírica gp70 y a un antígeno celular del complejo de histocompatibilidad mayor humano (MHC), respectivamente.
El documento WO 94/10323 describe vectores de adenovirus destinatarios que presentan en su superficie una proteína de fibra modificada por fusión con un anticuerpo monocatenario, con objeto de dirigir la infección adenovírica a las células que expresan el antígeno reconocido por el anticuerpo.
Sin embargo, el direccionamiento controlado de las partículas poxvíricas ha sido obstaculizado por la complejidad intrínseca de los poxvirus y la existencia de las dos formas infecciosas diferentes. A este respecto, Galmiche et al. (1997, J. Gen. Virol. 78, 3019-3027) describe la construcción de partículas de EEV para el direccionamiento a las células tumorales. Un anticuerpo monocatenario dirigido contra el antígeno ErbB-2 asociado al tumor se fusionó con la hemoaglutinina (HA) vírica con objeto de expresarse en la superficie del EEV. El ErbB-2 es un receptor del factor de crecimiento epidérmico que se sobreexpresa en células de adenocarcinoma humano. Aunque la proteína de fusión está expuesta en la superficie de la partícula de EEV y puede unirse a células de adenocarcinoma humano cultivadas in vitro, los autores no observaron infección preferente hacia las células que expresan a ErbB-2 del EEV que presenta la fusión anticuerpo-HA. Se supone que la partícula de EEV modificada contiene todavía incluso proteína(s) no identificada(s) que permite la infección de una amplia gama de células.
Por consiguiente, el problema técnico que subyace en la presente invención es el aporte de procedimientos y medios mejorados para el direccionamiento de partículas poxvíricas a células específicas. Este problema técnico se resuelve con el aporte de las formas de realización definidas por la presente memoria.
La presente invención se refiere a una partícula poxvírica que presenta especificidad de infección dirigida hacia las células diana en las que dicha partícula infecta preferentemente dichas células diana y en la que dicha especificidad está proporcionada por lo menos por un resto de ligando heterólogo que está situado en la superficie de dicha partícula poxvírica y que puede unirse a una molécula antiligando localizada en la superficie de dichas células diana, con la condición de que cuando dicha partícula poxvírica sea una partícula de virus de vacuna EEV dicho ligando no sea un anticuerpo dirigido contra ErbB-2.
La expresión "especificidad de infección dirigida (de una partícula poxvírica) hacia las células diana" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una especificidad controlada de la infección, en la que una partícula vírica de la presente invención se modifica genéticamente para presentar un tropismo nuevo o mejorado hacia dichas células diana, en comparación con una partícula poxvírica no modificada (es decir natural) relacionada. Como resultado, la partícula poxvírica de la presente invención muestra una propensión a infectar dichas células diana a diferencia de su partícula poxvírica no modificada relacionada, lo que significa que la partícula poxvírica de la presente invención se infecta con más eficacia o más rápidamente que sus células diana (presentando en su superficie el antiligando reconocido por el resto de ligando presentado en la superficie de la partícula poxvírica de la infección) que ninguna de las células diana (que no presentan en su superficie dicho antiligando), mientras que una partícula poxvírica no modificada relacionada infectará a dichas célula diana con una eficacia inferior o similar en comparación con las células que no son dianas. Esta propiedad infecciosa preferida puede determinarse fácilmente comparando la propiedad de infección de la partícula poxvírica de la presente invención con la propiedad de infección de su partícula poxvírica no modificada relacionada hacia las células diana y las células que no son dianas, ya sea in vitro (por ejemplo en células cultivadas) o in vivo (por ejemplo en modelos animales) y bajo las mismas condiciones experimentales. Las condiciones experimentales in vitro para analizar las propiedades de la infección se proporcionan en el Ejemplo 5 de la presente memoria, sin embargo otros procedimientos son bien conocidos por los expertos en la materia y son por lo tanto utilizables en el contexto de la invención. Por ejemplo, cuando se utiliza una mezcla de partículas poxvíricas según la invención y de partículas poxvíricas no modificadas para infectar células diana cultivadas con un tiempo de infección relativamente corto (inferior a 30 min. y especialmente 1 a 10 min.), una mayoría (por lo menos el 60%, preferentemente, por lo menos el 70% y más preferentemente, por lo menos el 80%) de las partículas poxvíricas según la invención comprendidas en la mezcla original pueden infectar dichas células diana, mientras que una minoría (por lo menos el 40%, preferentemente, por lo menos el 30% y más preferentemente, por lo menos el 20%) de las partículas poxvíricas no modificadas comprendidas en la mezcla original pueden infectar dichas células diana. Esto produce un enriquecimiento de la cantidad de partículas poxvíricas según la invención presentes en la mezcla en cada ronda de infección. Dicho enriquecimiento puede evaluarse determinando las valoraciones víricas de las respectivas partículas poxvíricas por las técnicas habituales.
La expresión "resto de ligando" tal como se utiliza en la presente invención define cualquier resto que puede reconocer y unirse a por lo menos una molécula de antiligando que se expresa o expone en la superficie de una célula diana. Esto proporciona la fijación de la célula y la especificidad de infección a la partícula poxvírica de la invención. Es evidente que la lectura de la memoria que dicha molécula de antiligando es diferente del receptor celular natural que media la absorción del poxvirus (por ejemplo sulfato de heparán o sulfato de condroitina). Según la invención, el resto del ligando está localizado en la superficie de la partícula poxvírica reivindicada. Dependiendo del procedimiento de acoplamiento utilizando (véase a continuación), dicho resto de ligando puede ser un resto añadido a la superficie de la partícula vírica y expuesto sobre la misma (por ejemplo por acoplamiento químico) o un resto fusionado en la estructura de la envoltura de la partícula (por ejemplo por acoplamiento genético). "Heterólogo" hace referencia a que dicho resto de ligando no se encuentra en la superficie de una partícula poxvírica natural. Por extensión, "homólogo" se refiere a los polipéptidos o restos naturales encontrados en la superficie de una partícula poxvírica natural. La molécula de antiligando localizada en la superficie de una célula diana es preferentemente en la que la partícula poxvírica natural no se une o una que la partícula poxvírica natural se une pero con especificidad inferior que una partícula poxvírica modificada de la presente invención. La especificidad de unión entre un ligando y una molécula de antiligando dada puede determinarse según las técnicas de la materia, incluyendo ELISA, inmunofluorescencia y tecnología basada en resonancia del plasma en superficie (Biacore AB).
En general, los restos de ligando que pueden utilizarse en el contexto de la presente invención están ampliamente descritos en la bibliografía. Es un resto que puede proporcionar a la partícula poxvírica modificada de la invención, la capacidad de unirse a una molécula de antiligando dada o a una clase de moléculas de antiligando situadas en la superficie de por lo menos una célula diana. Las moléculas antiligando adecuadas incluyen a título no limitativo polipéptidos seleccionados de entre el grupo constituido por marcadores específicos para células, marcadores específicos para tejidos, receptores celulares, antígenos víricos, epítopos antigénicos y marcadores asociados al tumor. Las moléculas de antiligando pueden consistir además en azúcar, lípido, glucolípido, anticuerpo, etc... Según la invención, un resto de ligando puede ser por ejemplo un lípido, un glucolípico, una hormona, un azúcar, un polímero (por ejemplo, PEG, polilisina, PEI, ...), un polipéptido, un oligonucleótido, una vitamina, un antígeno, una lectina, un resto de polipéptido que presenta propiedades de direccionamiento tales como por ejemplo JTS1 (documento WO 94/40958), un anticuerpo o una combinación de los mismos. Un fragmento del resto de ligando mencionado anteriormente puede utilizarse también con tal que conserve la propiedad de direccionamiento de la molécula natural.
Preferentemente, el resto de ligando utilizado en la presente invención es un polipéptido que tiene una longitud mínima de 7 aminoácidos. Es un polipéptido natural o un polipéptido obtenido a partir de un polipéptido natural. "Obtenido" hace referencia a que contiene (i) una o más modificaciones con respecto a la secuencia natural (por ejemplo, adición, deleción y/o sustitución de uno o más restos), (ii) análogos de aminoácidos, incluyendo los aminoácidos naturales o (iii) enlaces sustituidos así como (vi) otras modificaciones conocidas en la técnica. Este término comprende polipéptidos variantes e híbridos obtenidos fusionando las secuencias de varios orígenes. Además, el resto de ligando puede tener una estructura lineal o cíclica (por ejemplo flanqueando en ambos extremos un ligando de polipéptido por restos de cisteína). Además, el resto de ligando en utilización en la presente invención puede incluir modificaciones de su estructura original a modo de sustitución o adición de restos químicos (por ejemplo glucosilación, alquilación, acetilación, amidación, fosforilación, adición de grupos sulfhidrilo y similares). La invención comprende además modificaciones que hacen detectable al resto de ligando. Con este fin, pueden preverse modificaciones con un resto detectable (es decir, marcadores gráficos de centelleo, radioactivos, fluorescentes o colorantes y similares). Los marcadores radioactivos adecuados incluyen pero no se limitan a Tc^{99m}, I^{123} e In^{111}. Dichos marcadores detectables pueden estar unidos a un resto de ligando por cualquiera de las técnicas convencionales y pueden utilizarse para diagnóstico (por ejemplo diagnóstico por imagen de células tumorales).
En una forma de realización preferida, la molécula de antiligando es un antígeno (por ejemplo un antígeno específico de células, un antígeno específico de la enfermedad, un antígeno expresado específicamente sobre la superficie de células diana modificadas genéticamente, ...) y el resto de ligando es un anticuerpo, un fragmento o una unidad de reconocimiento mínima del mismo (es decir, un fragmento que presenta todavía una especificidad antigénica) tal como los descritos con detalle en los manuales de inmunología (véase por ejemplo Immunology, tercera edición 1993, Roitt, Brostoff y Male, ed. Gambli, Mosby). El resto de ligando puede ser un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales que se unirán a muchos de los antígenos son ya conocidos pero en cualquier caso, con las técnicas actuales en relación con la tecnología del anticuerpo monoclonal, pueden prepararse anticuerpos contra la mayoría de los antígenos. El resto de ligando puede formar parte de un anticuerpo (por ejemplo un fragmento Fab) o un fragmento de anticuerpo sintético (por ejemplo, ScFv).
Los anticuerpos monoclonales adecuados contra los antígenos seleccionados pueden prepararse por técnicas conocidas, por ejemplo las descritas en "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H. Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J. G. R. Hurrell (CRC Press, 1982). Los anticuerpos no humanos preparados de manera adecuada pueden "humanizarse" de maneras conocidas, por ejemplo insertando las zonas CDR de los anticuerpos de ratón en el armazón de los anticuerpos humanos. Además, como los dominios variables pesados (VH) y variables ligeros (VL) del anticuerpo están implicados en el reconocimiento del antígeno, los dominios variables de origen roedor pueden fusionarse con los dominios constantes de origen humano de modo que el anticuerpo resultante conserve la especificidad antigénica del anticuerpo original del roedor (Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855).
La especificidad antigénica de los anticuerpos es proporcionada por dominios variables que incluyen moléculas de tipo Fab (Better et al. (1988) Science 240, 1041); moléculas Fv (Skerra et al. (1988) Science 240, 1038); moléculas ScFv en las que los dominios acompañantes VH y VL pueden estar unidos por un oligopéptido flexible (Bird et al. (1988) Science 242, 423; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) y dAbs que comprende dominios V aislados (Ward et al. (1989) Nature 341, 544). Un estudio general de las técnicas implicadas en la síntesis de fragmentos de anticuerpo que conservan sus zonas de fijación específicas se encuentra en Winter y Milstein (1991) Nature 349, 293-299.
Según una forma de realización ventajosa, el resto de ligando se selecciona de entre fragmentos de anticuerpo, mejor que entre anticuerpos completos. Se eliminan las funciones efectoras de anticuerpos completos, tal como la fijación del complemento. Los fragmentos de anticuerpo ScFv y dAb pueden expresarse como funciones con otros polipéptidos. Las unidades de reconocimiento mínimo pueden obtenerse a partir de la secuencia de una o más de las zonas determinantes de complementariedad (CDR) del fragmento Fv. Los anticuerpos completos y los fragmentos de F(ab')2 son "bivalentes". "Bivalente" significa que dichos anticuerpos y los fragmentos F(ab')2 presentan dos zonas de combinación del antígeno. En cambio, los fragmentos Fab, Fv, ScFv, dAB y las unidades de reconocimiento mínimo son monovalentes, teniendo solamente uno de los puntos de combinación del antígeno.
En otra forma de realización, el resto de ligando forma parte por lo menos de un resto especificado implicado en la fijación del receptor a la superficie de la célula natural. Desde luego, dichos receptores naturales (por ejemplo receptores hormonales) pueden ser antígenos específicos de la célula diana y pueden ser reconocidos por restos de ligando que tienen la propiedad de alguno de los anticuerpos monoclonales, un ScFv, un dAb o una unidad de reconocimiento mínimo.
En una forma de realización preferida, el resto del ligando permite dirigir una célula infectada por virus y puede reconocer y de unirse a un componente vírico (por ejemplo la glucoproteína de la envoltura) o puede interferir con la biología el virus (por ejemplo introducción, réplica...). Por ejemplo, el direccionamiento de una célula infectada por VIH (virus de inmunodeficiencia humana) puede realizarse con un resto de ligando específico para un epítopo de la envoltura del VIH, tal como un resto de ligando procedente del anticuerpo 2F5 (Buchacher et al., 1992, Vaccines 92, 191-195) que reconoce un epítopo muy conservado de la glucoproteína gp41 de la transmembrana o con un resto de ligando que interfiere con el acoplamiento del VIH con su receptor CD4 celular (por ejemplo el dominio extracelular de la molécula de CD4).
