DE60107746T2 - Pockenviren mit zielgerichteter Infektionsspezifität - Google Patents

Pockenviren mit zielgerichteter Infektionsspezifität Download PDF

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Pockenvirus-Partikel mit einer zielgerichteten Infektionsspezifität, welche durch eine heterologe Ligandengruppierung, die auf der Oberfläche des Pockenvirus-Partikels lokalisiert ist und in der Lage ist, ein Anti-Liganden-Molekül, das auf der Oberfläche von Zielzellen lokalisiert ist, spezifisch zu erkennen und daran zu binden, verliehen wird. Die Erfindung betrifft ferner einen Vektor, welcher eine Nukleotidsequenz umfasst, welche ein chimäres Polypeptid, welches eine derartige heterologe Ligandengruppierung und die Gesamtheit oder einen Teil eines natürlichen, auf der Pockenvirus-Oberfläche vorhandenen Polypeptids umfasst, kodiert. Die Erfindung betrifft zusätzlich Zusammensetzungen, welche das Pockenvirus-Partikel oder den Vektor umfassen, wie auch deren Verwendung für therapeutische und prophylaktische Zwecke. Die Erfindung ist von sehr speziellem Interesse bei Gentherapie-Anwendungen, insbesondere bei der Verhütung oder Behandlung von Krebs bei Säugetieren.
  • Gentherapie kann als Transfer von genetischem Material eine Zelle oder einen Organismus definiert werden. Die Möglichkeit, Krankheiten beim Menschen durch Gentherapie zu behandeln, hat sich in einigen wenigen Jahren vom Stadium von theoretischen Erwägungen bis zu jenem von klinischen Anwendungen verändert. Das erste Protokoll, das auf den Menschen angewendet wurde, wurde in den U.S.A. im September 1990 an einem an Adenindesaminase (ADA)-Defizienz leidenden Patienten begonnen. Diesem ersten ermutigenden Experiment folgten zahlreiche neue Anwendungen und vielversprechende klinische Versuche, die auf einer Gentherapie basieren, dauern gegenwärtig noch an (siehe beispielsweise die klinischen Versuche, die aufgelistet sind unter:
    http://cnetdb.nci.nih.gov/trialsrch.shtml oder http//www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/).
  • Eine erfolgreiche Gentherapie hängt hauptsächlich von der effizienten Abgabe eines therapeutischen Gens von Interesse ab, indem dessen Expression in Zellen eines lebenden Organismus ermöglicht wird. Therapeutische Gene können in Zellen unter Verwendung einer großen Vielzahl von Vektoren, welche entweder zu einer transienten Expression (Transfektion) oder permanenten Transformation des Wirtsgenoms führen, transferiert werden. Während des letzten Jahrzehnts ist eine große Anzahl von viralen, wie auch von nicht-viralen Vektoren für den Gentransfer entwickelt worden (siehe beispielsweise Robbins et al., 1998, Tibtech 16, 35–40, und Rolland, 1998, Therapeutic Drug Carrier Systems 15, 143–198, für Übersichtsartikel).
  • Die am umfassendsten verwendeten viralen Vektoren sind von Retroviren und Adenoviren abgeleitet (für eine Übersicht siehe Miller, 1997, Human Gene Therapy 8, 803–815). Es sind jedoch andere virale Vektoren, wie vom Sindbis-Virus abgeleitete Vektoren oder von Pockenviren abgeleitete Vektoren, als vielversprechende Kandidaten für einen in vivo-Gentransfer im Kommen.
  • Pockenviren sind eine Gruppe von komplexen umhüllten Viren, die sich hauptsächlich aufgrund ihrer ungewöhnlichen Morphologie, ihres großen DNA-Genoms und ihrem zytoplasmatischen Replikationsort unterscheiden. Das Genom von mehreren Mitgliedern der Pockenviridae, einschließlich des Copenhagen-Vacciniavirus (VV)-Stamms (Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247–266 und 517–563; Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381–401) und des modifiziertes Vacciniavirus Ankara (MVA)-Stamms (Antoine et al., 1998, Virol. 244, 365–396), ist kartiert und sequenziert worden. VV weist ein doppelsträngiges DNA-Genom von ungefähr 192 kb, welches ungefähr 200 Proteine kodiert, von denen ungefähr 100 an dem Zusammenbau des Virus beteiligt sind, auf. MVA ist ein hochgradig attenuierter Vacciniavirus-Stamm, der durch mehr als 500 Reihenpassagierungen des Ankara-Vacciniavirus-Stamms (CVA) auf Hühner-Embryo-Fibroblasten erzeugt worden ist (Mayr et al., 1975, Infection 3, 6–16). Das MVA-Virus wurde bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) unter der Hinterlegungsnummer 1–721 hinterlegt. Eine Bestimmung der vollständigen Sequenz des MVA-Genoms und ein Vergleich mit dem Copenhagen-VV-Genom ermöglicht die genaue Identifizierung der Veränderungen, die in dem Virusgenom aufgetreten sind und die Definition von sieben Deletionen (I bis VII) und von zahlreichen Mutationen, die zu fragmentierten ORFs (offenes Leseraster) führen (Antoine et al., 1998, Virology 244, 365–396).
  • Der natürliche Weg für die intrazelluläre Aufnahme von umhüllten Viren umfasst eine Reihe von Schritten, welche das Binden eines auf der Virusoberfläche exponierten viralen Polypeptids an einen zellulären Rezeptor und einen Fusionsmechanismus zwischen den viralen und zellulären Membranen, welcher zu der Freisetzung des Virusgenoms in das Zytoplasma der infizierten Zelle führt, umfassen.
  • Jedoch wird in dem speziellen Falle der Pockenviren die genaue Analyse des Abgabewegs durch die Existenz von zwei morphologisch unterschiedlichen Formen von infektiösen Viren, welche als intrazelluläres reifes Virus (IMV) und extrazelluläres umhülltes Virus (EEV) bezeichnet werden, verkompliziert. Die IMV-Form ist neben anderen Besonderheiten durch eine Monolipid-Hülle, welche den Viruskern umgibt, (1) gekennzeichnet und ist hauptsächlich im Zytoplasma der infizierten Zellen lokalisiert, obwohl sie nach einer Lyse der infizierten Zellen extrazellulär freigesetzt werden könnte. Viele der natürlichen Polypeptide, die auf der Oberfläche der IMV-Lipidhülle exponiert werden, sind identifiziert worden, wie beispielsweise die p14 kDa- und p21 kDa-Proteine, die durch das A27L-Gen (Rodriguez et al., 1985, J. Virol. 56, 482–488; Rodriguez und Estaban, 1987, J. Virol. 61, 3550–3554) bzw. das A17L-Gen kodiert werden, wie auch durch L1R, A14L, D8L, A9L (Yeh et al., 2000, J. Virol. 74, 9701–9711), E10R (Senkevich et al., 2000, Virol. 5, 244–252) und H3L-Gene kodierte Proteine. Verglichen mit den IMV weist die EEV-Form eine zusätzliche äußere Lipidmembranhülle (Lipiddoppelschicht) auf, die aus den Zisternen des Trans-Golgi-Netzwerks erworben wird. Sie entspricht der Virusform, die auf die Außenseite der infizierten Zellen freigesetzt wird. Die EEV-Oberflächenmembranhülle weist ungefähr 10 Proteine auf, die bei der IMV-Oberfläche fehlen, wie beispielsweise die kodierten B5R-, A34R- und Hämagglutinin (HA)-Genprodukte (1). Die Coexistenz der IMV- und EEV-Formen ist bei den meisten Vacciniastämmen (z.B. den Copenhagen- und MVA-Stämmen) wie auch bei anderen Pockenviren, wie dem Geflügelpockenvirus (Boulanger et al., 2000, J. Gen. Virol. 81, 675–687), beschrieben worden.
  • Die unterschiedlichen Morphologien von IMV und EEV legen das Auftreten von unterschiedlichen Mechanismen für das Eindringen dieser Pockenvirus-Formen in die Wirtszellen nahe. Es ist unlängst vorgeschlagen worden, dass der EEV-Abgabeweg durch Endozytose und einen nachfolgenden pH-abhängigen Membranfusionsweg vermittelt wird, wohingegen die IMV-Form direkt mit der Zellmembran in einer pH-unabhängigen Weise fusioniert (Vanderplasschen et al., 1998, J. Gen. Virol. 79, 877–887). Unlängst sind zwei zelluläre Rezeptoren, die die Bindung und intrazelluläre Aufnahme von IMV vermitteln, identifiziert worden: Heparansulfat, das eine Glycosaminoglycan (GAG)-Seitenkette von Proteoglycanen auf der Zelloberfläche ist (Chung et al., 1998, J. Virol. 72, 1577–1585) und eine andere GAG-Komponente, das Chondroitinsulfat (Hsiao et al., 1999, J. Virol. 73, 8750–8761). Beide Rezeptoren wechselwirken mit einem unterschiedlichen IMV-Oberflächenpolypeptid, dem p14-(Bindung an Heparansulfat) bzw. dem D8L-Genprodukt (Bindung an Chondroitinsulfat), was unterschiedliche Arten von Virus-GAG-Wechselwirkungen nahe legt.
  • Das 14 kDa-Protein des Vacciniavirus (p14) spielt eine bedeutende Rolle bei der Infektionseigenschaft des Virus. Das p14-Protein ist in der IMV-Lipidhülle durch Assoziation mit dem 21 kDa-Protein (p21) verankert. Das p14-Protein ist an dem IMV-Abgabeweg beteiligt, wahrscheinlich indem es an der Anheftung an das auf der Zelloberfläche befindliche Heparansulfat teilnimmt (Chung et al., 1998, J. Virol. 72, 1577–1585). Zusätzlich ist der Fusionsprozess dem p14-Protein zugeschrieben worden. Darüber hinaus ist, als allgemeine Aussage, gezeigt worden, dass die IMV-Oberflächenpolypeptide in enger Beziehung zu der IMV-Infektionseigenschaft stehen und dass deren Mutation oder Deletion die IMV-Verbreitung dramatisch beeinträchtigte (Dallo et al., 1987, Virology 159, 423–32). Das p14-Protein ist auch für die EEV-Bildung und Virusausbreitung außerhalb der infizierten Zellen erforderlich. Unlängst sind die funktionalen Domänen, die für die Bindung an den auf der Zelloberfläche be findlichen Heparansulfat-Rezeptor, für die Virus/Zellmembran-Fusion und die Virusfreisetzung erforderlich sind, innerhalb der ersten 43 N-terminalen Aminosäuren von p14 kartiert worden (Vazquez und Esteban, 1999, J. Virol. 73, 9098–9109). Daneben haben Vazquez et al. (1998, J. Virol. 72, 10126–10137) gezeigt, dass die C-terminale Domäne von p14 an der Bindung an das p21-Protein beteiligt ist.
  • Es ist in der Literatur über viele rekombinante pockenvirale Vektoren, welche verschiedene therapeutische Gene exprimieren, berichtet worden. Insbesondere sind VV, die Zytokingene (Peplinski et al., 1995, Ann. Surg. Oncol. 2, 151–159; Whitman et al., 1994, Surgery 116, 183–188), ein immunstimulatorisches B7.1-Gen (Hodge et al., 1994, Cancer Res. 54, 5552–5555), ICAM-1 (Uzendoski et al., 1997, Hum. Gene Ther. 8, 851–860) oder Suizidgene, wie das Thymidinkinasegen des Herpes simplex-Virus 1 (TK HSV-1) (Puhlmann et al., 1999, Hum. Gene Ther. 10, 649–657), und das Cytosindesaminasegen (Gnant et al., 1999, Cancer Res. 59, 3396–3403) exprimieren, für die Krebstherapie vorgeschlagen worden. Zusätzlich ist ihre Anti-Tumor-Aktivität in Tiermodellen gezeigt worden. Auf einem MVA-Stamm basierende Vektoren sind ebenfalls vorgeschlagen worden (Sutter und Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847–10851; Carroll und Moss, 1995, BioTechniques 19, 352–355; Antoine et al., 1996, Gene 177, 43–46; Schleiflinger et al., 1996, Arch. Virol. 141, 663-669).
  • Jedoch zeigt das Vacciniavirus ein sehr breites Wirtsspektrum und kann die meisten Vertebratenzellen infizieren. Wieder sollte festgehalten werden, dass die IMV- und EEV-Formen sich in Hinblick auf ihre Ausbreitungseigenschaften unterscheiden, da das EEV, welches auf seiner Oberfläche eine größere Vielzahl von Polypeptiden als auf der IMV-Oberfläche präsentiert, mehr als IMV dazu neigt, sich stärker auszubreiten. Dennoch, unabhängig davon, welche Form in Betracht gezogen wird, könnte dieses Fehlen einer Infektionsselektivität als ein Nachteil für spezielle Anwendungen, wo es wünschenswert wäre, abträgliche Wirkungen zu begrenzen, die aus der Expression von transferierten Genen (d.h. zytotoxischen Genen) in den Nicht-Ziel-Zellen resultieren könnten, angesehen werden. Dementsprechend wäre es interessant, das Virus zu modifizieren, um dessen Wirtsspektrum einzuschränken, um die Infektion auf Zielzellpopulationen zu richten.
  • Die Modifikation des viralen Tropismus ist bereits bei bestimmten Viren erreicht worden. Beispielsweise wird in WO 93/09221 der Influenzavirus-Tropismus modifiziert durch Hemmung des viralen Hämagglutinin-Polypeptids, welches normalerweise die Bindung des Virus an den zellulären Rezeptor vermittelt, mittels eines monoklonalen Antikörpers und durch Koppeln des Virus an einen Antikör per, der in der Lage ist, mit dem auf Zielzellen exprimierten Transferrin-Rezeptor eine Wechselwirkung einzugehen.
  • Roux et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9079–9083) berichten über die Infektion von humanen Zellen mit einem ekotrophen rekombinanten Mäuse-Retrovirus unter Verwendung von zwei biotinylierten Antikörpern, die gegen das retrovirale Hüll-gp70 bzw. gegen ein zelluläres Antigen des humanen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) gerichtet sind.
  • WO 94/10323 beschreibt Adenovirus-Vektoren mit zielgerichteter Wirkung, die auf ihrer Oberfläche ein durch Fusion mit einem einzelkettigen Antikörper modifiziertes Faserprotein aufweisen, um die adenovirale Infektion auf die Zellen, die das durch den Antikörper erkannte Antigen exprimieren, zu richten.
  • Die kontrollierte Vermittlung einer Zielgerichtetheit von Pockenvirus-Partikeln ist jedoch durch die ureigene Komplexität der Pockenviren und die Existenz der zwei unterschiedlichen infektiösen Formen behindert worden. In dieser Hinsicht berichten Galmiche et al. (1997, J. Gen. Virol. 78, 3019-3027) über die Konstruktion von EEV-Partikeln für das zielgerichtete Ansteuern von Tumorzellen. Ein einzelkettiger Antikörper, der gegen das Tumor-assoziierte Antigen ErbB-2 gerichtet ist, wurde mit dem viralen Hämagglutinin (HA) fusioniert, um auf der EEV-Oberfläche exprimiert zu werden. ErbB-2 ist ein epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor, der auf humanen Adenokarzinomzellen überexprimiert wird. Obwohl das Fusionsprotein auf der Oberfläche des EEV-Partikels exponiert und in der Lage ist, an in Kultur befindliche humane Adenokarzinomzellen in vitro zu binden, beobachteten die Autoren keine präferentielle Infektion der EEV, die die Antikörper-HA-Fusion aufwiesen, in Richtung auf ErbB-2 exprimierende Zellen. Es wird angenommen, dass das modifizierte EEV-Partikel nach wie vor ein oder mehrere noch unidentifizierte(s) Protein(e), welches) eine Infektion eines breiten Spektrums von Zellen ermöglicht bzw. ermöglichen, enthält.
  • Dementsprechend ist das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem die Bereitstellung von verbesserten Verfahren und Mitteln, um Pockenvirus-Partikeln Zielgerichtetheit in Richtung auf spezielle Zellen zu vermitteln („Targeting"). Dieses technische Problem wird durch die Bereitstellung der Ausführungsformen, wie hiermit definiert, gelöst.
  • Die Erfindung betrifft ein IMV-Pockenvirus-Partikel mit einer zielgerichteten Infektionsspezifität in Richtung auf Zielzellen, wobei das Partikel vorzugsweise die Zielzellen infiziert und wobei die Spezifität durch wenigstens eine heterologe Ligandengruppierung, die auf der Oberfläche des IMV- Pockenvirus-Partikels lokalisiert ist und die in der Lage ist, ein Anti-Liganden-Molekül, das auf der Oberfläche der Zielzellen lokalisiert ist, zu binden, verliehen wird.
