CN107847534B - Mva或mvaδe3l作为抗实体瘤的免疫治疗剂的应用 - Google Patents

Mva或mvaδe3l作为抗实体瘤的免疫治疗剂的应用 Download PDF

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Abstract

本公开涉及作为抗癌免疫治疗剂的通过瘤内或全身递送的修饰的安卡拉痘苗(MVA)病毒或MVAΔE3L，其单独地或与一种或多种免疫检查点阻断剂组合用于治疗恶性实体瘤。具体的实施方案涉及动员宿主的免疫系统产生针对肿瘤的免疫应答。

Description

MVA或MVAΔE3L作为抗实体瘤的免疫治疗剂的应用
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年4月17日提交的美国临时申请序列号62/ 149,484的优先权。该临时申请的全部公开内容通过引用整体并入本文。政府支持
在本公开中公开的工作可能得到由美国国立卫生研究院授予的编号K08AI073736和编号R56AI095692的资助支持。美国政府在本发明中可能有权利。
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，并且通过引用将其全部内容并入本文。在2016年6月15日创建的所述ASCII拷贝被命名为 11000-005111-WO0_SL.txt并且大小为3493字节。
发明领域
本公开一般涉及肿瘤学，病毒学和免疫治疗领域。它涉及使用痘病毒，特别是高度减毒的修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)和具有缺失痘苗毒力因子E3的重组修饰的安卡拉痘病毒(MVAΔE3L)作为癌症免疫治疗剂以及用于免疫治疗剂载体的开发。上述痘病毒也可以与免疫检查点阻断疗法联合使用。
背景
免疫系统与癌症
恶性肿瘤固有地抵抗常规疗法，呈现显著的治疗挑战。免疫疗法已经成为研究的一个发展领域，也是治疗某些类型癌症的附加选择。免疫治疗方法的基础是可以刺激免疫系统来识别肿瘤细胞，并将其靶向破坏。
许多研究支持免疫系统组分在癌症进展中差异化存在的重要性 (Jochems等，ExpBiol Med，236(5)：567-579(2011))。临床数据表明肿瘤浸润淋巴细胞的高密度与改善的临床结果相关(2)(Mlecnik等， Cancer Metastasis Rev.；30：5-12，(2011))。不同类型的癌症，包括黑色素瘤，卵巢癌，头颈癌，乳腺癌，尿路上皮癌，结肠直肠癌，肺癌，肝细胞癌，胆囊癌和食道癌都报道了强烈的淋巴细胞浸润与患者生存之间的相关性(Angell等CurrentOpinion in Immunology，25：1-7，(2013))。肿瘤免疫浸润包括巨噬细胞，树突细胞(DC)，肥大细胞，自然杀伤(NK) 细胞，幼稚和记忆淋巴细胞，B细胞和效应T细胞(T淋巴细胞)，首先负责识别由肿瘤细胞表达的抗原，随后通过细胞毒性T细胞破坏肿瘤细胞。
尽管癌细胞呈递抗原并且存在可能潜在地对抗肿瘤细胞的免疫细胞，但在许多情况下免疫系统不会被激活或被肯定地抑制。这种现象的关键是肿瘤通过支配免疫系统的细胞来抑制免疫系统的其他细胞来保护自己免受免疫应答的能力。肿瘤发展了许多免疫调节机制来逃避抗肿瘤免疫反应。例如，肿瘤细胞分泌免疫抑制性细胞因子(如TGF-β)或在肿瘤损伤中诱导免疫细胞如CD4+T调节性细胞和巨噬细胞分泌这些细胞因子。肿瘤也有能力偏倚CD4+T细胞来表达调节表型。总体结果是受损的T细胞应答和诱导细胞凋亡或降低CD8+细胞毒性T细胞的抗肿瘤免疫能力。此外，肿瘤相关的肿瘤细胞表面上的MHC I改变的表达使其对免疫应答(4)“不可见”(Garrido等，Cancer Immunol.Immunother.59(10)，1601-1606(2010))。对抗原呈递功能和树突细胞(DC)的抑制也有助于避免抗肿瘤免疫(5) (Gerlini等，Am.J.Pathol.165(6)，1853-1863(2004))。
此外，肿瘤微环境的局部免疫抑制性质以及免疫编辑可以导致不表达靶抗原的癌细胞亚群的逃逸。因此，找到能够促进免疫系统的抗肿瘤活性的保存和/或恢复的方法将具有相当的治疗益处。
免疫检查点涉及肿瘤介导的抗肿瘤免疫的下调并被用作治疗靶标。已经证明T细胞功能障碍与抑制性受体CTLA-4和程序性死亡1多肽 (PD-1)(CD28家族受体成员)的诱导表达同时发生。PD-1是CD28 受体家族的抑制成员，除PD-1外，还包括CD28，CTLA-4，ICOS和BTLA。然而，虽然抗CTLA-4(ipilimumab)和抗PD-1药物(例如pembrolizumab 和nivolumab)的临床应用，甚至监管批准，已经强调了关于使用免疫疗法治疗黑素瘤的承诺，但患者接受这些免疫治疗的能力有限。最近的临床试验着重于阻断T细胞中的这些抑制性信号(如CTLA-4，PD-1和PD-1 PD-L1的配体)，表明逆转T细胞抑制对于成功的免疫疗法是关键的(6，7)(Sharma等，Science 348(6230)，56-61(2015)；Topalian等，Curr Opin Immunol.24(2)，202-217(2012))。这些观察结果强调了开发治疗癌症免疫系统的新型治疗方法的必要性。
痘病毒
痘病毒如工程化的痘苗病毒在转移性癌症的溶瘤治疗中处于最前沿 (Kirn等，Nature Review Cancer 9,64-71(2009))。痘苗病毒是大型DNA 病毒，其具有快速的生命周期和有效的血源性扩散到远处组织(9)(Moss， In Fields Virology(LippincottWilliams&Wilkins，2007)，pp.2905-2946)。痘病毒非常适合作为在癌细胞中表达多种转基因的载体，从而增强治疗功效(10)(Breitbach等人，Current pharmaceuticalbiotechnology 13,1768-1772 (2012))。临床前研究和临床试验证明使用溶瘤痘苗病毒和其它痘病毒治疗难治性晚期癌症(11-13)(Park等人，Lacent Oncol 9,533-542(2008)；Kirn等人PLoS Med 4，e353(2007)；Thorne等，J Clin Invest 117,3350-3358 (2007))。基于痘病毒的溶瘤疗法具有通过细胞溶解，细胞凋亡和坏死的组合来杀死癌细胞的优点。它也触发先天性免疫感测途径，促进免疫细胞募集到肿瘤和抗肿瘤适应性免疫应答的发展。在临床试验中(例如 JX-594)，目前的溶瘤痘苗病毒株使用缺失胸苷激酶的野生型牛痘以增强肿瘤选择性，并使用转基因如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 免疫反应(10)(Breitbach等，Curr Pharm Biotechnol 13,1768-1772(2012))。然而，许多研究显示野生型痘苗对抗原呈递细胞(APCs)具有免疫抑制作用(14-17)(Engelmayer等，J Immunol 163,6762-6768(1999)；Jenne 等，Gene therapy(2000)；P.Li等，J Immunol 175,6481-6488(2005)；Deng 等，J Virol 80,9997-9987(2006))，因此增加了免疫抑制和肿瘤本身的免疫侵袭作用。相比之下，高度减毒的痘苗病毒改良型痘苗病毒安卡拉 (MVA)具有中等的免疫激活作用(18,19)(Drillien等人，J Gen Virol 85,2167-75(2004)；Dai等人，PLoS Pathog10(4)，e1003989(2014)。
改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)是高度减毒的痘苗病毒株，是感染性疾病和癌症的重要疫苗载体。MVA来源于牛痘菌株，在鸡胚成纤维细胞中传代超过570代。MVA具有亲本痘苗基因组的31-kb缺失，并且在大多数哺乳动物细胞中是非复制的。在世卫组织赞助的天花疫苗接种期间，超过120,000人使用了MVA，并被证明对人类使用非常安全。由于其安全性和表达外来抗原的能力，MVA已经作为针对HIV，结核，疟疾，流感，冠状病毒和CMV以及癌症的疫苗载体进行了研究(20-25)(Sutter 等，Current(2008)；Gomez等，Curr Gene Ther 11,189-217(2011)；Goepfert 等，J Infect Dis 203,610-619(2011)；Wyatt等，Virology372,260-272(2008)； Garcia等，Vaccine 29,8309-8316(2011))。
作为癌症治疗剂的MVA的研究迄今仅限于其用作表达肿瘤抗原的疫苗载体(26,27)(Tagliamonte等，Hum Vaccin Immunother 10,3332-3346 (2014)；Verardi等，HumVaccin Immunother 8,961-970(2012))。基于MVA的载体已经表达了多种肿瘤抗原，一些重组病毒处于临床试验的不同阶段。例如，MVA-PSA-PAP表达前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)在转移性前列腺癌患者的临床试验中。表达肿瘤抗原brachyury的重组病毒MVA-brachyury-TRICOM和T细胞共刺激分子也在转移性癌症患者的临床试验中。已经证明在临床试验中表达p53肿瘤抑制基因的重组病毒MVA-p53是安全的。其他靶向的肿瘤抗原包括Her2， hMUC-1，TWIST等
虽然MVA是高度减毒和适度免疫刺激，它保留多种免疫抑制病毒基因，包括关键的毒力因子，E3。通过缺失痘苗毒力因子E3进一步减毒的重组MVA病毒MVAΔE3L不能在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)中复制，但其在幼仓鼠肾BHK-21细胞中保留复制能力(28)(Hornemann等，J Virol 77(15)，8394-07(2003))。MVAΔE3L能够在CEF中复制病毒DNA 基因组，并且在病毒晚期蛋白质合成中是缺失的(28)(Hornemann等， J Virol 77(15)，8394-07(2003))。它也在CEF中引发细胞凋亡(28) (Hornemann等，J Virol 77(15)，8394-07(2003))。HaLa细胞的 MVAΔE3L感染具有类似的效果(29)(Ludwig等，J Virol 79(4)，2584-2596 (2005))，MVAΔE3L也可能通过活化在HeLa细胞中诱导细胞凋亡线粒体途径(29)(Ludwig等，J Virol79(4)，2584-2596(2005))，dsRNA 在中间基因转录过程中产生，其可导致2'-5'-寡聚腺苷酸合酶/核糖核酸酶L和蛋白激酶R(PKR)。在PKR缺陷的MEF中，MVAΔE3L获得表达中间和晚期蛋白的能力((29)(Ludwig等，J Virol 79(4)，2584-2596 (2005))。
一项研究表明，促凋亡蛋白Noxa在MVAΔE3L细胞凋亡诱导中起作用(30)(Fischer等人，Cell Death Differ 13,109-118(2006))。尽管早期研究显示MVAΔE3L在CEF中诱导比MVA更高水平的I型IFN，但确切的机制尚未完全阐明(28)(Hornemann等，J Virol 77(15)，8394-07 (2003)。
在美国专利7049145中已经描述了一个MVAΔE3L，该专利通过引用并入本文。在大多数哺乳动物细胞包括小鼠和人类中，它是有感染潜力但不可复制的。
本公开集中于作为抗癌免疫治疗剂的MVA或MVAΔE3L的肿瘤内递送。希望MVA或MVAΔE3L的肿瘤内递送将引发肿瘤浸润免疫细胞(例如白细胞)，肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞的先天性免疫应答，并导致诱导I型IFN和促炎细胞因子和趋化因子，这将导致肿瘤免疫抑制微环境的改变。
最近在各种实体瘤中发现肿瘤新抗原(neoantigen)表明实体肿瘤具有通常因人而异的独特的新抗原(31,32)(Castle等人，Cancer Res 72,1081-1091(2012)；Schumacher等人，Science 348,69-74(2015))。本发明公开的重组病毒不通过表达肿瘤抗原起作用。本发明的重组MVA 病毒的瘤内递送允许肿瘤新抗原的有效交叉呈递和肿瘤内抗肿瘤适应性免疫的产生(并且也是系统性地延伸)，因此导致利用肿瘤细胞表达的肿瘤分化抗原和新抗原产生对抗肿瘤的免疫应答的“原位癌症疫苗接种”。
尽管存在由肿瘤内体细胞突变产生的新抗原，但是肿瘤抗原特异性 T细胞的功能常常受到多种抑制机制的控制(33)(Mellman等，Nature 480,480-489(2011))。例如，细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4) 对活化的T细胞的上调可以与T细胞共刺激因子CD28竞争与树突细胞 (DCs)上的CD80(B71)/CD86(B7.2)相互作用，从而抑制T细胞活化和增殖。CTLA-4也在调节性T(Treg)细胞上表达，并在介导Tregs 的抑制功能中起重要作用(Wing等，Science 322,271-275(2008)；Peggs 等J Exp Med 206,1717-1725(2009))。此外，PD-L/PD-L2在肿瘤细胞上的表达可以导致CD28家族抑制性受体PD-1的激活，导致T细胞耗竭。利用针对抑制性受体如CTLA-4和程序性死亡1多肽(PD-1)的抗体的免疫疗法已经在动物研究中显示出显著的临床前活性，并在转移性癌症患者中显示出临床反应，并且已经由FDA批准用于治疗转移性黑素瘤，非小细胞肺癌以及肾细胞癌(6,36-39)(Leach等，Science 271,1734-1746(1996)； Hodi等，NEJM 363,711-723(2010)；Robert等人，NEJM 364,2517-2526(2011)；Topalian等人，Cancer Cell 27,450-461(2012)；Sharma等人， Science 348(6230)，56-61(2015))
黑色素瘤
黑色素瘤是最致命的癌症之一，是美国和全世界增长最快的癌症。1980年以来，年轻白种女性的发病率上升了50％，主要原因是过度的阳光照射和使用晒黑床。根据美国癌症协会的统计，到2015年，美国约有 78,000人将被诊断为黑色素瘤，近一万人(或每小时一个人)将死于黑色素瘤。在大多数情况下，晚期黑色素瘤对传统疗法，包括化学疗法和辐射有抗性。因此，转移性黑色素瘤患者的预后很差，预期寿命只有6至10 个月。BRAF(一种关键的肿瘤促进基因)中大约50％的黑素瘤有突变的发现为这种疾病的靶向治疗打开了大门。使用BRAF抑制剂的早期临床试验显示，具有BRAF突变的黑色素瘤患者的显著但不幸的是不可持续的反应。因此，迫切需要针对这些患者以及其他患有BRAF突变的黑色素瘤的替代治疗策略。
人类病理学数据表明，黑素瘤病灶内T细胞浸润的存在与较长的患者存活率正相关(40)(Oble等，Cancer Immun.9,3(2009))。免疫系统如免疫激活剂IFN-α2b和IL-2进一步支持免疫系统在防止黑素瘤中的重要性(41)(Lacy et al.Expert Rev Dermatol 7(1)：51-68(2012))以及转移性黑素瘤患者对免疫检查点治疗的前所未有的临床反应，包括抗CTLA-4和抗PD-1/PD-L1单独或联合治疗(6,7,37，42-45)(Sharma 和Allison，Science 348(6230)，56-61(2015)；Hodi等，NEJM 363(8)， 711-723(2010)；Wolchok等，LancetOncol.11(6)，155-164(2010)； Topalian等，NEJM 366(26)，2443-2454(2012)；Wolchok等，NEJM 369 (2)，122-133(2013)；Hamid等(2013)；Tumeh等，Nature 515(7528)， 568-571(2014)。然而，许多患者单独对免疫检查点阻断疗法没有反应。病毒治疗可能会克服对免疫检查点阻断的抵抗，这是由动物肿瘤模型支持的(46)(Zamarin等，Sci Transl Med 6(226)，2014)。