En otra forma de realización preferida, el resto de ligando permite dirigir una célula tumoral y puede reconocer y unirse a una molécula relacionada con el estado tumoral, tal como un antígeno específico del tumor, una proteína celular expresada de forma diferenciada o sobreexpresada en células tumorales o un producto génico de un virus asociado al cáncer.
Los ejemplos de antígenos específicos del tumor incluyen pero no se limitan a MUC-1 relacionado con el cáncer de mama (Hareuveni et al., 1990, Eur. J. Biochem. 189, 475-486), los productos codificados por los genes mutados BRCA1 y BRCA2 relacionados con los cánceres de mama y de ovario (Miki et al., 1994, Science 226, 66-71; Futreal et al., 1994, Science 226, 120-122; Wooster et al., 1995, Nature 378, 789-792), APC relacionado con el cáncer de colon (Polakis, 1995, Curr. Opin. Genet. Dev. 5, 66-71), el antígeno específico de la próstata (PSA) relacionado con el cáncer de próstata, (Stamey et al., 1987, New England J. Medicamento. 317, 909), el antígeno embrionario del carcinoma (CEA) relacionado con los cánceres de colon (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748), la tirosinasa relacionada con los melanomas (Vile et al., 1993, Cancer Res. 53, 3860-3864), el receptor para la hormona estimulante de melanocitos (MSH) que se expresa en gran número en células de melanoma, ErbB-2 relacionada con los cánceres de mama y de páncreas (Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175) y la alfa-fotoproteína relacionada con los cánceres de hígado (Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465).
Un resto de ligando preferido en utilización en la presente invención es un fragmento de un anticuerpo que puede reconocer y unirse al antígeno MUC-1 y de este modo dirigir las células tumorales positivas MUC-1. Un resto de ligando más preferido es el fragmento scFv del anticuerpo monoclonal SM3 que reconoce la zona de repetición en tándem del antígeno MUC-1 (Burshell et al., 1987, Cancer Res. 47, 5476-5482; Girling et al., 1989, Int. J. Cancer 43, 1072-1076; Dokurno et al., 1998; J. Mol. Biol. 284, 713-728).
Los ejemplos de proteínas celulares expresadas de manera diferenciada o sobreexpresadas en células tumorales incluyen pero no se limitan al receptor para la interleucina 2 (IL-2) sobreexpresado en algunos tumores linfoides, al GRP (péptido de liberación de gastrina) sobreexpresado en células de carcinoma pulmonar, tumores de páncreas, próstata y estómago (Michael et al. 1995, Gene Therapy 2, 660-668), al receptor del TNF (factor de necrosis tumoral), a los receptores del factor de crecimiento epidérmico, al receptor Fas, al receptor CD40, al receptor CD30, al receptor CD27, a OX-40, a las integrinas de Vv (Brooks et al., 1994, Science 264, 569) y a los receptores de determinados factores de crecimiento angiógenos (Hanahan, 1997, Science 277, 48). Basándose en estas indicaciones, dentro del alcance de los expertos en la materia está el definir un resto de ligando apropiado que puede reconocer y unirse a dichas proteínas. Para ilustrar, IL-2 es un resto de ligando adecuado para unirse al receptor de IL-2.
Los productos génicos adecuados de virus asociados al cáncer incluyen pero no se limitan a los polipéptidos precoces E6 y E7 del virus del papiloma humano (VPH) así como los polipéptidos tardíos L1 y L2 (documentos EP 0 462 187, US nº 5.744.133 y nº WO 98/04705) que se expresan en el cáncer cervical y el antígeno EBNA-1 del virus de Epstein-Barr (EBV) asociado a los linfomas de Burkitt (Evans et al., 1997, Gene Therapy 4, 264-267).
Todavía en otra forma de realización preferida, el resto de ligando permite dirigir moléculas específicas para el tejido. Por ejemplo, los restos de ligando adecuados para dirigir células hepáticas incluyen pero no se limitan a los derivados de la ApoB (apolipoproteína) que pueden unirse al receptor LDL, la alfa-2-macroglobulina que puede unirse al receptor LPR, la glucoproteína del ácido alfa-1 que puede unirse al receptor de asialoproteína y la transferrina que puede unirse al receptor de transferrina. Un resto del ligando para dirigir las células endoteliales activadas puede derivarse del antígeno sialil-Lewis-X (que puede unirse a ELAM-1), de VLA-4 (que puede unirse al receptor de VCAM-1) o de LFA-1 (que puede unirse al receptor de ICAM-1). Un resto de ligando derivado de CD34 es útil para dirigir las células originales hematopoyéticas mediante fijación al receptor CD34. Un resto de ligando derivado de ICAM-1 es más deseado para dirigir linfocitos mediante fijación al receptor LFA-1. Por último, el direccionamiento de los linfocitos T colaboradores puede utilizar un resto de ligando derivado de gp-120 del VIH o un antígeno MCH de clase II que puede unirse al receptor CD4.
Los expertos en la materia apreciarán que los restos de ligando que son polipéptidos puedan prepararse de manera conveniente utilizando técnicas de ADN recombinante. El resto de ligando puede fusionarse con una proteína en la superficie de la partícula de virus como se dio a conocer anteriormente o pueden sintetizarse independientemente, por ejemplo, por síntesis de novo o por expresión del fragmento de ADN apropiado en células eucarióticas así como procarióticas acopladas a continuación a la partícula de virus como se da a conocer a continuación. Se conocen las secuencias de ácido nucleico que codifican muchos de los restos de ligando, por ejemplo aquellas para las hormonas peptídicas, factores de crecimiento, citocinas y similares y pueden encontrarse fácilmente por referencia a las bases de datos de secuencias nucleotídicas accesibles al público tal como EMBL y GenBank. Una vez conocida la secuencia nucleotídica resulta evidente para el experto en la materia cómo preparar el ADN que codifica el resto de ligando seleccionado utilizando, por ejemplo, técnicas de síntesis de ADN químicas o utilizando la reacción en cadena de la polimerasa para ampliar el ADN requerido del ADN genómico o del ADNc específico para el tejido. Muchos ADNc que codifican hormonas peptídicas, factores de crecimiento, todos o parte de los anticuerpos, citocinas y similares, todos los cuales pueden ser útiles como restos de ligando, están generalmente disponibles en el mercado.
Por "células diana", se hace referencia a las células que la partícula poxvírica modificada de la invención puede infectar preferentemente. Dependiendo de la naturaleza del resto de ligando y/o de la molécula antiligando, las "células diana" pueden designar un único tipo de célula o grupo de tipos diferentes de células que tienen como característica común en su superficie molécula(s) antiligando reconocida por el/los resto(s) de ligando presente(s) en partículas poxvíricas de la invención. Para la invención, una célula diana está constituida por cualquier célula de mamífero (preferentemente células humanas) que pueden infectarse con una partícula poxvírica según la presente invención. La célula puede ser una célula primaria, una célula transformada o una célula de tumor de cualquier origen. Las células diana adecuadas incluyen pero no se limitan a las células hematopoyéticas (células madre multipotentes, leucocitos, linfocitos, monocitos, macrófagos, células dendríticas y similares), células musculares (células satélite, monocitos, mioblastos, del esqueleto o células del músculo liso, células del corazón), células pulmonares, células traqueales, células hepáticas, células epiteliales, células endoteliales o fibroblastos.
Por "resto de ligando (o alternativamente, molécula antiligando) está situado en la superficie de la partícula poxvírica (o alternativamente, de las células diana)", se hace referencia a que dicho resto de ligando (o dicha molécula antiligando) es accesible en la superficie de la partícula poxvírica (o de las células diana) para unirse con su molécula antiligando (o respectivamente, resto de ligando) cuando dicha partícula poxvírica se pone en contacto con dichas células diana. Esta accesibilidad puede medirse in vitro sin experimentación excesiva utilizando los procedimientos dados a conocer extensamente en la bibliografía.
La partícula poxvírica de la presente invención puede obtenerse a partir de cualquier miembro de la familia de poxvirus, en particular del virus de la vacuna, de la viruela del canario, viruela aviar, viruela vacuna, entomoviruela, viruela del mono, viruela porcina o viruela del pingüino. Preferentemente, es una partícula de virus de vacuna de la cepa de Copenhague, Wyeth o modificada de Ankara (MVA). De manera general, numerosas publicaciones se refieren a la secuencia y biología de las cepas de poxvirus y poxvíricas mencionadas anteriormente. Además, están disponibles en colecciones reconocidas tales como ATCC (viruela aviar, ATCC VR-251, viruela del mono ATCC VR-267, viruela porcina ATCC VR-363, viruela del canario ATCC VR-111, viruela vacuna ATCC VR-302) o ICTV (Canberra, Australia) (virus de Copenhague código 58.1.1.0.001; número de registro en el GenBank M35027).
La partícula poxvírica de la invención puede estar en forma IMV o EEV. En una forma de realización preferida, es una partícula IMV. Como se mencionó anteriormente, una partícula IMV comprende el núcleo vírico que incluye el genoma vírico rodeado por una envoltura de lípidos monocapa con polipéptidos víricos presentes en su superficie incluyendo los productos codificados por los genes A27L (proteína p14), L1R, A14L, A17L (proteína p21) D8L, A9L, E10R y H3L. El término "EEV" se refiere a una partícula de IMV rodeada por una envoltura de lípido bicapa adicional que expone en su superficie celular así como polipéptidos víricos que incluyen los productos codificados por los genes B5R, A34R y HA.
En una forma de realización ventajosa, el genoma poxvírico puede ser insuficiente en por lo menos un gen implicado en la producción de partículas EEV, y preferentemente, es insuficiente en el gen F13L (que codifica la proteína p37). Ha sido demostrado por Borrego et al. (1999, J. Gen. Virol. 80, 425-432) que la eliminación del gen F13L produce un defecto grave en el proceso de envoltura de EEV, aunque se producen niveles normales de IMV. Por consiguiente, alternando el gen F13L poxvírico es posible aumentar la producción de IMV. Dicho gen F13L puede alterarse por eliminación, mutación o inserción completa o parcial de cualquier secuencia dentro de la secuencia de codificación o el activador. Opcionalmente, el genoma poxvírico puede también alterarse en por lo menos un gen cuyo producto está implicado en la interacción con el receptor celular natural que media en la absorción del poxvirus (por ejemplo, sulfato de heparán o sulfato de condroitina). Estas técnicas de alteración génica son bien conocidas en la materia y están ilustradas en Borrego et al., 1999 (anteriormente).
La nomenclatura génica utilizada en la presente memoria es la de la cepa de la vacuna de Copenhague y se utiliza también para los genes homólogos de otros poxvirus (por ejemplo MVA) a menos que se indique de otra manera. Sin embargo, la nomenclatura génica es diferente según la cepa de viruela. Para información, puede encontrarse correspondencia entre los genes de Copenhague y MVA en la Tabla I de Antoine et al. (1998, Virol. 244, 365-396). Por ejemplo, el gen A27L de Copenhague se denomina 138L en MVA, codificando ambos genes una proteína homóloga p14-kDa que presenta funciones similares y localización en la superficie del IMV.
Según la invención, las partículas poxvíricas están acopladas operativamente con un resto de ligando heterólogo en utilización en la invención. "Acopladas operativamente" significa que dicha partícula y resto de ligando están en una relación que les permite funcionar de la manera deseada (es decir, el resto de ligando activa la especificidad de infección dirigida de la partícula poxvírica a la célula deseada). El acoplamiento puede hacerse por diferentes medios que son bien conocidos por los expertos en la materia incluyendo los medios covalente, no covalente o genético.
El acoplamiento covalente de los restos de ligando a la superficie de la partícula poxvírica puede ser realizada directamente por grupos funcionales reactivos o indirectamente por un grupo espaciador u otro resto activador. En particular, el acoplamiento puede realizarse con reactivos de reticulación (i) homobifuncionales o (ii) heterobifuncionales, con (iii) carbodiimidas, (iv) por aminación reductora o (vi) por activación de carboxilatos (véase por ejemplo Bioconjugate techniques 1996; ed. G. Hermanson; Academic Press).
Los enlazadores cruzados homobifuncionales incluyendo el glutaraldehído y bis-imidoéster tal como DMS (suberimidato de dimetilo) pueden utilizarse para acoplar grupos amino del resto del ligando a estructuras lipídicas (por ejemplo de la envoltura del IMV) que contienen diacilaminas.
En la presente invención pueden utilizarse muchos enlazadores heterobifuncionales cruzados, en particular los que presentan ambos grupos reactivos amínicos y reactivos de sulfhidrilo, reactivos con carbonilo y grupos reactivos con sulfhidrilo y grupos reactivos con sulfhidrilo y enlazadores fotorreactivos. Los reticuladores heterobifuncionales adecuados se describen en Bioconjugate techniques (1996) 229-285; ed. G. Hermanson; Academic Press) y en el documento WO 99/40214. Los ejemplos de la primera categoría incluyen pero no se limitan a SPDP (propionato de N-succinimidil 3-(2-piridilditio)), SMBP (butirato de succinimidil-4-(p-maleimidofenil)), SMPT (succinimidiloxicarbonil-\forall-metil-(\forall-2-piridilditio) tolueno), MBS (éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida), SIAB (N- (4-yodoacetil) aminobenzoato de succinimidilo), GMBS (éster de (maleimidobutiriloxi)succinimida), S1AX (hexonato de succinimidil-6-yodoacetil amino, SIAC (succinimidil-4-yodiacetil amino metil), NP1A (yodoacetato de p-nitrofenilo). La segunda categoría es útil para acoplar moléculas que contienen carbohidrato (por ejemplo glicoproteínas env, anticuerpos) a grupos reactivo sulfhidrilo. Los ejemplos incluyen a MPBH (hidrazida del ácido 4-(4-N maleimidofenil) butírico) y PDPH (4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxil-hidrazida (M_{2}C_{2}H e 3-2(2-piridilditio) propionil hidrazida). Como ejemplo de la tercera categoría, se puede citar ASIB (butirato de 1-(p-azidosalicilamido)-4-(yodoacetamido)). Otra alternativa incluye los reactivos que reaccionan con tiol descritos en Frisch et al. (Bioconjugate Chem. 7 (1996) 180-186).