  • Der Ausdruck „eine zielgerichtete Infektionsspezifität (eines IMV-Pockenvirus-Partikels) in Richtung auf Zielzellen", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine kontrollierte Infektionsspezifität, wenn ein IMV-Pockenvirus-Partikel der Erfindung gentechnologisch so modifiziert ist, dass es einen neuen oder verstärkten Tropismus in Richtung auf die Zielzellen verglichen mit einem verwandten, nicht-modifizierten (d.h. Wildtyp) IMV-Pockenvirus-Partikel zeigt. Als Ergebnis zeigt das IMV-Pockenvirus-Partikel anders als das damit verwandte, nicht-modifizierte IMV-Pockenvirus-Partikel eine Neigung, die Zielzellen zu infizieren, was bedeutet, dass das IMV-Pockenvirus-Partikel der Erfindung seine Zielzellen (die auf ihrer Oberfläche den Anti-Liganden, der durch die auf der Oberfläche des IMV-Pockenvirus-Partikels der Erfindung vorhandene Ligandengruppierung erkannt wird, präsentieren) effizienter oder schneller infiziert als Nicht-Ziel-Zellen (die auf ihrer Oberfläche einen solchen Anti-Liganden nicht aufweisen), wohingegen ein verwandtes, nicht-modifiziertes IMV-Pockenvirus-Partikel die Zielzellen mit einer geringeren oder ähnlichen Effizienz verglichen mit Nicht-Ziel-Zellen infizieren wird. Diese bevorzugte Infektionseigenschaft kann leicht bestimmt werden, indem die Infektionseigenschaft des IMV-Pockenvirus-Partikels der Erfindung mit der Infektionseigenschaft von dessen verwandtem, nicht-modifiziertem IMV-Pockenvirus-Partikel in Richtung auf Zielzellen und Nicht-Zielzellen entweder in vitro (z.B. bei kultivierten Zellen) oder in vivo (z.B. in Tiermodellen) und unter den gleichen experimentellen Bedingungen verglichen wird. Experimentelle in vitro-Bedingungen für das Analysieren von Infektionseigenschaften werden in Beispiel 5 der vorliegenden Anmeldung angegeben; jedoch sind andere Verfahren den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt und können folglich im Kontext der Erfindung verwendet werden. Wenn beispielsweise eine Mischung von erfindungsgemäßen IMV-Pockenvirus-Partikeln und von verwandten nichtmodifizierten IMV-Pockenvirus-Partikeln verwendet wird, um in Kultur befindliche Zielzellen mit einer relativ kurzen Infektionszeit (geringer als 30 min und insbesondere 1 bis 10 min) zu infizieren, ist eine Mehrheit (wenigstens 60% , vorzugsweise wenigstens 70% und mehr bevorzugt wenigstens 80%) der erfindungsgemäßen IMV-Pockenvirus-Partikel, die in der ursprünglichen Mischung vorhanden sind, in der Lage, die Zielzellen zu infizieren, wohingegen eine Minderheit (höchstens 40 % , vorzugsweise höchstens 30 % und mehr bevorzugt höchstens 20 %) der verwandten, nicht-modifizierten IMV-Pockenvirus-Partikel, die in der ursprünglichen Mischung vorhanden sind, in der Lage sind, die Zielzellen zu infizieren. Dies führt zu einer Anreicherung der Menge von erfindungsgemäßen IMV-Pockenvirus-Partikeln, die in der Mischung bei jeder Infektionsrunde vorhanden sind. Eine solche Anreicherung kann ausgewertet werden, indem die Virustiter der jeweiligen IMV-Pockenvirus-Partikel durch Standardtechniken bestimmt werden.
  • Der Ausdruck „Ligandengruppierung", wie er im Rahmen der Erfindung verwendet wird, definiert eine jegliche Gruppierung, die in der Lage ist, wenigstens ein Anti-Liganden-Molekül, das auf der Oberfläche einer Zielzelle exprimiert oder exponiert wird, zu erkennen und daran zu binden. Sie vermittelt dem IMV-Pockenvirus-Partikel der Erfindung die Zielzellen-Bindungs- und -Infektionsspezifität. Es wird anhand des Lesens der vorliegenden Unterlagen offensichtlich, dass das Anti-Liganden-Molekül sich von dem natürlichen zellulären Rezeptor, welcher die IMV-Pockenvirus-Aufnahme vermittelt (z.B. Heparansulfat oder Chondroitinsulfat), unterscheidet. Gemäß der Erfindung ist die Ligandengruppierung auf der Oberfläche des beanspruchten IMV-Pockenvirus-Partikels lokalisiert. Abhängig von der verwendeten Kopplungsmethode (siehe unten) kann die Ligandengruppierung eine Gruppierung sein, die zu der Viruspartikel-Oberfläche hinzugefügt und auf dieser exponiert wird (beispielsweise durch chemische Kopplung), oder eine Gruppierung, die mit der Hüllstruktur des Partikels fusioniert ist (beispielsweise durch genetische Kopplung). „Heterolog" bedeutet, dass die Ligandengruppierung auf der Oberfläche eines Wildtyp-IMV-Pockenvirus-Partikels nicht gefunden wird. Zur Erweiterung bezieht sich „homolog" auf die Polypeptide oder natürlichen Gruppierungen, die auf der Oberfläche eines Wildtyp-IMV-Pockenvirus-Partikels gefunden werden. Das auf der Oberfläche einer Zielzelle lokalisierte Anti-Liganden-Molekül ist vorzugsweise eines, an welches das Wildtyp-IMV-Pockenvirus-Partikel nicht bindet, oder eines, an das das Wildtyp-IMV-Pockenvirus-Partikel bindet, aber mit einer geringeren Spezifität als ein modifiziertes IMV-Pockenvirus-Partikel der Erfindung. Die Bindungsspezifität zwischen einem Liganden und einem gegebenen Anti-Liganden-Molekül kann gemäß Techniken dieses Fachgebiets, einschließlich ELISA, Immunfluoreszenz und auf Oberflächen-Plasmon-Resonanz basierenden Techniken (Biacore AB), bestimmt werden.
  • Allgemein werden die Ligandengruppierungen, die im Kontext der Erfindung verwendet werden können, in der Literatur umfassend beschrieben; es ist eine Gruppierung, die in der Lage ist, dem modifizierten IMV-Pockenvirus-Partikel der Erfindung die Fähigkeit zu verleihen, an ein gegebenes Anti-Liganden-Molekül oder eine Klasse von Anti-Liganden-Molekülen, das bzw. die auf der Oberfläche von wenigstens einer Zielzelle lokalisiert ist, zu binden. Geeignete Anti-Liganden-Moleküle umfassen, ohne Einschränkung, Polypeptide, die aus der Gruppe bestehend aus zellspezifischen Markern, gewebespezifischen Markern, zellulären Rezeptoren, viralen Antigenen, antigenen Epitopen und mit Tumoren assoziierten Markern ausgewählt werden. Anti-Liganden-Moleküle können darüber hinaus aus Zuckern, Lipiden, Glycolipiden, Antikörpern u.s.w. ... bestehen. Gemäß der Erfindung kann eine Ligandengruppierung beispielsweise ein Lipid, ein Glycolipid, ein Hormon, ein Zucker, ein Polymer (z.B. PEG, Polylysin, PEI, ...), ein Polypeptid, ein Oligonukleotid, ein Vitamin, ein Antigen, ein Lectin, eine Polypeptidgruppierung, welche eine „Targeting"-Eigenschaft (Eigenschaft, die die Zielgerichtetheit vermittelt) aufweist, wie beispielsweise JTS1 (WO 94/40958), ein Antikörper oder eine Kombination davon sein. Es kann auch ein Fragment der vorerwähnten Ligandengruppierung eingesetzt werden mit der Maßgabe, dass es die „Targeting"-Eigenschaft des natürlichen Moleküls beibehält.
  • Die im Rahmen der Erfindung verwendete Ligandengruppierung ist vorzugsweise ein Polypeptid mit einer minimalen Länge von 7 Aminosäuren. Sie ist entweder ein natives Polypeptid oder ein von einem nativen Polypeptid abgeleitetes Polypeptid. „Abgeleitet" bedeutet (i), dass sie eine oder mehrere Modifikationen bezogen auf die native Sequenz (z.B. Hinzufügung, Deletion und/oder Substitution von einem oder mehreren Resten) enthält, (ii) Aminosäureanaloga, einschließlich in der Natur nicht vorkommender Aminosäuren, enthält oder (iii) substituierte Verknüpfungen wie auch (vi) andere Modifikationen, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, enthält. Dieser Ausdruck umfasst Polypeptidvarianten und chimäre Polypeptide, die durch Fusionieren von Sequenzen unterschiedlicher Herkunft erhalten werden. Zusätzlich kann die Ligandengruppierung eine lineare oder cyclisierte Struktur (z.B. durch flankierende Cysteinreste an beiden Enden eines Polypeptidliganden) aufweisen. Zusätzlich kann die im Rahmen der Erfindung verwendete Ligandengruppierung Modifikationen gegenüber ihrer ursprünglichen Struktur aufgrund einer Substitution oder Hinzufügung von chemischen Gruppierungen (z.B. Glycosylierung, Alkylierung, Acetylierung, Amidierung, Phosphorylierung, Hinzufügung von Sulfhydrylgruppen und dergleichen) umfassen. Die Erfindung zieht auch Modifikationen mit in Betracht, die die Ligandengruppierung detektierbar machen. Zu diesem Zweck können Modifikationen mit einer detektierbaren Gruppierung in Betracht gezogen werden (d.h. eine szintigraphische, radioaktive, fluoreszierende Markierung oder Farbstoffmarkierung und dergleichen). Geeignete radioaktive Markierungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Tc99m, I123 und In111. Solche detektierbaren Markierungen können an die Ligandengruppierung durch jegliche herkömmliche Techniken angefügt werden und können zu Diagnosezwecken verwendet werden (z.B. bildgebende Darstellung von Tumorzellen).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Anti-Liganden-Molekül ein Antigen (z.B. ein zellspezifisches Antigen, ein Krankheits-spezifisches Antigen, ein spezifisch auf der Oberfläche von gentechnologisch modifizierten Zielzellen exprimiertes Antigen ...) und ist die Ligandengruppierung ein Antikörper, ein Fragment oder eine minimale Erkennungseinheit („minimal recognition unit") davon (d.h. ein Fragment, welches nach wie vor eine Antigenspezifität aufweist), wie jene, die detailliert in Immunologie-Handbüchern (siehe beispielsweise Immunology, 3. Auflage, 1993, Roitt, Brostoff und Male, Hrsg. Gambli, Mosby) beschrieben werden. Die Ligandengruppierung kann ein monoklonaler Antikörper sein. Es sind bereits monoklonale Antikörper, die an viele dieser Antigene binden werden, bekannt, aber in einem jeden Falle können mit den heutigen Techniken in Bezug auf die monoklonale Antikörper-Technologie Antikörper gegen die meisten Antigene hergestellt werden. Die Ligandengruppierung kann ein Teil eines Antikörpers (beispielsweise ein Fab-Fragment) oder ein synthetisches Antikörperfragment (beispielsweise ScFv) sein.
  • Geeignete monoklonale Antikörper gegen ausgewählte Antigene können durch bekannte Techniken, beispielsweise jene, die in „Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H. Zola (CRC Press, 1988) und in „Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J.G.R. Hurrell (CRC Press, 1982) offenbart werden, hergestellt werden. Geeignet hergestellte nicht-humane Antikörper können auf bekannte Weisen „humanisiert" werden, beispielsweise durch Inserieren der CDR-Regionen von Mäuse-Antikörpern in das Gerüst von humanen Antikörpern. Da die variable schwere (VH) und variable leichte (VL) Domänen des Antikörpers an der Antigenerkennung beteiligt sind, können zusätzlich variable Domänen von Nagetier-Herkunft an konstante Domänen von humaner Herkunft fusioniert werden, so dass der resultierende Antikörper die Antigenspezifität des Nagetier-Ausgangsantikörpers bewahrt (Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855).
  • Die Antigenspezifität von Antikörpern wird durch variable Domänen, einschließlich Fab-artiger Moleküle (Better et al. (1988) Science 240, 1041); Fv-Moleküle (Skerra et al. (1988) Science 240, 1038); ScFv-Moleküle, in denen die VH- und VL-Partnerdomänen über ein flexibles Oligopeptid verknüpft sein können (Bird et al. (1988) Science 242, 423; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) und dAbs, welche isolierte V-Domänen umfassen (Ward et al. (1989) Nature 341, 544), vermittelt. Eine allgemeine Übersicht über die an der Synthese von Antikörperfragmenten, die ihre spezifischen Bindungsstellen bewahren, beteiligten Techniken, kann in Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293–299, gefunden werden.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Ligandengruppierung aus Antikörperfragmenten anstelle von ganzen Antikörpern ausgewählt. Effektorfunktionen von ganzen Antikörpern, wie die Komplementbindung, werden entfernt. ScFv- und dAb-Antikörperfragmente können als Fusionen mit anderen Polypeptiden exprimiert werden. Minimale Erkennungseinheiten können von der Sequenz von einer oder mehreren der „complementary determining regions" (CDR) des Fv-Fragments abgeleitet werden. Ganze Antikörper und F(ab')2-Fragmente sind „bivalent". Unter „bivalent" verstehen wir, dass die Antikörper und F(ab')2-Fragmente zwei Antigenbindungsstellen aufweisen. Im Gegensatz dazu sind Fab-, Fv-, ScFv-, dAb-Fragmente und minimale Erkennungseinheiten monovalent, da sie nur eine Antigenbindungsstelle aufweisen.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die Ligandengruppierung wenigstens ein Teil einer speziellen Gruppierung, die an der Bindung durch den natürlichen Zelloberflächenrezeptor beteiligt ist. Selbstverständlich können diese natürlichen Rezeptoren (z.B. Hormonrezeptoren) ihrerseits Zielzellspezifische Antigene sein und können durch Ligandengruppierungen, die die Eigenschaft von irgendeinem eines monoklonalen Antikörpers, eines ScFv, eines dAb oder einer minimalen Erkennungseinheit aufweisen, erkannt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erlaubt die Ligandengruppierung, eine durch Viren infizierte Zelle spezifisch anzusteuern, und ist in der Lage, eine Viruskomponente (z.B. Hüllglycoprotein) zu erkennen und daran zu binden, oder in der Lage, mit der Virusbiologie (z.B. Eindringen, Replikation...) zu interferieren. Beispielsweise kann das zielgerichtete Ansteuern einer durch HIV (Human Immunodeficiency Virus) infizierten Zelle ausgeführt werden mittels einer Ligandengruppierung, welche für ein Epitop der HIV-Hülle spezifisch ist, wie einer Ligandengruppierung, die von dem 2F5-Antikörper (Buchacher et al, 1992, Vaccines 92, 191–195), welcher ein hochgradig konserviertes Epitop des Transmembranglycoproteins gp41 erkennt, abgeleitet ist, oder mittels einer Ligandengruppierung, die mit der Anheftung des HIV an dessen zellulären Rezeptor CD4 interferiert (z.B. die extrazelluläre Domäne des CD4-Moleküls).
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ermöglicht die Ligandengruppierung, eine Tumorzelle zielgerichtet anzusteuern, und ist in der Lage, ein mit dem Tumorstatus in Beziehung stehendes Molekül, wie ein Tumor-spezifisches Antigen, ein zelluläres Protein, welches in Tumorzellen unterschiedlich oder überexprimiert wird, oder ein Genprodukt eines mit einem Krebs assoziierten Virus, zu erkennen und daran zu binden.
  • Beispiele für Tumor-spezifische Antigene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf MUC-1, welches mit Brustkrebs in Beziehung steht (Hareuveni et al., 1990, Eur. J. Biochem. 189, 475–486), die durch die mutierten BRCA1- und BRCA2-Gene kodierten Produkte, die mit Brust- und Ovarialkrebsformen in Beziehung stehen (Miki et al., 1994, Science 226, 66–71; Futreal et al., 1994, Science 226, 120–122; Wooster et al., 1995, Nature 378, 789–792), APC, welches mit Kolonkrebs in Beziehung steht (Polakis, 1995, Curr. Opin. Genet. Dev. 5, 66–71), das Prostata-spezifische Antigen (PSA), welches mit Prostatakrebs in Beziehung steht (Starney et al., 1987, New England J. Med. 317, 909), das „carcinoma embryonic antigen" (CEA), das mit Kolonkrebsformen in Beziehung steht (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738–2748), Tyrosinase, welche mit Melanomen in Beziehung steht (Vile et al., 1993, Cancer Res. 53, 3860–3864), den Rezeptor für das Melanozyten-stimulierende Hormon (MSH), der in hoher Zahl in Melanomzellen exprimiert wird, ErbB-2, welches in Beziehung zu Brust- und Pankreaskrebsformen steht (Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170–175), und a-Foetoprotein, welches mit Leberkrebsformen in Beziehung steht (Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461–465).