I型IFN和肿瘤免疫中的胞质DNA感测途径。
I型IFN在宿主抗肿瘤免疫中起重要作用(47)(Fuertes等，Trends Immunol 34,67-73(2013))。IFNAR1修饰的小鼠在植入肿瘤细胞后更容易发生肿瘤；自发的肿瘤特异性T细胞引发在IFNAR1缺陷型小鼠中也是有缺陷的(48,49)(Diamond等，J Exp Med 208,1989-2003(2011)；Fuertes 等，J Exp Med 208,2005-2016(2011))。最近的研究显示胞质DNA感测途径在肿瘤来源的DNA的先天性免疫感应中是重要的，这导致抗肿瘤 CD8+T细胞免疫的发展(Woo等，Immunity 41,830-842(2014))。该途径在辐射诱导的抗肿瘤免疫中也起作用(51)(Deng等人，Immunity 41,843-852(2014))。尽管在癌症患者中可以检测到自发性抗肿瘤T细胞应答，但是癌症最终在大多数患者中克服了宿主抗肿瘤免疫性。改变肿瘤免疫抑制微环境的新策略对于癌症治疗是有益的。
概要
本公开涉及MVA和MVAΔE3L具有可以有效用于开发针对癌症的免疫疗法的性质的发现。瘤内注射MVA或MVAΔE3L导致肿瘤消退甚至根除，并产生系统性抗肿瘤免疫。因此，MVA和MVAΔE3L都可以用作治疗实体瘤的免疫疗法。此外，预期全身或肿瘤内递送的基于MVA的病毒疗法和免疫检查点阻断(或检查点激动剂疗法)的肿瘤内递送的组合导致注射肿瘤以及未注射的远处肿瘤中的抗肿瘤活性增强。
本发明人观察到，常规树突细胞(cDCs)的MVA感染通过由新发现的胞质DNA感测器cGAS(环状GMP-AMP合酶)及其衔接子STING (IFN基因的刺激物)介导的胞质DNA感测途径触发I型IFN。相反， cDC的野生型牛痘感染不能诱导I型IFN。他们还观察到具有缺失痘苗毒力因子E3(MVAΔE3L)感染cDC的重组MVA病毒比MVA诱导更高水平的I型IFN。它还能激活cDCs中MVAΔE3L病毒的先天性免疫感测途径，并通过MVA和MVAΔE3L诱导I型IFN，炎性细胞因子和趋化因子以及癌细胞凋亡。
这些观察结果导致使用这些高度减毒的修饰的痘苗病毒作为免疫激活剂以通过在肿瘤细胞以及免疫细胞中诱导I型IFN和其它炎性细胞因子和趋化因子来改变肿瘤诱导的免疫抑制性微环境的可能性(即在宿主中诱导抗肿瘤免疫应答或增强可能已经在进行的抗肿瘤应答并逆转它们的抑制)。这反过来导致更有效的肿瘤抗原呈递，以及抗肿瘤细胞毒性CD8+T 细胞，效应性CD4+T细胞的产生和活化，以及免疫抑制性CD4+调节性T 细胞和肿瘤相关巨噬细胞的减少。因为MVA和MVAΔE3L是安全的疫苗载体，所以在肿瘤内使用这种病毒载体可以使肿瘤抗原释放，有效呈递，并且产生抗肿瘤效应和记忆T细胞应答和抗肿瘤抗体产生。实际上，发明人观察到，瘤内使用MVA和MVAΔE3L导致树突细胞的活化和肿瘤抗原(包括致癌病毒抗原，肿瘤分化抗原和肿瘤新抗原)的改善。
MVA和MVAΔE3L的局部(例如肿瘤内)注射可用于肿瘤的各个阶段。对于早期的癌症，可以在手术切除肿瘤前2-3周使用病毒疗法。在此期间，宿主会产生系统性的抗肿瘤适应性免疫。对于晚期癌症，病毒疗法可以与其他治疗方式结合使用，包括手术，化疗，靶向治疗，放疗和免疫检查点治疗，这些将在下面详细介绍。
基于由本发明人获得的失活MVA的结果，并且在2016年2月25 日提交的PCTUS2016/019663中描述，为了所有目的将其通过引用整体并入，本发明人假设MVA或MVAΔE3L的肿瘤内注射将提供通过在免疫细胞和癌细胞中诱导I型IFN，通过激活包括树突细胞的免疫细胞以及促进肿瘤抗原呈递来改变肿瘤免疫抑制环境，从而对PD-1或CTLA-4靶向方法的额外的有益的作用。
在一个方面，本公开内容涉及治疗患者中的实体恶性肿瘤的方法，其包括向患者的肿瘤细胞递送一定量的MVA或MVAΔE3L，以有效诱导患者的免疫系统产生针对肿瘤的免疫应答，例如如以上概要所述，以完成以下(不分顺序)中的一个或多个：减小肿瘤的大小，根除肿瘤，抑制肿瘤生长或抑制转移或肿瘤的转移性生长。
另一方面，本公开涉及治疗恶性肿瘤的方法，其包括：
·向患者的肿瘤细胞递送一定量的MVA或MVAΔE3L以有效诱导患者的免疫系统产生针对肿瘤的免疫应答。
在一些实施例中，还存在以下特定特征中的一个或多个：
·效应T细胞的募集和激活，伴随着肿瘤中调节性CD4+细胞的减少；
·肿瘤是黑色素瘤或结肠癌；
·定期递送MVA或MVAΔE3L的方案继续进行，直至诱导肿瘤消退或根除；
·定期递送MVA或MVAΔE3L的方案将持续数周，数月或数年或无限期地进行，只要益处持续存在；
·定期递送MVA或MVAΔE3L的方案无限期地继续，直至达到最大耐受剂量；
·MVA或MVAΔE3L的输送是通过肠胃外注射；
MVA或MVAΔE3L的输送是通过肿瘤内注射进行的；
·交付MVA或MVAΔE3L是通过静脉注射；
·患者是人；
·MVA或MVAΔE3L以每次给药的剂量在约105-1010噬菌斑形成单位(pfu)范围内递送；
·MVA或MVAΔE3L以每次给药的剂量在约106至约109斑块形成单位(pfu)范围内递送；
·递送的量足以感染所有肿瘤细胞；
·每周一次到每周两次的频率重复给药；
·治疗持续数周，数月或数年；
·每周一次到每周两次的频率重复给药；
·黑素瘤是转移性黑素瘤。
MVA或MVAΔE3L在肿瘤部位的递送诱导罹患恶性实体瘤的患者的免疫系统产生针对肿瘤的免疫应答。患者针对肿瘤的免疫系统的刺激可以通过以下一种或多种免疫学作用显现出来(并且确实可以测试)：
·肿瘤内和/或肿瘤引流淋巴结内的抗肿瘤细胞毒性CD8+和效应性 CD4+T细胞的增加；
·通过诱导I型IFN诱导浸润所述肿瘤的树突细胞成熟；
诱导患者中活化的抗肿瘤效应T细胞，识别肿瘤内和/或肿瘤引流淋巴结内的肿瘤细胞；
·减少肿瘤内的免疫抑制性(调节性)CD4+T细胞；和
诱导肿瘤细胞在其表面表达MHC I并产生I型IFN。
更具体地，在一个方面，本公开涉及用于治疗患有恶性实体瘤的患者的方法，所述方法包括将选自MVA和MVAΔE3L及其组合的修饰的痘苗病毒递送至肿瘤细胞，从而治疗肿瘤。
在一些实施方案中，所述病毒的量有效地引起以下中的一种或多种：
a.诱导患者的免疫系统产生针对肿瘤的免疫应答或增强免疫系统对肿瘤的持续应答；
b.减少肿瘤的大小；
c.根除肿瘤；
d.抑制肿瘤的生长；
e.抑制肿瘤的转移；和
f.减少或根除转移性肿瘤。
另一方面，本公开内容提供了用于治疗患者中的实体恶性肿瘤的方法，其包括向患者的肿瘤细胞递送一定量的MVA或MVAΔE3L或其组合，以有效诱导患者的免疫系统产生抗肿瘤的免疫反应或增强所述患者对肿瘤的持续免疫反应，从而完成以下一项或多项：减小肿瘤的大小，根除肿瘤，抑制肿瘤的生长，抑制肿瘤的转移性生长，诱导肿瘤细胞凋亡或延长患者的存活。
另一方面，本公开内容涉及治疗患者的实体恶性肿瘤的方法，其包括向患者的肿瘤递送一定量的修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)或 MVAΔE3L或两者的组合以至少带来以下一种免疫效应：
a.增加肿瘤内和/或肿瘤引流淋巴结内的效应子CD8+T细胞和效应子CD4+T细胞中的至少一种；
b.通过诱导I型IFN诱导浸润所述肿瘤的树突细胞成熟；
c.减少肿瘤内的免疫抑制性(调节性)CD4+T细胞；
d.减少肿瘤内的免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞(TAM)
e.诱导免疫细胞和基质成纤维细胞中的I型IFN，炎性细胞因子和趋化因子的产生。
在每个前述方面的一些实施例中：
MVA或MVAΔE3L不含有编码或表达肿瘤抗原的核酸；
肿瘤包括位于MVA或MVAΔE3L位点的肿瘤或位于患者体内别处的肿瘤；
所述肿瘤中CD4+效应子T细胞的募集和活化伴随着调节性CD4+细胞的减少。
肿瘤是黑色素瘤或结肠癌或其他实体瘤；
继续递送MVA或MVAΔE3L直至其诱导肿瘤消退或根除；
MVA或MVAΔE3L的递送持续数周，数月或数年或无限期，只要益处持续或达到最大耐受剂量即可；
MVA或MVAΔE3L的递送无限期地继续，直到达到最大耐受剂量；
MVA或MVAΔE3L的递送是通过胃肠外，例如，
瘤内或静脉内注射；
患者是人；
MVA或MVAΔE3L以每次给药剂量约105-1010噬菌斑形成单位(pfu) 范围递送；
MVA或MVAΔE3L以每次施用剂量约106-109噬菌斑形成单位(pfu) 范围递送；
递送的量足以感染所有肿瘤细胞；
以每月一次到每周两次的频率重复递送；
递送每周重复一次；
黑素瘤是转移性黑素瘤；
MVA是MVAΔE3L；
又一方面，本公开内容提供了治疗患者中恶性肿瘤的方法，所述方法包括向患者的肿瘤细胞递送选自以下的病毒：改良的安卡拉痘苗病毒 (MVA)，MVAΔE3L及其组合，其量有效诱导患者的免疫系统产生针对肿瘤的免疫应答或增强所述患者针对肿瘤的持续免疫应答，并联合给药患者第二量的免疫检查点阻断剂或免疫检查点激动剂以有效阻断肿瘤内的免疫抑制机制。
在更具体的实施例中：
免疫抑制机制由肿瘤细胞，基质细胞或肿瘤浸润免疫细胞引发；
通过肠胃外途径给药；
递送是通过瘤内注射，并且给药是通过静脉内途径；
递送和给药均采用静脉途径；
递送和给药均通过瘤内注射；
免疫检查点阻断剂选自PD-1抑制剂，PD-L1抑制剂，CTLA4抑制剂，抗LAG-3(淋巴细胞激活基因3)抑制性抗体，TIM3(T细胞免疫球蛋白和黏蛋白-3)，B7-H3，和TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)；并且免疫检查点激动剂选自抗ICOS抗体、抗OX40抗体、抗4-1BB(CD137)和抗GITR；的激动剂抗体
所述抑制剂或激动剂中的任何一种是抗体；
肿瘤是原发性或转移性黑素瘤或原发性或转移性结肠癌或另一种实体瘤。
病毒被递送，并且免疫检查点阻断剂分别根据其自己的分隔间隔的施用时间表被施用；
首先递送病毒的第一剂量，并在一段时间后给药第一剂量的免疫检查点阻断剂；
递送和给药在相同的整个时间段内并行发生；
病毒和免疫检查点阻断剂中的一种或两种在数周，数月或数年或无限期的时间内分别递送和给药，只要益处持续且未达到最大耐受剂量即可；
病毒以每次给药剂量约105-1010噬菌斑形成单位(pfu)范围递送；
以每次施用剂量约106-109噬菌斑形成单位(pfu)范围递送病毒；
以每月一次到每周两次的频率重复病毒递送；
每周重复一次病毒递送；
病毒是MVAΔE3L；
患者是人；
病毒是MVA；
病毒和免疫检查点阻断剂或激动剂同时施用；
病毒和免疫检查点阻断剂或激动剂在相同的组合物施用；
MVA和免疫检查点阻断剂通过瘤内递送；
病毒和免疫检查点阻断剂依次施用；
灭活的MVA和免疫检查点阻断剂通过瘤内递送。
另一方面，本公开内容提供了用于治疗实体瘤的组合物，其包含一定量的选自MVA和MVAΔE3L及其组合的修饰的痘苗病毒，其有效诱导将被施用所述组合物的宿主的免疫系统以产生针对肿瘤的免疫应答或增强宿主对肿瘤的持续免疫应答；和药学上可接受的载体或稀释剂。
在该组合物的更具体的实施方案中，所述有效量为在一个单位剂型中约105-1010个噬菌斑形成单位(pfu)的范围内；或所述有效量在106至 109pfu的范围内。
附图说明
图1是以下数据的一系列图示，显示MVA诱导小鼠cDC中的I型 IFN产生。图1A是显示用WT VAC或MVA感染后1,4,8,14和22小时， GM-CSF-BMDC中IFN-γ和IFN-β分泌水平的图。图1B是柱状图，显示了用WT VAC或MVA感染6小时后GM-CSF-BMDC中IFNA4和IFNB 的mRNA水平。
图2是一系列条形图，显示由MVA诱导I型IFN在小鼠cDC中需要IFNAR1介导的转录因子IRF3/IRF7和I型IFN阳性反馈环。图2A-2C 是由IRF3-/-(2A)，IRF7-/-(2B)，IFNAR1-/-(2C)小鼠或它们的年龄匹配的WT对照产生的GM-CSF-BMDC中IFN-α和IFN-β的浓度。数据是平均值±SEM(n＝3)。显示了一个有代表性的实验，重复两次。*，p <0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图3是一系列图示，显示在BMDC中通过MVA诱导I型IFN和IRF3 磷酸化需要STING。图3A显示由Sting+/+和StingGt/Gt小鼠产生的 GM-CSF-BMDCs细胞中的IFN-α和IFN-β分泌水平的柱状图，用LPS刺激或用MVA感染。图3B显示了由Sting+/+和StingGt/Gt小鼠产生并感染了MVA的GM-CSF-BMDCs细胞中IFNA4和IFNB的mRNA表达水平。图 3C是免疫印迹的扫描图像，其显示IRF3，IRF3和GAPDH的磷酸化TBK1， TBK1，磷酸丝氨酸-396的蛋白质水平。“hpi”，感染后小时，“M”，模拟感染对照。图3D是条形图，显示了感染MVA的StingGt/Gt，IRF3-/和年龄匹配的WT C57B/6对照小鼠中IFN-α和IFN-β的分泌水平。数据是平均值±SD。显示的结果两个独立的实验的代表。
图4是一系列图示，表明cGAS是cDC的MVA感染的关键细胞溶质DNA感测器。图4A是显示由cGAS-/-小鼠及其年龄匹配的WT对照产生并感染MVA的GM-CSF-BMDC中IFN-α和IFN-β分泌水平的柱状图。数据是平均值±SEM(n＝3)。显示代表性实验，重复两次(***，p<0.001)。图4B是显示由cGAS-/-小鼠及其年龄匹配的WT对照产生并感染MVA 的GM-CSF-BMDCs细胞中IFNA4和IFNB的mRNA表达水平的条形图。数据是平均值±SEM(n＝3)。显示代表性实验，重复两次(***，p<0.001)。图4C是显示感染MVA的cGAS+/+和cGAS-/-cDC中IRF3，IRF3和GAPDH 的磷酸化TBK1，TBK1，磷酸丝氨酸-396的蛋白质水平的免疫印迹的扫描图像。“hpi”，感染后数小时。
图5是一系列图示，显示MVAΔE3L在BMDCs中比在MVA中诱导更高水平的I型IFN基因表达。图5A是显示用WT VAC，MVA或 MVAΔE3L感染的GM-CSF-BMDC中E3和β-肌动蛋白的蛋白质水平的免疫印迹的扫描图像。“hpi”感染后小时，“M”，模拟感染控制。图5B是显示用MVA或用MVAΔE3L感染的GM-CSF-BMDC中IFNA4和IFNB的 mRNA水平的柱状图。数据是平均值±SEM(n＝3)。显示了一个有代表性的实验，重复两次。***，p<0.001；在MVA和MVAΔE3L感染的细胞之间进行比较。图5C是显示从IRF3-/-小鼠和年龄匹配的WT C57B/6小鼠产生并用MVA或MVAΔE3L感染的GM-CSF-BMDC中IFNA4和IFNB 的mRNA水平的柱状图。数据是平均值±SEM(n＝3)。显示了一个有代表性的实验，重复两次。***，p<0.001；在MVA和MVAΔE3L感染的细胞之间进行比较。图5D是显示用MVA或用MVAΔE3L感染的 GM-CSF-BMDC中的p-IRF3和β-肌动蛋白的蛋白质水平的免疫印迹的扫描图像。
图6是一系列条形图，显示在cDC中通过MVAΔE3L诱导I型IFN 需要cGAS。图6A包括显示感染MVAΔE3L的cGAS+/+和cGAS-/-cDC中 IFNA4和IFNB的mRNA水平的柱状图。图6B包括显示感染MVAΔE3L 或用STING激动剂cGAMP处理的cGAS+/+和cGAS-/-cDCs中的IFN-α和 IFN-β分泌水平的条形图。图6C是显示感染有MVAΔE3L的cGAS+/+和 cGAS-/-cDCs中p-IRF3和GAPDH的蛋白质水平的免疫印迹的扫描图像。
图7是Western印迹数据的一系列扫描图像，显示dsRNA感测途径在MVAΔE3L诱导的IRF3磷酸化中也起作用。图7A显示WT，STINGGt/Gt或MAVS-/-小鼠产生的，且感染了MVAΔE3L或未处理(NT)的cDCs 中的p-IRF3和β-肌动蛋白的蛋白质水平。“hpi”，感染后小时。图7B显示了由WT或STINGGt/Gt/MDA5-/-(DKO)小鼠产生并感染了MVAΔE3L 或MVA的cDC中的磷酸化TBK1，TBK1，IRF3的磷酸丝氨酸-396，IRF3 和GAPDH的蛋白质水平。“hpi”，感染后小时。