El acoplamiento (iii) implica por ejemplo, grupos amino de diazilaminas presentes en estructuras lipídicas que pueden participar en la reacción de carbodiimida con grupos carboxilato del resto de ligando.
El acoplamiento (iv) puede realizarse, por ejemplo, por formación de imina seguida de reducción utilizando cianoborohidrato.
El acoplamiento (vi) puede implicar, por ejemplo, un éster de NHS derivado de un resto de ligando y grupos amínicos del poxvirus para producir enlaces amídicos estables.
Otro ejemplo utiliza un enlace maleimida-sulfhidrilo que conlleva un grupo sulfhidrilo y un grupo sulfhidrilo reactivo. Por ejemplo, SATA (S-acetiltioacetato de N-succinimidilo) puede utilizarse para introducir un grupo sulfhidrilo mientras que el sulfo SMCC (1-carboxilato de sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano) puede utilizarse para introducir un grupo maleimido que da como resultado un enlace covalente de tioéter.
El acoplamiento covalente puede realizarse también utilizando un polímero tal como el polietilenglicol (PEG) o sus derivados. Preferentemente, el plásmido tiene un peso molecular medio comprendido entre 200 y 20.000 Da. Por ejemplo, puede utilizarse tresil-MPEG para acoplar un grupo amino presente en los restos Lys (véase por ejemplo el documento WO 99/40214). Otro medio de conjugar dos socios vía PEG se describe en la bibliografía (en Bioconjugate techniques (1996) 606-618; ed. G. Hermanson; Academic Press y Frisch et al. Bioconjugate Chem. 7 (1996) 180-186).
El acoplamiento no covalente incluye interacciones electrostáticas, por ejemplo entre un resto de ligando catiónico y un poxvirus con carga negativa. Otra alternativa consiste en utilizar componentes con afinidad tales como la proteína A, anticuerpos biotina/avidina, que pueden asociarse de manera no covalente o por afinidad con ambos socios. Por ejemplo, el acoplamiento entre un resto de ligando peptídico y una partícula poxvírica puede utilizar anticuerpos biotinilados dirigidos contra un epítopo expuesto en superficie y anticuerpos marcados con estreptavidina dirigidos contra el resto de ligando peptídico según la técnica dada a conocer por Roux et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9079). Los anticuerpos bifuncionales dirigidos contra cada uno de los socios de acoplamiento son también adecuados para esta finalidad.
Se desea acoplamiento genético para acoplar un resto de ligando que es un polipéptido o un fragmento del mismo. Ventajosamente, un ácido nucleico que codifica dicho resto de ligando se fusiona con una secuencia de ácido nucleico vírico que codifica un polipéptido de poxvirus homólogo localizado en la superficie de la partícula poxvírica no modificada. Sin embargo, la invención se refiere además a un acoplamiento genético en el que un ácido nucleico que codifica un resto de ligando se fusiona con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo (por ejemplo un polipéptido de anclaje en la membrana) permitiendo localizar dicho resto de ligando en la superficie de la partícula poxvírica. Preferentemente, el ácido nucleico que codifica el resto de ligando se fusiona en zonas del genoma vírico que no son esenciales para la integridad del poxvirus.
Según una primera alternativa, el acoplamiento genético produce un polipéptido híbrido en el que por lo menos una parte del polipéptido poxvírico homólogo expuesto en superficie se elimina y se reemplaza por el resto de ligando heterólogo en utilización en la presente invención. Según una segunda alternativa, el acoplamiento genético produce un polipéptido híbrido en el que el resto del polipéptido de ligando heterólogo en utilización en la presente invención se incorpora al polipéptido poxvírico homólogo expuesto en superficie. La fusión del polipéptido resultante del acoplamiento genético puede hacerse en cualquier posición, en el terminal N, en el terminal C o entre dos restos de aminoácidos del polipéptido vírico. Preferentemente, la zona de acoplamiento genético seleccionada (es decir, la zona del ácido nucleico vírico donde el resto de ligando que codifica la secuencia se inserta) no destruye el marco de lectura abierto correspondiente.
Cuando la partícula poxvírica de la invención es un IMV, los polipéptidos poxvíricos expuestos en superficie homólogos adecuados para estos acoplamientos genéticos incluyen pero no se limitan a los productos con expresión de los genes A27L (proteína p14), L1R, A14L, A17L (proteína p21), D8L, A9L, E10R y H3L. Según una forma de realización preferida, la secuencia nucleotídica que codifica el resto de ligando se fusiona con la secuencia del gen A27L de modo que dicho resto de ligando se sitúa por último en el terminal N de la p14. Preferentemente, dicho resto de ligando que codifica la secuencia 
\hbox{nucleotídica se
fusiona inmediatamente corriente abajo del  codón iniciador del gen
A27L.}
Cuando la partícula poxvírica de la invención es un EEV, polipéptidos poxvíricos homólogos expuestos en superficie adecuados para este acoplamiento genético incluyen pero no se limitan a los productos de expresión de los genes B5R, A34R y HA. Según una forma de realización preferida, la secuencia nucleotídica que codifica el resto de ligando se fusiona con una secuencia del gen B5R de modo que dicho resto de ligando se sitúa finalmente en el terminal N del producto de expresión correspondiente. Preferentemente, dicho resto de ligando que codifica la secuencia nucleotídica se fusiona independientemente corriente abajo del codón iniciador del gen B5R.
Según la presente invención, el resto de ligando y la partícula poxvírica pueden modificarse más para mejorar o estabilizar el acoplamiento. En particular, el resto de ligando puede presentar un resto espaciador en una de sus extremidades para facilitar su accesibilidad a las células diana. Además, la partícula poxvírica según la invención puede comprender uno o más restos de ligando que pueden o no combinarse uno o con otro, por ejemplo en una estructura tándem. Por ejemplo, cuando sea deseable aumentar la especificidad de la partícula poxvírica a las células diana específicas, puede presentar ventajas utilizar una combinación de restos de ligando que pueden reconocer y unirse a dichas células diana.
Según los objetivos de la presente invención, el resto de ligando puede comprender un polipéptido señal que facilita su inserción en la envoltura de la partícula poxvírica. Aunque la utilización de una secuencia hidrófoba que permite el anclaje en la membrana puede preverse, resulta preferido utilizar un péptido señal que permite la transposición a la red trans-Golgi. Dicho péptido puede aislarse o identificarse de una proteína naturalmente presente en el compartimento de Golgi (véase por ejemplo Mochamer y Rose, 1987, J. Cell Biol. 105, 1205-1214; Mochamer, 1993, Curr. Opin. Cell Biol. 5, 606-612; Muesch et al., 1990, Trends Biochem sci 15, 86-88). El péptido señal puede incluir una o varias modificaciones con respecto a la secuencia natural con la condición de que su función no se altere de manera significativa. Un péptido señal preferido en utilización en la presente invención se deriva de la glucoproteína TGN51 de la red trans-Golgi humana (Kain et al., 1997, J. Biol. Chem. 273, 981-988). Se incorpora preferentemente por acoplamiento genético en el terminal N del resto del ligando. Preferentemente el resto de ligando está genéticamente a un polipéptido vírico.
Aunque es posible obtener partículas poxvíricas vacías (denominadas también partículas pseudopoxvíricas) que presentan la propiedad de infección específica descrita anteriormente, según una forma de realización preferida, la partícula poxvírica de la invención comprende por lo menos un ácido nucleico de interés, particularmente un ácido nucleico recombinante que incluye por lo menos un gen terapéutico colocado bajo el control de los elementos que permiten su expresión en las células diana eucarióticas. Sin embargo, las partículas poxvíricas vacías, o las partículas pseudovíricas del poxvirus, de la invención pueden utilizarse en la formación de complejos con el ácido nucleico de interés para facilitar su absorción celular dirigida tal como se da a conocer en la patente US nº 5.928.944 y el documento WO 9521259.
La expresión "ácido nucleico" dentro de la presente invención pretende designar cualquier ácido nucleico posible, en particular ambas formas de ADN, ARN o un híbrido, monocatenarias o bicatenarias, lineales o circulares, naturales o sintéticas, modificadas o no (ver los documentos U.S. nº 5.525.711, U.S. nº 4.711.955 o EP-A 302 175 para ejemplos de modificación). Puede ser, entre otros, un ADN genómico, un ARN genómico, un ADNc, un ARNm, un ARN complementario, un ARN ribosómico, un ribozima, un ARN de transferencia o un ADN que codifica dichos ARN. El ácido nucleico puede estar en forma de un plásmido o ácido nucleico lineal que contiene por lo menos una secuencia expresable que puede generar un polipéptido, un ribozima, un ARN complementario u otra molécula de interés en la administración a una célula. El ácido nucleico puede también ser un oligonucleótido (es decir un ácido nucleico que tiene un tamaño corto inferior a 100 bp) que es administrado a la célula, por ejemplo, para funciones complementarias o de ribozima. Preferentemente, el ácido nucleico está en forma de un ADN genómico poxvírico.
Si el ácido nucleico contiene las informaciones genéticas apropiadas cuando se coloca en un medio adecuado para la expresión génica, su unidad de transcripción expresará de este modo el producto génico codificado. El nivel y especificidad celular de la expresión dependerá en medida significativa de la intensidad y origen del activador asociado y de la presencia y activación de un elemento potenciador asociado. De este modo en una forma de realización preferida, el elemento de control de transcripción incluye las secuencias activadoras/potenciadoras tal como el activador/potenciador de CMV. Sin embargo, los expertos en la materia apreciarán que resultan conocidas una variedad de otras secuencias activadoras y/o potenciadoras que pueden obtenerse de cualquier partícula vírica, procariótica, por ejemplo bacteriana o eucariótica, que constitutiva o regulable, que son adecuadas para la expresión en las células eucarióticas y particularmente en las células diana. Más exactamente, estas informaciones genéticas necesarias para la expresión por una célula diana comprenden todos los elementos requeridos para la transcripción de dicho ADN en el ARNm y, si es necesario, para la traducción del ARNm en polipéptidos. Los activadores de la transcripción adecuados para su utilización en varios sistemas vertebrados están ampliamente descritos en la bibliografía. Por ejemplo, los activadores adecuados incluyen activadores víricos como RSV, MPSV, SV40, CMV o 7,5 k, el activador de la vacuna, activadores inducibles, etc. Los activadores preferidos se aíslan del virus de la vacuna por ejemplo virus 7,5 K, H5R, TK, p28, p11 o K1L de la vacuna. Alternativamente, se puede utilizar un activador sintético tales como los descritos en Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23, 1094-1097), Hammond et al. (1997, J. Virological Methods 66, 135-138) y Kumar y Boyle (1990, Virology 179, 151-158) así como activadores híbridos entre los activadores del poxvirus precoz y tardío.
El ácido nucleico puede incluir además elementos funcionales adicionales, tal como secuencias de intrón, secuencias de direccionamiento, secuencias de transporte, señal de secreción, señal de localización nuclear, IRES, secuencias de terminación de la transcripción de poli A, secuencias principales tripartitas, secuencias implicadas en la replicación o integración. Dichas secuencias han sido descritas en la bibliografía y pueden ser obtenidas fácilmente por los expertos en la materia.
En una forma de realización preferida, el ácido nucleico de interés contiene por lo menos una secuencia de interés que codifica un producto génico que es una molécula terapéutica (es decir, un gen terapéutico). Una "molécula terapéutica" es la que presenta una actividad farmacológica o protectora cuando se administra de manera apropiada a un paciente, especialmente a un paciente que padece una enfermedad o un cuadro clínico o que debería protegerse contra esta enfermedad o dolencia. Dicha actividad farmacológica o protectora es la que cabe esperar que esté relacionada con un efecto beneficioso en el transcurso o un síntoma de dicha enfermedad o dicha dolencia. Cuando el experto selecciona en el transcurso de la presente invención un gen que codifica una molécula terapéutica, generalmente se refiere a su elección para los resultados previamente obtenidos y pueden esperarse de manera razonable, sin excesiva experimentación aparte de la puesta en práctica de la invención tal como se reivindica, para obtener dicha propiedad farmacológica. Según la invención, la secuencia de interés puede ser homóloga o heteróloga a las células diana en las que se introduce. De manera ventajosa dicha secuencia de interés codifica todo o parte de un polipéptido, especialmente un polipéptido terapéutico o profiláctico que proporciona una propiedad terapéutica o profiláctica. Un polipéptido se entiende que es cualquier producto de traducción de un polinucleótido independientemente del tamaño, y de si está glucosilado o no, e incluye péptidos y proteínas. Los polipéptidos terapéuticos incluyen como ejemplo principal los polipéptidos que pueden compensar de proteínas defectuosas o deficientes en un organismo animal o humano, o aquellos que actúan mediante efectos tóxicos para limitar o eliminar las células nocivas en el cuerpo. Pueden también proporcionar inmunidad a polipéptidos que actúan como antígeno endógeno para provocar una respuesta humoral o celular o ambas.