  • Eine bei einer Verwendung im Rahmen der Erfindung bevorzugte Ligandengruppierung ist ein Fragment eines Antikörpers, der in der Lage ist, das MUC-1-Antigen zu erkennen und daran zu binden und folglich die MUC-1-positiven Tumorzellen zielgerichtet anzusteuern. Eine mehr bevorzugte Ligandengruppierung ist das scFv-Fragment des monoklonalen SM3-Antikörpers, der die in Tandemanordnung vorliegende Wiederholungsregion des MUC-1-Antigens erkennt (Burshell et al., 1987, Cancer Res. 47, 5476–5482; Girling et al., 1989, Int. J. Cancer 43, 1072–1076; Dokurno et al., 1998, J. Mol. Biol. 284, 713–728).
  • Beispiele von zellulären Proteinen, die in Tumorzellen unterschiedlich oder überexprimiert werden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf den Rezeptor für Interleukin 2 (IL-2), der bei einigen lymphoiden Tumoren überexprimiert wird, das GRP („Gastrin Release Peptide"; Gastrin-Freisetzungspeptid), welches in Lungenkarzinomzellen, bei Pankreas-, Prostata- und Magentumoren überexprimiert wird (Michael et al., 1995, Gene Therapy 2, 660–668), den TNF (Tumornekrosefaktor)-Rezeptor, Rezeptoren des epidermalen Wachstumsfaktors, den Fas-Rezeptor, CD40-Rezeptor, CD30-Rezeptor, CD27-Rezeptor, OX-40, ∀v Integrine (Brooks et al., 1994, Science 264, 569) und Rezeptoren für bestimmte angiogene Wachstumsfaktoren (Hanahan, 1997, Science 277, 48). Basierend auf diesen Angaben liegt es innerhalb des Vermögens der Fachleute auf diesem Gebiet, eine geeignete Ligandengruppierung zu definieren, die in der Lage ist, solche Proteine zu erkennen und an diese zu binden. Zur Veranschaulichung ist IL-2 eine geeignete Ligandengruppierung, um an den IL-2-Rezeptor zu binden.
  • Geeignete Genprodukte von mit Krebs assoziierten Viren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die frühen Polypeptide E6 und E7 wie auch die späten Polypeptide L1 und L2 des humanen Papillomavirus (HPV) ( EP 0 462 187 , US 5,744,133 und WO 98/04705), die bei Gebärmutterhalskrebs exprimiert werden, und das EBNA-1-Antigen des Epstein-Barr-Virus (EBV), das mit Burkitt-Lymphomen assoziiert ist (Evans et al., 1997, Gene Therapy 4, 264–267).
  • In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform ermöglicht die Ligandengruppierung, zielgerichtet gewebespezifische Moleküle anzusteuern. Beispielsweise umfassen Ligandengruppierungen, welche geeignet sind, um zielgerichtet Leberzellen anzusteuern, jene, die von ApoB (Apolipoprotein), welches in der Lage ist, an den LDL-Rezeptor zu binden, alpha-2-Makroglobulin, welches in der Lage ist, an den LPR-Rezeptor zu binden, saures alpha-1-Glycoprotein, welches in der Lage ist, an den Asialoglycoproteinrezeptor zu binden, und Transferrin, welches in der Lage ist, an den Transferrinrezeptor zu binden, sind aber nicht darauf beschränkt. Eine Ligandengruppierung zum zielgerichteten Ansteuern von aktivierten Endothelzellen kann von dem Sialyl-Lewis-X-Antigen (welches in der Lage ist, an ELAM-1 zu binden), von VLA-4 (welches in der Lage ist, an den VCAM-1-Rezeptor zu binden) oder von LFA-1 (welches in der Lage ist, an den ICAM-1-Rezeptor zu binden) abgeleitet werden. Eine von CD34 abgeleitete Ligandengruppierung ist nützlich, um die hämopoetischen Vorläuferzellen zielgerichtet durch Bindung an den CD34-Rezeptor anzusteuern. Eine Ligandengruppierung, welche von ICAM-1 abgeleitet ist, ist mehr dazu gedacht, Lymphozyten durch Bindung an den LFA-1-Rezeptor zielgerichtet anzusteuern. Schließlich kann das zielgerichtete Ansteuern von T-Helfer-Zellen eine Ligandengruppierung, welche von gp 120 von HIV abgeleitet ist, oder ein Klasse II-MHC-Antigen, welches in der Lage ist, an den CD4-Rezeptor zu binden, verwenden.
  • Für die Fachleute auf diesem Gebiet versteht sich, dass Ligandengruppierungen, die Polypeptide sind, bequem unter Verwendung von Techniken der in vitro-DNA-Rekombination hergestellt werden können. Die Ligandengruppierung kann mit einem Protein auf der Oberfläche des Viruspartikels fusioniert werden, wie nachfolgend offenbart wird, oder sie können unabhängig, beispielsweise durch de novo-Synthese oder durch Expression des geeigneten DNA-Fragments in eukaryotischen wie auch prokaryotischen Zellen synthetisiert und dann mit dem Viruspartikel gekoppelt werden, wie nachfolgend offenbart wird. Die Nukleinsäuresequenzen, die viele der Ligandengruppierungen kodieren, sind bekannt, beispielsweise jene für Peptidhormone, Wachstumsfaktoren, Zytokine und dergleichen und können leicht durch Bezugnahme auf öffentlich zugängliche Nukleotidsequenzdatenbanken, wie EMBL und GenBank, gefunden werden. Ist die Nukleotidsequenz einmal bekannt, ist es für den Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich, wie DNA, die die gewählte Ligandengruppierung kodiert, herzustellen ist unter Verwendung von beispielsweise chemischen DNA-Synthesetechniken oder durch Verwendung der Polymerasekettenreaktion, um die benötigte DNA ausgehend von genomischer DNA oder ausgehend von gewebespezifischer cDNA zu amplifizieren. Viele cDNAs, die Peptidhormone, Wachstumsfaktoren, die Gesamtheit oder einen Teil von Antikörpern, Zytokine und dergleichen kodieren, die allesamt als Ligandengruppierungen nützlich sein können, sind allgemein kommerziell erhältlich.
  • Mit „Zielzellen" bezeichnen wir die Zellen, die das modifizierte IMV-Pockenvirus-Partikel der Erfindung vorzugsweise infizieren kann. Abhängig von der Natur der Ligandengruppierung und/oder des Anti-Liganden-Moleküls können „Zielzellen" einen einzigartigen Typ von Zelle oder eine Gruppe von verschiedenen Arten von Zellen, die als ein gemeinsames Merkmal auf ihrer Oberfläche ein oder mehrere Anti-Liganden-Molekül(e), welche(s) durch eine oder mehrere Ligandengruppierung(en), die auf IMV-Pockenvirus-Partikeln der Erfindung vorliegt bzw. vorliegen, erkannt wird bzw. werden, aufweisen, bezeichnen. Für den Zweck der Erfindung besteht eine Zielzelle aus einer jeglichen Säugetierzelle (vorzugsweise humanen Zellen), die mit einem erfindungsgemäßen Pockenvirus-Partikel infiziert werden kann. Die Zelle kann eine primäre Zelle, eine transformierte Zelle oder eine Tumorzelle einer jeglichen Herkunft sein. Geeignete Zielzellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf hämopoetische Zellen (totipotente Stammzellen, Leukoryten, Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen, dendritische Zellen und dergleichen), Muskelzellen (Satellitenzellen, Myozyten, Myoblasten, Skelett- oder glatte Muskelzellen, Herzzellen), pulmonale Zellen, tracheale Zellen, hepatische Zellen, Epithelzellen, Endothelzellen oder Fibroblasten.
  • Mit „die Ligandengruppierung (oder alternativ das Anti-Liganden-Molekül) ist an der Oberfläche des Pockenvirus-Partikels (oder alternativ der Zielzellen) lokalisiert", meinen wir, dass die Ligandengruppierung (oder das Anti-Liganden-Molekül) auf der Oberfläche des IMV-Pockenvirus-Partikels (oder der Zielzellen) für eine Bindung an deren (dessen) spezifisches Anti-Liganden-Molekül (bzw. Ligandengruppierung) zugänglich ist, wenn das Pockenvirus-Partikel mit den Zielzellen in Kontakt gebracht wird. Diese Zugänglichkeit kann in vitro ohne unangemessenes Experimentieren unter Verwendung von Verfahren, die in der Literatur umfassend offenbart worden sind, gemessen werden.
  • Das IMV-Pockenvirus-Partikel der Erfindung kann ausgehend von einem jeglichen Mitglied der Pockenviridae-Familie, insbesondere einem Vacciniavirus, Kanarienvogelpocken-, Geflügelpocken-, Kuhpocken-, Insektenpocken-, Affenpocken-, Schweinepocken- oder Pinguinpocken-Virus erhalten werden. Es ist vorzugsweise ein Vacciniavirus des Copenha-gen-, Wyeth- oder des modifizierten Ankara- (MVA) -Stamms. Allgemein betreffen zahlreiche Veröffentlichungen die Sequenz und Biologie der Pockenviren und Pockenvirusstämme, die oben aufgeführt wurden. Darüber hinaus sind sie in anerkannten Sammlungen, wie der ATCC (Geflügelpocken ATCC VR-251, Affenpocken ATCC VR-267, Schweinepocken ATCC VR-363, Kanarienvogelpocken ATCC VR-111, Kuhpocken ATCC VR-302) oder der ICTV (Canberra, Australien) (Copenhagen-Virus Code 58.1.1.0.001; GenBank-Aufnahmenummer M35027), erhältlich.
  • Wie zuvor angegeben, umfasst ein IMV-Partikel den Viruskern, einschließlich des Virusgenoms, umgeben von einer einlagigen Lipidhülle mit viralen Polypeptiden, die auf dessen Oberfläche vorhanden sind, welche die Produkte, die durch die A27L- (p14-Protein), L1R-, A14L-, A17L- (p21-Protein), D8L-, A9L-, E10R- und H3L-Gene kodiert werden, umfassen.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform kann das Pockenvirus-Genom hinsichtlich wenigstens eines Gens, welches an der Produktion von EEV-Partikeln beteiligt ist, defekt sein und ist vorzugsweise hinsichtlich des F13L-Gens (welches das p37-Protein kodiert) defekt. Es ist von Borrego et al. (1999, J. Gen. Virol. 80, 425–432) gezeigt worden, dass die Deletion des F13L-Gens zu einem schweren Defekt bei dem Umhüllungsprozess von EEV führt, obwohl normale Konzentrationen von IMV produziert werden. Dementsprechend ist es durch Verändern des pockenviralen F13L-Gens möglich, die IMV-Produktion zu erhöhen. Dieses F13L-Gen kann durch vollständige oder partielle Deletion, Mutation oder Insertion einer jeglichen Sequenz innerhalb der kodierenden Sequenz oder des Promotors verändert werden. Gegebenenfalls kann das Pockenvirus-Genom auch hinsichtlich wenigstens eines Gens, dessen Produkt an der Wechselwirkung mit dem natürlichen zellulären Rezeptor, welche die Pockenvirus-Aufnahme vermittelt (z.B. Heparansulfat oder Chondroitinsulfat), beteiligt ist, verändert werden. Diese Techniken zur Genveränderung sind in diesem Fachgebiet wohlbekannt und werden in Borrego et al., 1999, a.a.O. veranschaulicht.
  • Die hier verwendete Gennomenklatur ist jene des Copenhagen-Vacciniastamms und wird auch für die homologen Gene von anderen Pockenviridae (z.B. MVA) verwendet, sofern nicht anders angegeben. Jedoch ist die Gennomenklatur je nach Pockenstamm unterschiedlich. Zur Information kann die Entsprechung zwischen Copenhagen- und MVA-Genen in Tabelle I von Antoine et al. (1998, Virol. 244, 365–396) gefunden werden. Beispielsweise wird das Copenhagen A27L-Gen in MVA als 138L bezeichnet, wobei beide Gene ein homologes p14 kDa-Protein mit ähnlichen Funktionen und ähnlicher Lokalisation an der IMV-Oberfläche kodieren.
  • Gemäß der Erfindung sind die IMV-Pockenvirus-Partikel in funktionaler Weise mit einer heterologen Ligandengruppierung, die im Rahmen der Erfindung verwendet wird, gekoppelt. „Funktional gekoppelt" bedeutet, dass das Partikel und die Ligandengruppierung in einer Beziehung zueinander stehen, die es diesen erlaubt, ihre Funktion in der beabsichtigten Weise zu entfalten (d.h. die Ligandengruppierung fördert die zielgerichtete Infektionsspezifität des IMV-Pockenvirus-Partikel gegenüber der gewünschten Zelle). Die Kopplung kann durch verschiedene Mittel oder Maßnahmen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, einschließlich kovalenter, nicht-kovalenter oder genetischer Mittel, vorgenommen werden.
  • Eine kovalente Kopplung von Ligandengruppierungen an die Oberfläche des IMV-Pockenvirus-Partikels kann direkt durch reaktive funktionale Gruppen oder indirekt durch eine Spacer- oder Abstandshaltergruppe oder eine andere aktivierende Gruppierung vorgenommen werden. Insbesondere kann die Kopplung erfolgen mit (i) homobifunktionalen oder (ii) heterobifunktionalen Vernetzungsmitteln, mit (iii) Carbodiimiden, (iv) durch reduktive Aminierung oder (vi) durch Aktivierung von Carboxylaten (siehe beispielsweise Bioconjugate techniques 1996; Hrsg. G. Hermanson; Academic Press).
  • Es können homobifunktionale Vernetzungsmittel, welche Glutaraldehyd und Bis-imidoester, wie DMS (Dimethylsuberimidat), umfassen, verwendet werden, um Amingruppen der Ligandengruppierung an Lipidstrukturen (z.B. der IMV-Hülle), welche Diacylamihe enthalten, zu koppeln.
  • Im Rahmen der Erfindung können viele heterobifunktionale Vernetzungsmittel verwendet werden, insbesondere jene, die sowohl Amin-reaktive als auch Sulfhydryl-reaktive Gruppen, Carbonylreaktive und Sulfhydryl-reaktive Gruppen und Sulfhydryl-reaktive Gruppen und photoreaktive Linker umfassen. Geeignete heterobifunktionale Vernetzer werden in Bioconjugate techniques (1996) 229-285; Hrsg. G. Hermanson; Academic Press) und WO 99140214 beschrieben. Beispiele der ersten Kategorie umfassen, sind aber nicht beschränkt auf SPDP (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat), SMBP (Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat), SMPT (Succinimidyloxycarbonyl-a-methyl-(a-2-pyridyldithio)toluol), MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester), SIAB (N-Succinimidyl-(4-iodacetyl)aminobenzoat), GMBS ((maleimidobutyryloxy)succinimidester), SIAX (Succinimidyl-6-iodacetylaminohexonat), SIAC (Succinimidyl-4-iodacetylaminomethyl), NPIA (p-Nitrophenyliodacetat). Die zweite Kategorie ist nützlich, um Kohlenwasserstoff-enthaltende Moleküle (z.B. env-Glycoproteine, Antikörper) an Sulfhydryl-reaktive Gruppen zu koppeln. Beispiele umfassen MPBH (4-(4-N-Maleimidophenyl)buttersäurehydrazid) und PDPH (4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylhydrazid (M2C2H und 3-2-(2-Pyridyldithio)propionylhydrazid. Als ein Beispiel für die dritte Kategorie kann man ASIB (1-(p-Azidosalicylamido)-4-(iodacetamido)butyrat) aufführen. Eine andere Alternative umfasst die Thiolreaktiven Reagenzien, die in Frisch et al. (Bioconjugate Chemistry 7 (1996) 180–186) beschrieben werden.
  • Eine Kopplung (iii) umfasst z.B. Amingruppen von Diacylaminen, die in Lipidstrukturen, die an der Carbodiimidreaktion mit Carboxylatgruppen der Ligandengruppierung teilnehmen können, vorhanden sind.
  • Eine Kopplung (iv) kann z.B. über eine Iminbildung, gefolgt von einer Reduktion unter Verwendung eines Cyanborhydrids, ausgeführt werden.
  • Eine Kopplung (vi) kann z.B. ein NHS-Ester-Derivat der Ligandengruppierung und Pockenvirus-Amingruppen, um stabile Amidbindungs-Verknüpfungen zu erzeugen, umfassen.