图8是一系列条形图，显示鼠原代成纤维细胞的MVA和MVAΔE3L 感染导致诱导Ifnb(图8A)，Ccl4(图8B)，Il6(图8C)和Ccl5(图 8D)，这在很大程度上取决于cGAS。“NT”，没有处理。在STING和 MDA5双重缺失的小鼠原代成纤维细胞中，MVAΔE3L诱导的Ifnb(图8E)，Ccl4(图8F)，Il6(图8G)和Ccl5(图8H)的表达完全消除。
图9是显示鼠原代成纤维细胞的MVA和MVAΔE3L感染导致产生 IFN-β(图9A)，CCL4(图9B)，IL-6(图9C)和CCL5(图9D)，这主要取决于STING，以及MDA5的一些贡献。
图10是一系列条形图，显示B16-F10黑素瘤细胞中，MVAΔE3L感染比MVA感染导致更高的Ifna4(图10A)，Ifnb(图10B)，Il6(图10C)， Tnf(图10D)，Ccl4(图10D)10E)和Ccl5(图10F)分泌水平。“NT”，没有处理。
图11是一系列扫描的免疫印迹图像，显示用MVA或MVAΔE3L感染B16-F10黑素瘤细胞诱导细胞凋亡。图11A显示了用MVA或MVAΔE3L 感染的B16-F10黑素瘤细胞中PARP，切割的PARP和β-肌动蛋白的蛋白质水平。图11B显示了用MVA或MVAΔE3L感染的B16-F10黑素瘤细胞中MCL-1和β-肌动蛋白的蛋白质水平。“hpi”，感染后小时。图11C显示用MVA或MVAΔE3L感染的B16-F10黑素瘤细胞中磷酸化的IRF3和 GAPDH的水平。“hpi”，感染后小时。
图12是一系列图，显示瘤内注射MVA和MVAΔE3L导致荷瘤小鼠的存活延长并且在一些小鼠中根除肿瘤。图12A-C是注射PBS(A)， MVA(B)和MVAΔE3L(C)的个体小鼠中随时间的肿瘤体积的图。图12D是用PBS，MVA或MVAΔE3L注射的荷瘤小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。****，p<0.0001(MVA vs.PBS组)；***，p<0.001(MVAΔE3L vs.PBS组)。图12E是用MVA或MVAΔE3L成功治疗后无肿瘤小鼠的 Kaplan-Meier存活曲线，其接受对侧的B16-F10黑素瘤细胞攻击。幼稚小鼠从未接受过任何肿瘤细胞或病毒。
图13是数据的一系列图形表示，其显示用MVA瘤内注射导致肿瘤微环境中的免疫学改变。图13A-B是用PBS(13A)或MVA(13B)处理的肿瘤中表达FoxP3的CD4+细胞的流式细胞术分析的点图。图13D-E是用PBS(13D)或MVA(13E)处理的肿瘤中表达粒酶B的CD8+细胞的流式细胞术分析的点图。图13G-H是用PBS(13G)或MVA(13H)处理的肿瘤中表达Ki-67的CD8+细胞的流式细胞术分析的散点图。图13C 是描绘用PBS或MVA处理的肿瘤中CD4+Foxp3+百分比的图。图13F是描述用PBS或MVA处理的肿瘤中颗粒酶B+CD8+细胞百分比的图。图13I 是描绘用PBS或MVA处理的肿瘤中CD8+Ki-67+百分比的图。
图14是数据的一系列图示，显示用MVA肿瘤内注射诱导肿瘤引流淋巴结(TDLN)的免疫学改变。图14A-B是PBS(14A)或MVA(14B) 处理的小鼠的TDLN中颗粒酶B+CD8+细胞的流式细胞术分析的点图。图 14C-D是PBS(14D)或MVA(14E)处理的小鼠的TDLN中Ki-67+CD8+细胞的流式细胞术分析的点图。图14C是描绘来自用PBS或MVA处理的小鼠的TDLN中的颗粒酶B+CD8+细胞的百分比的图。图14F是描绘来自用PBS或MVA处理的小鼠的TDLN中的CD8+Ki-67+百分比的图。
图15是显示MVAΔE3L在MC38结肠癌细胞中诱导I型IFN和炎性细胞因子/趋化因子产生的一系列图示。图15A-D是显示用MVA或 MVAΔE3L感染的MC38结肠癌细胞的上清液中的IFN-β(15A)，IL-6 (15B)，CCL4(15C)和CCL5(15D)。图15E-H是显示用MVA或 MVAΔE3L感染后6小时的MC38结肠癌细胞中的Ifnb(15E)，Il6(15F)， Ccl4(15G)和Ccl5(15H)的mRNA水平的柱状图。图15I是蛋白质印迹的扫描图像，其显示了PARP，切割的PARP，磷酸化-IRF-3，IRF3和β- 肌动蛋白的蛋白质水平。“hpi”，感染后小时。
图16是显示MVAΔE3L在结肠癌的鼠模型中抑制肿瘤发生的一系列图。图16A和16B是肿瘤体积与从小鼠中注射PBS或病毒开始的时间的关系图，显示瘤内注射MVAΔE3L对于小鼠(C57B/6)小鼠单侧植入的鼠结肠腺癌(MC38细胞)的处理是有效的。显示了在治疗之前(第0 天)和治疗后至多45天用PBS或MVAΔE3L组治疗的小鼠的肿瘤体积。图16C是经处理的小鼠(MVAΔE3L)与对照小鼠(PBS)的Kaplan-Meier 存活曲线。***，p<0.001(MVAΔE3L对PBS组)。
图17是数据的一系列图示，其显示在鼠B16-F10黑素瘤双侧植入模型中MVA或MVAΔE3L瘤内注射诱导的未注射的远处肿瘤中的抗肿瘤作用。图17A-F是分别在PBS，MVA或MVAΔE3L注射后相对于时间(天) 绘制的注射(A，C，E)和未注射(B，D，F)肿瘤体积的图。图17G是注射PBS(实心圆圈)，MVA(实心方块)或MVAΔE3L(实心三角形) 的荷瘤小鼠(B16-F10细胞)的Kaplan-Meier存活曲线。****，p<0.0001 (MVAΔE3L对PBS组)；***，p<0.001(MVAvs.PBS组)。
图18是数据的一系列图示，显示在鼠B16-F10黑素瘤双侧植入模型中，MVA或MVAΔE3L的肿瘤内注射在注射和未注射肿瘤中诱导活化的效应子CD8+和CD4+T细胞并减少调节剂CD4+T细胞。图18A是在用PBS， MVA或MVAΔE3L处理的注射和未注射的肿瘤中的CD3+CD8+T细胞的流式细胞术分析的点图。图18B是用PBS，MVA或MVAΔE3L处理的注射和未注射肿瘤中的％CD3+CD8+T细胞的图。图18C和E是表达颗粒酶 B+(18C)或Ki-67(18E)的CD8+细胞的流式细胞术分析的点图。图18D 和F是用PBS，MVA或MVAΔE3L处理的注射和未注射肿瘤中的％CD8+颗粒酶B+(18D)，CD8+Ki-67+(18F)T细胞的图。图18G是用PBS， MVA或MVAΔE3L处理的注射和未注射肿瘤中的CD4+Foxp3+T细胞的流式细胞术分析的点图。图18H是用PBS，MVA或MVAΔE3L处理的注射和未注射肿瘤中的％CD4+Foxp3+T细胞的图。图18I和K是表示颗粒酶B+(18I)或Ki-67(18K)的CD4+细胞的流式细胞术分析的点图。图 18J和L是用PBS，MVA或MVAΔE3L处理的注射和未注射肿瘤中的％ CD4+粒酶B+(18J)，CD8+Ki-67+(18L)T细胞的图。(*，p<0.05；**， p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001)。
图19是数据的一系列图示，其显示瘤内注射MVA或MVAΔE3L减少鼠B16-F10黑素瘤模型中的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。图19A是用 PBS，MVA或MVAΔE3L处理的肿瘤中的TAM细胞 (CD45+Ly6C-MHCII+CD24loF4/80+CD11B+CD11c+)的流式细胞术分析的点图。图19B-D是用PBS，MVA或MVAΔE3L处理的肿瘤中的CD45+细胞中的％TAM，TAM1(CD11CloCD11bhi)和TAM2(CD11ChiCD11blo) 的图。(*，p<0.05；ns：不显著)。
详细说明
定义：
如本文所使用的，除非上下文另外明确指出，否则以下术语应该具有下文给出的含义：
“癌症”是指以不受控制的细胞生长为特征的一类人和动物疾病。除非另外明确指出，术语“癌症”在本文中可以与术语“肿瘤”，“恶性肿瘤”，“过度增殖”和“瘤”可互换使用。术语“癌细胞”与术语“肿瘤细胞”，“恶性细胞”，“过度增殖细胞”和“瘤细胞”可互换。
“黑色素瘤”是指源自能够产生黑色素的细胞的恶性肿瘤。术语黑素瘤与“恶性黑素瘤”同义。黑色素瘤广泛转移，涉及患者的淋巴结，皮肤，肝脏，肺和脑组织。
“实体瘤”是指除如淋巴瘤，白血病和多发性骨髓瘤的血液性癌症之外的所有赘生性细胞生长和增殖，原发性或转移性，以及所有的癌前和癌细胞和组织。实体瘤的实例包括但不限于：软组织肉瘤如纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤因瘤和其他骨肿瘤例如骨肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤)，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞癌，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎癌，肾母细胞瘤，宫颈癌，睾丸肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，脑/CNS肿瘤(例如，星形细胞瘤，胶质瘤，胶质瘤胚胎瘤，儿童肿瘤，例如非典型畸胎瘤样/横纹肌样瘤、生殖细胞瘤、胚胎瘤、室管膜瘤)，成神经管细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突胶质细胞瘤，脑膜瘤，黑色素瘤，成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。本发明的组合物和方法可用的一些最常见的实体瘤包括：头颈癌，直肠腺癌，神经胶质瘤，成神经管细胞瘤，尿路上皮癌，胰腺癌，子宫(例如子宫内膜癌，输卵管癌)卵巢癌，宫颈癌前列腺癌，非小细胞肺癌(鳞状和腺癌)，小细胞肺癌，黑色素瘤，乳腺癌，原位导管癌，肾细胞癌和肝细胞癌。肾上腺肿瘤(例如肾上腺皮质癌)，食管癌，眼(例如黑素瘤，成视网膜细胞瘤)，胆囊癌，胃肠癌，肾母细胞瘤，心脏，头和颈，喉和下咽癌，口腔(例如唇，口，唾液腺)，鼻咽癌，神经母细胞瘤，腹膜癌，垂体癌，卡波西肉瘤，小肠癌，胃癌，睾丸癌，胸腺癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，阴道肿瘤和任何前述的转移瘤。
“转移”是指癌症从其主要部位扩散到邻近组织或身体的远端位置。癌细胞可以脱离原发肿瘤，渗入淋巴管和血管，循环通过血液，并在身体其他部位的正常组织中生长。转移是一个连续的过程，取决于肿瘤细胞(或癌症干细胞)从原发肿瘤脱离，穿过血流或淋巴管，并在远处停止。一旦到了另一个地方，癌细胞会重新穿透血管或淋巴管壁，继续增殖，最终形成新的肿瘤(转移性肿瘤)。在一些实施方案中，这种新的肿瘤被称为转移性(或继发性)肿瘤。
“免疫应答”是指由上述细胞或肝脏产生的淋巴细胞，抗原呈递细胞，吞噬细胞，粒细胞和可溶性大分子中的一种或多种(包括抗体，细胞因子和补体)的作用，其导致选择性损伤，破坏或从人体中消除癌细胞，转移性肿瘤细胞等。免疫应答可以包括细胞应答，例如作为T细胞功能的细胞功能改变(调节，例如显着增强，刺激，激活，损伤或抑制)的T细胞应答。T细胞应答可以包括产生，增殖或扩增，或刺激特定类型的T细胞或T细胞子集，例如效应子CD4+，CD4+辅助子，效应子CD8+，CD8+细胞毒素或天然杀伤(NK)细胞。这种T细胞亚群可以通过检测一种或多种细胞受体或细胞表面分子(例如CD或分化分子簇)来鉴定。T细胞应答还可以包括影响其他细胞的分化或增殖的细胞因子(例如可溶性介质 (例如，细胞因子，淋巴因子，细胞因子结合蛋白或白细胞介素))的表达的改变(统计学显着增加或减少)。例如，I型干扰素(IFN-α/β)是先天免疫的关键调节剂(52)(Huber等，Immunology 132(4)：466-474 (2011))。动物和人体研究显示IFN-α/β在抗原识别抗肿瘤免疫应答的初始阶段直接影响CD4+和CD8+T细胞的命运。I型IFN响应于树突细胞的激活而被诱导，进而是先天免疫系统的哨兵。
“肿瘤免疫”是指肿瘤逃避免疫系统识别和清除的一个或多个过程。因此，作为一种治疗概念，当这种逃避被减弱或消除时，肿瘤免疫被“治疗”，并且肿瘤被免疫系统识别和攻击(后文称为“抗肿瘤免疫”)。肿瘤识别的一个例子是肿瘤结合，肿瘤发作的例子是肿瘤减少(数目，大小或两者)和肿瘤清除。
“T细胞”是指参与各种细胞介导的获得性免疫反应的胸腺来源的淋巴细胞。
“辅助T细胞”是指CD4+T细胞；辅助性T细胞识别与MHC II类分子结合的抗原。至少有两种类型的辅助性T细胞Th1和Th2，产生不同的细胞因子。
“细胞毒性T细胞”是指通常在其表面上具有CD8分子标记(CD8+) 的T细胞，并且通过破坏表面上具有特定抗原性分子的靶细胞而在细胞介导的免疫中起作用。细胞毒性T细胞也释放颗粒酶，一种丝氨酸蛋白酶，可通过穿孔素形成的孔进入靶细胞并诱导细胞凋亡(细胞死亡)。颗粒酶作为细胞毒性表型的标记。细胞毒性T细胞的其他名称包括CTL，细胞溶解性T细胞，溶细胞T淋巴细胞，杀伤性T细胞或杀伤性T淋巴细胞。细胞毒性T细胞的靶标可以包括病毒感染细胞，被细菌或原生动物寄生虫感染的细胞或癌细胞。大多数细胞毒性T细胞的蛋白CD8存在于细胞表面。CD8被吸引到I类MHC分子的部分。通常，细胞毒性T细胞是CD8+细胞。
“肿瘤浸润性白细胞”是指患有癌症(例如黑素瘤)的患者的白血细胞，其存在于或已经离开循环(血液或淋巴液)并迁移到肿瘤中。
“免疫检查点抑制剂”或“免疫检查点阻断剂”是指完全或部分减少，抑制，干扰或调节一种或多种检查点蛋白质的活性的分子。检查点蛋白调节T细胞活化或功能。检查点蛋白包括但不限于CD28受体家族成员， CTLA-4及其配体CD80和CD86；PD-1及其配体PDL1和PDL2；LAG3， B7-H3，B7-H4，TIM3，ICOS和BTLA(53)。
当在治疗性物质给药的情况下使用时，“肠胃外”包括除了通过消化道给药之外的任何给药途径。与本文公开的方法特别相关的是静脉内(包括例如通过肝门静脉)，肿瘤内或鞘内施用。
“抗体”是指与抗原或该分子的抗原结合片段特异性结合的免疫球蛋白分子，因此抗体可以是天然来源或重组来源的免疫球蛋白，可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性(结合抗原的)的片段或部分。抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体，单克隆抗体，Fv，Fab和F(ab)2，以及单链抗体(scFv)人源化抗体，嵌合抗体抗体，人重组抗体和双特异性和三特异性抗体。
“溶瘤病毒”是指优先感染癌细胞，在这些细胞中复制，并通过其复制过程诱导癌细胞裂解的病毒。天然存在的溶瘤病毒的非限制性实例包括水疱性口炎病毒，呼肠孤病毒，以及经基因工程改造为癌选择性的病毒诸如腺病毒，新城疫病毒和单纯疱疹病毒的病毒(参见例如Nemunaitis， J.InvestNew Drugs.17(4)：375-86(1999)；Kirn，DH等Nat RevCancer.9 (1)：64-71(2009)；Kirn等，Nat.Med.7：781(2001)；Coffey等Science 282：1332(1998))(8,54-56)。痘苗病毒感染许多类型的细胞，但优先在肿瘤细胞中复制，这是因为肿瘤细胞具有有利于复制的代谢，表现出也有利于复制的某些途径的激活，并创造逃避先天免疫系统的环境，这也有利于病毒复制。在本公开的上下文中，MVA和MVAΔE3L不符合溶瘤病毒的定义，因为它们不是主要通过在肿瘤细胞内复制并引起细胞凋亡而产生抗肿瘤作用。(它们也不符合疫苗的经典定义，因为这些病毒不表达肿瘤抗原，但可以说它们起免疫刺激分子的作用，类似于佐剂，因为它们可以增强宿主对肿瘤的免疫应答。