Los ejemplos de polipéptidos codificados por un gen terapéutico incluyen los genes que codifican una citocina (interferón alfa, beta o gamma, interleucina, en particular IL-2, IL-6, IL-10 o IL-12, un factor de necrosis tumoral (TNF), un factor estimulante de colonias GM-CSF, C-CSF, M-CSF...), un polipéptido inmunoestimulante (B7.1, B7.2 y similares), un factor de coagulación (FVIII, FIX...), un factor de crecimiento (factor de crecimiento transformante TGF, factor de crecimiento de fibroblastos FGF y similares), una enzima (ureasa, renina, trombina, metaloproteinasa, óxido nítrico sintasa NOS, SOD, catalasa...), un inhibidor enzimático (antitripsina alfa1, antitrombina III, inhibidor de proteasa vírico, inhibidor PAI-1 activador de plasminógeno), la proteína del CFTR (regulador de conductancia de la transmembrana de fibrosis cística), insulina, distrofina, un antígeno MHC de clase I o II, un polipéptido que puede modular/regular la expresión de genes celulares, un polipéptido que puede inhibir una infección bacteriana, parasítica o vírica o su desarrollo (polipéptidos antigénicos, epítopos antigénicos, variantes transdominantes que inhiben la acción de una proteína natural por competencia...), un activador o inhibidor de apoptosis (Bax, Bcl2, BclX...), un agente citoestático (p21, p 16, Rb...), una alipoproteína (ApoAI, ApoAIV, ApoE...), un inhibidor de angiogénesis (angiostatina, endostatina...), un polipéptido angiogénico (familia de factores de crecimiento endoteliales vasculares VEGF, FGF, familia CCN que incluye CTGF, Cyr61 y Nov), un antioxidante con radical de oxígeno, un polipéptido que tiene un efecto antitumoral, un anticuerpo, una toxina, una inmunotoxina y un marcador (beta-galactosidasa, luciferasa...) o cualesquiera otros genes de interés que son conocidos en la técnica resultar de utilidad para el tratamiento o prevención de un estado clínico.
En vista del tratamiento de una disfunción hereditaria, se puede utilizar un alelo funcional de un gen defectuoso, por ejemplo un gen que codifica el factor VIII o IX en el contexto de la hemofilia A o B, distrofina (o minidistrofina) en el contexto de las miopatías, insulina en el contexto de la diabetes, CFTR en el contexto de la fibrosis quística.
Los genes antitumorales adecuados incluyen pero no se limitan a los que codifican los genes supresores del tumor (por ejemplo Rb, p53, DCC, NF-1, tumor de Wilm, NM23, BRUSH-1, p16, p21, p56, p73 así como sus mutantes respectivos), productos génicos suicidas, anticuerpos, polipéptidos que inhiben la división celular o señales de transducción.
En una forma de realización preferida, el gen terapéutico es un gen suicida que codifica un producto de expresión que puede transformar una sustancia inactiva (profármaco) en una sustancia citotóxica, dando lugar de este modo a la muerte celular. El gen que codifica el VSH-1 de TK constituye el prototipo de la familia del gen suicida (Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028; Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552). Aunque el polipéptido TK no es tóxico como tal, cataliza la transformación de análogos nucleosídicos (profármaco) tal como aciclovir o ganciclovir. Los nucleósidos transformados se incorporan en las cadenas de ADN que están en proceso de alargamiento, producen la interrupción de dicho alargamiento y por consiguiente la inhibición de la división celular. Un gran número de combinaciones gen suicida/profármaco resultan actualmente disponibles. Las que pueden mencionarse más específicamente son el citocromo p450 de rata y la ciclofosforamida (Wei et al., 1994, Human Gene Ther. 5, 969-978), la purina nucleósido fosforilasa de Escherichia coli (E. coli) y la 6-metilpurina desorribonucleósido (Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 223-238), la guanina fosforribosil transferasa de E. coli y la 6-tioxantina (Mzoz et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 589-595). Sin embargo, en una forma de realización más preferida, la partícula poxvírica de la invención comprende un gen suicida que codifica un polipéptido que tiene actividad de una citosina desaminasa (CDasa) o una uracil fosforribosil transferasa (UPRTasa) o ambas actividades de CDasa y UPRTasa, que pueden utilizarse con el profármaco 5-fluorocitosina (5-FC). La utilización de una combinación de genes suicidas, por ejemplo que codifican polipéptidos que tienen actividades de CDasa y UPRTasa, pueden también preverse en el contexto de la invención.
Se han demostrado actividades de CDasa y UPRTasa en procariotas y eucariotas inferiores, pero no están presentes en los mamíferos. La CDasa está normalmente implicada en la vía metabólica de la pirimidina mediante la cual la citosina exógena se transforma en uracilo por medio de una desaminación hidrolítica, mientras que la UPRTasa transforma el uracilo en UMP. Sin embargo, la CDasa también desamina un análogo de citosina, 5-FC, formando de este modo el 5-fluorouracilo (5-FU), que es muy citotóxico cuando se convierte en 5-fluoro-UMP (5-FUMP) por acción de la UPRTasa.
Los genes adecuados que codifican la CDasa incluyen pero no se limitan al gen FCY1 de Saccharomyces cerevisiae (Erbs et al., 1997, Curr. Genet. 31, 1-6; documento WO 93/01281) y el gen codA de E. coli (documento EP 402 108). Los genes adecuados que codifican a la UPRTasa incluyen pero no se limitan a los de E. coli (gen upp; Anderson et al., 1992, Eur. J. Biochem. 204, 51-56), Lactococcus lactis (Martinussen y Hammer, 1994, J. Bacteriol. 176, 6457-6463), Mycobacterium bovis (Kim et al., 1997, Biochem. Mol. Biol. Int. 41, 1117-1124), Bacillus subtilis (Martinussen et al., 1995, J. Bacteriol. 177, 271-274) y Saccharomyces cerevisiae (gen FUR-1; Kern et al., 1990, Gene 88, 149-157). Preferentemente el gen que codifica a la Cdasa se obtiene a partir del gen FCY1 y el gen que codifica a la UPRTasa se obtiene a partir del gen FUR-1.
La presente invención también comprende la utilización de genes suicidas mutantes, modificados por adición, eliminación y/o sustitución de uno o varios nucleótidos que proporcionan que se conserve la actividad citotóxica del producto génico. Un determinado número de mutantes de CDasa y UPRTasa se ha descrito en la bibliografía incluyendo una proteína de fusión que codifica un tratamiento enzimático con dos dominios ambas actividades de CDasa y UPRTasa (documento WO 96/16183) así como un mutante de la UPRTasa codificado por el gen FUR-1 que tiene los primeros 35 restos eliminados (mutante FCU-1 dado a conocer en el documento WO 99/54481).
Como se mencionó anteriormente, los genes terapéuticos debe entenderse también que incluyen secuencias complementarias y genes que codifican el ribozima que pueden unirse y destruir ARN de los genes reguladores del crecimiento que actúan de manera positiva seleccionados, tales como los oncogenes y los protooncogenes (c-myc, c-fos, c-jun, c-myb, c-ras, Kc y JE).
El ácido nucleico incorporado en la partícula poxvírica de la presente invención puede comprender uno o más gen(es) terapéutico(s). A este respecto, presenta ventajas la combinación de genes que codifican un producto génico suicida y un gen de citocina (por ejemplo, interferones \alpha, \exists o \gamma, interleucina, seleccionadas preferentemente entre IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 o IL-12, factores TNF, GM-CSF, C-CSF, M-CSF...), un gen inmunoestimulante (por ejemplo B7.1, B7.2, ICAM) o un gen de quimiocina (por ejemplo MIP, RANTES, MCP 1, ...). La expresión génica diferente puede controlarse mediante un activador único (casete policistrónico) o mediante activadores independientes. Además, pueden insertarse en un único punto o en varios puntos a lo largo del ácido nucleico ya sea en la misma o direcciones opuestas.
En otra forma de realización, la presente invención se refiere además a un vector que comprende por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica una proteína híbrida que comprende (i) por lo menos un resto de ligando heterólogo como se describió anteriormente, y (ii) todo o parte de un polipéptido vírico homólogo localizado de forma natural en la superficie de una partícula poxvírica como se describió anteriormente. Desde luego, la secuencia nucleotídica se coloca bajo el control de elementos que son necesarios para su expresión. La selección del vector según la invención es amplia y accesible para los expertos en la materia. El vector puede ser un plásmido, o un vector vírico procedente de cualquier virus animal, especialmente un adenovirus, un retrovirus, un AAV (virus asociado a adenovirus) o un poxvirus. Según una forma de realización preferida, el vector de la invención es un vector poxvírico (es decir, un ADN del genoma poxvírico, especialmente un ADN del genoma VV o MVA). El término "parte" como se utiliza en la presente memoria se refiere a un fragmento del polipéptido vírico que permite la exposición del resto del ligando en la superficie de un vector vírico. Además, un vector según la presente invención puede incluir también por lo menos una secuencia nucleotídica de interés.
La técnica básica para insertar en un genoma vírico las secuencias de interés y los elementos asociados requeridos para la expresión se describe en numerosos documentos accesibles para el experto en la materia (Piccini et al., 1987, Methods of Enzymology 153, 545-563; documentos US nº 4.769.330; nº 4.772.848; nº 4.603.112; nº 5.100.587 y nº 5.179.993). Esta técnica se refiere a los episodios de recombinación homólogos entre secuencias solapantes en un genoma vírico (es decir, el punto de inserción deseado) y un plásmido que comprende la secuencia de interés.
El punto de inserción dentro del genoma poxvírico es preferentemente un locus no esencial, con el fin de que el poxvirus recombinante permanezca viable e infeccioso. Las zonas no esenciales adecuadas incluyen pero no se limitan a las zonas intergénicas no codificantes o a cualquier gen para el que la activación o eliminación no afecta de manera significativa el crecimiento vírico, la replicación o la infección. Se puede también prever la inserción en un locus vírico esencial con la condición de la función defectuosa se suministre en trans durante la producción de las partículas víricas por ejemplo utilizando una estirpe celular cooperadora que lleva las secuencias complementarias correspondientes a las eliminadas en el genoma poxvírico.
Por ejemplo, al utilizar el virus de la vacuna de Copenhague, se seleccionará preferentemente un secuencia de inserción localizada dentro del gen de la timidina cinasa (tk) (Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3411-3415; Weir et al., 1983, J. Virol. 46, 530-537). Sin embargo, otras secuencias de inserción son también apropiadas, tales como en el gen de la hemoaglutinina (Guo et al., 1989, J. Virol. 63, 4189-4198), en el locus K1L, en el gen u (Zhou et al., 1990, J. Gen. Virol. 71, 2185-2190) o en el extremo izquierdo del gen del virus de la vacuna en el que se ha descrito en la bibliografía una variedad de eliminaciones espontáneas o modificadas genéticamente (Altenburger et al., 1989, Archives Virol. 105, 15-27; Moss et al., 1981, J. Virol. 40, 387-395; Panicali et al., 1981, J. Virol. 37, 1000-1010; Perkus et al., 1989, J. Virol. 63, 3829-3836; Perkus et al., 1990, Virol. 179, 276-286; Perkus et al., 1991, Virol. 180, 406-410).
Al utilizar MVA, se seleccionará preferentemente una secuencia de inserción localizada dentro de cualquiera de las deleciones I a VII identificadas, y preferentemente en la eliminación II o III (Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032-1040) así como dentro del locus D4R.
Cuando se utiliza el poxvirus aviar, aunque la inserción dentro del gen de la timidina cinasa puede considerarse, la secuencia de interés se introduce preferentemente en una zona intergénica no codificante, por ejemplo, la zona intergénica situada entre los ORF 7 y 9 del fragmento HindIII de 1,3 kb del genoma del virus de la viruela aviar (véase por ejemplo el documento EP 314 569 y U.S. nº 5.180.675).
La presente invención proporciona además un procedimiento de producción de una partícula poxvírica según la invención, que comprende las etapas siguientes:
a)
obtener una semilla de dicha partícula poxvírica,
b)
preparar un cultivo de células permisivas,
c)
infectar dicho cultivo celular con dicha semilla de partículas poxvíricas,
d)
cultivar dichas células infectadas durante un periodo de tiempo adecuado,
e)
recuperar las partículas poxvíricas producidas a partir del cultivo celular y/o del sobrenadante del cultivo, y
f)
opcionalmente, purificar las partículas poxvíricas recuperadas.
Según una forma de realización especial, es posible combinar la etapa a) y c). En este caso, el procedimiento de la invención comprende las etapas siguientes:
a)
preparar un cultivo de células permisivas,
b)
infectar dicho cultivo celular con una partícula poxvírica natural y transfectar dicha célula con un plásmido que comprende una secuencia de interés flanqueada por la secuencias solapantes capaz de recombinación homóloga con el genoma del ADN de dicho poxvirus,
c)
cultivar dichas células durante un periodo de tiempo apropiado,
d)
recuperar las partículas del poxvíricas producidas a partir del cultivo celular y/o del sobrenadante del cultivo, y
e)
opcionalmente, purificar las partículas poxvíricas recuperadas.
En una forma de realización preferida, las "células permisivas" son fibroblastos embrionarios de pollo primarios (CEF) preparados a partir de embriones de pollo obtenidos de huevos fecundados. Según la forma de realización específica en la que el genoma del poxvirus de la partícula es defectuoso para una o más funciones víricas (por ejemplo defectuoso en por lo menos un gen implicado en la producción de partículas EEV) puede presentar ventajas al utilizar las células cooperadoras que proporcionan in trans la función defectuosa. En particular, los poxvirus defectuosos para la función codificada por el gen F13L se cultivan preferentemente en una estirpe celular que expresa el producto de expresión F13L. Dicha estirpe celular puede generarse por transfección de un vector apropiado que expresa el polipéptido F13L como se describe en Borrego et al. (1999, J. Gen. Virol. 80, 425-432). Según una forma de realización ventajosa, el aislamiento y la propagación de una partícula poxvírica de la presente invención puede realizarse en una estirpe celular diana que presenta en su superficie la molécula antiligando reconocida por el resto de ligando de la presente invención. Esto permite minimizar la posible contaminación con el genoma natural. Por ejemplo, una partícula poxvírica que tiene un resto de ligando específico para el polipéptido MUC-1 se propaga preferentemente en las células diana que expresan a MUC-1. La construcción de dichas estirpes celulares que expresan en su superficie una molécula de antiligando está dentro del alcance del experto en la materia.