  • Ein anderes Beispiel verwendet eine Maleimid-Sulfhydryl-Bindung, welche eine Sulfhydrylgruppe und eine Sulfhydryl-reaktive Gruppe umfasst. Beispielsweise kann SATA (N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat) verwendet werden, um eine Sulfhydrylgruppe einzuführen, wohingegen Sulfo SMCC (Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat) verwendet werden kann, um eine Maleimidgruppe einzuführen, was zu einer kovalenten Thioetherbindung führt.
  • Eine kovalente Kopplung kann auch unter Verwendung eines Polymers, wie von Polyethylenglycol (PEG) oder von dessen Derivaten, ausgeführt werden. Das Polymer hat vorzugsweise ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 200 und 20000 Da. Es kann beispielsweise Tresyl-MPEG verwendet werden, um eine an Lys-Resten vorhandene Aminogruppe zu koppeln (siehe beispielsweise WO 99/40214). Andere Mittel, um zwei Partner über PEG zu konjugieren, werden in der Literatur beschrieben (in Bioconjugate techniques (1996) 606–618; Hrsg. G. Hermanson; Academic Press und Frisch et al., Bioconjugate Chem. 7 (1996) 180–186).
  • Eine nicht-kovalente Kopplung umfasst elektrostatische Wechselwirkungen, beispielsweise zwischen einer kationischen Ligandengruppierung und einem negativ geladenen IMV-Pockenvirus. Eine andere Alternative besteht in einer Verwendung von Affinitätskomponenten, wie Protein A, Biotin/Avidin, Antikörpern, die in der Lage sind, beide Partner nicht-kovalent oder anhand von Affinität zu assoziieren. Beispielsweise kann eine Kopplung zwischen einer Peptidligandengruppierung und einem IMV-Pockenvirus-Partikel biotinylierte Antikörper, die gegen ein auf der Oberfläche exponiertes Epitop gerichtet sind, und Streptavidin-markierte Antikörper, die gegen die Peptidligandengruppierung gerichtet sind, gemäß der von Roux et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9079) offenbarten Technik verwenden. Bifunktionale Antikörper, die gegen jeden der Kopplungspartner gerichtet sind, sind für diesen Zweck gleichfalls geeignet.
  • Eine genetische Kopplung ist dazu bestimmt, eine Ligandengruppierung, die ein Polypeptid oder ein Fragment davon ist, zu koppeln. Vorteilhafterweise wird eine Nukleinsäure, die die Ligandengruppierung kodiert, mit einer viralen Nukleinsäuresequenz, welche ein homologes pockenvirales Polypeptid, welches auf der Oberfläche des nicht-modifizierten IMV-Pockenvirus-Partikels lokalisiert ist, kodiert, fusioniert. Jedoch betrifft die Erfindung des Weiteren eine genetische Kopplung, bei welcher eine eine Ligandengruppierung kodierende Nukleinsäure mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein heterologes Polypeptid (z.B. ein Membranverankerungspolypeptid), welches erlaubt, die Ligandengruppie rung an der Oberfläche des IMV-Pockenvirus-Partikels zu lokalisieren, kodiert, fusioniert wird. Die Fusion der die Ligandengruppierung kodierenden Nukleinsäure wird in Regionen des Virusgenoms, die für die Integrität des Pockenvirus nicht-essentiell sind, vorgenommen.
  • Gemäß einer ersten Alternative führt die genetische Kopplung zu einem chimären Polypeptid, in welchem wenigstens ein Abschnitt des an der Oberfläche exponierten homologen pockenviralen Polypeptids entfernt und durch die heterologe Ligandengruppierung, die im Rahmen der Erfindung verwendet wird, ersetzt ist. Gemäß einer zweiten Alternative führt die genetische Kopplung zu einem chimären Polypeptid, in welchem die heterologe Liganden-Polypeptidgruppierung, die im Rahmen der Erfindung verwendet wird, in das an der Oberfläche exponierte homologe pockenvirale Polypeptid inkorporiert ist. Eine aus einer genetischen Kopplung resultierende Polypeptidfusion kann an einer jeglichen Stelle, am N-Terminus, C-Terminus oder zwischen zwei Aminosäureresten des viralen Polypeptids vorgenommen werden. Die ausgewählte genetische Kopplungsstelle (d.h. die Stelle der viralen Nukleinsäure, wo die die Ligandengruppierung kodierende Sequenz inseriert wird) zerstört vorzugsweise das entsprechende offene Leseraster nicht.
  • Da das Pockenvirus-Partikel der Erfindung ein IMV ist, umfassen homologe, an der Oberfläche exponierte pockenvirale Polypeptide, die für diese genetische Kopplung geeignet sind, die Expressionsprodukte der A27L- (p14-Protein), L1R-, A14L-, A17L- (p21-Protein), D8L-, A9L-, E10R- und H3L-Gene, sind aber nicht darauf beschränkt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nukleotidsequenz, die die Ligandengruppierung kodiert, mit der A27L-Gensequenz derart fusioniert, dass die Ligandengruppierung schließlich am N-Terminus von p14 lokalisiert ist. Die die Ligandengruppierung kodierende Nukleinsäure wird unmittelbar strangabwärts des A27L-Gen-Startcodons fusioniert.
  • Gemäß der Erfindung können die Ligandengruppierung und das IMV-Pockenvirus-Partikel weiter modifiziert werden, um die Kopplung zu verbessern oder zu stabilisieren. Insbesondere kann die Ligandengruppierung eine Spacer-Gruppierung an einem ihrer Enden aufweisen, um deren Zugänglichkeit gegenüber den Zielzellen zu vereinfachen. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße IMV-Pockenvirus-Partikel eine oder mehrere Ligandengruppierungen, die miteinander kombiniert sein können oder nicht, beispielsweise in einer Tandemstruktur, umfassen. Beispielsweise kann es, wenn es wünschenswert ist, die Spezifität des IMV-Pockenvirus-Partikels gegenüber speziellen Zielzellen zu erhöhen, vorteilhaft sein, eine Kombination von Ligandengruppierungen, die in der Lage sind, solche Zielzellen zu erkennen und daran zu binden, zu verwenden.
  • Gemäß den durch die Erfindung verfolgten Zielen kann die Ligandengruppierung ein Signalpeptid umfassen, welches deren Insertion in die Hülle des IMV-Pockenvirus-Partikels erleichtert. Obwohl die Verwendung einer hydrophoben Sequenz, welche eine Membranverankerung erlaubt, in Betracht gezogen werden kann, ist es bevorzugt, ein Signalpeptid zu verwenden, welches eine Translokation zu dem Trans-Golgi-Netzwerk erlaubt. Ein solches Peptid kann ausgehend von einem jeglichen Protein, welches von Natur aus in dem Golgi-Kompartiment vorhanden ist, isoliert oder identifiziert werden (siehe beispielweise Mochamer und Rose, 1987, J. Cell Biol. 105, 1205–1214; Mochamer, 1993, Curr. Opin. Cell Biol. 5, 606–612; Muesch et al., 1990, Trends Biochem sci 15, 86–88). Das Signalpeptid kann eine oder mehrere Modifikationen) in Hinblick auf die native Sequenz umfassen mit der Maßgabe, dass deren Funktion nicht signifikant verändert wird. Eine bevorzugte Signalsequenz, die im Rahmen der Erfindung verwendet wird, leitet sich von dem Glycoprotein TGN51 des humanen Trans-Golgi-Netzwerks ab (Kain et al., 1997, J. Biol. Chem. 273, 981–988). Sie wird vorzugsweise durch genetische Kopplung an dem N-Terminus der Ligandengruppierung eingebaut. Die Ligandengruppierung wird vorzugsweise genetisch mit einem viralen Polypeptid.
  • Obwohl es möglich ist, ein leeres IMV-Pockenvirus-Partikel (welches auch als Pseudo-Pockenvirus-Partikel bezeichnet wird), welches die oben beschriebene spezifische Infektionseigenschaft zeigt, zu erhalten, umfasst gemäß einer bevorzugten Ausführungsform das IMV-Pockenvirus-Partikel der Erfindung wenigstens eine Nukleinsäure von Interesse, insbesondere eine rekombinante Nukleinsäure, welche wenigstens ein therapeutisches Gen, welches unter die Kontrolle der Elemente, die dessen Expression in eukaryotischen Zielzellen erlauben, gestellt ist, umfasst. Es können jedoch leere IMV-Pockenvirus-Partikel oder ein Pseudo-Pockenvirus-Partikel der Erfindung bei der Bildung von Komplexen mit Nukleinsäuren von Interesse zur Vereinfachung von deren zielgerichteter zellulärer Aufnahme verwendet werden, wie in US 5,928,944 und WO 9521259 offenbart.
  • Der Ausdruck „Nukleinsäure" innerhalb der Erfindung soll eine jegliche mögliche Nukleinsäure, insbesondere sowohl DNA als auch RNA oder eine hybride Form, einzel- oder doppelsträngig, linear oder zirkulär, natürlich oder synthetisch, modifiziert oder nicht-modifiziert, bezeichnen (siehe US 5525711 , US 4711955 oder EP-A 302 175 für Modifizierungsbeispiele). Sie kann unter anderem eine genomische DNA, eine genomische RNA, eine cDNA, eine mRNA, eine Antisinn-RNA, eine ribosomale RNA, ein Ribozym, eine Transfer-RNA oder DNA, welche solche RNAs kodiert, sein. Die Nukleinsäure kann in Form eines Plasmids oder einer linearen Nukleinsäure, das bzw. die wenigstens eine exprimierbare Sequenz enthält, die ein Polypeptid, ein Ribozym, eine Antisinn-RNA oder ein anderes Molekül von Interesse nach einer Abgabe an eine Zelle erzeugen kann, vorliegen. Die Nukleinsäure kann auch ein Oligonukleotid sein (d.h. eine Nukleinsäure mit einer kurzen Größe von we niger als 100 bp), die an die Zelle abgegeben werden soll, z.B. für Antisinn- oder Ribozym-Funktionen. Die Nukleinsäure liegt vorzugsweise in Form einer pockenviralen genomischen DNA vor.
  • Wenn die Nukleinsäure die korrekten genetischen Informationen enthält, wird deren Transkriptionseinheit, wenn sie in eine für die Genexpression geeignete Umgebung gebracht wird, folglich das kodierte Genprodukt exprimieren. Das Niveau und die Zellspezifität der Expression werden in einem signifikanten Ausmaß von der Stärke und der Herkunft des damit assoziierten Promotors und dem Vorhandensein und der Aktivierung eines damit assoziierten Enhancer-Elements abhängen. So umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform das Transkriptionskontrollelement die Promotor/Enhancer-Sequenzen, wie den CMV-Promotor/Enhancer. Die Fachleute auf diesem Gebiet werden jedoch erkennen, dass verschiedene andere Promotor- und/oder Enhancer-Sequenzen bekannt sind, die ausgehend von einer jeglichen viralen, prokaryotischen, z.B. bakteriellen, oder eukaryotischen erhalten werden können, die konstitutiv oder regulierbar sind, die für eine Expression in eukaryotischen Zellen und insbesondere in Zielzellen geeignet sind. Genauer umfassen diese für die Expression durch eine Zielzelle erforderlichen genetischen Informationen alle Elemente, die für eine Transkription der DNA zu mRNA und, sofern erforderlich, für die Translation von mRNA in ein Polypeptid erforderlich sind. Transkriptionelle Promotoren, die für eine Verwendung in verschiedenen Vertebratensystemen geeignet sind, sind in der Literatur umfassend beschrieben. Geeignete Promotoren umfassen beispielsweise virale Promotoren, wie RSV, MPSV, SV40, CMV oder 7.5K, einen Vacciniavirus-Promotor, induzierbare Promotoren u.s.w. Bevorzugte Promotoren werden aus Pockenviren isoliert, z.B. 7.5K, H5R, TK, p28, p11 oder K1L von Vacciniavirus. Alternativ kann man einen synthetischen Promotor verwenden, wie jene, die in Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23, 1094–1097), Hammond et al. (1997, J. Virological Methods 66, 135–138) und Kumar und Boyle (1990, Virology 179, 151–158) beschrieben werden, wie auch chimäre Promotoren zwischen frühen und späten pockenviralen Promotoren.
  • Die Nukleinsäure kann des Weiteren zusätzliche funktionale Elemente, wie Intronsequenzen, Targeting-Sequenzen, Transportsequenzen, ein Sekretionssignal, Kernlokalisierungssignal, IRES, poly A-Transkriptionsterminationssequenzen, dreiteilige Leadersequenzen, an Replikation oder Integration beteiligte Sequenzen umfassen. Über diese Sequenzen ist in der Literatur berichtet worden und diese können durch die Fachleute auf diesem Gebiet leicht erhalten werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Nukleinsäure von Interesse wenigstens eine Sequenz von Interesse, welche ein Genprodukt kodiert, das ein therapeutisches Molekül ist, (d.h. ein therapeutisches Gen). Ein „therapeutisches Molekül" ist eines, das eine pharmakologische oder schützende Aktivität aufweist, wenn es in geeigneter Weise an einen Patienten, insbesondere einen Patienten, der unter einer Krankheit oder einem Erkrankungszustand leidet oder der gegen diese Krankheit oder diesen Zustand geschützt werden sollte, verabreicht wird. Eine derartige pharmakologische oder schützende Aktivität ist eine, von der erwartet wird, dass sie mit einer günstigen Wirkung auf den Verlauf oder ein Symptom dieser Krankheit oder dieses Zustands verbunden ist. Wenn der Fachmann im Verlauf der Erfindung ein ein therapeutisches Molekül kodierendes Gen auswählt, setzt er im allgemeinen seine Wahl in Beziehung zu zuvor erhaltenen Ergebnissen und kann vernünftigerweise ohne unangemessenes Experimentieren außer einem solchen, um die Erfindung, wie beansprucht, praktisch auszuführen, erwarten, eine solche pharmakologische Eigenschaft zu erhalten. Gemäß der Erfindung kann die Sequenz von Interesse homolog oder heterolog zu den Zielzellen, in die sie eingeführt wird, sein. Vorteilhafterweise kodiert die Sequenz von Interesse die Gesamtheit oder einen Teil eines Polypeptids, insbesondere ein therapeutisches oder prophylaktisches Polypeptid, welches eine therapeutische oder prophylaktische Eigenschaft liefert. Ein Polypeptid versteht sich als ein jegliches Translationsprodukt eines Polynukleotids unabhängig von der Größe und davon, ob es glycosyliert ist oder nicht, und umfasst Peptide und Proteine. Therapeutische Polypeptide umfassen als ein erstes Beispiel jene Polypeptide, die defekte oder mangelhaft vorhandene Proteine in einem tierischen oder menschlichen Organismus kompensieren können, oder jene, die durch toxische Effekte wirken können, um schädliche Zellen aus dem Körper zu begrenzen oder zu entfernen. Sie können auch Immunität verleihende Polypeptide sein, die als endogenes Antigen wirken, um eine humorale oder zelluläre Antwort oder beides hervorzurufen.
  • Beispiele von Polypeptiden, die durch ein therapeutisches Gen kodiert werden, umfassen Gene, die ein Zytokin (alpha-, beta- oder gamma-Interferon, Interleukin, insbesondere IL-2, IL-6, IL-10 oder IL-12, einen Tumornekrosefaktor (TNF), einen koloniestimulierenden Faktor GM-CSF, C-CSF, M-CSF...), ein immunstimulatorisches Polypeptid (B7.1, B7.2 und dergleichen), einen Gerinnungsfaktor (FVIII, FIX...), einen Wachstumsfaktor (transformierender Wachstumsfaktor TGF, Fibroblastenwachstumsfaktor FGF und dergleichen), ein Enzym (Urease, Renin, Thrombin, Metalloproteinase, Stickoxidoxidase NOS, SOD, Katalase...), einen Enzyminhibitor (alphal-Antitrypsin, Antithrombin III, viraler Proteaseinhibitor, Plasminogenaktivatorinhibitor PAI-1), das CFTR („Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator"; zystische Fibrose-Transmembranleitfähigkeitsregulator)-Protein, Insulin, Dystrophin, ein MHC-Antigen der Klasse I oder II, ein Polypeptid, das die Expression von zellulären Genen modulieren/regulieren kann, ein Polypeptid, das in der Lage ist, eine bakterielle, durch Parasiten hervorgerufene oder virale Infektion oder deren Entwicklung zu hemmen (antigene Polypeptide, antigene Epitope, transdominante Varianten, welche die Wirkung eines nativen Proteins durch Kompetition hemmen....), eine Apoptose induzierende Substanz oder einen Apoptose-Inhibitor (Bax, Bcl2, BclX...), ein zytostatisches Mittel (p21, p 16, Rb...), ein Apolipoprotein (ApoA1, ApoAIV, ApoE...), einen Inhibitor der Angiogenese (Angiostatin, Endostatin...), ein angiogenes Polypeptid (Familie der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren VEGF, FGF-Familie, CCN-Familie, einschließlich CTGF, Cyr61 und Nov), einen Sauerstoffradikalfänger, ein Polypeptid mit einer Antitumorwirkung, einen Antikörper, ein Toxin, ein Immuntoxin und einen Marker (beta-Galactosidase, Luciferase...) kodieren, oder jegliche andere Gene von Interesse, die in diesem Fachgebiet als nützlich für die Behandlung oder Verhütung eines klinischen Zustands anerkannt sind.