“MVA”是指“经过修饰的安卡拉痘苗病毒”，是指来源于安卡拉菌株的高度减毒牛痘病毒株，并被开发用作疫苗和疫苗佐剂。最初的MVA是通过鸡胚细胞连续传代从野生型安卡拉菌株中分离出来的，因此经过处理，它丧失了大约15％的野生型痘苗基因组，包括其在灵长类(包括人)细胞中有效复制的能力。(57)(Mayr等，Zentralbl Bakteriol B 167,375-390 (1978))。天花疫苗株MVA：标志物，遗传结构，经肠道接种疫苗获得的经验和在生物体中行为具有衰弱防御机制。MVA被认为是开发作为针对感染性疾病或肿瘤的基因或疫苗接种的重组载体的合适候选者。(58) (Verheust等，Vaccine 30(16)，2623-2632(2012))。MVA具有长度为178kb的基因组和(59)(Antoine等，Virol.244(2)：365-396(1998)) 中首次公开的序列。Genbank U94848.1中也公开了序列。临床级MVA 商业上可从丹麦的BavarianNordic A/S Kvistgaard公开获得。此外，MVA 可从ATCC，Rockville，MD和CMCN(InstitutPasteur Collection Nationale des Microorganismes)Paris，France获得。
“MVAΔE3L”是指MVA的缺失突变体，其缺乏功能性E3L基因，具有感染性但非复制性，并且其逃避宿主免疫系统的能力进一步受损。它可以用作疫苗载体。例如在美国专利7,049,145中已经描述了这种突变 MVA E3L敲除及其制备。
“患者”是指任何可以患有癌症并且因此受到折磨而需要治疗的动物 (哺乳动物，人类或其他)患者。
“治疗有效量”或“有效量”是指当以一个或多个剂量施用并持续足够的时间，足以提供期望的生物学结果以减轻，治愈或缓解疾病的足够量。在本公开中，MVA或MVAΔE3L的有效量分别是(以适当的时间和以合适的频率给药)减少癌细胞的数量的量；或减小肿瘤大小或根除肿瘤；或抑制(即减缓或停止)癌细胞浸润到周围器官；抑制(减慢或停止)转移性生长；抑制(稳定或中止(arrest))肿瘤生长；允许治疗肿瘤，和/或诱导针对肿瘤的免疫应答。本领域普通技术人员根据本公开可以使用常规实验来确定任何个别情况下的适当治疗量。这种测定将从体外发现的量开始，并在动物中发现有效量。治疗有效量将首先基于发现赋予培养中细胞益处的一种或多种浓度来确定。有效量可以从细胞培养物内的数据推断出来，并且可以基于诸如此处详细描述的因素来上调或下调。有效量范围的实例是每次给药从105个病毒颗粒到约1012个病毒颗粒。
具体关于本文公开的基于病毒的免疫刺激剂，“治疗有效量”或“有效量”是指这么一种包含MVA或MVAΔE3L的组合物的量，其足以减少，抑制或消除肿瘤细胞生长，从而减少或消除所述肿瘤，或足以在体外，离体或在患者中抑制，减少或消除转移性扩散，或引发针对肿瘤的免疫应答，所述免疫应答将最终导致视情况可以是转移性扩散减少，抑制和/或消除的一种或多种。肿瘤细胞生长的减少，抑制或根除可能是坏死，细胞凋亡或免疫应答或两种或更多种前述的组合的结果(然而，细胞凋亡的沉积 (precipitation)例如可能不是由于和溶瘤病毒观察到的相同的因子)。治疗有效量可取决于诸如组合物中使用的特定MVA，所治疗患者的年龄和状况，肿瘤形成程度，是否存在或缺失其它治疗方式等因素而变化。类似地，待施用的组合物的剂量和施用的频率将取决于多种因素，例如活性成分的效力，一旦施用其活性的持续时间，施用途径，患者的大小，年龄，患者性别和身体状况，不良反应的风险以及医师的判断。组合物以各种剂型如可注射溶液给药。
具体关于与免疫检查点抑制剂的组合疗法，免疫检查点阻断剂的“治疗有效量”应意指足以逆转或减少肿瘤微环境中的免疫抑制并激活或增强患者的宿主免疫力的免疫检查点阻断剂的量。有几种免疫检查点阻断剂被批准在临床试验中，或者还在开发中，包括针对CD28抑制剂的抑制性抗体如CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞抗原4)(例如ipilimumab)，抗PD-1 (程序性死亡1)抑制性抗体(例如nivolumab，pembrolizumab，pidilizumab，lambrolizumab)和抗PD-L1(程序性死亡配体1)抑制性抗体(MPDL3280A， BMS-936559，MEDI4736，MSB 00107180)以及针对LAG-3(淋巴细胞激活基因3)，TIM3(T细胞免疫球蛋白和黏蛋白-3)，B7-H3和TIGIT (具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)的抑制性抗体。前述的剂量范围在本领域技术人员中已知或容易在本领域的技术范围内，因为已经完成了多个剂量临床试验，从而可能推断出其它试剂。
优选地，肿瘤表达特定的检查点，但是这不是严格必需的，因为免疫检查点阻断剂阻断肿瘤内由肿瘤细胞，基质细胞和肿瘤浸润免疫细胞引发的更普遍的免疫抑制机制。
例如，CTLA4抑制剂ipilimumab当作为黑素瘤手术后的辅助疗法施用时，在90分钟内以1-2mg/mL施用，每3周总共3mg/kg的总输注量，总共4次剂量。该疗法通常伴有严重甚至危及生命的免疫介导的不良反应，这限制了耐受剂量以及可以施用的累积量。预计当与MVA或MVAΔE3L 联合给药时，可以减少ipilimumab的剂量和/或累积量。具体而言，鉴于以下所述的实验结果，预计如果将CTLA4抑制剂的剂量与一种或两种前述MVA病毒同时或相继地直接施用于肿瘤，则可进一步降低CTLA4抑制剂的剂量。因此，以上提供的ipilimumab的量将是确定给予联合给药的患者的特定剂量和累积量的起始点，但是将需要剂量研究来确定最佳量。
Pembrolizumab用于黑素瘤中作为辅助治疗时处方为在稀释至25mg /mL给药。每3周以30分钟内2mg/kg的剂量施用。再次，这将是确定与MVA或MVAΔE3L联合给药的剂量和给药的起始点。
Nivolumab处方为3mg/kg，每两周60分钟静脉内输注，为确定该检查点抑制剂与MVA或MVAΔE3L联合使用的剂量和给药方式提供了类似的起点。
免疫刺激剂例如激动剂抗体也已经作为癌症的免疫治疗被探索。例如，抗ICOS抗体结合ICOS的细胞外结构域，导致ICOS信号传导和T 细胞活化的激活。抗OX40抗体可以结合OX40并增强T细胞受体信号传导，导致T细胞活化，增殖和存活。其他例子包括针对4-1BB(CD137)， GITR的激动剂抗体。所有这些药物处于临床试验的不同阶段。
免疫刺激激动剂抗体可以联合瘤内注射MVA或MVAΔE3L全身施用。或者，免疫刺激激动剂抗体可以通过瘤内递送同时或依次与MVA或 MVAΔE3L联合使用。
“药学上可接受的载体和/或稀释剂”或“药学上可接受的赋形剂”包括但不限于任何和所有溶剂，分散介质，包衣，抗细菌剂和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂等。这种用于生物活性物质的介质和试剂的使用在本领域是公知的。赋形剂的进一步细节在下面提供。补充活性成分，例如抗微生物剂，例如抗真菌剂，也可以掺入组合物中。
与在肿瘤微环境中施置本公开的MVA或MVAΔE3L相关的“递送”，无论这是通过局部施用于肿瘤还是通过例如静脉内途径来完成。该术语着重于达到肿瘤本身的MVA或MVAΔE3L。
本文中的“联合给药”是指与MVA或MVAΔE3L联合给予第二种治疗方式，例如给予免疫检查点阻断剂并与MVA或MVAΔE3L紧密接近。例如，PD-1/PDL-1抑制剂和/或CTLA4抑制剂(在更具体的实施方案中，抗体)可以与MVA或MVAΔE3L同时施用(通过静脉内注射，或通过瘤内注射，当如上所述的MVA或MVAΔE3L通过瘤内注射或全身施用时) 或在MVA或MVAΔE3L施用之前或之后施用。如果MVA或MVAΔE3L 施用和免疫检查点阻断剂分开1-7天或甚至高达三周分开施用，这属于本文所述的“紧密接近”。
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在一个实施方案中，本公开涉及在患有肿瘤的患者中引发抗肿瘤免疫应答的方法，包括向所述肿瘤递送有效量的MVA或MVAΔE3L。免疫系统的刺激可以通过以下一种或多种免疫学作用来体现：
效应器CD8+T细胞和效应器CD4+T细胞中的至少一种在肿瘤和/ 或肿瘤引流淋巴结中的增加；
通过诱导I型IFN诱导浸润所述肿瘤的树突细胞成熟；
在患者中诱导在肿瘤内和/或在肿瘤引流淋巴结中识别患者肿瘤细胞效应CD4+T细胞；
减少肿瘤内的免疫抑制性(调节性)CD4+T细胞；
诱导肿瘤细胞产生一种或多种I型IFN或其它炎性细胞因子或趋化因子；
减少肿瘤内的免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞。
前述的一种或多种免疫学效应可以作为患者对治疗反应的早期指标，并且可以作为其持续有效性的监测。这些效果的观察表明，目前的病毒治疗肿瘤的方式不同于带有肿瘤抗原的疫苗载体(其不是通过瘤内递送，而是通过肌内，皮下或很少情况下，静脉途径递送)，也不同于溶瘤的病毒 (其主要由于肿瘤细胞中的病毒复制导致细胞病变)。如果根据本发明的治疗产生的细胞凋亡，不是由于与这些不同的作用模式引起或可能引起的细胞凋亡相同的机制导致。
本发明人已经探索了免疫应答的机制，并得出结论，它是由介导1 型IFN产生的cGAS/STING介导的胞质DNA感测途径启动的。在实施例中提供了对招募的机制和免疫细胞的进一步见解。其中提出的结论并不局限于这些机制被阐明的具体实验环境。
在一个实施方案中，本公开提供了治疗诊断患有实体瘤的患者的方法，包括向所述肿瘤递送治疗有效量的MVA或MVAΔE3L。
在一个实施方案中，本公开提供了在诊断患有癌症的患者中诱导抗肿瘤免疫的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的MVA或 MVAΔE3L。本公开的方法包括诱导抗肿瘤免疫，其可以减小肿瘤的大小，根除肿瘤，抑制肿瘤的生长，抑制转移或减少肿瘤的转移性生长或根除肿瘤的转移性生长，诱导肿瘤细胞的凋亡或延长患者的存活(与未治疗或常规治疗的患者相比)。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了在诊断有实体恶性肿瘤的患者中通过将肿瘤暴露于治疗有效量的MVA或MVAΔE3L来增强，刺激或引发可以包括先天性免疫应答和/或适应性免疫应答(例如T细胞应答) 的抗肿瘤免疫应答的方法。
在具体的实施方案中，本公开内容提供了引发介导适应性免疫应答的免疫应答的方法，所述适应性免疫应答既涉及针对肿瘤细胞的T细胞细胞毒性也涉及针对肿瘤细胞的效应子T细胞。所述方法包括向患有实体瘤的肿瘤内施用或(如本发明人预期的)静脉内施用包含MVA或MVAΔE3L 的组合物，其中所述组合物的施用导致针对肿瘤的肿瘤特异性免疫应答，以及最后导致减少，抑制或根除肿瘤生长，抑制转移性生长，肿瘤细胞的凋亡和/或延长患者的存活。事实上，本发明人已经显示癌细胞在被杀死，并且如在转移的情况中，免疫应答可以迁移到远端位置。
在一些实施方案中，本公开内容提供了介导适应性免疫应答的免疫应答的方法，所述适应性免疫应答既涉及针对肿瘤细胞的T细胞细胞毒性也涉及针对肿瘤细胞的效应子T细胞。所述方法包括肠胃外给药患者包含 MVA或MVAΔE3L的组合物，其中所述组合物的给药导致针对肿瘤的肿瘤特异性免疫应答，并最终导致肿瘤生长的减少，抑制或根除和/或抑制与常规治疗或不治疗相比，减少或消除转移性生长，肿瘤细胞凋亡和/或治疗患者存活的延长。对于腹膜内转移，病毒可以腹膜内注射。
事实上，本发明人已经显示癌细胞被杀死，并且如在转移的情况中，免疫应答可以迁移到远端位置，并且仍然发挥抗肿瘤作用。
由于MVA和MVAΔE3L在大多数哺乳动物细胞中基本上不具有复制能力，因此它不像具复制能力的疫苗或载体一样对免疫系统产生作用。因此，尽管认为免疫系统的刺激对于溶瘤作用是个障碍(8)(Kirn等， Nat Rev Cancer。(1)，64-71(2009))，但MVA和MVAΔE3L是能够利用先天性免疫系统来刺激适应性免疫，无论是在细胞毒性方面，还是在更广泛地针对肿瘤的效应T细胞活化方面。
因此，本公开内容提供了用于治疗实体恶性肿瘤的方法，包括向患者的肿瘤递送有效量的MVA或MVAΔE3L以诱导针对诊断为实体瘤的患者的肿瘤的免疫应答。
本公开内容还提供了在患有实体恶性肿瘤的患者中产生抗肿瘤系统免疫的方法，其包括向患者的肿瘤递送一定量的MVA或MVAΔE3L，其有效引起在所述患者中排斥非注射肿瘤和患者抑制肿瘤转移中的一种或两种(本发明人通过肿瘤再次攻击来测试)。
如本文所示，MVA通过由cGAS/STING介导的胞质DNA感测途径在常规树突细胞(cDCs)中诱导I型IFN诱导。在C57B/6小鼠中MVA 的静脉内递送在野生型小鼠中诱导I型IFN，但在缺乏STING或IRF3的小鼠中不诱导。还显示在cDC中，MVAΔE3L比MVA诱导更高水平的I 型IFN基因表达和IRF3的磷酸化。MVAΔE3L在由cGAS/STING介导的胞质DNA感测途径和由MDA5/MAVS介导的dsRNA感测途径都被检测。另外，B16黑素瘤细胞和MC38结肠腺癌细胞的MVAΔE3L感染诱导 I型IFN和促炎细胞因子和趋化因子，以及IRF3的磷酸化的活化。MVA 和MVAΔE3L都诱导B16和MC38细胞凋亡，如通过PARP和Caspase-3 的切割所证明的。根据本公开内容，将MVA或MVAΔE3L病毒用作直接抗癌疗法。在小鼠B16黑素瘤模型中瘤内注射MVA或MVAΔE3L导致细胞凋亡，延长存活和肿瘤根除，以及产生全身性抗肿瘤免疫。
基于目前的文献，并且不希望受理论束缚，认为以下机制有助于 MVA和MVAΔE3L的抗肿瘤作用：(i)在包括常规树突细胞和巨噬细胞的免疫细胞中诱导I型IFN应答；(ii)在癌细胞中诱导I型IFN和促炎细胞因子和趋化因子；(iii)在癌细胞中诱导细胞凋亡；和(iv)将肿瘤免疫抑制环境改变为免疫激活的环境。
改良的安卡拉痘苗(MVA)
修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)是痘病毒科Orthopoxvirus属的成员。安卡拉痘苗病毒株(CVA)的鸡胚成纤维细胞(CEF)上通过大约570 次连续传代产生MVA(60)(Mayr等，Infection 3,6-14(1975))。作为这些长期传代的结果，所得的MVA病毒含有广泛的基因组缺失，并且是高度限制于禽类细胞的宿主细胞(61)(Meyer等， J.Gen.Virol.72,1031-1038(1991))。在多种动物模型中显示，所得到的 MVA显著无毒(57)(Mayr等，Dev.Biol.Tstand.41,225-34(1978))。
MVA的安全性和免疫原性已经在临床试验中被广泛测试和记录，特别是针对人类天花病。这些研究包括超过12万个人，并且已经在人类中表现出优异的功效和安全性。而且，与其他基于牛痘的疫苗相比，MVA 减弱了毒力(感染性)，同时引发了良好的特异性免疫应答。因此，MVA 已被确立为安全的疫苗载体，具有诱导特异性免疫应答的能力。
由于上述特征，MVA成为开发用于重组基因表达和疫苗的工程化 MVA载体的有吸引力的候选者。作为疫苗载体，已经研究了对许多病理状况的MVA，包括HIV，结核和疟疾，以及癌症(20,21)(Sutter等， Curr Drug Targets Infect Disord 3：263-271(2003)；Gomez等，Curr Gene Ther 8：97-120(2008))。
已经证明，人单核细胞衍生的树突细胞(DC)的MVA感染引起 DC活化，其特征在于共刺激分子的上调和促炎细胞因子的分泌(18) (Drillien等人，J Gen Virol 85：2167-2175(2004))。在这方面，MVA 不同于标准野生型痘苗病毒(WT-VAC)，其不能激活DC。树突细胞可以分为两个主要亚型：常规树突细胞(cDC)和浆细胞样树突细胞(pDC)。前者，特别是CD103+/CD8+亚型，特别适用于将抗原交叉呈递给T细胞；后者是I型IFN的强力生产者。
人类细胞的病毒感染导致由I型干扰素(特别是干扰素-α)介导的先天性免疫应答(第一道防线)的激活。这通常导致激活免疫“级联”，具有活化T细胞(CTL和辅助细胞)的募集和增殖，并最终产生抗体。然而，病毒表达抑制宿主免疫应答的因子。MVA是比WT-VAC更好的免疫原，在哺乳动物细胞中复制不良。(参见，例如，Brandler等， J.Virol.84,5314-5328(2010))(62)。
但是，MVA不是完全不可复制，如本发明人显示包含一些残留的免疫抑制活性。然而，如本文所示，MVA显著延长了治疗患者的存活。这些发现的暗示是，通过注射肿瘤或系统性递送MVA(或MVAΔE3L)，有可能增强宿主的先天和适应性免疫应答，从而克服肿瘤逃避免疫应答和恢复宿主的能力以产生针对肿瘤的免疫应答，无论应答是天然的还是由另一种免疫治疗剂如检查点抑制剂诱导或增强的。