La "semilla de partícula poxvírica" se obtiene según técnicas habituales al final de los episodios de recombinación homólogos entre el genoma del poxvirus y el plásmido que incorpora la secuencia de interés. A este respecto, se puede mencionar por ejemplo el apartado Experimental de la presente memoria.
En el caso en que se requiera la transfección adicional de las células con un plásmido, pueden utilizarse varios métodos de transfección de células ampliamente utilizados (por ejemplo precipitación del ADN con calcio, electrotransfección,...) opcionalmente combinados con un glicerol que puede facilitar la absorción de plásmido. Además, puede incluirse una etapa de selección en la que el virus recombinante contiene un gen de selección (por ejemplo gen gpt de E. coli), por ejemplo, utilizando un medio de cultivo selectivo que contiene una mezcla de ácido micofenílico, xantina e hipoxantina en la etapa c).
Aunque las partículas víricas pueden recuperarse del sobrenadante del cultivo, también pueden recuperarse de las células. Uno de los procedimientos utilizados normalmente consiste en lisar las células por cualquier medio (químico, congelación/descongelación, choque osmótico, choque mecánico, tratamiento con ultrasonidos y similares). La partícula poxvírica de la invención puede aislarse por rondas consecutivas de purificación en placa y a continuación purificarse utilizando las técnicas de la materia (métodos cromatográficos, ultracentrifugación en cloruro de cesio o gradiente de sacarosa). Alternativamente, la afinidad entre el resto de ligando presentada en la superficie vírica y su antiligando puede utilizarse para purificar la partícula poxvírica de la presente invención. Por ejemplo, la purificación puede realizarse a) inmovilizando el antiligando mencionado sobre un soporte sólido, b) poniendo en contacto la precipitación vírica con el antiligando inmovilizado durante un periodo suficiente que permita la fijación específica entre el antiligando y el resto de ligando, c) descartando el material no unido, d) eluyendo el material unido y e) recuperando el material eluído. Dicha purificación puede presentar ventajas para reducir una eventual contaminación de las partículas poxvíricas de la invención con los poxvirus natural o cooperador.
El procedimiento de la invención puede utilizarse para producir partículas poxvíricas tanto IMV como EEV. Según una forma de realización preferida de la invención, el procedimiento incluye una etapa complementaria que permite la rotura de la envoltura adicional de EEV y la producción selectiva de IMV. Preferentemente, dicha etapa adicional consiste en una etapa de tratamiento con ultrasonidos o una etapa de solubilización en un detergente suave (por ejemplo Brij-58).
La invención se refiere también a una composición que comprende por lo menos una partícula poxvírica y/o por lo menos un vector según la invención. En un caso especial, la composición comprende dos o más partículas poxvíricas y/o dos o más vectores de la invención, en la que se diferencian cada una de la otra por (i) la naturaleza del resto de ligando heterólogo y/o (ii) la naturaleza del ácido nucleico de secuencia de interés y/o (iii) el origen poxvírico y/o (iv) la forma de la partícula (IMV/EEV). Esta composición puede estar en varias formas, por ejemplo, en forma sólida, líquida, en polvo, acuosa, liofilizada. En una forma de realización preferida, esta composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable, permitiendo su utilización en un procedimiento para el tratamiento terapéutico de seres humanos o animales. En este caso particular, el portador es preferentemente un vehículo o diluyente inyectable farmacéuticamente adecuado (para ejemplos, véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, 1980, Mack Publishing Co.). Dicho vehículo o diluyente es farmacéuticamente aceptable, es decir no es tóxico para un receptor a la dosis y concentración utilizadas. Es preferentemente isotónico, hipotónico o débilmente hipertónico y tiene una fuerza iónica relativamente baja, tal como la proporcionada por una solución de sacarosa. Además, puede contener algunos disolventes aplicables, vehículos líquidos acuosos o parcialmente acuosos que comprenden agua esterilizada, exenta de pirógenos, medio de dispersión, recubrimientos y equivalentes o diluyentes (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), emulsionantes, solubilizantes o adyuvantes. El pH de la preparación farmacéutica se ajusta de manera adecuada y se tampona con objeto de que sea útil en aplicaciones in vivo. Puede prepararse ya sea como solución o como una forma sólida (por ejemplo liofilizada) que puede ponerse en suspensión en una solución antes de su administración. Los ejemplos representativos de vehículos o diluyentes para una composición inyectable incluyen agua, soluciones salinas isotónicas que están preferentemente tamponadas a un pH fisiológico (tal como la solución salina tamponada con fosfato o la solución salina tamponada con Tris), manitol, dextrosa, glicerol y etanol, así como polipéptidos o proteínas tal como la albúmina de suero humano. Por ejemplo, dicha composición puede comprender 10 mg/ml de manitol, 1 mg/ml de HSA, Tris 20 mM pH 7,2 y NaCl 150 mM.
Una composición según la invención puede prepararse de manera convencional para la administración local, generalizada, oral, rectal o tópica. Dichas vías de administración incluyen pero no se limitan a las vías intergástrica, subcutánea, aerosol, instilación, inhalación, intracardíaca, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratumoral, intranasal, intrapulmonar o intratraqueal. La administración puede tener lugar en una sola dosis o una dosis repetida una o varias veces después de un determinado intervalo de tiempo. La vía de administración apropiada y la dosis varían según varios parámetros, por ejemplo, con la dolencia o enfermedad implicada, la necesidad de prevención o terapia, el estado al que ha evolucionado y se ha transferido el gen terapéutico. Como indicación, las partículas poxvíricas pueden formularse en forma de dosis de entre 10^{4} y 10^{14} pfu (unidades formadoras de placa), de manera ventajosa entre 10^{5} y 10^{13} pfu y preferentemente entre 10^{6} y 10^{12} pfu. El valor puede determinarse por técnicas convencionales. La dosis de vector están comprendidas 
\hbox{preferentemente entre 0,01 y 10 mg/kg, más
específicamente entre 0,1 y 2 mg/kg.}
Además, una composición según la presente invención puede incluir una o más sustancia(s) estabilizante(s), tal como lípidos (por ejemplo lípidos catiónicos, liposomas, lípidos como se describen en el documento WO 98/44143), inhibidores de nucleasa, polímeros, agentes quelantes con el fin de preservar su degradación dentro del cuerpo animal/humano.
En otra forma de realización, la presente invención proporciona la utilización de una partícula poxvírica o de un vector según la invención para la preparación de un fármaco destinado al tratamiento de un organismo humano o animal por terapia génica. Dentro del alcance de la presente invención, por "terapia génica" debe entenderse un procedimiento para introducir cualquier gen terapéutico en una célula. De este modo, también incluye la inmunoterapia que se refiere a la introducción de un epítopo potencialmente antigénico en una célula para provocar una respuesta inmunitaria que puede ser celular, humoral o ambas.
La utilización según la invención depende de las propiedades de direccionamiento del resto de ligando presentado en la superficie de la partícula poxvírica o expresado por el vector de la invención. Así, un resto de ligando que puede reconocer y unirse a una molécula presente en la superficie de la célula infectada con un agente patógeno (bacteria, virus o parásito) es apropiado para el tratamiento o prevención de cualquier dolencia o enfermedad producida por dicha infección. Un resto de ligando que se dirige al tumor es más deseado en el tratamiento o prevención de un cáncer. El término "cáncer" comprende algunas enfermedades cancerosas incluyendo los tumores difusos o localizados, la metástasis, los pólipos cancerosos y las lesiones preneoplásicas (por ejemplo las displasias) así como las enfermedades que proceden de la proliferación celular no necesitada. Se pueden mencionar más específicamente los cánceres de mama, cuello uterino (en particular, las provocadas por un papilomavirus), de próstata, pulmón, vejiga, hígado, colorrectal, páncreas, estómago, esófago, laringe, sistema nervioso central, sangre (linfomas, leucemia, etc.), melanomas y mastocitoma.
La invención proporciona además un procedimiento para el tratamiento de un organismo humano o animal, que comprende administrar a dicho organismo una cantidad terapéuticamente eficaz de una partícula poxvírica, de un vector o de una composición según la invención. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una dosis suficiente para el alivio de uno o más síntomas asociados normalmente a la enfermedad o dolencia que se desea tratar. Cuando se refiere a la utilización profiláctica, esta expresión significa una dosis suficiente para impedir o retardar el establecimiento de una enfermedad o dolencia.
El procedimiento de la presente invención puede utilizarse con fines preventivos y para las aplicaciones terapéuticas relativas a las enfermedades o dolencias listadas anteriormente. El presente procedimiento es particularmente útil para prevenir la creación de tumores o para invertir la existencia de tumores de cualquier tipo, utilizando un método similar al descrito en la presente memoria. Debe apreciares que el presente procedimiento puede realizarse por alguno de entre una variedad de métodos. De manera ventajosa, la partícula poxvírica, el vector o la composición de la invención pueden administrarse directamente in vivo por cualquier vía de administración convencional y fisiológicamente aceptable, por ejemplo por inyección intravenosa, en un tumor accesible, en los pulmones por medio de un aerosol o instilación, en el sistema vascular utilizando un catéter apropiado, etc. El método ex vivo puede adoptarse también que consiste en la extracción de células de un paciente (células de la médula ósea, linfocitos de la sangre periféricos, mioblastos y similares..), introduciendo la partícula poxvírica o el vector de la invención según las técnicas de la materia y readministrándolas al paciente.
En el caso del tratamiento in vivo según la invención, con el fin de mejorar la tasa de transfección, el paciente puede experimentar un tratamiento de eliminación de macrófago antes de la administración de las preparaciones farmacéuticas descritas anteriormente. Dicha técnica se describe en la bibliografía (referirse particularmente a Van Rooijen et al., 1997, TibTech, 15, 178-184).
Según la forma de realización preferida, cuando el procedimiento de la invención utiliza una partícula poxvírica recombinante que presenta las características de la invención y que expresa un gen suicida, puede presentar ventajas administrar además una cantidad farmacéuticamente aceptable de un profármaco que es específico para el producto génico suicida expresado. Las dos administraciones pueden realizarse simultánea o consecutivamente, pero preferentemente el profármaco se administra después de la partícula poxvírica de la invención. A título ilustrativo, es posible utilizar una dosis de profármaco de 50 a 500 mg/kg/día, prefiriéndose una dosis de 200 mg/kg/día. El profármaco se administra según la práctica habitual. Resulta preferida la vía oral. Es posible administrar una dosis única de profármaco o dosis que se repitan durante un tiempo suficientemente largo que permita al tóxico metabólico que se produzca dentro del organismo del hospedador o de la célula diana. Tal como se mencionó anteriormente, puede utilizarse el profármaco ganciclovir o aciclovir en combinación con el producto génico del HSV-1 de TK y 5-FC en combinación con el producto génico FCY1, FUR1 y/o FCU1.
Para ilustrar el método deseado para el tratamiento del tumor, se puede administrar en primer lugar una partícula poxvírica que expresa un gen suicida y que presenta en su superficie un resto de ligando que puede reconocer y unirse a un antígeno tumoral expresado por las células tumorales. Una vez infectadas, las células cancerosas expresarán al gen suicida. La destrucción de las células infectadas puede realizarse administrando el profármaco metabolizado por el producto génico suicida seleccionado. En los individuos en los que se desea la prevención o inversión del cáncer de mama positivo a MUC-1, se puede utilizar una partícula poxvírica que expresa a FCU-1 y que alberga en su superficie un ligando SM3 scFv que puede reconocer y unirse al antígeno tumoral MUC-1. La destrucción de las células infectadas positivas a MUC-1 puede conseguirse con más administración del profármaco 5-FC.
Además, una característica específica del procedimiento de la invención es que la partícula poxvírica de la invención puede producirse in vivo en el organismo tratado. A este respecto, se puede prever administrar al paciente una partícula poxvírica de IMV que no presenta en su superficie el grupo de ligando pero contiene un genoma poxvírico modificado genéticamente mediante la inserción de un ácido nucleico que codifica dicho resto de ligando en una secuencia que codifica un polipéptido localizado en la superficie de la partícula poxvírica de EEV (por ejemplo el gen B5R). Por consiguiente, en esta forma de realización especial, el genoma poxvírico recombinante que puede producir in vivo (es decir después de la administración al paciente) de partículas EEV según la presente invención mientras la forma IMV administrada presenta todavía las características del poxvirus natural. Dichas partículas IMV administradas que infectan las células del paciente de manera no específica (células no dirigidas), el genoma vírico se replicará en las células infectadas del hospedador y liberará partículas EEV que pueden infectar solamente las células diana.
La prevención o el tratamiento de una enfermedad o una dolencia puede realizarse utilizando el presente procedimiento solo o, si se desea, junto con los procedimientos actualmente disponibles (por ejemplo radiación, quimioterapia y cirugía).
La especificidad de la infección de las partículas poxvíricas de la invención está realmente relacionada con la especificidad de fijación del resto de ligando localizado en su superficie. Por consiguiente, dichas partículas poxvíricas pueden utilizarse en los procedimientos basados en la fijación específica entre dicho resto de ligando y una molécula antiligando. De este modo, la invención se refiere también a un procedimiento para detectar y/o separar y/o concentrar y/o purificar y/o analizar cualquier molécula de antiligando, o por extensión cualquier compuesto que comprenda dicha molécula de antiligando, presente en una muestra, en la que unas partículas poxvíricas según la invención (es decir que presentan en su superficie un resto de ligando heterólogo que puede unirse específicamente a dicha molécula) se utiliza para formar un complejo de fijación con dicha molécula de ligando, o dicho compuesto, si están presentes en la muestra.
La invención también se refiere a un reactivo para detectar y/o concentrar y/o separar y/o purificar y/o analizar en una muestra cualquier molécula de antiligando, o por extensión cualquier compuesto que incluya dicha molécula de antiligando, que comprende unas partículas poxvíricas según la presente invención, es decir presentando en su superficie un resto de ligando heterólogo que puede unirse específicamente a dicha molécula o compuesto.