  • Angesichts einer Behandlung einer vererbten Dysfunktion kann man ein funktionales Allel eines defekten Gens, beispielsweise ein Faktor VIII oder IX kodierendes Gen im Kontext von Hämophilie A oder B, Dystrophin (oder Minidystrophin) im Kontext von Muskeldystrophien, Insulin im Kontext von Diabetes, CFTR im Kontext von zystischer Fibrose, verwenden.
  • Geeignete Antitumorgene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf jene, die Tumorsuppressorgene (z.B. Rb, p53, DCC, NF-1, Wilms-Tumor, NM23, BRUSH-1, p16, p21, p56, p73 wie auch deren jeweilige Mutanten), Suizidgenprodukte, Antikörper, Polypeptide, die die Zellteilung oder Translationssignale hemmen, kodieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das therapeutische Gen ein Suizidgen, welches ein Expressionsprodukt kodiert, welches in der Lage ist, eine inaktive Substanz (Prodrug) in eine zytotoxische Substanz umzuwandeln, wodurch ein Zelltod bewirkt wird. Das TK HSV-1 kodierende Gen bildet den Prototyp der Suizidgenfamilie (Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90, 7024–7028; Culver et al., 1992, Science 256, 1550–1552). Obwohl das TK-Polypeptid als solches nicht toxisch ist, katalysiert es die Umwandlung von Nukleosid-Analoga (Prodrug), wie Acyclovir oder Ganciclovir. Die umgewandelten Nukleoside werden in die DNA-Ketten, die sich im Verlängerungsprozess befinden, eingebaut, bewirken eine Unterbrechung der Verlängerung und dementsprechend eine Hemmung der Zellteilung. Gegenwärtig steht eine große Anzahl von Suizidgen/Prodrug-Kombinationen zur Verfügung. Jene, die spezieller erwähnt werden können, sind Ratten-Cytochrom p450 und Cyclophosphophamid (Wei et al., 1994, Human Gene Ther. 5, 969–978), Escherichia coli (E. coli)-Purinnukleosidphosphorylase und 6-Methylpurindesoxyribonukleosid (Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 223–238), E. coli-Guaninphosphoribosyltransferase und 6-Thioxanthin (Mzoz et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 589–595). Jedoch umfasst in einer mehr bevorzugten Ausführungsform das Pockenvirus-Partikel der Erfindung ein Suizidgen, welches ein Polypeptid mit einer Cytosindesaminase (CDase)- oder einer Uracilphosphoribosyltransferase (UPRTase)-Aktivität oder sowohl CDa se- als auch UPRTase-Aktivität kodiert, das mit dem Prodrug 5-Fluorcytosin (5-FC) verwendet werden kann. Die Verwendung einer Kombination von Suizidgenen, welche z.B. Polypeptide mit CDase- und UPRTase-Aktivitäten kodieren, kann im Kontext der Erfindung ebenfalls in Betracht gezogen werden.
  • CDase- und UPRTase-Aktivitäten sind in Prokaryoten und niederen Eukaryoten nachgewiesen worden, sind aber in Säugetieren nicht vorhanden. CDase ist normalerweise am Pyrimidin-Stoffwechselweg, durch welchen exogenes Cytosin in Uracil mittels einer hydrolytischen Desaminierung umgewandelt wird, beteiligt, wohingegen UPRTase Uracil in UMP umwandelt. Jedoch desaminiert CDase auch ein Cytosin-Analog, 5-FC, wodurch 5-Fluoruracil (5-FU) gebildet wird, welches hochgradig zytotoxisch ist, wenn es zu 5-Fluor-UMP (5-FUMP) durch UPRTase-Wirkung umgewandelt wird.
  • Geeignete CDase kodierende Gene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf das Saccharomyces-FCY1-Gen (Erbs et al., 1997, Curr. Genet 31, 1–6; WO 93/01281) und das E. coli-codA-Gen ( EP 402 108 ). Geeignete UPRTase kodierende Gene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf jene aus E. coli (upp-Gen; Anderson et al., 1992, Eur. J. Biochem. 204, 51–56), Lactococcus lactis (Martinussen und Hammer, 1994, J. Bacteriol. 176, 6457–6463), Mycobacterium bovis (Kim et al., 1997, Biochem. Mol. Biol. Int. 41, 1117–1124), Bacillus subtilis (Martinussen et al., 1995, J. Bacteriol. 177, 271–274) und Saccharomyces cerevisiae (FUR-1-Gen; Kern et al., 1990, Gene 88, 149–157). Das CDase kodierende Gen ist vorzugsweise von dem FCY1-Gen abgeleitet und das UPRTase kodierende Gen ist von dem FUR-1-Gen abgeleitet.
  • Die Erfindung umfasst auch die Verwendung von mutierten Suizidgenen, die durch Hinzufügung, Deletion und/oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden modifiziert worden sind mit der Maßgabe, dass die zytotoxische Aktivität des Genprodukts bewahrt bleibt. In der Literatur ist über eine bestimmte Anzahl von CDase- und UPRTase-Mutanten berichtet worden, einschließlich eines Fusionsproteins, welches ein Zwei-Domänen-Enzym, welches sowohl CDase- als auch UPRTase-Aktivität aufweist (WO 96/16183), kodiert, wie auch einer Mutante der UPRTase, welche durch das FUR-1-Gen kodiert wird, bei welchem die ersten 35 Reste deletiert sind (in WO 99/54481 offenbartes mutiertes FCU-1).
  • Wie oben erwähnt, sollen therapeutische Gene auch Antisinn-Sequenzen und Ribozym kodierende Gene umfassen, welche in der Lage sind, die RNA von ausgewählten positiv-wirkenden die Vermeh rung regulierenden Genen, wie Onkogenen und Protoonkogenen (c-myc, c-fos, c-jun, c-myb, c-ras, Kc und JE), zu binden und zu zerstören.
  • Die in das IMV-Pockenvirus-Partikel der Erfindung eingebaute Nukleinsäure kann ein oder mehrere therapeutisches) Gene) umfassen. In dieser Hinsicht ist die Kombination von Genen, welche ein Suizidgenprodukt und ein Zytokingen (z.B. a,-, b- oder g-Interferone, Interleukine, vorzugsweise ausgewählt aus IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 oder IL-12, TNF-Faktoren, GM-CSF, C-CSF, M-CSF...), ein immunstimulatorisches Gen (z.B. B7.1, B7.2, ICAM) oder ein Chemokingen (z.B. MIP, RANTES, MCP 1,...) kodieren, vorteilhaft. Die Expression der verschiedenen Gene kann durch einen einzigen Promotor (polycistronische Kassette) oder durch unabhängige Promotoren kontrolliert werden. Darüber hinaus können sie an einer einzigen Stelle oder an verschiedenen Stellen entlang der Nukleinsäure entweder in der gleichen oder in entgegengesetzter Richtung inseriert werden.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ferner einen Vektor, welcher wenigstens eine Nukleotidsequenz umfasst, welche ein chimäres Protein kodiert, welches (i) wenigstens eine heterologe Ligandengruppierung, wie zuvor beschrieben, und (ii) die Gesamtheit oder einen Teil eines homologen viralen Polypeptids, welche von Natur aus an der Oberfläche eines IMV-Pockenvirus-Partikels lokalisiert ist, wie zuvor offenbart, umfasst. Selbstverständlich ist die Nukleotidsequenz unter die Kontrolle von Elementen, die für dessen Expression erforderlich sind, gestellt. Die Wahlmöglichkeiten des erfindungsgemäßen Vektors sind groß und für die Fachleute auf diesem Gebiet zugänglich. Der Vektor kann ein Plasmid oder ein viraler Vektor, der von einem jeglichen tierischen Virus, insbesondere einem Adenovirus, einem Retrovirus, einem AAV (Adenovirus-assoziiertes Virus) oder einem Pockenvirus, abgeleitet ist, sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor der Erfindung ein pockenviraler Vektor (d.h. eine Pockenvirus-Genom-DNA, insbesondere eine VV- oder MVA-Genom-DNA). Der Ausdruck „Teil", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Fragment des viralen Polypeptids, das eine Exposition der Ligandengruppierung an der Oberfläche eines viralen Vektors erlaubt. Darüber hinaus kann ein erfindungsgemäßer Vektor auch wenigstens eine Nukleotidsequenz von Interesse umfassen.
  • Die grundlegende Technik zum Inserieren der Sequenzen von Interesse und von damit assoziierten Elementen, die für die Expression erforderlich sind, in ein virales Genom wird in zahlreichen Dokumenten, die den Fachleuten auf diesem Gebiet zugänglich sind, beschrieben (Piccini et al., 1987, Methods of Enzymology 153, 545–563; US 4,769,330 ; US 4,772,848 , US 4,603,112 ; US 5,100,587 und US 5,179,993 ). Diese Technik betrifft homologe Rekombinationsereignisse zwischen überlap penden Sequenzen in einem viralen Genom (d.h. gewünschte Insertionsstelle) und einem Plasmid, welches die Sequenz von Interesse umfasst.
  • Die Insertionsstelle innerhalb des pockenviralen Genoms ist vorzugsweise ein nicht-essentieller Genort, damit das rekombinante Pockenvirus lebensfähig und infektiös bleibt. Geeignete nicht-essentielle Regionen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf nicht-kodierende intergenische Regionen oder ein jegliches Gen, bei welchem eine Inaktivierung oder Deletion die Virusvermehrung, -replikation oder -infektion nicht signifikant beeinträchtigt. Man kann auch die Insertion in einen essentiellen viralen Genort in Betracht ziehen mit der Maßgabe, dass die defekte Funktion in trans während der Produktion von Viruspartikeln bereitgestellt wird, beispielsweise durch Verwendung einer Helferzelllinie, welche die komplementierenden Sequenzen, welche jenen, die in dem pockenviralen Genom deletiert worden sind, entsprechen, trägt.
  • Man wird beispielsweise bei einer Verwendung des Copenhagen-Vacciniavirus vorzugsweise eine Insertionsstelle auswählen, welche innerhalb des Thymidinkinasegens (tk) lokalisiert ist (Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3411–3415; Weir et al., 1983, J. Virol. 46, 530–537). Jedoch sind auch andere Insertionsstellen geeignet, wie innerhalb des Hämagglutiningens (Guo et al., 1989, J. Virol. 63, 4189–4198), innerhalb des K1L-Genorts, innerhalb des u-Gens (Zhou et al., 1990, J. Gen. Virol. 71, 2185–2190) oder am linken Ende des Vacciniavirus-Genoms, wo über verschiedene spontane oder durch gentechnologische Maßnahmen eingeführte Deletionen berichtet worden ist (Altenburger et al., 1989, Archives Virol. 105, 15–27; Moss et al., 1981, J. Virol. 40, 387–395; Panicali et al., 1981, J. Virol. 37, 1000–1010; Perkus et al., 1989, J. Virol. 63, 3829–3836; Perkus et al., 1990, Virol. 179, 276–286; Perkus et al., 1991, Virol. 180, 406–410).
  • Bei einer Verwendung von MVA wird man vorzugsweise eine Insertionsstelle auswählen, die innerhalb einer beliebigen der identifizierten Deletionen I bis VII und vorzugsweise in der Deletion II oder III (Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031–1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032–1040) wie auch innerhalb des D4R-Genorts lokalisiert ist.
  • Bei einer Verwendung von Geflügelpockenvirus wird die Sequenz von Interesse, obwohl eine Insertion innerhalb des Thymidinkinasegens mit in Betracht gezogen werden kann, vorzugsweise in eine nicht-kodierende intergenische Region, z.B. die intergenische Region, die sich zwischen den ORFs 7 und 9 des 1,3 kb-HindIII-Fragments des Geflügelpocken-Genoms befindet, eingeführt (siehe beispielsweise EP 314 569 und US 5,180,675 ).
  • Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines IMV-Pockenvirus-Partikels gemäß der Erfindung bereit, welches die Schritte umfasst:
    • a) ein Einsaat-Präparat des Pockenvirus-Partikels zu erhalten;
    • b) eine Kultur von permissiven Zellen herzustellen,
    • c) die Zellkultur mit dem Einsaat-Präparat des Pockenvirus-Partikels zu infizieren,
    • d) die infizierten Zellen für eine geeignete Zeitspanne zu kultivieren,
    • e) die produzierten Pockenvirus-Partikel ausgehend von der Zellkultur und/oder dem Kulturüberstand zu gewinnen und
    • f) gegebenenfalls die gewonnenen Pockenvirus-Partikel zu reinigen.
  • Gemäß einer speziellen Ausführungsform ist es möglich, die Schritte a) und c) zu kombinieren. In diesem Falle umfasst das Verfahren der Erfindung die Schritte:
    • a) eine Kultur von permissiven Zellen herzustellen,
    • b) die Zellkultur mit einem Wildtyp-Pockenvirus-Partikel zu infizieren und die Zelle mit einem Plasmid, welches eine Sequenz von Interesse flankiert von überlappenden Sequenzen, die zu einer homologen Rekombination mit dem DNA-Genom des Pockenvirus in der Lage sind, zu transfizieren,
    • c) die Zellen für eine geeignete Zeitspanne zu kultivieren,
    • d) die produzierten Pockenvirus-Partikel ausgehend von der Zellkultur und/oder dem Kulturüberstand zu gewinnen und
    • e) gegebenenfalls die gewonnenen Pockenvirus-Partikel zu reinigen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind „permissive Zellen" primäre Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF), die ausgehend von Hühnerembryos, die ausgehend von befruchteten Eiern erhalten worden sind, hergestellt worden sind. Gemäß der besonderen Ausführungsform, wenn das pockenvirale Genom des Partikels hinsichtlich einer oder mehrerer viraler Funktionen defekt ist (z.B. bezüglich wenigstens eines Gens, welches an der Produktion von EEV-Partikeln beteiligt ist), kann es vorteilhaft sein, Helferzellen zu verwenden, die in trans die defekte Funktion bereitstellen. Insbesondere werden Pockenviren, die hinsichtlich der durch das F13L-Gen kodierten Funktion defekt sind, vorzugsweise auf einer Zelllinie, die das F13L-Expressionsprodukt exprimiert, kultiviert. Eine solche Zelllinie kann durch Transfektion eines geeigneten Vektors, welcher das F13L-Polypeptid exprimiert, erzeugt werden, wie in Borrego et al. beschrieben (1999, J. Gen. Virol. 80, 425–432). Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform können Isolierung und Vermehrung eines Pockenvirus-Partikels der Erfindung mittels einer Zielzelllinie ausgeführt werden, welche auf ihrer Oberfläche das durch die Ligandengruppierung der Erfindung erkannte Anti-Liganden-Molekül aufweist. Dies ermöglicht, eine mög liche Verunreinigung mit dem Wildtyp-Genom zu minimieren. Beispielsweise wird ein Pockenvirus-Partikel mit einer für das MUC-1-Polypeptid spezifischen Ligandengruppierung vorzugsweise auf MUC-1 exprimierenden Zielzellen vermehrt. Die Konstruktion von solchen Zelllinien, die auf ihrer Oberfläche ein Anti-Liganden-Molekül exprimieren, liegt innerhalb des Vermögens eines Fachmanns auf diesem Gebiet.
  • Das „Einsaat-Präparat des Pockenvirus-Partikels" wird gemäß den üblichen Techniken am Ende der homologen Rekombinationsereignisse zwischen dem pockenviralen Genom und dem Plasmid, welches die Sequenz von Interesse beherbergt, erhalten. In dieser Hinsicht kann man sich beispielsweise auf den experimentellen Abschnitt der vorliegenden Unterlagen beziehen.
  • In dem Falle, wo eine zusätzliche Transfektion der Zellen mit einem Plasmid erforderlich ist, können verschiedene weithin verwendete Zelltransfektionsmethoden verwendet werden (z.B. DNA-Aufällung mit Calcium, Elektrotransfektion...), gegebenenfalls kombiniert mit einem Glycerol, welches die Plasmidaufnahme vereinfachen kann. Zusätzlich kann ein Selektionsschritt mit aufgenommen werden, wenn das rekombinante Virus ein der Selektion dienendes Gen (z.B. das E. coli-gpt-Gen) enthält, beispielsweise durch Verwendung eines selektiven Kulturmediums, welches eine Mischung von Mycophenolsäure, Xanthin und Hypoxanthin enthält, in Schritt c).