E3缺失的修饰的安卡拉痘苗病毒(MVAΔE3L)
MVAΔE3L也观察到前一节描述的MVA的抗肿瘤作用。后者比 MVA免疫抑制性低，在大多数哺乳动物细胞中甚至更少复制，并且从这个角度来看是优选的。另外，MVAΔE3L的作用通常在定性上说比用MVA 作用更好，如本文所述的实验中所见。
免疫反应
除了通过上调特定的免疫系统活性(例如抗体和/或细胞因子产生，或细胞介导的免疫的激活)来诱导免疫应答之外，免疫应答还可以包括抑制，削弱或任何其它可检测的免疫力下调，从而重建体内平衡并防止宿主自身器官和组织的过度损伤。在一些实施方案中，根据本公开的方法诱导的免疫应答产生可以直接或间接导致肿瘤细胞的死亡或增殖能力丧失的效应CD8+(抗肿瘤细胞毒性CD8+)T细胞或活化的T辅助细胞或两者。
可以通过检测多种众所周知的免疫学参数来检测本发明的方法引发的免疫反应(63,64)(Takaoka et al。，Cancer Sci.94：405-11(2003)；Nagorsen 等，Crit.Rev.Immunol.22：449-62(2002))。因此可以通过任何众所周知的测定法(包括免疫学测定法)来确定诱导的免疫应答的建立。这样的测定法包括但不限于，体内，离体或体外测定可溶性免疫球蛋白或抗体；细胞因子，趋化因子，激素，生长因子等可溶性介质以及其它可溶性小肽，碳水化合物，核苷酸和/或脂质介质；细胞活化状态改变，如通过改变的免疫系统细胞的功能或结构性质，例如细胞增殖，改变的运动性，改变的细胞内阳离子梯度或浓度(如钙)所确定；细胞多肽的磷酸化或去磷酸化；诸如特定基因表达或细胞溶解行为的特定活动的诱导；细胞免疫系统的细胞分化，包括改变的表面抗原表达谱或细胞凋亡(程序性细胞死亡)的发作；或可以检测到免疫应答的存在的任何其他标准。例如，区分免疫细胞类型的细胞表面标记可以通过与CD4+，CD8+或NK细胞结合的特异性抗体检测。可检测的其他标志物和细胞组分包括但不限于干扰素γ(IFN-γ)，肿瘤坏死因子(TNF)，IFN-α，IFN-β，IL-6和CCL5。检测免疫应答的常用方法包括但不限于流式细胞术，ELISA，免疫组织化学。进行这些和类似测定的程序是广泛已知的，并且可以在例如Letkovits(Immunology MethodsManual：The Comprehensive Sourcebook of Techniques，Current Protocols inImmunology，1998)中找到。
药物组合物和制剂
包含MVA或MVAΔE3L的药物组合物可以含有载体或稀释剂，其可以是含有，例如水，多元醇(例如甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性的保持可以，例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散的情况下维持所需的粒径和通过使用表面活性剂。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。一般而言，对于本领域技术人员而言，可以包括适合于注射制剂的赋形剂。
包含MVA或MVAΔE3L的药物组合物和制剂可以通过常规的混合，溶解，制粒，乳化，包封，包埋或冻干方法来制造。药物病毒组合物可以以常规方式使用一种或多种生理上可接受的载体，稀释剂，赋形剂或助剂来配制，所述载体，稀释剂，赋形剂或助剂有助于配制适用于体外，体内或离体使用的病毒制剂。所述组合物可以与一种或多种另外的生物活性剂(例如平行施用GM-CSF)组合，并且可以与药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂一起配制以产生本公开的适合肠胃外或瘤内给药的药物(包括生物学)或兽医用组合物。
如本领域技术人员所理解的，许多类型的配方是可能的。所选择的具体类型取决于所选择的施用途径，如本领域所公认的。例如，全身制剂通常将被设计用于通过注射给药，例如静脉内给药以及为瘤内给药而设计的那些。优选的，所述全身或肿瘤内制剂是无菌的。
通过将MVA或MVAΔE3L与需要量的适当溶剂以及本文列举的各种其他成分，根据需要，合并，随后合适的灭菌方法来制备无菌注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基本分散介质和所需的上述列举的其它成分的无菌载体中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前的无菌过滤溶液产生病毒粉末以及任何额外的所需成分。
在一些实施方案中，本公开内容的MVA和MVAΔE3L组合物可以配制成水溶液或生理学相容的溶液或缓冲液，例如Hanks溶液，林格溶液，甘露醇溶液或生理盐水缓冲液。在某些实施方案中，MVA和MVAΔE3L 组合物中的任一种可以包含配制剂，例如悬浮剂，稳定剂，渗透剂或分散剂，缓冲剂，冻干保护剂或防腐剂如聚乙二醇，聚山梨酸酯80,1-十二烷基六氢-2H-吖庚因-2-酮(laurocapran)，油酸，柠檬酸钠，Tris HCl，右旋糖，丙二醇，甘露糖醇，聚山梨酯聚乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯 (
Figure BDA0001495996790000261
-20)，肉豆蔻酸异丙酯，苯甲醇，异丙醇，乙醇蔗糖，海藻糖等本领域已知的，可用于本公开的任何组合物中。(Pramanick等，Pharma Times 45(3)，65-76(2013))(65)。
可以配制本公开内容的生物制品或药物组合物以使得其中包含的病毒在将组合物施用于患者后可用于感染肿瘤细胞。可以通过各种公认的技术如基于抗体的测定(例如，ELISA，免疫组织化学等)来监测施用后的血清，肿瘤以及其它组织(如果需要)的病毒水平。
MVA和MVAΔE3L的剂量
通常，给予患者MVA和MVAΔE3L的剂量范围为约105至约1010个空斑形成单位(pfu)，尽管可以施用较低或较高的剂量。在一个优选的实施方案中，剂量是约106-109pfu。根据所使用的特定pfu滴定方法， pfu与病毒颗粒的等同性可以不同。通常，pfu等于约5至100个病毒颗粒。 MVA或MVAΔE3L的治疗有效量可以以一个或多个分开的剂量在处方的时间段和以处方的给药频率给药。
例如，对于本领域技术人员显而易见的是，根据本公开内容的MVA 或MVAΔE3L的治疗有效量可根据诸如疾病状态，年龄，性别，体重和患者的一般状况患者以及MVA或MVAΔE3L在特定患者中引起期望的免疫应答(患者对疗法的应答)的能力。在向患者递送MVA或MVAΔE3L时，剂量还将取决于诸如一般医学状况，既往病史，疾病进展，肿瘤负荷等因素而变化。
在一些实施方案中，以剂量单位形式配制本公开的组合物对便于施用和剂量均匀性可能是有利的。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗的哺乳动物患者的单位剂量的物理上分散的单位；每个单位含有经计算可产生所需治疗效果的预定量的活性物质以及所需的药学上或兽医上可接受的载体。
MVA和MVAΔE3L的给药和治疗方案
MVA和MVAΔE3L的施用可以使用多于一种途径来实现，包括肠胃外，例如肿瘤内或静脉内施用。在一个实施方案中，将MVA或 MVAΔE3L直接施用到肿瘤中，例如，通过肿瘤内注射，其中需要直接的局部反应。另外，MVA和MVAΔE3L的施用途径可以变化，例如，使用瘤内注射的第一次施用，以及随后通过静脉内注射施用，或其任何组合。MVA或MVAΔE3L注射剂的治疗有效量可以在处方的时间段内和以处方的给药频率给药。在某些实施方案中，MVA和MVAΔE3L可以与其它治疗性治疗联合使用。例如，MVA和MVAΔE3L可以在新辅助(neoadjuvant，术前)或辅助(postoperative，术后)方式中施用用于患大体积原发性肿瘤的患者。预期这种优化的治疗方案将诱导针对肿瘤的免疫应答，并在主要治疗(例如手术)之前或之后减少患者的肿瘤负荷。此外，MVA或 MVAΔE3L可以与其他治疗性治疗如化疗或放射联合施用。
在某些实施方案中，MVA或MVAΔE3L病毒每周或每月至少施用一次，但是如果需要，可以更频繁地施用，例如每周两次，几周，几月，几年或甚至无限期地持续施用。如果耐受并且如果它们导致持续的或增加的益处，那么考虑更频繁的施用。本方法的益处包括但不限于以下：减少癌细胞数量，减小肿瘤大小，根除肿瘤，抑制癌细胞浸润到周围器官，抑制或稳定或根除转移性生长，抑制或稳定肿瘤生长，稳定或改善生活质量。此外，益处可包括诱导针对肿瘤的免疫应答，效应物CD4+T细胞的激活，效应物CD8+T细胞的增加或调节性CD4+细胞的减少。例如，在黑素瘤的情况下，益处可以是在黑素瘤的初始诊断的一年，二年，三年，四年，五年或更多年内没有复发或转移。可以对结肠癌和其他实体瘤进行类似的评估。
在某些其他实施方案中，用MVA或MVAΔE3L体内，离体或体外处理肿瘤块或肿瘤细胞。
实施例
材料和方法
病毒和细胞系
MVA和MVAΔE3L病毒由Gerd Sutter(慕尼黑大学)友情提供，并在BHK-21(幼仓鼠肾细胞，ATCC CCL-10)细胞中繁殖。MVA是商业和/或公开可获得的。描述了产生MVAΔE3L病毒的方法(28) (Hornemann等，J Virol 77,8394-8407(2003))。病毒通过36％蔗糖缓冲液纯化。在含有10％FBS，0.1mM非必需氨基酸(NEAA)和50mg/ml 庆大霉素的Eagle's MinimalEssential Medium(Eagle's MEM，可以从Life Technologies，目录号11095-080购买)中培养BHK-21。鼠黑素瘤细胞系 B16-F10最初从I.Fidler(MD Anderson Cancer Center)获得。将B16-F10 细胞维持在补充有10％FBS，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素， 0.1mMNEAA，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠和10mM HEPES缓冲液的RPMI 1640培养基中。将MC38结肠腺癌癌细胞维持在Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM，Invitrogen)中。所有细胞在37℃，5％ CO2培养箱中培养。
除非另有说明，否则本文使用的细胞和细胞系是商业上可获得的。小鼠
6至10周龄的雌性C57BL/6J小鼠购自Jackson Laboratory，用于制备骨髓来源的树突细胞，并用作体内实验的对照小鼠。这些小鼠被保存在斯隆凯特林研究所的动物设施中。所有程序严格按照美国国家卫生研究院“实验动物护理和使用指南”中的建议进行。操作程序由斯隆-凯特林癌症研究所动物实验伦理委员会批准。cGAS-/-，IRF3-/-，IRF7-/-，MAVS-/-， MDA5-/-和STINGGt/Gt小鼠在Zhijian Chen博士(德克萨斯大学西南医学中心；cGAS-/-和MAVS-/-)，Tadatsugu Taniguchi博士(东京大学，IRF3 和IRF7-/-)，Marco Colonna博士(华盛顿大学MDA5-/-)，Russell Vance 博士(加州大学伯克利分校；STINGGt/Gt)的实验室中产生。
这些或类似动物的商业来源如下：
Figure BDA0001495996790000291
产生骨髓来源的树突细胞
首先从骨骼中分离出肌肉，然后用含有10％FCS的RPMI的0.5cc U-100胰岛素注射器(Becton Dickinson)冲洗细胞，从而收集小鼠胫骨和股骨的骨髓细胞。离心后，通过在冰上孵育细胞1-3分钟，将细胞重悬于 ACK裂解缓冲液(Lonza)中进行红细胞裂解。然后收集细胞，重悬于新鲜培养基中，并通过40-μm细胞过滤器(BD Biosciences)过滤。计数细胞的数量。为了产生GM-CSF-BMDCs，将骨髓细胞(每个15cm细胞培养皿中500万个细胞)在GM-CSF(30ng/ml，由斯隆凯特林学院的单克隆抗体核心设施制备)存在的CM培养10-12天。CM是补充有10％胎牛血清(FBS)，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.1mM必需和非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠和10mMHEPES缓冲液的的RPMI 1640培养基。每2天通过用新鲜培养基代替50％的旧培养基喂养细胞，并每3-4天重新铺板以除去贴壁细胞。只有非贴壁细胞被用于实验。
RNA分离和实时PCR
用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从全细胞裂解液中提取RNA，并用First StrandcDNA合成试剂盒(Fermentas)逆转录。使用基因特异性引物，用SYBR Green PCR Mater Mix(Life Technologies)和Applied Biosystems 7500实时PCR仪(Life Technologies)一式三份进行定量实时 PCR。相对表达以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平标准化。
以下引物用于实时PCR：
IFNA4正向：5'-CCTGTGTGATGCAGGAACC-3'(SEQ ID NO：1)，
IFNA4反向：5'-TCACCTCCCAGGCACAGA-3'(SEQ ID NO：2)；
IFNB正向：5'-TGGAGATGACGGAGAAGATG-3'(SEQ ID NO：3)，
IFNB反向：5'-TTGGATGGCAAAGGCAGT-3'(SEQ ID NO：4)；
CCL5正向：5'-GCCCACGTCAAGGAGTATTTCTA-3'(SEQ ID NO：5)，
CCL5反向：5'-ACACACTTGGCGGTTCCTTC-3'(SEQ ID NO：6)；
IL-6正向：5'-AGGCATAACGCACTAGGTTT-3'(SEQ ID NO：7)，
IL-6反向：5'-AGCTGGAGTCACAGAAGGAG-3'(SEQ ID NO：8)；
CXCL10转发：5'ATTCTTTAAGGGCTGGTCTGA 3'(SEQ ID NO：9)
CXCL10反向：5'CACCTCCACATAGCTTACAGT 3'(SEQ ID NO：10)
TNF正向：5'GTCAGGTTGCCTCTGTCTCA 3'(SEQ ID NO：11)
TNF反向：5'TCAGGGAAGAGTCTGGAAAG 3'(SEQ ID NO：12)
GAPDH正向：5'-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3'(SEQ ID NO：13)，
GAPDH反向：5'-AGACAACCTGGTCCTCAGTGT-3'(SEQ ID NO：14)。
相对表达对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)的水平进行标准化。
细胞因子测定
细胞用MOI为10的各种病毒感染1小时或模拟(mock)感染。除去接种物并用PBS洗涤细胞两次并与新鲜培养基一起温育。感染后不同时间收集上清液。通过使用IFN-α/β(PBLBiomedical Laboratories)，IL-6， CCL4和CCL5(R&D systems)的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒来测量细胞因子水平。
Western blot分析
以MOI(感染复数)为10的MVA或等量的MVA或MVAΔE3L感染BMDCs，B16-F10或MC38细胞(1x106)。在感染后的不同时间，除去培养基并收集细胞。制备全细胞裂解物。将相等量的蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将多肽转移到硝酸纤维素膜上。使用对IRF3的磷酸丝氨酸-396特异性的兔多克隆抗体(Cell Signaling)测定IRF3的磷酸化。使用对IRF3的兔多克隆抗体(Cell Signaling)测定IRF3 的水平。抗STING抗体购自CellSignaling。通过使用Stuart N.Isalls博士 (University of Pennsylvania)(66)(Weaver等，Virus Res 130：269-274 (2007))提供的抗E3单克隆抗体(MAb 3015B2)测定痘苗病毒E3蛋白水平。使用抗PARP和抗MCL-1抗体(Cell Signaling)来测定PARP 切割和MCL-1蛋白降解。使用抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)或抗β -肌动蛋白抗体(Cell Signaling)作为上样对照。