La invención se refiere en particular a un procedimiento para detectar y/o concentrar y/o separar y/o purificar y/o analizar cualquier molécula de antiligando o por extensión cualquier compuesto que comprenda dicha molécula de antiligando en una muestra, incluyendo las etapas siguientes: dicha muestra se coloca en contacto con un reactivo según la invención en condiciones que permitan una reacción de fijación, a continuación cualquier complejo de fijación formado se separa, posiblemente se detecta y/o se cuantifica.
Más específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar y/o concentrar y/o separar y/o purificar y/o analizar cualquier molécula de antiligando o por extensión cualquier compuesto que comprenda dicha molécula de antiligando, presente en una muestra, utilizando un reactivo según la invención que comprende las etapas siguientes:
a)
inmovilizar dicho reactivo sobre un soporte sólido,
b)
poner en contacto dicha muestra con dicho reactivo inmovilizado durante un tiempo suficiente que permita la fijación específica de la molécula de antiligando, o un compuesto que comprenda la molécula de antiligando, con el resto de ligando heterólogo de dicho reactivo,
c)
descartar la muestra no ligada,
d)
eluir la molécula de antiligando, o el compuesto que comprende la molécula antiligando, retenido en la etapa b), y
e)
analizar dicha molécula antiligando, o el compuesto que comprende la molécula antiligando, eluido en la etapa d).
La expresión "soporte sólido" tal como se utiliza en la presente memoria está, sin limitación, en forma de portaobjetos de microvaloración, una hoja de aluminio, una columna, una lámina, un cono, un pocillo, una perla o cualquier otro sustrato apropiado de micro o micropartículas e incluye todos los materiales en los que puede inmovilizarse la partícula vírica de la invención. Este pueden ser materiales sintéticos que se modifiquen químicamente o de otro modo, especialmente polisacáridos, tales como los materiales celulósico, por ejemplo papel, derivados de celulosa tales como nitrocelulosa y acetato de celulosa o dextrano (BIAcore, Upsala, Suecia); polímeros tales como el cloruro de vinilo, polietileno, poliestireno, poliacrilato o copolímeros tales como propileno y polímero de cloruro de vinilo, polímero de cloruro de vinilo y acetato de vinilo; copolímeros a base de estireno; fibras naturales tales como algodón y fibras sintéticas tales como nilón.
Preferentemente, el "soporte sólido" es un polímero de poliestireno, un copolímero de butadieno/estireno o un copolímero de butadieno/estireno mezclado con uno o más polímeros o copolímeros seleccionados de entre poliestireno, estireno/acrilonitrilo o copolímeros de estireno/metacrilato de metilo, polipropilenos, policarbonatos y similares.
El reactivo (es decir el que comprende las partículas víricas de la invención) puede acoplarse al soporte sólido directa o indirectamente.
Utilizando el modo directo, son posibles dos métodos: bien por absorción del reactivo sobre el soporte sólido, es decir por enlaces no covalentes (principalmente de hidrógeno, Van der Walls o de tipo iónico) o por formación de enlaces covalentes entre el reactivo y el soporte. Indirectamente, es posible acoplar previamente un compuesto "antirreactivo" (por adsorción o covalencia) al sustrato, pudiendo dicho compuesto interactuar con el reactivo tal como para inmovilizar el sistema sobre el sustrato sólido. A título de ejemplo, puede mencionarse un anticuerpo, con la condición de que sea inmunológicamente reactivo con una parte de las partículas poxvíricas diferente de la implicada en la fijación a las moléculas de antiligando; un sistema ligando-receptor, por ejemplo injertando en las partículas poxvíricas una molécula tal como una vitamina, e inmovilizando en la fase sólida el receptor correspondiente (por ejemplo el sistema biotina-estreptavidina). El modo indirecto se entiende también que significa el injerto preliminar o la fusión por acoplamiento genético de una proteína, o un fragmento de esta proteína, o de un polipéptido, a un extremo de las proteínas de la partícula poxvírica, y la inmovilización de esta última sobre el soporte sólido por adsorción pasiva o enlace covalente de la proteína o del polipéptido injertado o fusionado.
En el contexto del procedimiento de la presente invención, la expresión "molécula antiligando, o por extensión cualquier compuesto que comprenda dicha molécula antiligando" se utiliza extensamente para designar un producto químico orgánico tal como un fármaco o un polipéptido que pueda estar contenido en una muestra o algunas células diana o definido previamente, y más en particular las células tumorales. Por ejemplo, puede designarse una molécula no natural que puede producirse como resultado de un procedimiento in vitro o de síntesis. Puede ser una molécula natural presente en una muestra celular o biológica (células cultivadas, célula, órganos o biopsia de tejido, fluidos corporales y similares), tales como anticuerpos, receptores celulares, receptores víricos y marcadores tumorales. Si se desea la muestra puede procesarse utilizando un procedimiento tal como HPLC, que puede proporcionar una fracción enriquecida en moléculas que tienen un intervalo definido de peso molecular, características hidrófilas o similares. Las condiciones de enriquecimiento pueden ser definidas por el experto en la materia dependiendo de la química de la molécula específica y de la técnica.
La etapa de elución puede realizarse utilizando algunas técnicas que permiten separar el resto de ligando unido, molécula antiligando. Estas técnicas están bien descritas en la bibliografía y se basan en las propiedades fisicoquímicas de dicho enlace. Por ejemplo, es posible variar las condiciones de pH o de fuerza iónica. Además es posible utilizar el compuesto de elución que puede competir con la fijación específica del ligando y la molécula.
Otro objetivo de la invención consiste en un kit para detectar la molécula antiligando, o por extensión cualquier compuesto que comprenda dicha molécula antiligando (por ejemplo células tumorales), incluyendo el reactivo descrito anteriormente, unido a un sustrato sólido que es compatible (es decir, no impide la fijación del resto de ligando con una molécula antiligando) con dicho reactivo.
Por último, las partículas poxvíricas según la presente invención, pueden identificarse utilizando el procedimiento siguiente. En primer lugar se proporciona un banco de partículas poxvíricas. Dicho banco de partículas poxvíricas se diseña para clonar restos de ligando polipéptido aleatorios y expresarlos en un plegamiento correcto en la superficie del poxvirus. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "banco" significa una colección de partículas poxvíricas que presenta en su superficie unos pocos o un gran número de restos de ligando diferentes, comprendidos entre aproximadamente diez a varios biliones. Preferentemente, el resto ligando es un fragmento monocatenario de un anticuerpo o un péptido. Un banco de partículas poxvíricas que expresa diversas poblaciones de ligandos en la superficie vírica puede prepararse tal como se describe para el banco de presentación del fago (documento WO 97/10507) o los vectores de ligadura directa de la vacuna (Merchlinsky et al., 1997, Virol. 238, 444-451). Alternativamente, se puede utilizar secuencias de ácido nucleico para los bancos de expresión (fragmentos genómicos, ADNc de órganos y tejidos seleccionados) o bancos aleatorios que expresan motivos peptídicos. Dichos bancos están descritos en la bibliografía o disponibles en el mercado (Invitrogene, referencia USA K1125-01; Clontech Laboratories Inc. referencia NL4000AA).
Preferentemente, como se describió anteriormente, la secuencia de ácido nucleico que codifica el resto de ligando polipéptido se clona en un gen poxvírico apropiado que codifica una proteína natural localizada en la superficie de la partícula poxvírica. En una forma de realización preferida, el resto de ligando de polipéptido se expresa como proteína de fusión con uno de los polipéptidos de la superficie de IMV o EEV. En una forma de realización más preferida, el resto de ligando del polipéptido se fusiona en el marco en el terminal N de la proteína p14 presente en la superficie del IMV o el producto génico B5R presente en la superficie del EEV.
A continuación, dicho banco de partículas poxvíricas se coloca en contacto con un reactivo inmovilizado consistente en una molécula antiligando identificada, o por extensión el compuesto identificado que comprende dicha molécula de antiligando (por ejemplo células tumorales que expresan MUC1). El contacto se realiza durante un periodo de tiempo suficiente que permita la fijación específica del resto de ligando presente en la superficie del banco de partículas poxvíricas con la molécula antiligando identificada presente en el reactivo inmovilizado. La fijación específica puede mejorarse por condiciones apropiadas de pH y osmolaridad. Preferentemente, el banco de partículas poxvíricas se coloca en una solución tamponante que tiene un peróxido comprendido entre aproximadamente 6 y aproximadamente 9,5 y, más preferentemente, entre aproximadamente 7 y aproximadamente 8,5. Además, pueden ser útiles varios procedimientos para impedir la fijación no específica, por ejemplo realizando una etapa de preadsorbión que utiliza un agente cualquiera útil para bloquear la fijación no específica (por ejemplo albúmina de suero, sulfato de dextrano y similares) antes de la etapa de puesta en contacto.
Las partículas sin ligar se eliminan y las partículas ligadas se eluyen. Las condiciones de inmovilización y elución del reactivo se llevan a cabo como se describió anteriormente. Las partículas poxvíricas del banco que han sido retenidas mediante fijación sobre el reactivo inmovilizado se analizan a continuación. Más específicamente, dicho análisis se realiza mediante la determinación de la secuencia del resto de ligando que codifica el ácido nucleico insertado en el genoma de las partículas poxvíricas aisladas. La especificidad de fijación del resto de ligando identificado en este procedimiento puede confirmarse fácilmente (i) utilizando células diana y células que no son diana, y controlando la propiedad infecciosa de las partículas poxvíricas que presentan dicho resto de ligando de acuerdo con los procedimientos dados a conocer en el apartado Experimental o (ii) preparando un reactivo según la invención, inmovilizándolo sobre un soporte sólido y efectuando un procedimiento para analizar las células diana y las células que no son diana tal como se describió anteriormente.
Estas y otras formas de realización se dan a conocer o resultan evidentes a partir de la descripción y los ejemplos de la presente invención y están comprendidas en los mismos. La bibliografía adicional que se refiere a cualquiera de los procedimientos, utilizaciones y compuestos que van a emplearse según la presente invención puede recuperarse de los bancos públicos, utilizando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo, puede utilizarse a base de datos pública "Medline" que está disponible en Internet, por ejemplo en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html.
Además, las bases de datos y direcciones, tales como http://www.ncbi.nlm.nih.gov, http://www.infobiogen.fr,
http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org, son conocidas por el experto en la materia y pueden también obtenerse utilizando, por ejemplo, http://www.lycos.com. Una panorámica de la información de la patente en biotecnología y un sondeo de las fuentes aplicables de la información de la patente útiles para la búsqueda retrospectiva y para el conocimiento actual se proporciona en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
La presente invención se refiere también a un procedimiento para la purificación de una partícula poxvírica de la invención procedente de una preparación vírica que contiene tanto la partícula poxvírica de la invención como una partícula poxvírica natural, que comprende las etapas de fijación de dicha preparación vírica a un soporte sólido recubierto con una molécula de antiligando que puede unirse a dicho resto de ligando heterólogo y recuperar dicha partícula poxvírica. Preferentemente, la etapa de fijación se realiza por resonancia de plasma en superficie, utilizando preferentemente el sistema biosensor BIAcore X^{TM} (BIAcore AB, Uppsala, Suecia) según las instrucciones del fabricante. Según una forma de realización preferida, la estreptavidina está unida por enlace covalente al soporte sólido de un chip del sensor SA por acoplamiento amínico utilizando el kit de acoplamiento amínico (BIAcore AB, Uppsala, Suecia). A continuación, la molécula de antiligando biotinilada se inmoviliza en el flujo de la célula en el chip del sensor SA recubierto con estreptavidina. La célula de flujo 1 sirvió como referencia. La fijación de partículas poxvíricas en fase fluida de la invención se determinó en un intervalo entre 1\times10^{4} y 1\times10^{10} pfu/ml. Los volúmenes de la inyección están comprendidos entre 5 y 100 \mul y el flujo está comprendido entre 2 y 10 \mul/min. La superficie se regenera con NaOH (2 a 50 mM) para la recuperación de las partículas específicas dirigidas. Preferentemente, el soporte sólido es un soporte de dextrano. Preferentemente, la molécula de antiligando es un péptido derivado de MUC-1 y especialmente un polímero de 60 elementos representando 3 repeticiones en tándem de MUC-1.
El procedimiento de la invención comprende además la etapa de infección de una célula permisiva con dicha partícula poxvírica recuperada. Esta etapa se realiza según una tecnología habitual. Preferentemente, la etapa de infección se realiza en presencia de EDTA (0,1 a 10 mM con preferencia para 1 mM).
La invención se ha descrito de manera ilustrativa y se debe apreciar que la terminología que se ha utilizado se pretende que esté en la naturaleza de las palabras de la descripción en lugar de limitación. Obviamente, muchas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles a partir de lo dado a conocer anteriormente. Por lo tanto debe entenderse que dentro de la alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención puede ponerse en práctica de manera diferente de la que está específicamente descrita en la presente memoria.
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Leyendas de las Figuras
La Figura 1 ilustra la organización de la partícula poxvírica. La envoltura del IMV se representa con una línea fina presentando en su superficie el producto del gen D8L y el complejo de p21-kDa (p21) y la proteína p14-kDa (p14). La envoltura de EEV se representa con una línea en negrita que presenta en su superficie los productos génicos A34R, HA y B5R.
La Figura 2 representa esquemáticamente el plásmido pTG14552.
La Figura 3 representa un análisis por citometría de flujo después de la infección de P815, MUC-1 que expresa P815 (P815-MUC1), BHK-21 y MUC-1 que expresa BHK-21 (BHK-21-MUC1) por MVATG14552 (A) o la referencia MVAN33 (B).
Los ejemplos siguientes se proporcionan a título ilustrativo de la presente invención.