  • Obwohl die Viruspartikel aus dem Kulturüberstand gewonnen werden können, können sie auch aus den Zellen gewonnen werden. Eine der üblicherweise verwendeten Methoden besteht darin, die Zellen durch ein jegliches Mittel oder eine jegliche Maßnahme (chemisch, Einfrieren/Auftauen, osmotischer Schock, mechanischer Schock, Beschallung und dergleichen) zu lysieren. Das IMV-Pockenvirus-Partikel der Erfindung kann durch aufeinanderfolgende Runden von Plaque-Reinigung isoliert und dann unter Verwendung der Techniken dieses Fachgebiets (chromatographische Methoden, Ultrazentrifugation auf Cäsiumchlorid- oder Saccharose-Gradient) gereinigt werden. Alternativ kann die Affinität zwischen der auf der Virusoberfläche präsentierten Ligandengruppierung und deren Anti-Ligand zum Reinigen des IMV-Pockenvirus-Partikels der Erfindung verwendet werden. Beispielsweise kann die Reinigung ausgeführt werden, indem (a) der betreffende Anti-Ligand auf einem festen Träger immobilisiert wird, b) die Viruspräparation mit dem immobilisierten Anti-Liganden für eine ausreichende Zeitspanne, um eine spezifische Bindung zwischen dem Anti-Liganden und der Ligandengruppierung zu ermöglichen, in Kontakt gebracht wird, c) das ungebundene Material verworfen wird und d) das gebundene Material eluiert wird und e) das eluierte Material gewonnen wird. Eine solche Reinigung kann vorteilhaft sein, um eine etwaige Verunreinigung der IMV-Pockenvirus-Partikel der Erfindung mit Wildtyp- oder Helfer-Pockenviren zu verringern.
  • Das Verfahren der Erfindung kann verwendet werden, um sowohl IMV- als auch EEV-Pockenvirus-Partikel herzustellen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren einen ergänzenden Schritt, welcher ein Aufbrechen der zusätzlichen Hülle von EEV und eine selektive Produktion von IMV erlaubt. Vorzugsweise besteht dieser weitere Schritt in einem Beschallungsschritt oder Solubilisierungsschritt in einem milden Detergens (z.B. Brij-58).
  • Die Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, die wenigstens ein IMV-Pockenvirus-Partikel und/oder wenigstens einen Vektor gemäß der Erfindung umfasst. In einem speziellen Fall umfasst die Zusammensetzung zwei oder mehr IMV-Pockenvirus-Partikel und/oder zwei oder mehr Vektoren der Erfindung, wobei diese sich voneinander durch (i) die Natur der heterologen Ligandengruppierung und/oder (ii) die Natur der Nukleinsäure oder der Sequenz von Interesse und/oder (iii) die Herkunft des Pockenvirus unterscheiden. Diese Zusammensetzung kann in verschiedenen Formen vorliegen, z.B. in fester, flüssiger, pulverförmiger, wässriger, lyophilisierter Form. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst diese Zusammensetzung des Weiteren einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, welcher deren Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung von Menschen oder Tieren ermöglicht. In diesem besonderen Falle ist der Träger vorzugsweise ein pharmazeutisch geeigneter injizierbarer Träger oder ein pharmazeutisch geeignetes injizierbares Verdünnungsmittel (für Beispiele siehe Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., 1980, Mack Publishing Co.). Ein solcher Träger oder ein solche Verdünnungsmittel ist pharmazeutisch annehmbar, d.h. ist für einen Empfänger in der eingesetzten Dosierung und Konzentration nicht-toxisch. Sie ist vorzugsweise isotonisch, hypotonisch oder schwach hypertonisch und weist eine relativ geringe Innenstärke, wie sie beispielsweise durch eine Saccharoselösung bereitgestellt wird, auf. Darüber hinaus kann sie jegliche relevante Lösemittel, wässrige oder teilweise wässrige flüssige Träger, umfassend steriles pyrogenfreies Wasser, Dispersionsmedien, Überzüge und äquivalente Mittel oder Verdünnungsmittel (z.B. Tris-HCl, -Acetat, -Phosphat), Emulgatoren, Solubilisierungsmittel oder Adjuvantien, enthalten. Der pH der pharmazeutischen Zubereitung wird in geeigneter Weise eingestellt und gepuffert, um bei in vivo-Anwendungen nützlich zu sein. Sie kann entweder als flüssige Lösung oder als feste Form (z.B. lyophilisiert), die in einer Lösung vor einer Verabreichung suspendiert werden kann, hergestellt werden. Repräsentative Beispiele für Träger oder Verdünnungsmittel für eine injizierbare Zusammensetzung umfassen Wasser, isotonische Kochsalzlösungen, die vorzugsweise auf einen physiologischen pH gepuffert sind (wie mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung oder mit Tris gepufferte Kochsalzlösung), Mannitol, Dextrose, Glycerol und Ethanol, wie auch Polypeptide oder Proteine, wie humanes Serumalbumin. Eine solche Zusammensetzung kann beispielsweise 10 mg/ml Mannitol, 1 mg/ml HSA, 20 mM Tris, pH 7,2, und 150 mM NaCl umfassen.
  • Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auf eine herkömmliche Weise für eine örtliche, systemische, orale, rektale oder topische Verabreichung hergestellt werden. Geeignete Verabreichungsrouten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf intragastrische, subkutane, Aerosol-, Instillations-, Inhalations-, intrakardiale, intramuskuläre, intravenöse, intraarterielle, intraperitoneale, intratumorale, intranasale, intrapulmonale oder intratracheale Routen. Die Verabreichung kann in einer einzelnen Dosis oder in einer nach einem bestimmten Zeitintervall ein- oder mehrmals wiederholten Dosis stattfinden. Die geeignete Verabreichungsroute und Dosierung variieren gemäß verschiedenen Parametern, beispielsweise mit dem Zustand oder der Krankheit, die beteiligt sind, der Notwendigkeit für Verhütung oder Therapie, dem Stadium, bis zu welchem sie fortgeschritten ist, und dem zu transferierenden therapeutischen Gen. Als Angabe können die Pockenvirus-Partikel in Form von Dosen zwischen 104 und 1014 pfu (Plaque-bildende Einheiten), vorteilhafterweise zwischen 105 und 1013 pfu und vorzugsweise zwischen 106 und 1012 pfu formuliert werden. Der Titer kann durch herkömmliche Techniken bestimmt werden. Die Vektordosen liegen vorzugsweise zwischen 0,01 und 10 mg/kg, spezieller zwischen 0,1 und 2 mg/kg.
  • Zusätzlich kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung eine oder mehrere stabilisierende(n) Substanz(en), wie Lipide (z.B. kationische Lipide, Liposome, Lipide, wie in WO 98/44143 beschrieben), Nukleaseinhibitoren, Polymere, Chelatbildner, um deren Abbau innerhalb des tierischen/menschlichen Körpers zu verhüten, umfassen.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung eines IMV-Pockenvirus-Partikels oder eines Vektors gemäß der Erfindung für die Herstellung eines Arzneimittels, welches für die Behandlung eines humanen oder tierischen Organismus durch Gentherapie bestimmt ist, zur Verfügung. Innerhalb des Umfangs der Erfindung muss „Gentherapie" als ein Verfahren zum Einführen eines jeglichen therapeutischen Gens in eine Zelle verstanden werden. Sie umfasst auch die Immuntherapie, die sich auf die Einführung eines potentiell antigenen Epitops in eine Zelle, um eine Immunantwort, die zellulär oder humoral oder beides sein kann, zu induzieren, bezieht.
  • Die erfindungsgemäße Verwendung ist von den Eigenschaften einer Vermittlung von Zielgerichtetheit („Targeting") der Ligandengruppierung, die auf der Oberfläche des IMV-Pockenvirus-Partikels präsentiert oder durch den Vektor der Erfindung exprimiert wird, abhängig. So ist eine Ligandengruppierung, die in der Lage ist, ein auf der Oberfläche einer mit einem pathogenen Agens (Bakterium, Virus oder Parasit) infizierten Zelle vorhandenes Molekül zu erkennen und daran zu binden, für die Behandlung oder Verhütung eines jeglichen Zustands oder einer jeglichen Erkrankung, die durch eine solche Infektion verursacht wird, geeignet. Eine Tumor-Targeting-Ligandengruppierung ist mehr für die Behandlung oder Verhütung einer Krebserkrankung gedacht. Der Ausdruck „Krebs" umfasst jegliche krebsartigen Zustände, einschließlich diffuser oder lokalisierter Tumore, Metastasen, kanzeröser Polypen und präneoplastischer Läsionen (z.B. Dysplasien) wie auch Erkrankungen, die aus einer unerwünschten Zellproliiferation resultieren. Man kann spezieller die Krebserkrankungen der Brust, des Gebärmutterhalses (insbesondere jene, die durch Papillomaviren induziert werden), Prostata, Lunge, Blase, Leber, Kolorektum, Pankreas, Magen, Ösophagus, Kehlkopf, Zentralnervensystem, Blut (Lymphome, Leukämien u.s.w.), Melanome und Mastozytome aufführen.
  • Die erfindungsgemäße Verwendung für die Behandlung eine menschlichen oder tierischen Organismus umfasst, an den Organismus eine therapeutisch wirksame Menge eines IMV-Pockenvirus-Partikels, eines Vektors oder einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung zu verabreichen. Eine „therapeutisch wirksame Menge" ist eine Dosis, welche für die Linderung von einem oder mehreren Symptomen, die normalerweise mit der Erkrankung oder dem Zustand, die man zu behandeln wünscht, verbunden sind, ausreicht. Was eine prophylaktische Verwendung angeht, bedeutet dieser Ausdruck eine Dosis, welche ausreicht, um den Ausbruch einer Krankheit oder eines Zustands zu verhüten oder zu verzögern.
  • Die Verwendung der Erfindung für therapeutische Anwendungen bezieht sich auf die Krankheiten oder Zustände, die oben aufgelistet worden sind. Die Verwendung ist besonders nützlich, um den Ausbruch von Tumoren zu verhindern oder um existierende Tumore jeglicher Art umzukehren, unter Verwendung eines ähnlichen Ansatzes zu jenem, der hier beschrieben worden ist. Es versteht sich, dass die Verwendung durch einen jeglichen von verschiedenen Ansätzen ausgeführt werden kann. Das IMV-Pockenvirus-Partikel, der Vektor oder die Zusammensetzung der Erfindung kann vorteilhafterweise direkt in vivo über eine jegliche herkömmliche und physiologisch annehmbare Verabreichungsroute, beispielsweise durch intravenöse Injektion, in einen zugänglichen Tumor, in die Lungen mittels eine Aerosols oder einer Instillation, in das Gefäßsystem unter Verwendung eines geeigneten Katheters u.s.w. verabreicht werden. Es kann auch der ex vivo-Ansatz herangezogen werden, der darin besteht, Zellen aus einem Patienten zu entfernen (Knochenmarkszellen, Lymphozyten des peripheren Bluts, Myoblasten und dergleichen...), das IMV-Pockenvirus-Partikel oder den Vektor der Erfindung gemäß den Techniken dieses Fachgebiets einzuführen und diese dem Patienten erneut zu verabreichen.
  • In dem Falle einer in vivo-Behandlung, um die Transfektionsrate zu verbessern, kann der Patient sich vor der Verabreichung der oben beschriebenen pharmazeutischen Präparate einer Makrophagen depletionsbehandlung unterziehen. Eine solche Technik wird in der Literatur beschrieben (siehe insbesondere Van Rooijen et al., 1997, TibTech, 15, 178–184).
  • Gemäß der bevorzugten Ausführungsform, wenn die Verwendung der Erfindung ein rekombinantes IMV-Pockenvirus-Partikel, welches die Merkmale der Erfindung aufweist und ein Suizidgen exprimiert, verwendet, kann es vorteilhaft sein, zusätzlich eine pharmazeutisch annehmbare Menge eines Prodrugs, das für das exprimierte Suizidgenprodukt spezifisch ist, zu verabreichen. Die beiden Verabreichungen können gleichzeitig oder nacheinander erfolgen; das Prodrug wird aber vorzugsweise nach dem IMV-Pockenvirus-Partikel der Erfindung verabreicht. Zur Veranschaulichung ist es möglich, eine Prodrug-Dosis von 50 bis 500 mg/kg/Tag zu verwenden, wobei eine Dosis von 200 mg/kg/Tag bevorzugt ist. Das Prodrug wird gemäß der Standardpraxis verabreicht. Die orale Route ist bevorzugt. Es ist möglich, eine einzelne Dosis Prodrug oder Dosen, die eine ausreichend Zeit lang wiederholt werden, um es dem toxischen Metaboliten zu ermöglichen, innerhalb des Wirtsorganismus oder der Zielzelle produziert zu werden, zu verabreichen. Wie oben erwähnt, kann das Prodrug Ganciclovir oder Acyclovir in Kombination mit dem TK HSV-1-Genprodukt und 5-FC in Kombination mit dem FCY1-, FUR1- und/oder FCU1-Genprodukt verwendet werden Um die für eine Tumorbehandlung gedachte Verwendung zu veranschaulichen, kann man zuerst ein IMV-Pockenvirus-Partikel, welches ein Suizidgen exprimiert und auf dessen Oberfläche eine Ligandengruppierung, welche in der Lage ist, ein durch die Tumorzellen exprimiertes Tumorantigen zu erkennen und daran zu binden, präsentiert, verabreichen. Einmal infiziert, werden die krebsartigen Zellen das Suizidgen exprimieren. Das Abtöten der infizierten Zellen kann durch Verabreichung des Prodrugs, welches durch das gewählte Suizidgenprodukt metabolisiert wird, erfolgen. Bei Individuen, bei welchen eine Prävention oder Umkehrung einer MUC-1-positiven Brustkrebserkrankung angestrebt wird, kann man ein IMV-Pockenvirus-Partikel, welches FCU-1 exprimiert und auf seiner Oberfläche einen SM3-scFv-Liganden, der in der Lage ist, das MUC-1-Tumorantigen zu erkennen und daran zu binden, beherbergt, einsetzen. Das Abtöten der MUC-1-positiven infizierten Zellen kann mittels einer weiteren Verabreichung des Prodrugs 5-FC erzielt werden.
  • Zusätzlich besteht ein besondere Merkmal des Verfahrens der Erfindung darin, dass das IMV-Pockenvirus-Partikel der Erfindung in vivo in dem behandelten Organismus produziert werden kann.
  • Verhütung oder Behandlung einer Krankheit oder eines Zustands können unter Verwendung der vorliegenden Verwendung allein oder, sofern gewünscht, in Kombination mit gegenwärtig verfügbaren Methoden (z.B. Bestrahlung, Chemotherapie und chirurgischer Eingriff) ausgeführt werden.
  • Diese und andere Ausführungsformen werden offenbart oder sind naheliegend aufgrund von oder werden umfasst von der Beschreibung und den Beispielen der Erfindung. Weitere Literatur, welche eine) jegliches) der Verfahren, Verwendungen und Verbindungen, die gemäß der Erfindung eingesetzt werden sollen, betrifft, kann aus öffentlichen Bibliotheken unter Verwendung von beispielsweise elektronischen Vorrichtungen herangezogen werden. Es kann beispielsweise die öffentliche Datenbank „Medline" verwendet werden, die im Internet, z.B. unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html zur Verfügung steht. Weitere Datenbanken und Adressen, wie http://www.ncbi.nlm.nih.gov, http://www.infobiogen.fr, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org, sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt und können ebenfalls unter Verwendung von z.B. http://www.lycos.com erhalten werden. Eine Übersicht über Patentinformationen auf dem Gebiet der Biotechnologie und ein Überblick über relevante Patentinformationsquellen, die für eine retrospektive Recherche und dafür, sich Neuerungen aktuell bewusst zu machen, nützlich sind, werden in Berks, TIBTECH 12 (1994), 352–364, geliefert.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Reinigung eines IMV-Pockenvirus-Partikels der Erfindung aus einer Viruspräparation, welche sowohl das IMV-Pockenvirus-Partikel der Erfindung als auch ein IMV-Pockenvirus-Wildtyp-Partikel enthält, umfassend die Schritte, die Viruspräparation an einen festen Träger, welcher mit einem Anti-Liganden-Molekül, welches in der Lage ist, die heterologe Ligandengruppierung zu binden, beschichtet ist, zu binden und das IMV-Pockenvirus-Partikel zurückzugewinnen. Der Bindungsschritt wird vorzugsweise durch Oberflächen-Plasmon-Resonanz, bevorzugt unter Verwendung eines BIAcore XTM-Biosensor-Systems (BIAcore AB, Uppsala, Schweden) gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise wird Streptavidin kovalent an den festen Träger eines SA-Sensor-Chips durch Amin-Kopplung unter Verwendung des Amin-Kopplungs-Kits (BIAcore AB, Uppsala, Schweden) gebunden. Dann wird biotinyliertes Anti-Liganden-Molekül in einer Durchflusszelle auf dem mit Streptavidin beschichteten SA-Chip immobilisiert. Die Durchflusszelle 1 diente als Referenz. Die Bindung von Pockenvirus-Partikeln der Erfindung aus der flüssigen Phase wurde über einen Bereich von 1×104–1×1010 pfu/ml bestimmt. Die Injektionsvolumina lagen zwischen 5 und 100 μl und die Flussrate zwischen 2 und 10 μl/min. Die Oberfläche wird mit NaOH (2 bis 50 mM) für eine Gewinnung von spezifischen Zielpartikeln regeneriert. Der feste Träger ist vorzugsweise ein Dextranträger. Das Anti-Liganden-Molekül ist vorzugsweise ein von MUC-1 abgeleitetes Peptid und speziell ein 60-mer, welches 3 Tandem-Wiederholungen von MUC-1 darstellt.