肿瘤植入和瘤内注射病毒
将B16-F10黑素瘤细胞(1×105)皮内植入C57BL/6J小鼠的右侧剃毛皮肤中。在植入后10至12天后，测量肿瘤尺寸，当小鼠处于麻醉下，在直径3mm或更大的肿瘤注射MVA或MVAΔE3L(2×107pfu)或PBS。病毒每周注射或根据每个实验中指定。每天监测小鼠，每周两次测量肿瘤大小。根据以下公式计算肿瘤体积：l(长度)×w(宽度)×h(高度)/2。在小鼠出现痛苦(distress)的迹象或肿瘤的直径达到10毫米时处予安乐死。当小鼠安乐死时收集血清。
将MC38鼠结肠腺癌细胞(2×105)皮内植入C57BL/6J小鼠右侧剃须皮肤中。植入7天后，测量肿瘤尺寸，当小鼠处于麻醉下时，直径2-3mm 的肿瘤注射PBS或MVAΔE3L(2×107pfu)。在病毒注射后的不同天测量肿瘤大小。
双侧肿瘤植入模型和瘤内注射MVA或MVAΔE3L
简而言之，将B16-F10黑素瘤细胞皮内植入到C57B/6小鼠的左侧和右侧(右侧为5×105，左侧为1×105)。肿瘤植入后8天，右侧腹部较大的肿瘤用2×107pfu的MVA或等量的MVAΔE3L瘤内注射。测量肿瘤大小，每周两次重新注射肿瘤。监测小鼠的存活。
在一些实验中，将MC38结肠腺癌细胞皮内植入到C57B/6小鼠的左侧和右侧(右侧5×105和左侧1×105)。
流式细胞仪
为了分析肿瘤或肿瘤引流淋巴结中的免疫细胞表型和特征，我们根据以下操作程序(46)(Zamarin等，Science Translational Medicine 6,226-232 (2014))在FACS分析之前制备细胞悬液。首先我们用MVA或PBS处理三天后用镊子和手术剪刀分离肿瘤。然后称重肿瘤。在Liberase (1.67WünschU/ml)和DNase(0.2mg/ml)孵育30分钟之前，将肿瘤或肿瘤引流淋巴结切碎。通过反复移液产生细胞悬液，通过70-μm尼龙过滤器过滤，然后用完全RPMI洗涤，然后进行Ficoll纯化以去除死细胞。处理细胞以用抗CD3，CD45，CD4和CD8抗体进行表面标记。通过使用固定染料eFluor506(eBioscience)将活细胞与死细胞区分开来。使用FoxP3 固定和透化试剂盒(eBioscience)使它们进一步透化，并对Ki-67，FoxP3 和颗粒酶B进行染色。为了染色髓系细胞群，使用购自eBioscience的荧光共轭抗CD45.2(104)，CD11b(M1/70)，Ly-6C(HK1.4)，MHCⅡ(M5 /114.15.2)，CD24(M1/69)，F4/80(BM8)，CD103(2E7)和CD11c (N418)。所有的抗体用它们各自的同种型对照进行测试。使用LSRII 流式细胞仪(BD Biosciences)获得数据。数据用FlowJo软件(Treestar) 分析。
试剂
试剂的商业来源如下：CpG寡脱氧核苷酸ODN2216(Invitrogen)； cGAMP从InvivoGen购买。抗-PARP、抗-Mcl1抗体获自Cell Signaling。用于流式细胞术的抗体购自eBioscience(CD45.2 Alexa Fluor 700，CD3 PE-Cy7，CD4 APC-efluor780，CD8 PerCP-efluor710，FOXP3 Alexa Fluor 700， CD45.2 eFluor 450，CD11b APC-eFluor 780，Ly -6C PE，MHC PE-eFluor 610， CD24 APC，F4/80 PerCP-Cy5.5，CD103 FITC，CD11c AlexaFluor 700)。 Invitrogen(CD4 QDot 605,Granzyme B PE-Texas Red,Granzyme B APC)，BD Pharmingen(Ki-67-Alexa Fluor 488)。抗IRF3的磷酸丝氨酸-396和抗-IRF3 抗体购自Cell signaling。
统计
Two-tailed unpaired Student’s t检验用于研究中两组的比较。通过对数秩(log-rank,Mantel-Cox)检验分析存活数据。下面图中显示的p值被认为是显着的：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)制备
将肿瘤与小鼠分离，并在用剪刀研磨之前评估肿瘤的总重量。然后用RPMI 1640中的1.7U/ml Liberase(Roche)和100μg/ml DNAse(Sigma) 消化肿瘤，并在37.C振荡器中温育30分钟。消化后，将细胞样品在RPMI 1640中稀释并通过细胞过滤器。接下来将细胞用RPMI 1640洗涤并重悬于FACS缓冲液中。在染色进行流式细胞术分析之前，将单细胞保持在冰上。
TIL的流式细胞术
将TIL与2.4G2mAb预孵育以阻断FcγR结合，并在冰上用抗体组染色30分钟。荧光标记的CD45.2(104)，CD11b(M1/70)，Ly-6C(HK1.4)， MHCⅡ(M5/114.15.2)，CD24(M1/69)，F4/80(BM8)，CD103 (2E7)和CD11c(N418)购自eBioscience。所有的抗体用它们各自的同种型对照进行测试。活力通过用LIVE/DEAD试剂盒(Invitrogen)染色来评估。所有样品用LSRII流式细胞仪(Becton Dickinson)采集并用FlowJo 软件(Tree Star)分析。
从小鼠皮肤产生原代成纤维细胞的操作程序
通过吸入二氧化碳使小鼠安乐死，剃光和化学脱毛。它们被浸没在 70％乙醇1-2分钟。切下躯干皮，放入100mm组织培养皿的盖上的PBS 中，并使表皮侧向下展开。用两对镊子刮取真皮一侧的皮下组织后，将皮肤样品与500μl分散酶(0.5U/ml)/PBS一起在37℃温育45分钟。将皮肤样品置于100mm组织培养皿的盖上，其表皮侧朝上，并且使用两对钳子机械去除表皮。用PBS洗涤真皮层4次，然后在I型胶原酶(4mg/ml，含1％BSA的PBS中)中消化3小时，37℃。将细胞在具有20％FBS的 DME培养基中培养1-2周。
实施例1
MVA诱导小鼠cDC中的I型IFN产生
为了测试MVA是否可以诱导I型IFN诱导，在GM-CSF存在下培养骨髓衍生的树突细胞(GM-CSF-BMDC或cDC)，并以感染复数(MOI) 为10的WT VAC或MVA进行感染。在感染后不同时间点(1,4,8,14和 22小时)收集上清液，通过ELISA评估IFN-α和IFN-β蛋白水平。如图 1A所示，在用MVA感染后8小时检测到IFN-α和IFN-β两者，并在感染后持续累积达24小时。
为了测试cDC的WT VAC或MVA感染是否影响I型IFN基因表达，使用感染6小时后分离自感染WT VAC或MVA的GM-CSF培养的cDC 的RNA进行定量实时PCR分析。模拟感染控制也包括在实验中。如图1B 所示，当与未处理的细胞相比时，cDCs的MVA感染分别使IFNA4和IFNB mRNA水平增加6倍和105倍。相比之下，WT VAC感染使IFNA4和IFNB mRNA水平分别增加了2倍和6倍(图1B)。这些结果表明，MVA是比 WT VAC显著更强的IFNA4和IFNB基因表达的诱导物(p<0.001)。该实验表明，WT VAC和MVA对宿主的免疫系统(这里通过对树突细胞的作用评估)具有不同的作用，从MVA而不是WT VAC诱导由IFN-α和 IFN-β代表的I型干扰素的表达开始。
实施例2
在鼠cDC中MVA诱导的I型IFN产生依赖于IRF3/IRF7/IFNAR1
转录因子IRF3和IRF7是I型IFN诱导的关键调节因子，并且对宿主防御病毒感染是关键的(67)(Sato等，Immunity 13：539-548,2000)。为了测试MVA诱导I型IFN是否需要IRF3和IRF7，从IRF3-/-，IRF7-/-和 WT小鼠(年龄匹配)产生cDC，并用MVA感染。MVA诱导的IFN- α/β分泌在IRF3缺失的cDC中消除(图2A)。IRF7-/-细胞不能产生响应MVA感染的IFN-α，而MVA感染的IRF7-/-细胞的IFN-β诱导减少 57％(图2B)。
为了评估由IFNAR1介导的I型IFN阳性反馈环是否是诱导IFN所需要的，用MVA以10MOI感染IFNAR1-/-cDC和WT对照，并通过ELISA 评估IFN-α/β分泌水平。在IFNAR1-/-细胞中MVA诱导的IFN-α消除，而MVA诱导的IFN-β与野生型对照相比，减少45％(图2C)。总的来说，这些结果表明：(i)IRF3是MVA诱导的I型IFN产生的关键转录因子，和(ii)IRF7和IFNAR1在扩增MVA感染诱导的I型IFN信号传导中起作用。因此，这些结果证实了MVA通过与免疫系统活化相关的机制诱导I型IFN的能力。
实施例3
MVA诱导的I型IFN诱导依赖于STING
STING是响应细胞内DNA或DNA病原体(包括细菌和DNA病毒) 的I型IFN诱导所必需的内质网相关蛋白(68，69)(Ishikawa等，Nature 455：674-678(2008)；Barber等Curr OpinImmunol 23：10-20(2011)。为了测试通过MVA在cDC中诱导I型IFN是否需要STING，从N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)诱导的Goldenticket(Gt)变异小鼠(StingGt/Gt)产生cDC，StingGt/Gt携带Sting的单核苷酸变异，导致功能上无效的等位基因(70)(Sauer等，Infect Immun79：688-694(2011))，使用来自年龄匹配的WT小鼠的cDCs细胞用MOI为10的MVA感染或用脂多糖(LPS)处理，在StingGt/Gt细胞中MVA诱导IFN-α/β被消除，而LPS 诱导的IFN-α/β产生不受影响(图3A)，MVA诱导的IFNA4mRNA从 WT细胞的6倍降低到StingGt/Gt细胞的2倍，而通过MVA诱导的IFNB mRNA从WT细胞中的133倍降低至StingGt/Gt细胞中的14倍(图3B)。此外，蛋白质印迹分析显示MVA诱导的IRF3磷酸化在WTcDC中感染后 4和6小时达到高峰，在StingGt/GtcDC中不存在(图3C)。总之，这些结果表明，STING对于MVA诱导的I型IFN产生和cDC中的IRF3磷酸化是必需的。
MVA激活STING及其下游信号转导途径(包括转录因子IRF3)的能力使其不同于具有复制能力的WT VAC，其不能激活STING/IRF3。发明人推断MVA介导的抗肿瘤免疫的机制将不同于由WT VAC或缺失胸苷激酶的重组复制型VAC介导的溶瘤效应的机制。
实施例4
MVA以STING/IRF3依赖性方式在体内触发I型IFN生产
为了测试MVA是否以STING/IRF3依赖性方式在体内触发I型IFN 生产，通过尾静脉注射2×107pfu感染Sting+/+，StingGt/Gt和IRF3-/-。感染后6小时收集血清。在StingGt/Gt和IRF3-/-小鼠中(图3D)，Sting+/+小鼠的MVA感染分别诱导IFN-α和IFN-β产生至798pg/ml和1017pg/ ml的水平。这些结果表明，体内MVA诱导的I型IFN产生也依赖于STING 和转录因子IRF3。
MVA通过静脉内递送以STING/IRF3依赖性方式诱导I型IFN产生的能力也指出由MVA介导的IFN依赖性治疗效果。
实施例5
在cDC中通过MVA诱导I型IFN需要cGAS
STING/IRF3途径可以通过环GMP-AMP(cGAMP)激活，环 GMP-AMP(cGAMP)是由环GMP-AMP合酶(cGAS)响应DNA病毒感染而产生的第二信使(71)(Sun等人Science 339：786-791(2013))。为了测试cDC的MVA感染是否通过由胞质DNA感测器cGAS介导的胞质DNA感测途径触发I型IFN诱导，从cGAS-/-(72)(Li等，Science 341 (6152)：1390-1394(2013))小鼠和年龄匹配的WT对照产生cDCs，并用MVA感染，如图4A所示，MVA诱导的IFN-α/β产生在cGAS-/-细胞中消除。与WT细胞比较，MVA诱导的IFNA4和IFNB的mRNA在 cGAS-/-细胞中也消除(图4B)。最后，Western印迹分析表明cGAS-/-细胞中缺失MVA诱导的TBK1和IRF3的磷酸化(图4C)。这些结果表明 cGAS是MVA的关键胞质DNA感测器。
实施例6
与MVA相比，MVAΔE3L在小鼠cDC中诱导更高水平的I型IFN产生
E3是减弱各种先天性免疫应答(包括I型IFN诱导)的关键毒力因子。MVA保留了E3L基因。Western印迹分析显示E3蛋白在WTVAC 和MVA感染的BMDC中产生，但在MVAΔE3L感染的细胞中不产生(图 5A)。为了测试E3是否在cDC中MVA感测起抑制作用，比较MVA和 MVAΔE3L之间对I型IFN基因表达的诱导。发现MVAΔE3L诱导比 MVA更高水平的IFNA4和IFNBmRNA(图5B)(P<0.001)。这种诱导在缺乏转录因子IRF3的细胞中被消除(图5C)。此外，蛋白质印迹分析显示MVAΔE3L感染在感染后4和8小时都诱导比MVA更高水平的磷酸-IRF3(图5D)。这些结果表明E3抑制MVA的先天性免疫感应，并且从MVA中去除E3导致I型IFN基因表达的激活增强。发明人推断MVA ΔE3L可能比MVA具有更强的抗肿瘤作用，因为与MVA相比，其诱导 I型IFN的能力优异。
实施例7
由cGAS介导的胞质DNA感测途径在cDC中的MVAΔE3L诱导的I型 IFN诱导起重要作用
为了测试cDC的MVAΔE3L感染是否通过由胞质DNA感测器 cGAS(环状GMP-AMP合酶)(71,73)(Sun等人，Science 339(6121)： 786-791(2013)；Wu等，Science 339(6121)：826-830(2013))及其衔接子STING(68,74)(Ishikawa等，Nature 455(7213)：674(2008)；Gao等人，Cell 154(4)：748-762(2013))介导的胞质DNA感测途径触发I型IFN诱导，从cGAS-/-(72)(Li等人，Science 341(6152)： 1390-1394(2013))小鼠和年龄匹配的WT对照产生cDC，并用MVA ΔE3L感染。使用定量实时PCR分析，发现感染后6小时，MVAΔE3L 诱导的IFNA4和IFN-β基因表达在cGAS缺陷细胞中均降低(图6A，P <0.001)。感染后22小时收集的上清液的ELISA分析还显示在cGAS缺失细胞中MVAΔE3L诱导的IFN-α/β分泌显著降低(图6B，P<0.001)。相反，终浓度为15μM的cGAMP处理在WT和cGAS-/-cDC中都以诱导相似水平的IFN-α/β分泌。最后，蛋白质印迹分析显示MVAΔE3L诱导的IRF3的磷酸化在感染后2和4小时不存在，在感染后6和8小时在 cGAS-/-细胞中显著降低(图4C)。这些结果表明cGAS是MVAΔE3L 的关键胞质DNA感测器。这些结果也意味着MVAΔE3L在树突细胞中诱导cGAS/STING途径的能力可能有助于其治疗益处。基于由本发明人获得的，并且在2016年2月25日提交的PCT US2016/019663中描述的灭活MVA的结果，为了所有目的将其全部内容并入本文作为参考，发明人预期MVAΔE3L的抗肿瘤作用在缺失cGAS或STING的小鼠中将会减少。具有E3缺失的WT VAC不能在树突细胞中诱导I型IFN(数据未显示)，表明由WT VAC表达的cGAS/STING途径的病毒抑制因子可能在MVA 中缺失。
实施例8
由MDA5/MAVS介导的细胞质dsRNA-感测途径也有助于在cDC中MVA ΔE3L-诱导的I型IFN产生