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Ejemplos
Las construcciones descritas a continuación se realizan según las técnicas de clonación modificada genéticamente y molecular generales detalladas en Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY) o según las recomendaciones del fabricante cuando se utiliza un kit comercial. Las técnicas de ampliación por PCR son conocidas por los expertos en la materia (véase por ejemplo los protocolos de PCR - A guide to methods and applications, 1990, publicado por Innis, Gelfand, Sninsky y White, Academic Press).
Los bacteriófagos M13 recombinantes se cultivan en la cepa NM522 de E. coli (Stratagen) en un medio mínimo a base de agar-agar o en un líquido rico en medio LBM. Los plásmidos recombinantes que llevan el gen con resistencia a la ampicilina se replican en el C600 (Stratagene), BJ5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580) y NM522 en agar-agar o medio líquido enriquecido con 100 \mug/ml de antibiótico. La cepa BJ5183 se utiliza preferentemente cuando la clonación se realiza por recombinacion homóloga (Bubek et al., 1993, Nucleic acid Res. 21, 3601-3602).
Las construcciones de los virus de la vacuna recombinante se llevan a cabo según la tecnología convencional en el campo en los documentos citados anteriormente y en Mackett et al. (1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415-7419) y Mackett et al. (1984, J. Virol. 49, 857-864). El gen gpt de selección (xantina guanina fosforribosiltransferasa) de E. coli (Falkner y Moss, 1988, J. Virol. 62, 1849-1854) se utiliza para facilitar la selección de los virus de la vacuna recombinantes.
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Ejemplo 1
Construcción de un MVA que se dirige a las células positivas a MUC1
Se han modificado genéticamente dos construcciones diferentes:
MVATG14519 es un vector MVA modificado genéticamente para dirigir las células tumorales positivas a MUC-1 que expresa una proteína p14 híbrida en el que la cadena scFv del anticuerpo monoclonal SM3 se fusiona en su forma natural al terminal N del ORF de MVA I38L (p14-kDa).
MVATG14552 (Figura 2) es un vector de MVA modificado para las células tumorales positivas a MUC-1 diana y que es similar al vector MVATG14519 con la excepción de la presencia de un péptido señal de la glucoproteína TGN51 de la red trans-golgi humana (secuencia descrita por Kain et al., 1997, J. Biol. Chem. 273, 981-988) fusionada al terminal N de la cadena scFv del anticuerpo monoclonal SM3.
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A. Modificación génica de MVA138L
El vector de clonación para la inserción de las secuencias scFv se ha montado utilizando una estrategia basada en la PCR. El extremo 3' del gen MVA138L y la zona adyacente 3' se amplían utilizando los cebadores OTG12340 (SEC. ID. nº: 1) y OTG12343 (SEC. ID. nº: 2) para producir el fragmento C. El casete de expresión del marcador de selección que codifica el gpt de E. coli colocado bajo el control del activador precoz-tardío pH5R (Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266, 517-563) está aislado de un ADN plásmido de la técnica anterior, tal como pH5R-GPT (FR 98 13279) (denominado en adelante pTG9996), utilizando los cebadores OTG12342 (SEC. ID. nº: 3) OTG12341 (SEC. ID. nº: 4) para producir el fragmento E. La fusión entre los fragmentos C y E se realiza por PCR mezclando ambos fragmentos y los cebadores OTG12340 y 12342 (Fragmento F).
La zona corriente arriba de MVA138L está ampliada con el cebador OTG12338 en tándem (SEC. ID. nº: 5) y OTG12359 (SEC. ID. nº: 6) en caso en que la scFv se fusione al p14-kDa natural para generar el fragmento A que se clona posteriormente entre las secuencias EcoRI y HindIII de M13TG6131 (Ejemplo 7 del documento WO 99/03885) para dar lugar a M13TG14025. En el caso en que el scFv se fusione en su terminal N a la señal de transposición de la glucoproteína TGN51 de la red trans-golgi, la ampliación se lleva a cabo con los cebadores OTG12338 (SEC. ID. nº: 5) y OTG12346 (SEC. ID. nº: 7). El fragmento resultante (Fragmento Asp) se clona entre las secuencias EcoRI y HindIII de MT13TG6131, para dar M13TG14027. Ambas construcciones incluyen una secuencia única HindIII corriente arriba de la secuencia de codificación MVA138L.
La MVA138L y la zona corriente abajo de MVA138L se amplían utilizando los cebadores OTG12380 (SEC. ID. nº: 8) y OTG12339 (SEC. ID. nº: 9). El fragmento resultante (fragmento D) se clona entre las secuencias EcoRI y HindIII de M13TG6131, para dar M13TG14026. Los fragmentos A/D o Asp/D se aíslan por digestión con HindIII y EcoRI y se inserta en la secuencia EcoRI del vector pTG1E (Ejemplo 2 del documento WO 99/03885), para proporcionar respectivamente pTG14359 (que contiene el fragmento A/D) y pTG14358 (que contiene el fragmento Asp/D). El fragmento F se inserta a continuación bien dentro de pTG14359 o pTG14358 en la secuencia PacI. Las construcciones finales se denominan pTG14366 y pTG14365.
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B. Aislamiento de scFv de SM3
El hibridoma SM3 ha sido descrito por Burschell et al. (1987, Cancer Res. 47, 5476-5482), Girling et al. (1989, Int. J. Cancer 43, 1072-1076) y Dokurno et al. (1998, J. Mol. Biol. 284, 713-728). El epítopo reconocido en la forma MUC-1 asociada al tumor es P-D-T-R-P. El scFv de SM3 comprende la zona variable de cadena pesada del anticuerpo SM3 (denominada en el GeneBank con los números de registro AF042142) ligada a un espaciador de 10 restos seguida por una zona variable de la cadena ligera del anticuerpo SM3 (denominada en el GeneBank con los números de registro AF042143). Cada zona variable puede aislarse por PCR a partir de un plásmido de la técnica anterior, tal como pMAL-SM3 utilizando los cebadores OTG12360 (SEC. ID. nº: 10) y OTG12361 (SEC. ID. nº: 11) en tándem para la inserción de la secuencia SM3-scFv dentro de la secuencia HindIII de pTG14366 de los cebadores OTG12344 (SEC. ID. nº: 12) y OTG12361 (SEC. ID. nº: 11) en tándem para la inserción de la secuencia SM3-scFv dentro de la secuencia HindIII de pTG14365. Las construcciones resultantes se denominan pTG14519 y pTG14552 (Figura 2).
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C. Aislamiento de las partículas infecciosas MVA
Un subclón de MVA se ha aislado en condiciones de GMP de un material en bruto como se describe en Stickl et al. (1974, Deutsch Med. Wochenschr. 99, 2386-2392; Mayr et al., 1978, Zentralbl. Bakteriol. 167, 375-390). Este subclonado se denomina MVATGN33.1. Este MVA progenitor se propaga de manera rutinaria y se valora en los CEF.
Los CEF se preparan a partir de embriones de pollo obtenidos de huevos fertilizados previamente incubados 11 días a 37ºC en una atmósfera húmeda. El embrión de pollo se corta en pequeñas piezas y se trata con una solución de tripsina al 2,5% (p/v). Los CEF se colocan a continuación en placas Petri de plástico de Falcon 3001 a una densidad celular de 1,5\times10^{6} células/placa en medio a base de Eagle (MBE)/triptosa (Gibco BRL) enriquecido con suero de ternero al 10%. Después de 48 h., las células monocapa se infectan con MVATGN33.1 durante 30 min. en PBS más cationes (acetato de magnesio y CaCl_{2} 1 mg/ml de cada uno) más suero de ternero al 1% con el fin de adsorber el virus sobre las células. Las células infectadas se cultivan a continuación durante una hora en MBE más suero de ternero al 5% a 37ºC y 5% de CO_{2}. A continuación se precipita en una solución de Hepes y CaCl_{2} 1 a 5 g de plásmido (pTG14519 o pTG14552). El ADN precipitado se estratifica en la monocapa de células infectadas y se incuba 2 h. a 37ºC y 5% de CO_{2}. Puede realizarse un choque con glicerol durante 1 minuto con objeto de facilitar la introducción del plásmido. Con esta finalidad, una solución de 10% de glicerol en MBE/triptosa se estratifica en la monocapa de células durante 1 min. Las monocapas se lavan a continuación con PBS más cationes y se incuban en MBE más 5% de suero de ternero a 37ºC y 5% de CO_{2}. Después de 48 h. se congelan las placas Petri.
El aislamiento de las placas recombinantes se lleva a cabo de la manera siguiente: se descongelan las placas Petri, se recogen las células infectadas y se someten a ultrasonidos en MBE/suero de ternero. Los virus recombinantes se aíslan a continuación por rondas consecutivas de purificación de la placa en los CEF bajo la presión del marcador de selección en presencia de 250 \mug/ml de xantina, 15 \mug/ml de hipoxantina y 25 \mug de ácido micofenólico como se describió anteriormente por Falkner y Moss (1988, J. Virol. 62, 1849-1854).
Puede prepararse una solución madre (semilla vírica) en matraces F175 que contienen 10^{8} CEF que se infectan con el MVA. Los virus se propagan durante 48 a 72 horas. Las células infectadas y el medio de cultivo se agrupan y la suspensión se somete a ultrasonidos. Los extractos en bruto se fraccionan en primer lugar en una almohadilla con sacarosa al 36%. El sedimento vírico se fracciona a continuación en un gradiente de sacarosa discontinuo, como se describe en Joklik (1962, Virology 18, 9-18).
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Ejemplo 2
Construcción de un MVA que expresa a FCU-1 y direccionamiento de células positivas a MUC1
El gen FCU-1 fue aislado por digestión con HindIII/KpnI del plásmido pTG13046 de ADN (denominado pCI-neoFCU1 en el documento WO 99/54481). El vector de transferencia que contiene las secuencias homólogas a las zonas adyacentes de la deleción III denominado pTG6019 (Ejemplo 2 del documento WO 99/03885) se modificó de la manera siguiente. El casete de expresión que codifica gpt de E. coli colocado bajo el control del activador del virus de la vacuna pH5R precoz tardío se aísla del plásmido pTG9996 de ADN mediante digestión con SacI. Este fragmento de ADN se inserta a continuación con la secuencia SacI del plásmido pTG6019 de ADN, para dar pTG14033. El activador p11K75 temprano tardío sintético (SEC. ID. nº: 13) se aísla por PCR de la plantilla M13TG4052 con los cebadores OTG122271 (SEC. ID. nº: 14) y OTG12272 (SEC. ID. nº: 15). M13TG4052 está basado en M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gene 26, 91-99). El activador 11K7.5 contiene desde 5' hasta 3' de la secuencia del activador tardío 11 k (Goebel et al., 1990, anteriormente) hasta el nucleótido +4 de la secuencia de iniciación de la transcripción, la secuencia del activador TK de los nucleótidos -28 a -13 que tienen una C en lugar de una A en la posición -18 en la zona entre los nucleótidos -12 a +6 del activador precoz de 7,5 k.
El fragmento ampliado es digerido por las enzimas de restricción BamHI y BglII antes de ser insertado en la secuencia BamHI de pTG14033, para dar pTG14084. El gen FCU-1 se clona corriente abajo el p11K75 se activa por recombinación homóloga de la manera siguiente. En primer lugar, se insertan las secuencias sintéticas entre las secuencias PstI y BamHI del pTG14984 utilizando OTG12522 (SEC. ID. nº: 16) y OTG12523 (SEC. ID. nº: 17). El ADN plásmido es linealizado a continuación por XhoI y recombinación homóloga con el gen FCU-1 se realiza en E. coli. El ADN plásmido resultante se denomina pTG14322.
La recombinación homóloga en los CEF infectados con MVATG14552 y transfectados con pTG14322 da como resultado la obtención de un MVA dirigido a MUC1 que expresa el gen suicida FCU-1.
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Ejemplo 3
Producción de MVA con un gen modificado genéticamente de F13L
La zona adyacente 5' F13L está aislada del ADN vírico MVATGN33 mediante el ensayo PCR habitual utilizando los cebadores OTG13192 (SEC. ID. nº: 18) y OTG13194 (SEC. ID. nº: 19) en tándem y se inserta entre las secuencias BamHI y EcoRI de pBS (Stratagene) (pTG14746). La zona adyacente a 3' F13L está aislada del ADN vírico MVATGN33 mediante el ensayo PCR habitual utilizando los cebadores OTG13190 (SEC. ID. nº: 20) y OTG13191 (SEC. ID. nº: 21) en tándem y se inserta entre las secuencias BamHI y EcoRI de M13TG6131 para dar M13TG14101. Las zonas adyacentes a 5' y 3' F13L se clonan a continuación en la secuencia EcoRI de pTG1E. La construcción resultante se denomina pTG14783.
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Ejemplo 4
Generación de una estirpe celular productora que expresa al antígeno MUC-1
Como se mencionó anteriormente, la inserción del resto del ligando scFv de SM3 en la proteína p14-kDa puede afectar la producción de virus (rendimiento reducido del virus). De este modo, los MVA dirigidos del Ejemplo 1 se aíslan y se propagan preferentemente en una estirpe celular que presenta en la superficie celular el antígeno MUC-1 que es reconocido por el anticuerpo SM3 presente en la superficie vírica, con objeto de reducir la contaminación con el MVATGN33.1 natural.
El ADNc que codifica la forma anclada en la membrana del antígeno MUC-1 está aislado del pPOLYII-ETAtm (Hareuveni et al., 1990, Eur. J. Biochem. 189, 475-486) mediante una doble digestión con las enzimas de restricción BgIII y EcoRI y se inserta entre las secuencias BamHI y EcoRI del vector de expresión pcDNA3 (InVitrogen, EUA) corriente abajo del activador de CMV. El plásmido resultante se denomina pTG5077.