  • Das Verfahren der Erfindung umfasst des weiteren den Schritt, eine permissive Zelle mit dem zurückgewonnenen IMV-Pockenvirus-Partikel zu infizieren. Dieser Schritt wird gemäß Standardtechniken ausgeführt. Der Infektionsschritt wird vorzugsweise in Gegenwart von EDTA (0,1 bis 10 mM mit einer Präferenz für 1 mM) ausgeführt.
  • Die Erfindung ist auf eine veranschaulichende Weise beschrieben worden und es versteht sich, dass die Terminologie, die verwendet wurde, von der Art beschreibender Worte anstelle der Art der Einschränkung dienender Worte sein soll. Offensichtlich sind viele Modifizierungen und Variationen der Erfindung im Lichte der obigen Lehren möglich. Es versteht sich dementsprechend, dass innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche die Erfindung in einer unterschiedlichen Weise zu jener, die hier speziell beschrieben wird, praktisch ausgeführt werden kann.
  • Legenden der Figuren
  • 1 veranschaulicht die Organisation der Pockenvirus-Partikel. Die IMV-Hülle wird mit einer dünnen Linie dargestellt, welche auf ihrer Oberfläche das D8L-Genprodukt und den Komplex von p21-kDa- (p21) und p14-kDa-Protein (p14) präsentiert. Die EEV-Hülle ist mit einer fettgedruckten Linie dargestellt, welche auf ihrer Oberfläche die A34R-, HA- und BSR-Genprodukte präsentiert.
  • 2 repräsentiert schematisch das Plasmid pTG14552.
  • 3 repräsentiert eine durchflusszytometrische Analyse nach einer Infektion von P815, MUC-1 exprimierenden P815 (P815-MUC1), BHK-21 und MUC-1 exprimierenden BHK-21 (BHK-21-MUC1) durch MVATG14552 (A) oder die Kontrolle MVAN33 (B).
  • Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu veranschaulichen.
  • BEISPIELE
  • Die nachfolgend beschriebenen Konstruktionen werden gemäß den allgemeinen Gentechnologie- und molekularen Klonierungstechniken, die detailliert in Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY beschrieben werden, oder gemäß den Empfehlungen des Herstellers, wenn ein kommerzieller Kit verwendet wird, ausgeführt. PCR-Amplifizierungstechniken sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt (siehe beispielsweise PCR protocols – A guide to methods and applications, 1990, veröffentlicht von Innis, Gelfand, Sninsky und White, Academic Press).
  • Die rekombinanten M13-Bakteriophagen werden auf dem E. coli-NM522-Stamm (Stratagene) in einem auf Agar basierenden Minimalmedium oder in einem flüssigen reichen LBM-Medium kultiviert. Die rekombinanten Plasmide, die das Ampicillinresistenzgen tragen, werden in E. coli C600 (Stratagene), BJ5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557–580) und NM522 auf Agar oder flüssigem Medium, welches mit 100 μg/ml Antibiotikum ergänzt wird, repliziert. Der BJ5183-Stamm wird bevorzugt verwendet, wenn die Klonierung durch homologe Rekombination ausgeführt wird (Bubek et al., 1993, Nucleic Acid Res. 21, 3601–3602).
  • Die Konstruktionen der rekombinanten Vacciniaviren werden gemäß den herkömmlichen Techniken auf dem Gebiet in den oben aufgeführten Dokumenten und in Mackett et al. (1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415–7419) und Mackett et al. (1984, J. Virol. 49, 857–864) ausgeführt. Das der Selektion dienende Gen gpt (Xanthinguaninphosphoribosyltransferase) von E. coli (Falkner und Moss, 1988, J. Virol. 62, 1849–1854) wird verwendet, um die Selektion der rekombinanten Vacciniaviren zu vereinfachen.
  • BEISPIEL 1: Konstruktion eines MVA, welches zielgerichtet MUC1-positive Zellen ansteuert.
  • Es sind zwei unterschiedliche Konstrukte gentechnologisch hergestellt worden:
    • MVATG14519 ist ein MVA-Vektor, der gentechnologisch so modifiziert worden ist, dass er zielgerichtet MUC-1-positive Tumorzellen, die ein chimäres p14-Protein exprimieren, in welchem die scFv-Kette des monoklonalen SM3-Antikörpers in ihrer nativen Form an den N-Terminus des 138L-ORF von MVA (p14-kDa) fusioniert ist, ansteuert.
    • MVATG14552 (2) ist ein MVA-Vektor, welcher gentechnologisch so modifiziert worden ist, dass er zielgerichtet MUC-1-positive Tumorzellen ansteuert, und welcher dem MVATG14519-Vektor ähnlich ist mit Ausnahme der Anwesenheit eines Signalpeptids des Glycoproteins TGN51 des humanen Trans-Golgi-Netzwerks (Sequenz beschrieben von Kain et al., 1997, J. Biol. Chem. 273, 981-988), welches mit den N-Terminus der scFv-Kette des monoklonalen Antikörpers SM3 fusioniert ist.
  • A. MVA138L-Gen-Modifikation
  • Ein Klonierungsvektor für die Insertion von scFv-Sequenzen ist unter Verwendung einer auf PCR basierenden Strategie zusammengebaut worden. Das 3'-Ende des MVA138L-Gens und die 3'-flankierende Region werden unter Verwendung der Primer OTG12340 (SEQ ID NO: 1) und OTG12343 (SEQ ID NO: 2) amplifiziert, wodurch das Fragment C erzeugt wird. Die Selektionsmarker-Expressionskassette, welche E. coli-gpt, welches unter die Kontrolle des früh-späten Promotors pH5R gestellt ist (Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247–266, 517–563), kodiert, wird durch PCR aus einer Plasmid-DNA des Standes der Technik, wie pH5R-GPT (FR 98 13279) (im Folgenden als pTG9996 bezeichnet), unter Verwendung der Primer OTG12342 (SEQ ID NO: 3) und OTG12341 (SEQ ID NO: 4) isoliert, wodurch das Fragment E erzeugt wird. Die Fusion zwischen den Fragmenten C und E erfolgt durch PCR durch Mischen von beiden Fragmenten und den Primern OTG12340 und 12342 (Fragment F).
  • Die strangaufwärts gelegene Region von MVA138L wird mit dem Tandem-Primer OTG12338 (SEQ ID NO: 5) und OTG12359 (SEQ ID NO: 6) amplifiziert in dem Falle, wo das scFv mit dem nativen p14-kDa fusioniert wird, um das Fragment A zu erzeugen, das nachfolgend zwischen die EcoRI- und HindIII-Stellen von M13TG6131 (Beispiel 7 von WO 99/03885) kloniert wird, um M13TG14025 zu erzeugen. In dem Falle, wo das scFv an dessen N-Terminus mit dem Translokationssignal des Trans-Golgi-Netzwerk-Glykoproteins TGN51 fusioniert wird, erfolgt die Amplifizierung mit den Primern OTG12338 (SEQ ID NO: 5) und OTG12346 (SEQ ID NO: 7). Das resultierende Fragment (Fragment Asp) wird zwischen die EcoRI- und HindIII-Stellen von M13TG6131 kloniert, wodurch M13TG14027 erhalten wird. Beide Konstrukte umfassen eine einmalige HindIII-Stelle strangaufwärts von der kodierenden Sequenz von MVA138L.
  • MVA 138L und die strangabwärts gelegene Region von MVA 138L werden unter Verwendung der Primer OTG12380 (SEQ ID NO: 8) und OTG12339 (SEQ ID NO: 9) amplifiziert. Das resultierende Fragment (Fragment D) wird zwischen die EcoRI- und HindIII-Stellen von M13TG6131 kloniert, wodurch M13TG14026 erhalten wird. Die Fragmente A/D oder Asp/D werden durch Verdau mit HindIII und EcoRI isoliert und in die EcoRI-Stelle des Vektors pTG1E (Beispiel 2 von WO 99/03885) inseriert, wodurch pTG14359 (welches das A/D-Fragment enthält) bzw. pTG14358 (welches das Asp/D-Fragment enthält) erhalten wird. Das Fragment F wird dann an der PacI-Stelle entweder in pTG14359 oder pTG14358 inseriert. Die fertigen Konstrukte werden als pTG14366 und pTG14365 bezeichnet.
  • B. Isolierung von SM3-scFv
  • Das SM3-Hybridom ist von Burschell et al. (1987, Cancer Res. 47, 5476–5482), Girling et al., (1989, Int. J. Cancer 43, 1072–1076) und Dokurno et al. (1998, J. Mol. Biol. 284, 713–728) beschrieben worden. Das auf der MUC-1-Tumor-assoziierten Form erkannte Epitop ist P-D-T-R-P. SM3-scFv umfasst die variable Region der schweren Kette des SM3-Antikörpers (innerhalb von GeneBank mit der Aufnahmenummer AF042142 bezeichnet), verknüpft mit einem Spacer aus 10 Resten, gefolgt von der variablen Region der leichten Kette des SM3-Antikörpers (innerhalb von GeneBank mit der Aufnahmenummer AF042143 bezeichnet). Jede variable Region kann durch PCR aus einem Plasmid des Standes der Technik, wie pMAL-SM3, unter Verwendung entweder der Tandem-Primer OTG12360 (SEQ ID NO: 10) und OTG12361 (SEQ ID NO: 11) für die Insertion der SM3-scFv-Sequenz in die HindIII-Stelle von pTG14366 oder der Tandem-Primer OTG12344 (SEQ ID NO: 12) und OTG12361 (SEQ ID NO: 11) für die Insertion der SM3-scFv-Sequenz in die HindIII-Stelle von pTG14365 isoliert werden. Die resultierenden Konstrukte werden als pTG14519 und pTG14552 bezeichnet (2).
  • C. Isolierung von infektiösen MVA-Partikeln.
  • Ein Subklon von MVA ist unter GMP-Bedingungen aus einem Rohmaterial isoliert worden, wie in Stickl et al. (1974, Deutsch Med Wochenschr 99, 2386–2392; Mayr et al., 1978, ZentralbI Bakteriol 167, 375–390) beschrieben. Dieser Subklon wird als MVATGN33.1 bezeichnet. Dieses Ausgangs-MVA wird routinemäßig vermehrt und auf CEFs titriert.
  • CEFs werden ausgehend von Hühnerembryos, welche aus fertilisierten Eiern, die zuvor 11 Tage bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre inkubiert worden waren, erhalten worden sind, hergestellt. Hühnerembryo wird in kleine Stücke geschnitten und mit einer 2,5%-igen (Gew./Vol.) Trypsin-Lösung behandelt. CEF werden dann auf Falcon 3001-Kunststoff-Petrischalen zu einer Zelldichte von 1,5×106 Zellen/Platte in Eagle Based Medium (MBE)/Tryptose (Gibco BRL), komplementiert mit 10% Kälberserum, ausplattiert. Nach 48 h werden Monolayer-Zellen mit MVATGN33.1 30 min in PBS plus Kationen (Magnesiumacetat und CaCl2, jeweils 1 mg/ml) plus 1 % Kälberserum infiziert, um das Virus auf die Zellen zu adsorbieren. Infizierte Zellen werden dann eine Stunde in MBE plus 5 % Kälberserum bei 37°C, 5% CO2 kultiviert. 1 bis 5 g Plasmid (pTG14519 oder pTG14552) werden dann in einer Lösung von Hepes und CaCl2 ausgefällt. Die ausgefällte DNA wird als Überschichtung auf die Monolayer aus infizierten Zellen aufgetragen und 2 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Ein Glycerol-Schock kann während 1 min ausgeführt werden, um den Plasmideintritt zu vereinfachen. Zu diesem Zweck wird eine Lösung von 10% Glycerol in MBE/Tryptose als Überschichtung 1 min auf die Zell-Monolayer aufgetragen. Die Monolayer. werden dann mit PBS plus Kationen gewaschen und in MBE plus 5% Kälberserum bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach 48 h werden die Petrischalen eingefroren.
  • Die Isolierung von rekombinanten Plaques erfolgt, wie folgt: die Petrischalen werden aufgetaut, die infizierten Zellen geerntet und innerhalb des MBE/Kälberserums beschallt. Rekombinante Viren werden dann durch aufeinanderfolgende Runden von Plaque-Reinigung in CEFs unter dem Druck der Selektionsmarker in Gegenwart von 250 μg/ml Xanthin, 15 μg/ml Hypoxanthin und 25 μg Mycophenolsäure isoliert, wie zuvor von Falkner und Moss (1988, J. Virol. 62, 1849–1854) beschrieben.
  • Eine Stammlösung (Virus-Einsaat-Präparat) kann in F175-Flaschen, die 108 CEFs, die mit dem MVA infiziert sind, enthalten, hergestellt werden. Viren werden 48 bis 72 h vermehrt. Die infizierten Zellen und das Kulturmedium werden vereinigt und die Suspension wird beschallt. Rohextrakte werden zuerst auf einem 36 % -igen Sucrosekissen fraktioniert. Das Viruspellet wird dann auf einem diskontinuierlichen Sucrose-Gradienten fraktioniert, wie in Joklik (1962, Virology 18, 9–18) beschrieben.
  • BEISPIEL 2: Konstruktion eines rekombinanten MVA, welches FCU-1 exprimiert und zielgerichtet MUC1-positive Zellen ansteuert.
  • Das FCU-1-Gen wurde durch HindIII/KpnI-Verdau des DNA-Plasmids pTG13046 (in WO99/54481 als pCI-neoFCU1 bezeichnet) isoliert. Der als pTG6019 bezeichnete Transfervektor (Beispiel 2 von WO 99/03885), der die zu den flankierenden Regionen der Deletion III homologen Sequenzen enthält, wurde wie folgt modifiziert. Die Expressionskassette, die E. coli-gpt, welches unter die Kontrolle des früh-späten pHSR-Vacciniaviruspromotors gestellt ist, kodiert, wird aus dem DNA-Plasmid pTG9996 durch einen SacI-Verdau isoliert. Dieses DNA-Fragment wird dann in die SacI-Stelle des DNA-Plasmids pTG6019 inseriert, wodurch pTG14033 erhalten wird. Der synthetische früh-späte Promotor p11K75 (SEQ ID NO: 13) wird durch PCR aus der Matrize M13TG4052 mit den Primern OTG122271 (SEQ ID NO: 14) und OTG12272 (SEQ ID NO: 15) isoliert. M13TG4052 basiert auf M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gene 26, 91–99). Der Promotor 11K7.5 enthält von 5' nach 3' die Sequenz des späten Promotors 11k (Goebel et al., 1990, a.a.O.) bis zu Nukleotid +4 der Transkriptionsstartstelle, die Sequenz des TK-Promotors von Nukleotid –28 bis –13, wobei sie ein C anstelle eines A an Position –18 aufweist, und die Region zwischen den Nukleotiden –12 bis +6 des frühen 7.5k-Promotors.
  • Das amplifizierte Fragment wird durch BamHI- und BgIII-Restriktionsenzyme verdaut, bevor es in die BamHI-Stelle von pTG14033 inseriert wird, wodurch pTG14084 erhalten wird. Das FCU-1-Gen wird strangabwärts des p11K75-Promotors durch homologe Rekombination, wie folgt, kloniert. Zuerst werden synthetische Sequenzen zwischen die PstI- und BamHI-Stellen von pTG14084 unter Verwendung von OTG12522 (SEQ ID NO: 16) und OTG12523 (SEQ ID NO: 17) inseriert. Das DNA-Plasmid wird dann durch XhoI linearisiert und eine homologe Rekombination mit dem FCU-1-Gen wird in E. coli ausgeführt. Das resultierende DNA-Plasmid wird als pTG14322 bezeichnet.