蛋白质印迹分析显示与野生型细胞相比，STINGGt/Gt小鼠产生的 STING缺失型骨髓来源的cDCs感染后，MVAΔE3诱导的IRF3磷酸化在感染后4小时消失，在感染后8小时也减少(图7A)。与野生型细胞相比，在MAVS-/-cDCs中，MVAΔE3L诱导的IRF3的磷酸化也在感染后8小时减少(图7A)。这些结果表明cGCs的MVAΔE3L感染可被cGAS/ STING介导的胞质DNA感测途径以及MDA5/MAVS介导的胞质dsRNA 感测途径所感知。为了检验该假设，制备了STINGGt /Gt/MDA5-/-小鼠，并且分离了双缺陷的cDC。在STINGGt/Gt/MDA5-/-细胞中，MVAΔE3L 诱导的TBK1和IRF3的磷酸化被消除(图7B)。这些结果表明，胞质dsRNA- 感测途径在感测由MVAΔE3L产生的dsRNA中也起作用。总之，这些结果表明，cDC中的MVAΔE3L感染分别导致cGAS/STING和MDA5/ MAVS信号传导途径对病毒DNA和dsRNA的胞质检测，这导致TBK1 和IRF3的激活以及I型IFN基因表达。已经显示静脉内递送合成的dsRNA 激活MDA5并诱导抗肿瘤作用(Tormo等，2009)。MVAΔE3L在免疫细胞，成纤维细胞(参见实施例)和肿瘤细胞(参见实施例)两者中通过产生dsRNA诱导活化MDA5的能力也可以有助于其治疗益处。
实施例9
由cGAS/STING介导的胞质DNA感测途径在小鼠原代成纤维细胞中的MVAΔE3L诱导的Ifnb基因表达中起重要作用
皮肤成纤维细胞构成黑色素瘤基质细胞中的重要细胞类型，通过生长因子和其他可溶性介质的产生促成黑素瘤进展和转移(Li等，Oncogene 2003；Inada等，2015)。为了研究皮肤真皮成纤维细胞是否也对MVA或 MVAΔE3L有反应，本发明人从WT和cGAS-/-小鼠产生原代皮肤成纤维细胞，并以MOI为10的MVA或MVAΔE3L进行感染。在感染后6h收集细胞。使用定量实时PCR分析，本发明人发现MVAΔE3L感染在感染后6小时比MVA诱导更高水平的Ifnb，Ccl4和Il6基因表达(图8A-D)。 MVA和MVAΔE3L诱导的Ifnb，Ccl4，Ccl5和Il6基因表达在cGAS缺陷型成纤维细胞中减少(图8A-D)。这些结果表明，成纤维细胞的MVA 和MVAΔE3L感染可被胞质DNA感测器cGAS检测，这导致诱导IFNB 和其他促炎细胞因子和趋化因子。STING是胞质DNA感测途径的关键适配器。MDA5是胞质dsRNA感测器(Gitlin等，PNAS2006)。为了测试STING或MDA5或两者是否也涉及感测皮肤成纤维细胞中的MVA或 MVAΔE3L，发明人从WT，STINGGt/Gt，MDA5-/-和STINGGt/Gt MDA5-/-小鼠产生原代皮肤成纤维细胞，并用MVA或MVAΔE3L感染他们。定量实时荧光定量PCR分析表明，MVA或MVAΔE3L诱导的Ifnb，Ccl4， Ccl5和Il6基因表达在SENT缺陷细胞中大大减少，证实了由cGAS/ STING介导的胞质DNA感测途径对于检测病毒感染和诱导抗病毒先天免疫是关键的。在STING缺失的细胞中，MVAΔE3L诱导的Il6和Ccl4基因表达水平有一些低的残留水平，STING和MDA5双重缺陷细胞中这些表达水平消失，表明MDA5在检测由MVAΔE3L病毒产生的dsRNA中起支持作用。本发明人得出结论，在皮肤真皮原代成纤维细胞中，通过 cGAS/STNG胞质DNA感测途径感测MVA以诱导Ifnb，Ccl4，Ccl5和 Il6基因表达，而MVAΔE3L激活cGAS/STING和MDA5途径来诱导先天免疫。
实施例10
在小鼠原代成纤维细胞中，由cGAS/STING介导的细胞溶质DNA感测途径在MVA和MVAΔE3L诱导的I型IFN，炎性细胞因子和趋化因子产生中起重要作用
为了关联来自受感染的皮肤成纤维细胞的蛋白质分泌，发明人从感染了MVA或MVAΔE3L的WT，STINGGt/Gt，MDA5-/和STINGGt/Gt MDA5-/-小鼠的皮肤成纤维细胞收集上清液并进行ELISA分析。观察到 MVAΔE3L感染比MVA诱导更高的IFN-α，IL-6和CCL4的分泌水平。与在基因表达分析中观察到的相似，在STING缺陷型细胞中，MVA诱导的IFN-α，IL-6和CCL5的分泌被消除。尽管MVAΔE3L诱导的IFN-γ和CCL5在STING缺陷型细胞中减少，但在感染MVAΔE3L病毒的STING 缺陷型细胞的上清液中有残留的IL-6和CCL4水平，其在STING和MDA5 双缺陷细胞中消除。总之，这些结果显示，皮肤成纤维细胞是响应MVA 或MVAΔE3L感染产生IFN-α，IL-6，CCL4和CCL5的重要来源，其依赖于胞质DNA感测途径。发明人推断肿瘤基质成纤维细胞也能够响应免疫激活病毒如MVA或MVAΔE3L而诱导I型IFN和促炎细胞因子和趋化因子。
实施例11
B16黑色素瘤细胞的MVAΔE3L感染诱导了I型IFN和炎性细胞因子/趋化因子的产生
为了测试B16黑素瘤细胞的MVAΔE3L感染是否也诱导了I型IFN 和炎性细胞因子/趋化因子的产生，用MOI为10的MVA或MVAΔE3L 感染B16黑素瘤细胞或模拟感染(NT)。感染后6小时收集细胞并进行实时PCR分析以分析基因表达。如图10A-F所示，MVAΔE3L感染比MVA诱导较高水平的IFNA4(图10A)，IFNβ(图10B)，IL6(图10C)， TNF(图10D)，CCL5(图10E)和CXCL-10(图10F)的基因表达。
实施例12
用MVA或MVAΔE3L感染B16黑素瘤细胞诱导细胞凋亡
通过半胱氨酸蛋白酶对聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的蛋白水解切割是细胞凋亡的标志。痘苗病毒E3已经显示在HeLa细胞中抑制由 dsRNA诱导的凋亡(75,76)(Kibler等人，J Virol 71,1992-2003(1997)； Lee等人，Virology 199,491-496(1994))。与MVA相比，MVAΔE3L 在鸡胚胎成纤维细胞(CEF)中诱导更多的凋亡(28)(Hornemann等人， J Virol77,8394-8407(2003))。为了评价MVA和MVAΔE3L是否诱导黑色素瘤细胞的凋亡，用MOI为10的MVA或MVAΔE3L感染B16黑色素瘤细胞，使用Western印迹分析确定PARP的切割。如图9A所示， MVA和MVAΔE3L感染均在感染后22小时触发PARP从116-kDa全长蛋白切割成89-kDa片段。此外，MVAΔE3L比MVA更有效地诱导PARP 切割(图11A)。
根据MVA和MVAΔE3L触发凋亡的观察，MVA和MVAΔE3L感染引起重要的抗凋亡Bcl-2家族成员-髓样细胞白血病-1(Mcl-1)蛋白的降解(图11B)。总之，这些结果显示黑素瘤细胞的MVAΔE3L感染触发细胞凋亡的程度与MVA相同甚至更大。
实施例13
MVA或MVAΔE3L的瘤内注射导致荷瘤小鼠的存活期延长并且产生全身性抗肿瘤免疫
可移植的体内B16黑素瘤模型包括在C57B/6小鼠的一侧皮内植入鼠B16F10黑素瘤细胞(1×105)。肿瘤植入后12天，当肿瘤直径约3mm 时，每周向肿瘤注射MVA或MVAΔE3L(2×107pfu)或PBS。MVA 的肿瘤内注射导致60％的处理小鼠中的肿瘤根除和其余的存活延长(图 12B-D)，而瘤内注射MVAΔE3L导致处理小鼠中的肿瘤根除57％，并且其余的存活延长(图12B-D)，证明了两种制剂都具有优异的治疗效果。相比之下，所有瘤内注射PBS的小鼠具有持续的肿瘤生长，并且在肿瘤植入后中值为21天时被安乐死(图12A和D)。在最初的实验中，MVA的肿瘤内注射似乎具有与MVAΔE3L病毒至少相似的抗肿瘤功效。
为了测试瘤内注射MVA或MVAΔE3L后肿瘤根除的小鼠在动物中是否产生全身抗肿瘤免疫，在消灭最初的肿瘤8周后，通过将致死剂量的 B16黑素瘤细胞(5×104)皮内注射到对侧来对动物进行攻击。在攻击实验中使用从未暴露于B16黑素瘤细胞或病毒的初始小鼠(
Figure BDA0001495996790000391
mice)作为对照。肿瘤攻击后跟踪动物70天。80％的MVA处理的小鼠和100％的MVAΔE3L处理的小鼠在肿瘤攻击中存活，而所有初始小鼠发育成长的肿瘤并最终被安乐死(图10E)。总的来说，这些结果表明瘤内注射 MVA或MVAΔE3L导致肿瘤根除，延长存活以及系统性抗肿瘤免疫的发展。此外，该实验显示所公开的治疗在抑制肿瘤攻击所代表的转移中的功效。
实施例14
瘤内注射MVA导致肿瘤环境中的免疫学改变
为了研究由瘤内注射MVA诱导的肿瘤内的免疫学变化，瘤内注射 MVA或PBS后3天收获肿瘤，并通过FACS分析免疫细胞浸润物。我们观察到，Foxp3+CD4+T细胞(即调节性CD4+T细胞)的百分比从PBS 处理的肿瘤中的34.7％降低到MVA处理的肿瘤中的7.0％(P<0.0001，图13A-C)。我们还观察到用MVA处理的肿瘤内表达颗粒酶B(即表达细胞毒性表型)的CD8+T细胞百分比(89％)相对PBS处理(31％)的增加(P<0.0001，图13D-F)。Ki-67+CD8+T细胞(即增殖CD8+T细胞)的百分比从PBS处理的肿瘤中的51％增加到MVA处理的肿瘤中的 76％(P＝0.0004，图11，G-1)。这些结果表明瘤内注射MVA显着上调肿瘤微环境中的免疫应答，包括肿瘤内细胞毒性CD8+T细胞的增殖和活化和伴随的CD4+调节性T细胞的减少。我们预计在用MVAΔE3L治疗的肿瘤内的免疫细胞浸润中看到类似的变化。这些实验已经计划好了。
实施例15
瘤内注射MVA也诱导肿瘤引流淋巴结(TDLNs)的免疫学改变，
为了测试瘤内注射MVA是否也引起TDLNs的免疫学改变，在处理后三天从注射MVA或PBS的小鼠中分离TDLN，并通过FACS分析。颗粒酶B+CD8+T细胞在TDLNs中的百分比从用PBS处理的小鼠中的0.15％增加到用MVA处理的小鼠中的4.6％(P＝0.0002，图14A-C)。此外，Ki-67+CD8+T细胞的百分比从用PBS处理的小鼠中的7.2％增加到用 MVA处理的小鼠中的15％(P＝0.0008，图14D-F)。这些结果表明在 MVA处理的小鼠中的TDLN中存在比在PBS处理的小鼠中更多的活化和复制CD8+T细胞。总之，这些结果表明瘤内注射MVA不仅导致CD8+T 细胞在肿瘤内的局部激活和增殖，而且在宿主内全身性地激活和增殖。
实施例16
MVA和MVAΔE3L感染MC38鼠结肠腺癌细胞诱导I型IFN和炎性细胞因子/趋化因子产生
为了解决MVA和MVAΔE3L是否也在其他类型的实体瘤细胞中引发类似的反应，在MC38结肠腺癌细胞中测试了MVA和MVAΔE3L诱导I型IFN途径的能力。用MOI为10的MVA或MVAΔE3L感染MC38 细胞，或模拟感染对照。在感染后22小时收集上清液。使用ELISA，确定MVAΔE3L诱导MC38细胞中的IFN-β，IL-6，CCL4和CCL5的产量高于MVA(图15A-D)。类似地，实时PCR分析显示MVAΔE3L感染触发MC38细胞中的Ifnb，Il6，Ccl4和Ccl5基因表达的水平高于MVA (图15E-H)。蛋白质印迹分析证明在感染后22小时，MVAΔE3L感染在MC38细胞中引发比MVA更高水平的IRF3磷酸化(图15I)。这些结果表明，本治疗的功效不限于黑素瘤。此外，因为结肠癌的选择是任意的，以及这两个肿瘤是不相关的。除了都为实体瘤和基底细胞来源(癌)以外，目前的结果可以外推到所有的癌。而且，因为本发明人已经显示MVA和 MVAΔE3L以系统性和非肿瘤抗原依赖性方式对免疫系统发挥其活性，所以本发现可以进一步外推至实体瘤。
实施例17
MVAΔE3L感染MC38小鼠结肠腺癌细胞诱导细胞凋亡
为了研究MVA和MVAΔE3L是否也在MC38鼠结肠腺癌细胞中触发凋亡，以MOI为10的MVA或MVAΔE3L感染MC38细胞或模拟感染对照。如在B16黑素瘤细胞中观察到的，Western印迹分析显示，MVA 和MVAΔE3L均引发PARP从116-kDa全长蛋白切割成89-kDa片段(在 22小时，图15I)。实施例16和17一起表明，MVA和MVAΔE3L中的每一种均具有诱导I型IFN和炎性细胞因子/趋化因子产生以及在不同类型的癌细胞中凋亡的能力。与MVA相比，MVAΔE3L似乎是I型IFN和促炎细胞因子和趋化因子生成以及细胞凋亡的更强的诱导剂。然而，这两个结果都表明，由本病毒引起的免疫应答贯穿到细胞凋亡，导致癌细胞死亡。这进一步建立了目前公开的治疗方法，作为治疗黑色素瘤，结肠癌，一般对肿瘤和确实对实体瘤的可行方法。
实施例18
MVAΔE3L在小鼠结肠癌模型中抑制肿瘤发生
实施例11中公开的实验研究表明，瘤内注射MVA或MVAΔE3L 导致在鼠移植B16黑素瘤模型中的肿瘤根除和全身抗肿瘤免疫。为了测试 MVAΔE3L是否能够抑制其他实体瘤中的肿瘤生长，发明人测试了MVA ΔE3L在鼠结肠癌植入模型中的抗肿瘤作用。结肠癌是代表与黑素瘤无关的肿瘤，但在其他方面是随机选择。将2x105个MC38结肠癌细胞皮内植入到C57B/6小鼠的右侧。允许肿瘤形成7天，然后将MVAΔE3L(2× 107)或PBS对照肿瘤内注射入小鼠。在注射前(第0天)和注射后至多 45天测量肿瘤，并根据下式计算肿瘤体积：1(长度)×w(宽度)×h(高度)/2。如图16(A和B)所示，用MVAΔE3L处理的肿瘤显着小于PBS 处理的肿瘤。此外，用MVAΔE3L处理的小鼠表现出比注射PBS或 MVAΔE3L的荷瘤小鼠的改善的存活，如Kaplan-Meier存活曲线所证明的 (图16C)。总的来说，这些发现显示，在结肠癌以及黑素瘤的情况下， MVAΔE3L保持抑制肿瘤发生和肿瘤生长的能力。此处以及实施例13和实施例17中观察到的结果共同证明和说明MVAΔE3L在促进各种实体瘤中的抗肿瘤作用方面是有效的，并且本公开中描述的发现不限于黑素瘤，而是可以外推到其他不同来源的实体瘤。
实施例19
MVA和MVAΔE3L的瘤内注射导致注射和未注射的远处肿瘤中的抗肿瘤作用，并增强存活
接下来，本发明人使用鼠B16-F10黑素瘤双侧植入模型研究了瘤内注射MVA和MVAΔE3L对转移性生长的作用。简而言之，将B16-F10 黑素瘤细胞皮内植入到C57B/6小鼠的左侧和右侧(右侧为5×105，左侧为1×105)。在肿瘤植入8天后，本发明人将MVA或MVAΔE3L(2× 107pfu)或PBS瘤内注射到右侧腹部较大的肿瘤，每周两次。测量肿瘤大小并监测小鼠的存活(图17)。然而，PBS处理的小鼠在接下来的10-14 天随着肿瘤生长的增加迅速死亡(图17A和B)，用MVA和MVAΔE3L 处理的小鼠表现出在对侧的注射和未注射的肿瘤的肿瘤生长延迟(图 17A-F)。
控制未注射的远处肿瘤生长的能力与用MVA和MVAΔE3L处理的动物的存活改善相关(图17G，***，P<0.001对于MVA对PBS，****， P<0.0001对于MVAΔE3L与PBS相比)。总的来说，这些结果说明了用于治疗转移性实体瘤的治疗方法的可靠。
实施例20
瘤内注射MVA和MVAΔE3L导致注射和未注射的远处肿瘤中的免疫学改变
为了理解MVA和MVAΔE3L的抗肿瘤作用的免疫机制，本发明人研究了与PBS对照相比，MVA或MVAΔE3L处理的小鼠的注射和未注射的肿瘤中的免疫细胞浸润。简而言之，将2.5×105个B16-F10黑素瘤细胞皮内植入到小鼠左侧，将5×105个B16-F10黑素瘤细胞皮下植入到小鼠右侧。植入后7天，将2×107pfu的MVA或MVAΔE3L或PBS注射到右侧较大的肿瘤中。三天后重复注射。收集未注射的肿瘤并产生细胞悬液。通过流式细胞术(FACS)分析肿瘤中活的免疫细胞浸润。与用PBS 处理的小鼠(图18A和B)相比，本发明人观察到用MVA或MVAΔE3L处理的小鼠的注射和未注射的肿瘤的CD8+CD3+免疫细胞均显着增加。 MVAΔE3L在注射和未注射肿瘤中招募CD8+CD3+比MVA更有效(图 18A和B)。MVA或MVAΔE3L处理导致在注射和未注射的肿瘤中表达颗粒酶B的CD8+和CD4+T细胞的数目增加(图18C，D，I和J)。另外，通过增殖标志物Ki-67的表达测量MVA或MVAΔE3L处理导致注射和未注射肿瘤中效应子CD8+和CD4+T细胞的增殖(图18E，F，K和L)。最后，MVA和MVAΔE3L的肿瘤内注射导致注射的和未注射的肿瘤中表达FoxP3的CD4+T细胞的百分比降低(图18G和H)。这些结果表明， MVA和MVAΔE3L都能够招募，激活和诱导效应细胞CD8+和CD4+的增殖，以及注射和未注射的肿瘤中免疫抑制调节性CD4+T细胞的减少。这与它们在根除或延迟注射和未注射肿瘤的生长和延长生存期方面的功效相关。在大多数情况下，MVAΔE3L在诱导注射和未注射肿瘤内的免疫学变化方面比MVA更有效。这可能是由于与MVA相比，MVAΔE3L在免疫细胞，肿瘤细胞以及基质细胞中诱导I型IFN的能力增强。