Se transfectan 1\times10^{6} células BHK-21 (ATCC CCL-10) con 5 \mug de pTG5077 y se cultivan posteriormente en GMEM (medio Eagle modificado con Glasgow, Gibco, BRL) que contiene 20 g/l de gentamicina y suero de ternero fetal al 10%. Después de 24 h. a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2}, se añade 1 mg/ml de G418 (Gibco BRL). A continuación se aíslan los clones resistentes a la neomicina por dilución al límite y se analiza por FACS la expresión de MUC-1 en la superficie celular utilizando el anticuerpo monoclonal H23 (Tsarfaty et al., 1989, en Breast cancer immunodiagnosis and Immunotherapy, ed. Ceriani, Plenum NY). Resulta interesante que la mayoría de los clones positivos a MUC-1 perdieron la propiedad de adherencia al plástico de la estirpe celular BHK-21 original y comienzan a desarrollarse en suspensión. Esta observación facilitará la propagación y producción farmacéutica de los virus recombinantes de la invención en el biorreactor.
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Ejemplo 5
Evaluación de las propiedades de direccionamiento
Los clones de MVATG14552 del Ejemplo 1 se aíslan mediante rondas consecutivas de purificación en placa en los CEF bajo condición selectiva en presencia de xantina, hipoxantina y ácido micofenólico tal como se describió anteriormente.
Un determinado número de clones se analizan en primer lugar por PCR para detectar la presencia en el genoma vírico del gen híbrido que codifica la proteína de fusión TG51/SM3scFv/p14kDa. Se seleccionan nueve clones y se analizan más por inmunotransferencia Western para confirmar la expresión de la proteína de fusión en la superficie de las partículas poxvíricas. Se realiza la detección con el kit ECL (Amersham) por inmunotransferencia con suero policlonal de conejo específico para p14-kDa en el extracto en bruto obtenido de las células infectadas o de los sobrenadantes. Se utiliza como referencia la proteína p14-kDa purificada. A excepción del clon C5, todos los clones seleccionados expresan la proteína de fusión híbrida que tiene una masa molecular de 46 kDa. Como cabía esperar, la intensidad del marcado es mayor en los extractos en bruto que en los sobrenadantes del cultivo reflejando el estado intracelular de las partículas poxvíricas. Estos resultados indican que la mayoría partículas poxvíricas que presentan en su superficie la proteína de fusión TG51/SM3scFv/p14kDa son partículas de IMV. La detección de la pequeña cantidad de proteína de fusión en el sobrenadante del cultivo puede explicarse por una rotura de la envoltura de EEV o por una lisis celular durante la preparación del clon.
Se han estudiado a continuación las propiedades de infección de MVATG14552 en diferentes estirpes celulares:
-
El mastocitoma P815 murino (ATCC CRL6448),
-
P815 que expresa el antígeno MUC-1 (P815-MUC1) obtenido por transfección de las células originales P815 con un vector que expresa la forma del antígeno MUC1 anclada a la membrana,
-
BHK 21 (riñón de hámster pequeño),
-
BHK 21 que expresa el antígeno MUC-1 (BHK 21-MUC) obtenido por transfección de las células originales BHK 21 con un vector que expresa la forma de antígeno MUC1 anclado a la membrana.
Las células se infectan con el clon 9 de MVATG14552 o con un virus de referencia (MVAN33) a una MOI de aproximadamente 0,1 durante 24 h. Se determina la eficacia de infección por citometría de flujo (FACS) tras la incubación con un suero policlonal murino obtenido después de la inmunización por MVA a una tasa de dilución de 1/100. El revelado se realiza por incubación con una IgG anti-ratón de cabra FITC monoclonal (Pharmingen, 10 \mug/ml). Como se muestra en la Figura 3A, MVATG14552 infecta preferentemente las células que expresan a MUC-1 en comparación con las células originales P815 y BHK-21. Por el contrario, el MVA de referencia infecta tanto a MUC-1 que expresa como el que no expresa las células con una eficacia similar (Fig. 3B).
Todos estos resultados conjuntamente indican que el resto de ligando scFv de SM3 se expresa en la superficie de las partículas poxvíricas (IMV) y que puede reconocer y unirse a su diana (antígeno MUC-1) lo que conduce a una infección específica de dichas células por el virus modificado.
Las interacciones entre dos clones que expresan a scFv de SM3 (A3 y C9) con un péptido de 60 monómeros de MUC-1 fueron examinados por resonancia en un plasmón de superficie (SPR), utilizando un sistema biosensor XTM de BIAcore (BIAcore AB, Uppsala, Suecia). Todos los experimentos se realizaron a 25ºC. La estreptavidina se unió por enlace covalente a la matriz de dextrano carboxilada de un chip sensor SA por acoplamiento amínico utilizando el kit de acoplamiento amínico (BIAcore AB, Uppsala, Suecia). A continuación, el péptido de 60 monómeros biotinilado que representa 3 repeticiones en tándem de MUC-1 (10 \mug/ml en tampón HBSS) se inmovilizó en la celda de flujo 2 en el chip del sensor SA recubierto con estreptavidina. La celda de flujo sirvió como referencia. Se utilizó como referencia positiva la fijación de SM3 recombinante en fase fluida. La fijación de los virus recombinantes en fase fluida se determinó en un intervalo entre 1\times10^{6} y 1\times10^{8} pfu/ml en tampón HBSS. Con este fin, se infectaron fibroblastos primarios de pollo a una MOI de 1 durante 24 h. con las suspensiones víricas. Los volúmenes de inyección fueron de 15 \mul y el caudal de 5 \mul/min. Se regeneró la superficie con NaOH 10 mM. Se realizó análisis cinético utilizando un programa informático BIAevaluation 3.0. Se observó una interacción específica y reproducible entre los virus recombinantes y el péptido MUC-1 de 60 monómeros. Se descubrió que las mediciones se correlacionan con las concentraciones de virus. No se observó nunca la fijación del MVA de referencia (MVAN33) al mismo péptido.
Estos resultados demuestran que la proteína de fusión SM3 scFv/p14 se asocia con las partículas de MVA y que los virus recombinantes reconocen específicamente al péptido derivado de MUC-1.
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Ejemplo 6
Purificación de las partículas víricas que expresan a SM3 scFv
Con el fin de separar las partículas víricas naturales no recombinantes de las recombinantes, se llevó a cabo un protocolo de selección por la técnica BIAcore para purificar las partículas víricas que expresan a SM3 scFv recombinante basándose en su capacidad de fijación a un péptido MUC-1. Una preparación vírica realizada a partir del clon A3 se inyectó en el sistema BIAcore X como se describió anteriormente. Los virus que presentan una gran afinidad para el péptido MUC-1 de 60 monómeros se recuperaron en la superficie durante la fase de regeneración utilizando NaOH 20 mM, tal como se describe en el manual del instrumento BIAcore X. Se infectaron a continuación las células permisivas con los virus recuperados, en presencia de EDTA (1 mM) para impedir la formación de agregados víricos y se seleccionaron virus recombinantes mediante una doble selección GUS/GPT. La ausencia de virus no recombinantes naturales se evaluó en clones aislados por PCR. Esta nueva purificación y el protocolo de selección han permitido la obtención de varios clones exentos de virus naturales contaminantes.
<110> TRANSGENE S.A.
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<120> Poxvirus con especificidad de infección dirigida
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<130> D18836
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<150> EP 00 44 0109
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<151> 2000-04-14
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<150> EP 01 44 0009
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<151> 2001-01-22
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<150> US 60/246 080
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<151> 2000-11-07
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<160> 21
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR para ampliar el gen 138 de MVA y la zona adyacente
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<400> 1
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1 
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<210> 2
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<211> 61
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> gene
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<222> Complement ((1).._(61))
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR complementario para ampliar el extremo 3' del gen 138L de MVA y la zona adyacente a 3'
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<400> 2
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2 
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<210> 3
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<211> 61
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR para ampliar el gen de gpt de E. coli y el activador de H5R
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<220>
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<221> gen
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<222> (1).._(61)
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<400> 3
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3 
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<210> 4
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR complementario para ampliar el gen GTP de E. coli y el activador de pH5R
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<400> 4
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4 
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<210> 5
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<211> 38
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR para ampliar la zona corriente arriba del gen 138 L de MVA
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<400> 5
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5 
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<210> 6
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<211> 44
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR para ampliar el gen 138L de MVA y su zona corriente abajo
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 68
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador complementario de PCR para ampliar la zona corriente arriba del gen 138L de MVA.
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR complementario para ampliar el gen 138 L de MVA y su zona corriente abajo
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 37
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR complementario para ampliar el gen 138 L de MVA y su zona corriente abajo
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 68
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de pCR para ampliar la secuencia scFv de SM3
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 58
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR complementario para ampliar la secuencia scFv de SM3
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<210> 12
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<211> 57
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR para ampliar la secuencia scFv de SM3
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 111
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia sintética del activador de p11k7.5
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 53
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR para ampliar el activador de p11k7.5
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 50
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR complementario para ampliar el activador de p11k7.5
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 77
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia sintética
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<400> 16
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<210> 17
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<211> 85
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia sintética
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<400> 17
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<210> 18
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR para ampliar la zona adyacente a 5' F13L de MVA
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<400> 18
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<210> 19
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR complementario para ampliar la zona adyacente a 5' F13L de MVA
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<400> 19
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR para ampliar la zona adyacente a 3' F13L de MVA
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<400> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR complementario para ampliar la zona adyacente a 5' F13L de MVA
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<400> 21
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Claims (22)

1. Partícula poxvírica EEV que presenta especificidad de infección dirigida hacia las células diana en la que dicha partícula infecta preferentemente dichas células diana y en la que dicha especificidad está proporcionada por lo menos por un resto de ligando heterólogo que está situado en la superficie de dicha partícula poxvírica y que puede unirse a una molécula antiligando localizada en la superficie de dichas células diana, en la que dicho resto de ligando heterólogo es un polipéptido y forma parte de una proteína híbrida que incluye dicho resto de ligando heterólogo y un polipéptido poxvírico seleccionado de entre los productos de expresión de los genes B5R o A34R, con la condición de que cuando dicha partícula poxvírica sea una partícula de virus de vacuna EEV dicho ligando no sea un anticuerpo dirigido contra ErbB-2.
2. Partícula poxvírica EEV según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido poxvírico es el producto de expresión del gen B5R.
3. Partícula poxvírica EEV según la reivindicación 2, en la que dicho resto de ligando heterólogo se fusiona con el terminal N del producto de expresión del gen B5R.
4. Partícula poxvírica EEV según la reivindicación 3, en la que dicho resto de ligando heterólogo se fusiona inmediatamente corriente abajo del codón de iniciación del gen B5R.
5. Partícula poxvírica EEV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha partícula poxvírica, es una partícula del virus de la vacuna, de la viruela del canario, de la viruela aviar, de la viruela bovina, de entomoviruela, de la viruela del mono, de la viruela porcina o de la viruela del pingüino.
6. Partícula poxvírica EEV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho virus de la vacuna se selecciona de entre el grupo constituido por las cepas de Copenhague, Wyeth y Ankara modificada (MVA).
7. Partícula poxvírica EEV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dichas células diana son células tumorales y dicho resto de ligando heterólogo puede unirse a un antígeno específico del tumor, una proteína celular expresada de manera diferencial o sobreexpresada en dichas células tumorales o un producto génico de un virus asociado al cáncer.
8. Partícula poxvírica EEV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho resto de ligando heterólogo es un fragmento de un anticuerpo que puede reconocer y unirse al antígeno MUC-1.
9. Partícula poxvírica EEV según la reivindicación 8, en la que dicho resto de ligando heterólogo es el fragmento scFv del anticuerpo monoclonal SM3.
10. Partícula poxvírica EEV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicho resto de ligando heterólogo comprende un péptido señal que facilita su inserción en la envoltura de dicha partícula poxvírica.
11. Partícula poxvírica EEV según la reivindicación 10, en la que dicho péptido señal permite la transposición de dicho resto de ligando heterólogo en la red trans-Golgi.
12. Partícula poxvírica EEV según la reivindicación 11, en la que dicho péptido señal se obtiene a partir de la glucoproteína TGN51 de la red trans-Golgi humana.
13. Partícula poxvírica EEV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicha partícula poxvírica comprende por lo menos un ácido nucleico de interés.
14. Partícula poxvírica EEV según la reivindicación 13, en la que dicho ácido nucleico de interés es un gen suicida.
15. Vector que comprende por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica una proteína híbrida que comprende (i) por lo menos un resto de ligando heterólogo tal como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 7 a 9, y (ii) todo o parte de un polipéptido vírico homólogo localizado de manera natural en la superficie de una partícula poxvírica de una partícula poxvírica EEV seleccionada de entre los productos de expresión de los genes B5R o A34R.
16. Vector según la reivindicación 15, en el que dicho polipéptido vírico homólogo es como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.
17. Composición que comprende por lo menos una partícula poxvírica EEV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o por lo menos un vector según la reivindicación 15 ó 16 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
18. Utilización de una partícula poxvírica EEV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o de un vector según la reivindicación 15 ó 16 para la preparación de un fármaco destinado al tratamiento de un organismo humano o animal mediante terapia génica.
19. Procedimiento para la purificación de una partícula poxvírica EEV según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 procedente de una preparación vírica que contiene tanto dicha partícula poxvírica EEV como una partícula poxvírica EEV de tipo salvaje, que comprende las etapas de unión de dicha preparación vírica a un soporte sólido recubierto con una molécula de antiligando que puede unirse a dicho resto de ligando heterólogo y recuperar dicha partícula poxvírica EEV.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que dicha etapa de unión se realiza por resonancia en un plasmón de superficie en un soporte de dextrano.
21. Procedimiento según la reivindicación 19 ó 20, que comprende además la etapa de infección de una célula permisiva con dicha partícula poxvírica EEV recuperada.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en la que dicha etapa de infección se realiza en presencia de EDTA.
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