  • Eine homologe Rekombination in mit MVATG14552 infizierten und mit pTG14322 transfizierten CEFs führt zu der Erzielung eines zielgerichtet auf MUC 1 gerichteten MVA, welches das Suizidgen FCU-1 exprimiert.
  • BEISPIEL 3: Produktion von MVA mit einem Knockout des F13L-Gens
  • Die F13L 5' flankierende Region wird aus viraler MVATGN33-DNA durch einen Standard-PCR-Assay unter Verwendung der Tandem-Primer OTG13192 (SEQ ID NO: 18) und OTG13194 (SEQ ID NO: 19) isoliert und zwischen die BamHI- und EcoRI-Stellen von pBS (Stratagene) (pTG14746) inseriert. Die F13L 3' flankierende Region wird aus viraler MVATGN33-DNA durch einen Standard-PCR-Assay unter Verwendung der Tandem-Primer OTG13190 (SEQ ID NO: 20) und OTG13191 (SEQ ID NO: 21) isoliert und zwischen die BamHI- und EcoRI-Stellen von M13TG6131 inseriert, wodurch M13TG14101 erhalten wird. Die F13L 5' und 3' flankierenden Regionen werden dann in die EcoRI-Stelle von pTG1E kloniert. Das resultierende Konstrukt wird als pTG14783 bezeichnet.
  • BEISPIEL 4: Erzeugung einer Produzentenzelllinie, welche das MUC-1-Antigen exprimiert.
  • Wie oben erwähnt, kann eine Insertion der SM3-scFv-Ligandengruppierung in das p14-kDa-Protein die Virusproduktion beeinflussen (verringerte Virusausbeute). Folglich werden die mit Zielgerichtetheit ausgestatteten MVA von Beispiel 1 vorzugsweise isoliert und auf einer Zelllinie, die auf der Zelloberfläche das MUC-1-Antigen aufweist, das durch den auf der Virusoberfläche vorhandenen SM3-Antikörper erkannt wird, vermehrt, um die Verunreinigung mit dem Wildtyp-MVATGN33.1 zu verringern.
  • Die die membranverankerte Form von MUC-1-Antigen kodierende cDNA wird aus pPOLYII-ETAtm (Hareuveni et al., 1990, Eur. J. Biochem. 189, 475–486) durch einen doppelten Verdau mit BglII- und EcoRI-Restriktionsenzymen isoliert und zwischen die BamHI- und EcoRI-Stellen des pcDNA3-Expressionsvektors (In Vitrogen, USA) strangabwärts von dem CMV-Promotor inseriert. Das resultierende Plasmid wird als pTG5077 bezeichnet.
  • 1 × 106 BHK-21 (ATCC CCL-10)-Zellen werden mit 5 μg pTG5077 transfiziert und nachfolgend in GMEM (Glasgow Modified Eagle Medium, Gibco BRL), welches 20 g/l Gentamycin und 10% fötales Kälberserum enthält, kultiviert. Nach 24 h bei 37°C in 5% CO2-Atmosphäre wird 1 mg/ml G418 (Gibco BRL) zugesetzt. Neomycin-resistente Klone werden dann durch Grenzwert-Verdünnung isoliert und durch FACS auf eine MUC-1-Expression auf der Zelloberfläche unter Verwendung des monoklonalen Antikörper H23 (Tsarfaty et al., 1989, in Breast cancer immunodiagnosis and immunotherapy, Hrsg. Ceriani, Plenum NY) getestet. Interessanterweise verlieren die meisten MUC-1-positiven Klone die Hafteigenschaft auf dem Kunststoff der BHK-21-Ausgangszelllinie und beginnen, sich in Suspension zu vermehren. Diese Beobachtung wird die Vermehrung und pharmazeutische Produktion der rekombinanten Viren der Erfindung in einem Bioreaktor erleichtern.
  • BEISPIEL 5: Auswertung der „Targeting"-Eigenschaften
  • Klone von MVATG14552 von Beispiel 1 werden durch aufeinanderfolgende Runden von Plaque-Reinigung in CEFs unter Selektionsbedingungen in Gegenwart von Xanthin, Hypoxanthin und Mycophenolsäure, wie oben beschrieben, isoliert.
  • Eine bestimmte Anzahl von Klonen wird zuerst durch PCR analysiert, um die Anwesenheit des chimären Gens, welches das TG51/SM3scFv/p14kDa-Fusionsprotein kodiert, in dem Virusgenom nachzuweisen. Es werden neun Klone ausgewählt und durch Western-Blot weiter analysiert, um die Expression des Fusionsproteins auf der Oberfläche der Pockenvirus-Partikel zu bestätigen. Die Detektion erfolgt mit dem ECL-Kit (Amersham) durch Immunblotting mit einem p14-kDa-spezifischen polyklonalen Kaninchen-Serum in Rohextrakt, welcher ausgehend von infizierten Zellen oder Überständen erhalten wird. Gereinigtes p14-kDa-Protein wird als Kontrolle verwendet. Mit Ausnahme des Klons C5 exprimieren alle ausgewählten Klone das chimäre Fusionsprotein, das eine Molekülmasse von 46 kDa aufweist. Wie erwartet, ist die Intensität der Markierung in Rohextrakten intensiver als in Kulturüberständen, was den intrazellulären Status der Pockenvirus-Partikel wiederspiegelt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Hauptmenge der Pockenviren, die auf ihrer Oberfläche das TG51/SM3scFv/p14kDa-Fusionsprotein aufweisen, IMV-Partikel sind. Die Detektion einer schwachen Menge von Fusionsprotein im Kulturüberstand kann entweder durch ein Aufbrechen der EEV-Hülle oder durch eine zellulärer Lyse während der Klonherstellung erklärt werden.
  • Die Infektionseigenschaften von MVATG14552 sind in verschiedenen Zelllinien untersucht worden:
    • – in der Mäuse-Mastozytom-Zelllinie P815 (ATCC CRL6448),
    • – in der Zelllinie P815, welche das MUC-1-Antigen exprimiert (P815-MUC1), welche durch Transfektion der P815-Ausgangszellen mit einem Vektor, welcher die membranverankerte Form des MUC1-Antigens exprimiert, erhalten wird,
    • – in BHK 21 (Baby-Hamster-Niere),
    • – in BHK 21, welches das MUC-1-Antigen exprimiert (BHK 21-MUC1), welche durch Transfektion der BHK 21-Ausgangszellen mit einem Vektor, welcher die membranverankerte Form des MUC 1-Antigens exprimiert, erhalten wird.
  • Zellen werden mit dem MVATG14552-Klon 9 oder mit einem Kontrollvirus (MVAN33) mit einer MOI von ungefähr 0,1 24 h infiziert. Die Infektionseffizienz wird durch Durchflusszytometrie (FACS) nach Inkubation mit einem polyklonalen Mäuse-Serum, erhalten nach MVA-Immunisierung mit einer Verdünnungsrate von 1/100, bestimmt. Die Detektion erfolgt durch Inkubation mit einem monoklonalen FITC-Ziege-anti-Maus-IgG (Pharmingen, 10 μg/ml). Wie in 3A gezeigt, infiziert MVATG14552 verglichen mit den Ausgangszellen P815 und BHK-21 bevorzugt MUC-1-exprimierende Zellen. Im Gegensatz dazu infiziert das Kontroll-MVA sowohl die MUC-1-exprimierenden als auch nicht exprimierenden Zellen mit einer ähnlichen Effizienz (3B).
  • Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Ligandengruppierung SM3 scFv auf der Oberfläche der Pockenvirus (IMV)-Partikel exprimiert wird und dass sie in der Lage ist, ihre Zielstruktur (das MUC-1-Antigen) zu erkennen und daran zu binden, was zu einer spezifischen Infektion dieser Zellen durch das modifizierte Virus führt.
  • Die Wechselwirkungen zwischen zwei SM3 scFv exprimierenden Klonen (A3 und C9) mit einem 60mer-Peptid von MUC-1 wurden durch „Surface Plasmon Resonance" (SPR) unter Verwendung des BIAcore XTM Biosensor-Systems (BIAcore AB, Uppsala, Schweden) untersucht. Alle Experimente wurden bei 25°C ausgeführt. Streptavidin wurde kovalent an die carboxylierte Dextranmatrix eines SA-Sensorchips durch Aminkopplung unter Verwendung des Aminkopplungskits (BIAcore AB, Uppsala, Schweden) gebunden. Dann wurde biotinyliertes 60mer-Peptid, welches 3 Tandem-Wiederholungen von MUC-1 repräsentiert (10 μg/ml in HBSS-Puffer), in der Durchflusszelle 2 auf dem mit Streptavidin beschichteten SA-Sensorchip immobilisiert. Die Durchflusszelle 1 diente als Referenz. Die Bindung von rekombinantem SM3 in flüssiger Phase wurde als Positivkontrolle verwendet. Eine Bindung von rekombinanten Viren in flüssiger Phase wurde über einen Bereich von 1×106 – 1 × 108 pfu/ml in HBSS-Puffer bestimmt. Zu diesem Zweck wurden primäre Hühner-Fibroblasten mit einer MOI von 1 während 24 h mit den Virussuspensionen infiziert. Die Injektionsvolumen betrugen 15 μl und die Flussrate betrug 5 μl/min. Die Oberfläche wurde mit 10 mM NaOH regeneriert. Die kinetische Analyse erfolgte unter Verwendung einer BIAevaluation 3.0-Software. Es wurde eine spezifische und reproduzierbare Wechselwirkung zwischen rekombinanten Viren und dem 60meren MUC-1-Peptid beobachtet. Es wurde festgestellt, dass die Messungen mit den Viruskonzentrationen korrelierten. Es wurde niemals eine Bindung von Kontroll-MVA (MVAN33) an eben dieses Peptid beobachtet.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass das SM3 scFv/p14-Fusionsprotein mit MVA-Partikeln assoziiert und dass die rekombinanten Viren spezifisch ein von MUC-1-abgeleitetes Peptid erkennen.
  • BEISPIEL 6: Reinigung der SM3 scFv-exprimierenden Viruspartikel
  • Um die nicht-rekombinanten Wildtyp-Viruspartikel von den rekombinanten zu trennen, wurde ein Selektionsprotokol durch die BIAcore-Technik ausgeführt, um die rekombinanten SM3 scFv-exprimierenden Viruspartikel basierend auf ihrer Fähigkeit, ein MUC-1-Peptid zu binden, zu reinigen. Eine ausgehend von dem Klon A3 hergestellte Viruspräparation wurde in das BIAcore X-System injiziert, wie oben beschrieben. Die Viren, die eine hohe Affinität für das 60mere MUC-1-Peptid zeigten, wurden an der Oberfläche während der Regenerationsphase unter Verwendung von 20 mM NaOH gewonnen, wie in dem BIAcore X Instrument Handbook beschrieben. Permissive Zellen wurden dann mit den gewonnenen Viren in Gegenwart von EDTA (1 mM), um die Bildung von Virusaggregaten zu verhindern, infiziert und die rekombinanten Viren wurden durch eine doppelte GUS/GPT-Selektion selektiert. Das Fehlen von nicht-rekombinanten Wildtyp-Viren wurde in isolieren Klonen durch PCR bestimmt. Dieses neue Reinigungs- und Selektionsprotokoll hat die Gewinnung von mehreren Klonen, die frei von verunreinigenden Wildtyp-Viren waren, erlaubt.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (22)

  1. IMV-Pockenvirus-Partikel mit einer zielgerichteten Infektionsspezifität in Richtung auf Zielzellen, wobei das Partikel vorzugsweise die Zielzellen infiziert und wobei die Spezifität durch wenigstens eine heterologe Ligandengruppierung, die auf der Oberfläche des IMV-Pockenvirus-Partikels lokalisiert ist und die in der Lage ist, ein Anti-Liganden-Molekül, das auf der Oberfläche der Zielzellen lokalisiert ist, zu binden, verliehen wird.
  2. IMV-Pockenvirus-Partikel nach Anspruch 1, wobei das IMV-Pockenvirus-Partikel ein Vacciniavirus-, Kanarienvogelpocken-, Geflügelpocken-, Kuhpocken-, Insektenpocken-, Affenpocken-, Schweinepocken- oder Pinguinpocken-Partikel ist.
  3. IMV-Pockenvirus-Partikel nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Vacciniavirus aus der Gruppe bestehend aus dem Copenhagen-, Wyeth- und dem modifizierten Ankara- (MVA) -Stamm ausgewählt wird.
  4. IMV-Pockenvirus-Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zielzellen Tumorzellen sind und die heterologe Ligandengruppierung in der Lage ist, ein tumorspezifisches Antigen, ein zelluläres Protein, welches auf den Tumorzellen in unterschiedlicher Weise oder überexprimiert wird, oder ein Genprodukt eines mit einer Krebserkrankung assoziierten Virus zu binden.
  5. IMV-Pockenvirus-Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die heterologe Ligandengruppierung ein Fragment eines Antikörpers, welcher in der Lage ist, das MUC-1-Antigen zu erkennen und an dieses zu binden, ist.
  6. IMV-Pockenvirus-Partikel nach Anspruch 5, wobei die heterologe Ligandengruppierung das scFv-Fragment des monoklonalen SM3-Antikörpers ist.
  7. IMV-Pockenvirus-Partikel nach Anspruch 1, wobei die heterologe Ligandengruppierung ein Polypeptid ist und wobei es ein Teil eines chimären Proteins, welches die heterologe Ligandengruppierung und ein pockenvirales Polypeptid umfasst, ist.
  8. IMV-Pockenvirus-Parikel nach Anspruch 7, wobei das pockenvirale Polypeptid aus der Gruppe bestehend aus den Expressionsprodukten der A27L-, L1R-, A14L-, A17L-, D8L- und H3L-Gene ausgewählt wird.
  9. IMV-Pockenvirus-Partikel nach Anspruch 7 und 8, wobei die heterologe Ligandengruppierung an den N-Terminus der Expressionsprodukte des A27L-Gens fusioniert ist.
  10. IMV-Pockenvirus-Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die heterologe Ligandengruppierung ein Signalpeptid umfasst, welches deren Insertion in die Hülle des IMV-Pockenvirus-Partikels erleichtert.
  11. IMV-Pockenvirus-Partikel nach Anspruch 10, wobei das Signalpeptid die Translokation der heterologen Ligandengruppierung in dem Trans-Golgi-Netzwerk ermöglicht.
  12. IMV-Pockenvirus-Partikel nach Anspruch 11, wobei das Signalpeptid von dem humanen Trans-Golgi-Netzwerk-Glycoprotein TNG51 abgeleitet ist.
  13. IMV-Pockenvirus-Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das IMV-Pockenvirus-Partikel wenigstens eine Nukleinsäure von Interesse umfasst.
  14. IMV-Pockenvirus-Partikel nach Anspruch 13, wobei die Nukleinsäure von Interesse ein Suizid-Gen ist.
  15. Vektor, umfassend wenigstens eine Nukleotidsequenz, welche ein chimäres Protein kodiert, umfassend (i) wenigstens eine heterologe Ligandengruppierung, wie in einem der Ansprüche 1 und 4 bis 7 definiert, und (ii) die Gesamtheit oder einen Teil eines homologen viralen Polypeptids, welches natürlicherweise auf der Oberfläche eines IMV-Pockenvirus-Partikels lokalisiert ist.
  16. Vektor nach Anspruch 15, wobei das homologe virale Polypeptid wie in Anspruch 8 definiert ist.
  17. Zusammensetzung, umfassend wenigstens ein IMV-Pockenvirus-Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder wenigstens einen Vektor nach Anspruch 15 bis 16 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  18. Verwendung eines IMV-Pockenvirus-Partikels nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder eines Vektors nach den Ansprüchen 15 bis 16 für die Herstellung eines Arzneimittels, welches für die Behandlung eines menschlichen oder tierischen Organismus durch Gentherapie bestimmt ist.
  19. Verfahren zur Reinigung eines IMV-Pockenvirus-Partikels nach einem der Ansprüche 1 bis 14 aus einer Viruspräparation, welche sowohl das IMV-Pockenvirus-Partikel als auch ein IMV-Pockenvirus-Wildtyp-Partikel enthält, umfassend die Schritte, die Viruspräparation an einen festen Träger, welcher mit einem Anti-Liganden-Molekül, welches in der Lage ist, die heterologe Ligandengruppierung zu binden, beschichtet ist, zu binden und das IMV-Pockenvirus-Partikel zurückzugewinnen.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Bindungsschritt durch Oberflächen-Plasmon-Resonanz an einem Dextranträger ausgeführt wird.
  21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, welches ferner den Schritt umfasst, eine permissive Zelle mit dem zurückgewonnenen IMV-Pockenvirus-Partikel zu infizieren.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Infektionsschritt in Gegenwart von EDTA ausgeführt wird.
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