实施例21
MVA和MVAΔE3L的瘤内注射导致注射肿瘤中肿瘤相关巨噬细胞的显着减少
为了研究黑素瘤肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是否受MVA或 MVAΔE3L治疗影响，本发明人基于先前报道的策略(Broz等，Cancer Cell2014)应用了多组抗体来定义TAM。一般来说，首先定义了活CD45+和Ly6C-细胞。在MHCII+细胞内，根据CD24hi和F4/80lo表达将巨噬细胞与DC区分开来。TAM族群通过CD11c和CD11b的差异表达进一步揭示了两种类型的巨噬细胞(TAM1和TAM2)。在MVA或MVAΔE3L 治疗后，与对照相比，黑素瘤肿瘤中的TAM族群减少(图19A和B)。同时，TAM1和TAM2群体均下降到低水平(图19A，C和D)。这些观察表明瘤内注射MVA和MVAΔE3L导致TAM的减少，其在肿瘤微环境内诱导免疫抑制作用。
预实施例22
单侧黑色素瘤植入模型中，MVA或MVAΔE3L的瘤内注射与免疫检查点阻断抗体的腹膜内递送的组合
目前病毒的瘤内注射将用于增强当前免疫疗法的治疗效果，例如阻断免疫检查点(例如抗CTLA-4抗体)，荷瘤小鼠将用瘤内注射MVA或 MVAΔE3L与腹膜内递送抗CTLA-4抗体组合。简而言之，将B16-F10黑素瘤细胞(2x105)皮内植入WT C57B/6小鼠的右侧。在肿瘤植入十天后，当肿瘤生长大于实施例11的那些时，用下列组合处理小鼠：PBS+同种型对照，PBS+抗CTLA-4抗体，MVA+同种型对照，MVA+CTLA-4，MVA ΔE3L+同种型对照和MVAΔE3L+抗CTLA。本发明人将确保在病毒注射开始时在测试组中肿瘤体积是一致的。预计与单独的免疫检查点阻断或单独的MVA或MVAΔE3L治疗相比，MVA和抗CTLA-4抗体或MVAΔ E3L和抗-CTLA-4抗体的治疗将导致优越的治疗功效。
预实施例23
双侧黑素瘤植入模型中，MVA或MVAΔE3L的瘤内注射与腹膜内递送免疫检查点阻断的组合
发明人也将在双侧B16-F10黑素瘤模型中，肿瘤内注射MVA或 MVAΔE3L增强免疫检查点阻断疗法如抗CTLA-4，抗PD-1或抗PD-L1 抗体的治疗效果，其也模拟有转移性疾病的个体。简而言之，将B16-F10 黑素瘤细胞皮内植入C57B/6小鼠的左侧和右侧(5×105右侧和1×105左侧)。在肿瘤植入后8天，将MVA或MVAΔE3L(2×107pfu的MVA 或MVAΔE3L)或PBS瘤内注射于右侧较大的肿瘤，每周两次。用MVA 处理四组小鼠，用MVAΔE3L处理四组，每组接受腹膜内递送的同种型对照或抗-CTLA-4或抗PD-1或抗PD-L1抗体。
本发明人预期MVA或MVAΔE3L的瘤内注射和全身递送检查点抑制剂(由抗CTLcomA-4，抗PD-1和抗PD-L1抗体表示)的组合相比瘤内注射单独的检查点抑制剂或单独的MVA或MVAΔE3L将进一步延缓生长或根除未注射的肿瘤。
预计结果将显示在转移性B16黑素瘤模型中，MVA或MVAΔE3L 的肿瘤内递送克服了对免疫检查点阻断的治疗抗性，这预示将该方法转移到人类治疗中具有有益的结果。
预实施例24
在双侧MC38结肠腺癌植入模型中，瘤内注射MVA或MVAΔE3L与腹膜内递送免疫检查点阻断的组合
本发明人将进一步在其它双侧肿瘤植入模型中进行涉及瘤内注射 MVA或MVAΔE3L增强免疫检查点阻断疗法如抗CTLA-4，抗-或抗 PD-L1抗体的治疗效果的实验，其模拟具有转移性疾病的个体。简而言之，将MC38结肠腺癌细胞皮内植入到C57B/6小鼠的左侧和右侧(右侧5× 105和左侧1×105)。在肿瘤植入后8天，将MVA或MVAΔE3L(2×107 pfu的MVA或MVAΔE3L)或PBS瘤内注射于右侧较大的肿瘤，每周两次。将三组小鼠用PBS处理，每组接受腹膜内递送的同种型对照，或抗 CTLA-4或抗-PD-L1抗体。将有额外的三组小鼠将用MVA治疗，每组接受腹膜内递送的同种型对照，或抗CTLA-4或抗PD-L1抗体。最后，将用 MVAΔE3L处理的小鼠分成三组，每组用同种型对照或抗-CTLA-4或抗 PD-L1抗体处理。然后将每个组分成也用MVA或MVAΔE3L治疗的亚组。还将提供单独用病毒处理的对照。
将监测和评估每组小鼠的注射和未注射肿瘤的肿瘤体积。另外，发明人将监测每个治疗组的存活。
预期由腹膜内递送抗CTLA-4抗体或瘤内递送MVA或MVAΔE3L 与腹膜内递送抗PD-1/PD-L1所代表的MVA或MVAΔE3L的瘤内递送与检查点阻断的组合以及将导致比MVA或MVAΔE3L更高的效率根除未注射的远处肿瘤。因此，预期这些结果显示与单独检查点阻断或仅病毒相比，使用MVA或MVAΔE3L和免疫检查点阻断的组合治疗转移性实体瘤的改善。更具体地说，预计注射的和未注射的肿瘤的大小将会减小，甚至根除的程度大于任一种单一疗法所达到的程度，并且结果将持续至少 45天和更长，从而验证组合治疗原发性和转移性实体瘤的方法。
预实施例25
在双侧B16-F10植入模型中，瘤内注射MVA或MVAΔE3L与瘤内递送免疫检验点阻断剂抗CTLA-4抗体的组合
在预示性实施例22,23和24中，本发明人将在黑素瘤和结肠腺癌模型中测试瘤内注射MVA或MVAΔE3L与免疫检查点阻断剂的全身递送的组合。在此实施例中，发明人将测试MVA或MVAΔE3L和由抗CTLA-4 抗体代表的检查点阻断剂(以用于腹膜内递送的剂量的1/10)的共同施用是否将在严谨的双侧肿瘤植入模型下获得抗癌效果。简而言之，将B16-F10黑素瘤细胞皮内植入C57B/6小鼠的左侧和右侧(5×105右侧和1×105左侧)。在肿瘤植入后8天，将MVA或MVAΔE3L(2×107pfu的MVA 或MVAΔE3L或PBS)瘤内注射到右侧的较大的肿瘤中，每周两次。将三组小鼠用MVA处理，每组接受：(i)腹膜内递送抗CTLA-4(100μg/ 小鼠)(ii)瘤内递送同种型抗体(10μg/小鼠)或)抗CTLA-4抗体的瘤内递送(10μg/小鼠)。另外三组小鼠将用MVAΔE3L处理，每组接受： (i)腹膜内递送抗CTLA-4(100μg/小鼠)，(ii)瘤内递送同种型抗体 (10μg/小鼠)，或(iii)肿瘤内递送抗CTLA-4抗体(10μg/小鼠)。
监测和评估注射和未注射肿瘤的肿瘤体积。本发明人预期MVA或 MVAΔE3L和检查点阻断剂(10μg/小鼠的抗CTLA-4抗体)的瘤内共注射将与MVA或MVAΔE3L瘤内注射和腹腔内递送抗CTLA-4抗体(100 μg/小鼠)的组合的治疗效果相当。预期MVA或MVAΔE3L与显着较低剂量的免疫检查点阻断剂的共同施用可实现与MVA或MVAΔE3L的瘤内递送与较高剂量的抗CTLA-4抗体的全身递送的组合相似的系统抗肿瘤作用。
***
以上说明书，示例和数据提供了对本发明的组成的制造和使用的完整描述。然而，这些是说明性的而非限制性的。本发明的广度在于权利要求。
为了所有目的，本文引用的所有专利和文献文献都通过引用整体并入。本文公开的任何实施例或权利要求的特征可以在申请人的决定下放弃 (disclaimed)。
序列表
<110> 纪念斯隆凯特琳癌症中心
<120> MVA或MVAΔE3L作为抗实体瘤的免疫治疗剂的应用
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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Claims (53)

1.具有缺失痘苗毒力因子E3的修饰的痘苗病毒安卡拉(MVAΔE3L)在制备用于治疗患有恶性实体瘤的患者的药物中的用途，其中所述恶性实体瘤为黑素瘤或结肠癌，其中所述MVAΔE3L经配制以有效量递送至所述患者。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述病毒有效地引起以下一项或多项：
a.诱导患者的免疫系统产生针对所述肿瘤的免疫应答或增强免疫系统对肿瘤的持续应答；
b.减少肿瘤的大小；
c.根除肿瘤；
d.抑制肿瘤的生长；和
e.抑制肿瘤的转移。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述病毒有效地引起：
f.减少或根除转移性肿瘤。
4.根据权利要求2所述的用途，其中针对所述肿瘤的免疫应答完成以下一项或多项：
a.增加肿瘤内和/或肿瘤引流淋巴结内的抗肿瘤细胞毒性CD8+T细胞和效应子CD4+T细胞中的至少一种；
b.通过诱导I型IFN诱导浸润所述肿瘤的树突细胞成熟；
c.减少肿瘤内的调节性CD4+T细胞；
d.减少肿瘤内的免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞(TAM)；
e.诱导免疫细胞和基质成纤维细胞中的I型IFN，炎性细胞因子和趋化因子的产生。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述MVAΔE3L不携带编码或表达肿瘤抗原的核酸。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述恶性实体瘤包括位于MVAΔE3L位点处的肿瘤或位于所述患者体内别处的肿瘤。
7.根据权利要求4所述的用途，其中效应子CD4+T细胞的募集和活化伴随所述肿瘤中调节性CD4+细胞的减少。
8.根据权利要求6所述的用途，其中所述MVAΔE3L的递送继续进行直到其诱导肿瘤消退或根除。
9.根据权利要求6所述的用途，其中MVAΔE3L的递送持续数周，只要益处持续或达到最大耐受剂量。
10.根据权利要求6所述的用途，其中MVAΔE3L的递送持续数月，只要益处持续或达到最大耐受剂量。
11.根据权利要求6所述的用途，其中MVAΔE3L的递送持续数年，只要益处持续或达到最大耐受剂量。
12.根据权利要求6所述的用途，其中MVAΔE3L的递送持续无限期，只要益处持续或达到最大耐受剂量。
13.根据权利要求6所述的用途，其中所述MVAΔE3L的递送是通过肠胃外注射进行的。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述MVAΔE3L的递送是通过肿瘤内注射进行的。
15.根据权利要求13所述的用途，其中所述MVAΔE3L的递送是通过静脉内注射进行的。
16.根据权利要求6-15中任一项所述的用途，其中所述患者是人。
17.根据权利要求6-15中任一项所述的用途，其中所述MVAΔE3L以每次施用剂量105-1010个噬菌斑形成单位(pfu)的范围递送。
18.根据权利要求6-15中任一项所述的用途，其中所述MVAΔE3L以每次施用剂量106至109个噬菌斑形成单位(pfu)的范围递送。
19.根据权利要求6-15中任一项所述的用途，其中递送的量足以感染所有肿瘤细胞。
20.根据权利要求6-15中任一项所述的用途，其中所述递送以从每月一次到每周两次的范围内的频率重复。
21.根据权利要求6-15中任一项所述的用途，其中所述递送每周重复一次。
22.根据权利要求6-15中任一项所述的用途，其中所述黑素瘤是转移性黑素瘤。
23.根据权利要求1所述的用途，其中所述量有效地募集和活化所述患者中的识别所述肿瘤的细胞的效应子CD4+T细胞。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述MVAΔE3L在感染的肿瘤细胞中诱导I型干扰素。
25.具有缺失痘苗毒力因子E3的修饰的痘苗病毒安卡拉(MVAΔE3L)在制备用于治疗患者的实体恶性肿瘤的药物中的用途，其中所述病毒有效诱导所述患者的免疫系统产生针对所述肿瘤的免疫应答或增强所述患者对肿瘤的持续免疫反应，从而完成以下一项或多项：减小肿瘤的大小，根除肿瘤，抑制肿瘤的生长，抑制肿瘤的转移性生长，诱导肿瘤细胞的凋亡或延长患者的存活，其中所述实体恶性肿瘤为黑素瘤或结肠癌。
26.具有缺失痘苗毒力因子E3的修饰的痘苗病毒安卡拉(MVAΔE3L)在制备用于治疗患者的恶性肿瘤的药物中的用途，其中所述病毒有效诱导所述患者的免疫系统对所述肿瘤产生免疫应答或增强所述患者抵抗所述肿瘤的持续免疫应答，并联合给药所述患者第二量的有效阻断肿瘤内的免疫抑制机制的免疫检查点阻断剂或免疫检查点激动剂，其中所述恶性肿瘤为黑素瘤或结肠癌，其中所述MVAΔE3L经配制以有效量递送至所述患者。
27.根据权利要求26所述的用途，其中所述免疫抑制机制由肿瘤细胞，基质细胞或肿瘤浸润免疫细胞引发。
28.根据权利要求26所述的用途，其中所述给药是通过肠胃外途径进行的。
29.根据权利要求26所述的用途，其中所述递送是通过肿瘤内注射进行的，并且所述给药是通过静脉内途径进行的。
30.根据权利要求26所述的用途，其中所述递送和所述给药都是通过静脉内途径进行的。
31.根据权利要求26所述的用途，其中所述递送和所述给药都是通过肿瘤内注射进行的。
32.根据权利要求26所述的用途，其中所述免疫检查点阻断剂选自PD-1抑制剂，PD-L1抑制剂，CTLA4抑制剂，抗LAG-3、TIM3、B7-H3和TIGIT抑制性抗体；并且免疫检查点激动剂选自抗ICOS抗体、抗OX40抗体、抗4-1BB(CD137)和抗GITR的激动剂抗体。
33.根据权利要求32所述的用途，其中所述抑制剂中的任一种是抗体。
34.根据权利要求26所述的用途，其中所述肿瘤是原发性或转移性黑素瘤或原发性或转移性结肠癌。
35.根据权利要求26所述的用途，其中所述病毒和所述免疫检查点阻断剂分别根据其自身的分隔间隔的施用时间表被递送或施用。
36.根据权利要求35所述的用途，其中首先递送所述病毒的第一剂量，并且在一段时间后给药第一剂量的免疫检查点阻断剂。
37.根据权利要求35所述的用途，其中所述递送和给药在相同的整个时间段内并行发生。
38.根据权利要求35所述的用途，其中所述病毒和免疫检查点阻断剂中的一种或两种在数周的时间内分别被递送和给药，只要益处持续并且最大耐受剂量没有达到。
39.根据权利要求35所述的用途，其中所述病毒和免疫检查点阻断剂中的一种或两种在数月的时间内分别被递送和给药，只要益处持续并且最大耐受剂量没有达到。
40.根据权利要求35所述的用途，其中所述病毒和免疫检查点阻断剂中的一种或两种在数年的时间内分别被递送和给药，只要益处持续并且最大耐受剂量没有达到。
41.根据权利要求35所述的用途，其中所述病毒和免疫检查点阻断剂中的一种或两种无限期地分别被递送和给药，只要益处持续并且最大耐受剂量没有达到。
42.根据权利要求26所述的用途，其中所述病毒以每次施用剂量105-1010个噬菌斑形成单位(pfu)范围递送。
43.根据权利要求42所述的用途，其中所述病毒以每次施用剂量106至109个噬菌斑形成单位(pfu)的范围递送。
44.根据权利要求26所述的用途，其中所述病毒递送以从每月一次到每周两次的范围内的频率重复。
45.根据权利要求44所述的用途，其中所述病毒递送每周重复一次。
46.根据权利要求26-44中任一项所述的用途，其中所述病毒和所述免疫检查点阻断剂同时施用。
47.根据权利要求26-44中任一项所述的用途，其中所述病毒和所述免疫检查点阻断剂在相同的组合物中施用。
48.根据权利要求26-44中任一项所述的用途，其中所述MVAΔE3L和所述免疫检查点阻断剂瘤内递送。
49.根据权利要求26所述的用途，其中所述病毒和所述免疫检查点阻断剂依次施用。
50.根据权利要求49所述的用途，其中所述MVAΔE3L和免疫检查点阻断剂瘤内递送。
51.一种用于治疗实体瘤的组合物，其包含具有缺失痘苗毒力因子E3的修饰的痘苗病毒安卡拉(MVAΔE3L)，其有效诱导将被施用所述组合物的宿主的免疫系统，以产生针对肿瘤的免疫应答或增强宿主对肿瘤的持续免疫应答；和药学上可接受的载体或稀释剂。
52.根据权利要求51所述的组合物，其中MVAΔE3L的量为在一个单位剂型中105-1010个噬菌斑形成单位(pfu)的范围内。
53.根据权利要求52所述的组合物，其中所述量在106至109个pfu的范围内。
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